Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша.

Каратаев, Геннадий Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша.
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша."

Каратаев Геннадий Иванович

Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша

03 00 07 - микробиология 03 00 15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2008

003171249

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук.

Научный консультант член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор

Смирнов Георгий Борисович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Миронов Александр Сергеевич

Доктор медицинских наук

Мазурова Изабелла Константиновна

Доктор медицинских наук

Шагинян Игорь Андроникович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

заседании диссертационного совета Д 001007 01 в ГУ научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи РАМН (123098 г Москва ул Гамалеи д 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН

Защита диссертации состоится

2008 г в 11 часов на

(

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е В

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы.

Коклюш - респираторное заболевание людей, вызываемое грам-отрицательными бактериями Bordetella pertussis Бактерии В pertussis передаются от человека к человеку воздушно-капельным путем Профилактика коклюша входит в национальный календарь плановых прививок и обеспечивается программами массовой вакцинации детей Несмотря на это, циркуляция возбудителя коклюша в популяции не уменьшается Ежегодно в мире регистрируется до 48,5 миллионов заболеваний, из них до 300 ООО случаев заканчиваются летальным исходом (Crowcroft N S et al 2003) Чаще, и в более тяжелой форме, коклюшем болеют дети первого года жизни, но в последнее время отмечается рост числа лабораторно подтвержденных случаев коклюша у подростков и взрослых (Cherry JD, Heimnger (J, 2004) Эпидемиологические исследования показали, что дети старших возростных групп и взрослые являются источником инфекции для наиболее восприимчивых к заболеванию детей младшего возраста (Mattoo S .Cherry J D , 2005) Отмечены случаи бессимптомного носительства В pertussis (Heimnger UW et al, 2004) Активно изучаются механизмы носительства и персистенщш возбудителя в организме человека Установлена связь между переживанием бактерий Bordetella внутри эукариотической клетки и экспрессией некоторых факторов вирулентности возбудителя (Bassinet L, 2000)

Одной из характерных особенностей возбудителя коклюша является высокая степень изменчивости его фенотипических признаков Бактерии с разной вирулентностью, формой колоний и способностью к гемолизу эритроцитов были выделены на разных стадиях заболевания, при экспериментальном заражении лабораторных животных и при культивировании т \itro (Wardlaw A, Parton R, 1988) Такие бактерии названы фазовыми вариантами (Lacey В 1960), а переход из одной фазы в другую - фазовым переходом

На протяжении последних 20-и лет проведены многочисленные молеку-лярно-генетические исследования структуры и экспрессии генов вирулентности Установлено, что большинство из них регулируется на уровне транскрипции, управляемой двухкомпонентной сенсорной системой BvgAS Bordetella (Cotter PA, Miller JF, 2001, Cummmgs CA et al, 2006)

Регуляция экспрессии генов вирулентности Bordetella изучена главным образом в экспериментах in vitro Только в одной работе предпринята попытка анализа транскрипции ¿v^/íS-зависимых генов суа, jha, prn и ptx в процессе размножения бактерий в легких мышей после аэрозольного заражения вирулентным штаммом В pertussis (Wendy L, Stibitz S , 2005) Отсутствие адекватной модели затрудняет изучение роли отдельных факторов вирулентности и фазовых переходов в формировании и развитии инфекционного процесса в экспериментах на животных Остается открытым вопрос о механизме формирования носительства (персистенции) возбудителя коклюша в организме человека (Mattoo S , Cherry J D, 2005, Cummings CA et al, 2006)

Установлена структурная организация и полные нуклеотидные последовательности хромосом В pertussis, В parapertussis и В bronchiseptica, что позволило идентифицировать повторяющиеся IS-подобные элементы и геномы про-фагов в хромосомах микроорганизмов рода Bordetella (McLafferty MA etal, 1989, McPheat WL et al, 1989, Parkhill J M et al, 2003) Использование современных методов молекулярного анализа (пульс-электрофореза, IS-типирования и гибридизации) выявило значительные отличия структуры хромосом бактерий В pertussis, выделенных в разные периоды времени и в различных географических регионах (Mary М et al, 2006) Изменения структуры хромосомы обнаружены и после пассажа бактерий В pertussis на питательных средах in vitro (Вп-nig ММ et al, 2006) Авторы полагают, что перестройки являются следствием рекомбинаций, индуцированных IS-подобными элементами В pertussis События гомологичной и «незаконной рекомбинации», индуцированные IS-элементами, обеспечили редуктивную эволюцию геномов микроорганизмов рода Bordetella (Cummings CA et al, 2004, Mary M et al, 2006) Высказываются предположения о формировании некоторых фазовых вариантов В pertussis в результате перемещения (исключения) IS-элементов в оперон bvgAS В pertussis (Stibitz S et al, 1989, Monack DM et al, 1989, McGillivray D M al, 1989) Однако экспериментально эти предположения не были подтверждены

Актуальность проведенных исследований определяется необходимостью расширения знаний об эпидемиологически значимом возбудителе инфекционного заболевания человека Идентификация мобильных генетических элементов В pertussis (IS-элементов, Tn-подобных структур, бактериофагов), определение факторов, влияющих на частоту перемещения МГЭ в клетках В pertussis, изучение роли МГЭ в регуляции вирулентности возбудителя коклюша, позволят понять механизмы изменчивости и адаптации бактерий возбудителя коклюша к среде обитания

Используемые в настоящее время бактериологические методы лабораторной диагностики коклюша недостаточно чувствительны, а серологические методы недостаточно специфичны Идентификация ДНК В pertussis с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Xuan Qin et al, 2007) не нашла широкого применения в отечественной практике здравоохранения (Лыткина И Н и др , 2004) Необходимость совершенствования лабораторной диагностики возбудителя коклюша, включающей методы анализа фазовых вариантов бактерий В pertussis in vitro и in vivo, определяет актуальность прикладного раздела исследования Тест-системы, разработанные для обнаружения с помощью ПЦР ДНК возбудителя коклюша в клинических образцах и выявления инсер-ций RS-элементов в генах вирулентности бактерий В pertussis, предполагается использовать для изучения носительства возбудителя коклюша, диагностики атипичных форм заболевания, определения структуры и механизмов формирования резервуаров инфекции.

Цель исследования Выявление генетических основ и молекулярных механизмов изменчивости В pertussis и роли мобильных генетических элементов (МГЭ) в регуляции экспрессии генов вирулентности возбудителя коклюша

Задачи исследования:

1 Выделение и характеристика повторяющейся последовательности (RS) и Тп -подобных элементов хромосомы В pertussis

2 Разработка экспериментального метода регистрации событий перемещен™ RS-элементов в специфические сайты хромосомы В pertussis Определение факторов, влияющих на перемещение RS-элементов в оперон b\gAS, регулирующий вирулентность В pertussis

3 Выделение мутантов В pertussis, содержащих инсерцию RS -элемента в опе-роне fogAS

4 Выделение и характеристика новых бактериофагов и лизогенности микроорганизмов рода Bordetella

5 Конструирование тест-систем для идентификации и характеристики ДНК бактерий В pertussis в биологическом материале от носителей и больных коклюшем детей и взрослых с помощью полимеразной цепной реакции

Научная новизна

- клонированы повторяющаяся последовательность и транспозоно-подобная структура хромосомы В pertussis, сконструированы их генетически маркированные варианты Показано, что изолированные нами RS и Тп-подобная последовательности являются мобильными генетическими элементами, сходными с МГЭ других бактерий МГЭ В pertussis способны к RecA- независимым перемещениям, индуцируют образование дупликаций, делеций, инверсий прилегающего генетического материала и формирование коинтегратов в бактериях Е coll Установлена зависимость RS- индуцируемых событий рекомбинации от фенотипа бактерии-хозяина Сконструирован штамм Е colt, продуцирующий функционально-активную транспозазу RSBP В pertussis,

- идентифицированы события спонтанного перемещения RS- элементов в cctagg сайт оперона bvgAS вирулентных бактерий В pertussis и выделены ин-серционные Bvg' мутанты В pertussis Установлено, что частота перемещения RS-элементов зависит от функционирования оперона bvgAS и условий культивирования бактерий В pertussis Перемещение RS-элементов не регистрируется в бактериях, содержащих мутацию в опероне bvgAS Показано, что бактерии В pertussis могут переходить в авирулентное состояние в результате интеграции RS-элементов в оперон bvgAS, регулирующий экспрессию генов вирулентности бактерий,

- выделены и охарактеризованы бактериофаги из бактерий международного штамма В pertussis Tohama I (фТ) и конвертанта В parapertussis 17903 (фК), установлена лизогенность бактерий и структура геномов описанных ранее бактериофагов В pertussis и В bronchiseptica Показано, что геномы всех изученных бактериофагов Bordetella, за исключением бактериофага фК, идентичны Геном бактериофага фК отличается от генома фТ и всех охарактеризованных бактериофагов Bordetella Бактерии В pertussis и В bronchiseptica являются полилизо-генными Геном профага фК находится в хромосоме клетки-хозяина, тогда как геном фТ присутствует, скорее всего, в состоянии плазмиды и утрачивается в

процессе культивирования большей частью бактериальной популяции По меньшей мере, один из выделенных бактериофагов В pertussis, родственный фТ, способен лизогенизировать бактерии В parapertmsii, интегрируя фрагмент генома в хромосому, и вызывая изменение свойств возбудителя паракоклюша Свойства охарактеризованных бактериофагов позволяют отнести их к классу мобильных генетических элементов

Практическая значимость

Показана целесообразность использования разработанных в процессе выполнения работы тест-системы и метода выявления ДНК бактерий В perussis, находящихся в различных фазовых состояниях, для диагностики заболевания, выявления носителей возбудителя коклюша, определения роли фазовых состояний в патогенезе и персистенции возбудителя

Использование разработанных тест-систем для лабораторной диагностики коклюша показало их высокую эффективность в сравнении с бактериологическими методами и позволило выявить возбудитель коклюша почти у 7% «практически здоровых» детей и более чем у 30% больных детей с диагнозом острое респираторное заболевание Полученные нами и другими авторами результаты указывают на то, что стертая и атипичная формы коклюша является причиной значительного числа заболеваний с симптомами длительного кашля Длительно кашляющие дети и взрослые, бессимптомные носители бактерий В perussis, наряду с больными типичной формой коклюша, являются носителями инфекции

Разработанный экспериментальный подход позволяет идентифицировать бактерии, содержащие инсерцию RS-элемекгов в оперон bvgAS, регулирующий транскрипцию генов вирулентности возбудителя коклюша Идентификация ин-серционных Bvg" мутантов и мутантов по другим генам вирулентности В perussis на разных стадиях заболевания, в организме носителей позволит определить роль RS-индуцированного мутагенеза при формировании персисти-рующих форм бактерий Bordetella Исключение RS-элемента из структуры му-тантного гена приводит к восстановлению вирулентного фенотипа, что может вызывать развитие инфекционного процесса в организме хозяина Определение относительного числа инсерционных мутантов В perussis у носителей и больных на разных стадиях заболевания может оказаться важным критерием для оценки эпидемиологической значимости носительства Bvg" мутантов и разработки новых подходов к профилактике коклюша

Подготовлена фармакопейная статья и инструкция по применению «Тест-системы для экспресс-иццикации возбудителя коклюша методом поли-меразной цепной реакции», одобренные Советом по внедрению научных достижений в практику ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН 7 февраля 2008 г, протокол №3

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены на конференции National Institute of Allergy and Infection Diseases USA research conference , June 24-30, 2006, 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000, 2-м Всесоюзном симпозиуме теоретических и прикладных аспектов молекулярной биологии, Самарканд 1991, Всесоюзной школе-семинаре «Молекулярная биология и медицина», Ленинград, 1990, FEMS-symposium Pertussis, Berlin, 1988, 13-ой Всесоюзной конференции по электронной микроскопии «Биология и медицина», Москва 1988

Апробация диссертации состоялась 13 декабря 2007г на совместной научной конференции отделов медицинской микробиологии, генетики и молекулярной биологии бактерий ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 34 работы, из которых 21 в рекомендованных ВАК РФ изданиях

Структура работы.

Диссертационная работа изложена на 292 страницах, содержит введение, 3 главы («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение») заключение и выводы Работа иллюстрирована 32 рисунками и 16 таблицами Список литературы содержит 490 ссылок, из них 19 в изданиях на русском языке

Основное содержание работы

1. Материалы и методы.

Штаммы и условия культивирования В работе использованы штаммы Е coli, В pertussis, В parapertussis В bronchiseplica из коллекции ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН Бактерии Е coli культивировали на плотной питательной среде ЦДифко), на минимальной среде с аминокислотами или на жидкой питательной следе ЦДифко) (Миллер ДМ, 1984) Бактерии рода Bordetella культивировали на плотной питательной среде КУА (казеиново-угольный агар), агаре БЖ (Борде-Жангу) с добавлением или без добавления 10% дефибриниро-ванной крови барана. Инсерционный мутант Е coli metY рККЗ отобран и проанализирован на минимальной среде, содержащей 1 мкг/мл метионина В качестве индикаторных сред для характеристики Pts- мутантов использовали среды Мак Конки и среду с тетразолием (Bolshakova TN, 1992), добавляя необходимые углеводы (глюкозу и фруктозу) до 1%

Для титрования фагов Bordetella использовали полусинтетическую среду типа Cohen- Wheeler с добавлением 0 5% агара (Дифко)

Конструирование изогенных штаммов Изогенные RecA и RecBC -штаммы Е coli конструировали, используя скрещивание с донорами KN502 (TetR) или GA87 (Thy ) Изогенные штаммы бактерий FruSl' и PtsH5" сконструированы в соответствии со стандартной схемой трансдукции селективных

маркеров донорных штаммов LBG1605 (Glu) и LBG1156 (Man) Изогенные штаммы бактерий KmR PtsH" (LBG1623-H7) и CmR PtsI" (LBG1623-I3) сконструированы путем инсерции m vitro последовательности генов кап и cad в структуру генов pis H и ptsl оперона pis бактерий LBG1623, любезно предоставленных нам Dr Barry L Wanner Department of biological sciences, Purdue University, USA Изогенные варианты, содержащие инсерцию metY рККЗ и другие мутанты Е coli, конструировали с помощью Plvir трансдукции с использованием соответствующих доноров Штаммы бактерий, содержащие рекомбинантные плазмиды рОХ38 рККЗ, конструировали с помощью конъюгации коинтеграта в бактерии соответствующего реципиентного штамма

Бактерии, содержащие одну или несколько плазмид, получены с помощью трансформации соответствующих реципиентных штаммов

Рестрикционный анализ, лигирование. электрофорез ДНК, саузерн- и гибридизацию in 4itu проводили в соответствии с методическим руководством ( Маниатис Т и др, 1984)

Генетические манипуляции Трансформацию клеток Е coli гшазмидной ДНК или лигированной смесью проводили в соответствии с руководством (Маниатис Т и др, 1984) Процедуры конъюгации и Plvir - трансдукци бактерий Е coli проводили по стандартным методикам (Миллер ДМ, 1984) или использовали модификации, описанные в соответствующих разделах главы «Результаты и обсуждение» Для отбора рекомбинантов (трансдуктантов, трансформантов и трансконыогантов) использовали селективные среды, содержащие антибиотики, или минимальные питательные среды на основе среды М9 (Миллер ДМ, 1984) Бактерии В pertussis трансформировали методом электропорации на приборе (Biorad США), согласно инструкции изготовителя

Выделение ДНК плазмид, хромосомы, бактериофагов и продуктов ПЦР из геля проводили с помощью систем Wizard Plus SV MmiPrepsDNA purification system (Promega США), Wizard Plus MmiPrepsDNA purification system (Promega США) и Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega США)

Клонирование последовательностей ДНК проводили в соответствии с руководством (Маниатис Т и др, 1984) Инвертированные повторяющиеся последовательности ДНК хромосомы В pertussis 475 клонировали в соответствии с методикой (Ohtsubo H, Ohtsubo Е, 1976)

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили, в соответствии с ре-комецдацииями (Müller FM, 1997) на приборе «Терцик» (Россия) с использованием праймеров, синтезированных АО «Синтол»

Определение нуклеотидной последовательности. Автоматическое секве-нирование проводили на приборе 373А Automatic Sequencer (Applied Biosys-thems, USA) с использованием реактивов Dye Deoing Terminator ABI sequencing Kit с Taq-полимеразой FS (Perkin Elmer, USA) Для реакции использовали продукт амплификации ДНК или плазмиды, очищенные в соответствии с приведенной выше методикой

Синтез и очистка транспозазы RSBP из бактерий Е coli BL21/pET32 ORF1 Ночную культуру клеток рекомбинантного штамма, выращенную при

37"С в L бульоне с ампициллином, разводили в 100 раз и подращивали 3 часа Затем добавляли IPTG до концентрации 1тМ и культивировали еще 3 часа

Очистку транспозазы из нерастворимой фракции бактерий Е toll BL21/ pET320RFl проводили с помощью хроматографии на MS-His агарозе (Promega-V8500) в присутствии 6М мочевины в соответствии с инструкцией фирмы производителя Белок анализировали методом электрофореза в 12% PAAG-геле в денатурирующих условиях по стандартной методике (Laemmli UK, 1970)

Лейкоцитозстимулнрующую активность (ЛСА) коклюшного токсина, активность термолабильного токсина (ТЛИ и видоспецифические агглютиногены бактерий В pertussis определяли в соответствии с "Инструкцией по проверке биологических свойств вакцинных штаммов В pertussis" Для определен™ ви-доспецифических агглютиногенов использовали «Сыворотки диагностические коклюшные и паракоклюшные к агглютиногенам 1 2 3 и 14, адсорбированные, сухие» (ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН)

Получение фагов Bordetella в высоком титре и изучение их свойств проводили в соответствии с методами, разработанными Синяшиной ЛН и др , 1982 Приготовление препаратов ДНК и бактериофага для электронной микроскопии осуществляли по методике (Davis R, 1971)

Исследования клинических образцов. Для исследования использовали смывы с назофарингеальных декроновых тампонов Взятие материала проводили в соответствии с «Требованиями к взятию и транспортировке материала для лабораторной диагностики коклюша» Комитета Здравоохранения Москвы от 25 ноября 2002 года № 539/№ 230

Выделение ДНК из клинического материала, проведение ПЦР и учет результатов описаны в ФСП и Инструкции по применению «Тест-системы для экспресс-индикации возбудителя коклюша методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) "МастерК"»

Нерадиоактивное мечение и гибридизацию ДНК-зонда проводили по методике, разработанной Вейко НН и др, 1989

Статистическая обработка результатов Использованы методы математической статистики, принятые в биологии и медицине (Гланц С, 1999)

2. Результаты и обсуждение

2 1. Повторяющиеся последовательности и транспозоно-подобчые элементы В pertussis.

Электронно-микроскопический анализ ДНК В pertussis 475 и Tohama I выявил большое число инвертированных друг к другу повторяющихся последовательностей размером около 1 1 т п н, равномерно распределенных по хромосоме Одна из структур, содержащих два инвертированных повтора, обнаружена нами вблизи оперона bvgAS, контролирующего вирулентность возбудителя коклюша

2.1.1. Клонирование повторяющейся последовательности и транспозоно-подобного элемента хромосомы В pertussis 475. Конструирование генетически маркированных RSBP н ТпВР- элементов.

Для клонирования повторяющейся последовательности хромосомы В pertussis 475 использован метод Ohtsubo Н , Ohtsubo Е (1976) Двушггевые фрагменты, сформированные в результате обработки Sl-нуклеазой гомодуп-лекса ДНК В pertussis 475, содержащей инвертированные повторы, клонированы в векторе рНС79 Структура трех характерных рекомбинантных плазмид pNKl, рМК2 и рМК1, определенная с помощью рестрикционного анализа, Сау-зерн - гибридизации, электронной микроскопии и частичного секвенирования, представлена на рисунке 1 Последовательность RSBP идентична последовательностям RS1 и RS2 (McLafferty MA et al, 1988, McPheat W et al, 1989)

Рисунок 1. Структура плазмид, полупенных в результате клонирования повторяющейся последовательности В pertussis 475 в плазмиде рНС79.

Cos - фрагмент последовательности вектора рНС79, K10F и KIOr - специфические праймеры RSBP

Транспозоно-подобный элемент (ТпВР) обнаружен нам в составе BamHI фрагмента хромосомы В pertussis 475, содержащего последовательность оперо-на bvgAS - регулятора транскрипции генов вирулентности бактерий рода Bordetella Показано, что ТпВР стимулирует образование гесА - независимых делеций и инверсий в составе рекомбинантной плазмиды, содержащей BamHI фрагмент хромосомы ТпВР состоит из двух инвертированных друг к другу последовательностей, размером 1053 п н (RSBP) и 402 п н (RSBPi), фланкирующих внутреннюю область хромосомы 731 п н (рис 2) Для дальнейшего изучения свойств RSBP и Tn-подобного элемента были скоструированы их генетически маркированные варианты Структура рекомбинантной плазмиды рККЗ, содержащей маркированный ТпВР, представлена на рисунке 2

Для конструирования маркированной, функционально активной производной RSBP, проведен компьютерный анализ последовательностей 238-и копий RS хромосомы В pertussis Tohama I, позволивший пред положить, что транспозазу RSBP В pertussis размером 316 а к кодирует наибольшая из трех

ORF - последовательность ORF1 Для проверки этого предположения сконструированы мутанты, содержащие инсерции гена кап, внутри или вне ORF1 RSBP В pertussis, клонированные в составе плазмид рМи5 и рМиб, соответственно (рис 2) Дальнейшие эксперименты показали, что только последовательность RSBP, содержащая интактную ORF1, сохранила способность индуцировать формирование межплазмидных коинтегратов и кошггегратов между плазмидой и хромосомой Е coli (см ниже)

Рисунок 2. Физическая карта плазмид рККЗ, рМи, рМи5 и рМиб, содержащих генетически маркированные элементы ТпВР и К8ВР.

K10R К101!

ORF1 и Д ORF1- интактная и делегированная рамка считывания, кодирующая транспозазу RSBP, Xma*III - сайт рестрикразы, нарушенный в результате лигирования с BamHl сайтом последовательности гена кап, K10F и K10R- специфические праймеры для амплификации фрагмента последовательности RSBP

2.1.2. Свойства RSBP и ТпВР-элементов В pertussis в бактериях E.coli Основное свойство мобильных генетических элементов, к числу которых, по нашему предположению, относятся RSBP и ТпВР- элементы В pertussis - их способность перемещаться между геномами и внутри одного генома Часто, перемещение МГЭ сопровождается изменением структуры прилегающих к нему областей, проявляющееся в виде дупликаций, делеций и

инверсий последовательностей ДНК мишени Перемещение МГЭ может происходить без образования промежуточных продуктов, или сопровождаться формированием коинтегратов между ДНК донора и реципиента МГЭ (Хесин PB, 1984, Berger В, Haas D, 2001) Для изучения событий транспозиции чаще всего используют перемещение МГЭ из плазмиды в хромосому или между двумя плазмвдами

2 12 1 Транспозиция (интеграция) RSBP и ТпВР-элементов В pertussis в хромосому Е coli

Перемещение RSBP и ТпВР- элементов В pertussis в хромосому бактерий Е coli регистрировали без элиминации плазмиды-донора или после ее элиминации Во всех случаях для доказательства хромосомной локализации RSBP, ТпВР или плазмиды использовали выделение плазмидной ДНК, Р1мг трансдук-цию, Саузерн-гибридизацию, ПЦР и секвенирование продуктов ПЦР

Первая модель регистрировала события спонтанной транспозиции ТпВР из плазмиды рККЗ (рис 2) в хромосому гесА мутантов HfrH Е coli KS721 События транспозиции ТпВР фиксировали в экспериментах по переносу маркера транспозона ТпВР, переместившегося в хромосому Ecoli KS721, в процессе скрещивания HfrH Е coli KS 721/рККЗ х Е со!1%А1% Изучение структуры хромосомы трансконьюганта 5(478-5 методами гибридизации и ПЦР показало, что она содержит только последовательность ТпВР и не содержит последовательности векторной плазмиды, а структура транспозона в составе хромосомы %478-5 не отличается от структуры ТпВР в составе плазмиды - донора Эксперименты выявили высокую нестабильность транспозантов в бактериях Е coliyAli Структура рекомбинантной хромосомы более стабильна в бактериях реципиента Е coli GA87 RecBCsbcB

Вторая и третья экспериментальные модели представляют собой варианты использования метода «спасения маркера» для идентификации RSBP-ивдуцированных коинтегратов плазмиды рККЗ с хромосомой Е coli, основанного на применении различных методов элиминации плазмиды-донора

Первый способ элиминации плазмид основан на подавлении их репликации в результате обработки бактерий коумермицином (Данилевская О, Граге-ров А, 1980) В работе использованы RecA+ и RecA" производные штаммов Hfr KS721/pKK3 и F"x5097/pKK3 Результаты экспериментов представлены в таблице 1 Частоту Ni определяли как отношение числа KmR бактериальных клонов, выросших на L-arape с канамицином после обработки бактерий коаумер-мицином, к числу бактерий, выросших на L-arape без антибиотика Частота «спасения маркера» N2 = (п2/ ni)x N!, где п, и п2 - число проверенных и бес-плазмидных бактериальных клонов, соответственно

Из таблицы 1 видно, что частота «спасения маркеров» плазмиды рККЗ изменяется незначительно в зависимости от гесА генотипа бактерий Ecoli Подавляющее большинство бесплазмцдных клонов несли оба маркера устойчивости - маркер KmR ТпВР и плазмидный маркер ApR Среди них были обнаружены ауксотрофные мутанты Один из бесплазмидных мутантов Km Ар

KS721r.pKK3, с наиболее часто встречающимся фенотипом, названным нами MetY (см. «Мат. и методы»), выбран для дальнейшего анализа. Для локализации места интеграции плазмиды рККЗ в хромосому Е.соП проведён комплемен-тационный анализ мутации MetY в бактериях штамма трансдуктанта Х5097::рК.КЗ с помощью генов, клонированных в составе бактериофага коллекции Kochara Y. (коллекция ВНИИ Генетика). Фенотип MetY' был восстановлен после трансдукции фагом Хда, содержащим ген metY , что позволило картировать инсерцию плазмиды в область структурного гена metY. Показано, что передача хромосомных и плазмидных маркеров в экспериментах Plvir трансдукции от донора KmRApR MetY KS721::pKK3 проходила совместно с частотой 25-100%, независимо от генотипа реципиента, что указывает на хромосомную локализацию плазмиды рККЗ в гене metY.

Таблица1. 'Значения частот «спасения маркера» (N2) плазмиды рККЗ в _бактериях E.coli._

Штамм N, ni (n2) n2 Ay ксотроф ность

KS720K RecA 318 x 10"f> 142 (3) 6,5x 10"6 Lys, Ade

KS721K RecA" 5,33 x 10~6 54 (20) 2,0 x 10"6 Met, Lys, Тф

%5097К RecA" 1,1 xlO"6 60 (58) 1,0x10"6 Nad, Ade, His

Х5098К RecA 0,2x10"6 47 (47) 0,2 x 10"6 Lys, Met

Рисунок 3. Структура коиитеграта хромосомы KmRApR£,.c<?// %Х5097 и

плазмиды рККЗ. Bgl II Rrsbp Rrsbp Bgl II

| RSBPi RSBP l MetY

_rVMetY/

FMetY

PCAAAACGAGTAAATTTGCCAC: tgtgaag

acaccta.gttt с aggcgcgg л_

Стрелки с изломом - праймеры Ртйу ,Ктс1У, Яезвр; вертикальные стрелки

указывают положение сайтов рестрикции //, использованных для клонирования интегрированной структуры, буквами на выносе обозначены последовательности нуклеотидов на границе ЯБвР.

Структура коинтеграта 5(5097 рККЗ определена в результате секвениро-вания продуктов ПЦР с праймерами, представленными на рисунке 3

Аналогичные результаты получены нами (см ниже) при элиминации плазмид рККЗ из клеток мутанта recBCsbcR Ecoh в результате их культивирования при 42С°

При выращивании бактерий MetY" h coli на минимальной среде, содержащей 1 мкг/мл метионина, регистрировали реверсии к фенотипу MetY+ Минимальные частоты реверсий (10 9 - 3x108) регистрировали в бактериях Gh&HrecA*recBCsbcB), у5099(recA+rccBCsbcB) и КS72l(recArecBC*sbcB*), а максимальные (2x10"2) в бактериях %5097 (recA recBC sbcli ') Этот результат подтверждает стабилизацию рекомбинантных структур, содержащих RSBP, в RecBCSbcB мутантах или (и) указывает на различия в структуре коинтегратов, сформированных в разных штаммах Е coli

Таким образом, в условиях подавления репликции ппазмиды-донора в бактериях Е coli наблюдается, преимущественно, интеграция плазмиды с хромосомой хозяина Коинтеграт содержит плазмиду, фланкированную двумя прямыми копиями RSBP В pertussis, интегрированную в последовательность гена metY Е coli Структура melY рККЗ типична для коинтегратов, формируемых известными МГЭ (Berger В, Haas D, 2001) Зарегистрированы реверсии мутации MetY" к дикому фенотипу Минимальные частоты реверсий к MetY наблюдали в RecBCSbcB мутантах Е coli

Как продемонстрировано выше, перемещение ТпВР в хромосому Е coli, образование RS-индуцированкых коинтегратов между плазмидами (см ниже), и плазмидой и хромосомой практически не зависит от RecA системы гомологичной рекомбинации Е coli Однако мутации RecBCSbcB кишечной палочки влияют, по крайней мере, на стабильность RS-индуцированных рекомбинантных структур и, в конечном итоге, на регистрируемые в эксперименте частоты транспозиции и образования коинтегратов в Е сок

Согласно современным представлениям фосфоенолпируват-зависимая фосфотрансферазная система (ФТС) имеет непосредственное отношение ко многим сторонам функционирования бактериальной клетки Наряду с другими функциями, она принимает участие в регуляции экспрессии бактериальных генов, в том числе и некоторых генов вирулентности Паралоги ряда генов ФТС обнаружены в хромосоме В pertussis и других бактерий (Deutscher J, Saier VJr, 2005), что делает возможным участие ФТС в регуляции процессов «незаконной рекомбинации», обеспечивающих формирование RSBP-индуцируемых коинтегратов Для изучения зависимости частоты формирования RSBP-индуцированных коинтегратов от ФТС Ecoh нами использована упомянутая выше термоэлиминация плазмид с ColEl репликоном из клеток recBCsbcB Е coli (Basset CL, Kushner SR, 1984) Донором ТпВР служила плазмцда рККЗ, в качестве отрицательного контроля - плазмида pUC4K Результаты эксперимента представлены в таблице 2 Частоту спасения маркеров определяли также, как и в эксперименте по элиминации плазмиды рККЗ с помощью коумермицина Из таблицы 2 видно, что плазмидные маркеры сохраняются в бактериях GA87-3 с

частотой 10 , но не наследуются клетками Е coli GA87 PtsH5 после их выращивания при 42°С (частота « спасения маркера» <10"9) Фенотипическая супрессия мутации ptsH5- выращивание в среде с фруктозой и генетическая супрессия ptsH5 (мутация fruS) - увеличивают частоты «спасения маркера» до значений 10~8 и 5x10"7, соответственно Во втором случае, частота наследования плазмид-ных маркеров близка к частоте, наблюдаемой в клетках дикого типа

Таблица 2. Значения частот «спасения маркеров» плазмиды рККЗ в ptsH+ и ptsH" бактериях Е coli.

Штаммы Генотип Плазмида Частота (N2)

GA87-3 ptsH" рККЗ 106

GA87-4 ptsH* pUC4K <109

GA87-45 ptsH5 pUC4K <10-9*

GA87-35 р1чН5 рККЗ <109

GA87-35 ptsHS рККЗ 10 8 *

GA87-513 ptsH5fruSl рККЗ 5x10"7

* культивирование бактерий на среде с фруктозой

Аналогичные результаты получены при изучении зависимости частоты исключения интегрированной структуры от ФТС Е coli (табл 3) Для этих целей использованы сконструированные нами PtsH+ и PtsH производные штаммов £5097-88, а также PtsH+ и PtsH гаогенные штаммы LBG1623 и LBG1605, содержащие мутантный аллель metY рККЗ События исключения рККЗ из гена metY регистрировали по изменению фенотипа бактерий от MetY KmRApR к Ме-tY+ KmRApR Как видно из таблицы 3 исключение рККЗ из гена metY происходит только в бактериях с фенотипом PtsH' или в условиях фенотипической или генетической супрессии мутации ptsH5 В ряде случаев события перемещения сопровождались не только восстановлением MetY+ фенотипа, но и появлением ауксотрофности по различным аминокислотам, что указывает на возможное внутримолекулярное перемещение плазмиды рККЗ

Таблица 3. Значения частот исключения плазмиды рККЗ в ptsll+ и ptsll" _бактериях E.coh._

Штаммы Генотип Частоты регистрации клонов MetY+KmRApR

£5097-88 ptsll' 2x10"7

%5097-885 plsH5 <10"9

£5097-885 ptsH5 2,5xl0"s*

LBG1623-88 ptsH' 2,5xl0'7

LBG1623-885 ptsH5 <10"9

LBG1623-885 ptsH5 3,lxl0"8*

LBG1156-88 ptsHS fruSl l,3xl0"7

* культивирование бактерий на среде с фруктозой

Для проверки правильности определения структуры коинтеграта (рис 3) проведено клонирование фрагмента BglII хромосомы %5097-88 размером около 10 т п н, содержащего рлазмиду рККЗ в составе последовательности metY Бактериальные клоны Ecoli, содержащие плазмиду ожидаемой структуры, удалось получить только при использовании для трансформации PtsH мутантов Е coli В PtsH+ бактериях плазмида интегрировала в хромосому Таким образом, мутация PtsH стабилизирует не только структуру хромосомы, но и рекомби-нантных плазмид, содержащих RSBP В pertussis Это наблюдение указывает на целесообразность использования PtsH мутантов Е coli для клонирования RS-элементов В pertussis и, возможно, других мобильных генетических элементов Результаты рестрикционного и гетеродуплексного анализа ДНК плазмиды, содержащей фрагмент BglII хромосомы ^5097-88, подтвердили правильность структуры, изображенной на рис 3

Представленные экспериментальные результаты позволяют сделать следующие выводы

- транспозоноподобная структура ТпВР может перемещаться из плазмиды в хромосому Е coli,

- в условиях подавления репликции плазмиды-донора в бактериях Е coli наблюдается, преимущественно, интеграция плазмиды с хромосомой хозяина,

- структура коинтеграта Е coli (metY рККЗ) типична для коинтегратов, формируемых известными МГЭ,

- плазмида рККЗ способна к точному (почти точному) исключению из хромосомы коинтеграта Е coli (metY рККЗ),

- частоты RSBP-индуцируемых интеграции, исключения плазмиды рККЗ, и внутримолекулярного перемещения рККЗ по хромосоме Е coli, зависят от генотипа бактерий,

- частоты RSBP-индуцируемых событий рекомбинации значительно снижены в PtsH мутантах Е coli Фенотипическая или генетическая супрессия мутации ptsH восстанавливает RSBP- индуцируемую интеграцию и исключение рККЗ из гена metY

2 12 2 Картирование открытой рамки считывания, ответственной за синтез транспозазы RSBP Формирование и разрешение RSBP индуцируемых межплазмидных коинтегратов в бактериях Е coli

Определение последовательности RSBP и потенциальных рамок считывания, ответственных за синтез транспозазы, имеющийся набор инсерционных мутантов RSBP позволили перейти к картированию гена, кодирующего транс-позазу RSBP Для этого, были проведены эксперименты, регистрирующие события формирования коинтегратов между плазмидами рМи, рМи5 и рМиб, содержащими интактную и мутантную последовательности ORF1 RSBP (рис 2), и коньюгативной плазмидой pOX38G, содержащей маркер устойчивости к ген-тамицину, а также с хромосомой Е coli Для регистрации событий RSBP-индуцированной интеграции использован описанный выше метод, термоэлиминации плазмид рМи, рМи5, рККЗ и рМиб из клеток recBCsbcB Е coli, и метод

(Galas DJ,Chandler M, 1982), разработанный для анализа межплазмидных коин-тегратов Формирование RSBP-индуцированных коинтегратов между плазми-дами рМи, рМи5, рМиб, рККЗ и плазмидой pOX38G регистрировали в бактериях Pol А Е coli, в которых не возможна репликация плазмид - доноров RSBP(TnBP), содержащих репликон ColEl Разрешение коингефатов pMu(pMu5, рККЗ) pOX38G наблюдали в PolA' бактериях Е coli

Результаты экспериментов, представленные в таблицах 4 и 5 «Спасение маркера» наблюдается только у плазмид рМи, рМи5, рККЗ, содержащих нн-тактную ORF 1 RSBP (определение значения N2 см выше)

Таблица 4. Частоты «спасения маркера» плазмид в бактериях Е coli GA87

Штамм Плазмида (маркер) Частота (N2) Ауксотрофность

GA87-1 рМи (Ашк) 1,5х 10"8 НО

GA87-3 рККЗ (Ктк Арк ) 1,2х 10"6 Met, Lys, Тф Ade,

GA87-4 pUC4K( KmkApk) <юу

GA87-5 рМи5 (КшкАрк) 0,5х10"8 Тф

GA87-6 рМиб (КткАрк) <10'9

Межплазмидные коинтеграты с pOX38G, формирование которых регистрировали по передаче макеров KmR или (и) ApR в скрещиваниях бактерий RecA" Ecoli 1605pOX38G/pMu5(pMu, рККЗ, рМиб, pUC4K) x E coli KS164, также образуются только с плазмидами, содержащими интактную ORF1 RSBP Межплазмидные коинтеграты регистрировали только в бактериях PtsH+ Е coli LBG1605 или в PtsH5 мутантах Е coli в присутствии фруктозы или в результате генетической супрессии мутации ptsH Все KmR трансдуктанты содержали маркер ApR

Таблица 5. Частоты передачи маркеров устойчивости при скрещивании Ree А'Е. coli 1605pQX38G/pMu5(pMu6, рМи, рККЗ, pUC4K)x£ coli KS164

Штамм Донор Основной генотип Частота передачи маркеров

GnR Ктк Ар*

LC839-3 ptsH >eo47pOX38G +рККЗ 2x10"2 3x10"5 НО

1605-1 ptsH5recA~/pOX3 8G+pMu 2x10"2 - <10"у

1605-1 ptsHSrecÄ¡рОХЗ 8G+pMu 1 2x102 - 4x10"6*

1605-3 ptsH5recA'/pOX3 8G+pKK3 2х10~2 ю-7 НО

1605-3 plsH5 recA!pOX3 8G+pKK3 26x102 6х10"5 * но

1605-4 ptsH5recA'/pOX38G+p\JC4K 1 7x102 <10'у но

1605-4 plsII5recÄ/pOX3 8G+pUC4K 2x10"2 <10'9 * но

1605-5 ptsH5recA'/pOX38G+pMu5 1 5x10'2 <109 но

1605-5 ptsH5recA'/pOX3 8G+pMu5 1 5х102 1 бхЮ"6 * но

1605-6 ptsH5recÄ/pOX38G+pMu6 1 4x102 <10 9 но

1605-6 plsH5recA'/pOX3 8G ЬрМиб 1 2x10"2 <10"9* но

* культивирование бактерий на среде с фруктозой, Н О - не определяли

Для плазмиды рМиб, содержащей дефектную ORF1 (рис 2), и плазмиды pUC4K, не содержащей RSBP, «спасения маркеров» и образования коинтегра-тов с плазмидой pOX38G не зарегистрировано

Таким образом, результаты экспериментов, представленные в таблицах 4 и 5, показывают, что события RSBP-индуцированного образования межплазмид-ных коинтегратов и коинтегратов между плазмидой и хромосомой Е coli происходят только при наличии интактной последовательность ORF1 в составе RSBP плазмиды-донора RSBP-элемент, содержащий инсерцию внутри ORF1, утрачивает способность индуцировать образование коинтегратов, что в совокупности с результатами компьютерного анализа аминокислотной последовательности ORF1 (см ниже) указывает на кодирование транспозазы RSBP В pertussis последовательностью ORF1 Образование межплазмидных коинтегратов, коинтегратов между плазмидой и хромосомой, и перемещение интегрированных структур внутри хромосомы, с максимальной частотой наблюдается в клетках Е coli с интактным ptsH аллелем или в условиях супрессии мутации ptsH

Согласно классической схеме межмолекулярной транспозиции МГЭ, на первом этапе могут формироваться коинтеграты, состоящие го двух плазмид -донорной, фланкированной двумя прямыми повторами МГЭ, и реципиентной Продуктами разрешения коинтеграта, обычно, является плазмида донор и плазмида реципиент, содержащая одну копию МГЭ Разрешение коинтегратов может обеспечиваться резольвазами, кодируемыми МГЭ, ферментами гомологичной рекомбинации клетки-хозяина или теми и другими вместе (Berger В, Haas D, 2001)

Для определения структуры коинтеграта и продуктов его разрешения использованы коинтеграты плазмцд pOX38G и рККЗ, полученные в штамме Е coli LC839/pOX38G + рККЗ и переданные в результате коньюгационного скрещивания в PolA мутант Е coli KS 164 Плазмидная ДНК из пяти трансконъюгантов (KS 164-1, KS 164-2, KS 164-9, KS164-11, KS164-14) проанализирована с помощью методов электронной микроскопии и Саузерн-гибридизации Все PolA" трансконьюганты Е coli содержали только одну плазмиду с молекулярным весом большим, чем pOX38G в составе которой, находится только одна копия ТпВР Наличие в коинтеграте только одной копии ТпВР указывает на то, что в образовании коинтеграта, в процессе формирования которого обычно происходит дупликация МГЭ, принимает участие не весь транспозон, а только RSBP Результаты Саузерн-гибридизации фрагментов рестрикции плазмидных ДНК с Р32 меченным RSBP подтвердили этот вывод и выявили интеграцию плазмвды рККЗ в три различных EcoRI фрагмента плазмиды рОХ38 В коинтеграте KS 164-1 обнаружена делеция примыкающей к RSBP последовательности гена traN плазмиды pOX38G

Таким образом, в ходе описанных экспериментов показано, что слияние репликонов рККЗ и pOX38G обусловлено активностью RSBP, и образование коинтегратов с его участием происходит согласно классическим схемам Ре-комбинантная молекула состоит из реципиентной плазмиды pOX38G, донорной плазмиды рККЗ и двух последовательностей RSBP, прямо ориентированных к

другу (аналогично структуре коинтеграта на рис 3) Выявлено три участка интеграции плазмиды рККЗ в плазмиду pOX38G Находясь в составе коинтеграта, RSBP сохраняет способность индуцировать образование делений протяженных сегментов ДНК, прилегающих к сайту интеграции

Для изучения продуктов разрешения коинтегратов использовали описанные выше коинтеграты pOX38G рККЗ Разрешение коинтегратов регистрировали по появлению двух плазмид в бактериях RecA" Е coli Х5098 и RecA* Е coli Х5097 после их скрещивания с донорами Pol" KS164/pOX38G рККЗ ( KS164-1, KS 164-2, KS 164-9, KS 164-11, KS164-14) В скрещиваниях с участием четырех доноров KS164-2, KS164-9, KS164-11, KS164-14 трансконьганты отбирали с частотами около 10"2/клетку донора Как и следовало ожидать, трансконьюган-тов в скрещиваниях с донором KS 164-1, содержащим делецию ira/VpOX38G, не обнаружено В клетках всех трансконьюгантов, независимо от генотипа реципиента, присутствовала «тяжелая» и «легкая» плазмиды «Легкая» плазмида во всех, трансконьгантах, за исключением KS164-2 х Х5097, по размеру и профилю рестрикции совпадала с рККЗ, что позволяет говорить о правильном разрешении коинтегратов независимо от функциональной активности системы гомологичной рекомбинации клетки-хозяина Исходя из традиционных представлений о механизмах разрешения RS-индуцированных коинтегратов, можно ожидать, что плазмида большего размера является вторым продуктом разрешения коинтеграта, и состоит из плазмиды pOX38G и ТпВР или RSBP Для проверки этого предположения проведены скрещивания между различными вариантами доноров X5097/pC>X38G ТпВР и реципиентами Е coli HB 101 и Е coli KS 164 с селекцией по маркеру КпЛпВР или Gm плазмиды pOX38G Полученные результаты, независимо от селективного маркера, выявили стабильное сцепленное наследование маркеров плазмиды рККЗ и pOX38G при скрещивании с обоими реципиентами ДНК «легкой» плазмиды, выделенной из клеток трансконьгантов Е coli HB 101, совпадала по размеру и картине рестрикции с плазмидой рККЗ

Структура «тяжелых» плазмид была установлена при анализе ДНК, выделенной из клеток трансконьгантов PolA'Е coli KS 164 «Тяжелые» плазмиды не отличались от коинтегратов pOX38G рККЗ, независимо от использованного для селекции маркера При разрешении коинтеграта всегда регистрировали плазмиду рККЗ и вторую плазмиду, идентичную исходному коинтеграту

Таким образом, формирование RSBP-индуцируемых межплазмидных коинтегратов и коинтегратов между плазмидой и хромосомой Е coli происходит только при участии рекомбинантных плазмид, содержащих интактную последовательность ORF1 в составе RSBP Этот результат подтверждает вывод о кодировании транспозазы RSBP последовательностью ORF1 Структура коинтегратов соответствует структуре, описанной для коинтегратов ряда известных IS-элементов, однако их разрешение в бактериях Е coli происходит иначе В отличие, например, от IS 1-индуцированных коинтегратов, (Хесин РВ, 1984) продуктами разрешения коинтеграта pOX38G рККЗ является плазмида рККЗ и плазмида, со структурой, не отличающейся от структуры исходного коинтегра-

та. Процесс разрешения и образования RSBP-индуцированных коинтегратов не зависит от RecA системы гомологичной рекомбинации клетки-хозяина

2 12 3 Суперпродукция и функциональная активность транспозазы RSBP В pertussis в бактериях Е coli

Транспозазы некоторых IS-элемнтов выделены и охарактеризованы, в других случаях, проведен анализ последовательностей соответствующих генов и предсказаны домены, обеспечивающие ферментативные функции и их связывание с ДНК (см например, Mahillon J, Chandler М, 1998) Компьютерный анализ открытых рамок считывания RSBP показал, что только последовательность ORF1 может кодировать белок, обладающий характерной для транспозаз структурой Каталитический D139D217E253 домен транспозазы RSBP В pertussis, предположительно, локализован в области 120-290 а к С- конца, а ДНК- связывающий домен - в области 25-115 а к N - конца белковой молекулы Однако, окончательное определение структуры и положения активных центров возможно только в результате экспериментов, определяющих функциональную активность соответствующих мутантных белков Подавляющее большинство транспозаз имеют размер более 200 а к и высокое значение pi от 9,48 у IS3 до 11 85 у IS30 (Mahne Braam LA, Rezmkoff WS, 1998, Stalder R et al, 1990) Расчетная молекулярная масса гипотетической транспозазы RSBP В pertussis составляет ЗбкДа (316 а.к), а ее изоэлектрическая точка определяется значением pl=ll,4, что вполне укладывается в разброс значений соответствующих параметров транспозаз прокариот, определенных экспериментально или теоретически Значения pi и размеры белков, кодируемых двумя оставшимися рамками считывания (ORF2 и ORF3) RSBP составляют pi (4,46 и 12,18) и (133 и 127 а к), соответственно, и не входят в интервал значений, характерных для транспозаз Расчетные характеристики, белка кодируемого ORF1, а также приведенные выше результаты функционального анализа мутантов RSBP позволили заключить, что ORF1 кодирует транспозазу RSBP В pertussis и приступить к конструированию штамма-продуцента

В качестве вектора экспрессии ORF1 RSBP в клетках Е coli выбрана плаз-мида рЕТ32 содержащая Т7 промотор, Т7-терминатор и последовательность, кодирующую полигистидин, предназначенный для очистки рекомбинантных белков на никель - содержащих колонках Так как нами установлено, что ре-комбинантные структуры, содержащие RSBP, более стабильны в клетках ptsH мутанта Е coli LBG1605, клонирование продукта ПЦР, содержащего ORF1 RSBP в векторе pGem проведено в бактериях Еcoli LBGI605 Фрагмент (Ndel-Xhol), содержащий ORF1 в составе плазмиды pGem4, переклонирован в вектор экспрессии рЕТ32 Рекомбинантная плазмида pET320RFl использована для трансформации клеток BL21(DE3) (далее BL21), содержащих ген РНК-полимеразы фага Т7 в составе хромосомы Транскрипция гена РНК-полимеразы обеспечивается индуцибельным Lac-промотором Е coli

Рекомбинантные клетки Е coli BL21/pET320RFl, выращенные в присутствии IPTG, центрифугировали, осадок ресуспендировали и разрушали в дезин-

теграгоре Fisher Sonic Dismembrator 300. Лизат бактерий центрифугировали при 10000 об/мин, супернатант и осадок использовали для электрофореза. Результаты электрофореза суммарных белков из клеток двух независимых клонов £,.co//BL21/pET320RFl, выращенных в условиях репрессии и индукции Lac-промотора, и препаратов растворимой и нерастворимой фракций индуцированной культуры представлены на рисунке 4 а и б. Как видно на рисунках, в условиях индукции, бактерии синтезируют рекомбинантный белок размером 36 кДа (далее р36) (дор. 2, 4 рис. 4 а). Масса белка, синтезированного в условиях индукции, совпадает с ожидаемым размером продукта экспрессии ORF1. Количество рекомбинантного белка достигает 10%-20% от тотального белка клетки. Практически весь белок находится в нерастворимой фракции, по-видимому, в тельцах включения (дорожка 3 рис. 4 б). При культивировании клеток Е.соЧ BL21/ pET320RFl в условиях репрессии Ьас-промотора продукции белка не наблюдается.

Рисунок 4. Электрофореграмма белков бактерий штамма BL21-pET320RFl.

м|

ЬЬ юпм

§Я|

а) б)

а) суммарные белки бактерий, выращенных без добавления 1РТО (дор. 1, 3) и в присутствии 1РТО (дор. 2, 4).

б) растворимая (дор. 2) и нерастворимая (дор.З) фракции бактериальных клеток, выращенных в присутствии 1РТС. Дорожки 1- маркер 14,18, 25, 35,45, 66 кДа.

Несмотря на то, что основная масса белка р36 находится в нерастворимой фракции клеток штамма-продуцента, нами были предприняты попытки выделения очищенной транспозазы Я8ВР для определения её активности в экспериментах т vit.ro. Для этого, растворимую и нерастворимую фракции индуцированных 1РТО бактерий ВЕ21/рЕТ32К8 наносили на колонки, содержащие №-ЫТА агарозу, и после двухэтапной элюции белка буфером с концентрацией имидозола 250мМ рН 5.7 и рН 4,5 анализировали с помощью 808-электрофореза. Хроматография нерастворимой фракции лизатов бактериальных клеток позволила выделить 1,5 мг белка в концентрации 100 мкг/мл, содержа-

щего менее 10% примесей Нам не удалось идентифицировать искомый белок при исследовании растворимой фракции концентрата из 200 мл бактериальной культуры Изменение условий культивирования рекомбинантных бактершЧ Е coli BL21/pET320RFl (температуры, времени инкубации и концентрации IPTG), попытки перевода очищенного белка из денатурированного состояния (в растворе 6М мочевины) в фосфатный буфер (50мМ фосфатного буфера рН7,2 25мМ NaCl, 5мМ ß-меркапгоэтанола) с помощью ступенчатого диализа раствора белка против буферов того же состава, но содержащих меньшую концентрацию мочевины, использование для диализа различных температурных режимов и концентраций белка, сниженных до 10 мкг/мл, не привели к положительному результату

Невозможность определения активности рекомбинантного белка in vitro, потребовала разработки экспериментальной модели для тестирования его активности in vivo в бактериях Е coli штамма-продуцента белка Для этого нами сконструирована система «дефектный RSBP - плазмида-помощник» Транспозицию RSBP, «дефектного» по гену транспозазы, должна обеспечить транспо-заза, кодируемая "плазмидой-помощник" Функциональную активность транспозазы определяли в бактериях штамма-продуцента содержащих RSBP, инак-тивированную инсерцией гена кап, клонированную в составе рекомбинантной плазмцды pVVl (Aps дериват плазмиды рМиб) Интегранты отбирали после индуцированной коумермицином элиминации плазмидной ДНК из клеток BL21/pET320RFl+ pVVl (см выше) Из 100 KmRAps бесплазмидных клонов BL21/pET320RFl + pVVl, 5 клонов проанализированы с помощью Р1то транс-дукции Наличие последовательностей гена кап и RSBP в клетках донора и трансдуктантов подтверждено методом ПЦР, что указывает на интеграцию плазмиды pVVl, содержащей «дефектный» элемент RSBP, или транспозицию «дефектного» RSBP в хромосому BL21

Таким образом, использованная нами система позволила, идентифицировать события интеграции плазмиды pVVl (или транспозиции «дефектного» RSBP) в хромосому клеток BL21/pET320RFl+ pVVl, что указывает на наличие функциональной активности у транспозазы RSBP В pertussis, синтезированной в клетках Е coli

Другим проявлением активности транспозазы является выявленное нами снижение выживаемости рекомбинантных штаммов BL21/pET320RFl в условиях иццукции IPTG Изучение культуральных свойств бактерий рекомбинантных штаммов BL21/pET320RFl показало, что на L- агаре с Ар и ImM IPTG, титр бактерий в 104 раз меньше чем на L- агаре, а выжившие Арк бактерии не способны продуцировать белок р36 Можно предположить, по крайней мере, две причины гибели клеток первая, продукция кодируемого ORF 1 белка нарушает деление клеток и, вторая, подавляет репликацию плазмиды pET320RFl, обеспечивающей синтез ß-лактомазы (Арк)

Эксперименты показали, что бактерии BL21/pET320RFl, выжившие в условиях суперпродукции транспозазы в присутствии антибиотика, сохранили исходную плазмиду pET320RFl и приобрели хромосомную мутацию, нару-

шаюшую синтез транспозазы Результаты, демонстрирующие влияние суперпродукции транспозазы Тп5 на выживаемость бактерий Е coli, опубликованы Yigit Н, Reznikoff WS, 1998 Ими показано, что в условиях суперпродукции транспозазы, выживают бактерии (с частотой 10"4), содержащие одну из четырех хромосомных мутации stk Картированные ими мутации снижают активность транспозазы, но не влияют на уровень ее продукции Обнаруженная нами мутация, напротив, приводит к нарушению синтеза транспозазы и, вероятно, затрагивает ген Т7-РНК-полимеразы

Для определения возможной роли транспозазы RSBP в ингибировании репликации плазмиды pET320RFl проведена оценка выживаемости бактерий BL21/pET320RFl+pMu6 Плазмида рМиб (рис 2) имеет схожую структуру и механизм репликации с плазмидой pET320RFl Эксперименты, проведенные по описанной выше схеме, показали, что выживаемость рекомбинантных бактерий BL21/pET320RFl+pMu6, выращенных в присутствии ампициллина и IPTG, снижалась в 200 раз (а не в 104, как было определено для клеток BL21/pET320RFl) Выжившие клетки содержали только плазмиду рМиб Полученные результаты демонстрируют влияние транспозазы В pertussis на репликацию ColEl плазмид pET320RFl и рМиб в клетках Е coli и выявляют специфическую функциональную активность рекомбинантного белка рЗб, продуцируемого бактериями Е coli

Таким образом, в результате работы, направленной на конструирование продуцента транспозазы и изучение ее свойств, получены следующие результаты

- сконструирован штамм Е coli, продуцирующий функционально - активную транспозазу RSBP В pertussis,

- получены очищенные препараты транспозазы RSBP в растворе 6м мочевины Основная масса транспозазы, синтезируемой бактериями BL21/pETORFl, находится в нерастворимой фракции

- разработана система «дефектный RSBP - плазмида помощник», выявляющая функциональную активность траспозазы в клетках штамма-продуцента Е coli,

- культивирование бактерий BL21/pETORFl в условиях синтеза транспозазы в присутствии антибиотика снижает их выживаемость Выжившие бактерии утрачивают способность синтезировать транспозазу в результате хромосомной мутации

2 12 4 Неопределенность границ повторяющейся последовательности RSBP хромосомы В pertussis

Повторяющиеся последовательности обнаружены в хромосомах всех представителей рода Bordetella Установлено, что помимо IS481(RSBP) и IS 1002 в хромосоме В pertussis Tohama I, присутствует близкая к ним по размеру IS 1663 (Parkhill J et al, 2003) Определение последовательности первых

клонированных копий RS В pertussis, в том числе и RSBP В pertussis 475, показало, что они состоят из 1053 пн, включающих в себя почти совершенные концевые инвертированные повторы размером 28 п н (McPheat W, McNelly Т,

1997) Проведенный нами анализ последовательности хромосомы В pertussis Tohama I выявил высокую консервативность концевых последовательностей IS481(RSBP) Из 238 копий IS481, 181 - содержит совершенный прямой повтор с tag на обоих концах последовательности, у 44 копий - одна из двух последовательностей ctag содержит одну замену, в 13 копиях - по одной замене обнаружено в обеих фланкирующих последовательностях ctag Так как высокая консервативность концевых последовательностей, участвующих в связывании с транспозазой, типична для большинства известных IS-элементов, то правильность определения границ последовательности IS481(RSBP) не вызывала сомнений Не характерным для IS-элементов, являлось отсутствие дупликации последовательностей ДНК-мишени, фланкирующих большинство клонированных разными авторами копий RS-элементов В pertussis Отсутствие дупликаций последовательностей ДНК-мишени может быть связано с особенностью IS481(RSBP) или указывать на неточность определения его границ

Логично предположить, что структура RSBP, в том числе и последовательность концевых нуклеотидов, не зависит от бактерий в которых происходит его перемещение Нами был проведен анализ последовательностей ДНК мишени в сайтах интеграции RSBP в бактериях Е coli и В pertussis

Эксперименты, позволившие зарегистрировать события спонтанной транспозиции RSBP и IS 1002 в специфический сайт cctagg оперона bvgAS В pertussis, описаны в следующем разделе диссертации Д ля настоящего обсуждения важно отметить, что перемещение произошло в сайт cctagg, последовательность которого совпадает с нуклеотидами, отнесенными к IS481(RSBP) Показано, что перемещение RSBP сопровождается дупликацией последовательности cctagg ДНК-мишени

Аналогичные результаты получил S Stibitz (1998), при изучении бактерий В pertussis, выживших в условиях суперпродукции BvgAS Оказалось, что выжившие бактерии содержат инсерцию IS481 или(и) IS 1002 в ctag и gtag сайтах последовательности bvgAS Татке, как и в наших экспериментах, IS-элементы в сайте интеграции фланкированы прямыми повторами соответствующих последовательностей ДНК-мишени

Полученные результаты позволили заключить, что RSBP (IS481) состоит из 1043 п н, включая концевые инвертированные повторы размером 23 п.н, а последовательность NctagN является частью ДНК хромосомы В pertussis В этом случае, приведенный выше анализ последовательностей копий RSBP(IS481), и полученные экспериментальные результаты заставляют не только пересмотреть размер повторяющейся последовательности хромосомы В pertussis, но указывают на высокую специфичность их транспозиции в клетках возбудителя коклюша Последовательность NctagN, предпочтительная для транспозиции RSBP в бактериях В pertussis, содержит терминирующий кодон tag, обеспечивающий терминацию трансляции транспозазы RSBP, кодируемой ORF1 Таким образом, если RSBP имеет размер 1043 п н, то "корректная" тер-минация синтеза кодируемой им транспозазы в бактериях В pertussis наступает в том случае, когда RSBP перемещается в специфический NctagN сайт ДНК-

мишени Это наблюдение указывает на возможность регуляции транспозиции RSBP(IS481) на уровне регуляции синтеза его транспозазы Схожий механизм предполагается для регуляции транспозиции ряда МГЭ Терминирующий кодон отсутствует в последовательности IS240 (Mahillon J, Chandler М, 1998), IS427 (De Meirsman С, Van Soom С, 1990), ISMkl (Munani F et al, 1993), IS870, ISrfl(Fourmer P et al, 1993) Некоторые из них перемещаются в последовательности, содержащие или формирующие терминирующий кодон в результате транспозиции

Подобная схема регуляции может быть реализована и при транспозиции RSBP в бактериях Е coli То есть, если RSBP размером 1043 п н перемещается в бактериях Е coli, сохраняя свои концевые последовательности (tgt аса), то ее способность к последующим перемещениям зависит от наличия в сайте интеграции терминирующего кодона Анализ определенных нами последовательностей на границе RSBP в плазмидах рМК2, pNKl, а также хромосомы коинте-грата melY рККЗ Е coli позволяет сделать следующие выводы

- на границе 3' конца RSBP ( tlcaca) плазмиды рМК2 расположена последовательность cctaac, содержащая триплет taa, способный обеспечить «корректную» терминацию ORF1 RSBP Последовательность cctaac близка к консенсусу NclagN и состоит из нуклеотидов ccta неизвестного происхождения и ас, принадлежащих последовательности гена гроС Нельзя исключить, что последовательность ccta захвачена, как часть последовательности хромосомы В pertussis в процессе клонирования RSBP,

- последовательность pNKl, граничащая с ORF1, не имеет терминирующего кодона Ближайший терминирующий кодон, расположенный в структуре cos-последовательности, находится на расстоянии 34 аминокислоты от концево аминокислоты, кодируемой ORF1,

- на грашще 3' конца RSBP ( ttcacä) в хромосоме metY рККЗ расположены нуклеотиды ccta, совпадающие с нуклеотидами неизвестного происхождения, обнаруженными на границе RSBP плазмиды рМК2. Аналогично описанным выше примерам, первые нуклеотиды gt последовательности metY, дополняют последовательность ccta до канонической cctagt (NctagiN), содержащей терминирующий tag кодон для ORF1 RSBP Однако, в отличие от рМК2, последовательность ccta не могла оказаться в составе рекомбинантной плазмиды в результате клонирования повторяющейся последовательности хромосомы Следовательно, в процессе RSBP индуцированной интеграции плазмиды рККЗ в ген metY Е coli, произошло копирование пограничной последовательности ТпВР, присутствующей в плазмнде рККЗ, возможно, в результате репарации однонитевых брешей, возникающих при разрезании ДНК рККЗ в процессе ее интеграции в ДНК-мишени,

- дупликаций последовательностей ДНК мишени в плазмидах рМК2, pNKl и коинтеграте metY рККЗ не обнаружено,

- делеции, стимулируемые RSBP в бактериях Е coli, могут включать последовательности RSBP и прилегающие участки ДНК-мишени В формировании де-

леций могут принимать участие короткие последовательности, идентичные концевым нуклеотидам RSBP,

- транспозиция RSBP может регулироваться, по-видимому, на уровне регуляции синтеза его транспозазы

Таким образом, в отличие от транспозиции RSBP в бактериях В pertussis, анализ последовательности сайтов интеграции плазмиды рККЗ и участков, примыкающих к концам RSBP, в плазмццах рМК2 и pNKl, сформированных в бактериях Е coli, не позволяет отнести нуклеотиды cclagg к последовательности ДНК-мишени и подтвердить, что размер RSBP составляет 1043 п н Особенный интерес вызывают нуклеотиды ccta, обнаруженные в коинтеграте metY рККЗ и в плазмиде рМК2, которые, с одной стороны, близки к концевым нуклеотидам RSBP размером 1053 п н, а с другой, являются частью последовательности ДНК-мишени, специфичной для перемещения RSBP размером 1043 пн в бактериях В pertussis

Приведенные выше рассуждения основываются на предположении о том, что размер RSBP составляет 1043 п н, расчитанного по результатам анализа участков интеграции RSBP в оперон bvgAS Если принять во внимание более ранние оценки размера RSBP - 1053 п н (McPheat W, 1987), то нуклеотиды ccta следует отнести к концевой последовательности NctagN RSBP Отсутствие последовательности ctag на другом конце RSBP, в составе упомянутых выше ре-комбинантных структур Е coli, объясняется ее делетированием в процессе RSBP-индуцированных рекомбинаций В таком случае, обнаруженная нами в бактериях В pertussis, высокая консервативность последовательностей сайтов интеграции RSBP, обусловлена полной или почти полной идентичностью его концевых нуклеотидов и сайтов интеграции (NctagN) Такая возможность кажется вполне вероятной, хотя и не описана в известных нам источниках литературы

Таким образом, имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные не позволяют сделать окончательный выбор в пользу одной из обсужденных выше возможностей и однозначно определить границы RSBP

2.2. IS- индуцируемая фазовая изменчивость Bordetella pertussis

Одной из характерных особенностей возбудителя коклюша является высокая степень изменчивости его фенотипических признаков т vitro и in vivo Изучению механизмов фазовой изменчивости В pertussis посвящены многочисленные исследования последних десятилетий Были выделены, фазовые варианты, лишенные всех факторов вирулентности в результате мутации сдвига рамки, мелких делеций, инверсий коротких последовательностей и инсерций в опероне bvgAS (Stibitz S, et al, 1989, McGillivray DM et al 1989, Monack D et al 1989) Обсуждалась возможность участия IS Bordetella в формировании авиру-лентных фазовых вариантов В pertussis и В bronchiseptica

Цель настоящего раздела - изучение возможности формирования IS-индуцированных фазовых переходов бактерий В pertussis Определение основ-

ных направлений исследования регуляции и значения фазовых переходов для адаптации бактерий рода Bordetella к условиям обитания

2.2.1. Разработка метода идентификации транспозиции RSBP в бактериях В pertussis

Отсутствие разработанных генетических методов исследования и сложность культивирования бактерий привели к необходимости использования непрямых методов, основанных на идентификации событий перемещения RSBP в специфические участки хромосомы В pertussis, выявленные в предыдущем разделе работы Так как одним из наиболее важных для функционирования и проявления вирулентности бактерий рода Bordetella является оперон bvgAS, сайт CctagG в его структуре выбран в качестве объекта для изучения транспозиции IS-элементов в клетках В pertussis

Рис 5 Структура фрагмента хромосомы содержащего инсерцию RSBP (IS1002) в cctagg саитоперона bvg AS В. pertussis

а) Схема расположения анализируемых последовательностей и праймеров, использованных для анализа структуры ORF1

Вр2 \ K10F K10R

6vj»-locus

б) Фрагмент последовательности продукта ГТЦР (SF-Bp2) ДНК В pertussis 5 cctcgccaaacgcaacaatctcgCCTAGGigigaagaHcaa

в) Фрагмент последовательности продукта ПЦР (Sf-AR) ДНК мутанта В pertussis 5, не обладающего гемолитической активностью

cctcgccaaacgcaacaatctcüCCTAGQg/ga/gfcfcflfl ttagaattcgacaCCTAGc

geegggeat

Последовательности RSBP (б) и IS 1002(в) обозначены курсивом, последовательность оперона bvg - обычным шрифтом и подчеркнута, сайт интеграции обозначен большими буквами (CCTAGG)

События перемещения регистрировали с помощью метода ПЦР. Для этого выбраны праймеры Sf-Ar (рис. 5), фланкирующие CctagG сайт оперона bvgAS, и праймеры, которые могли бы, в сочетаниях с SF и Ar. сформировать продукты амплификации при наличии в популяции клеток бактерий, содержащих искомые интеграции RSBP (рис.5).

Некоторые из возможных сочетаний праймеров и расчетные размеры соответствующих фрагментов амплификации представлены в таблице 6. В качестве матриц для амплификации выбрана ДНК хромосом Bvg~ штаммов В.pertussis Tohama I, В.pertussis 5 и 35, а также авирулентных Bvg" штаммов В.pertussis IV и В.pertussis Tohama 347. Результаты амплификации представлены на рисунке 6.

Таблица 6. Размер расчётных продуктов ПЦР (п.н.) ДНК, содержащей _ к8В1' в сМаця- сайте оперона Ьу%АЯ._

Сочетание праймеров Размер ПЦР продукта 1-ая ориентация RSBP Размер ПЦР продукта 2-ая ориентация RSBP

SF - Вр2 - 236

Sr -К10р 529 -

Sf -K10R - 926

Sf - ar 1779 1779

Рисунок 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР ДНК B.pertussis, выделенных из бактерий. вьшашенных на с neue КУА.

Праймеры Sf-Ar (дор. 1-7), S[.-Bp2 (дор. 8-14); 1,8- Н20; 2,9- В. pertussis Toha-mal; 3,10 -В. pertussis 5; 4,11-Я pertussis 35; 5,12-ß. pertussis IV; 6,13- В. pertussis 347; 7,14 - В. pertussis IVK; 15- Маркер (170, 310, 480, 620, 1570 н.п).

Как видно на рисунке 6, продукты ПЦР (Sf- Ar) всех использованных матриц имеют размер, соответствующий расчетному размеру- 731 п.н. В ПЦР ДНК хромосом Bvg" B.pertussis Tohama I, B.pertussis 5, B.pertussis 35 с прайме-рами SF - Bp2 образуются фрагменты ожидаемого размера 236 п.н. (дор. 9,10, 11) и 926 п.н. с праймерами SF - K10R (результаты не представлены). ПЦР ДНК

хромосом авирулентных Bvg" штаммов В pertussis IV и В pertussis 347 с прай-мерамн Sr - Вр2 и Si - K10R продуктов амплификации не выявила (дор 12 и 13) Продуктов амплификации не обнаружено и в нестед - ПЦР ДНК хромосом авирулентных штаммов (SF-AR - первый этап и Sp - Вр2 - второй этап)

Специфичность продукта ПЦР (SF - Вр2) и (Sr - K10R) размером 236 п и и 926 п н установлена с помощью рестрикции и прямого определеши их последовательностей (рис 5 а, б) (результаты анализа фрагмента 926 п н не представлены) Последовательность фрагмента 236 п н полностью совпадает с расчетной и состоит из двух частей, разделенных cctagg сайтом Слева от cctagg сайта расположена последовательность оперона bvgAS (Х58355), справа - последовательность RSBP (S66929)

Для проверки зависимости частоты перемещения RSBP от состояния оперона bvgAS выполнены эксперименты по идентификации событий перемещения RSBP в бактериях В pertussis IV фазы, содержащих полноценный оперон bvgAS в транс-положении на плазмиде pRVOl Клетки KmR В pertussis IV фазы, содержащие нативный оперон bvgAS в транс-положении, отобраны в результате трансформации бактерий В pertussis IV фазы плазмидон pRVOl (Вpertussis IVK) Определение видоспецифических агглютиногенов и JICA коклюшного токсина бактерий В pertussis IV и В pertussis IVK указывали на восстановление Bvg+ фенотипа в бактериях В pertussis IVK Результаты электрофореза продуктов ПЦР ДНК В pertussis IVK, представленные на рисунке 6 (дор 7, 14), показывают, что комплементация мутантного оперона bvgAS в транс-положении восстанавливает способность к перемещению RSBP в клетках В pertussis

Таким образом, нами разработана система регистрации событий транспозиции RSBP в cctagg сайг оперона bvgAS В pertussis События перемещения RSBP в бактериях В pertussis наблюдаются только при наличии интактного оперона bvgAS В возбудителе, хромосома которого содержит мутантный оперон bvgAS, события перемещения RSBP не регистрируются Способность к перемещению RSBP восстанавливается в результате комплементации мутантного оперона bvgAS в транс-положении

2.2.2. Перемещение RSBP в оперон bvgAS В pertussis зависит от присутствия MgSC>4 в среде культивирования бактерий.

Представленные в предыдущем разделе экспериментальные результаты позволяют охарактеризовать перемещение RSBP в клетках В pertussis как bvg -регулируемый процесс В таком случае, по аналогии с другими bvg- зависимыми характеристиками бактерий Bordetella, такими как токсичность, гемаглюти-нирующая активность и т д (см выше), перемещение RSBP может зависеть от модулирующих факторов (MgSC>4 и никотиновой кислоты) Для проверки такого предположения нами отобраны отдельные бактериальные колонии В pertussis Tohama I, выращенные на среде КУА Каждую их этих колоний трижды пересевали на среде КУА и КУА+ MgSC>4 Для анализа использовали также KmR трансформанты В pertussis IVK, отобранные на среде КУА и КУА+ MgSC>4 и расчищенные на соответствующих питательных средах Результаты

ПЦР анализа ДНК выделенных из бактерий В pertussis Tohama I и В pertussis IVK, проведенного по описанной выше схеме, выявили инсерцию RSBP в опе-роне bvgAS в бактериях, выращенных на КУА+ MgSO,*, и не обнаружили ин-серции в хромосоме бактерий, выращенных на среде КУА без MgS04 Нестед -ПЦР (праймеры Sf-Ar и Sr-Bp2) ДНК бактерий, выращенных в немодули-рующих условиях, идентифицировала искомые продукты, специфичность которых доказана с помощью рестрикции и определения нуклеотидной последовательности Полученный результат указывает на увеличение частоты транспозиции RSBP при культивировании бактерий в присутствии MgSCXi

Для определения соотношения между количеством копий мутантных (содержащих инсерцию RSBP в cctagg сайт оперона bvgAS) и не мутантных хромосом в препарате ДНК бактерий В pertussis Tohama I, выращенных в модулирующих условиях, проведена ПЦР с праймерами Sf-Ar и Sp-Bp2 серии 10-кратных разведений ДНК хромосомы, одного из охарактеризованных выше клонов Положительный сигнал амплификации ДНК с праймеров Sf- Ar фиксируется вплоть до 7-го разведения матрицы (Kj), тогда как ПЦР с праймеров SF-Вр2 - только до 3-4-го разведения (Кг) Зная, что специфический фрагмент 731 п н (Sf-Ar), должен формироваться при участии каждой копии хромосомной ДНК, тогда как фрагмент 236 и н (SF-Bp2) формируется только на ДНК, содержащих инсерцию RSBP, соотношение K2/Ki = 10" -Ю'4 можно использовать в качестве оценки относительного количества молекул ДНК хромосом, содержащих инсерцию RSBP в cctagg последовательность оперона bvgAS, или частоты перемещения RSBP в cctagg сайт оперона bvgAS Значения, полученные в аналогичных экспериментах для бактерий В pertussis 5 и 35, составили около 10"2-10"3

Таким образом, установлено, что в процессе размножения клеток вирулентных бактерий В pertussis in vitro, наблюдается внутрихромосомное сайт-специфическое перемещение RSBP, сопровождающееся инактивацией оперона bvgAS возбудителя коклюша и переходом бактерий в авирулентное состояние Авирулентные bvg- мутанты В pertussis не способны поддерживать внутримолекулярное перемещение RSBP Присутствие MgSQi в среде культивирования повышает частоту перемещения RSBP

Выявленная нами зависимость транспозиции от функционирования генов оперона bvgAS возбудителя коклюша и содержания MgS04 позволяют провести некоторые аналогии с регуляцией транскрипции гена bipA, экспрессирующего-ся в промежуточной фазе микроорганизмов рода Bordetella (Wilhams CI et al, 2005) Можно предположить, что регуляция транспозиции RSBP в бактериях В pertussis осуществляется на уровне регуляции транскрипции его транспозазы за счет изменения концентрации фосфорилированного регулятора транскрипции BvgA При больших концентрациях белка BvgA транскрипция ORF1 подавляется, при малых усиливается Регуляция транскрипции может происходить в результате взаимодействия фосфорилированного белка BvgA с РНК-полимеразой и специфическими участками RSBP Полное подавление синтеза белка BvgA в результате мутации в опероне bvgAS нарушает не только репрес-

сию, но и активацию транскрипщш транспозазы Предлагаемая схема регуляции транскрипции транспозазы RS-элементов В pertussis объясняет существующие экспериментальные результаты и выглядит привлекательной для понимания механизма сдерживания транспозиций множественно повторяющихся IS-элементов в хромосоме В pertussis Дополнительным фактором, работающим на понижение уровня активации транскрипщш многократно повторенных копий гена транспозазы, может быть отсутствие в структуре RSBP канонических последовательностей для связывания BvgA с зоной активации транскрипщш bvg - регулируемых генов Последовательность RSBP, расположенная выше стартового кодона ORF1, содержит только одну вырожденную последовательность АТТСААТ, похожую на консенсус Т/А)ТТ(С/Т)ТА Вырожденность предполагаемого участка связывания может привести к снижению аффинитета и уменьшению константы связывания BvgA, по крайней мере с участком, необходимым для активации промотора

2.2.3. Выделение IS индуцируемых фазовых вариантов В pertussis. В настоящее время практически отсутствует информация о природе упомянутых выше авирулентных или частично вирулентных мутантов В pertussis, выделенных от больных детей на разных стадиях заболевания или in vitro Исключение составляют, упомянутые выше спонтанные авирулентные мутанты оперона bvgAS В pertussis и В bronchiseptica, отобранные in vitro (Stibitz S, 1989, Monack DM, 1989 и McGillivray DM, 1989)

Изложенные в настоящей работе результаты позволили сформулировать подход к выделению и анализу мутантов В pertussis, возникших в результате инсерции RSBP в гены, кодирующие факторы вирулентности возбудителя коклюша в процессе культивирования бактерий in vitro

Для выделения бактерий, содержащих инсерцшо RSBP в оперон bvgAS, культуру вирулентного штамма В pertussis 5, пересевали на среде КУА + MgS04 и рассевали до отдельных колоний на среде БЖ, содержащей 10% де-фибринированной крови барана Колонии, лишенные зон гемолиза, могут возникать в результате мутаций в опероне bvgAS или в генах гемолизинов Среди 700 проанализированных колоний выявлено 10, не содержащих зон гемолиза Бактерии, лишенные гемолитической активности, протестированы на присутствие активности термолабильного токсина на наличие факторспецифических агглютиногенов («Материлы и методы») Все проверенные мутанты лишены активности TJIT и агглютиногенов 1,2,3 Так как экспрессия генов агглютиногенов, гемолизинов и ТЛТ регулируются с помощью оперона bvgAS (см выше), можно ожидать, что отобранные клоны содержат мутацию в опероне bvgAS ДНК из 5 проверенных бактериальных колоний проанализирована с помощью ПЦР Электрофорез и определение нуклеотидной последовательности двух продуктов ПЦР выявили инсерцию IS 1002 и дупликацию специфической последовательности CctagG оперона bvgAS (рис 5в) Секвенированная нами последовательность IS 1002, идентичная ранее определенной последовательности IS 1002 (van der Zee, A et al 1996), имеет 60,5% гомологии с последовательно-

стью RSBP(IS481) и содержит открытую рамку считывания ORF1, кодирующую транспозазоподобный белок tnpA размером 214 аминокислот Первые 130 аминокислот tnpA IS 1002 на 58% идентичны соответствующему фрагменту транспозазы RSBP и содержат характерный ДНК-связывающий мотив В структуре tnpA IS 1002 нет ярко-выраженного каталитического DDE-домена, характерного для транспозазы RSBP и большинства известных ферментов транспозиции бактерий, что само по себе не означает отсутствие необходимой каталитической активности у белка InpA IS 1002 Наличие шести консервативных копий IS 1002 в геноме В pertussis указывает на значимость ее последовательности для кодирования белков транспозиции Возможно, транспозицию IS 1002 обеспечивает ДНК-связывающий домен tnpA IS 1002 и DDE-домен транспозазы RSBP(IS481) или только транспозаза RSBP Идентичность концевых нуклеотидов и значительное сходство инвертированных терминальных повторов IS 1002 и IS481 (80%), могут свидетельствовать в пользу такого предположения

Таким образом, нами установлено, что перемещение RSBP(IS481) и IS 1002, наблюдаемое в бактериях В pertussis, содержащих интактный оперон bvgAS, может привести к инактивации оперона bvgAS возбудителя коклюша Выделены мутантные клоны бактерий В pertussis 5, хромосома которых содержит инсерцию IS 1002 в cctagg сайте оперона bvgAS

2.2.4. Оперон bvgAS влияет на транспозицию RSBP в Pis мутантах E.colL

Как следует из материала изложенного в предыдущих главах, оперону bvgAS и IS-элементам принадлежит важная роль в регуляции вирулентности и изменчивости возбудителя коклюша Регуляция экспрессии ¿^-зависимых генов, число которых постоянно возрастает по мере накопления информации о возбудителе, осуществляется на уровне регуляции их транскрипции Регулятор транскрипции BvgA связывается с операторами промоторной зоны регулируемого гена Белок BvgS - АТФ-зависимая фосфокиназа, фосфорилирует белок BvgA, сообщая ему возможность специфического связывания с операторной областью гена и РНК полимеразой (Cotter PA, Miller JF, 2001) Нами установлено, что в клетках Е coli и В pertussis события RS-индуцированной рекомбинации зависят от функционирования ФТС и bvgAS, соответственно Несмотря на значительные отличия в функционировании и назначении ФТС и двухкомпо-нентной регуляторной системы BvgAS в клетках Е сок и В pertussis, они имеют ряд общих характеристик Ключевым этапом их работы является передача фосфата на белки-мишени, которые в свою очередь, участвуют в обеспечении транспорта углеводов (в Е coli) и регуляции экспрессии большой группы бактериальных генов (Е coli и В pertussis) (Гершанович ВН 2003, 2004, Cotter РА, Miller JF, 2001) Участие компонентов ФТС в событиях RS-индуцированной рекомбинации в бактериях Ecoli и сходство некоторых характеристик ФТС и двухкомпонентной регуляторной системы BvgAS, позволили предположить, что экспрессия оперона bvgAS в Pts" мутантах Е coli может привести к восстановлению транспозиции RS-элементов в мутантных бактериях Е coli

Для шучения RS -1гиду ш tpyе мой интеграции использованы произодные плазмнды рМТ2, не способные реплицироваться в бактериях Е coli при температуре выше 35°С и содержащие маркер устойчивости к Km (Greated А, 2000) Рекомбинантные плазмнды включали в себя сконструированные нами варианты ТпВР, маркированные генами устойчивости к Cm (TnBP-Cm) и Тс (ТпВР-Тс) Интеграцию плазмид рМТ TnBP-Cm и рМТ ТпВР-Тс в хромосому Е coli изучали на изогенных бактериях Е coli дикого типа LBG1623, KmR мутанте PtsI LBG1623-I3 и CmR мутанте PtsH LBG1623-H7 События интеграции регистрировали по появлению CmR или TcR клонов бактерий, после культивирования на селективном L-arape при температуре 42°С (в дальнейшем TR клоны) по схеме, аналогичной использованной нами ранее Частоту интеграции определяли, как и раньше, по отношению числа TR бесплазмидных клонов к числу взятых в эксперимент живых бактерий Некоторые TRCmR или TRTcR бесплазмидные клоны проверяли на наличие гена кап плазмиды рМТ2 (ген устойчивости к канамици-ну в составе хромосомы PtsI LBG1623-I3 отличается от гена кап плазмиды рМТ2) и последовательности RSBP с помощью ПЦР Все они содержат искомые последовательности, что свидетельствовало об интеграции плазмид рМТ TnBP-Cm и рМТ ТпВР-Тс в хромосому рекомбинантов Результаты экспериментов представлены в таблице 7

Таблица 7. Значение частот «спасения маркеров» в бактериях E.coli

Штамм Генотип Плазмида Частота

LBG1623-2 PtsH", Кшк pMT2 >10"8

LBG1623-2ТС PtsH", KmRCmR pMT2 TnBP-Cm 2,5xlO"J

LBG1623-I32TC PtsI, Km" Cm" pMT2 TnBP-Cm 2.5X10"4

LBG1623-Н72Т PtsH7, KmRTcR pMT2 TnBP-Tc l,3xI0"6

LBG1623-13 2 V Ptsl+, Km" CmKApR pMT2 TnBP-Cm+pDM20 2x10"J

LBG1623-H72V PtsH7+, KmR TcKApK pMT2 TnBP-Tc + pDM20 l,lxl0"2

Из таблицы видно, что мутация PtsH7 привела к выраженному снижению частоты интеграции плазмиды рМТ ТпВР-Тс, в сравнении с Pts+ бактериями Примерно такое же снижение частоты интеграции плазмиды рККЗ наблюдалось в точечном мутанте PtsH5 LBG1605 по сравнению со штаммом дикого типа LBG1623, что вполне ожидаемо, так как обе мутации затрагивают ген ptsH и отличаются только типом мутации Если хромосома PtsH5 LBG1605 содержит две точечные мутации в гене ptsH (Большакова Т Н, личное сообщение), то мутация PtsH7 LBG1623 представляет собой делецию части последовательности гена ptsH и инсерцию гена cad (см «Материалы и методы) Инсерционная му-

тация в гене ptsí (Datsenko К, личное сообщение), кодирующем фермент I, приводит к менее значительным снижениям частот интеграции Вероятно, это связано с тем, что мутация PtsH7 нарушает транскрипцию всего оперона pis, тогда как инсерция в ген ptsí, только структуру и экспрессию гена ptsí

Внесение оперона bvgAS в Pts мутанты бактерий Е coli, в составе плазмиды pDM20 (Kanmova G Pasteur Inst, France), восстанавливает их способность к поддержанию RSBP-индуцированной интеграции рекомбинантных плазмцд в хромосому Частота RSBP-индуцированной интеграция рМТ TnBP-Cm в мутанте Pts I в присутствии плазмиды pDM20 возросла до значений, определенных для штамма дикого типа, а в мутанте PtsH7/pDM20 частота интеграции даже превзошла соответствующее значение для штамма дикого типа

Представленные экспериментальные результаты укладываются в сформулированную ранее гипотезу о регуляции транскрипции гена транспозазы с помощью белков ФТС и BvgAS Можно предположить, что ФТС обеспечивает фосфорилирование некоего регуляторного белка Е сок, участвующего в транскрипции транспозазы В Pts мутантах Е coli фосфорилирование регулятора нарушается, а транскрипция транспозазы снижается, что проявляется в снижении частот наблюдаемых RS-индуцируемых рекомбинационных событий В Pts мутантах Е colt, содержащих оперон bvgAS в транс-положении, фосфорипирован-ный белок BvgA обеспечивает транскрипцию гена транспозазы, заменяя, по-видимому, фосфорилированный регулятор транскрипции, функционирующий в бактериях дикого типа, и не активный в Pts мутантах Е coli

Таким образом, мутации по генам ptsí и ptsH в разной степени снижают частоты RSBP-индуцируемых интеграций плазмид в хромосому Е colt Способность к интеграции восстанавливается в мутантах, содержащих оперон bvgAS в транс-положении

2.2.5. Биологическое значение событий инсерцноиой инактивации оперона bvgAS в бактериях B.pertussis Новый подход к регистрации фазовой изменчивости возбудителя коклюша in vitro и in vivo Коклюш - острое, респираторное инфекционное заболевание, с высокой летальностью у детей первого года жизни Предполагается, что вспышки коклюша у восприимчивых к возбудителю новорожденных обусловлены носитель-ством (персистенцией) бактерий В pertussis у детей старшего возраста и взрослых, являющихся источниками инфекции Обследования длительно кашляющих взрослых и подростков выявили от 12% до 52% носителей возбудителя коклюша (Matttoo S, Chery JM, 2005)

Совместно со специалистами «Консультативно - диагностической поликлиники Медицинского центра Управления делами Президента Российской Федерации» проведены обследования детей с симптомами коклюша и острых респираторных инфекций (ОРЗ) Выявление возбудителя проводили методом дотг-гибридизации нерадиоактивного зонда, представлявшего собой ДНК RS BP с ДНК, выделенной из смывов с назофарингеальных мазков от детей разных возрастных групп Контролем служили традиционные исследования - бак-

териологический аиалга посевов, клинические обследования и серологические исследования крови для выявления антител к возбудителю коклюша, аденовирусов, энтеровирусов, вируса гриппа А и В, парагриппа 1, 2, 3, выполненные в лаборатории Медицинского центра Управления делами Президента Российской Федерации в соответствии с действующими инструкциями

Аналогичные исследования проведены совместно со специалистами ЗАО НПО «Лагис» с использованием метода ПЦР Обследования проводили в детских садах (№ 213 и 272) и поликлиниках (№ 103, 111, 63, 81 и 97) Юго-Западного округа Кроме того, методом ПЦР обследовано 89 детей (52 ребенка с длительным кашлем и 37 практически здоровых ребенка), обратившихся за консультативной помощью к сотрудникам группы молекулярной биологии патогенных микроорганизмов ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалей РАМН в 19982006гг Результаты обследования представлены в таблице 8

Таблица 8. Результаты исследования смывов назофарингеальных мазков от детей с помощью метода ДНК гибридизации (ДНК Г, 1-й эксперимент) и __ПЦР (2-ой эксперимент). _

Состояние Количество об- Количество детей с ла- Количество положи-

обследован- следованных бораторно подтвер- тельных результатов

ных детей жденным диагнозом обследования

1 2* 1 2* ДНК Г ПЦР*

Коклюш 69 - 24 (40%) - 56(81%) -

ОРВИ 54 38 (70%) - 20 (37%) -

Здоровые 58 82 - - 5 (8,6%) 6 (7,3%)

дети

Длительный - 106 - - - 31 (30%)

кашель

Всего 181 188

* объединены все исследования с помощью метода ПЦР

Из таблицы 8 видно, что в группе детей с клиническим диагнозом коклюш, методом ДНК-гибридизации возбудитель выявлен в 81% случаев, в сравнении с 40% случаев, зарегистрированных с помощью бактериологического метода. Положительная реакция ДНК- гибридизации, обнаружена при обследовании 37% детей с диагнозом ОРЗ, что, скорее всего, указывает на смешанную вирусную и коклюшную инфекцию 82 длительно кашляющих ребенка и 106 «практически здоровых» детей обследованы с помощью разработанной нами ПЦР тест-системы (см ниже) ДНК возбудителя коклюша обнаружена в назофарингеальных мазках у 31% и 7,3% длительно кашляющих и здоровых детей, соответственно, что совпадает с результатами зарегистрированным нами с помощью метода ДНК-гибридизации Heininger U et al, 2004 выявили ДНК В pertussis у 5,3% пациентов контрольной группы, не имеющих симптомов коклюша в момент обследования Обнаруженные отличия в цифрах нельзя считать

значимыми из-за малого числа выявленных положительных результатов Присутствие ДНК В pertussis у практически здоровых людей может указывать на бактерионосительство или быть связано с начальной стадией или атипичной формой коклюша, по крайней мере, у некоторых из обследованных пациентов Из представленных в таблице результатов следует также, что разработанная нами тест-система для выделения ДНК В pertussis методом ПЦР обнаружила возбудитель коклюша более чем у 30% длительно кашляющих детей

Таким образом, коклюш может проявляться в стертой форме и протекать под маской ОРЗ у детей и взрослых с длительным кашлем (5-7)% практически здоровых и более 30% длительно кашляющих детей являются носителями возбудителя коклюша Носители могут быть источниками заражения не иммунизированных детей и взрослых, прежде всего иммунодефицитных людей

Механизмы перехода бактерий в состояние носительства не установлены Предполагается, что носительство формируется в результате переживания бактерий внутри эукариотических клеток, длительность которого зависит от состояния вирулентности бактерий Нами показано, что регуляция генов вирулентности В pertussis может быть нарушена в результате инсерции IS-элементов в оперон bvgAS Частота перемещения IS-элементов в оперон bvgAS и другие специфические сайты хромосомы В pertussis in vitro, зависит от условий культивирования возбудителя и функционирования оперона bvgAS Результаты ряда исследователей, указывают на увеличение времени переживания в эукариотических клетках бактерий В pertussis, мутантных по генам аденилат-циклазы (Gueirard Р, 1998) Это позволяет предположить, что инактивация в результате инсерции IS-элементов в оперон bvgAS или других генов вирулентности, может быть пусковым механизмом перехода бактерий в состояние переживания или персистенции Так как на первом этапе взаимодействия происходит адгезия бактерии к эукариотической клетке, то изменение ее фазового состояния, способствующее переживанию, скорее всего, происходит после проникновения бактерии в клетку хозяина Точное исключение IS-элемента, восстанавливающее экспрессию гена(ов) вирулентности, может привести к апоптозу, гибели эукариотической клетки, освобождению вирулентной бактерии и развитию инфекционного процесса в организме-хозяине или передачи возбудителя новому реципиенту Альтернативой внутриклеточному переживанию, может быть переживание бактерий в биопленках, возможность формирования которых установлена для бактерий В bronchiseptica, находящихся в промежуточной фазе Bvg1 (Mattoo МН, Yuk К, 2004) Механизмы перехода бактерий в промежуточную фазу in vivo не установлены, что не позволяет исключить участие в этом процессе IS-элементов Bordetella Увеличение частоты транспозиции IS-элементов может быть индуцировано факторами организма-хозяина, попаданием бактерии во внешнюю среду или воздействием других факторов, связанных, например, с применением средств лекарственной терапии заболевания

Полученные результаты позволяют разработать методы регистрации не только инсерционных Bvg" мутантов В pertussis, но и бактерий, содержащих инсерцию IS-элемента в гены, кодирующие различные факторы вирулентности

возбудителя коклюша (KT, ФГА, и т д), и открывают новые возможности для исследования фазовых состояния бактерий В pertussis в клиническом материале на разных стадиях заболевания Информация о структуре генов вирулентности т vivo позволит установить значение кодируемых ими продуктов для развития инфекции и перехода бактерий в состояние переживания (персистенщш)

2 3 Выделение и характеристика новых бактериофагов и определение лнзогенностн микроорганизмов рода Bordetella

Результаты, изложенные в предыдущих разделах, подтверждают значимость IS элементов в изменчивости и регуляции вирулентности возбудителя коклюша К МГЭ относятся и умеренные бактериофаги Лизогенизация бактерий может привести к изменениям их свойств, в том числе и вирулентности Изменение вирулентности достигается в результате прямого переноса факторов пато-генности, например генов токсинов, или является следствием более сложных событий, изменяющих поверхностные антигены бактериальной клетки (Hendrix RW, 1999)

В настоящее время перечень бактериофагов микроорганизмов рода Bordetella ограничен фагами, выделенными в НИИЭМ им Н Ф Гамалеи из бактерий коллекции ВОЗ и клинических штаммов, а также бактериофагами ВРР-1, ВМР-1 и BIP-1 В bronchiseptica, проявляющими различный тропизм к бактериям в разных фазовых состояниях (Liu М et al, 2004), и двумя бактериофагами В avium В1 и В2, способными к генерализованной транедукции (Shelton С В, et al, 2000)

В настоящей работе описаны новые бактериофаги фТ и фК, изолированные из международного штамма вирулентных бактерий В pertussis Tohama I, и бактерий 662.2, полученных в результате конверсии бактерий В parapertussis 17903 бактериофагом В pertussis 134 Проведен сравнительный анализ структуры геномов бактериофагов фТ и фК и ранее изолированных бактериофагов 134 и 41405 - В pertussis и 214 -В bronchiseptica Выявлены особенности лгаогении и конверсии бактерий рода Bordetella

Бактериофаги фТ и фК морфологически идентичны друг другу и ранее охарактеризованным фагам В pertussis 134, 41405 и 214 В bronchiseptica Диаметр икосаэдрической головки составляет (49,5±0,5)н м Бактериофаги имеют хвостовой отросток длиной (145±7) н м, толщиной (8,7+0,8) н м с внутренним каналом (2,0 ± 0,2)н м Хвостовой отросток состоит из 37-40 соединенных друг с другом сегментов, на которые он легко фрагментируется Сегменты имеют розеткообразную структуру диаметром (11,0±1,0)нм Розетки образованы 6-7 субъединицами и соединены с соседними розетками на расстоянии порядка 15 н м друг от друга

Результаты электронно-микроскопического анализа ДНК бактериофагов В pertussis 134, 41405, фТ и В bronchiseptica 214 показали, что их популяции ге-терогенны и содержат гомологичные ДНК размером (37 ±2)т п н, отличающиеся друг от друга одной или двумя инсерциями размером около 1 т п н Геном

бактериофага фК размером (41± 3)т п н циркулярно гтермутирован, так же как и геномы бактериофагов ВРР-1, ВМР-1 и BIP-1, и не гомологичен ДНК других фагов Пермутированноеть генома фК указывает на его способность к генерализованной трансдукции

Саузерн-гибридизация ДНК бактериофагов фТ, 134 с хромосомами бактерий-хозяев и других бактерий рода Bordetella, а также ДНКфК с хромосомами разных штаммов В parapertussis не обнаружила фаговых геномов в структуре хромосом, что указывает на преимущественно внехромосомную локализацию геномов фТ, 134, 41405, 214 во всех изученных бактериях Bordetella и фК в бактериях В parapertussis В пользу такого предположения говорят результаты дотт-гибридизации, обнаружившей 1 на 500-700 отдельных колоний бактерий-хозяев, содержащих ДНК бактериофагов А также результаты анализа последовательности участка ДНК, являющейся сайтом интегрирации генома профага ВРР1 в хромосому В bronchiseptica RB50 Сопоставление последовательностей (Liu М, Gingery М, Doulatov S R et al, 2004) и В bronchiseptica RB50 (EMBL ВХ470250) не выявило профага ВРР1 в хромосоме Таким образом, два разных коллектива авторов, определяя последовательность ВРР1 в хромосоме В bronchiseptica RB50, получили принципиально разную информацию об участке интеграции профага С нашей точки зрения, это можно объяснить только тем, что авторы имели дело с разными клонами возбудителя, один из которых оказался лизогенным Можно ожидать, что выделение такого лизогенного клона является достаточно редким событием как для штамма В bronchiseptica RB50, так и для штаммов В pertussis ¡34, Tohama I, В bronchiseptica 214 и В parapertussis 17903 Низкая степень лизогенизации бактерий рода Bordetella может быть связана с потерей фагового генома, находящегося, скорее всего, в состоянии линейной плазмиды

Саузерн-гибридизация Р32 меченной ДНК бактериофага 134 В pertussis выявила гибридизацию только с одним фрагментом Pstl рестрикции ДНК хромосом конвертантов В parapertussis 662.2 (рис 7а) Размер фрагмента (около 7 т п н ) указывает на то, что только часть фагового генома интегрирует в хромосому бактерии в процессе лизогенизации Бактерии конвертантов, резистентные к фагу 134, приобрели специфические агглютиногены, летальную токсичность, способность размножаться в мозговой ткани мышей и так далее, характерные для вирулентных бактерий В pertussis (Лапаева И А идр 1982) Можно предположить, что в процессе лизогенизации клеток конвертанта принимают участие IS-элементы бактерий Bordetella Возможно, фрагмент генома фага 134, фланкированный IS-элементами, перемещается в хромосому В parapertussis, тогда как основная часть генома остается в свободном состоянии и утрачивается популяцией бактериальных клеток Каким образом, перемещение небольшого фрагмента фаговой ДНК в хромосому В parapertussis приводит к значительным изменениям свойств возбудителя паракоклюша, предстоит выяснить

Результаты Саузерн - гибридизации ДНК хромосом В parapertussis 17903 и 594, двух независимых конвертантов 662 2, авирулентного мутанта В pertussis IV и вирулентных бактерий В pertussis 134, Tohama I, 3865, а также бактерий

B.bronchiceptica 8220, W, ЗК, выделенных от свиней в хозяйствах СССР, с меченой Р" ДНК фага фК представлены на рисунке 76.

Рисунок 7. Саузерн-гибридизация Р32 ДНК бактериофага 134 (а) и Р32 ДНК фК1 (б) с хромосомами бактерий рода Bordetella.

a) Pstl фрагменты рестрикции B.parapertussis 17903, B.pertussis 134 (дор. 1 и 2), B.parapertussis 662-2О), 662-2(2) и 662.2(2) при двойной дозе фермента (дор.З, 4 и 5). Маркер (дор. 6): 23,7; 9,5; 6,7; 4,3 т.п.н..

б) EcoRI фрагменты рестр!жции ДНК бактериофага фК1 (дорожка 1) и хромосом B.parapertussis 662_2(1) и 662-2(2) (дор. 2 и 3), В. parapertussis 504 (дор. 4), 17903 (ДНК дор. 5, 11 и 13), B.bronchiceptica 214, W, ЗК (дор. 6-8), 8220 (дор. 9 и 10), B.pertussis IV (дор. 12), 134(дор.14),ТоЬата1 (дор. 15), 3865 (дор. 16).

Сравнение профилей гибридизации фрагментов EcoRI рестрикции ДНК хромосом различных видов бактерий рода Bordelell с ДНК фК, представленных на рисунке 76 (дор. 2-16), позволяет сделать следующие заключения:

- ДНК фК гибридизуется с ДНК хромосом всех исследованных возбудителей рода Bordetella кроме B.parapertussis;

- картины гибридизации ДНК хромосом B.bronchice ptica 214, W, ЗК (дор. 6-8) близки к картине гибридизацшг ДНК 662.2 (дор. 2,3), что указывает на одинаковую локализацию генома профага в хромосомах бактерий;

- характер изменения картины гибридизации ДНК хромосом независимых клонов B.bronchiceptica 8220 (дор. 9, 10) по отношению к гибридизации ДНК 662-2 указывает на одинаковую локализацию геномов профагов и на наличие мутаций в структуре профага B.bronchiceptica 8220;.

- картина гибридизации ДНК хромосомы B.pertussis 3865 (дор. 16) указывает на то, что геномы профагов 3865, W, ЗК, 214 и 662_2 не идентичны, хотя и имеют

протяженные участки гомологии, локализованные, скорее всего, в различных участках хромосомы бактерий,

- характер гибридизации ДНК хромосом В pertussis 134 и Tohama I (дор 14 и 15) свидетельствует о значительных отличиях геномов профагов этих штаммов бактерий от профагов В bronchiceptica 8220, W, ЗК, 214, В pertussis 3865 и кон-вертанта 66 2 2,

- выявлено значительное отличие между картинами гибридизации ДНК хромосом В pertussis IV, 134, Tohama I Профиль саузерн-гибридизации фрагментов хромосомы авирулентного штамма В pertussis IV (дор 12) ближе к гибридизации хромосомы В bronchiceptica 8220 (дор 9,10), чем к профилю гибридизации вирулентных штаммов В pertussis Tohama I или 134 (дор 14, 15)

Результаты, полученные при изучении выделенных нами и охарактеризованных ранее бактериофагов и лизогенности бактерий рода Bordetella, позволяют сделать следующие выводы

- бактерии, по крайней мере, двух представителей рода Bordetella -В pertussis и В bronchiseptica полилизогенны Геном одного из двух идентифицированных профагов находится в составе хромосомы клеток-хозяев Второй профаг, скорее всего, находится в автономном состоянии и утрачивается значительной долей популяции бактерий при культивировании т vitro,

- бактериофаг В pertussis 134 способен осуществлять лизогенизацию бактерий В parapertussis 17903, сообщая им ряд свойств возбудителя коклюша В процессе конверсии происходит интеграция части фагового генома 134 в хромосому конвертанта, возможно в результате IS- индуцированной рекомбинации фрагмента фагового генома и хромосомы В parapertussis 17903,

- бактерии конвертанта В parapertussis 17903 продуцируют бактериофаг фК, последовательность которого отсутствует в хромосоме В parapertussis 17903 Бактериофаг фК идентичен по морфологии фагам фТ, 134 и 214, но имеет совершенно отличный от них геном,

- последовательности, гомологичные ДНК бактериофага фК, обнаружены в хромосоме двух независимых конвертантов В parapertussis 17903 и всех изученных нами штаммах бактерий В pertussis и В bronchiseptica Локализация сайтов интеграции геномов профагов, гомологичных фК, различна у разных видов и штаммов бактерий и может быть связана с вирулентностью бактерий,

- свойства бактериофагов микроорганизмов рода Bordetella указывают на их принадлежность к классу МГЭ

2.4. Конструирование тест-систем для идентификации ДНК возбудителя коклюша и его фазовых вариантов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Сложность лабораторной диагностики коклюша, распространенность возбудителя среди «практически здоровых» и длительно кашляющих людей различных возрастных групп делают актуальным разработку тест-систем, пригодных для идентификации возбудителя коклюша и его фазовых состояний

Целью настоящего раздела работы является создание тест-системы, содержащей внутренний стандарт (ВС), обеспечивающей высокое качество ана-лгоа клинических образцов с помощь ПЦР, и пригодной для транспортировки при комнатной температуре

Согласно современным представлениям, так!ш требованиям удовлетворяют тест-системы, содержащие высушенные в «ПЦР-пробирке» компоненты реакционной смеси, в том числе и ДНК ВС, и обеспечивающие «технологию горячего старта» ПЦР В разработанной нами тест-системе «горячий старт» достигается в результате временной инактивации Taq - полимеразы за счет ее взаимодействия с моноклональными антителами (МАТ) Тест-система состоит из сухих компонентов, включающих праймеры KlOf - KlOr, комплекс Taq -полимеразы и МАТ, смеси трифосфатов и ДНК ВС, помещенных в реакционную пробирку объемом 0,6 мл ПЦР проводится в пробирке после добавления в нее ПЦР-буфера и исследуемой ДНК Комплекс Taq - полимеразы с МАТ денатурируется в результате прогрева пробирки при 95°С в течение 5 минут Для предотвращения ложноотрицательных результатов, разработан внутренний стандарт ПЦР (ВС) ВС - плазмидная ДНК, состоящую из вектора pGEM и клонированного фрагмента ДНК В pertussis Tohama I Клонированный фрагмент включает в себя последовательность хромосомы В pertussis Tohama I, содержащую вставку ДНК бактериофага X размером около 200 п н, фланкированную последовательностями праймеров KlOf и KlOr Использование ВС позволяет, не только контролировать качество реакции, но и оценить количество ДНК мишени в образце Для детектирования продуктов реакции может быть использован гельэлектрофорез или один из вариантов методов гибридизации

Для выделения ДНК из смывов с назофарингеальных тампонов использована обработка клинического материала раствором гуанидшггиоционата с последующей сорбцией ДНК на магнитном сорбенте фирмы Promega США

Модельные эксперименты по определению чувствительности сконструированной нами тест-системы, выполненные на серии разведений суспензии бактерий В pertussis Tohama I и очищенной бактериальной ДНК, показали, что она составляет 5-10 бактерий в реакции

Для определения специфичности тест-системы использованы ДНК в количестве 107-108 геном эквивалентов на реакцию, выделенные из различных микроорганизмов, находящихся в коллекциях ГУНИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН и контрольного института ГУ НИИГИСК им JI А Тарасевича HBV, HSV, CMV, Chi trachomatis, Chi pneumonia, Mhomims, U urealytwum, G vaginalis, T vaginalis, Streptoccocus B,D,G, F, Mtuberculosis, EcoliK.12, В pertussis, В parapertussis, В bronchiseptica, L pneumophiha, К pneumoniae, С diphtheriae, S typhi, Sh sonnet, Shflexneri, Ypseudotuberculosis, Enteropathogemc и ДНК человека

Специфический сигнал амгшификащи зарегистрирован с помощью электрофореза в агарозном геле только при использовании в качестве матрицы ДНК В pertussis, В parapertussis и В bronchiseptica Тест-система выявляет ДНК бактерий В parapertussis и В bronchiseptica в количестве более чем 104 молекул

в реакции или, примерно, 106 бактерий/мл суспензии В то время как, чувствительность при выявлении ДНК В pertussis более чем в 1000 раз выше Схожие результаты были получены с помощью использованного нами метода ДНК-гибридизации Низкая чувствительность метода при выявлении ДНК В Parapertussis и В bronchiseptica, делает возмоясным использование разработанной нами тест-системы для видоспецифической диагностики возбудителя коклюша в клинических образцах

Однако, как показывают приведенные выше результаты, при использовании больших концентраций ДНК, существует возможность идентификации бактерий В Parapertussis и В bronchiseptica в ПЦР с праймерами KlOf - КЮг ПЦР ДНК 40 штаммов В bronchiseptica, выделенных от животных и находящихся в коллекции НИИЭМ им Н Ф Гамалеи, показал, что бактерии 21 штамма содержат, последовательности гомологичные RSBP В pertussis Эти результаты указывают, по-видимому, на более широкую распространенность штаммов В bronchiseptica, содержащих последовательности RSBP, чем это было выявлено Diavatopoulos DA et al, 2005 Это обстоятельство необходимо учитывать при видоспецифическом типировании культур бактерий рода Bordetella с помощью ПЦР

Аналогичный принцип, основанный на использовании технологии «горячего старта» и иммобилизованной в ПЦР пробирках реакционной смеси, положен в основу тест-системы для идентификации ДНК В pertussis, содержащей инсерцию RSBP в специфическом сайте оперона bvgAS

Таким образом, нами разработаны и проверены в лабораторных условиях тест-системы для выявления ДНК возбудителя коклюша и его Bvg" мутантов, содержащих инсерцию RSBP в опероне bvgAS, методом ПЦР Тест-система для выявления ДНК возбудителя коклюша использована для диагностики атипичных и бессимптомных форм коклюша у детей и взрослых

выводы

1 Хромосома В pertussis содержит большое число повторяющихся нук-леотидиых последовательностей (RS-элементов), имеющих различную ориентацию и образующих транспозоно-подобные структуры Клонированы RS -элемент (RSBP) и Tn-подобная структура (ТпВР) хромосомы В pertussis 475, сконструированы их генетически маркированные варианты

2 RSBP и ТпВР В pertussis обладают основными свойствами мобильных генетических элементов перемещаются между плазмидой и хромосомой, индуцируют RecA независимое формирование коинтегратов между плазмидами и между плазмидой и хромосомой бактерий Ecoli, индуцируют перестройки прилегающего генетического материала генома хозяина, что позволяет отнести их к классу инсерционных последовательностей (IS-элементов) и транспозонов

3 Частота формирования RSBP-индуцируемых коинтегратов зависит от генотипа бактерий Е coli, прежде всего, от активности генов фосфоенолпиру-ватзависимой фосфотрансферазной системы Нарушение функционирования ФТС Е coli, снижает частоты формирования RSBP-индуцируемых коинтегратов и внутрихромосомного перемещения интегрированной структуры

4 Определена открытая рамка считывания (ORF1), в составе RSBP, кодирующая транспозазу (белок р36) Сконструирован штамм Е coli, продуцирующий функционально активную транспозазу, основная масса которой находится в нерастворимой фракции бактерий штамма-продуцента

5 Установлено, что перемещение RSBP в специфический сайт оперона bvgAS В pertussis, регулирующего вирулентность возбудителя коклюша, зависит от функционирования оперона bvgAS в бактериях В pertussis, содержащих мутантный оперон bvgAS, перемещения RSBP не регистрируются, способность к перемещению восстанавливается при транс-комплементации мутантного оперона bvgAS Формирование RSBP- индуцируемых коинтегратов восстанавливается в Pts" мутантах Е coli, содержащих оперон bvgAS в транс-положении

6 Выделены спонтанные авирулентные Bvg инсерционные мутанты В pertussis, сформированные в результате перемещения RSBP в оперон bvgAS Показано, что популяции бактерий всех изученных Bvg+ штаммов В pertussis гетерогенны и содержат инсерционные Bvg" мутанты с частотой 10"4 - 10"2 Относительное число Bvg" бактерий в популяции зависит от штамма и условий культивирования Частота перемещения RSBP увеличивается в присутствии MgS04

7 Получены доказательства участия IS-элементов В pertussis в регуляции вирулентности возбудителя коклюша в результате обратимой инактивации оперона bvgAS Инактивация регулятора транскрипции генов вирулентности наступает в результате перемещения IS - элементов в специфический сайт последовательности bvgAS Способность RSBP индуцировать точное исключение интегрированных структур, зависимость частоты перемещения RSBP от функционирования оперона bvgAS и условий культивирования бактерий Вpertussi,

указывают на возможную роль перемещений IS-элементов в адаптации возбудителя коклюша к организму хозяина

8 Сформулирована гипотеза, устанавливающая связь между образованием фазовых состояний и переживающих (персистирующих) форм возбудителя коклюша, с инактивацией генов вирулентности В pertussis в результате инсер-ции IS-элементов Исключение IS из сайта интеграции восстанавливает вирулентность и может привести к развитию заболевания

9 Штаммы бактерий В pertussis и В bronchiseplica - полилизогенны Последовательности, гомологичные ДНК бактериофага фК, обнаружены в хромосомах всех изученных штаммов бактерий В pertussis и В bronchiseplica Геном профага, гомологичного фТ, локализован вне хромосомы и утрачивается в процессе культивирования большей частью популяции изученных штаммов бактерий рода Bordetella

10 Различная локализация геномов одного из профагов в хромосомах разных видов и штаммов бактерий рода Bordetella, и способность второго исследованного бактериофага интегрировать часть генома в хромосому В parapertussis, вызывая изменение свойств возбудителя паракоклюша, позволяют отнести выделенные бактериофаги к классу мобильных генетических элементов

11 Разработаны тест-системы для регистрации событий перемещения RSBP в оперон bvgAS бактерий рода Bordetella и тест-системы для выявления ДНК возбудителя коклюша, с помощью которых показано, что до 30% детей с диагнозом ОРВИ и до 7% практически здоровых детей инфицированы возбудителем коклюша

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Ггащбург А JI, Янншевский Н В , Мотнн В JI Каратаев Г И, Смирнов Г Б Природа последовательностей RSI, фланкирующих ген vct, кодирующий синтез холерного токсина у Vibrio cholerae eltor // Молек генетика, микробиология и вирусология -1986 -№2 -С 11- 17

2 Покровская М С, Каратаев Г И, Смирнов Г Б Особенности образования и свойства плазмид pLS, возникающих в результате делеций генома бактериофага 1а„8о(Тп9) // Мол генетика, микробиология и вирусология -1986 -№1 -С 12-18

3 Покровская М С, Каратаев Г И, Смирнов Г Б Делеции генома фага ХаП80 Тп9 Характер внутримолекулярной рекомбинации // Мол генетика, микробиология и вирусология -1986 -№10 -С 33-39

4 Каратаев Г И, Рябинина О П , Лапаева И А Множественно повторяющиеся последовательности ДНК хромосомы - видовой признак Вperiissis II Сб Вопросы физиологии, метаболизма и идентификации микроорганизмов Москва -1987 -С 11-17

5 Гольцмайер Т А, Каратаев Г И, Розинов М Н , Москвина И Л , Шумаков Ю Л , Мопщ В Л, Мебель С М , Гершанович В Н , Лапаева И А Особенности лизогении и конверсии у микробов рода Bordetella IIЖМЭИ -1987 -№ 5 -С 9-13

6 Дорошенко В Г, Даниле в ич В Н, Каратаев Г И , Лившиц В А Структурная и функциональная организация транспозона Тп2555, несущего гены утилизации сахарозы //Молекулярная биология -1988 -Т 22 -С 645-658

7 Karataev GI, Lapajeva I А , Ryabinina О Р , Mebel S Detection of а new bacte-nophage in Bordetella II FEMS- symposium Pertussis Berlin, GDR - 1988 -P 20

8 Каратаев Г И , Мотин В Л , Рябинина О Г , Лапаева И А Электронно-микроскопическое изучение повторяющихся последовательностей ДНК хромосомы микроорганизмов рода Bordetella П Сб тезисов докладов 13-ой Всесоюзной конференции по электронной микроскопии «Биология и медицина» Москва -1988 -С 51

9 Holzmayer Т А, Karataev G I, Rozinov М N , Moskvina I L, Shumakov Y L ,V L Motin, Mebel S M , Gershanovich V N, Kapaeva I A Bactenophages of Bordetella sp Features of Lysogeny and Conversion // Zbl Bakt Hyg-1988 -V269 -P 147-155

10 Каратаев Г И, Москвина И Л , Рябинина О П, Миллер Г Г, Мебель С М, Лапаева И А Выделение и характеристика бактериофага из вакцинного штамма Tohama I фазы // Молек генетика, микробиология и вирусология -1988 -№4 -С 22-25

11 Каратаев Г И , Нечаева Е В , Синяшина Л Н, Лапаева И А Видоспецифиче-ский ДНК-зонд для идентификации микроорганизмов рода Bordetella // Доклады Республиканской конференции «новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы» Алушта -1990 -С 79-80

12 Волгина Т И, Кириллов М Ю Нечаева Е В, Шумаков Ю Л, Лапаева И А, Каратаев Г И Новый мобильный элемент В pertussis И Доклады Всесоюзной школы-семинар «Молекулярная биология и медицина» Москва -1990 -С 39

13 Каратаев Г И , Кириллов М Ю Нечаева Е В , Шумаков Ю Л, Волгина Т И, Лапаева И А Структурные особенности участков ДНК, содержащих "vir" и "tox" гены В pertussis II Доклады Всесоюзной школы-семинар «Молекулярная биология и медицина» Москва -1990 -С 38

14 Каратаев Г И , Шумаков Ю Л , Кириллов М Ю , Волгина Т И , Лапаева И А Структурная организация участка хромосомы, содержащего vir-ген В pertussis // Молек генетика, микробиология и вирусология -1990 -№12 -С 27-34

15 Нечаева Е В , Волгина Т И , Кириллов М Ю , Шумаков Ю Л, Лапаева И А, Каратаев Г И Мобильный элемент RSBP1 Bordetella pertussiss //Молек генетика, микробиология и вирусология -1990 -№12 -С 22-27

16 Каратаев Г И , Шакирова Р Г , Карпухин А В Высокочувствительный ДНК-зонд для идентификации возбудителя коклюша // в Сб материалов 2-го Всесоюзного симпозиума теоретических и прикладных аспектов молекулярной биологии Самарканд -1991 -С 84

17 Шумаков ЮЛ, Кириллов МЮ, Бутчер С, Нечаева ЕН, Руниберг-Ньюман К, Каратаев Г И Нуклеотидная последовательность и свойства транс-позоноподобной структуры, клонированной из хромосомы Bordetella pertussis //Генетика -1993 -№7 -С 1061-1069

18 Шумаков Ю Л, Кириллов М Ю , Нечаева Е В , Синяшина Л Н, Каратаев Г И Нуклеотидная последовательность и свойства транспозоноподобной структуры, клонированной из хромосомы В pertussis II Генетика -1993 -Т 29 -С 1061-1069

19 Кириллов М Ю, Шумаков Ю Л, Нечаева Е В , Синяшина Л Н, Каратаев Г И Нуклеотидная последовательность и свойства инвертированного повторяющегося элемента хромосомы В pertussis II Генетика. -1993 -Т29 -С 12671276

20 Kinllov М Y, Shumakov Y , Nechaeva E V, Butcher S , Sinjashina L N, Runeberg К, Romantschuk M, Karataev G I Repeated sequences isolated from Bordetella pertussis mduce DNA rearrangements and deletions at high frequency II Gene -1995 -V 166 -P 111-116

21 Боковой А Г, Волкова Т А, Кабишева Е В , Каратаев Г И , Кульнева Г М Специфическая диагностика коклюша у детей методом ДНК-зондирования // Клинический вестник -1996 -№3 -С 15-16

22 Лыткина И Н , Макаров В Б , Семина С В , Каратаев Г И Выявление возбудителя коклюша в клинических образцах с помощью ПЦР // Сб Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней В 2 Москва-1997 -С 144-148

23 Синяшина Л Н Кириллов М Ю, Карпухин А В , Богуш А И, Боковой А Г, Каратаев Г И Выявление возбудителя коклюша в клинических образцах методом ДНК-ДНК гибридизации // В сб Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней В 2 Москва -1997 -С 149-153

24 Кириллов М Ю, Нечаева Е В , Каратаев Г И Мобильный генетический элемент хромосомы В pertussis стимулирует образование коинтегратов в штаммах Е coli // Генетика -1997 -Т 33 -С 1621-1628

25 Артемьев МИ, Сметашша СЕ, Барановский ПМ, Зуева ЕН, Смирнов В Д, Каратаев Г И Количественная оценка мишени методом ПЦР // Сб тезисов докл 3-й Всероссийской научно-практической конференции Москва -2000 -С 341-342

26 Нечаева Е В , Сивов И Г Каратаев Г И Транспозиция и наследование Тп -элемента Bordetella в клетках Escherichia Coli Kl 2II Молек генетика, микробиология и вирусология -2000 -№ 1 -С 20-23

27 Сивов И Г, Белявский О А, Каратаев Г И Интеграция плазмиды в хромосому Escherichia Coli К12, обусловленная транспозоном Bordetella // Мол генетика, микробиология и вирусология -2000 -№ 2 -С 33-36

28 Каратаев Г И , Синяшина Л Н, Сивов И Г Мигрирующие генетические элемены Bordetella pertussis, как генетические и эпидемиологические маркеры //Вестник РАМН -2000 -№1 -С 34-38

29 Сивов И Г, Большакова Т Н , Каратаев Г И Интеграция и внутримолекулярное перемещение транспозона ТпВрЗ В pertussis в клетках Е coli К-12, му-тантных по белку Нрг фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы//Генетика -2001 -Т 37 -С 900-907

30 Воронцов В В , Сивов И Г, Умяров А М , Синяшина Л Н , Каратаев Г И Определение открытой рамки считывания, кодирующей транспозазу RS- элемента Bordetella pertussis 11 Генетика -2004 -T 1 -С 16-23

31 Синяшина Л Н , Воронцов В В, Сёмин Е Г, Честков А В , Цыганков Ю Д, Каратаев Г И Bvg-негативная регуляция перемещений повторяющихся последовательностей в клетках В peruss «//Генетика -2005, -№12 -С 1-9

32 Воронцов В В , Сивов И Г, Умяров А М , Синяшина Л Н , Каратаев Г И Функциональная активность транспозазы IS-элемента В pertussis в клетках Etoli// Генетика -2006 -№1 -С 39-48

33 Синяшина Л Н, Каратаев Г И Молекулярное подтверждение лизогенноста микроорганизмов рода Bordetella и характеристика умеренного бактериофага Bordetella parapertussis 662-2 //Генетика. -2006 -№3 -С 1-10

34 Sinyashma L N, Medkova A Yu, Semin Е G, Chestkov A V, Tsygankov Y D, Karataev G I IS481-Induced Variability of Bordetella pertussis/An "National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH Frontiers m Research" Ed Vassil St Georgiev, Humana Press, Totowa, N J -2008 -P 227-231

Список сокращений

МГЭ - мобильный генетический элемент ЯБ - повторяющаяся последовательность

18 - инсерционный элемент, повторяющаяся последовательность, обладающая свойствами МГЭ

Тп - транспозон, мобильный генетический элемент

ФТС - фосфоенолпируватзависимая фосфотрансферазная система

т п н - тысяча пар нуклеотидов

а к - аминокислота

п н - пар нуклеотидов

н м - нанометр

кДа - килодальтон, единица измерения молекулярного веса белка КУА - казеиново угольный агар

ЛСА - лейкоцитозстимулирующая активность коклюшного токсина

ТЛТ - термолабильный токсин

ФГА - филаментозный гемагглютинин

КТ - коклюшный токсин

МАТ - моноклональные антитела

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ВС - внутренний стандарт

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Каратаев, Геннадий Иванович

Использованные сокращения.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Факторы патогенности бактерий рода Bordetella,. их молекулярная структура и регуляция экспрессии генов вирулентности.

1.1.1. Адгезины бактерий рода Bordetella.

1.1.1.1 .Филаментозный гемагглютинин.

1.1.1.2.Фимбрии или агглютиногены.

1.1.1.3. Пертактин.

1.1.1.4. Белок устойчивости к сыворотке BrkA.

1.1.1.5 .Трахеальный колонизирующий фактор.

1.1.2. Токсины бактерий рода Bordetella.

1.1.2.1. Коклюшный токсин.

1.1.2.2. Аденилатциклазный токсин.

1.1.2.3. Термолабильный токсин (ТЛТ).

1.1.2.4. Трахеальный цитотоксин.

1.1.2.5. Липополисахаридный эндотоксин B.pertussis.

1.1.3. Третий тип системы секреции бактерий рода Bordetella.

1. 2. Регуляция вирулентности бактерий рода Bordetella.

1.3. Персистенция возбудителя коклюша в эукариотических. клетках, как возможный механизм сохранения популяции бактерий в организме человека.

1.4. Повторяющиеся последовательности микроорганизмов. рода Bordetella.

1.5. Бактериофаги и плазмиды микроорганизмов рода Bordetella.

1.6. Лабораторная диагностика микроорганизмов рода Bordetella. с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.7. Мобильные генетические элементы прокариот.

1.7.1. Структура и свойства мобильных генетических элементов.

1.7.2. Генетический контроль транспозиции МГЭ.

1.7.2.1. Регуляция экспрессии транспозазы.

1.7.2.2. Контроль транспозиции МГЭ факторами клетки хозяина.

1.7.3. Механизмы транспозиции МГЭ.

1.7.4.Систематика IS-элементов прокариот.

1.7.5. Ферменты транспозиции, кодируемые МГЭ прокариот.

1.8. Краткая характеристика фосфоенолпируватзависимой. фосфотрансферазной системы и двухкомпонентных сенсорных регуляторных систем бактерий.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение.

3.1. Повторяющиеся последовательности и транспозоно-подобные. элементы B.pertussis

3.1.1. Клонирование повторяющейся последовательности. хромосомы B.pertussis 475.

3.1.1.1. RS индуцируемая нестабильность рекомбинантных плазмид. в клетках recA Е. coli НВ101.

3.1.1.2. RS B.pertussis 475 стимулирует гесА - независимую. рекомбинацию плазмиды с хромосомой E.coli НВ

3.1.2. Структурная организация участка хромосомы B.pertussis 475,. содержащего bvg - оперон. Клонирование Тп- подобного элемента B.pertussis 475.

3.1.3 Конструирование генетически маркированных RSBP и.

ТпВР элеменов B.pertussis.

3.1.4. Свойства RSBP и ТпВР элементов B.pertussis. Картирование открытой рамки считывания, ответственной за синтез транспозазы.

3.1.4-1. Транспозиция B.pertussis 475 и RSBP индуцируемая. коинтеграция между плазмидами и плазмидой и хромосомой в клетках Е. coli.

3.1.4.1.1. Транспозиция ТпВР в хромосому Е.coli KS721.

3.1.4.1.2. RSBP индуцированная интеграция плазмиды рККЗ. в хромосому E.coli.

3.1.4.2. Перемещение и интеграция RSBP и ТпВР В. pertussis в. клетках E.coli, мутантных по белку Нрг фосфоенолпируватзависимой фосфотрансферазной системы

3.1.4.2.1. Интеграция плазмиды рККЗ с хромосомой в клетках. дикого типа и мутантах PtsH Е. coli.

3.1.4.2.2. Исключение и внутримолекулярное перемещение. интегрированной плазмиды рККЗ в клетках дикого типа и мутантах PtsH Е. coli.

3.1.4.2.3. Нестабильность рекомбинантных плазмид, содержащих.

RSBP и ТпВР B.pertussis, в бактериях E.coli. Бактерии ptsH

E.coli -предпочтительный хозяин для клонирования повторяющихся последовательностей B.pertussis.

3.1.4.3. Картирование открытой рамки считывания,. ответственной за синтез транспозазы.

3.1.4.3.1 Коинтеграция плазмид рМи, рМи5 и рМиб. с хромосомой E.coli.

3.1.4.3.2. Коинтеграция плазмид рККЗ, рМи, рМи5 и рМиб плазмидой рОХ38 в Pts+ RecA" и Pts- RecA" бактериях E.coli.

3.1.4.4. Особенности разрешения межплазмидных RSBP. индуцируемых коинтегратов в бактериях E.coli.

3.1.4.4.1. Структура межплазмидных RSBP индуцируемых. коинтегратов, в клетках E.coli.

3.1.4.4.2. Структура продуктов разрешения межплазмидных.

RSBP индуцируемых коинтегратов в клетках E.coli.

3.1.5. Функциональная активность транспозазы IS- элемента.

В.pertussis в бактериях E.coli.

3.1.5.1 Клонирование и экспрессия ORF1 в составе рекомбинантной плазмиды pET320RFl в клетках Е.coli BL21(DE3).

3.1.5.2. Выживаемость бактерий рекомбинантных штаммов.

E.coli BL21/pET320RFl в условиях индукции IPTG.

3.1.5.3. Транспозиция «дефектного» RSBP в клетках Е.coli-. продуцентах транспозазы RSBP В.pertussis

3.1.6 Очистка транспозазы из бактерий E.coli BL21/ рЕТ32 ORF1.

3.1.7. Неопределенность границ повторяющейся. последовательности Bordetella pertussis.

3.1.7.1. Приграничные последовательности RSBP. в плазмиде рМК2.

3.1.7.2. Приграничные последовательности RSBP. в плазмиде pNKl.

3.1.7.3. Особенности последовательности участка интеграции рККЗ в ген metY хромосомы E.coli.

3.2. IS- индуцируемая изменчивость Bordetella pertussis.

3.2.1. Разработка метода идентификации транспозиции RSBP. в клетках В.pertussis.

3.2.2. Перемещение RSBP в оперон bvgASB.pertussis зависит. от присутствия MgS04 в среде культивирования бактерий возбудителя коклюша.

3.2.3. Выделение IS- индуцируемых фазовых вариантов B.pertussis.

3.2.4. Оперон bvgAS влияет на транспозицию RSBP. в Pts мутантах E.coli.

3.2.5. Биологическое значение событий инсерционой инактивации. оперона bvg AS в бактериях Bordetella pertussis. Новый подход к регистрации изменчивости возбудителя коклюша in vitro и in vivo.

3.3. Выделение и характеристика бактериофагов микроорганизмов рода Bordetella.

3.3.1. Выделение и характеристика бактериофагов В.pertussis и.

В. bronchiseptica.

3.3.2. Выделение и характеристика бактериофагов из бактерий.

В. parapertussis, резистентных к бактериофагу 134 В.pertussis.

3.4. Конструирование тест-систем для идентификации возбудителя. коклюша и его фазовых вариантов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша."

Коклюш - респираторное заболевание людей, вызываемое грам-отрицательными бактериями Bordetella pertussis. Бактерии B.pertussis передаются от человека к человеку воздушно-капельным путем. Профилактика коклюша входит в национальный календарь плановых прививок и обеспечивается программами массовой вакцинации детей. Несмотря на это, циркуляция возбудителя коклюша в популяции не уменьшается. Ежегодно в мире регистрируется до 48,5 миллионов заболеваний коклюшем, из них до 300 ООО случаев заканчиваются летальным исходом (Crowcroft N.S. et al. 2003). Чаще, и в более тяжелой форме, коклюшем болеют дети первого года жизни, но в последнее время отмечается рост числа лабораторно подтвержденных случаев коклюша у подростков и взрослых (Cherry JD, Heininger U, 2004). Эпидемиологические исследования показали, что последние являются основным резервуаром инфекции для заражения наиболее восприимчивых к заболеванию новорожденных (Mattoo S,Cherry JD, 2005). Отмечены случаи бессимптомного носительства B.pertussis (Heininger UW et al., 2004). Активно изучаются механизмы носительства и пер-систенции возбудителя в организме человека. Установлена связь между переживанием бактерий Bordetella внутри эукариотической клетки и экспрессией некоторых факторов вирулентности возбудителя (Bassinet L, 2000).

Одной из характерных особенностей возбудителя коклюша является высокая степень изменчивости его фенотипических признаков. Бактерии с разной вирулентностью, формой колоний и способностью к гемолизу эритроцитов были выделены на разных стадиях заболевания, при экспериментальном заражении лабораторных животных и при культивировании in vitro (обзор Wardlaw А, Parton R, 1988). Такие бактерии были названы фазовыми вариантами (Lacey В. 1960), а их переход из одной фазы в другую — фазовым переходом. Фазовые пе

3 6 реходы in vitro осуществляются с частотами 10 " -10" на клетку, в зависимости от штамма бактерий (Preston et al., 1982). Более поздние исследования показали, что авирулентные фазовые варианты (IV фаза) in vitro могут появляться в результате мутации в опероне bvgAS, ответственном за регуляцию вирулентности микроорганизмов рода Bordetella ( Weiss et al., 1983). Некоторых из таких мутантов были охарактеризованы (Stibitz S et al., 1989, Monack D.M. et al., 1989, Mc Gillivray D.M. al., 1989). Однако механизм их формирования остается неизвестным.

Обратимое изменение фазового состояния бактерий Bordetella, происходящее в результате изменения условий их культивирования, принято называть фазовой модуляцией. Такие изменения регистрируются in vitro при культивировании бактерий при 28 °С в присутствии MgS04 или никотиновой кислоты. (Lacey, В. W. 1960)

На протяжении последних 20-30 лет проведены многочисленные моле-кулярно-генетические исследования структуры и регуляции экспрессии генов вирулентности. Установлено, что большинство из них регулируется на уровне транскрипции, управляемой двухкомпонентной сенсорной системой BvgAS Bordetella (например, Cotter P.A., MillerJ.F., 2001 Cummings С.A. et al., 2006).

Регуляция экспрессии генов вирулентности Bordetella изучена главным образом в экспериментах in vitro. Только в одной работе предпринята попытка анализа транскрипции ^^ЛЗ-зависимых генов суа, fha, рт и ptx в процессе размножения бактерий в легких мышей после их аэрозольного заражении вирулентным штаммом B.pertussis (Wendy L, Stibitz S, 2005). Отсутствие адекватной модели затрудняет изучение роли отдельных факторов вирулентности и фазовых переходов в формировании и развитии инфекционного процесса в экспериментах на животных. Остается открытым вопрос о механизме формирования носительства (персистенции) возбудителя коклюша в организме человека (Mattoo S, Cherry JD, 2005, Cummings CA et al., 2006).

Установлена структурная организация и последовательности хромосом B.pertussis, В.parapertussis и B.bronchiseptica, что позволило идентифицировать повторяющиеся IS-подобные элементы и геномы профагов в хромосомах микроорганизмов рода Bordetella (McLafferty MA et.al.,1989, McPheat WL et.al.,

1989, Parkhill JM et al., 2003). Использование современных методов молекулярного анализа (пульс-электрофореза и IS-типирования и гибридизации) выявило значительные отличия структуры хромосом бактерий B.pertussis, выделенных в разные периоды времени и в различных географических регионах (Магу М et al., 2006). Изменения структуры хромосомы обнаружены и после пассажа бактерий B.pertussis на питательных средах in vitro (Brinig MM et al., 2006). Авторы полагают, что перестройки являются следствием рекомбинаций, индуцированных IS-подобными элементами B.pertussis. События гомологичной и «незаконной рекомбинации», индуцированные IS-элементами, обеспечили редуктивную эволюцию геномов микроорганизмов рода Bordetella (Cummings СА et al., 2004, Mary M et al., 2006). Высказываются предположения о формировании некоторых фазовых вариантов B.pertussis в результате перемещения (исключения) IS-элементов в оперон bvgAS B.pertussis (Stibitz S et al., 1989, Monack DM et al., 1989, McGillivray DM al., 1989). Однако экспериментальных подтверждений этого предположения получено не было.

Постоянно поддерживается интерес к бактериофагам бактерий рода Bordetella, их роли в обеспечении вирулентности и изучению лизогенности патогенных для человека и животных микроорганизмов. Этот интерес обусловлен известной ролью бактериофагов в формировании вирулентных форм патогенных бактерий и их участием в адаптации бактерий к среде обитания. До сих пор связь бактериофагов Bordetella с вирулентностью возбудителей не установлена. Однако показано, что некоторые бактериофаги B.bronchiseptica обладают повышенным тропизмом к бактериям, находящимся в различных фазовых состояниях (Liu М. et.all 2002, 2004). Трансдуцирующие бактериофаги всегда были важным инструментом генетического анализа бактерий. По этой причине поиск и изучение новых бактериофагов, особенно способных осуществлять генетическую трансдукцию хромосомных маркеров недостаточно охарактеризованных бактерий рода Bordetella, остается актуальной задачей.

Научная новизна

- клонированы повторяющаяся последовательность и транспозоно-подобная структура хромосомы B.pertussis, сконструированы их генетически маркированные варианты. Показано, что изолированные нами RS и Тп— подобная последовательности являются мобильными генетическими элементами, сходными с МГЭ других бактерий. МГЭ B.pertussis способны к RecA- независимым перемещениям, индуцируют образование дупликаций, делеций, инверсий прилегающего генетического материала и формирование коинтегратов в бактериях E.coli. Установлена зависимость RS- индуцируемых событий рекомбинации от фенотипа бактерии-хозяина. Сконструирован штамм E.coli, продуцирующий функционально-активную транспозазу RSBP B.pertussis;

- идентифицированы события спонтанного перемещения RS- элементов в cctagg сайт оперона bvgAS вирулентных бактерий B.pertussis и выделены ин-серционные Bvg" мутанты B.pertussis. Установлено, что частота перемещения RS-элементов зависит от функционирования оперона bvgAS и условий культивирования бактерий B.pertussis. Перемещение RS-элементов не регистрируется в бактериях, содержащих мутацию в опероне bvgAS. Показано, что бактерии B.pertussis могут переходить в авирулентное состояние в результате интеграции RS-элементов в оперон bvgAS, регулирующий экспрессию генов вирулентности бактерий;

- выделены и охарактеризованы новые бактериофаги из бактерий международного штамма B.pertussis Tohama I (фТ) и конвертанта В.parapertussis 17903 (фК), установлена лизогенность бактерий и структура геномов описанных ранее бактериофагов B.pertussis и B.bronchiseptica. Показано, что геномы всех изученных бактериофагов Bordetella, за исключением бактериофага фК, идентичны. Геном бактериофага фК отличается от генома фТ и всех охарактеризованных бактериофагов Bordetella. Бактерий B.pertussis и B.bronchiseptica являются полилизогенами. Геном профага фК находится в хромосоме клетки-хозяина, тогда как геном фТ присутствует, скорее всего, в состоянии плазмиды и утрачивается в процессе культивирования большей частью бактериальной популяции. По меньшей мере, один из выделенных бактериофагов В.pertussis, родственный фТ, способен лизогенизировать бактерии B.parapertussis, интегрируя фрагмент генома в хромосому, и вызывая изменение свойств возбудителя паракоклюша. Свойства охарактеризованных бактериофагов позволяют отнести их к классу мобильных генетических элементов.

Актуальность проблемы.

Актуальность проведенных исследований определяется необходимостью расширения знаний об эпидемиологически значимом возбудителе инфекционного заболевания человека. Идентификация мобильных генетических элементов B.pertussis (IS-элементов, Tn-подобных структур, бактериофагов), определение факторов, влияющих на частоту перемещения МГЭ в клетках B.pertussis, изучение роли МГЭ в регуляции вирулентности возбудителя коклюша, позволит понять механизмы изменчивости и адаптации бактерий возбудителя к среде обитания.

Используемые в настоящее время бактериологические методы лабораторной диагностики коклюша недостаточно чувствительны, а серологические методы недостаточно специфичны. Идентификация ДНК B.pertussis с помощью методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Xuan Qin et al., 2007) не нашла широкого применения в отечественной практике здравоохранения (И.Н. Лыт-кина и др., 2004). Необходимость совершенствования лабораторной диагностики возбудителя коклюша, в том числе, методов анализа фазовых вариантов бактерий B.pertussis in vitro и in vivo, определяет актуальность прикладного раздела исследования. Тест-системы для обнаружения ДНК возбудителя коклюша в клиническом материале с помощью ПЦР и методы выявления бактерий B.pertussis, содержащих инсерцию IS-элемента в генах вирулентности, будут использованы для изучения носительства возбудителя коклюша, диагностики атипичных форм заболевания, определения структуры и механизмов формирования резервуаров инфекции.

Цель исследования Выявление генетических основ и молекулярных механизмов изменчивости B.pertussis и роли мобильных генетических элементов (МГЭ) в регуляции экспрессии генов вирулентности возбудителя коклюша.

Задачи исследования:

1. Выделение и характеристика повторяющейся последовательности (RS) и Тп -подобных элементов хромосомы B.pertussis.

2. Разработка экспериментального метода для регистрации событий перемещения RS-элементов в специфические сайты хромосомы B.pertussis. Определение факторов, влияющих на перемещение RS-элементов в оперон bvgAS, регулирующий вирулентность B.pertussis.

3. Выделение мутантов B.pertussis, содержащих инсерцию RS -элемента в опе-роне bvgAS.

4. Выделение и характеристика новых бактериофагов и лизогенности микроорганизмов рода Bordetella.

5. Конструирование тест-систем для идентификации и характеристики ДНК бактерий B.pertussis в биологическом материале от носителей и больных коклюшем детей и взрослых с помощью полимеразной цепной реакции.

Практическая значимость

Показана целесообразность использования разработанных в процессе выполнения работы тест-системы и метода выявления ДНК бактерий B.perussis, находящихся в различных фазовых состояниях, для диагностики заболевания, выявления носителей возбудителя коклюша, определения роли фазовых состояний в патогенезе и персистенции возбудителя.

Использование разработанных тест-систем для лабораторной диагностики коклюша показало их высокую эффективность в сравнении с бактериологическими методами и позволило выявить возбудитель коклюша примерно у 7% «практически здоровых» детей и более чем у 30% больных детей с диагнозом острое респираторное заболевание. Полученные нами и другими авторами результаты указывают на то, что стертая и атипичная формы коклюша является причиной значительного числа заболеваний с симптомами длительного кашля. Длительно кашляющие дети и взрослые, бессимптомные носители бактерий B.perussis, наряду с больными типичной формой коклюша, являются источником инфекции.

Разработанный экспериментальный подход позволяет идентифицировать бактерии, содержащие инсерцию RS-элементов в оперон bvgAS, регулирующий транскрипцию генов вирулентность возбудителя коклюша. Идентификация ин-серционных Bvg" мутантов и мутантов по другим генам вирулентности B.perussis на разных стадиях заболевания или в организме носителей позволит определить роль RS-индуцированного мутагенеза при формировании персисти-рующих форм бактерий рода Bordetella. Исключение RS-элемента из структуры мутантного гена приводит к восстановлению вирулентного фенотипа, что может вызывать развитие инфекционного процесса в организме хозяина. Определение относительного числа инсерционных мутантов B.perussis у носителей и больных на разных стадиях заболевания может оказаться важным критерием для оценки эпидемиологической значимости носительства Bvg" мутантов и разработки новых подходов к профилактике коклюша.

Подготовлена фармакопейная статья и инструкция по применению «Тест-системы для экспресс-индикации возбудителя коклюша методом поли-меразной цепной реакции», одобренные Советом по внедрению научных достижений в практику ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 7 февраля 2008 г., протокол №3.

Структура работы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Каратаев, Геннадий Иванович

выводы

1. Хромосома B.pertussis содержит большое число повторяющихся нук-леотидных последовательностей (RS-элементов), имеющих различную ориентацию и образующих транспозоно-подобные структуры. Клонированы RS -элемент (RSBP) и Tn-подобная структура (TnBP) хромосомы B.pertussis 475; сконструированы их генетически маркированные варианты.

2. RSBP и TnBP B.pertussis обладают основными свойствами мобильных генетических элементов: перемещаются между плазмидой и хромосомой, индуцируют RecA независимое формирование коинтегратов между плазмидами и между плазмидой и хромосомой бактерий E.coli; индуцируют перестройки прилегающего генетического материала генома хозяина, что позволяет отнести их к классу инсерционных последовательностей (IS-элементов) и транспозонов.

3. Частота формирования RSBP-индуцируемых коинтегратов зависит от генотипа бактерий E.coli, прежде всего, от активности генов фосфоенолпиру-ватзависимой фосфотрансферазной системы. Нарушение функционирования ФТС E.coli, снижает частоты формирования RSBP-индуцируемых коинтегратов и внутрихромосомного перемещения интегрированной структуры.

4. Определена открытая рамка считывания (ORF1), в составе RSBP, кодирующая транспозазу (белок р36). Сконструирован штамм E.coli, продуцирующий функционально активную транспозазу, основная масса которой находится в нерастворимой фракции бактерий штамма-продуцента.

5. Установлено, что перемещение RSBP в специфический сайт оперона bvgAS B.pertussis, регулирующего вирулентность возбудителя коклюша, зависит от функционирования оперона bvgAS: в бактериях B.pertussis, содержащих мутантный оперон bvgAS, перемещения RSBP не регистрируются; способность к перемещению восстанавливается при транс-комплементации мутантного оперона bvgAS. Формирование RSBP- индуцируемых коинтегратов восстанавливается в Pts" мутантах E.coli, содержащих оперон bvgAS в транс-положении.

6. Выделены спонтанные авирулентные Bvg" инсерционные мутанты B.pertussis, сформированные в результате перемещения RSBP в оперон bvgAS. Показано, что популяции бактерий всех изученных Bvg+ штаммов B.pertussis гетерогенны и содержат инсерционные Bvg" мутанты с частотой 10"4 — 10"2. Относительное число Bvg" бактерий в популяции зависит от штамма и условий культивирования. Частота перемещения RSBP увеличивается в присутствии MgS04.

7. Получены доказательства участия IS-элементов B.pertussis в регуляции вирулентности возбудителя коклюша в результате обратимой инактивации оперона bvgAS. Инактивация регулятора транскрипции генов вирулентности наступает в следствие перемещения IS — элементов в специфический сайт последовательности bvgAS. Способность RSBP индуцировать точное исключение интегрированных структур, зависимость частоты перемещения RSBP от функционирования оперона bvgAS и условий культивирования бактерий B.pertussi, указывают на возможную роль перемещений IS-элементов в адаптации возбудителя коклюша к организму хозяина.

8. Сформулирована гипотеза, устанавливающая связь между образованием фазовых состояний и переживающих (персистирующих) форм возбудителя коклюша, с инактивацией генов вирулентности B.pertussis в результате инсерции IS-элементов. Исключение IS из сайта интеграции восстанавливает вирулентность и может привести к развитию заболевания.

9. Штаммы бактерий B.pertussis и B.bronchiseptica — полилизогенны. Последовательности, гомологичные ДНК бактериофага фК, обнаружены в хромосомах всех изученных штаммов бактерий B.pertussis и B.bronchiseptica. Геном профага, гомологичного фТ, локализован вне хромосомы и утрачивается в процессе культивирования большей частью популяции изученных штаммов бактерий рода Bordetella.

10. Различная локализация геномов одного из профагов в хромосомах разных видов и штаммов бактерий рода Bordetella, и способность второго исследованного бактериофага интегрировать часть генома в хромосому В.parapertussis, вызывая изменение свойств возбудителя паракоклюша, позволяют отнести выделенные бактериофаги к классу мобильных генетических элементов.

11. Разработаны тест-системы для регистрации событий перемещения RSBP в оперон bvgAS Bordetella и тест-системы для выявления ДНК возбудителя коклюша, с помощью которых показано, что до 30% детей с диагнозом ОРВИ и до 7% практически здоровых детей инфицированы возбудителем коклюша.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хромосома патогенной для человека бактерии B.pertussis представляет собой мозаичную структуру, насыщенную повторяющимися элементами, содержащую геномы профагов и изменяющуюся в результате перестроек, инициированных многочисленными рекомбинационными событиями. В литературе активно обсуждаются механизмы изменчивости возбудителя коклюша и возможная роль повторяющихся последовательностей и бактериофагов в регуляции его вирулентности.

Целью настоящего исследования было изучение генетических основ и молекулярных механизмов изменчивости возбудителя коклюша и регуляции генов его вирулентности.

Проведенные исследования показали, что многие копии повторяющихся последовательностей B.pertussis инвертированы друг к другу. Клонирована одна из копий повторяющихся последовательностей B.pertussis, названная RSBP, и Тп- подобная структура (TnBP), расположенная вблизи оперона bvgAS, ответственного за регуляцию транскрипции генов вирулентности бактерий рода Bordetella. Определена открытая рамка считывания, кодирующая транспозазу RSBP(ORFl). Сконструированы генетически маркированные, функционально активные варианты RSBP и TnBP. Установлено, что последовательности RSBP и TnBP способны к перемещению из плазиды в хромосому, формированию межплазмидных коинтегратов и коинтегратов между плазмидой и хромосомой E.coli. Частоты RSBP индуцируемых рекомбинационных событий не зависят от RecA, но зависят от фосфоенолпируватзависимой фосфотрансферазной системы (ФТС) E.coli. Мутации в генах общих компонентов ФТС (ptsHиptsl) значительно снижают частоты RSBP индуцируемых рекомбинационных событий в E.coli. Стабильность рекомбинантных плазмид, содержащих RSBP, и рекомби-нантов между этими плазмидами и хромосомой E.coli выше в RecBCsbcB" мутантах E.coli и еще выше в Pts" мутантах. Перечисленные рекомбинантные структуры не стабильны в бактериях дикого фенотипа и в RecA" мутантах E.coli. RSBP- индуцирует формирование делеций и дупликаций последовательностей рекомбинантных плазмид и хромосомы. Полученные результаты позволяют утверждать, что повторяющаяся последовательность хромосомы RSBP(IS481) и TnBP относятся к классу мобильных генетических элементов. Сконструированы бактерии E.coli, продуцирующие функционально активную транспозазу RSBP B.pertussis. Основная масса транспозазы, синтезируемая в бактериях штамма- продуцента E.coli BL21/pETORFl, находится в нерастворимой фракции. Установлено, что выживаемость клеток E.coli при культивировании в условиях суперпродукции транспозазы, снижается в 104 раз. Сохранение жизнеспособности клеток продуцентов транспозазы BL21/pET320RFl обеспечивается двумя процессами — потерей плазмиды, кодирующей транспозазу, или и) накоплением компенсаторных хромосомных мутаций, снижающих уровень ее продукции или активности. Получены результаты, указывающие на подавление репликации ColEl плазмид, в условиях суперпродукции транспозазы RSBP в бактерияхт E.coli.

Анализ нуклеотидной последовательности хромосомы B.pertussis и полученных нами экспериментальных результатов показали, что перемещение повторяющейся последовательности RSBP(IS481) в бактериях B.pertussis происходит в специфические участки, содержащие последовательность NC7MGN. Разработан метод регистрации событий перемещения RSBP в специфический NCZ/4GN сайт оперона bvgAS B.pertussis. С помощью разработанного метода установлено, что в процессе размножения клеток вирулентных бактерий B.pertussis in vitro с частотой 10"4-10 2 , наблюдается внутрихромосомные сайт-специфические перемещения IS элементов, сопровождающееся инактивацией оперона bvgAS возбудителя коклюша. Bvg" мутанты B.pertussis не способны поддерживать внутримолекулярное перемещение RSBP(IS481). Присутствие MgSC>4 в среде культивирования повышает частоту перемещения RSBP(IS481). Отсутствие модулирующих факторов в среде культивирования снижает частоту перемещения RSBP(IS481) по хромосоме бактерий B.pertussis. Предполагается, что регуляция bvg- зависимой транспозиции RSBP(IS481) осуществляется на уровне регуляции транскрипции транспозазы с помощью механизма, характерного для bipA гена B.pertussis.

Впервые выделены и охарактеризованы спонтанные Bvg" мутанты B.pertussis, содержащие инсерцию IS в опероне bvgAS возбудителя коклюша.

Установлено, что в бактериях E.coli мутации по генам, кодирующим общие компоненты ФТС - белок Нрг и фермент I, снижают частоту RSBP(IS481) индуцируемой интеграции плазмид в хромосому. Влияние на интеграцию мутации по гену ptsH менее выражено, чем мутации ptsl. Бактерии E.coli, мутант-ные по генам ptsH и ptsl и содержащие оперон bvg AS в транс-положении, восстанавливают способность поддерживать IS- идуцируемую интеграцию плазмид в хромосому. Полученные результаты, указывают на то, что в бактериях E.coli и B.pertussis транспозиция RSBP регулируется на уровне транскрипции транспозазы. В бактериях B.pertussis регуляция осуществляется продуктами экспрессии генов оперона bvgAS, тогда как в клетках E.coli в регуляции транскрипции гена транспозазы принимают участие общие компоненты фосфоенол-пируват фосфотрансферной системы кишечной палочки. В бактериях E.coli для завершения транспозиции, помимо транспозазы, скорее всего, необходимы дополнительные белки.

Нарастание заболеваемости коклюшем на фоне применения вакцинных препаратов, особенно среди подростков и взрослого населения, характерно для многих регионов мира. Обследования длительно кашляющих подростков и взрослых, а также персонала детских лечебных заведений, студентов и школьников привели исследователей к заключению о существовании резервуара коклюшных бактерий, способных инфицировать детей, особенно первого года жизни. Такими резервуарами являться больные коклюшем, длительно кашляющие взрослые и дети и практически здоровые люди, не имеющие клинических признаков коклюша.

Изучение переживания микроорганизмов рода Bordetella в культурах клеток и организме животных привело некоторых исследователей к выводу, что переход бактерий в состояние персистенции может быть связан с частичной или полной потерей их вирулентности. Наши исследования показали, что одним из возможных механизмов перехода бактерий B.pertussis в авирулентное состояние является инактивация оперона bvgAS, ответственного за вирулентность возбудителя коклюша, в результате перемещения инсерционных последовательности хромосомы B.pertussis. Аналогичные события могут лежать в основе формирования IS - индуцированных инактиваций других генов вирулентности — коклюшного токсина, филаментозного гемаглютинина, генов ТТСС, последовательности которых, как правило, содержат NctagN сайты, предпочтительные для внедрения IS элементов. Исключение IS из оперона bvgAS или(и) других генов вирулентности приводит к восстановлению их структуры и может способствовать развитию инфекционного процесса. Исключение IS, так же как и его перемещение, индуцируется внешними условиями и может быть связано, например, с попаданием бактерий во внешнюю среду или в организм другого реципиента. Моделирование этих процессов in vitro, предполагающее изучение влияния различных факторов на частоту транспозиции IS-элементов в бактериях B.pertussis и E.coli, и анализ авирулентных и частично вирулентных бактерий, выделенных на разных стадиях заболевания, должны привести к пониманию процессов, ответственных за переход бактерий возбудителя коклюша в персистирующее состояние и обратно.

Разработаны и апробированы диагностические тест-системы для выявления бактерий B.pertussis в клиническом материале и их Bvg" фазовых вариантов, содержащих RSBP в опероне bvgAS. Показано, что до 30% детей с диагнозом ОРВИ и до 7% практически здоровых детей инфицированы возбудителем коклюша.

Тест-системы будут использованы для мониторинга потенциально опасных носителей инфекции и изучения структуры популяции возбудителя коклюша, формируемой на разных стадиях заболевания. С их помощью будут определены факторы, индуцирующих переход бактерий в авирулентное состояние и состояния со сниженной вирулентностью, сформированное в результате перемещения IS - элементов в гены вирулентности, и обратно, в вирулентное состояние, в результате исключения IS - элементов из структуры мутантных генов.

Выделены и охарактеризованы новые бактериофаги бактерий рода Bordetella. Все изученные штаммы бактерий B.pertussis и B.bronchiseptica индуцируют схожие по структуре и свойствам бактериофаги, размножающиеся на бактериях B.parapertussis. По крайней мере, один из выделенных бактериофагов B.pertussis способен лизогенизировать бактерий B.parapertussis, сообщая им ряд свойств возбудителя коклюша. В процессе конверсии бактерий B.parapertussis происходит интеграция части фагового генома в хромосому конвертанта, возможно, в результате IS-индуцированной рекомбинации части фагового генома и хромосомы B.parapertussis 17903. Бактерии штамма конвертанта B.parapertussis17903 продукцируют бактериофаг фК. Морфология бактериофагов фК, B.pertussis Tohamal, конвертирующего бактериофагу 134 и других фагов B.bronchiseptica и B.pertussis, идентичны. Однако, циркулярно пермути-рованный геном фага фК, совершенно отличается от близкородственных геномов других фагов бактерий рода Bordetella.

Последовательности, гомологичные ДНК бактериофага фК, обнаружены в хромосоме конвертантов и всех проанализированных нами штаммов бактерий B.pertussis и B.bronchiseptica, но не обнаружены в хромосомах двух исследованных штаммов B.parapertussis. Геномы профагов, гомологичных фК, интегрированы в разные участки хромосомы у разных видов и штаммов бактерий, что может быть связано с их фазовым состоянием и вирулентностью.

Таким образом, бактерии всех изученных штаммов B.pertussis и B.bronchiseptica - полилизогенны и содержат, по крайней мере, два профага. Геномы одного из профагов обнаружены в хромосомах бактерий-хозяев, тогда как геномы второго - присутствуют только в части популяции лизогенных бактерий в автономном состоянии и утрачиваются в процессе культивирования большей частью бактериальной популяции. Ко второй группе относятся, по-видимому, и бактериофаги ВРР-1, ВМР-1 и BIP-1 B.bronchiseptica, охарактеризованные недавно группой американских авторов и имеющие различный тропизм к бактериям, находящимся в разных фазовых состояниях.

Различная локализация геномов одного из профагов в хромосомах разных видов и штаммов бактерий рода Bordetella, и способность второго исследованного бактериофага интегрировать часть генома в хромосому B.parapertussis, вызывая изменение свойств возбудителя паракоклюша, позволяют отнести выделенные бактериофаги к классу мобильных генетических элементов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Каратаев, Геннадий Иванович, Москва

1. World Health Organization. Pertussis vaccines: W. H. O. position paper // Wkly. Epidemiol. Rec. -1999. №74. - P. 137- 144.

2. Crowcroft N. S., C. Stein, P. Duclos, M. Birmingham. How best to estimate the global burden of pertussis? // Lancet Infect. Dis 2003.- V. 3. - P. 413-418.

3. Centers for Disease Control and Prevention. Pertussis United States, 1997- 2000 // Morb. Mortal. Wkly. Re P. 2001.- V. 51.- P. 73-76.

4. Mooi F.R., van Loo I. H., King A. J. Adaptation of Bordetella pertussis to vaccination: a cause for its reemergence? //Emerg. Infect. Dis. 2001. - V. 7. - P. 526-528.

5. Preziosi M. P., Yam A., Wassilak S. G. et al. Epidemiology of pertussis in a West African community before and after introduction of a widespread vaccination program // Am. J. Epidemiol. 2002.- V. 155.- P. 891-896

6. Baron S.E., Njamkepo E., Grimprel P. et al. Epidemiology of pertussis in French hospitals in 1993 and 1994: thirty years after a routine use of vaccination // Pediatr. Infect. Dis. J. 1998.- V. 17,- P. 412-418.

7. Barry E.M., Weiss A. A., Ehrmann I. E. et al. Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin and hemolytic activities require a second gene, cyaC, for activation // J. Bacteriol. -1991.- V. 173.- P. 720-726.

8. Cherry J.D. Epidemiological, clinical, and laboratory aspects of pertussis in adults //Clin. Infect. Dis. 1999. - V. 28(Suppl. 2). - P. S112-S117.

9. Cherry J.D., Heininger U. Pertussis and other Bordetella infections // In R. D. Feigin, J. D. Cherry, G. J. Demmler, and S. Kaplan (ed.), Textbook of pediatric infectious diseases, 5th ed. The W. B. Saunders Co, Philadelphia,Pa. -2004.-P.1588- 1608.

10. Crowcroft N.S., Booy R., Harrison T. et al. Severe and unrecognised: pertussis in UK infants // Arch. Dis. Child. 2003. - V. 88.- P. 802-806

11. Nelson J.D. The changing epidemiology of pertussis in young infants. The role of adults as reservoirs of infection // Am. J. Dis. Child. 1978.- V. 132.- P. 371-373.

12. Cullinane L.C., Alley M.R., Marshall R.B, Manktelow B.W. Bordetella parapertussis from lambs // N.Z. Vet. J. 1987. - V. 35. P. 175.

13. Skeeles J. K., Arp, L. H // In Diseases of Poultry, Edited by B. W. Calnck and others. Ames, IA: University of Iowa Press. 1988.- P. 275-288.

14. Wintzingerode F., Schattke A, Siddiqui R.A.et al. Bordetella petriis isolated from an anaerobic biorea, and emended description of genus Bordetella // Int. J. Syst Evol. Microbiol.- 2001.- V. 51.- P. 1257- 1265.

15. Weyant R.S., Hollis D.G., Weaver R.E. et al. Bordetella holmesii sp. nov., a new gram-negative species associated with septicemia // J.Clin Microbiol 1995.- V. 33. -P. 1-7.

16. Tang Y.W., Hopkins M.K., Kolbert C. P. et al. Bordetella holmesii-like organisms associated with septicemia, endocarditis, and respiratory failure // Clin Infect Dis.- 1998.- V. 26. P. 389-392.

17. Yih W.K., Silva E.A., Ida J. et al. Bordetella holmesii-like organisms isolated from Massachusetts patients with pertussis-like symptoms // Emerg Infect Dis 1999. - V. 5. - P. 441-443.

18. Mazengia E., Silva E.A., Peppe, J.A.et al. Recovery of Bordetella holmesii from patients with pertussis-like symptoms: use of pulsed-field gel electrophoresis to characterize circulating strains // J Clin Microbiol 2000. - V. 38. - P. 2330-2333.

19. Shepard C.W., Daneshvar M.I., Kaiser R.M. et al. Bordetella holmesii bacteremia: a newly recog-nized clinical entity among asplenic patients // Clin Infect Dis- 2004. -V. 38. P. 799-804.

20. Cookson B.T., Vandamme P., Carlson L.C. et al. Bacteremia caused by a novel Bordetella species, 'B. hinzii' // J Clin Microbiol- 1994. V. 32. - P. 2569-2571.

21. Kattar M.M., Chavez J.F., Limaye A. P. et al. Application of 16S rRNA gene sequencing to identify Bordetella hinzii as the causative agent of fatal septicemia // J Clin Microbiol 2000. - V. 38. - P. 789-794.

22. Vandamme P., Heyndrickx M., Vancanneyt M. et al. Bordetella trematum sp. nov., isolated from wounds and ear infections in humans, and reassessment of Alcali-genes denitrificans Ruger and Tan 1983 // Int. J. Syst. Bacterid.- 1996. V. 46. - P. 849-858.

23. Cummings C.A., Brinig M.M., Lepp P.W., et al. Bordetella species are distinguished by patterns of substantial gene loss and host adaptation // J. Bacteriol. 2004. - V. 186. P. 1484- 1492.

24. Gerlach G., von Wintzingerode F., Middendorf В., Gross R. Evolutionary trends in the genus Bordetella // Microbes Infect. 2001. - V. 3. - P. 61-72.

25. Finn T.M., R. Shahin, J. J. Mekalanos. Characterization of vz'r-activated TnPhoA gene fusions in Bordetella pertussis // Infect. Immun.-1991. V. 59. - P. 3273-3279.

26. Hewlett E.L., Gordon V. M., McCaffery J. D. et al. Adenylate cyclase toxin from Bordetella pertussis. Identification and purification of the holotoxin molecule // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 19379- 19384.

27. Livey I., Wardlow A. Production and properties of Bordetella pertussis heat-labile toxin // J. Med. Microbiol.- 1984. V. 17. - P. 91-103.

28. Mooi F.R., Jansen W.H., Brunings H. et al Construction and analysis of Bordetella pertussis mutants defective in the production of fimbriae // Microb. Pathag.-1992. V. 12. - P. 127- 135.

29. Relman D.A. Domenighini M., Tuomanen E.T. et al. Filamentous hemagglutinin of Bordetella pertussis: nucleotide sequence and crucial role in adherence 11 Proc. Natl. Acad. Sci. -1989. V. 86. - P. 2634- 2641.

30. Roberts M.F.N., Fairweather N.F., Leininger E. et al. Construction and characterization of Bordetella pertussis mutants lacking the vir-regulated P.69 outer membrane protein // Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. - P. 1393-1404.

31. Fernandez R.C., Weiss A.A. Cloning and sequencing of a Bordetella pertussis serum resistance locus // Infect. Immun. 1994. - V. 62. - P. 4727-4738.

32. Cotter, P. A., Miller J. F. Bordetellaln E. A. Groisman (ed.), Principles of bacterial pathogenesis I I Academic Press, Ltd., London, United Kingdom 2001. - P. 619-674.

33. Munoz J.J., Arai H.,. Bergman R. K, Sadowski P. L. Biological activities of crystalline pertussigen from Bordetella pertussis //Infect. Immun. 1981. - V. 33. -P. 820-826.

34. Stockbauer K.E, Foreman-Wykert A.K, Miller J.F. Bordetella type III secretion induces caspase 1-independent necrosis // Cell Microbiol. 2003. - V. 5. - P. 123-32.

35. Roy C.R., Falkow S. Identification of Bordetella pertussis regulatory sequences required for transcriptional activation of the fhaB gene and autoregulation of thebvgAS operon I I J. Bacteriol. -1991. V.173. - P. 2385- 2392.г

36. Stibitz S., Aaronson W., Monack D., Falkow S. Phase-variation in Bordetella pertussis by frameshift mutation in a gene for a novel two-component system // Nature.-1989. V. 338. - P.226- 229.

37. Uhl M.A., Miller J. F. Bordetella pertussis BvgAS virulence control system // In J. A. Hoch and T. J. Silhavy (ed.), Two-component signal transduction. ASM Press, Washington, D.C. 1995.- P. 333-349.

38. Arico В., Miller J. F., Roy C. et al. Sequences required for expression of Bordetella pertussis virulence factors share homology with prokaryotic signal transduction proteins I I Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. - V. 86. - P. 6671-6675.

39. Jacob-Dubuisson F., Kehoe В., Willery E. et al. Molecular characterization of Bordetella bronchiseptica filamentous haemagglutinin and its secretion machinery // Microbiology 2000. - V. 146. - P. 1211-1221

40. Coutte L., Willery E., Antoine R. et al. Surface anchoring of bacterial subtilisin important for maturation function // Mol. Microbiol. 2003. - V. 49. - P. 529-539.

41. Relman D., Tuomanen E., Falkow S., et al. Recognition of a bacterial adhesion by an integrin: macrophage CR3 (alpha M beta 2, CDllb/CD18) binds filamentous hemagglutinin of Bordetella pertussis // Cell 1990. - V. 61. - P. 1375- 1382.

42. Ishibashi Y., Claus S., Relman D. A. Bordetella pertussis filamentous hemagglutinin interacts with a leukocyte signal transduction complex and stimulates bacterial adherence to monocyte CR3 (CDllb/CD18) // J. Ex P. Med.- 1994. V. 180. - P. 1225- 1233.

43. Saukkonen K., Cabellos C., Burroughs M. et al. Integrin-mediated localization of Bordetella pertussis within macrophages: role in pulmonary colonization // J. Ex P. Med. -1991. V. 173. - P. 1143- 1149.

44. Prasad S.M., Yin Y., Rodzinski E. et al. Identification of a carbohydrate recognition domain in filamentous hemagglutinin from Bordetella pertussis // Infect. Immun. 1993. - V. 61. - P. 2780- 2785.

45. Menozzi F.D., Gantiez C., Locht C. Interaction of the Bordetella pertussis filamentous hemagglutinin with heparin // FEMS Microbiol. Lett.-1991. -V.62.-P.59-64.

46. Mattoo Y.S., Yuk M. H. The Bvg virulence control system regulates biofilm formation in Bordetella bronchiseptica // J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - P. 5692-5698.

47. Tuomanen E.J., Nedelman J.O., Hendley, Hewlett E. Species specificity of Bordetella adherence to human animal ciliated respiratory epithelial cells // Infect. Immun. 1983. - V. 42. - P. 692-695.

48. Arico В., Nuti S., Scarlato V., Rappuoli R. Adhesion of Bordetella pertussis toeucaryotic cells requires a time-dependent export and maturation of filamentous hemagglutinin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. - V. 90. - P. 9204-9208.

49. Tuomanen E., Weiss A. Characterization of two adhesins of Bordetella pertussis for human ciliated respiratory epithelial cells // J. Infect. Dis. 1985. - V. 152. - P. 118-125.

50. Weiss A.A., Goodwin M.S.M. Lethal infection by B. pertussis mutants in the infant mouse model // Infect. Immun. 1989. - V. 57. - N 12. - P. 3757-3764.

51. Locht С. Molecular aspects of Bordetella pertussis pathogenesis // Internatl Microbiol -1999. V. 2. - P. 137-144

52. Kimura A., Mountzouros K.T, Relman D.A. et al. Bordetella pertussis filamentous hemagglutinin: evaluation as a protective antigen and colonization factor in a mouse respiratory infection model // Infect. Immun. 1990.- V. 58. - P. 7- 16.

53. Goodwin M.S., Weiss A.A. Adenylate cyclase toxin is critical for colonization and pertussis toxin is critical for lethal infection by Bordetella pertussis in infant mice // Infect. Immun. -1990. V. 58. - P. 3445-3447.

54. KHeLaf N., Zychlinsky A., Guiso N. Bordetella pertussis induces apoptosis in macrophages: role of adenylate cyclase-hemolysin // Infect. Immun. -1993. V. 61. -P. 4-4071.

55. Roberts M., Cropley I., Chatfield S. Dougan G. Protection of mice against respiratory Bordetella pertussis infection by intranasal immunization with P. 69 and FHA // Vaccine 1993. V. 11. - P. 866-872.

56. Akerley B.J., Cotter P. A., Miller J.F. Ectopic expression of the flagellar regulon alters development of the Bordetella-host interaction // Cell 1995. -V.80. - P.611-20

57. Cotter P.A., Yuk M.H., Mattoo S et al. Filamentous hemagglutinin of Bordetella bronchiseptica is required for efficient establishment of tracheal colonization // Infect. Immun. 1998. - V. 66. - P. 5921-5929.

58. Robinson A. Ashworth L.A. Acellular and defined-component vaccines against pertussis // In: Wardlaw A.C. and Parton R. ed. Pathogenesis and immuniti in pertussis. John Wiley et Sons Inc. New.-York. 1988. - P. 399-417.

59. Storsaeter J., Hallander H., Farrington C. P. et al. Secondary analyses of the efficacy of two acellular pertussis vaccines evaluated in Swedish phase III trial // Vaccine. 1990. - V. 8. - P. 457-461.

60. Hallander HO, Olin P, Reizenstein E, Storsaeter J. A controlled trial of a two-component cellular, a five-component acellular, and a whole-cell pertussis vaccine // N Engl J Med 1996. - V. 334. - P. 349-355

61. Stevenson A, Roberts M. Use of Bordetella bronchiseptica and Bordetella pertussis as live vaccines and vectors for heterologous antigens // FEMS Immunol Med Microbiol. 2003. - V. 37. - №(2-3). - P. 121-128.

62. Mielcarek N., Nordstrom I., Menozzi F. D. et al. Genital Antibody Responses in Mice after Intranasal Infection with an Attenuated Candidate Vector Strain of Bordetella pertussis // Infection and Immunity 2000. -V.68. -№2. - P. 485-491.

63. Mielcarek N., Cornette J., Schacht A.M. et al. Intranasal priming with recombinant Bordetella pertussis for the induction of a systemic immune response against a heterologous antigen // Infect Immun. 1997. - V. 65.- №2. - P. 544-550.

64. Mielcarek N, Debrie A-S, Raze D. et al. Live Attenuated B. pertussis as a Single-Dose Nasal Vaccine against Whooping Cough // PLoS Pathogens 2006. - 2. P. 0662-0670

65. Robinson A., Ashworth L.A., Irons L.I. Serotyping Bordetella pertussis strains // Vaccine -1989. V. 7. - P. 491-494.

66. Robinson A., Irons L.I, Ashworth L.A. Pertussis vaccine: present status and future prospects // Vaccine -1985. V. 3. - P. 11- 22.

67. Ashworth L.A.E., Dowset A.B., Irons L.G., Robinson. The location of surface antigens of Bordetella pertussis by immunoelectron microscopy // In: Proceedings of the Fourth International Symposium on Pertussis. 1985. - P. 143-152

68. Cowell J.L., Zhang J.M., Urisu A. et al. Purification and characterization of serotype 6 fimbriae from Bordetella pertussis and composition of their properties with serotype 2 fimbriae // Infect. Immun. 1987. - V. 55. - P. 916-922.

69. Willems R.J.L., Geuijen C., van der Heide H.G.J. et al. Isolation of a putative fim-brial adhesin from Bordetella pertussis and the identification of its gene // Mol Microbiol 1993. - V. 9. - P. 623-634

70. Willems RJL, Paul A, van der Heide HGJ et al. Fimbrial phase variation in Bordetella pertussis: a novel mechanism for transcriptional regulation // EMBO J -1990. -V. 9. P. 2803-2809

71. Livey G., Dugleby C.J., Robinson A. Cloning and nucleotide sequence analysis of serotype 2 fimbrial subunit gene of Bordetella pertussis // Mol. Microbiol. 1987. -V. 1. - P. 203- 209.

72. Mooi F.R., ter Avest A., Han G.J., Van der Heicle. Structure of Bordetella pertussis gene coding for the serotype 3 fimbrial subunit // FEMS Microbiol. Lett. 1990. -V. 66. - P. 327-332.

73. Kania S.A.,. Burns S. E. H, Odom Jr., T. F. et al. Characterization of fimN, a new Bordetella bronchiseptica major fimbrial subunit gene // Gene 2000. - V. 256. - P. 149-155.

74. Boschwitz J. S., van der Heide H. G., Mooi, F. R, Relman D. A. Bordetella bronchiseptica expresses the fimbrial structural subunit gene jimA // J. Bacteriol. 1997. -V. 179. - P. 7882-7885.

75. Geuijen C. A., Willems R. J, Bongaerts M. et al. Role of the Bordetella pertussis minor fimbrial subunit, FimD, in colonization of the mouse respiratory tract // Infect. Immun. -1997. -V. 65. P. 4222-4228.

76. Hazenbos W.L., Geuijen C.A., van den Berg В. M. et al. Bordetella pertussis fimbriae bind to human monocytes via the minor fimbrial subunit FimD // J. Infect. Dis. 1995. - V. 171. - P. 924-929.

77. Hazenbos W. L., van den Berg В. M., Geuijen C. W. et al. Binding of FimD on Bordetella pertussis to very late antigen-5 on monocytes activates complement receptor type 3 via protein tyrosine kinases // J. Immunol. 1995. -V. 155. - P. 3972-3978.

78. Mattoo S., Miller J. F, Cotter P. A. Role of Bordetella bronchiseptica fimbriae in tracheal colonization and development of a humoral immune response // Infect. Immun. 2000. - V. 68. - P. 2024- 2033.

79. Cherry J.D., Gornbein J., Heininger U., Stehr K. A search for serologic correlates of immunity to Bordetella pertussis cough illnesses // Vaccine 1998. - V. 16. - P. 1901- 1906.

80. Storsaeter J., Hallander H. O., Gustafsson L., Olin P. Levels of anti- P ertussis antibodies related to protection after household exposure to Bordetella pertussis // Vaccine 1998. -V. 16. - P. 1907- 1916.

81. Olin P., Rasmussen F., Gustafsson L. et al. Randomised controlled trial of two-component, three-component, and five-component acellular pertussis vaccines compared with whole-cell pertussis vaccine // Lancet 1997. - V. 350. - P. 1569- 1577.

82. Montaraz J. A., Novotny P., Ivanyi J. Identification of a 68-kilodalton protective protein antigen from Bordetella bronchiseptica // Infect. Immun. 1985. -V. 47. - P. 744-751.

83. Charles I. G., Dougan G., Pickard D. et al. Molecular cloning and characterization of protective outer membrane protein P.69 from Bordetella pertussis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1989. V. 86. - P. 3554-3558

84. Li L. J., Dougan G., Novotny P. , Charles I. G. P.70 pertactin, an outer-membrane protein from Bordetella parapertussis: cloning, nucleotide sequence and surface expression in Escherichia coli // Mol. Microbiol. -1991. V. 5. - P. 409-417.

85. Emsley P, Charles I.G, Fairweather N.F, Isaacs N.W. Structure of Bordetella pertusssis virulence factor P.69 ertactin // Nature -1996. V. 381. - P. 90-92.

86. Leininger E., Kenimer J.G., Brennan M.J. Surface proteins of B. pertussis: roll in adherence // Proc. of the sixth international symposium on pertussis. September, 26-28,-1990.- P.100-105.

87. Leininger E., Roberts M., Kenimer J.G. et al. Pertactin, an Arg-Gly-Asp-containing Bordetella pertussis surface protein that promotes adherence of mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1991. V. 88. - P. 345-349.

88. Ewanowich C.A., Sherburne R.K., Man S.F. P., Pepler M.S. Bordetella pertussis invasion of HELA 229 cells and human respiratory epithelial cells in primary culture // Infect. Immun. -1989. V. 57. - N 4. - P. 1240-1247.

89. Shanin R.D., Brenner M.J., Li Z.M., et al. Characterization of the protective capacity and immunogenicity of the 69-kD outer membrane protein of B. pertussis // J. Ex P. Med. 1990. - V. 171. - P. 63-73.

90. Cherry J.D. Comparative efficacy of acellular pertussis vaccines: an analysis of recent trials. Pediatr // Infect. Dis. J. 1997. - V. 16. - P. S90-S96.

91. Tamura M., Nogimori K., Murai S. et al. Subunit structure of islet-activating protein, pertussis toxin in conformity with A-B model // Bichem. 1982. - V. 21. - P. 5516-5522.

92. Tallett A, Seabrook R.N., Irons L.I. et al. Localisation of a receptor-recognition domain on the S3 subunit of pertussis toxin by peptide mapping // Eur J Biochem. -1993.-V. 211.-P. 743-8.

93. Nicosia A., Perugini M., Franzini C. et al. Cloning and sequencing of pertussis toxin genes duplication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1986.- V. 83. P. 4631-4635.

94. Locht C, Keith J.M. Pertussis toxin gene: nucleotide sequence and genetic organization // Science 1986. - V. 232. - P. 1258-1264.

95. Stein P.E., Boodhoo A., Armstrong G.D. et al. The crystal structure of pertussis toxin // Structure 1994. - V. 2. - P. 45-57.

96. Bokoch G.M., Gilman A.G. Inhibition of receptor-mediated release of arachi-donic acid by pertussis toxin // Cell 1984. - V. 39. - P. 301-308.

97. Katada Т., Tamura M., Ui M. The A protomer of islet-activating protein, pertussis toxin, as an active peptide catalyzing ADP-ribosylation of a membrane protein // Arch. Biochem. Biophys. 1983. - V. 224. - P. 290- 298.

98. Pittman M. The concept of pertussis as a toxin-mediated disease // Pediatr. Infect. Dis. J. 1984. - V. 3. - P. 467-486.

99. Munoz J.J. Biological activities of pertussigen (pertussis toxin) // In: Sekura RD, Moss J, Vaughn M Pertussis Toxin. Orlando, FL: Academic Press- 1985.- P. 1-18

100. Dimitri A. Diavatopoulos, Craig A. et al. Bordetella pertussis, the Causative Agent of Whooping Cough, Evolved from a Distinct, Human-Associated Lineage of B. bronchiseptica// PLOS Pathogens. 2005.- V. 1. - P. 373-383.

101. Covacci A., Rappuoli R. Pertussis toxin export requires accessory genes located downstream from the pertussis toxin operon // Mol. Microbiol. 1993. - V. 8. - P. 429-434.

102. Craig-Mylius K. A., Weiss A.A. Mutants in the ptlA-H genes of Bordetella pertussis are deficient for pertussis toxin secretion // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 179. - P. 479-484.

103. Weiss A.A., Johnson F.D., Burns D.L. Molecular characterization of an operon required for pertussis toxin secretion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. - V. 90. -P. 2970- 2974.

104. Kotob S. I.,. Hausman S. Z, Burns D. L. Localization of the promoter for the ptl genes of Bordetella pertussis, which encode proteins essential for secretion of pertussis toxin // Infect. Immun. 1995.- V. 63. - P. 3227-3230.

105. Ricci S., Rappuoli R., Scarlato V. The pertussis toxin liberation genes of Bordetella pertussis are transcriptionally linked to the pertussis toxin operon // Infect. Immun. 1996. - V. 64. - P. 1458-1460.

106. Pizza M., Covacci A., Bartoloni A. Et al. Mutants of pertussis toxin sutable for vaccine development // Science. 1989. - V. 246. - P. 497-500.

107. Loosmore S., Cockle S., Zealey G., et al. Detoxification of pertussis toxin by site- directed mutagenesis: a review of connaught strategy to develop a recombinant pertussis vaccine // Mol. Immunol. -1991. V. 28. - N 3. - P. 235- 238.

108. Loosmore S.M., Zealey G., Cockle S., et al. Characterization of pertussis toxin analogs containing mutations in B-oligomer subunits // Infect. Immun. 1993. - V. 61.-N 6.- P. 2316-2324.

109. Guiso N., Rocancourt M., Szatanik M., Alonso J.-M. Bordetella adenylate cyclase is a virulence associated factor and an immunoprotective antigen // Microbial. Pathogenesis. 1989. - V. 7. - P. 373-380.

110. Leusch M.S., Paulaitis S., Friedman R.L. Adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis: production, purification, and partial characterization // Infect. Immun. -1990. V. 58. -11. - P. 3621-3626.

111. Glaser P., Sakamoto H., Bellalou J. et al. Secretion of cyclolysin, the calmodulin-sensitive adenylate cyclase haemolysin bifunctional protein of Bordetella pertussis //The EMBO J. - 1988. - V. 7. - P. 3997-4004.

112. Bellalou J., Sakamoto H., Ladant D. et al. Deletions affecting haemolytic and toxin activities of Bordetella pertussis adenilate cyclase I I Infect. Immun. 1990. - V. 58.- P. 3242-3247.

113. Gross M.K., Au D.C., Smith A.L., Storm D.R. Targeted mutations that ablate either the adenylate cyclase or hemolysin function of the bifunctional cyaA toxin of

114. Bordetella pertussis abolish virulence // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. - V. 89. - P. 4898-4902.

115. Glaser P. , Ladant D., Sezer O., et al. The calmodulin-sensitive adenylate cyclase of Bordetella pertussis: cloning and expression in Escherichia coli II Mol. Microbiol. 1988. - V. 2. - P. 19-30.

116. Glaser P., Elmaoglou-Lazaridou A., Krin E. et al. Identification of residues essential for catalysis and binding of calmodulin in Bordetella pertussis adenilate cyclase by site-directed mutagenesis // he EMBO J. 1989. - V. 8. - P. 967-972.

117. Weingart C.L., Weiss A. A. Bordetella pertussis virulence factors affect phagocytosis by human neutrophils // Infect. Immun. 2000. - V. 68. - P. 1735- 1739.

118. Nakai Т., Sawata A., Kume K. Intracellular location of dermonecrotic toxins in Pasteurella multocida and aabordetella bronchiseptica // Am. J. Vet. Res. 1985. - V. 46. - P. 870-874

119. Nakase I., Endoh M. Heat-labile toxin of Bordetella pertussis // In: Pathogenesis and immunity in Pertussis. Ed. by A.C. Wardlaw and R. Parton. 1988. - P. 231- 245.

120. Kashimoto T, Katahira J, CornejoW.R. et al .Identification of functional domains of Bordetella dermonecrotizing toxin // Infect Immun. -1999. V. 67.- P. 3727-32.

121. Walker KE, Weiss AA. Characterization of the dermonecrotic toxin in members of the genus Bordetella // Infect Immun. -1994.- V. 62.- P. 3817- 28.

122. Pullinger G.D., Adams Т.Е., Mullan P.B. et al. Cloning, expression, and molecular characterization of the dermonecrotic toxin gene of Bordetella spp. // Infect Immun. -1996. V. 64.- P. 4163-71

123. Zhang, Y. L., R. D. Sekura. Purification and characterization of the heat-labile toxin of Bordetella pertussis // Infect. Immun. -1991. V. 59. - P. 3754-3759.

124. Horiguchi Y., Nakai Т., Kume K. Effects of Bordetella bronchiseptica der-monecrotic toxin on the structure and function of osteoblastic clone MC3T3-E1 cells // Infect. Immun. -1991. V. 59. - P. 1112-1116.

125. Horiguchi Y., Senda Т., Sugimoto N. et al. Bordetella bronchiseptica dermone-crotizing toxin stimulates assembly of actin stress fibres and focal adhesions by modifying the small GTP-binding protein rho // J.Cell Sci.- 1995.- 108.- P. 3243-51.

126. Masuda M, Betancourt L, Matsuzawa T, et al. Activation of rho through a crosslink with polyamines catalyzed by Bordetella dermonecrotizing toxin // EMBO J. -2000Л V. 15.-P. 521-530

127. Cookson B.T., Tyler B.N., Coldman W.F. Primary structure of the peptidogly- * can-derived tracheal cytotoxin of Bordetella pertussis // Biochemistry. 1989. - V. 28. - P. 1744- 1749.

128. Goldman W.E. Tracheal cytotoxin of Bordetella pertussis // In: Pathogenesis and immunity in Pertussis. Ed. by A.C. Waldlaw and R. Parton. 1988. - P. 231- 245.

129. Goldman W.E., Herweldt L.A. Bordetella pertussis tracheal cytotoxin // Develop. Biol. Stand. 1985. - V. 61. - P. 103- 111.

130. Goldman W.E., Klapper D.G., Baseman J.B. Detexion, isolation, and analysis of a released Bordetella pertussis product toxic to cultured tracheal cells // Infect. Immun. 1982. - V. 36. - P. 782-794.

131. Wilson R. Read R., Thomas M. Et al. Effect of Bordetella prertussis infectiion on human respiratory epithelium in vivo and in vitro // Infect. Immun. 1991. - V. 59. - P. 337-345.

132. Flak T.A., Goldman W.E. Autotoxicity of nitric oxide in airway disease // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996 - V. 54. - P. S202-S206.

133. Flak T.A.,. Goldman W.E. Signalling and cellular specificity of airway nitric oxide production in pertussis // Cell. Microbiol. 1999. - V. 1. - P. 51-60.

134. Heiss L.N., Flak T. A., Lancaster J.R. et al. Nitric oxide mediates Bordetella pertussis tracheal cytotoxin damage to the respiratory epithelium // Infect. Agents. Dis. -1993.-V. 2. P. 173-177.

135. Heiss L. N., Moser S. A., Unanue E. R., Goldman W. E. Interleukin- 1 is linked to the respiratory epithelial cytopathology of pertussis // Infect. Immun. 1993. - V. 61. - P. 3123-3128.

136. Caroff M., Cavaillon J-M., Fitting C., Haeffner-Cavaillon N // Inability of py-rogenic, purified Bordetella pertussis lipid a to induce interleukin- 1 release by human monocytes // Infect. Immun. 1986. - V. 54. - P. 465-471.

137. Vinogradov E, Peppier M.S., Perry M.B.The structure of the nonreducing terminal groups in the O-specific polysaccharides from two strains of Bordetella bronchiseptica // Eur J Biochem. 2000. - V. 267. - 24. - P. 7230-7

138. Preston, A., Parkhill J., Maskell D.J. The Bordetellae: lessons from genomics // Nat. Rev. Microbiol. 2004. - V. 2Л P. 379-390.

139. Ray A, Redhead K, Selkirk S, Poole S Variability in LPS composition, antigenicity and reactogenicity of phase variants of Bordetella pertussis // FEMS Microbiol Lett 1991. - V. 63. - P. 211-217.

140. Preston A., Thomas R., Maskell D. J. Mutational analysis of the Bordetella pertussis wlb LPS biosynthesis locus // Microb. Pathog. 2002.- V. 33. - P. 91-95.

141. Harvill E.T., Preston A.,. Cotter P.A. et al. Multiple roles for Bordetella lipopolysaccharide molecules during respiratory tract infection // Infect. Immun. -2000. V. 68. - P. 6720-6728.

142. Kubori Т., Matsushima Y., Nakamura D. Et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system // Science 1998. - V. 280. - P. 602-605.

143. Cornelis G. R., F. Van Gijsegem. Assembly and function of type III secretory systems //Annu. Rev. Microbiol. 2000. - V. 54. - P. 735-774.

144. Hueck C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62. - P. 379-433.

145. Mattoo S., Yuk M. H., Huang., L. L., Miller J. F. Regulation of type III secretion in Bordetella // Mol. Microbiol. 2004. - V. 52. - P. 1201-1214.

146. Yuk M. H., Harvill E. Т., Cotter P.A., Miller J. F. Modulation of host immune responses, induction of apoptosis and inhibition of NF-kappaB activation by the Bordetella type III secretion system // Mol. Microbiol. 2000. - V. 35. - P. 991- 1004.

147. Yuk M. H., Harvill E. Т., Miller J. F. The BvgAS virulence control system regulates type III secretion in Bordetella bronchiseptica // Mol. Microbiol. -1998. V. 28. - P. 945-959.

148. Weiss AA, Hewlett EL, Myers GA, Falkow S. Tn5-induced mutations affecting virulence factors of Bordetella pertussis I I Infect Immun. 1983. - V. 42. - P. 33-41.

149. Graeff-Wohlleben H., Deppisch H., Gross R. Global regulatory mechanisms affect virulence gene expression in Bordetella pertussis // Mol. Gen. Genet. 1995. -V. 247. - P. 86-94.

150. Miller JF, Mekalanos JJ, Falkow S. Coordinate regulation and sensory transduction in the control of bacterial virulence // Science. 1989 - V. 243. - P. 916- 22.

151. Klumpp S., Krieglstein J. Phosphorylation and dephosphorylation of histidine residues in proteins Ц Eur. J. Biochem. — 2002.- V. 269. P. 1067-1071.

152. Uhl M. A.,. Miller J. F. Integration of multiple domains in a two-component sensor protein: the Bordetella pertussis BvgAS phosphorelay // EMBO J. 1996. - V. 15.-P. 1028- 1036.

153. Boucher P. E., Menozzi F. D., Locht C. The modular architecture of bacterial response regulators: insights into the activation mechanism of the BvgA transactiva-tor of Bordetella pertussis // J. Mol. Biol. 1994. - V. 241. - P. 363-377.

154. Boucher P. E., Murakami K., Ishihama A., Stibitz S. Nature of DNA binding and RNA polymerase interaction of the Bordetella pertussis BvgA transcriptional activator at the fha promoter // J. Bacteriol. -1997. V. 179. - P. 1755- 1763.

155. Boucher P.E., Stibitz S. Synergistic binding of RNA polymerase and BvgA phosphate to the pertussis toxin promoter of Bordetella pertussis // J. Bacteriol.-1995. V. 177. - P. 6486-6491.

156. Deora R., Bootsma H. J., Miller J. F., Cotter P.A. Diversity in the Bordetella virulence regulaon: transcriptional control of a Bvg-intermediate phase gene // Mol. Microbiol. 2001. -V. 40. - P. 669-683.

157. Karimova G., Bellalou J., Ullmann A. Phosphorylation-dependent binding of BvgA to the upstream region of the cyaA gene of Bordetella pertussis // Mol. Microbiol. 1996. - V. 20. - P. 489-496.

158. Karimova G., Ullmann A. Characterization of DNA binding sites for the BvgA protein of Bordetella pertussis //J. Bacteriol. -1997.- V. 179. -P. 3790-3792.

159. Kinnear S. M.,. Boucher P.E, Stibitz S., Carbonetti N. H. Analysis of BvgA activation of the pertactin gene promoter in Bordetella pertussis // J. Bacteriol. -1999. -V. 181.-P. 5234-5241.

160. Zu Т., Mannetti R, Rappouli R., Scarlato V. Differential binding of BvgA to two classas of virulence genes of Bordetella pertussis directs promoter sensitivity to RNA polymerase // Mol. Microbiol. 1996. - V. 21. - P. 557-565.

161. Merkel T.J., Stibitz S. Identification of a locus required for the regulation of bvg-repressed genes in Bordetella pertussis // J. Bacteriol. 1995. -V. 177. -P. 2727-36.

162. Cotter P.A., Miller J. F. BvgAS-mediated signal transduction: analysis of phase-locked regulatory mutants of Bordetella bronchiseptica in a rabbit model I I Infect. Immun. -1994. -V. 62. P. 3381-3390.

163. Martinez de Tejada G., Miller J. F., Cotter PA. Comparative analysis of the virulence control systems of Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica I I Mol. Microbiol. 1996. - V. 22. - P. 895-908.

164. Cotter P. A., Miller J. F. A mutation in the Bordetella bronchiseptica bvgS gene results in reduced virulence and increased resistance to starvation, and identifies a new class of Bvg-regulated antigens // Mol. Microbiol. 1997. - V. 24. - P. 671-685.

165. Deora R. Differential regulation of the Bordetella bipA gene: distinct roles for different BvgA binding sites I I J. Bacteriol. -2002. -184.- P. 6942-6951.

166. Stockbauer К. E., Fuchslocher В., Miller J. F., Cotter P. A. Identification and characterization of BipA, a Bordetella Bvg- intermediate phase protein I I Mol. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 65-78.

167. Lacey B. W. Antigenic modulation of Bordetella pertussis //J. Hyg. 1960. -V. 31.-P. 423-434.

168. Fuchslocher В., Millar L. L., Cotter P. A. Comparison of bipA alleles within and across Bordetella species I I Infect. Immun. 2003. - V. 71. - P. 3043-3052.

169. Scarlato V., Arico В., Prugnola A., Rappuoli R. Sequential activation and environmental regulation of virulence genes in Bordetella pertussis //EMBO J. -1991. -V. 10.-P. 3971-3975.

170. Gerlach G, Janzen S, Beier D, Gross R. Functional characterization of the BvgAS two-component system of Bordetella holmesii // Microbiology. 2004 - V. 150(Pt 11). - P. 3715- 29.

171. Marques R. R., Carbonetti N. H. Genetic analysis of pertussis toxin promoter activation in Bordetella pertussis // Mol. Microbiol. 1997. - V. 24. - P. 1215- 1224.

172. Stibitz S. Mutations affecting the asubunit of Bordetella pertussis RNA polymerase suppress growth inhibition conferred by short C-terminal deletions of the response regulator BvgA // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 2484- 2492.

173. Boucher P., Yang M. S., a Stibitz S. Mutational analysis of the high-affinity BvgA binding site in the fha promoter of Bordetella pertussis // Mol. Microbiol. -2001.- V. 40. P. 991-999.

174. Boucher P. E., Maris A. E, Yang M., Stibitz S. The response regulator BvgA and RNA Polymerase «subunit C-terminal domain bind simultaeously to different faces of the same segment of promoter DNA // Mol.Cell 2003. -V. 11. -P. 163- 173.

175. Boucher P.E., Yang M. S., Schmidt D. M., Stibitz S. Genetic and biochemical analyses of BvgA interaction with the secondary binding region of the fha promoter of Bordetella pertussis // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. -P. 536-544.

176. Melton A.R., Weiss A.A. Characterization of environmental regulators of Bordetella pertussis // Infect Immun. 1993. - V. 61. - P. 807-815.

177. Merkel T. J., Stibitz S., Keith J. M. et al. Contribution of regulation by the bvg locus to respiratory infection of mice by Bordetella pertussis. Infect // Immun. —1998. V. 66. - P. 4367-4373.

178. Merkel, T. J.,. Barros C, Stibitz S. Characterization of the bvgR locus of Bordetella pertussis //J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 1682- 1690.

179. Merkel T. J., Boucher P. E., Stibitz S., Grippe V. K. Analysis of bvgR Expression in Bordetella pertussis // J Bacteriology 2003. - V. 185. - P. 6902-6912

180. Mishra M., Deora R. Mode of Action of the Bordetella BvgA Protein: Transcriptional Activation and Repression of the Bordetella bronchiseptica bipA Promoter 11 J Bacteriol. -2005.- V. 187. P. 6290-6299.

181. Preston N.W. Pertussis today. «Pathogenesis and immunity in Pertussis» // Ed.by Wardlaw A.C. and Parton R.-J.Willey and Sons Ltd. -1988. P. 1-18.

182. Е.Ф.Трушина-Туманова Е.Ф. Изучение изменчивости коклюшного микроба // Журнал микробиология. 1949. - Т.5. - С. 61-68

183. Porter J. F., Parton R., Wardlaw A. C. Growth and survival of Bordetella bronchiseptica in natural waters and in buffered saline without added nutrients // Appl. Environ. Microbiol. -1991.- V. 57. P. 1202-1206.

184. Porter J. F., Wardlaw A. C. Long-term survival of Bordetella bronchiseptica in lakewater and in buffered saline without added nutrients // FEMS Microbiol. Lett. -1993. V. 110. - P. 33-36.

185. Mattoo S., James D. Molecular Pathogenesis, Epidemiology, and Clinical Manifestations of Respiratory Infections Due to Bordetella pertussis and Other Bordetella Subspecies // Clinical Microbiology Reviews.- 2005.- V. 18.- P. 326-382.

186. Gueirard P., Minoprio P., Guiso N. Intranasal inoculation of Bordetella bronchiseptica in mice induces long-lasting antibody and T-cell mediated immune responses // Scand. J. Immunol. 1996. - V. 43. - P.181-192.

187. Mills К. H., Barnard A., Watkins J., Redhead K. Cell-mediated immunity to Bordetella pertussis: role of Thl cells in bacterial clearance in a murine respiratory infection model // Infect. Immun. 1993. - V. 61. - P. 399-410.

188. Ewanowich C. A., Melton A. R., Weiss A. A., et al. Invasion of HeLa 229 cells by virulent Bordetella pertussis // Infect. Immun. 1989. - V. 57. - P.2698- 2704

189. Lee С. K.? Roberts A. L, Finn Т. M. et al. A new assay for invasion of HeLa 229 cells by Bordetella pertussis: effects of inhibitors, phenotypic modulation, and genetic alterations // Infect. Immun. 1990. - V. 58. - P.2516- 2522.

190. Masure H. R. The adenylate cyclase toxin contributes to the survival of Bordetella pertussis within human macrophages // Microb. Pathog. 1993. -V. 14. - P. 253- 260.

191. Steed L.L., Setareh M., Friedman R.L. Host- parasite interactions between Bordetella pertussis and human polymorphonuclear leukocytes // J. Leukocyte Biol. -1991. V. 50. - P. 321-330

192. Chhatwal G. S., Walker M. J., Yan H. et al. Temperature dependent expression of an acid phosphatase by Bordetella bronchiseptica: role in intracellular survival // Microb. Pathog. -1997. V. 22. - P. 257- 264

193. Guzman C. A., Rohde M., Timmis К. M. Invasion and intracellular survival of Bordetella bronchiseptica in mouse dendritic cells // Infect. Immun. 1994. -V. 62. -P. 5528-5537.

194. Guzman C. A., Rohde M., Timmis K. N. Mechanisms involved in uptake of Bordetella bronchiseptica by mouse dendritic cells // Infect. Immun. 1994. - V. 62. - P. 5538-5544.

195. Schipper H.,. Krohne G. F, Gross R. Epithelial cell invasion and survival of Bordetella bronchiseptica // Infect. Immun. 1994. - V. 62. - P. 3008-3011.

196. Savelkoul P. H. M., Kremer В., Kusters J. G. et al. Invasion of HeLa cells by Bordetalla bronchiseptica // Microb. Pathog. 1993. - V. 14. - P.161- 168.

197. West N. P., Fitter J. T, Jazubzik U et al. Non-motile mini-transposon mutants of Bordetella bronchiseptica exhibit altered abilities to invade and survive in eukaryotic cells // FEMS Microbiol. Lett. 1997. - V. 146. - P. 263- 269.

198. Banemann A., Gross R. Phase variation affects long-term survival of Bordetella bronchiseptica in professional phagocytes // Infect. Immun. -1997. V. 65. - P. 3469-3473.

199. Forde C.B., Parton R., Coote J. G. Bioluminescence as a Reporter of Intracellular Survival of Bordetella bronchiseptica in Murine Phagocytes // Infect Immun. — 1998.- V. 66. P. 3198-3207.

200. Woods D. E., Franklin R., Cryz S. J. et al. Development of a rat model for respiratory infection with Bordetella pertussis // Infect. Immun. 1989. - V. 57. - P. 1018- 1024.

201. KHeLaf N., Guiso N. Induction of macrophage apoptosis by Bordetella pertussis adenylate cyclase-hemolysin // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 134. - P. 27-32.

202. Weingart C. L., Mobberley-Schuman P. S., Hewlett E. L. et al. Neutralizing antibodies to adenylate cyclase toxin promote phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils // Infect. Immun. 2000. - V. 68. - P. 7152-7155.

203. Bassinet L., Gueirard P., Maitre B. et al. Role of Adhesins and Toxins in Invasion of Human Tracheal Epithelial Cells by Bordetella pertussis // Infect and Immun -2000. V. 68. - P. 934- 1941.

204. Van den Berg В., Beekhuizen H., Willems R. J. L. et al. Role of Bordetella pertussis virulence factors in adherence to epithelial cell lines derived from the human respiratory tract // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - P. 1056-1062

205. Hellwig S.M, Hazenbos WL, van de Winkel JG., Mooi FR. Evidence for an intracellular niche for Bordetella pertussis in broncho-alveolar lavage cells of mice // FEMS Immunol Med Microbiol. -1999. V. 26. - P. 203- 207.

206. Gueirard P., Druilhe A., Pretolani M, Guiso N. Role of adenylate cyclase-hemolysin in alveolar macrophage apoptosis during Bordetella pertussis infection in vivo // Infect Immun. 1998. - V. 66 . - P. 1718- 25.

207. McMillan D. J., Shojaei M.,. Chhatwal G. S et al. Molecular analysis of the bvg-repressed urease of Bordetella bronchiseptica // Microb. Pathog. 1996. - V. 21- P. 379-394.

208. Steed LL, Akporiaye ET, Friedman RL Bordetella pertussis induces respiratory burst activity in human polymorphonuclear leukocytes // Infect Immun. 1992 - V. 60. - P. 2101-2105.

209. Schneider В, Gross R, Haas A. Phagosome acidification has opposite effects on intracellular survival of Bordetella pertussis and B. bronchiseptica // Infect Immun. -2000.-V. 68. P. 7039-48

210. Haas A. Reprogramming the phagocytic pathway—intracellular pathogens and their vacuoles // Mol Membr Biol. -1998.- V. 15. P. 103-121

211. Lin J., Lee I. S., Frey J. et al. Comparative analysis of extreme acid survival in Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, and Escherichia coli // J Bacteriol. -1995. V. 177. - P. 4097-4104.

212. Foster J.W., Moreno M. Links Inducible acid tolerance mechanisms in enteric bacteria // Novartis Found Symp. -1999. V. 221. - P. 55-69.

213. Otero AS, Yi XB, Gray MC. et al. Membrane depolarization prevents cell invasion by Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin // Microb Pathog. 1993 - V. 14. -P. 161-8

214. Ganz T, Lehrer R I. Antimicrobial peptides of vertebrates // Curr Opin Immunol. -1998. V. 10. - P. 41-44

215. McPheat W.L., Hanson J.H. Livey L. et.al. Analysis of separate isolates of Bordetella pertussis repeated DNA sequences // J. Gen. Microbiol. 1989. - V. 35. - P. 1515- 1520.

216. McLafferty M.A., Harcus D.R., Hewlett E.L. Nucleotide sequence and characterization of a repetitive DNA element from the genome of Bordetella pertussis with characteristics of an insertion sequence // J Gen Microbiol. 1988. - V. 134. - P. 2297-306.

217. Хесин P.B. непостоянство генома // M. Наука. 1984. - С. 36-116.

218. Ильина Т.С. Механизмы генетической транспозиции // Генетика. -1981. -Т. 1. С. 7-32.

219. Stibitz S., Yang M.-S. Genomic fluidity of Bordetella pertussis assessed by a new method for chromosomal mapping // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 5820-5826.

220. Hendrix R. W., Smith C.M., Burns R. N. et al. Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages: All the world's a phage // PNAS. 1999. - V. 96. - P. 2192- 2197.

221. Brusson H., Canchaya C., Hardt W-D. Phage and evolution of bacteria pathogens: from genomic rearrengements to lysogenic convertion // Microbiol. And Mol. Biol. Reviews. 2004. - V. 68. P. 560-602.

222. Canchaya C., Proux C., Fournous G. et al. Prophage Genomics // Microbiol. Mol. Biol.Rev.- 2003. V. 67,. - P. 238- 276.

223. Shelton C.B., Crosslin D.R., Casey J.L, et all Purification and Characterization of a Temperate Transducing Bacteriophage for Bordetella avium // Journal of Bacteriol.- 2000. V. 82. - P. 6130-6136.

224. Liu M, Deora R., Doulatov S. et.all Reverse Transcriptase-Mediated Tropism Switching in Bordetella Bacteriophage // Science. 2002. - V. 295. - P. 2091- 2094.

225. Liu M., Gingery M., Doulatov S.R. et.all Genomic and Genetic Analysis of Bordetella Bacteriophages Encoding Reverse Transcriptase-Mediated Tropism-Switching Cassettes // J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - P. 503-1517.

226. Лапаева И.А., Мебель С. M., Переверзев Н.А., Синяшина Л.Н. Бактериофаг Bordetella pertussis II Ж. Микробиол. 1980. - Т. 5. -С. 85-90.

227. Переверзев Н.А., Синяшина Л.Н Структурная организация бактериофага выделенного из Bordetella pertussis II Ж. Микробиол.-1981. -Т.5. С. 54-57.

228. Синяшина Л.Н., Лапаева И.А., Мебель С. М. Прозрачная плотная питательная среда для изучения литического спектра бактериофагов микробов рода Bordetella // Ж.микробиол. 1982. -Т.6. - С. 53-55.

229. Синяшина Л.Н., Лапаева И.А., Мебель С. М. Характеристика основных биологических свойств бактериофагов Bordetella II Ж. Микробиол. -1982. —Т. 8.- С. 66-69.

230. Лапаева И.А., Мебель С. М., Синяшина Л.Н., Шахватова О.Ю. Конверсия токсигенности коклюшными фагами у Bordetella parapertussis II Ж.Микробиол.- 1982. -Т. 9. С. 60-64.

231. Antoine, R., Locht, С. Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from gram- positive organisms 11 Mol Microbiol -1992. V.6. - P. 1785-99.

232. Graham, A. C. , Abruzzo, G. K. Occurrence and characterization of plasmids in field isolates of Bordetella bronchiseptica // Am J Vet Res 1982. - V.43. - P. 1852-1855.

233. Hedges R. W., Jacob A. E. , Smith, J. T. Properties of an R factor from Bordetella bronchiseptica I IJ Gen Microbiol -1974. V. 84. - P.199-204.

234. Lax, A. J. , Walker, C. A. Plasmids related to RSF1010 from Bordetella bronchiseptica II Plasmid -1986. V. 15. - P. 210-216.

235. Shimizu M., Kuninori, К., Inoue, M. , Mitsuhashi, S. Drug resistance and R plasmids in Bordetella bronchiseptica isolates from pigs // Microbiol Immunol -1981.-V. 25.-P. 773-786.

236. Speakman A. J., Binns S. H., Osborn A. M. et al. Characterization of antibiotic resistance plasmids from Bordetella bronchiseptica // J Antimicrob Chemother — 1997.- V. 40. P. 811-816.

237. Terakado N., Azechi H., Ninomiya K. ,Shimizu T. Demonstration of R factors in Bordetella bronchiseptica isolated from pigs // Antimicrob Agents Chemther 1973. - V.3.-P. 555-558.

238. Terakado N., Mitsuhashi, S. Properties of R factors from Bordetella bronchiseptica II Antimicrob Agents Chemother -1974. V. 6. - P. 836-840.

239. Kamachi K, Sota M, Tamai Y. et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP- lbeta plasmids without accessory mobile elements // Microbiology. 2006. - V. 152(Ptl2). - P.3477-84.

240. Baraff L. J., Wilkins J., Wehrle P. F. The role of antibiotics, immunizations, and adenoviruses in pertussis // Pediatrics 1978. - V. 61. -P. 224- 230.

241. Collier A. M., Connor J. D., Irving W. R., Jr. Generalized type 5 adenovirus infection associated with the pertussis syndrome // J. Pediatr. 1966. - V. 69. - P. 1073- 1078.

242. Davis S. F.,. Sutter R. W, Strebel P. M. et al. Concurrent outbreaks of pertussis and Mycoplasma pneumoniae infection: clinical and epidemiological characteristics of illnesses manifested by cough // Clin. Infect. Dis. 1995. - V. 20. - P. 621-628.

243. Hallander H. O., Gnarpe J., Gnarpe H., Olin P. Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae and persistent cough in children. Scand // J. Infect. Dis. 1999. - V. 3. - P. 281- 286

244. Wirsing von Konig С. H., Rott H., Bogaerts H., Schmitt H. J. A serologic study of organisms possibly associated with pertussis-like coughing // Pediatr. Infect. Dis. J. 1998. - V. 17. - P. 645-649.

245. Loeffelholz M. J. Bordetella // In P. R. Murray, E. J. Baron, J. H. Jorgensen, M.

246. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 8th ed. ASM Press, Washington, D.C.- 2003.- P. 780-788.

247. Buck, G. E. Detection of Bordetella pertussis by rapid-cycle PCR and colorimet-ric microwell hybridization // J.Clin. Microbiol. 1996. -V.34. - P. 1355- 1358.

248. Meade B. D., Bollen A. Recommendations for use of the polymerase chain reaction in the diagnosis of Bordetella pertussis infections // J. Med. Microbiol. 1994. -V. 41. - P. 51-55.

249. Miiller F. M., Hoppe J. E., Wirsing von Konig С. H. Laboratory diagnosis of pertussis: state of the art in 1997 // J. Clin. Microbiol. 1997. -V. 35. - P. 2435- 2443.

250. Reizenstein E., Johansson В., Mardin L. et al. Diagnostic evaluation of polymerase chain reaction discriminative for Bordetella pertussis, B. parapertussis, and

251. B. bronchiseptica // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1993. - V. 17. - P. 185-191.

252. Reizenstein E., Lindberg L., Mollby R., Hallander H. O. Validation of nested Bordetella PCR in pertussis vaccine trial // J.Clin. Microbiol. 1996. -V.34. - P. 810-815.

253. Cloud J. L., Hymas W. C., Turlak A. et al. Description of a multiplex Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis LightCycler PCR assay with inhibition control // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2003. - V. 46. - P. 189- 195.

254. Dragsted D. M., Dohn В., Madsen J., Jensen J. S. Comparison of culture and PCR for detection of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis under routine laboratory conditions // J. Med. Microbiol. 2004. - V. 53. - P. 749-754.

255. Farrell J. D., McKeon M., Daggard D. et al. Rapid-Cycle PCR method to detect Bordetella pertussis that fulfills all consensus recommendations for use of PCR in diagnosis of pertussis // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 4499-4502.

256. Poddar S. K. Detection and discrimination of B. pertussis and B. holmesii by real-time PCR targeting IS481 using a beacon probe and probe-target melting analysis // Mol. Cell. Probes 2003. - V. 17. - P. 91-98.

257. Taranger J., Trollfors В., Lind L. et al. Environmental contamination leading to false- P ositive polymerase chain reaction for pertussis // Pediatr. Infect. Dis. J. -1994. V. 13.-P. 936-937.

258. Qin X., Galanakis E., Martin E.T. et al. Multitarget PCR for Diagnosis of Pertussis and Its Clinical Implications // Journal of Clinical Microbiology, February -2007. V. 45. - P. 506-511.

259. Taylor A. L. Вacteriophage-induced mutation in E. coli // Proc. Natl Acad. Sd.USA-1963. V. 50.-P. 1043-51.

260. Fiandt M., Szybalski W., Malamy M. H. Polar mutations in lac, gal and phage Xconsist of a few DNA sequences inserted with either orientation // Mol. Gen.Genet. -1972.-V. 119.-P. 223- 231.

261. Hirsch H. J., Starlinger P., Brachet, P. Two kinds of insertions in bacterial genes // Mol. Gen. Genet. -1972. V. 119. - P. 191- 206.

262. Heffron F. Tn3 and its relatives // In Mobile Genetic Elements. J. A. Shapiro (ed.). Academic Press, New York, 1983. -P. 223- 260.

263. Kleckner, N. (1983) Transposon TnlO // In Mobile Genetic Elements. J. A. Shapiro (ed.). Academic Press, New York, P. 261- 298.

264. Sherratt O. Tn3 and related transposable elements: site-specific recombination and transposition // In Mobile DNA. о. E. Berg and M. M. Howe (eds). American So-ciet; for Microbiology, Washington, ОС, 1989. - P. 163-184.

265. Henderson I. R., Owen P., James P. Molecular switches the ON and OFF of bacterial phase variation // Molecular Microbiology - 1999. - V. 33. - P. 919-932.

266. Mahillon J, Rezsohazy R, Hallet B, Delcour J. IS231 and other Bacillus thur-ingiensis transposable elements: a review // Genetica. -1994. V. 93. - P.13-26.

267. Brynestad S, Synstad B, Granum P E. The Clostridium perfringens enterotoxin gene is on a transposable element in type A human food poisoning strains // Microbiology. -1997. V. 143. - P. 2109-2115.

268. Cornillot E, Saint-Joanis B, Daube G. et al. The enterotoxin gene (cpe) of Clostridium perfringens can be chromosomal or plasmid-borne // Mol Microbiol. —1995. -V. 15. P. 639-647.

269. Гинцбург A.JI., Янишевский H.B., Мотин В.Л. и др. Природа последовательностей RSI, фланкирующих ген vet, кодирующий синтез холерного токсина у Vibrio cholerae eltor // Ж. молек. Генетт. Микробиол.и вирусол.- 1986. № 2,-С. 11-17.

270. Stroeher U Н, Jedani К Е, Dredge В К. et al. Genetic rearrangements in the rfb regions of Vibrio cholerae 01 and 0139 // Proc Natl Acad Sci USA. -1995. V. 92. - P. 10374-10378.

271. Fetherston J D, Perry R D. The pigmentation locus of Yersinia pestis KIM6 is flanked by an insertion sequence and includes the structural genes for pesticin sensitivity and HMWP2 // Mol Microbiol. -1994. V. 13. - P. 697-708

272. Filippov A A, Oleinikov P N, Drozdov A V, Protsenko О A. The role of IS-elements of Yersinia pestis (Lehmann, Neumann) in the emergence of calcium-independent mutations // Genetika. -1990. V. 26. - P. 740-1748.

273. Groisman E A, Ochman H. Pathogenicity islands: bacterial evolution in quantum leaps // Cell. -1996. V. 87.- P. 791-794.

274. Otten L, Canaday J, Gerard J C. et al. Evolution of agrobacteria and their Ti plasmids // Mol Plant-Microbe Interact. -1992. V. 5. - P. 279-287.

275. Reimmann C, Moore R, Little S. et al. Genetic structure, function and regulation of the transposable element IS21 // Mol Gen Genet. 1989. - V. 215. - P. 416-424.

276. Leelaporn A, Firth N, Byrne M.E. Possible role of insertion sequence IS257 in dissemination and expression of high- and low-level trimethoprim resistance in staphylococci // Antimicrob Agents Chemother. 1994. - V. 38. - P. 2238-2244.

277. DeShazer D., Wood G. E., Friedman R. L. Molecular characterization of catalase from Bordetella pertussis: identification of the katA promoter in an upstream insertion sequence // Mol Microbiol. -1994. V. 14. - P. 123-130.

278. Ciampi M S, Schmid M B, Roth J R. Transposon TnlO provides a promoter for transcription of adjacent sequences // Proc Natl Acad Sci USA. 1982. - V. 79. - P. 5016-5020.•

279. Haack K.R., Roth J.R. Recombination between chromosomal IS200 elements supports frequent duplication formation in Salmonella typhimurium // Genetics. -1995. V. 141. - P. 1245-1252

280. Louarn J M, Bouche J P, Legendre F. et al. Characterization and properties of very large inversions of the E. coli chromosome along the origin-to-terminus axis // Mol Gen Genet. -1985. V. 201. - P. 467-476

281. Savic D.J, Romac S.P., Ehrlich S.D. Inversion in the lactose region of Escherichia coli К- 12: inversion termini map within IS3 elements alpha 3 beta 3 and beta 5 alpha 5 // J Bacteriol. -1983. V. 155. - P. 943-946.

282. Carniel E. "Evolution of pathogenic Yersinia, some lights in the dark" // in "The genus Yersinia" Advances Experimental Medicine and Biology, V529, Kluwer Academic, New York 2003. - P. 3-12.

283. Galas D.J., Chandler M. Bacterial insertion sequences // In: Berg D E, Howe M M., editors. Mobile DNA. Washington, D.C: American Society for Microbiology; -1989. P. 109-162.

284. Small P M., van Embden J D A. Molecular epidemiology of tuberculosis // In: Bloom В R., editor. Tuberculosis: pathogenesis, protection, and control. Washington, D.C: American Society for Microbiology/ 1994. - P. 569-582

285. Cheng X, Nicolet J, Poumarat F. et al. Insertion element IS1296 in Mycoplasma mycoides subs P. mycoides small colony identifies a European clonal line distinct from African and Australian strains // Microbiology. -1996.- V. 141. P. 3221-3228.

286. Stanley J, Baquar N, Threlfall E J. Genotypes and phylogenetic relationships of Salmonella typhimurium are defined by molecular fingerprinting of IS200 and 16S rrn loci // J Gen Microbiol. 1993. - V. 139. - P. 1133-1140

287. Bik E. M., Gouw R. D., Mooi F. R. DNA fingerprinting of Vibrio cholerae strains with a novel insertion sequence element: a tool to identify epidemic strains // J Clin Microbiol. 1996. - V. 34. - P. 1453-1456

288. Kunst F, Ogasawara N, Moszer I, et al. The complete genome sequence of the Gram- positive bacterium Bacillus subtilis // Nature. 1997. - V. 390. - P. 249-256.

289. Derbyshire К M, Hwang L, Grindley N D. Genetic analysis of the interaction of the insertion sequence IS903 transposase with its terminal inverted repeats // Proc Natl Acad Sci USA. 1987. - V. 84. - P. 8049-8053.

290. Derbyshire К M, Kramer M, Grindley N D. Role of instability in the cis action of the insertion sequence IS903 transposase // Proc Natl Acad Sci USA. -1990. V. 87. - P. 4048-4052.

291. Huisman O, Errada P R, Signon L, Kleckner N. Mutational analysis of ISlO's outside end // EMBO J. 1989. - V. 8. - P. 2101-2109

292. Makris J. C., Nordmann P. L., Reznikoff W. S. Mutational analysis of insertion sequence 50 (IS50) and transposon 5 (Tn5) ends // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. - V. 85. - P. 2224-2228

293. Zerbib D, Prentki P, Gamas P. et al. Functional organization of the ends of IS1: specific binding site for an ISl-encoded protein // Mol Microbiol. 1990. - V. 4. - P. 1477-1486

294. Machida С, Machida Y. Regulation of IS1 transposition by the insA gene product // J Mol Biol. 1989. - V. 208. - P. 567-574.

295. Stalder R, Caspers P, Olasz F, Arber W. The N-terminal domain of the insertion sequence 30 transposase interacts specifically with the terminal inverted repeats of the element // J Biol Chem. -1990. V. 265. - P. 3757-3762.

296. Wiegand T. W., Reznikoff W. S. Interaction of Tn5 transposase with the transpo-son termini // J Mol Biol. -1994. V. 235.- P. 486-495

297. Polard P., Ton-Hoang В., Haren L. et al. IS911-mediated transpositional recombination in vitro // J Mol Biol. 1996. - V. 264. - P. 68-81.

298. Lavoie В D, Chaconas G. Transposition of phage Mu DNA // Curr Top Microbiol Immunol. 1996. - V. 204. - P. 83-102.

299. Maekawa T, Amemura-Maekawa J, Ohtsubo E. DNA binding domains in Tn3 transposase // Mol Gen Genet. 1993.- V. 236. - P. 267-274.

300. Bolland S, Kleckner N. The three chemical steps of TnlO/ISlO transposition involve repeated utilization of a single active site // Cell. 1996. -V. 84. - P. 223-233.

301. Grindley N.D., Leschziner A.E. DNA transposition: from a black box to a color monitor // Cell. -1995. V. 83. - P. 1063-1066.

302. Rice P, Craigie R, Davies D R. Retroviral integrases and their cousins // Curr Opin Struct Biol. 1996.- V. 6. - P. 76-83.

303. Turlan C, Chandler M. ISl-mediated intramolecular rearrangements: formation of excised transposon circles and replicative deletions // EMBO J. 1995. - V. 14. - P. 5410-5421.

304. Weinert T A, Schaus N A, Grindley N D. Insertion sequence duplication in transpositional recombination // Science. 1983. - V. 222. - P. 755-765.

305. Doolittle W.F, Kirkwood T.B, Dempster M.A. Selfish DNAs with self-restraint // Nature. 1984. - V. 307. - P. 501-502.

306. Escoubas J M, Prere M F, Fayet O. et al. Translational control of transposition activity of the bacterial insertion sequence IS1 // EMBO J. -1991.- V.10. P.705-12.

307. Zerbib D, Polard P, Escoubas J M. et al. The regulatory role of the ISl-encoded InsA protein in transposition // Mol Microbiol. 1990. - V. 4. P. 471-477.

308. Hu S. Т., Hwang J. H., Lee L.C. et al. Functional analysis of the 14 kDa protein of insertion sequence 2 // J Mol Biol. 1994. - V. 236. - P. 503-513.

309. Davis M A, Simons R W, Kleckner N. TnlO protects itself at two levels from fortuitous activation by external promoters // Cell. -1985. V. 43. - P. 379-387.

310. Krebs M P, Reznikoff W S. Transcriptional and translational initiation sites of IS50. Control of transposase and inhibitor expression // J Mol Biol. 1986. - V. 192. - P. 781-791.

311. Roth D B, Lindahl T, Gellert M. Repair and recombination. How to make ends meet // Curr Biol. 1995. - V. 5. - P. 496^199.

312. Luthi K, Moser M, Ryser J., Weber H. Evidence for a role of translational frameshifting in the expression of transposition activity of the bacterial insertion element IS1 // Gene. 1990. - V. 88. - P. 15-20.

313. De Meirsman C, Van Soom C, Verreth C. et al. Nucleotide sequence analysis of IS427 and its target sites in Agrobacterium tumefaciens T37 // Plasmid. 1990. - V. 24. - P. 227-234.

314. Mariani F, Piccolella E, Colizzi V. Characterization of an IS-like element from Mycobacterium tuberculosis // J Gen Microbiol. 1993. - V. 139. - P. 1767-1772.

315. Fournier P, Paulus F, Otten L. IS870 requires a 5'-CTAG-3' target sequence to generate the stop codon for its large ORFl // J Bacteriol. -1993. -V.175. P. 3151-60.

316. Levchenko I, Yamauchi M, Baker T A. ClpX and MuB interact with overlapping regions of Mu transposase: implications for control of the transposition pathway // Genes Dev. 1997. - V. 11. - P. 1561-1572.

317. Lewis L A., Grindley N D. Two abundant intramolecular transposition products, resulting from reactions initiated at a single end, suggest that IS2 transposes by an unconventional pathway // Mol Microbiol. 1997. - V. 25. - P. 517-529.

318. Lane D., Cavaille J., Chandler M. Induction of the SOS response by IS1 transposase // J Mol Biol. 1994. - V. 242. - P. 339-350.

319. Weinreich M D, Makris J C, Reznikoff W S. Induction of the SOS response in Escherichia coli inhibits TnJ and IS50 transposition // J Bacteriol. 1991. - V. 173. -P. 6910-6918.

320. Kuan С. Т., Liu S. K., Tessman I. Excision and transposition of Tn5 as an SOS activity in Escherichia coli // Genetics 1991. - V. 128. - P. 45-57.

321. Kuan С T, Tessman I. Further evidence that transposition of TnJ in Escherichia coli is strongly enhanced by constitutively activated RecA proteins // J Bacteriol. -1992.- V.174. P. 6872-6877

322. Ahmed A. Evidence for replicative transposition of Tn5 and Tn9 // J Mol Biol. -1986.-V. 191.-P. 75-84.

323. Lundblad V, Taylor A F, Smith G R, Kleckner N. Unusual alleles of recB and recC stimulate excision of inverted repeat transposons TnlO and Tn5 // Proc Natl Acad Sci USA. 1984. - V. 81. - P. 824-828.

324. Isberg R R, Syvanen M. DNA gyrase is a host factor required for transposition of Tn5 // Cell. 1982. - V. 30. - P. 9-18.

325. Pato M L, Banerjee M. The Mu strong gyrase-binding site promotes efficient synapsis of the prophage termini // Mol Microbiol. 1996. - V. 22. - P. 83-292.

326. Yin J С, Krebs M P, Reznikoff W S. Effect of dam methylation on Tn5 transposition. // J Mol Biol -1988.- V. 199. P. 35-45.

327. Koonin E V, Ilyina T V. Computer-assisted dissection of rolling circle DNA replication // Biosystems. 1993. - V. 30. - P. 241-268.

328. Haren L., Betermier M., Polard P., Chandler M. IS911-mediated intramolecular transposition is naturally temperature sensitive // Mol Microbiol 1997. - V. 25. -P. 531-540.

329. Plasterk R.H.A. Mechanism of DNA transposition // In.Mobile genetic elements IRL Press, ed. Sheratt D J. 1995. - P. 18-37

330. Berg M. Berg D. Transposable elements as tools for molecular analysis in bacteria // In.Mobile genetic elements IRL Press, ed. Sheratt D.J. -1995. P. 38-68

331. Berger, В., D. Haas. Transposase and cointegrase: specialized transposition proteins of the bacterial insertion sequence IS27 and related elements // Cell. Mol. Life Sci. 2001. - V. 58. - P. 403-419.

332. Huang D C, Novel M, Novel G. A transposon-like element on the lactose plas-mid of Lactococcus lactis subs P.lactis Z270 // FEMS Microbiol Lett. 1991. - V. 61. - P. 101-106.

333. Polard P, Ргёге M F, Chandler M, Fayet O. Programmed translational frameshift-ing and initiation at an AUU codon in gene expression of bacterial insertion sequence IS911 // J Mol Biol. 1991. - V. 222. - P. 465^77.

334. Ton-Hoang B, Betermier M, Polard P, Chandler M. Assembly of a strong promoter following IS911 circularization and the role of circles in transposition // EMBO J. 1997. - V. 16. - P. 3357-3371.

335. Ton-Hoang B, Polard P, Chandler M. Efficient transposition of IS911 circles in vitro // EMBO J. 1998. - V. 17. - P. 1169-1181.

336. Robertson H M. The mariner transposable element is widespread in insects // Nature. 1993. - V. 362. - P. 241-245.

337. Davies D.R., Goryshin I.Y., Reznikoff W.S et al. Three-dimensional structure of the Tn5 synaptic complex transposition intermediate // Science 2000. - V. 289 - P. 77-85.

338. Naumann T. A., Reznikoff W. S. Tn5 transposase with an altered specificity to transposon ends //J. Bacteriol. 2002.- V. 184. - P. 233- 240.

339. Naumann, T. A., Reznikoff W. S. Tn5 transposase with an altered specificity to transposon ends //J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 233- 240

340. Haren L., Ton-Hoang В., Chandler M. Integrating DNA: Transposases and retroviral integrases // Annu. Rev. Microbiol. 1999. - V. 53. - P. 245- 281.

341. Naumann, T. A., Reznikoff W. S. Tn5 transposase active site mutants // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 17623- 17629

342. Reznikoff W.S., Bordenstein S.R. Apodaca J. Comparative Sequence Analysis of IS50/Tn5 Transposase // J. Bacteriol. 2004. - V. 186.- 24. - P. 8240-8247.

343. Rousseau P., Gueguen E., Duval-Valentin G., Chandler M.The helix-turn-helix motif of bacterial insertion sequence ISP77 transposase is required for DNA binding // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 1335-1344.

344. Doak T G, Doerder F P, Jahn С L, Herrick G. A proposed superfamily of transposase genes: transposon-like elements in ciliated protozoa and a common "D35E" motif// Proc Natl Acad Sci USA. 1994. - V. 91. - P. 942-946.

345. Polard P, Chandler M. Bacterial transposases and retroviral integrases // Mol Microbiol. 1995. - V. 15. - P. 13-23.

346. Kundig, Ghosh W., S., Roseman S. Phosphate bound to histidine in a protein as an intermediate in a novel phosphotransferase system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1964. V. 52. - P. 1067- 1074.

347. Ravi D. В., Saier M.H. Jr. Comparative Genomic Analyses of the Bacterial Phosphotransferase System // Microbiol Mol Biol Rev. 2005. - V. 69. - P. 608-634.

348. Stiilke J, Hillen W. Coupling physiology and gene regulation in bacteria: the phosphotransferase sugar uptake system delivers the signals // Naturwissenschaften. — 1998. V. 85. - P. 583-92.

349. Postma PW, Lengeler JW, Jacobson GR. Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria // Microbiol Rev 1993. - V.57. - P.543-594.

350. Tchieu JH, Norris V, Edwards JS, Saier MH Jr. The complete phosphotranferase system in Escherichia coli // J Mol Microbiol Biotechnol. 2001. - V. 3. - P. 329-46.

351. De Reuse H, Danchin A. The ptsH, ptsl, and err genes of the Escherichia coli phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system: a complex-operon with several modes of transcription // J Bacteriol. 1988.- V.170. - P. 3827-37.

352. Bolshakova TN, Molchanova ML, Erlagaeva RS. et al. A novel mutation FruS, altering synthesis of components of the phosphoenolpyruvate: fructose phosphotransferase system in Escherichia coli K12 // Mol Gen Genet. 1992. - V. 232. -P. 394-8.

353. Гершанович B.H. Плейотропная функция фосфоенопируват зависимой фосфотрансферазной системы. Сообщение 1 // Молек. генет. микробиол. виру-сол. 2003. - Т1. - С. 14- 24.

354. Гершанович В.Н. Плейотропная функция фосфоенопируват зависимой фосфотрансферазной системы. Сообщение 2. // Молек. генет. микробиол. виру-сол. 2003. -Т.З. - С. 3-8.

355. Гершанович В.Н. Плейотропная функция фосфоенопируват зависимой фосфотрансферазной системы. Сообщение 3. // Молек. генет. микробиол. виру-сол. 2004. - Т. 1.-С. 3-12.

356. King, N. D., M. R. O'Brian. Evidence for direct interaction between enzyme INtr and aspartokinase to regulate bacterial oligopeptide transport // J. Biol. Chem. 2001. -V.276.-P. 21311-21316.

357. Cases, I., and V. de Lorenzo. Genetic evidence of distinct physiological regulation mechanisms in the a54 Pu promoter of Pseudomonas putida // J. Bacteriol. -2000. V. 182. - P. 956-960.

358. Merrick, M. J., Coppard J. R. Mutations in genes downstream of the rpoN gene(encoding a54) of Klebsiella pneumoniae affect expression from a54-dependent promoters // Mol. Microbiol. 1989. - V. 3. - P. 1765-1775.

359. Meier, Т. I., Peery R. В., McAllister K. A., Zhao. Era GTPase of Escherichia colt binding to 16S rRNA and modulation of GTPase activity by RNA and carbohydrates // Microbiology 2000. - V. 146. - P. 1071- 1083.

360. Powell B. S., Court D. L., Inada T. et al. Novel proteins of the phosphotransferase system encoded within the rpoN operon of Escherichia coli // J. Biol. Chem. -1995. V. 270. - P. 4822-4839.

361. Merrick M. J., Edwards R. A. Nitrogen control in bacteria // Microbiol. Rev. -1995.- V. 59.- P. 604-622.

362. Deutscher J., Pevec В., Beyreuther K. et al. Streptococcal phosphoenolpyruvate-sugar phosphotransferase system: amino acid sequence and site of ATP-dependent phosphorylation of HPr // Biochemistry -1986. V. 25. - P. 6543-65.

363. Reizer J., Hoischen C., Titgemeyer F. et al. A novel protein kinase that controls carbon catabolite repression in bacteria // Mol. Microbiol. -1998. V.27. - P.1157-69.

364. Alex L., Simon, M. I. Protein histidine kinases and signal transduction in pro-karyotes and eukaryotes // Trends Genet. 1994. - V. 10. - P. 133-138.

365. West, A. H., Stock, A. M. Histidine kinases and response regulator proteins in two-component signaling systems // Trends Biochem. Sci. -2001. V.26. - P.369-76.

366. Stock AM, Robinson VL, Goudreau PN. Two-component signal transduction // Annu Rev Biochem. 2000. - V. 69. - P. 183-215.

367. Purcell E.B., Siegal-Gaskins D., Rawling D.C. et al.A photosensory two-component system regulates bacterial cell attachment // Proc Natl Acad Sci U S A. -2007. V. 104. - P. 18241-6.

368. Barabote R.D., Saier M. H., Jr. Comparative Genomic Analyses of the Bacterial Phosphotransferase System Microbiol // Mol Biol Rev. 2005. - V. 69. - P. 608-634.

369. Giardina P.C., Foster L.A., Musser J.M et al. bvg Repression of alcaligin synthesis in Bordetella bronchiseptica is associated with phylogenetic lineage // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 6058-6063.

370. Cummings C. A., Bootsma H. J.,. Relman D. A, Miller J. F. Species- and Strain-Specific Control of a Complex, Flexible Regulon by Bordetella BvgAS // J. Bacteriol. 2006. - V. 188."- P. 1775-1785.

371. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике // Москва Мир 1984. -С. 436.

372. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование // М. Мир.- 1984. -С. 74- 244

373. Bassett CL, Kushner SR. Exonucleases I, III, and V are required for stability of ColEl-related plasmids in Escherichia coli. // J Bacteriol. 1984. -V.157. - P. 661-4.

374. Вейко H.H., Карпухин A.B. Салимов А.Г. и др. Биотинилированный ДНК-зонд с использованием фотоактивирующего реагента N-(4 азида- 2 нитробенза-ил) -1-7 диамигептана // Биотехнология -1989. Т.2. - С. 414-418.

375. Davis R.W., Simon Н., Devidson Electron microscope heteroduplex method for mapping regions of base sequence homology in nucleic acids // Method in Enzimol. -1971. V. 21. - P. 413-428.

376. Волгина Т.И. Свойства повторяющихся последовательностей B.pertussis // М. Диссертация на соискание уч. ст к.б.н.- 1993.

377. Cheng КС, Smith GR. Recombinational hotspot activity of Chi-like sequences-'//„ J Mol Biol. 1984. - V. 5. - P. 371-7.

378. Horii Z, Clark AJ.Genetic analysis of the recF pathway to genetic recombination in Escherichia coli K12: isolation and characterization of mutants // J Mol Biol. -1973. V. 25. -80. - P. 327-44.

379. Kohara Y, Akiyama K, Isono K. The physical map of the whole E. coli chromosome: application of a new strategy for rapid analysis and sorting of a large genomic library // Cell. 1987. - V. 31. - P. 495-508.

380. Ishii S, Kuroki K, Imamoto F. tRNAMetf2 gene in the leader region of the nusA operon in Escherichia coli. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1984.- V. 81. P. 409- 13.

381. Goran О. В., Lovgren J. M., Wikstrom P.M. Characterization of Mutations in the metY-nusA-infB Operon That Suppress the Slow Growth of a ArimM Mutant // J.Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 6095-6106.

382. Sekowska A., Robin S., Daudin J.-J. et al. Extracting biological information from DNA arrays: an unexpected link between arginine and methionine metabolism in Bacillus subtilis II Genome Biol. 2001.- V. 2. - P. 0019.1-0019.12.

383. Krin E., Laurent-Winter C., Bertin P.N. et al. Transcription Regulation Coupling of the Divergent argG and metY Promoters in Escherichia coli K- 12 // J Bacteriol. -2003. V. 185. - P. 3139-3146.

384. Matchell W.H. Methionine and the Regulation of Ribonucleic Acid Synthesis in Escherichia coli //J. Bacteriol 1967. - V. 1. - P. 90-97

385. Zerbib D, Jakowec M, Prentki P. et al. Expression of proteins essential for IS1 transposition: specific binding of InsA to the ends of IS1 // Embo J. 1987. - V. 6. -P. 3163-3169

386. Mahnke Braam LA., Reznikoff WS. Functional characterization of the Tn5 transposase by limited proteolysis // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 10908- 10913.

387. Chalmers R., Kleckner N. TnlO/ISlO transposase purification, activation, and in vitro reaction // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 029-8035.

388. Tavakoli N., DeVost J., Debryshire K. Defining functional regions of the IS903 transposase // J. Mol. Biol. 1997. - V. 274. - P. 491-504.

389. Yigit H., Reznikoff W.S. Escherichia coli DNA topoisomerase I copurifies with Tn5 transposase, and Tn5 transposase inhibits topoisomerase I I I J. Bacteriol. 1999. - V. 181.-P. 3185-3192.

390. Yigit H., Reznikoff W.S. Escherichia coli DNA topoisomerase I and suppression of killing by Tn5 transposase overproduction: topoisomerase I modulates Tn5 transposition // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 5866-5874.

391. Stibitz S. IS481 and IS1002 of Bordetella pertussis create a 6-base- pair duplication upon insertion at a consensus target site // J Bacteriol. -1998. -V.180. P. 4963-6.

392. Ohtsubo H, Ohtsubo E. Nucleotide sequence of an insertion element, IS1 // Proc Natl Acad Sci USA.- 1978. V. 75. - P. 615-9.

393. Tomcsanyi T, Berg CM, Phadnis SH, Berg DE Intramolecular transposition by a synthetic IS50 (Tn5) derivative // J Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 6348-54.

394. Craig N. L. Transposon Tn7 // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996.- V. 204. -P. 27-48.

395. Mendiola, M.V., F. de la Cruz. Specificity of insertion of IS91, an insertion sequence present in alpha-haemolysin plasmids of Escherichia coli // Mol. Microbiol.-1989. V. 3. - P. 979-984.

396. Hall R.M., Brown H.J., Brookes D.E., H. W. Stokes. Integrons found in different locations have identical 59 ends but variable 39 ends // J.Bacteriol. 1994. — V. 176. -P.6286-6294.

397. Sengstag C., Iida S., Hiestand-Nauer R., Arber W. Terminal inverted repeats of prokaryotic transposable element IS186 which can generate duplications of variable length at an identical target sequence // Gene 1986. - V. 49. - P. 153-156.

398. Galas D.J., Calos M. P., Miller J.H. Sequence analysis of Tn9 insertions in the lacZ gene // J. Mol. Biol. 1980. - V. 144. - P. 19-41.

399. Greated A.,Titok V.A., Krasowiak R. et al. The replication and stable-inheritance functions of IncP-9 plasmid pM3 // Microbiol. -2000. -V. 146. -P. 2249-2258.

400. Gershanovich V.N., Ilyina T.S., Rusina O.Y. et al. Repression of inducible enzyme synthesis in mutant of Escherichia coli K12 deleted for the ptsH gene // Mol.gen.genet. -1977. V. 153. - P. 185- 190.

401. Mink С. M., Cherry J. D., Christenson P. et al. A search for Bordetella pertussis infection in university students // Clin. Infect. Dis. 1992. - V. 14. - P. 464-471.

402. Учакин В.Ф. Руководство по инфекционным болезням у детей // Москва. Гэотар-Медицина -1998. -С. 501-508

403. Лыткина И.Н., Чистякова Г.Г., Филатов Н.Н. Заболеваемость коклюшем в Москве и организация мероприятий по ее снижению // Вакцинопрофилактика неинфекционных заболеваний 2004. —№5. medi.ru/doc/15b35.htm

404. Hu JJ, Lu CY, Chang LY.et al. Survey of pertussis in patients with prolonged cough // J Microbiol Immunol Infect. 2006. - V. 39. - P. 54-8.

405. Ward J., APERT Study Group. Pertussis epidemiology and acellular pertussis vaccine efficacy in older children: NIH APERT Multicenter Pertussis Trial // Ped. Res. 2001. - V. 49. - P. 240A.

406. Strebel P., Nordin J., Edwards K. et al. Population-based incidence of pertussis among adolescents and adults, Minnesota, 1995- 1996 // J. Infect. Dis. 2001. - V. 183. - P. 1353- 1359

407. Hodder S. L., Cherry J. D., Mortimer E. A. et al. Antibody responses to Bordetella pertussis antigens and clinical correlations in elderly community residents // Clin. Infect. Dis. 2000. - V. 31. - P. 7-14

408. Heininger U., Kleemann W. J., Cherry J. D., Group S. S. A controlled study of the relationship between Bordetella pertussis infection and sudden unexpected deaths in German infants // Pediatrics 2004. - V. 114. - P. e9-el5

409. Heininger U., Stehr K., Schmidt-Schlapfer G. et al. Bordetella pertussis infections and sudden unexpected deaths in children // Eur. J. Pediatr. 1996. -V. 155. - P. 551-553.

410. Streisinger G., Edgar R.S., Denhardt G.H. Chromosome structure in phage T4.1. Circularity of the linkage map // PNAS. 1964. - V. 51. - P. 775-779.

411. Туе B.K., Chan R.K., Botstein D. Packaging of an oversize transducing genome by Salmonella phage P22 I I J. Mol. Biol. 1974. - V. 85. - P. 485-500.

412. Туе В.К., Huberman J.A., Botstein D. Non-random circular permutation of phage P22 DNA // J.Mol.Biol. 1974. -V.85. - P. 501-532

413. Vander Byl. C., Kropinski A.M. Sequence of the Genome of Salmonella Bacteriophage P22 // Journal of Bacteriology. 2000. - V. 182. - P. 6472-6481.

414. Casjens S. Molecular organization of the bacteriophage P22 coat protein shell // J. Mol. Biol. 1979. - V. 131. - P. 1- 14.

415. MacHattie L.A., Ritchie D.A., Thomas C.A., Richardson C.C. Terminal repetition in permuted T2 bacteriophage DNA molecules // J. Mol. Biol. 1967. - V. 23.• P. 355-63.

416. Lee C.S., Davis R.W., Davidson N. A physical study by electron microscopy of the terminally repititious, circularly permuted DNA from the coliphage particles of Escherichia coli 15 // J. Mol. Biol. 1970. -V. 48. - P. 1- 22.

417. Ikeda H., Tomizawa J. Prophage PI and extrachromosomal replication unit // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1968. - V.33. - P. 791-798.

418. Покровская M.C. , Каратаев Г.И., Смирнов Г.Б. Особенности образования и свойства плазмид pLS, возникающих в результате делеций генома бактериофага Xatt8o(Tn9) //Мол. генетика, микробиол. и вирусология 1986.- №1.- С.12-18.

419. Gerald G., Leffers Jr., Gottesman S. Lambda Xis Degradation In Vivo by Lon and FtsH //J. Bacteriol. 1998. -V.180. - P. 1573-1577.

420. Svarchevsky A.N., Rybchin V.N. Characteristics of plasmid properties of bacteriophage N15 // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 1984. -V. 10. - P. 34-39.

421. Ravin N.V., Kuprianov V.V., Gilcrease E.B., Casjens S.R. Bidirectional replication from an internal ori site of the linear N15 plasmid prophage I I Nucleic Acids Research.- 2003. -V. 31. P. 6552-6560.

422. Hertwig S., Klein I., Lurz R. et al. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends 11 Mol. Microbiol. 2003. -V.48. - P. 9891003.

423. Barbour A.G., Garon C.F. Linear plasmids of the Borrelia burgdorferi have covalently closed ends // Science. 1987. -V.237. - P. 409-411.

424. Freser C.M., Casjens S., Huang W.M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi // Nature. 1997. -V.390. - P. 580-586.

425. Barbour AG. Plasmid analysis of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent // J Clin Microbiol. -1988. V.26. - P. 475-8.

426. Grimm D, Eggers CH, Caimano MJ. Et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and 1р28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle // Infect Immun. 2004. - V. 72. - P. 5938-46.

427. Roux K.H. Optimization and troubleshooting in PCR // In PCR primers. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab. Press 1995. — P. 60

428. Karen B. Register, Gary N. Sanden Prevalence and Sequence Variants of 1S481 in Bordetella bronchiseptica: Implications for IS481 -Based Detection of Bordetella pertussis //J. Clin. Microbiol.- 2006. V. 44. - P. 4577-4583.

429. Koidl C., Bozic M., Burmeister A. et al. Detection and Differentiation of Bordetella spp. by Real-Time PCR // J. Clin. Microbiol. 2007. - V. 45. -P. 347-350.

430. Riffclmann M., Wirsing von Konig С. H., Саго V. et al. for the Pertussis PCR Consensus Group Nucleic Acid Amplification Tests for Diagnosis of Bordetella Infections // J. Clin. Microbiol.- 2005. V. 43. - P. 4925-4929.

431. Dragsted D. M., Dohn В., Madsen J. et al. Comparison of culture and PCR for detection of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis under routine laboratory conditions // J Med Microbiol 2004. - V. 53. - P. 749-754.

Информация о работе

Каратаев, Геннадий Иванович
доктора биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы