Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики при этих инфекциях.

Борисова, Ольга Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики при этих инфекциях.
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики при этих инфекциях."

БОРИСОВА

ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ГЕНОВ ПАТОГЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ~ КОКЛЮША И ДИФТЕРИИ; СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПРИ ЭТИХ ИНФЕКЦИЯХ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва-2009

003463625

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Мазурова Изабелла Константиновна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Меньшиков Дмитрий Дмитриевич

доктор медицинских наук Грубер Ирина Мироновна

доктор медицинских наук, профессор Далин Михаил Викторович

Ведущая организация:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита диссертации состоится « у> г. в'^^час. на

заседании диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

С.Ю. Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Коклюш и дифтерия являются воздушно-капельными инфекциями, управляемыми средствами специфической вакцинопрофилакти-ки. Массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной против коклюша и дифтерии, осуществляемая в России с 1959 года, позволила достигнуть значительных успехов в борьбе с этими заболеваниями и коренным образом изменила характер течения эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций (Герасимова А.Г. и др., 2004; Лыткина И.Н. и др., 2004; Максимова Н.М. и др., 2002,2003,2008; Маркина С.С. и др., 2002,2005,2006; Петрова М.С. и др., 2000; Селезнева Т.С. и др., 2002, 2004; Чистякова Г.Г. и др., 2001,2005).

В настоящее время в г. Москве на фоне высокого охвата профилактическими прививками (до 95,0%) отмечается относительная стабилизация заболеваемости коклюшем (показатель заболеваемости на 100000 населения (ПЗ) 2006 г. - 13,28; 2007 г. -12,87), однако, регистрируется заболеваемость среди привитых детей, наметились изменения в возрастной структуре заболеваемости (увеличилась доля детей школьного возраста при сохраняющейся высокой заболеваемости среди детей раннего возраста), регистрируются тяжелые формы не только среди детей раннего возраста, но и у детей школьного возраста (Лыткина И.Н. и др., 2004; Чистякова Г.Г. и др., 2005). Аналогичные тенденции развития эпидпроцесса коклюшной инфекции отмечаются и в России (Герасимова А.Г. и др., 2004; Селезнева Т.С. и др., 2002). При дифтерии в настоящее время в России отмечается заболеваемость на спорадическом уровне (ПЗ - 0,48 -0,35 в 2005 - 2007 гг.), однако, продолжают регистрировать тяжелые формы заболевания, летальные исходы, заболеваемость среди привитых лиц, а также бактерионосительство, которое имеет место на фоне высокого уровня антитоксического иммунитета (Максимова Н.М. и др., 2002,2003; Маркина С.С. и др., 2002,2005,2006). Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции и сохранении возбудителей коклюша и дифтерии в окружающей среде, а значит,

существует риск возникновения заболеваний, особенно среди неиммунных и/или лиц с ослабленным иммунитетом.

Таким образом, в настоящее время сохраняются условия для поддержания эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций, что определяет необходимость борьбы с ними на современном этапе и невозможность эрадикации возбудителей дифтерии и коклюша как биологических видов с помощью существующих средств вакцинопрофилактики (Костюкова H.H., 1999; Мазурова И.К., 1993,2002,2006,2008; Комбарова С.Ю., 2007).

Поэтому, в сложившихся условиях необходимо проводить постоянный мониторинг циркулирующих штаммов возбудителей коклюша и дифтерии с использованием молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих выявлять самые незначительные изменения в геномах, в первую очередь, в генах, ответственных за проявление патогенных свойств микробов. Эти мутации могут привести к достаточно серьезным изменениям фенотипа и появлению новых клонов возбудителя, что, в свою очередь, может оказать влияние на течение эпидемических и инфекционных процессов и требует разработки новых технологий диагностики и наблюдения за возбудителями, как дифтерии, так и коклюша.

Цель исследования: выявление молекулярно-генетических особенностей структуры основных генов патогенности В. pertussis и С. diphtheriae, циркулирующих на современном этапе развития эпидемических процессов этих инфекций, и разработка принципиально новых подходов к совершенствованию лабораторной диагностики и средств вакцинопрофилактики коклюша и дифтерии.

Задачи исследования

1. Выявить особенности структуры пяти основных генов патогенности: ptxA гена, кодирующего энзиматически активную S1 субъединицу коклюшного токсина, ргп гена, кодирующего пертактин,flm2 иßm3 генов, кодирующих фймбриальные белки, и tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в период 1948 - 2007 гг.

2. Изучить генетическую структуру штаммов В. pertussis, используемых для приготовления коклюшного компонента АКДС-вак-цины, и провести сравнительный анализ с генетической структурой штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе. Оценить вирулентные свойства штаммов В. pertussis, несущих новые аллельные вариации основных генов па-тогенности.

3. Разработать ускоренный метод мониторинга, основанный на технологии ПЦР-ПДРФ, для выявления распространенных в настоящее время штаммов В. pertussis с измененной структурой гена коклюшного токсина.

4. Разработать и провести клинико-микробиологические испытания ускоренного молекулярно-генетического метода лабораторной диагностики коклюша (LAMP-вариант), позволяющего идентифицировать возбудителя коклюша в клиническом материале без предварительного выделения «чистой» культуры В. pertussis.

5. Изучить структуру гена дифтерийного токсина (tox) и провести наблюдение за распространением штаммов С. diphtheriae, имеющих изменения в его структуре.

6. Определить нуклеотидную последовательность (ату ген), являющуюся генетической детерминантой, определяющей амилазную активность С. diphtheriae, и выявить «мишени» - нуклеотидные последовательности ДНК, ответственные за принадлежность возбудителя дифтерии к биовару gravis или mit is, и на этой основе разработать новый метод дифференциальной диагностики биоваров.

7. Систематизировать коллекцию штаммов В. pertussis, выделенных за период 1948 - 1994 гг., и пополнить коллекцию штаммов В. pertussis и С. diphtheriae штаммами современного периода эпид-процессов.

Научная новизна

Впервые проведен молекулярно-генетический мониторинг штаммов В. pertussis, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, и показано, что происходит вытеснение штаммов, содержащих «вакцинные» аллели, штаммами с «невакцинными» аллелями генов, кодирующих S1 субъединицу коклюшного токсина, пертактина и фимбриальных белков.

на встречаются у 76,0% и 21,9% штаммов, соответственно. В то же время формирование и распространение штаммов с «невакцинными» fim2-2 иflm3B аллелями фимбриальных генов происходит медленнее и встречается в 53,3% и в 83,4% случаев, соответственно. Изменений в структуре гена, кодирующего фактор колонизации трахеи (tcfA) не выявлено. Обнаружено, что современная популяция штаммов В. pertussis, характеризующаяся новыми «невакцинными» аллелями основных генов патогенности, обладает высокой патоген-ностью и высокой лейкоцитозстимулирующей активностью, что влияет на тяжесть клинического течения коклюша.

Получены новые данные о несоответствии структуры основных генов патогенности, ответственных за коклюшный токсин, пертак-тин, фимбриальные белки, штаммов В. pertussis, которые используют в нашей стране для производства АКДС-вакцины, и штаммов

B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем в настоящее время, что является обоснованием совершенствования средств вакци-нопрофилактики при коклюше.

C. diphtheriae PW), которые не сказываются на первичной структуре белка дифтерийного токсина, что формирует генетическую вариабельность вида. В последние годы не произошло распространения штаммов С. diphtheriae с измененной структурой tox гена (в положении 1252), приводящей к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина.

Выявлено, что в геноме штаммов С. diphtheriae биовара gravis имеется нуклеотидная последовательность (ату ген), являющаяся генетической детерминантой, определяющей амилазную активность, в то время как штаммы С. diphtheriae биовара mitis имеют деле-цию этого фрагмента генома.

Сформированы новые подходы в системе мониторинга коклюшной инфекции и лабораторной диагностики коклюша и дифтерии, основанные на современных амплификационных технологиях, использующих выбранные «мишени» (нуклеотидные последовательности ДНК).

Впервые разработан новый метод мониторинга штаммов В. pertussis на основе молекулярно-генетического изучения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ) и получен патент на изобретение № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г.

Впервые разработан прямой ускоренный, высокочувствительный, специфичный и эффективный метод лабораторной диагностики коклюша - LAMP-вариант; получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (52390).

Впервые разработан молекулярно-генетический способ дифференцирования штаммов С. diphtheriae по принадлежности к биовару; получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке №2007140879/13(044745).

Теоретическая значимость

Новые знания о генетической структуре возбудителей коклюшной и дифтерийной инфекций, об измененных нуклеотидных последовательностях и мутациях в генетических детерминантах факторов патогенности штаммов В. pertussis и С. diphtheriae являются обоснованием для создания новых вакцинных препаратов, в первую очередь, при коклюшной инфекции, на основе современных штаммов В. pertussis. Установленные факты имеют значение для формирования новых подходов в системе мониторинга и ускоренной лабораторной диагностики возбудителей коклюша и дифтерии, основанных на выборе генетических «мишеней» и на современных амплификацион-ных технологиях. Данные о генетической гетерогенности штаммов свидетельствуют о резерве изменчивости, лежащем в основе механизмов формирования адаптаций микроорганизмов к меняющимся условиям существования и сохранению В. pertussis и С. diphtheriae как биологических видов.

Практическая значимость

Пополнена уникальная коллекция штаммов В. pertussis и С. diphtheriae, позволяющая проводить многоплановые исследования возбудителей коклюша и дифтерии с целью создания новых препаратов и биотехнологий, направленных на совершенствование лабораторной диагностики и средств иммунопрофилактики при этих инфекциях.

Подобраны штаммы В. pertussis, вызывающие заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса, с новой генетической структурой основных факторов патогенности, как кандидаты для конструирования перспективных вакцинных препаратов.

Новый метод мониторинга штаммов В. pertussis на основе ПЦР-ПДРФ позволяет определять штаммы с измененной структурой ptxA гена коклюшного токсина для наблюдения за циркулирующей на современном этапе развития эпидпроцесса коклюшной инфекции популяцией В. pertussis.

Прямой ускоренный метод лабораторной диагностики коклюша LAMP-вариант выявляет возбудителя заболевания непосредствен-

но из клинического материала больного без выделения «чистой» культуры в течение 9-10 часов. Клинические испытания метода показали его высокую специфичность (100%), высокую чувствительность (102 м.кл.) и высокую диагностическую эффективность (84,9% ± 4,9% (р < 0,001), по сравнению с бактериологическим методом, эффективность которого не превышала 22,7% ± 5,7% (р < 0,001). Использование ЬАМР-варианта расширило возможности обследования больных с различной тяжестью клинического течения болезни, в различные сроки от начала заболевания, начиная с ранних сроков, а также при обследовании детей до 1 года, детей с коклюшем, осложненным другими заболеваниями и в очагах инфекции, в первую очередь, в детских специализированных учреждениях.

Способ дифференциальной диагностики С. сИрЫкепае позволяет определять принадлежность к биовару по более специфичному, по сравнению с биохимической идентификацией, признаку - нуклеотид-ной последовательности в ату гене, что является одним из этапов в создании новых мультиплексных тест-систем для выявления возбудителя дифтерии при обследовании больных с подозрением на дифтерию и для своевременного проведения противоэпидемических мероприятий в очаге.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты проведенных исследований послужили основой для лекций и практических занятий на курсах сертификации и повышения квалификации для врачей -бактериологов «Актуальные вопросы медицинской микробиологии», проводимых на базе ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора (2000 г.; 2004 г.; 2005 г.; 2006 г.); семинара «Биологические свойства возбудителя коклюша и лабораторная диагностика» для врачей-бактериологов филиалов ФГУЗ ЦГиЭ г. Москвы на базе ФГУЗ ЦГиЭ (г. Москва) (2008 г.); семинара по лабораторной диагностике дифтерии для врачей-бактериологов филиалов ФГУЗ ЦГиЭ Центрального Федерального Округа Российской Федерации, проводимого в рамках программы Всемирной Организации Здравоохранения (2002 г.) и были использованы при составлении следующих пособий, рекомендаций и информационного письма (совместно с сотрудниками лаборатории):

1. Пособие для врачей «Характеристика СогупеЪаМегшт сИрЫкепае, циркулирующих в России в период 1984 - 1998 гг. (микробиологический мониторинг в системе эпиднадзора за дифтерийной инфекцией)».

2. Методические рекомендации «Ускоренные методы лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции».

3. Пособие для врачей «Нетоксигенные штаммы Corynebac-terium diphtheriae, несущие ген дифтерийного токсина».

4. Пособие для врачей «Комплексная система наблюдения за циркулирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae».

Патенты на изобретения (в соавторстве):

1. Патент на изобретение «Способ дифференциации штаммов Bordetella pertussis» № 2299908 от 27 мая 2007 г.

2. «Способ дифференцирования штаммов С. diphtheriae»; положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке №2007140879/13(044745).

3. «Набор и ускоренный способ лабораторной диагностики коклюша»; положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (52390).

Штаммы В. pertussis - кандидаты для конструирования перспективных вакцинных препаратов переданы в ГУ НИИ вакцин и сывороток им.И.И. Мечникова РАМН.

Разработанные методы ускоренной лабораторной диагностики коклюша и дифтерии внедрены в практическую работу отделений № 2 и № 20 ИКБ № 1 (г. Москва).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов В. pertussis выявил особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и изменения в распространении штаммов, несущих «вакцинные» и «невакцинные» аллели генов патогенности, ответственных за коклюшный токсин, пертактин и фимбриальные белки.

2. У штаммов В. pertussis, циркулирующих на современном этапе развития эпидемического процесса коклюшной инфекции, произошли изменения структуры генов, кодирующих основные факторы патогенности коклюшного микроба - коклюшного токсина (ptxA ген), пертактина (ргп ген) и фимбриальных белков (ßm2 и firrß гены), и отмечается усиление их вирулентных свойств. Структура основных генов патогенности штаммов В. pertussis, используемых в нашей стране для производства АКДС-вакцины, не соответствует структуре этих генов современных штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем.

3. Мутационные изменения происходят в структурном tox гене дифтерийного токсина С. diphtheriae - циркулируют штаммы с незначительными единичными мутациями, не приводящими к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина. Распространения штаммов С. diphtheriae с измененной структурой этого гена (в положении 1252), приводящей к замене аминокислот, не про-

изошло. Определена последовательность нуклеотидов, являющаяся генетической детерминантой дополнительного фактора патогеннос-ти С. diphtheriae, не связанного с токсином, - ату ген, ответственный за амилазную активность.

4. Новые знания о структуре генетических детерминант, кодирующих основные факторы патогенности штаммов В. pertussis и С. diphtheriae, позволили подобрать специфические «мишени» (нук-леотидные последовательности ДНК) и разработать на их основе новые молекулярно-генетические методы - мониторинга штаммов В. pertussis и лабораторной диагностики коклюша и дифтерии для ускоренного выявления возбудителей этих болезней непосредственно в клиническом материале.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, протокол № б от 23 октября 2008 г. Основные результаты исследований представлены и доложены на 4-х Российских и 15-ти международных конференциях: съездах Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002; 2007); Российских научно-практических конференциях «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (Москва, 2000), «Вакцинология - 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); на международных конференциях «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 1998; 2003; 2008); на Международных совещаниях Международной Лабораторной Рабочей Группы ВОЗ по дифтерии и проекта по контролю за дифтерией в странах Европейского Союза (International meetings of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network, DIPNET -Халхидики, 1998; Брюссель, 2000; Вена, 2002; Копенгаген, 2004; Во-льягмени, 2006; Ларнака, 2008).

Основное содержание работы отражено в 40 научных публикациях.

Работа выполнялась в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Эпидемиология, микробиология», Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007 - 2011 годы)», подпрограммы «Вакци-нопрофилактика», Международных проектов IncoCopernicus, INTAS, Международного научно-технического центра (МНТЦ), деятельности Международной Лабораторной Рабочей Группы ВОЗ по дифтерии.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы и четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Библиография включает 473 наименований работ, в том числе отечественных - 167 и зарубежных -306 авторов. Общий объем диссертации составляет 293 страницы машинописного текста. Текст иллюстрирован 25 таблицами и 48 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Штаммы бактерий. Изучено 187 штаммов В. pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции (34 штамма -1948- 1969 гг., 57 штаммов -1970- 1989 гг. из коллекции ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспот-ребнадзора и 96 штаммов, выделенных от больных коклюшем в г. Москве в 1990 - 2007 гг. и полученные из бактериологических лабораторий филиалов ФГУЗ ЦГиЭ Роспотребнадзора в г. Москве); 147 штаммов С. diphtheriae, выделенных от больных дифтерией и бактерионосителей на территории России в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции (1985 - 2006 гг.) (из них 100 токсигенных штаммов, 47 нетоксигенных штаммов, 76 штаммов биовара gravis и 71 штамм биовара mitis).

Коллекционные штаммы: три штамма В. pertussis, используемые для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины (№475 (серотип 1.2.3), №305 (серотип 1.2.0) и №267 (серотип 1.0.3) и С. diphtheriae Park Williams 8 (PW 8) - для анатоксина (из коллекции ГИСК им. JI.A. Тарасевича); референс штамм ВОЗ В. pertussis 18323 (из коллекции ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН). В качестве контролен использовали 20 штаммов В. parapertussis, 8 штаммов В. bronchiseptica, 2 штамма S. aureus, 10 штаммов С. ulcerans, 8 штаммов С. pseudodiphtheriticum из коллекции ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора. Штаммы микроорганизмов изучены с помощью микробиологических (334 штамма), им-мунохимических (187 штаммов) и молекулярно-генетических (сек-венирование (267 штаммов), ПЦР-технологии (268 штаммов) методов исследования.

Микробиологическое исследование штаммов В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica проводили согласно «Инструкции по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше» (1984) путем изучения их морфологических, культуральных, серологических и биохимических свойств. Изу-

чение штаммов С. diphtheriae, С. ulcerans, С. glutamicum, С. pseu-dodiphtheriticum осуществляли по «Методическим указаниям по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции» (Мазурова И.К. с соавт., 1998) с определением токсигенных свойств в реакции преципитации в геле (тест Элека); цистиназной, уреазной, сахаролити-ческой и нитратредуктазной активностей.

Для генотипирования штаммов В. pertussis пользовались стандартным протоколом, принятым на международном совещании ведущих специалистов в области молекулярно-биологических исследований представителей рода Bordetella в мае 1999 г. в Парижском институте Пастера (Mooi F., 2000). В основу проведения полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) по выявлению генов: S1 субъединицы коклюшного токсина (ptxA), пертактина (ргп), фимбриальных белков (fîm2 иßm3), фактора колонизации трахеи (tcfA) взяты условия (Mooi F., 1998,2000). Учитывая высокую стоимость реагентов и трудности их приобретения, проведены эксперименты по адаптации реагентов для ПЦР, предлагаемых российскими фирмами. Праймеры синтезировали в научно-производственной фирме «Литех» (г. Москва), реагенты для ПЦР приобретали в фирме "Fermentas" (Литва).

Секвенирование фрагментов ptxA, prn,ßm2,ßm3, tcfA генов штаммов В. pertussis выполнено с помощью ABI Prism Big Dye terminator cycle sequencing ready reaction kit на ABI DNA секвенато-ре (Perkin-Elmer Applied Biosystems). При секвенировании фрагментов ptxA гена использовали AF-AR праймеры; 1 области ргп гена использовали праймеры AF и AR, 2 области - BF и BR, на область 152 - 707 - PF и PRN707R; фрагментовßm2 - Fim2F - Fim2R праймеры, фрагментов fim3 генов - Fim3F - Fim3R праймеры и фрагментов tcfA гена - TcfAF - TcfAR праймеры. Нуклеотидные последовательности генов штаммов В. pertussis были сопоставлены с базой данных EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez).

Секвенирование фрагментов tox гена С. diphtheriae проводили по (Nakao H., Mazurova I.K. et all, 1997) с использованием прайме-ров Diph IF, Diph 3F, Diph 5F, Diph 6F. Секвенирование выполнено, как отмечено выше. В качестве сравнения использовали данные по структуре гена tox референс штаммов и токсигенных коринефагов из базы GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez ).

Вирулентные свойства штаммов В. pertussis (в опытах in vivo на мышах при интрацеребральном заражении и учете количества павших животных с расчетом LD50) и лейкоцитозстимулирующую активность (ЛCA) культур (подсчет количества лейкоцитов в 1 мм3 периферической крови опытных и контрольных животных) определяли согласно («Инструкции по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий», 1987).

Статистическая обработка результатов. Использованы методы математической статистики, принятые в биологии и медицине (ГланцС., 1999).

Программное обеспечение. Поиск и выравнивание нуклео-тидных последовательностей в международных базах данных проводили с использованием BLAST WWW-сервера в NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST; http://www.sanger.ac.uk; http://www.pasteur.fr/mycb. Использовали программы BlastN и Blast2. Подбор олигонуклеотидных праймеров и температур их плавления осуществляли с помощью программы "Primer3.0" (http://www-genome.wi.mit.edu).

Изучение вирулентных и иммунобиологических свойств штаммов В. pertussis выполнено совместно с коллективом сотрудников лаборатории иммуномодуляторов ГУ Института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН - руководителем лаборатории к.м.н. Н.С. Захаровой, к.б.н. Н.У. Мерцаловой и A.C. Шинкаревым. Изучение особенностей структуры tox гена штаммов С. diphtheriae выполнено совместно с сотрудниками лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Рос-потребнадзора - руководителем лаборатории д.м.н., профессором И.К. Мазуровой, ведущим научным сотрудником, д.б.н. С.Ю. Ком-баровой и к.м.н., доцентом В.Г. Мельниковым. Клинические испытания прямого ускоренного молекулярно-генетического метода LAMP-варианта проводили совместно с сотрудниками клинического отдела ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотреб-надзора на базе ИКБ № 1 (г. Москва) - к.м.н. М.С. Петровой и к.м.н. О.П. Поповой, с врачами-бактериологами филиала ФГУЗ ЦГиЭ в Северо-Западном административном округе (СЗАО) (г. Москва) В.Г. Скачковой и B.C. Савинковой и с младшим научным сотрудником ФРЛДДИ ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспот-ребнадзора Н.Т. Гадуа. Исследования по применению мультиплексной амплификационной технологии для выявления возбудителя дифтерии в клиническом материале больных проведены совместно с руководителем лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск) к.б.н. Н.В. Воложан-цевым и научным сотрудником этой лаборатории В.А. Банновым. Из вышеуказанной лаборатории получены праймеры и протоколы для проведения мультиплексной амплификации. Апробирование метода выявления возбудителя дифтерии проведено на базе ИКБ № 1 (г. Москва) совместно с ведущим научным сотрудником ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора к.м.н. М.П. Корженковой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Структура основных генов патогенности В. pertussis и особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции

Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг штаммов В. pertussis позволил оценить особенности распространения и свойства штаммов возбудителя коклюша, циркулировавших в прошлые годы, и сопоставить с данными о биологических и молеку-лярно-генетических свойствах штаммов, циркулирующих на современном этапе развития эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Изучена вариабельность биологических свойств 187 штаммов В. pertussis разных этапов эпидпроцесса, характеризующихся различным уровнем заболеваемости, охвата прививками, динамикой тяжести клинического течения коклюша и удельного веса штаммов различных серотипов (рис. 1):

Рисунок 1. Заболеваемость коклюшем и охват профилактическими прививками в г. Москве (1958-2007 гг.).

Примечание: — данных об охвате прививками в эти годы собрать не удалось.

I период - допрививочный и первые десять лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной (1958 -1969 гг.), II - период стабилизации заболеваемости в 70-е годы и роста заболеваемости в 80-е годы при резком уменьшении охвата профилактическими прививками (1970 - 1989 гг.) и Ш - период относительной стабилизации заболеваемости на фоне роста охвата прививками, который к настоящему времени достиг 95,0% (1990 - 2007 гг.).

Изучена динамика распространения 187 штаммов В. pertussis, выделенных в разные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции, и показано, что штаммы с новыми «невакцинными» (ptxAl, ргп2/ prn3,fim2-2 и ßm3B) аллелями четырех генов, кодирующих основные факторы патогенности возбудителя коклюша - коклюшный токсин, пертактин и фимбриальные белки, постепенно вытесняют штаммы со старыми «вакцинными» (ptxA2/ptxA4, prnl, fim2-l и fim3Ä) аллелями этих генов (рис. 2).

Для штаммов В. pertussis, циркулировавших в допрививочный период и первые 10 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной (I период наблюдения), характерными были «вакцинные» аллели четырех основных генов патогенности: ptxA2/ptxA4 аллели гена коклюшного токсина (в 47,0% и 53,0% случаев, соответственно), prnl аллель гена пертактина (в 100% случаев), fim2-l и ßm3A аллели фимбриальных генов (в 89,5% и 100% случаев, соответственно).

С начала 70-х годов в популяции штаммов коклюшного микроба появились штаммы (16,7% штаммов) с новым «невакцинным»ptxAl аллелем гена коклюшного токсина. Начиная с 80-х годов штаммы В. pertussis, имеющие «невакцинный» ptxAl аллель гена, стали доминирующими в популяции штаммов В. pertussis и в последующие годы полностью вытеснили штаммы с «вакцинными» ptxA4 и ptxA2 аллелями этого гена.

CTN

Jtm2

ptxA

find

Рисунок 2. Доля штаммов В. pertussis с аллельными вариациями генов коклюшного токсина (ptxA), пергактина (рт) и фимбриальных (Jim2 иfim3) в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции

Распространение штаммов, несущих новые «невакцинные» аллели гена пертактина и фимбриальных генов происходило более медленно. Во II периоде наблюдения (1970 - 80-е годы), продолжали циркулировать штаммы «вакцинных» аллелей: prnl аллеля (в 89,5% случаев),fim2-l и ßm3A аллелей фимбриальных генов (в 53,3% и 53,3% случаях, соответственно), кроме того, регистрировали штаммы с «невакцинными» аллелями этих генов патогенности: ргпЗ/ргп2 аллелями (в 25,1% и 11,0% случаев, соответственно), fim2-2 и fim3B аллелями (в 46,7% и 46,7% случаев, соответственно). Начиная с 90-х годов и до настоящего времени, в циркулирующей популяции штаммов В. pertussis, доминируют штаммы «невакцинных» аллелей этих четырех генов - ptxÄl, prn2, ßm2-2, ßm3B и ptxAI, prn3,fim2-2 и fim3B.

Таким образом, вся циркулирующая популяция современных штаммов В. pertussis (в 100% случаев) имеет «невакцинный» ptxAI аллель гена коклюшного токсина; доминируют штаммы, содержащие «невакцинные» ргп2 и ртЗ аллели гена пертактина (в 76,0% и 21,9% случаев, соответственно); отмечается тенденция к увеличению доли штаммов с «невакцинными» fim2-2 и fim3B аллелями фимбриальных генов (в 53,3% и 83,4% случаев, соответственно).

«Невакцинный» ptxAI аллель характерен для структуры гена коклюшного токсина (KT) современных штаммов В. pertussis, он отличается от других аллелей «немолчащей» мутацией в положении 684, приводящей к замене аминокислоты метионина на изолейцин (M228I) в молекуле белка KT. Все три вакцинных штамма В. pertussis имели «вакцинные» (№ 475 -ptxA4, № 267 и № 305 - ptxA2) аллели гена KT.

Наиболее существенные изменения произошли в структуре гена пертактина. Вакцинные штаммы характеризовались наличием «вакцинного» prnl аллеля гена пертактина. «Невакцинные» аллелиргп2 и ргпЗ отличались от «вакцинного» аллеля «немолчащими» мутациями в положениях 832 - 834, приводящими к замене аминокислоты аланина на фенилаланин (A278F), и мутацией в положении 836 с заменой аминокислоты валин на глицин (V279G), а также наличием у ргп2 аллеля дополнительного фрагмента в 15 п.н., которые кодируют новые аминокислоты в белковой молекуле пертактина, что существенно отличает её от молекулы белка пертактина вакцинных штаммов.

Значительно меньшие изменения обнаружены в fim2 и fim3 генах, кодирующих фимбриальные белки. Структураfim2 и fim3 генов циркулирующих штаммов В. pertussis соответствовала одному из двух аллелей fim2 гена и одному из трех аллелей fim3 гена. Вакцин-

ные штаммы характеризовались наличием «вакцинных» (flm2-l и flm3A) аллелей фимбриальных генов. У «невакцинного»flm2-2 алле-ля обнаружена «молчащая» мутация в положении 521, не приводящая к изменению на аминокислотном уровне. Вместе с тем, в «невакцинном» ßm3B аллеле выявлена «немолчащая» мутация в положении 260, сопровождающаяся заменой аланина на глутаминовую кислоту (А87Е), что является контрастной заменой и оказывает влияние на функциональное состояние белка.

Следовательно, генетическая структура современных штаммов В. pertussis с новыми «невакцинными» аллелями генов, кодирующих основные факторы патогенности возбудителя коклюша, отличается от генетической структуры вакцинных штаммов, входящих в АКДС-вакцину, что является весомым основанием для выбора и использования новых штаммов при конструировании АКДС-вакцины (табл. 1).

Таблица 1

Сопоставление структуры генов коклюшного токсина (ptxA), пертактина (рт) и фимбриальных (flm2 иfim3) у современных штаммов В.pertussis (2002 - 2007 гг.) и штаммов В. pertussis, входящих в АКДС-вакцину

Штаммы В. pertussis pixA ген рт ген ßm2 ген fim3 ген

От больных ptxAl prnl (2,4%) fim2-l (33,3%) ßm3A (12,5%)

коклюшем (100%) prn2 (75,8%) fim2-2 (66,7%) ßm3B (87,5%)

(70 шт.) prn3 (21,8%)

Вакцинные штаммы №267 1.0.3 №305 1.2.0 №475 1.2.3 ptxA2 ptxA2 ptxA4 prnl prnl prnl fim2-l fim2-l fim2-l ßm3A fim3A fim3A

Все изученные штаммы В. pertussis, независимо от периода эпидемического процесса коклюшной инфекции, также как и три производственных вакцинных штамма, были однородны и имели одинаковую структуру tcfA гена - «вакцинный» tcfA2 аллель. Другими словами, изменений в tcfA гене, кодирующем фактор колонизации трахеи, оказывающим существенное влияние на процесс адгезии и колонизации возбудителя коклюша в респираторном эпителии дыхательных путей, не обнаружено.

Вирулентные свойства штаммов В. pertussis, выделенных на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, изучены в пробе in vivo на мышах. Патогенные свойства штаммов В. pertussis оценивали по вирулентности и лейкоцитозстимулирующей активности.

Анализ данных литературы по изучению вирулентных и токсических свойств штаммов В. pertussis прошлых лет и собственных исследований современных штаммов позволил получить полное представление о свойствах возбудителя коклюша в процессе его циркуляции в различные периоды эпидпроцесса (рис. 3).

Рисунок 3. Патогенные свойства штаммов В. pertussis, выделенных в 1967 - 2005 гг.

Показано, что в 60-е годы прошлого столетия в популяции возбудителя коклюша преобладали высокопатогенные штаммы. Начиная с 70-х годов, в течение 10 лет, стали регистрировать единичные штаммы с новыми «невакцинными» аллелями генов основных факторов патогенности возбудителя коклюша. При этом высокопатогенных штаммов не выявляли.

В 80-е годы, т.е. в период снижения охвата профилактическими прививками и закрепления в популяции штаммов В. pertussis с «невакцинными» аллелями, среди циркулирующих штаммов появились высокопатогенные штаммы В. pertussis, удельный вес которых со-

ставил 6,0% - 8,0%, а к началу 90-х годов, когда штаммы с «невакцинными» аллелями заняли доминирующее положение, удельный вес высокопатогенных штаммов вырос до 11,1%. В настоящее время, когда охват профилактическими прививками достиг 95,0%, циркулируют штаммы В. pertussis с новыми «невакцинными» аллелями генов, кодирующих основные факторы патогенности, и в 72,7% случаев - с высокой степенью патогенности.

Штаммы В. pertussis с мутационными изменениями в гене коклюшного токсина, гене пертактина и фимбриальном гене, обнаружены еще в начале 70-х годов (рис. 2), т.е. через 10 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной в период стабилизации заболеваемости и высокого охвата прививками. Однако широкое распространение этих новых аллелей происходило в 80 - 90-е годы, когда процент охвата прививками не превышал 32,0% -33,4%. В это время распространились штаммы В. pertussis с новыми «невакцинными» аллелями генов коклюшного токсина, пертактина и фимбриальных белков. Появившиеся мутационные изменения в геноме возбудителя коклюша оказались «успешными» для циркулирующей популяции и в последующих поколениях получили преимущественное распространение. Можно полагать, что период отсутствия или снижения охвата прививками явился «стрессовым» фактором, позволившим «закрепиться» новым мутационным изменениям в циркулирующей популяции и «запустить» распространение высокопатогенных штаммов В. pertussis с новыми «невакцинными» аллелями генов, т.е. имеющих новую генетическую структуру основных факторов патогенности.

Нами подобраны три штамма В. pertussis - кандидата для вакцинных препаратов: № 186-01 (серотипа 1.0.3) с ptxAJ,prn2,fim2-2 и fim3B аллелями, № 178-03 (серотипа 1.2.0) с ptxAl,prn3,ßm2-2 иfim3B аллелями и № 19-05 (серотипа 1.0.3) сptxAl, prn2,ßm2-2,ßm3A аллелями генов. Предварительные исследования иммунобиологических свойств этих штаммов показали возможности использования их в качестве кандидатов для конструирования вакцинных препаратов.

Особенности структуры tox гена, кодирующего синтез дифтерийного токсина

С. diphtheriae

При постановке задач по изучению дифтерийной инфекции были учтены результаты совместных исследований, проводимых ранее в Федеральной референс лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнад-

зора (руководитель - д.м.н., профессор И.К. Мазурова) по изучению фено- и генотипических свойств С. сИрЫкепае, выявлению особенностей формирования структуры популяции и раскрытию механизмов эпидемического распространения возбудителя дифтерии.

Полная нуклеотидная последовательность 1ох гена секве-нирована у 45 штаммов С. сИрЫЬепае (табл. 2). У 18 штаммов С. ШрЫИепае (в 40,0% случаев) последовательность нуклеотидов структурного 1ох гена соответствовала последовательности нуклеотидов этого гена производственного вакцинного штамма С. сИрЫкепае Р\У 8. В тоже время у 27 штаммов (в 60,0% случаев) в последовательности нуклеотидов обнаружены точечные мутации в 7 положениях. При этом, большинство мутаций не приводили к замене аминокислот и только в позиции 1252 мутация сопровождалась изменением аминокислотного состава белка дифтерийного токсина.

Таблица 2

Замены нуклеотидов в Юх гене у штаммов С. (¡¡рШИепае по сравнению со структурой Юх гена штамма С. (ИрШкепае Р\У 8

Штаммы С. (ИрШИепае Количество штаммов Положение нуклеотида в нуклеотидной последовательности гена ДТ

промо-торная обл. фрагмент А фрагмент В З'некоди-рующая область

-58 415 1083 1233 1252 1590 1704

8 (производственный) 1 с % Б 8 % 1

от больных и бактерионосителей без изменений нуклеотид-ных последовательностей 18 с ё 8 % %

от больных и бактерионосителей с изменениями нуклео-тидных последовательностей 27 1 с а а с' а с

Примечание:! - мутация, приводящая к замене аминокислоты.

Мутационные изменения у штаммов С. сИрЫкепае встречались в различных сочетаниях (табл. 3). У большинства штаммов С. д.хрЫЫпаг (в 66,7% случаях) замены нуклеотидов были только в одном из трех положений, у 11,1 % штаммов - в двух и у 22,2% штаммов - в трех положениях. Частота встречаемости выявленных мутаций в Юх гене штаммов С. сИрЫИепае была различная (табл. 3).

Таблица 3

Сочетания мутационных изменений в Юх гене ДТ

Штаммы С. сИрШкепае Количество штаммов Положение нуклеотида в нуклеотидной последовательности гена ДТ

промо-торная область фрагмент А фрагмент В 3' некоди-рующая область

-58 415 1083 1233 1252 1590 1704

Ш 8 (производственный) 1 с 1 ё ё ё ё г

Выделенные от больных и бактерионосителей 1 * * * * * * с

1 * * * * * а с

16 * * * а * * *

3 * * а * * а с

1 * с * * * * *

2 * * * а * * с

2 * * * а гс! * с

1 * а * * * с

Частота распространения мутаций (%) 2,2 2,2 8,8 44,4 4,4 8,8 29,2

Примечание:! - мутация, приводящая к замене аминокислоты; * - наличие аналогичного нуклеотида.

Во фрагменте А 1ох гена только у одного штамма С. сИрЫкепае обнаружили замену нуклеотида, не приводящую к замене аминокислоты в белке дифтерийного токсина, что подтверждает консервативность А фрагмента Iох гена. У большинства штаммов С. сИрЫЪепае (в 75,0% случаях) мутационные изменения зарегистрированы в В фрагменте структурного Ш гена, из них у 44,4% штаммов мутации выявлены в положении 1233. Обнаруженные мутации

также не приводили к изменениям на аминокислотном уровне, за исключением замены нуклеотида в положении 1252, выявленной у двух штаммов биовара тШз, которая повлекла за собой изменение состава аминокислот - глицина на аргинин в положении 393 (039311), что может оказывать влияние на конформацию и, следовательно, функциональные свойства белка дифтерийного токсина.

Нами проведен мониторинг штаммов С. сИрк&епае для обнаружения выявленной мутации в положении 1252. Секвенирован фрагмент 1ох гена размером 760 п.н. (положение нуклеотидов 991 -1751) у 35 штаммов С. сИрЫЬепае биовара тШя, выделенных в различных регионах России. В результате проведенного исследования оказалось, что у всех 35 штаммов С. сИрЫкепае биовара тШз мутация в положении 1252 не выявлена.

Таким образом, обнаружено, что у большинства штаммов С. сИрЫЬгпае (в 60,0% случаях) имеются единичные мутации в структурном Юх гене, которые не сказываются на первичной структуре белка дифтерийного токсина, и только у 2 штаммов С. сИрЫкепае (в 2,5% случаях) выявлена мутация (замена нуклеотида в положении 1252), которая приводит к контрастной замене аминокислот, что может оказывать влияние на функциональное состояние белка дифтерийного токсина. Появление даже единичных штаммов со значительными мутационными изменениями в 1ох гене дифтерийного токсина у циркулирующих штаммов свидетельствует о «подвижности» генетической структуры С. сИрИЖепае, что может привести к снижению эффективности анатоксина, полученного из токсина С. сИрЫИепае PW8. С другой стороны, накопление штаммов с множественными мутационными изменениями, не приводящими к аминокислотным заменам, также может влиять на формирование генетической вариабельности вида и, вероятно, создает резерв изменчивости возбудителя дифтерии в меняющихся условиях существования.

Особенности структуры генетической детерминанты амилазной активности штаммов С. (ИрШкепае

Другим фактором патогенности С. сИрЫИепае, не связанным с токсическим компонентом, является способность возбудителя синтезировать фермент амилазу, который утилизирует углеводы, и тем самым создает дополнительный источник энергии для ускорения процессов генерации, роста на питательных средах и колонизации на слизистых оболочках человека.

Анализ структуры генома возбудителя дифтерии позволил нам выявить в островке патогенности, включающем локусы Б1Р0334 -

Э1Р0357, нуклеотидную последовательность - ату ген, кодирующий синтез амилазы, отвечающей за расщепление углеводов. Было сконструировано 10 пар праймеров, фланкирующих 10 взаимно перекрывающихся участков ату гена (рис. 4).

(840п,

5(839п.

:(839П.Н.)

'п.н.)

±ш

—^(839п.н.)

10(749п.н.

Рисунок 4. Схема расположения праймеров, фланкирующих фрагменты

ату гена

После амплификации (рис. 5) выбранных областей специфические светящиеся фрагменты выявили только в образцах, содержащих

Рисунок 5. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего

электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием специфических праймеров Amy3F - Amy3R к последовательности фрагмента ату гена

Примечание: дорожки 1,18- маркер молекулярных весов; 2, 4, 7, 9, 10, 11 -ДНК штаммов С. diphtheriae биовара gravis; 3,5,6, 8, 12, 13, 14 - ДНК штаммов С. diphtheriae биовара mitis; 15, 16, 17 - отрицательные контроли.

ДНК штаммов С. diphtheriae биовара gravis и не обнаружили в образцах, содержащих ДНК штаммов С. diphtheriae биовара mitis. Был проведен мониторинг 87 штаммов С. diphtheriae биоваров gravis и mitis, выделенных от больных и бактерионосителей в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции, на наличие фрагментов ату гена. Показано, что все образцы ДНК из 31 штаммов С. diphtheriae биовара gravis содержали специфический фрагмент ДНК, в то время как в 56 образцах, содержащих ДНК штаммов С. diphtheriae биовара mitis, данный фрагмент гена не регистрировали.

Следующим этапом исследования явилось установление размера делеции. Анализ последовательности нуклеотидов в геноме штамма С. diphtheriae показал, что перед ату геном расположен ген DIP0354. После проведения амплификации со специфическими прай-мерами и электрофореза регистрировали ПЦР - продукты во всех образцах, содержащих ДНК штаммов С. diphtheriae биовара gravis, и отсутствие таких фрагментов при исследовании образцов, содержащих ДНК штаммов С .diphtheriae биовара mitis.

Для установления начала делеции провели анализ последовательности нуклеотидов генома С. diphtheriae и сконструировали две пары праймеров (рис.6): первая пара праймеров фланкировала область DIP0353 -DIP0354 размером 285 п.н., охватывающую фрагмент гена DIP0353 и фрагмент гена DIP0354; другая пара - фланкировала область DEP03532F - DIP03532R размером 225 п.н., охватывающую фрагмент гена DIP0353.

После амплификации и электрофореза с парой праймеров DIP0353 IF - DIP03541R выявлены ПЦР - продукты в образцах, содержащих ДНК штаммов С. diphtheriae биовара gravis и отсутствие данных ПЦР - продуктов в образцах, содержащих ДНК штаммов С. diphtheriae биовара mitis (рис. 7А). После амплификации со второй парой праймеров (DIP0353 2F - DIP0353 2R) получили ПЦР -продукты в образцах, содержащих ДНК, как штаммов С. diphtheriae биовара gravis, так и штаммов С. diphtheriae биовара mitis (рис. 7Б).

Для определения конца делеции также сконструировали две пары праймеров (рис. 6): первая пара фланкировала область DIP0357 -DIP0358 размером 307 п.н., охватывающую фрагмент гена DIP0357 {ату ген) и фрагмент гена DIP0358, кодирующего синтез ацил-СоА-синтазы. После амплификации с этой парой праймеров (рис. 8А) выявлены ПЦР - продукты в образцах, содержащих ДНК штаммов С. diphtheriae биовара gravis и отсутствие ПЦР - продуктов в образцах, содержащих ДНК штаммов С. diphtheriae биовара mitis. Другая пара праймеров фланкировала фрагмент гена DIP0358 раз-

DIP0353 IF DIP0357 F

ЕЗ-1 DIP0358 2F

Dli'uj58yR

DIP0353 DIP0354 DIP0357 (ату ген) DIP0358

85n н.

•*—ш

*—гттти

ilOn.B. " _

Рисунок 6. Схема расположения праймеров, фланкирующих фрагменты генов Б1Р0354, Б1Р0357 (ату ген) и 01Р0358 С. сИркИепае

Дорожки: 1 2 3 4 5 6

Рисунок 7. Фотография фрагментов 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров DIP03531F-D1P03 541R к последовательности фрагмента локуса DIP0353 - D1P0354 (А) и продукты ПЦР с использованием праймеров D1P03532F - DIP03532R к последовательности фрагмента гена D1P0353 (Б)

С. diphtheriae

Примечание: дорожки 1 - маркер молекулярных весов; 2, 4 - ДНК штаммов С. diphtheriae биовара gravis; 3,5,6- ДНК штаммов С. diphtheriae биовара mitis

мером в 210 п.н. После амплификации с этой парой праймеров (рис. 8Б) получили ПЦР - продукты в образцах, содержащих ДНК, как штаммов С. diphtheriae биовара gravis, так и штаммов С. diphtheriae биовара mitis.

Рисунок 8. Фотография фрагментов 1,5% агарозного геля, содержащего

электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров DIP0357F-DIP0358R к последовательности фрагмента локуса

DIP0357 - DIP0358 (А) и продукты ПЦР с использованием праймеров DIP03582F -DlP0358yR к последовательности фрагмента гена DIP0358 (Б)

С. diphtheriae

Примечание: дорожки 1 - маркер молекулярных весов; 2, 4 - ДНК штаммов С. diphtheriae биовара gravis; 3,5,6- ДНК штаммов С. diphtheriae биовара mitis.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что в геноме штаммов С. diphtheriae биовара mitis отсутствуют локусы DIP0354 - DIP0357 (ату ген) и, следовательно, эти штаммы не обладают амилазной активностью.

Способностью штаммов С. diphtheriae биовара gravis продуцировать амилазу и использовать дополнительные источники энергии (углеводы) можно объяснить различия и во времени генерации {in vitro) штаммов биоваров gravis и mitis. У штаммов биовара gravis оно составляет 60 минут, в то время как у штаммов биовара mitis -180 минут. Быстрорастущие штаммы, формирующие колонии большего размера на питательной среде и на слизистых человека, имеют возможность более быстрого захвата железа из инфицированных тканей, что приводит к более ранней и высокой продукции дифтерийного токсина (Love J. et all, 2004). При изучении уровня токсинообразования (УТ) штаммов С. diphtheriae двух биоваров нами показано, что у штаммов биовара gravis УТ в два раза превышал УТ штаммов биовара mitis (Борисова О.Ю., 1999; Комбаро-ваС.Ю. и др., 2004; Мазурова И.К., 1993; Мазурова И.К. и др., 1999). Поэтому, взаимосвязь между тяжестью клинического течения дифте-

рии и выделением возбудителя биовара gravis можно объяснить высоким уровнем продукции дифтерийного токсина и быстрой колонизацией слизистой ротоглотки штаммами этого биовара. Так, совместные многолетние клинико-микробиологические исследования, проводимые сотрудниками лаборатории ФРЛДЦИ совместное Т.В. Платоновой показали, что в 90-е годы, в период эпидемического подъема заболеваемости дифтерией, формировалась генетически однородная высоко-токсигенная популяция С. diphtheriae. При этом от больных выделяли штаммы биовара gravis и наблюдали утяжеление клинической картины дифтерии у непривитых детей, по сравнению с 80-ми годами XX века, когда у больных выделяли штаммы С. diphtheriae биовара mit is. Такое наблюдение подкрепляется и данными литературы, показавшими более тяжелую клиническую картину дифтерии при выделении штаммов С. diphtheriae биовара gravis (Нисевич Н.И., 1947; Хрущева В.А., 1964; КорженковаМ.П., 2002,2006).

Способность штаммов С. diphtheriae биовара gravis продуцировать амилазу создает преимущества перед штаммами биовара mitis в скорости роста и, что, наряду с другими особенностями структуры биовара gravis, определяет более широкое и длительное распространение этого биовара. Показано, что период распространения штаммов С. diphtheriae биовара mitis (в 80-ые годы прошлого столетия) составил 7-8 лет, в то время как штаммы биовара gravis доминировали и циркулировали многие десятилетия - в 40 - 70-е годы и в течение последних 18 лет (Борисова О.Ю., 1999; Комбаро-ваС.Ю., 2004,2007; Мазурова ИХ, 1993,1997,1999).

Таким образом, исследование показало, что только штаммы С. diphtheriae биовара gravis несут генетическую детерминанту - ату ген, определяющую дополнительный фактор патогенности - фермент амилазу, дающий микроорганизму лучшие возможности колонизировать слизистые оболочки ротоглотки и, вследствие этого, более широко и длительно циркулировать среди населения, в то время как штаммы С. diphtheriae биовара mitis, в том числе и производственный вакцинный штамм С. diphtheriae PW8, имеют делецию фрагмента генома, включающего гены DIP0354 - DIP0357.

Разработка ускоренных методов, основанных на амплификационных технологиях, для наблюдения и выявления возбудителя коклюша

Новые знания о структуре генетических детерминант, кодирующих основные факторы патогенности, их мутационных изменениях, особенностях циркулирующих штаммов В. pertussis позволили подобрать специфические «мишени» и разработать на их основе но-

вые молекулярно-генетические методы наблюдения и диагностики за возбудителями коклюша и дифтерии.

Современный мониторинг и лабораторная диагностика инфекционных заболеваний, базирующиеся на молекулярно-генетических методах исследования, выявляют специфические генетические «мишени» и с большей достоверностью, по сравнению с фенотипичес-кой диагностикой, идентифицируют возбудителей инфекций, атаюке значительно сокращают сроки исследования.

Молекулярно-генетический метод, основанный на полиморфизме длин рестрикиионных фрагментов, для ускоренного выявления штаммов В. pertussis, циркулирующих на современном этапе

Нами разработан новый молекулярно-генетический метод мониторинга штаммов В. pertussis, основанный на изучении полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ). Метод базируется на выявлении специфических генетических «мишеней», дифференцирующих штаммы с новыми особенностями структуры ptxA гена, кодирующего основной фактор патогенности возбудителя коклюша - коклюшный токсин. Метод позволяет после проведения рестрикции амплифицированного определенного фрагмента ДНК специфической рестриктазой и последующего электрофореза, получить характерный рестрикционный профиль, являющийся генетическим «маркером», тесно связанным с генотипом микроорганизма. Учитывая выявленные особенности структуры различных аллелей ptxA гена (рис. 9), выбран фрагмент ДНК этого гена и подобраны две рестриктазы (Ehel и BfuI), с помощью которых получен специфический рестрикционный профиль ДНК (рис. 10).

Наличие мутации в положении 684 ptxAl аллеля (рис. 9), создающей сайт рестрикции для фермента-рестриктазы Ehel, определило выбор специфической «мишени» для дифференциации штаммов В. pertussis, имеющих новый «невакцинный»ptxAl аллель гена от штаммов, несущих старые «вакцинные» аллели (рис. 10А). Наличие мутации в положении 586, создающей сайт рестрикции для рестриктазы BfuI, определило выбор другой специфической «мишени», с помощью которой можно дифференцировать штаммы В. pertussis с уникальнымptxA5 аплелем гена от штаммов с другими аллелями (рис. 10Б).

Для подтверждения возможностей использования нового метода для мониторинга штаммов возбудителя коклюша, изучен 121 штамм В. pertussis и показана полная корреляция между результатами рестрикционного анализа и секвенирования.

* 196 204 586 684 696

ptxA2 GTG CTC GAC CAT CTG -//- GAG TAT T CC AAC GCT -//- CGC AI@ GCG CCG GTG ATA GGC

ptxA4 GTG CTC GAA CAT CTG -II-GAG TAT TCC AAC GCT -II- CGC AT@ GCG CCG GTG GTG GGC

ptxA5 GTG CTC GAA CAT CTG -II- GAG TAT @ CC AAC GC T -U- CGC Alg GCG CCG GTG ATG GGC

ptxAl GTG CTC GAC CAT CTG-//-GAG TAT T CC AAC GCT-//- CGC AT@ GCG CCG GTG ATA GGC

Рисунок 9. Сайты рестрикции для ферментов-рестриктаз Ehel и BfuI

Примечание: показаны четыре аллелиptxA гена; положения нуклеотидов относительно стартового кодонаА.1245366.

500 П.Н. 320 п.н. 130 п.н.

320 п.н. 300 п.н. 200 п.н. 130 п.н.

650 п.н. 550 п.н. 400 п.н.

Рисунок 10. Профили рестрикции штаммов В. pertussis, полученные после обработки ампликонов рестриктазой Ehel (А) и BfuI (Б)

Примечание

А: Дорожки: 1 - маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix; 2,3 - рестрикци-онный профиль тип 1 (Ehel); 4, 5, 6, 7 - рестрикционный профиль тип 2 (Ehel)

Б: Дорожки: 1 -маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix; 4-рестрикционный профиль тип I (В&1); 2, 3, 5 - рестрикционный профиль тип II (BfuI).

Разработанный нами новый метод типирования штаммов В. pertussis может явиться инструментом в системе мониторинга коклюшной инфекции, позволяющим проводить наблюдение за циркулирующей популяцией штаммов В. pertussis, выявлять штаммы с измененной структурой ptxA гена и следить за их распространением.

На новый молекулярно-генетический способ типирования штаммов В. pertussis, имеющих различную структуру гена коклюшного токсина, получен патент на изобретение № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г.

Прямой ускоренный молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики коклюшной инфекции

Лабораторная диагностика коклюша в России до сих пор основана на микробиологических методах исследования, которые являются недостаточно чувствительными и эффективными. Серологические методы диагностики используются для ретроспективного анализа, так как эффективны только на 4-ой неделе заболевания. Все используемые в настоящее время амплификационные технологии не обладают высокой специфичностью, чувствительностью и дают лож-ноположительные результаты из-за большой гомологии геномов представителей рода Bordetella.

Нами впервые разработан прямой, ускоренный и эффективный метод лабораторной диагностики коклюша - LAMP-вариант, основанный на современной изотермальной амплификационной технологии. Первым этапом разработки нового метода было воспроизведение LAMP-технологии. Использование этой технологии представляло серьезные затруднения вследствие отсутствия реагентов, используемых в LAMP, трудности их приобретения, а также их высокой стоимости. Поэтому были проведены предварительные эксперименты по оптимизации параметров амплификации - подобраны реагенты, отработаны концентрации и условия постановки реакции. Разработанный протокол исследования изучен на панели микроорганизмов, включающей 8 видов микроорганизмов (рис. 11). Обнаружено, что для всех образцов, содержащих ДНК штаммов В. pertussis, характерными были светящиеся специфические Ladder-подобные профили. Во всех остальных образцах, содержащих ДНК штаммов других микроорганизмов, регистрировали отрицательный результат.

Данный метод с разработанным нами составом реакционной смеси был воспроизводим, что подтверждено серией повторяющихся экспериментов. Во всех сериях опытов отмечали постоянство профилей LAMP-ампликонов штаммов В. pertussis.

Вместе с тем, такой вариант применим только при изучении «чистой» культуры возбудителя коклюша. Поэтому, перед нами стояла цель разработки прямого метода ускоренной лабораторной диагностики коклюша для выявления возбудителя непосредственно из клинического материала (с тампонов от больных коклюшем).

Рисунок 11. Профили LAMP-ампликонов штаммов В. pertussis, В. parapertussis, В. bronchiseptica, С. glutamicum, С. ulcerans, С. pseudodiphtheriticum, С. diphtheriae и S. aureus

Примечание: дорожки 1,2,5, 10, 12 -ДНК штаммов В. pertussis (50 штаммов); 3,4- ДНК штаммов В. parapertussis (20 штаммов); 6,7 - ДНК штаммов В. bronchiseptica (8 штаммов); 8 -ДНК штамма С. glutamicum (2 штамма); 11 - ДНК штамма С. ulcerans (Юштаммов); 14-ДНК штамма С. pseudodiphtheriticum (8 штаммов); 15, 16-ДНК штаммов С. diphtheriae (20 штаммов); 9, 13 - ДНК штаммов S. aureus (2 штамма)

Высокая чувствительность амплификационных технологий при работе с «чистыми» культурами микроорганизмов не всегда автоматически распространяется на чувствительность метода при работе с клиническим материалом, где на эффективность метода влияет методика подготовки клинического образца, способ выделения ДНК, освобождение от ингибиторов фермента амплификации, а также низкая концентрация первичной матрицы в малом объеме клинического образца. Разработка прямого молекулярно-генетического метода включала несколько этапов экспериментальных исследований: предварительную обработку клинического образца (смыв клинического материала с тампона от больного и его первичная обра-

ботка), подготовку клинического образца (разрушение клеточной стенки возбудителя коклюша в клиническом образце различными детергентами), выделение ДНК из клинического материала (изучены методы выделения ДНК с использованием сорбентов, детергентов, магнитных частиц, а также метода кипячения).

В результате большого числа предварительных экспериментов показано, что прямой ускоренный метод лабораторной диагностики коклюша LAMP-вариант обладает высокой специфичностью в 100% случаев, высокой чувствительностью - выявляет 102 м.кл. возбудителя и позволяет идентифицировать возбудителя заболевания в течение 9-10 часов от начала исследования непосредственно в клиническом материале от больного без этапа выделения «чистой» культуры.

Клинические испытания прямого ускоренного молекулярно-генетического метода LAMP-варианта

Применение LAMP-варианта для ускоренного выявления В. pertussis в клиническом материале больных коклюшем. Обследовано 86 больных, из них 53 больных с клиническим диагнозом «коклюш» разной степени тяжести (у 9,4% больных коклюш протекал в легкой форме, у 66,0% - в среднетяжелой форме и у 24,6% - в тяжелой форме), обследованных на различные сроки от начала заболевания (7,5% больных обследованы на неделе заболевания; 30,2% -на 2—; 41,5% - на 3^; 15,1% - на 4е* и 5,7% - на 5^ неделях заболевания) и 33 больных с другими заболеваниями верхних дыхательных путей. Основную группу больных коклюшем (67,9%) составили дети в возрасте до 1 года, обследованных на 2— - 3— неделях заболевания.

Клинический материал от 86 больных коклюшем и из контрольной группы изучали одновременно в разработанном молекулярно-гене-тическом методе - LAMP-варианте и в классическом бактериологическом методе. Проведенные клинические испытания прямого метода LAMP-варианта, показали его высокую специфичность и высокую диагностическую эффективность, по сравнению с бактериологическим методом (рис. 12). Из 53 больных с диагнозом «коклюш», у 35 больных (в 66,0% случаях) клинический диагноз подтвержден только в LAMP-варианте; у 10 больных (в 18,9% случаях) диагноз подтвержден в LAMP-варианте и в бактериологическом методе; у 2 больных (в 3,8% случаях) диагноз подтвержден только в бактериологическом методе и у 6 больных (в 11,3% случаях) клинический диагноз не был подтвержден ни в одном из используемых методов. При сопоставлении эффективности LAMP-варианта и бак-

Только клинический ДНИГН01

Положптельныйрезультат только в

бактериологическом методе

Положительный ретельтат ЬАМР-вариантеи в бактериологическом методе

135 больных бб.О" 0+6.5%

Положительный р езультат тольков ЬАМР-ваоианте

Рисунок 12. Диагностическая эффективность ЬАМР-варианта при сравнении с бактериологическим методом при обследовании 53 больных с клиническим диагнозом «коклюш»

териологического метода показано, что из 53 больных коклюшем, у 45 больных клинический диагноз «коклюш» был подтвержден в ЬАМР-варианте, т.е. процент совпадений клинического диагноза и результатов разработанного метода составил 84,9% ± 4,9% (р < 0,001). В то время как бактериологическое подтверждение клинического диагноза «коклюш» было лишь в 12 случаях, что составило 22,7% ± ± 5,7% (р< 0,001).

Высокая диагностическая эффективность ЬАМР-варианта показана при обследовании больных с различными клиническими формами заболевания (рис. 13) - не только при среднетяжелых (в 91,4% случаев) и тяжелых формах (в 61,5% случаев), но и при легких формах заболевания (в 100%) случаев). В то же время бактериологическим методом возбудитель коклюша выявлен в небольшом проценте случаев только при среднетяжелых (в 22,8% случаях) и тяжелых формах заболевания (в 30,7% случаях).

Высокая эффективность ЬАМР-варианта показана также при обследовании больных коклюшем в различные сроки от начала заболевания (рис. 14) - от 72,7% на 3^ неделе, 87,5% на 4^ неделе заболевания до 100% на 1®, 2аЁ и 521 неделях заболевания. Бактериологическим методом удалось выявить возбудителя коклюша лишь в небольшом проценте случаев и то, только на 3^ и на 4— неделях заболевания.

С целью определения специфичности разработанного метода взята контрольная группа больных - 33 человека с диагнозами

Легкая форма Среднетажелая Тяжелая форма форма

■LAMP- вариант □бактериологдоеазйметод

Рисунок 13. Сравнение эффективности ЬАМР-варианта и бактериологического метода в зависимости от формы заболевания коюпошем

100" о 100°.» 100%

Рисунок 14. Сравнение эффективности разработанного метода ускоренной диагностики коклюша и бактериологического метода в зависимости от сроков обследования больных коклюшем

«ОРВИ», «лакунарная ангина», «респираторный микоплазмоз» и др. Исследование клинических образцов, полученных от этих больных, в разработанном ЬАМР-варианте показало, что у всех 33 больных,

т.е. в 100% случаев, были отрицательные результаты, также как и при бактериологическом обследовании.

Таким образом, использование ЬАМР-варианта расширило возможности эффективного обследования больных, как с различной тяжестью клинического течения болезни, так и в различные сроки от начала заболевания (с ранних сроков и вплоть до 31 дня болезни, т.е. даже в период обратного развития заболевания), а также при обследовании детей до 1 года, детей с коклюшем, осложненным другими заболеваниями и в очагах инфекции, в первую очередь, в детских специал изированных учреждениях. Разработанный метод применим для быстрого подтверждения или опровержения клинического диагноза «коклюш», в то время как бактериологический метод обладает низкой диагностической эффективностью (10,0%) и длительностью выдачи ответа (5-7 дней).

Приведем несколько примеров эффективного использования нового прямого ускоренного молекулярно-генетического метода -ЬАМР-варианта при обследовании больных с подозрением на коклюш.

Ребенок А. (11 мес.) госпитализирован в ИКБ № 1 с предварительным диагнозом «коклюш» из Дома ребенка № 2 СЗАО г. Москвы. При обследовании группы контактных лиц (10 детей и 10 взрослых) бактериологическим методом и разработанным ускоренным методом - ЬАМР-вариантом в течение суток был выявлен ребенок Г. (11 мес.) с положительным результатом в ЬАМР-варианте, что позволило быстро удалить его из очага коклюша и госпитализировать также в инфекционное отделение с диагнозом «коклюш». Однако, бактериологическое подтверждение этого случая было получено только через 6 дней. Следовательно, применение ЬАМР-варианта позволило провести быстрое обследование очага коклюшной инфекции, выявить заболевшего ребенка и своевременно изолировать его от остальных детей грудничкового возраста, тем самым предотвратив распространение инфекции.

Ребенок М. (4 мес.) с серьезной патологией сердечно-сосудистой системы переведен из специализированного стационара в ИКБ №1 с подозрением на коклюш при отрицательных результатах бактериологического обследования. Применение разработанного ЬАМР-варианта позволило быстро подтвердить диагноз «коклюш».

Ребенок Г. (4 мес.) из асоциальной семьи госпитализирован в ИКБ № 1 с диагнозом «респираторный микоплазмоз, острый брон-хиолит, ателектаз сегмента левого легкого». Симптомы заболевания коклюшем у него были замаскированы выраженным микоплаз-мозом. Разработанный ЬАМР-вариант позволил подтвердить диаг-

ноз «коклюш», в то время как бактериологическое обследование дало отрицательные результаты. Впоследствии, серологическое обследование показало убедительное нарастание динамики титров антител в РА с 1:20 до 1:320, т.е. в четыре раза, на четвертой неделе от начала заболевания, что ретроспективно также подтвердило диагноз «коклюш» у ребенка.

Апробация LAMP-варианта для ускоренного выявления В. pertussis в клиническом материале больных, обследованных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, проведена на 447 клинических образцах от лиц, обследованных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания. Среди них, 81(18,1%) образец был положительным в LAMP-варианте, в то время как в бактериологическом методе положительными были только 19 образцов. Из 81 положительного LAMP-образца, бактериологически подтвержденными оказались только 23,4% образцов. Таким образом, выявлена высокая эффективность применения LAMP-варианта для диагностики больных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, которая в 4,3 раза превышала результативность бактериологического обследования, а также в 5 - 7 раз сокращала срок выдачи окончательного ответа.

На новый метод LAMP-вариант получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (052390).

Выбор фрагмента нуклеотидной последовательности в ату гене в качестве «мишени» для определения принадлежности С. diphtheriae к биовару с помощью ПЦР

Система бактериологической диагностики дифтерии, разработанная в России несколькими поколениями исследователей и практических микробиологов и используемая в настоящее время, направлена на то, чтобы в максимально короткий срок (4-5 дней) с помощью минимального набора тестов выявить в исследуемом материале (в мазках из ротоглотки и носа, или других мест локализации) возбудителя дифтерии - токсигенные С. diphtheriae.

выявление генетической детерминанты амилазной активности (фрагмента ату гена) в геноме возбудителя дифтерии с помощью ПЦР является более точным и достоверным методом определения принадлежности к биовару, по сравнению с биохимической идентификацией.

На основании выявленных особенностей структуры генетической детерминанты, определяющей амилазную активность, нами раз' работай новый основанный на ПЦР способ, позвс чяющий дифференцировать штаммы С. diphtheriae по принадлежности к биоварам.

На консервативную область ату гена сконструированы прайме-ры, фланкирующие фрагмент гена, после амплификации с которыми положительными считались образцы, содержащие специфический светящийся фрагмент и данные штаммы регистрировались как С. diphtheriae биовар gravis (рис. 15).

Дорожки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рисунок 15. Фотография фрагмента 1,5%агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеровАтуР1 -AmyRl к последовательности фрагмента amy гена

С. diphtheriae

Примечание: дорожки 1 - маркер молекулярных весов; 2, 4, 7, 9, 10, 11 - ДНК штаммов С. diphtheriae биовара gravis; 3, 5,6, 8, 12,13 - ДНК штаммов С. diphtheriae биовара mitis

Специфичность, чувствительность и воспроизводимость метода подтверждена при изучении 99 штаммов С. diphtheriae (48 штаммов биовара gravis и 51 штамм биовара mitis), выделенных от больных и бактерионосителей в 80 - 90-е годы прошлого столетия, а также на современном этапе эпидпроцесса дифтерийной инфекции. Сравнительные исследования фенотипических свойств штаммов С. diphtheriae в классическом бактериологическом методе и ПЦР показали 100% корреляцию результатов. Вместе с тем, разработанный способ позволял дифференцировать штаммы С. diphtheriae биовара gravis от штаммов биовара mitis в более короткие сроки (на 1 сутки меньше). Данный метод явился одним из этапов разработки метода ускоренной лабораторной диагностики дифтерии. На разработку способа дифференцирования штаммов С. diphtheriae биовара gravis от штаммов mitis получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке № 2007140879/13 (044745).

Для оценки возможностей использования разработанных «мишеней» в ату гене в качестве диагностического критерия определения принадлежности к биовару в ускоренной лабораторной диагностике дифтерии предпринята попытка применения мультиплексной ампли-фикационной технологии для выявления возбудителя дифтерии в клиническом материале больных, позволяющей одновременно в одной пробирке определять фрагменты ату гена, ответственного за ами-лазную активность, и tox гена, кодирующего дифтерийный токсин.

Метод апробирован на 147 штаммах С. diphtheriae, как токси-генных (100 штаммов), так и нетоксигенных (47 штаммов), двух био-варов - gravis (76 штаммов) и mitis (71 штаммов). У токсигенных штаммов С. diphtheriae биовара gravis регистрировали специфический профиль, состоящий из двух фрагментов ДНК с молекулярной массой 634 п.н. и 289 п.н., у токсигенных штаммов С. diphtheriae биовара mitis - фрагмент с молекулярной массой 634 п.н. При отсутствии этих фрагментов в исследуемом образце ДНК, продукты амплификации не регистрировали (рис. 16).

Апробирование метода подтвердило специфичность «мишеней» в ату гене для определения биовара gravis и показало возможности использования мультиплексной ПЦР-технологии для диагностических целей.

Нами предпринята попытка выделения возбудителя дифтерии по наличию фрагментов tox и ату генов непосредственно в клиническом материале от больных дифтерией. Обследовано 9 больных в возрасте от 28 лет до 60 лет, госпитализированных в ИКБ № 1 (г. Москва). Патологический материал собирали двумя тампонами из ротоглотки и носа для дальнейшего изучения в бактериологическом методе и мультиплексной ПЦР.

Рисунок 16. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего

электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием npaiiMepoBDTF-DTRHAmyFl -AmyRl к последовательностям фрагментов tox и ату генов С. diphtheriae

Примечание: дорожки 1,8- маркер молекулярных весов; 2, 5 - ДНК токсиген-ных штаммов С. diphtheriae биовара gravis; 3 - ДНК нетоксигенного штамма С. diphtheriae биовара gravis; 4 -ДНК нетоксигенного штамма С. diphtheriae биовара mitis\ 6 - ДНК токсигенного штамма С. diphtheriae биовара mitis; 7 - отрицательный контроль

На рис. 17 представлены результаты обследования больного (С., 44 лет) с подозрением на дифтерию в мультиплексной ПЦР. Положительной считалась проба, имеющая характерный вид профиля, состоящего из двух специфических светящихся фрагментов определенной молекулярной массы. В образцах, содержащих ДНК из клинического образца из носа и ротоглотки больного, регистрировали положительные результаты, что свидетельствовало о наличие в материале от больного токсигенного штамма С. diphtheriae биовара gravis и подтверждало клинический диагноз «дифтерия ротоглотки и носа».

С помощью мультиплексной ПЦР клинический диагноз «дифтерия» удалось подтвердить у трех больных: у больного (С., 44 лет) с диагнозом «комбинированная дифтерия ротоглотки и носа»; у больной (И., 54 лет) с клиническим диагнозом «комбинированная локализованная дифтерия ротоглотки и носа»; у больной (Е., 60 лет) с кли-

Дорожки 1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 17. Профили ПЦР-ампликонов образцов клинического материала,

полученного от больного (С., 44 года) с подозрением на дифтерию

Примечание: дорожки 1,8- маркер молекулярных весов; 2 - ДНК из клинического образца от больного дифтерией (С, 44 года (нос); 3 - ДНК из клинического образца от больного дифтерией (С., 44 года (зев); 5 - положительный контроль -ДНК токсигенного штамма С. diphtheriae биовара gravis; 6 - положительный контроль - ДНК токсигенного штамма С. diphtheriae биовара mitis\ 4,7 - отрицательные контроли.

ническим диагнозом «токсическая дифтерия ротоглотки II - III степени в комбинации с дифтерией гортани». Для первых двух больных получено бактериологическое подтверждение на 4 сутки, бактериологическое обследование последней больной дало отрицательные результаты. У остальных шести больных, госпитализированных в стационар с подозрением на дифтерию, при поступлении поставлены диагнозы «лакунарная ангина» и при бактериологическом обследовании и в мультиплексной ПЦР получены отрицательные результаты. Проведенное исследование показало возможности использования «мишеней» в ату гене, выявление которых с помощью ПЦР позволяет определять принадлежность к биовару, с целью комплек-сирования в мультиплексной ПЦР для разработки ускоренного метода обследования больных с подозрением на дифтерию. В настоящее время исследования по разработке ускоренного метода лабораторной диагностики дифтерии продолжаются.

выводы

1. Мониторинг штаммов В. pertussis выявил особенности распространения и различия в генетической структуре штаммов, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, и показал, что в допрививочный период (1948-1959 гг.) и первые десять лет (1960 - 1969 гг.) проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной, циркулировали штаммы В. pertussis с «вакцинными» аллелями генов, кодирующих основные факторы патогенности; в начале 70-х годов в популяции штаммов В. pertussis появились штаммы с новыми «невакцинными» аллелями генов, которые с начала 80-х годов заняли доминирующее положение в популяции.

2. Выявлены особенности генетической структуры штаммов В. pertussis, выделенных на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции. В настоящее время циркулируют штаммы В. pertussis с новым «невакцинным» ptxAl аллелем гена коклюшного токсина (в 100% случаев), новыми «невакцинными»ргп2 и ргпЗ аллелями гена пертактина (в 76,0% и 21,9% случаев, соответственно); распространение штаммов с «невакцинными» fim2-2 и fim3B аллелями фимбриальных генов происходит медленнее и встречается в популяции современных штаммов в 53,3% и в 83,4% случаев, соответственно. Изменений в структуре tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, не обнаружено.

3. Современные штаммы В. pertussis, несущие новые «невакцинные» аллели, и вакцинные штаммы В. pertussis, используемые для производства АКДС-вакцины и несущие старые «вакцинные» аллели генов коклюшного токсина, пертактина и фимбриальных белков, имеют существенные различия генетической структуры. У современных штаммов В. pertussis произошли существенные изменения в структуреptxA гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина,/от; гена, кодирующего пертактин, и в фимбриальном fim3 гене, кодирующем Fim3 белок.

4. Штаммы В. pertussis, характеризующиеся новыми «невакцинными» аллелями генов патогенности, обладают высокой степенью вирулентности (в 72,7% случаев) и высоким уровнем лейкоцитозсти-мулирующей активности (в 100% случаев), что является неблагоприятным прогностическим признаком тяжести течения инфекционного процесса коклюшной инфекции.

5. Разработан новый метод мониторинга штаммов В. pertussis на основе ПЦР-ПДРФ, позволяющий выявлять штаммы с новым ptxAl аллелем гена коклюшного токсина, для наблюдения за популя-

цией В. pertussis, циркулирующей на современном этапе развития эпидпроцесса коклюшной инфекции.

6. Показаны высокая специфичность (100%), высокая чувствительность (102 м.кл.), высокая диагностическая эффективность (84,9% ± 4,9% (р < 0,001) нового впервые разработанного прямого ускоренного метода (LAMP-вариант), позволяющего выявлять возбудителя заболевания непосредственно из клинического материала больного в течение 9-10 часов. Данный метод позволяет обследовать больных как в ранние (с 3 дня), так и в поздние (в течение месяца) сроки заболевания, а также больных с различными формами клинического течения заболевания.

7. Подтверждено сохранение в циркуляции штаммов С. diphthe-riae (в 66,7% случаях) с незначительными множественными единичными мутациями в tox гене, не приводящими к изменению первичной структуры белка дифтерийного токсина, что влияет на формирование генетической вариабельности вида. Мониторинг штаммов С. diphtheriae показал, что распространения штаммов С. diphtheriae с измененной структурой гена дифтерийного токсина (в положении 1252 tox гена), приводящей к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина, не произошло.

8. Получены новые знания о том, что в геноме С. diphtheriae биовара gravis имеется нуклеотидная последовательность (локус DIP0357 - ату ген), являющаяся генетической детерминантой, кодирующей амилазную активность - дополнительный фактор пато-генности С. diphtheriae биовара gravis, и впервые определена нуклеотидная «мишень» в ату гене, выявляемая в ПЦР новыми сконструированными специфическими праймерами, для дифференциации штаммов С. diphtheriae двух биоваров, что имеет значение для создания диагностических препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю. Характеристика Corynebacterium diphtheriae, циркулирующих в России в период 1984 -1998 гг. (микробиологический мониторинг в системе эпиднадзора за дифтерийной инфекцией) // Пособие для врачей. - Москва. -1999. - 26 Стр.

2. Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Костюкова H.H., Мазурова И.К. Риботипирование штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России // в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского "Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)".-2000. - С. 42-47.

3. Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., БорисоваО.Ю., ПлатоноваТ.В., Соков Б.Н., Смердов Г.Н., Ушакова Н.С., Степанова Н.И., Бугаев Е.А., Мазурова И.К. Усовершенствование методики постановки полимеразной цепной реакции для выявления гена дифтерийного токсина // в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского "Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)". - 2000. - С. 47 - 52.

4. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Герасимова С.В., Андрусенко Е.Э., Цепляева Э.Д., Калугина Л.П. Некоторые особенности циркуляции биоваров gravis и milis токсигенных и нетоксиген-ных штаммов Corynebacterium diphtheriae II в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского "Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)".-2000.-С. 52-55.

5. Платонова Т.В., Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г. Биологические свойства Corynebacterium diphtheriae и их влияние на клинику дифтерии у непривитых детей в условиях различной интенсивности эпидпроцесса // в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского "Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)". -2000. - С. 52 - 59.

6. Мазурова И.К., Платонова Т.В., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Костюкова H.H. Молекулярно-биологические свойства Corynebacterium diphtheriae и их влияние на клинику дифтерии у непривитых детей в периоды различной интенсивности эпидемического процесса // Материалы научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века», 24-26 мая, Москва. - 2000. - С. 75.

7. Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Мельников В.Г., КомбароваС.Ю., Платонова Т.В., Андрусенко Е.Э. Антибиотикорезистентность штаммов Corynebacterium diphtheriae - новая проблема инфекционной патологии // Материалы международной конференции «Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века», Москва, -том 2. -2000. - С. 27 - 28.

8. Melnikov V.G., ZoysaA.De, Mazurova I.K., Kombarova S.J., Borisova O.J., Engler K.H., Efstratiou A. Molecular screening for the 'identification' of non-toxigenic tox bearing strains of Corynebacterium diphtheriae from the Russian Federation // Proceedings of the Sixth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, 21-24 June, Brussels, Belgium. -2000.-P. 60-61.

9. Mazurova I.K., Platonova T.V., Kombarova S.J., Melnikov V.G., Borisova O.J. Diphtheria in Russia: clinical and epidemiological features // Proceedings of the Sixth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, 21 - 24 June, Brussels, Belgium. - 2000. - P. 33 - 34.

10. Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Бугаев Е.В. Ускоренные методы лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции // Методические рекомендации. - Москва. -2001.-12 Стр.

11. Kombarova S., Kim С., Melnikov V., Reeves М., Borisova О., Mazurova I., Popovic Т. Rapid identification of Corynebacterium diphtheriae clonal group associated with diphtheria epidemic, Russian Federation // Journal Infectious Diseases. - Vol. 7. - no. 1. - 2001. - P. 133 -13 6.

12. Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Мельников В.Г., Костюкова H.H., Волковой К.И., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Efstratiou А. Генетическая структура штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России при разной интенсивности эпидемического процесса дифтерии // Журн. микро-биол.-2001.-№3.-С,3-8.

13. Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мазурова И.К. Не-токсигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, несущие ген дифтерийного токсина // Пособие для врачей. - Москва. - 2002. -12 Стр.

14. Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Нарвская О.В., Костюкова Н.Н., Платонова Т.В., Волковой К.И., Прохоров В.А., Салова Н.Я., Андрусенко Е.Э., Цепляева Э.Д., Калугина Л.П., Кривопало-ваН.С. Молекулярная эпидемиология дифтерии в России // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-28 марта, Москва. - 2002. - том 1. - С. 68 - 69.

15. Бугаев Е., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Шипулин Г.А., Малинина С.В., Корочкина М.Ю., Мазурова И.К.. Полимеразная цепная реакция в диагностике дифтерийной инфекции // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-28 марта, Москва. - 2002. -том 3. - С. 236 - 237.

16. Mazurova I.K., Melnikov V., Kombarova S.J., Borisova О., Bugaev E.A. Laboratory diagnosis of diphtheria as part of diphtheria surveillance in Russia // Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. - 2002. - P. 53.

17. Borisova O., Melnikov V., Kombarova S.J., Mazurova I.K. Antibiotic-resistant Corynebacterium diphtheriae strains circulating in Russia // Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. - 2002. - P. 79.

18. Kombarova S., Melnikov V., Borisova O., Platonova T.V., Mazurova I.K. Genotype characteristics of Corynebacterium diphtheriae strains in a period of low diphtheria incidence in Russia: 1997 to 2001 // Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. - 2002. - P. 68 - 69.

19. Melnikov V., Kombarova S., Borisova O., Mazurova I.K. Etiological value of non-toxigenic tox-bearing (NTTB) Corynebacterium diphtheriae strains //

Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. - 2002. - P. 80.

20.Мазурова И.К., Борисова О .И., Петрова M.C., Мельников В.Г. Фено - и генотипического характеристика штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве // Материалы международной конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы». -2003.-С. 30.

21.Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Воложанцев Н.В., Веревкин В.В., Волковой К.И., Мазурова И.К. Характеристика нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae, несущих ген дифтерийного токсина // Журн. микробиол. - 2004. -№ 1. - С. 3 - 7.

22.Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Мазурова И.К. Комплексная система наблюдения за циркулирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae II Пособие для врачей. - Москва. - 2004. - 34 Стр.

23.Borisova O.J., Kombarova S.J., Berens Т.Т., Vaizovaj A., Mazurova I.K. Phenotypic and genotypic characteristics of toxigenic C. diphtheriae isolated in the Central Federal District of Russia during 2002-2004 // Proceedings of the Eighth International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, 16-18 june, Denmark, Copenhagen. -2004. - P. 45.

24.Kombarova S.J., Zotina R.K., Borisova O.J, Narvskaya O.V., Limeshen-ko E., Mazurova I.K. Circulation of toxigenic and non-toxigenic C. diphtheriae in period of decreasing morbidity of diphtheria in Russia // Proceedings of the Eighth International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, 16-18 june, Denmark, Copenhagen. - 2004. - P. 43

25.Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Захарова Н.С., Алеш-кин В.А. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Bordetella pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции//Мол. ген. микробиол. вирусол. -2005. -№4.-С. 21 -25.

26.Kombarova S.Yu., Borisova O.Yu., Melnikov V.G., Mazurova I.K Monitoring the genes responsible for Corynebacterium diphtheriae toxin production // Proceedings of the Ninth international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network (DIPNET), 15-17 November 2006, Voliagmeni, Greece. -2006. - P. 65.

27.Borisova O.Yu., Kombarova S.Yu., Volozhantsev N.V., Mazurova I.K. Investigation of the amylase gene structure of Corynebacterium diphtheriae II Proceedings of the Ninth international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network (DIPNET), 15 -17 November 2006, Voliagmeni, Greece -2006. - P. 66.

28.Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Петрова М.С., Грачева Н.М., Герасимова А.Г., АлешкинВ.А., Савинкова B.C., СкачковаВ.Г., Захарова Н.С., МерцаловаН.У., Шинкарев А.С., Семенов Б.Ф. Особенности генетической структуры производственных штаммов для АКДС-вакцины и циркулирующих в настоящее время штаммов возбудителей коклюша и дифтерии // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцино-логия-2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 21 -22 ноября, Москва. - 2006. - С. 60 - 61.

29.Чистякова Г.Г., Борисова О.Ю., Лыткина И.Н., Мазурова И.К., Комба-рова С.Ю., Петрова М.С., Мельникова А.М., Скачкова В.Г. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции в Москве на современном этапе // Журн. микробиол. - 2005. - № 5. - С. 3 5 - 40.

30.Borisova О., Kombarova S.J., ZakharovaN.S., Maijolein van Gent, Alesh-kin V.A., Mazurova I.K., Mooi F. Antigenic divergence between Bordetella pertussis clinical isolates from Moscow, Russia and vaccine strains // J. Clinical and vaccine immunology. - 2007. -Vol. 14. -№ 3. -P. 234 -238.

31.Шинкарев A.C, Мерцалова Н.У., Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Захарова Н.С., Озерецковская М.Н., Зайцев Е.М., Подцубиков A.B., Брицина М.В., Бажанова И.Г. Современные штаммы Bordetella pertussis", молекулярная и иммунобиологическая характеристика // Журн. микробиол. - 2007. -№ 4. -С. 20-25.

32.Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Герасимова А.Г., Пяева А.П., Скачкова В.Г., Захарова Н.С., Мерцалова Н.У., Мазурова И.К., Алешкин В.А. Полиморфизм генов, кодирующих основные факторы патогенности штаммов Bordetella pertussis II Материалы IX съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -2007. -TOM1.-C.50-51.

33.Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мельников В.Г., Гадуа Н.Т., Губи-на Н.И., Лосева Л.В., Савинкова B.C., Скачкова В.Г., Мазурова И.К., Алешкин В.А. Особенности структуры генов, ответственных за токсинообразование Corynebacterium diphtheriae II Материалы IX съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - 2007. - том 1. - С. 69 - 70.

34.Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мельников В.Г., Алешкин В.А. Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг дифтерийной инфекции // Материалы IX съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - 2007. -том 1. - С. 78 - 79.

35.Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Алешкин В.А. Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве (1948 -2005 гг.) // Журнал молекулярной медицины. - 2008. - № 1. - С. 40 - 45.

36. Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. Молекулярно-генетический метод ускоренного выявления штаммов Bordetella pertussis, обладающих различнымиptx генами // Журн. микробиол. - 2008. -№5.-С. 80-83.

37.Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мерцалова Н.У., Шинка-рев A.C., Захарова Н.С., Пяева А.П., Лыткина И.Н., Требунских И.П., Сало-ва Н.Я., Савинкова B.C., Скачкова В.Г., Мазурова И.К. Молекулярно-генети-ческий мониторинг штаммов Bordetella pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции // Материалы четвертой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», 2-4 июня 2008 г., Санкг - Петербург. - 2008. - С. 7.

Изобретения

38. Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Алешкин В. А., Мазурова И.К. Патент на изобретение «Способ дифференциации штаммов Bordetella pertussis» № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г,

39. Борисова О.Ю., Воложанцев Н.В., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. Заявка на изобретение «Способ дифференцирования штаммов С. diphtheriae» №2007140879/13(044745) от 07.11.2007; получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г.

40. Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Попова О.П., Алешкин В.А. Заявка на изобретение «Набор и ускоренный способ лабораторной диагностики коклюша» №2007147797/13(52390) от 25.12.2007; получено положительное решение о выдаче патента от 16.092008 г.

Список сокращений

ДТ - дифтерийный токсин

КТ - коклюшный токсин

ЛСА - лейкоцитозстимулирующая активность

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЗ - показатели заболеваемости на 100 тыс. населения

п.н. - пары нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

УТ - уровень токсинообразования штаммов возбудителя дифтерии

ФГУЗ - Федеральное государственное учреждение здравоохране-

ЦГ и Э ния «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора

ФРЛДДИ - Федеральная референс лаборатория диагностики дифтерийной инфекции

СепВапк - база данных геномов

/?т - фимбриалыше гены

рт - ген пертактина

росЛ - ген, кодирующий Б1 субъединицу коклюшного токсина

1с(А - ген, кодирующий фактор колонизации трахеи

1ох - ген, кодирующий дифтерийный токсин

Объем Зп.л. Тираж 150 экз. Зак.47.

Издательство РГАУ—МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44, тел.: 977-00-12,977-40-64,977-26-90 (тел./факс)

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Борисова, Ольга Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. ПАТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОКЛЮША И ДИФТЕРИИ.

1.1. Некоторые аспекты эволюционной изменчивости микроорганизмов.

1.2. Биологические свойства возбудителя коклюша.

1.2.1. Фенотипическая характеристика Bordetella pertussis.

1.2.2. Антигенная структура и серотипирование штаммов возбудителя коклюша.

1.2.3. Патогенные свойства штаммов В. pertussis.

1.2.4. Генетическая характеристика штаммов В. pertussis.

1.3. Биологические свойства возбудителя дифтерии.

1.3.1. Микробиологическая характеристика Corynebacterium diphtheriae.

1.3.2. Характеристика возбудителя дифтерии, циркулирующего на различных этапах эпидемического процесса дифтерийной инфекции.

1.3.3. Патогенные свойства штаммов С. diphtheriae.

1.3.4. Генетическая характеристика штаммов С. diphtheriae.

ГЛАВА II. ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ДИАГНОСТИКЕ КОКЛЮША И ДИФТЕРИИ.

2.1. Использование молекулярно-генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 .Штаммы бактерий.

3.2. Идентификация культур.

3.3. Генотипирование штаммов В.pertussis.

3.3.1. Выделение хромосомной ДНК.

3.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) по выявлению генов: S1 субъединицы коклюшного токсина (ptxÄ), пертактина (prri), фимбриальных генов ifim2 и flm3), фактора колонизации трахеи (tcfÄ).

3.4. Генотипирование штаммов С. diphtheriae.

3.4.1. Выделение ДНК С. diphtheriae.

3.4.2. Амплификация фрагментов tox гена.

3.5. Определение вирулентности штаммов В. pertussis.

3.5.1. Заражение животных.

3.5.2. Определение вирулентности.

3.5.3. Лейкоцитозстимулирующая активность (JICA) культур.

3.6. Статистическая обработка результатов.

3.7. Программное обеспечение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА IV. СТРУКТУРА ОСНОВНЫХ ГЕНОВ ПАТОГЕННОСТИ В. pertussis И ОСОБЕННОСТИ ЦИРКУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЛЮША В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА КОКЛЮШНОЙ ИНФЕКЦИИ.

4.1. Особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции.

4.1.1. Характеристика различных периодов эпидемического процесса коклюшной инфекции и фенотипические особенности возбудителя.

4.2. Генетическая структура популяции штаммов В. pertussis в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции.

4.2.1. Последовательность нуклеотидов ptxA гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями (аллеломорфами) этого гена.

4.2.2. Последовательность нуклеотидов ргп гена, кодирующего пертактин, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями этого гена.

4.2.3. Последовательность нуклеотидов фимбриальных генов (ßm2 и fim3) и распространение штаммов В. pertussis с различными их аллельными вариациями.

4.2.4. Последовательность нуклеотидов tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями этого гена.

4.2.5. Сопоставление генетической структуры штаммов В. pertussis, используемых для производства АКДС-вакцины, и штаммов, выделенных от больных коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции.

4.2.6. Вирулентные свойства штаммов В. pertussis, несущих новые аллельные вариации.

ГЛАВА V. РАЗРАБОТКА УСКОРЕННЫХ МЕТОДОВ, ОСНОВАННЫХ НА АМПЛИФИКАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ, ДЛЯ НАБЛЮДЕНИЯ И ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЛЮША.

5.1. Молекулярно-генетический метод, основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, для ускоренного выявления штаммов В. pertussis, циркулирующих на современном этапе.

5.1.1. Разработка метода слежения за генетической структурой штаммов В. pertussis.

5.1.2. Мониторинг штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе, методом ПЦР-ПДРФ.

5.2. Ускоренный молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики коклюшной инфекции.

5.2.1. Разработка ускоренного метода диагностики коклюша LAMP-вариант.

5.2.2. Клинические испытания прямого ускоренного молекулярно-генетического метода LAMP-варианта.

ГЛАВА VI. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ СИНТЕЗ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА (tox) И АМИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (ату) С. diphtheriae.

6.1. Структурный ген токсинообразования (tox) С. diphtheriae.

6.2. Особенности структуры генетической детерминанты амилазной активности штаммов С. diphtheriae.

6.2.1. Генетическая детерминанта амилазной активности штаммов С. diphtheriae.

6.2.2. Определение размера делеции.

6.2.3. Способность продуцировать амилазу - дополнительный фактор патогенности С. diphtheriae.

ГЛАВА VII. ВЫБОР ФРАГМЕНТА НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ату-гене ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ПЦР ПРИНАДЛЕЖНОСТИ С. diphtheriae К БИОВАРУ.

7.1. Выбор специфической «мишени» и постановка ПЦР с праймерами для определения биовара С. diphtheriae.

7.2. Апробация специфической «мишени», определяющей принадлежность к биовару, для комплексирования в мультиплексной ПЦР.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики при этих инфекциях."

Актуальность проблемы

Коклюш и дифтерия являются воздушно-капельными инфекциями, управляемыми средствами специфической вакцинопрофилактики. Массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной против коклюша и дифтерии, осуществляемая в России с 1959 года, позволила достигнуть значительных успехов в борьбе с этими заболеваниями и коренным образом изменила характер течения эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций. Опыт России показывает, что, даже в условиях социально-эпидемиологического неблагополучия, массовая вакцинопрофилактика дает четкий эпидемиологический результат.

Несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения, коклюш и дифтерия по-прежнему остаются актуальными инфекциями, как для детского, так и для взрослого населения. До настоящего времени сохраняются основные эпидемиологические особенности поддержания эпидпроцессов этих инфекций [26, 70, 90, 101, 102, 103, 125, 147, 148]. Так, при коклюше в г. Москве на фоне высокого охвата профилактическими прививками (до 95,0%) в настоящее время отмечается относительная стабилизация заболеваемости (показатель заболеваемости (ПЗ) 2006 г. - 13,28; 2007 г. - 12,87 на 100000 населения); однако, регистрируется заболеваемость среди привитых детей; наметились изменения в возрастной структуре заболеваемости (увеличилась доля детей школьного возраста при сохраняющейся высокой заболеваемости детей раннего возраста), регистрируются тяжелые формы не только среди детей раннего возраста, но и у детей школьного возраста [26, 70, 125, 148].

При дифтерии в настоящее время в России отмечается заболеваемость на спорадическом уровне (ПЗ - 0,48 - 0,35 в 2005 - 2007 гг.), однако, продолжают регистрировать тяжелые формы заболевания, летальные исходы, заболеваемость среди привитых лиц, а также бактерионосительство, которое имеет место на фоне высокого уровня антитоксического иммунитета [90, 101, 102, 103, 147]. Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции и сохранении возбудителей коклюша и дифтерии в окружающей среде, а значит существовании риска возникновения заболеваний, особенно среди неиммунных и/или лиц с ослабленным иммунитетом.

Таким образом, в настоящее время сохранились все условия для поддержания эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций, что определяет необходимость борьбы с ними на современном этапе и невозможность иррадикации возбудителей дифтерии и коклюша как биологических видов с помощью существующих средств вакцинопрофилактики [52, 60, 76, 81].

Одной из причин поддержания эпидпроцессов является изменчивость возбудителей, лежащая в основе их адаптации в меняющихся условиях существования. В последнее десятилетие появилось значительное число работ отечественных и зарубежных исследователей, рассматривающих природные и антропогенные факторы, в том числе иммунизацию, как мощный селективный фактор отбора [4, И, 45, 125, 127, 128, 149, 150, 176, 201, 203, 218, 242, 243, 244, 332, 374, 396, 445, 446, 452]. Поэтому, в сложившихся условиях, необходимо проводить постоянный мониторинг циркулирующих штаммов возбудителей коклюша и дифтерии с использованием молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих выявлять самые незначительные изменения в геномах, в первую очередь, в генах, ответственных за проявление патогенных свойств микробов. Эти мутации могут привести к достаточно серьезным изменением фенотипа и появлению измененных клонов возбудителя, что, в свою очередь, может оказать влияние на течение эпидемических и инфекционных процессов и требует разработки новых технологий диагностики и наблюдения за возбудителями, как дифтерии, так и коклюша.

Современные молекулярно-биологические технологии расширили наши возможности по изучению возбудителей инфекционных заболеваний. Поэтому, представляется актуальным использовать при мониторинге

B. pertussis комплексный методический подход, который разработан в Федеральной референс лаборатории диагностики дифтерийной инфекции (ФРЛДДИ) ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора (руководитель лаборатории - д.м.н., профессор И.К. Мазурова) [13, 46, 50, 51, 52, 76, 78, 81, 305] для наблюдения за фено- и генотипическими особенностями штаммов возбудителя дифтерии, включающий классические микробиологические и молекулярно-генетические методы исследования. Актуальными являются наблюдения за формированием популяции

C. diphtheriae и В. pertussis в динамике эпидемических процессов и выявление изменчивости бактерий данных видов, чтобы адекватно корректировать диагностические и профилактические мероприятия.

1. Выявить особенности структуры пяти основных генов патогенности: ptxA гена, кодирующего энзиматически активную S1 субъединицу коклюшного токсина, ргп гена, кодирующего пертактин, fim2 и fim3 генов, кодирующих фимбриальные белки, и tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в период 1948 - 2007 гг.

2. Изучить генетическую структуру штаммов В. pertussis, используемых для приготовления коклюшного компонента АКДС-вакцины, и провести сравнительный анализ с генетической структурой штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе. Оценить вирулентные свойства штаммов В. pertussis, несущих новые аллельные вариации основных генов патогенности.

6. Определить нуклеотидную последовательность (ату ген), являющуюся генетической детерминантой, определяющей амилазную активность С. diphtheriae, и выявить «мишени» - нуклеотидные последовательности ДНК, ответственные за принадлежность возбудителя дифтерии к биовару gravis или mitis, и на этой основе разработать новый метод дифференциальной диагностики биоваров.

Научная новизна

Получены новые данные об особенностях структуры пяти основных генов патогенности штаммов В. pertussis. Установлено, что в настоящее время штаммы В. pertussis с новым «невакцинным» ptxAl аллелем гена коклюшного токсина распространились и полностью вытеснили штаммы В. pertussis с «вакцинными» ptxA4 и ptxA2 аллелями; новые «невакцинные» ргп2 и ргпЗ аллели гена пертактина встречаются у 76,0% и 21,9% штаммов, соответственно. В то же время формирование и распространение штаммов с «невакцинными» fim2-2 и fimSB аллелями фимбриальных генов происходит медленнее и встречается в 53,3% и в 83,4% случаев, соответственно. Изменений в структуре гена, кодирующего фактор колонизации трахеи (tcfA) не выявлено. Обнаружено, что современная популяция штаммов В. pertussis, характеризующаяся новыми «невакцинными» аллелями основных генов патогенности, обладает высокой патогенностью и высокой лейкоцитозстимулирующей активностью, что влияет на тяжесть клинического течения коклюша.

Получены новые данные о несоответствии структуры основных генов патогенности, ответственных за коклюшный токсин, пертактин, фимбриальные белки, штаммов В. pertussis, которые используют в нашей стране для производства АКДС-вакцины, и штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем в настоящее время, что является обоснованием совершенствования средств вакцинопрофилактики при коклюше.

Показано, что сохраняется циркуляция штаммов С. diphtheriae (в 60,0% случаев) с незначительными множественными единичными мутациями в tox гене (по сравнению с вакцинным штаммом С. diphtheriae PW), которые не сказываются на первичной структуре белка дифтерийного токсина, что формирует генетическую вариабельность вида. В последние годы не произошло распространения штаммов С. diphtheriae с измененной структурой tox гена (в положении 1252), приводящей к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина.

Впервые разработан прямой ускоренный, высокочувствительный, специфичный и эффективный метод лабораторной диагностики коклюша -LAMP-вариант; получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (52390).

Теоретическая значимость

Новые знания о генетической структуре возбудителей коклюшной и дифтерийной инфекций, об измененных нуклеотидных последовательностях и мутациях в генетических детерминантах факторов патогенности штаммов В. pertussis и С. diphtheriae являются обоснованием для создания новых вакцинных препаратов, в первую очередь, при коклюшной инфекции, на основе современных штаммов В. pertussis. Установленные факты имеют значение для формирования новых подходов в системе мониторинга и ускоренной лабораторной диагностики возбудителей коклюша и дифтерии, основанных на выборе генетических «мишеней» и на современных амплификационных технологиях. Данные о генетической гетерогенности штаммов свидетельствуют о резерве изменчивости, лежащем в основе механизмов формирования адаптаций микроорганизмов к меняющимся условиям существования и сохранению В. pertussis и С. diphtheriae как биологических видов.

Практическая значимость

Прямой ускоренный метод лабораторной диагностики коклюша ЬАМР-вариант выявляет возбудителя заболевания непосредственно из клинического материала больного без выделения «чистой» культуры в течение 9-10 часов. Клинические испытания метода показали его высокую специфичность (100%), высокую чувствительность (10 м.кл.) и высокую диагностическую эффективность (84,9% ± 4,9% (р 0,001), по сравнению с бактериологическим методом, эффективность которого не превышала 22,7% ± 5,7% (р < 0,001). Использование ЬАМР-варианта расширило возможности обследования больных с различной тяжестью клинического течения болезни, в различные сроки от начала заболевания, начиная с ранних сроков, а также при обследовании детей до 1 года, детей с коклюшем, осложненным другими заболеваниями и в очагах инфекции, в первую очередь, в детских специализированных учреждениях.

Способ дифференциальной диагностики С. сИрЫЪеггае позволяет определять принадлежность к биовару по более специфичному, по сравнению с биохимической идентификацией, признаку — нуклеотидной последовательности в ату гене, что является одним из этапов в создании новых мультиплексных тест-систем для выявления возбудителя дифтерии при обследовании больных с подозрением на дифтерию и для своевременного проведения противоэпидемических мероприятий в очаге.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты проведенных исследований послужили основой для лекций и практических занятий на курсах сертификации и повышения квалификации для врачей-бактериологов «Актуальные вопросы медицинской микробиологии», проводимых на базе ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора (2000 г.; 2004 г.; 2005 г.; 2006 г.); семинара «Биологические свойства возбудителя коклюша и лабораторная диагностика» для врачей-бактериологов филиалов ФГУЗ ЦГиЭ г. Москвы на базе ФГУЗ ЦГиЭ (г. Москва) (2008 г.); семинара по лабораторной диагностике дифтерии для врачей-бактериологов филиалов ФГУЗ ЦГиЭ Центрального Федерального Округа Российской Федерации, проводимого в рамках программы Всемирной Организации Здравоохранения (2002 г.) и были учтены при составлении следующих пособий, рекомендаций и информационного письма (совместно с сотрудниками лаборатории):

1. Пособие для врачей «Характеристика Corynebacterium diphtheriae, циркулирующих в России в период 1984 - 1998 гг. (микробиологический мониторинг в системе эпиднадзора за дифтерийной инфекцией)».

3. Пособие для врачей «Нетоксигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, несущие ген дифтерийного токсина».

4. Пособие для врачей «Комплексная система наблюдения за циркулирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae».

Патенты на изобретения (в соавторстве):

1. Патент на изобретение «Способ дифференциации штаммов Bordetella pertussis» № 2299908 от 27.05.2007 г.

Штаммы В. pertussis — кандидаты для конструирования перспективных вакцинных препаратов переданы в ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, протокол № 6 от 23.10.2008 г. Основные результаты исследований представлены и доложены на 4-х Российских и 15-ти международных конференциях: съездах Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002; 2007); Российских научно-практических конференциях «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (Москва, 2000), «Вакцинология

- 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); на международных конференциях «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 1998; 2003; 2008); на Международных совещаниях Международной лабораторной рабочей группы ВОЗ по дифтерии и проекта по контролю за дифтерией в странах Европейского Союза (International meetings of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network, DIPNET - Халхидики, 1998; Брюссель, 2000; Вена, 2002; Копенгаген, 2004; Вольягмени, 2006; Ларнака, 2008).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 40 научных публикациях, в статьях - 13, в том числе в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК России - 9 (7 - в отечественных, 2 - в иностранных журналах), в материалах всероссийских и международных конференций — 20, в патентах на изобретение

- 3, в инструктивно-методических документах - 4.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на русском языке, состоит из введения, обзора литературы (две главы), пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Библиография включает 473 наименования работ, в том числе отечественных - 167 и зарубежных - 306 авторов. Общий объем диссертации составляет 292 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 25 таблицами и 48 рисунками.

Работа выполнялась в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Эпидемиология, микробиология», Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007 - 2011 годы)», подпрограммы «Вакцинопрофилактика», Международных проектов ХпсоСореписш, ПМТАБ, Международного научно-технического центра (МНТЦ), деятельности Международной Лабораторной Рабочей Группы ВОЗ по Дифтерии.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Борисова, Ольга Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Мониторинг штаммов В. pertussis выявил особенности распространения и различия в генетической структуре штаммов, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, и показал, что в допрививочный период (1948 - 1959 гг.) и первые десять лет (1960 - 1969 гг.) проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной, циркулировали штаммы В. pertussis с «вакцинными» аллелями генов, кодирующих основные факторы патогенности; в начале 70-х годов в популяции штаммов В. pertussis появились штаммы с новыми «невакцинными» аллелями генов, которые с начала 80-х годов заняли доминирующее положение в популяции.

2. Выявлены особенности генетической структуры штаммов В. pertussis, выделенных на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции. В настоящее время циркулируют штаммы В. pertussis с новым «невакцинным» ptxAl аллелем гена коклюшного токсина (в 100% случаев), новыми «невакцинными» ргп2 и ргпЗ аллелями гена пертактина (в 76,0%) и 21,9%) случаев, соответственно); распространение штаммов с «невакцинными» fim2-2 и fim3B аллелями фимбриальных генов происходит медленнее и встречается в популяции современных штаммов в 53,3% и в 83,4% случаев, соответственно. Изменений в структуре tc/A гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, не обнаружено.

3. Современные штаммы В. pertussis, несущие новые «невакцинные» аллели, и вакцинные штаммы В. pertussis, используемые для производства АКДС-вакцины и несущие старые «вакцинные» аллели генов коклюшного токсина, пертактина и фимбриальных белков, имеют существенные различия генетической структуры. У современных штаммов В. pertussis произошли существенные изменения в структуре ptxA гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина, рт гена, кодирующего пертактин, и в фимбриальном fim3 гене, кодирующем Fim3 белок.

4. Штаммы В. pertussis, характеризующиеся новыми «невакцинными» аллелями генов патогенности, обладают высокой степенью вирулентности (в 72,7% случаев) и высоким уровнем лейкоцитозстимулирующей активности (в 100% случаев), что является неблагоприятным прогностическим признаком тяжести течения инфекционного процесса коклюшной инфекции.

B. pertussis, циркулирующей на современном этапе развития эпидпроцесса коклюшной инфекции.

6. Показаны высокая специфичность (100%), высокая чувствительность (10 м.кл.), высокая диагностическая эффективность (84,9% ± 4,9%) (р < 0,001) нового впервые разработанного прямого ускоренного метода (LAMP-вариант), позволяющего выявлять возбудителя заболевания непосредственно из клинического материала больного в течение 9-10 часов. Данный метод позволяет обследовать больных как в ранние (с 3 дня), так и в поздние (в течение месяца) сроки заболевания, а также больных с различными формами клинического течения заболевания.

7. Подтверждено сохранение в циркуляции штаммов С. diphtheriae (в 66,7%) случаях) с незначительными множественными единичными мутациями в tox гене, не приводящими к изменению первичной структуры белка дифтерийного токсина, что влияет на формирование генетической вариабельности вида. Мониторинг штаммов С. diphtheriae показал, что распространения штаммов

C. diphtheriae с измененной структурой гена дифтерийного токсина (в положении 1252 tox гена), приводящей к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина, не произошло.

8. Получены новые знания о том, что в геноме С. diphtheriae биовара gravis имеется нуклеотидная последовательность (локус DIP0357 -ату ген), являющаяся генетической детерминантой, кодирующей амилазную активность - дополнительный фактор патогенности С. diphtheriae биовара gravis, и впервые определена нуклеотидная «мишень» в ату гене, выявляемая в ПЦР новыми сконструированными специфическими праймерами, для дифференциации штаммов С. diphtheriae двух биоваров, что имеет значение для создания диагностических препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярно-генетические методы позволяют выявлять самые незначительные изменения в геномах микроорганизмов и, в первую очередь, в генах, ответственных за проявление их патогенных свойств, которые могут привести к существенным изменениям фенотипа и появлению измененных клонов возбудителей инфекционных болезней.

Появление патогенных микроорганизмов, с точки зрения эволюции, произошло «недавно» [172, 221]. Считают, что в процессе эволюции в результате взаимодействия между организмом хозяина и окружающими его микробами имел место отбор определенных видов микроорганизмов, способных к прикреплению и колонизации слизистых соответствующих экологических ниш и использующих организм хозяина как новую среду обитания - паразитизм, являющийся одним из проявлений эволюции микроорганизмов. Патогенный микроорганизм получает от хозяина ряд метаболитов без значительных энергетических затрат с его стороны. Однако, выживание бактерий в той или иной экологической нише основано на динамичных взаимоотношениях в системе паразит - хозяин [7, 18, 34, 35]. С одной стороны, патогенный микроорганизм заставляет хозяина адаптироваться к его изменениям, но с другой стороны - микроб сталкивается с проблемами выживания в адаптивно меняющейся среде хозяина (защитные системы), т.е. происходит коэволюция паразита и хозяина.

Приспособление микроорганизма, и особенно патогенного, к изменяющимся условиям связано с их генетической вариабельностью. Существует несколько различных механизмов, приводящих к генетической вариабельности, - это накопление точечных мутаций, генетические перестройки и приобретение нового генетического материала посредством горизонтального переноса генов. Существенную роль в механизме переноса генетического материала играют мобильные генетические элементы [43, 172, 270, 272, 349, 368, 369]. Так, например, для возбудителей коклюша и дифтерии такими элементами являются IS элементы, бактериофаги, транспозазы и др. [43, 328, 398, 400]. Факторы патогенности микроорганизмов кодируются геномными островками - островками патогенности [270]. Детерминанты островков патогенности способны распространяться среди одного или родственных видов бактерий путем конъюгации, трансдукции или трансформации. Интеграция, стабилизация и экспрессия генов вирулентности, входящих в островок патогенности лежат в основе формирования новых свойств, в том числе патогенных, у родственных непатогенных видов бактерий различных таксономических групп [7, 9, 43, 233, 271, 296, 369]. Благодаря исследованиям по расшифровке геномов возбудителей коклюша и дифтерии, островки патогенности описаны у В. pertussis и С. diphtheriae [202, 380]. Однако возникновение островков патогенности является длительным процессом. Сначала островки патогенности встраиваются в геном определенного патогенного микроорганизма, далее, если патогенный вариант становится «успешным», эволюционный прессинг идет по пути "homing" (закрепление, фиксация) этого островка в геноме, что в дальнейшем приводит к возникновению нового «патогенного» варианта [270, 271, 272, 416]. Таким образом, наличие у микроорганизма островка патогенности и, следовательно, приобретение новых дополнительных свойств, дает микробам возможность адаптироваться к изменяющимся условиям существования в организме хозяина.

В настоящей работе с помощью современных молекулярно-генетических методов показана микроэволюционная изменчивость генов, кодирующих основные факторы патогенности возбудителей коклюша и дифтерии, являющаяся проявлением адаптационных механизмов приспособления возбудителей этих инфекций на современном этапе развития эпидпроцессов.

Коклюш и дифтерия являются респираторными инфекциями с воздушно-капельным механизмом передачи, управляемыми средствами специфической вакцинопрофилактики. Массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной против коклюша и дифтерии осуществляется в России с 1959 года. За такой продолжительный период достигнуты значительные успехи в борьбе с заболеваемостью этими инфекциями. Так, если в допрививочный период коклюш и дифтерия считались одними из наиболее распространенных и тяжелых детских инфекций, когда показатели заболеваемости достигали высоких значений (при коклюше в 1948 - 1958 гг. ПЗ - 574,0, при дифтерии в 1958 г. ПЗ - 68,0), введение массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной привело к существенному снижению заболеваемости при этих инфекциях (при коклюше в 70-е годы ПЗ - 18,95 - 33,93; при дифтерии в 1975 г. ПЗ - 0,03). Однако, сокращение охвата профилактическими прививками в конце 70-х и в 80-е годы и, следовательно, снижение уровня коллективного иммунитета, ухудшение экологической обстановки и социально-экономических условий жизни, массовая миграция населения привели к активизации эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций, что повлекло за собой резкие подъемы заболеваемости, в том числе дифтерией у взрослых. При коклюше в 80 - 90-е годы подъемы заболеваемости достигали значений допрививочного периода (ПЗ - 186,18 и 140,13 в 1985 г. и 1988 г., соответственно), а при дифтерии в 90-е годы регистрировали второй периодический подъем заболеваемости (ПЗ - 26,9 в 1994 г.) [26, 39, 45, 53, 67, 89, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 109, 115, 116, 118, 121, 130, 131, 132, 135, 147, 157]. Сложившаяся эпидемиологическая обстановка сконцентрировала усилия организаторов здравоохранения и практических врачей на иммунизации, контроле за состоянием антитоксического иммунитета к дифтерии, слежении за качеством клинической и лабораторной диагностики, совершенствовании методов лечения коклюша и дифтерии. Все это способствовало снижению заболеваемости при этих инфекциях. Таким образом, специфическая вакцинопрофилактика коренным образом изменила характер течения эпидпроцессов коклюшной и дифтерийной инфекций. Опыт России показывает, что даже в условиях социальноэпидемиологического неблагополучия, массовая вакцинопрофилактика дает четкий эпидемиологический результат.

Однако, несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения, коклюш и дифтерия по-прежнему остаются актуальными инфекциями, как для детского, так и для взрослого населения. До настоящего времени сохраняются основные эпидемиологические особенности поддержания эпидемических процессов этих инфекций. Так, при коклюше - в г. Москве на фоне высокого охвата профилактическими прививками (до 95,0%) и, несмотря, на относительную стабилизацию заболеваемости (ПЗ в 2006 г. - 13,28; 2007 г. - 12,87), отмечают периодические подъемы (ПЗ в 1994 г. - 73,21; 1998 г. - 57,6; 2000 г. - 71,79) и спады (ПЗ в 2002 г. - 9,86; 2005 г. - 4,58) заболеваемости коклюшем; регистрируется заболеваемость среди привитых детей; наметились структурные изменения возрастной заболеваемости (увеличилась доля детей школьного возраста при сохраняющейся высокой заболеваемости детей раннего возраста) и тяжести клинического течения коклюша (регистрируются тяжелые формы не только среди детей раннего возраста, но и у детей школьного возраста) [26, 70, 125, 148]. В отношении дифтерии в настоящее время в России отмечается заболеваемость на спорадическом уровне (ПЗ - 0,48 - 0,35 в 2005 - 2007 гг.), однако, продолжают регистрировать тяжелые формы заболевания, летальные исходы, заболеваемость среди привитых лиц, а также бактерионосительство, которое формируется на фоне высокого уровня антитоксического иммунитета, следует отметить, что недостаточный уровень бактериологической диагностики создает возможность существования «скрытого» бактерионосительства [90, 101, 102, 103, 147]. Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции и сохранении возбудителей коклюша и дифтерии в окружающей среде, т.е. существует риск возникновения заболеваний, особенно среди неиммунных и/или лиц с ослабленным иммунитетом.

Таким образом, в настоящее время сохранились все условия для поддержания эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций. Одной из причин поддержания эпидпроцессов является изменчивость самих возбудителей, вызывающих заболевания, приводящая их к адаптации в меняющихся условиях существования. В последнее десятилетие появилось значительное число работ отечественных и зарубежных исследователей, рассматривающих природные и антропогенные факторы, в том числе иммунизацию, как мощные селективные факторы эволюции [4, 11, 125, 127, 128, 149, 150, 176, 201, 203, 218, 242, 243, 244, 332, 374, 396, 445, 446, 452]. Поэтому, большое значение на современном этапе развития эпидпроцессов при этих инфекциях приобретает изучение биологических свойств возбудителей, распространенных в настоящее время, в сравнении с прошлыми годами, и тех изменений, которые могут явиться следствием продолжающейся их циркуляции в сложившихся эпидемиологических условиях и приводящие к существенным изменениям фенотипа и появлению измененных клонов возбудителя, которые могут оказывать влияние на течение эпидемических и инфекционных процессов. На основе новых знаний о структуре основных генов патогенности возбудителей дифтерии и коклюша, их биологических свойств и изменчивости, возможно, разработать новые подходы для совершенствования вакцинопрофилактики, лабораторной диагностики и мониторинга коклюшной и дифтерийной инфекций.

Поэтому целью работы явилось выявление молекулярно-генетических особенностей структуры основных генов патогенности В. pertussis и С. diphtheriae, вызывающих заболевания на современном этапе развития эпидемических процессов этих инфекций, и специфических нуклеотидных последовательностей - «мишеней» для разработки на их основе принципиально новых подходов к совершенствованию вакцинопрофилактики и лабораторной диагностики коклюша и дифтерии.

К началу наших исследований по мониторингу штаммов В. pertussis, изучению структуры генов патогенности и их изменчивости имелись единичные данные зарубежных авторов о штаммах В. pertussis, циркулирующих в мире. Поэтому изучение и мониторинг штаммов В. pertussis, циркулирующих в нашей стране, на примере такого мегаполиса, как г. Москва, явились основными задачами исследования, которые включали:

- выявление особенностей структуры пяти основных генов патогенности — ptxA гена, кодирующего энзиматически активную S1 субъединицу коклюшного токсина, ргп гена, кодирующего пертактин, fim2 и fim3 генов, кодирующих фимбриальные белки, и tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в период с 1948 г. по настоящее время;

- изучение генетической структуры штаммов В. pertussis, используемых для приготовления коклюшного компонента АКДС-вакцины, и проведение сравнительного анализа с генетической структурой штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе;

- оценка вирулентных свойств штаммов В. pertussis, несущих новые аллельные вариации (аллеломорфы) основных генов патогенности;

- разработка ускоренного метода наблюдения, основанного на технологии ПЦР-ПДРФ, для идентификации штаммов В. pertussis с измененной структурой гена коклюшного токсина, имеющих распространение в настоящее время;

- разработка ускоренного молекулярно-генетического метода лабораторной диагностики коклюша (LAMP-вариант), позволяющего выявлять возбудителя коклюша в клиническом материале без предварительного выделения «чистой» культуры В. pertussis;

- проведение клинико-микробиологических испытаний нового метода лабораторной диагностики коклюша - LAMP-варианта.

Проведенный расширенный анализ эпидемиологических особенностей, клинического течения и биологических свойств штаммов В. pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, позволил оценить свойства штаммов возбудителя коклюша, циркулировавших в прошлые годы, и сопоставить их с данными о биологических и молекулярно-генетических свойствах штаммов, циркулирующих на современном этапе эпидпроцесса. Изучена вариабельность биологических свойств штаммов В. pertussis различных этапов эпидпроцесса коклюшной инфекции: I период - допрививочный и первые десять лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной (1948 — 1969 гг.), II - период стабилизации заболеваемости в 70-е годы и роста заболеваемости в 80-е годы при резком уменьшении охвата профилактическими прививками (1970 - 1989 гг.) и III - период относительной стабилизации заболеваемости на фоне роста охвата прививками, который к настоящему времени достиг 95,0%.

Возбудитель коклюша отличается вариабельностью фенотипических свойств - по способности агглютинироваться монорецепторными сыворотками выделяют четыре серотипа (1.2.3, 1.2.0, 1.0.3 и 1.0.0). Анализ серотипового пейзажа циркулирующих штаммов возбудителя коклюша показал, что в настоящее время в популяции преобладают штаммы В. pertussis серотипа 1.0.3 (в 86,0% случаев), которые стали доминировать с середины 60-х годов. Вместе с тем, продолжают выделяться штаммы серотипа 1.2.3, обладающие более вирулентными свойствами и с циркуляцией которых связывают регистрацию тяжелых форм заболевания [53, 157]. Поэтому, увеличение доли штаммов В. pertussis серотипа 1.2.3 за последние пять лет (до 12,0% в 2007 г.) является неблагоприятным прогностическим признаком тяжести течения эпидпроцесса коклюшной инфекции. Однако принадлежность к тому или иному серотипу определяется поверхностными агглютиногенами. Опыт работы со штаммами В. pertussis и данные литературы [66] показали, что серотип не является стабильной характеристикой штаммов В. pertussis, который оценивается в малоспецифической и малочувствительной РА и зависит от многих факторов, в частности от условий культивирования. Поэтому, принадлежность к серотипу может быть только ориентировочным признаком для характеристики циркулирующей популяции штаммов В. pertussis.

В патогенезе заболевания коклюшем главная роль принадлежит коклюшному токсину - его энзиматически активной S1 субъединице, кодируемой ptxA геном. Вместе с тем, немаловажную роль в развитии инфекции играют другие факторы патогенности, такие как пертактин, кодируемый рт геном, фимбриальные белки, кодируемые fim2 и fim3 генами, и фактор колонизации трахеи, кодируемый tcfA геном, которые обеспечивают адгезию на поверхности чувствительных клеток эпителия и участвуют в запуске инфекционного процесса. Эти факторы патогенности В. pertussis, в основном, определяющие патогенез заболевания коклюшем, имеют важное значение при конструировании перспективных вакцинных препаратов - бесклеточных коклюшных вакцин [20, 113, 151, 370, 371]. В нашей стране исследования по созданию бесклеточной коклюшной вакцины проводятся в НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, в то время как вакцинация против коклюша до сих пор осуществляется АКДС-вакциной, включающей корпускулярный компонент, состоящий из трех штаммов В. pertussis серотипов 1.2.3, 1.2.0 и 1.0.3.

С целью оценки гетерогенности популяции возбудителя коклюша и выявления особенностей молекулярно-генетической структуры генов коклюшного токсина (ptxA) и пертактина (рт) изучены 187 штаммов В. pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции. Проведено сравнительное сопоставление генетической структуры циркулирующих штаммов в различные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции, со структурой трех вакцинных штаммов В. pertussis, входящих в качестве коклюшного компонента в АКДС-вакцину.

Показано, что среди 187 штаммов В. pertussis, выделенных в различные периоды эпидпроцесса, выявлены штаммы, имеющие один из трех аллелей (аллеломорфов) ptxA гена - ptxA2, ptxA4 или ptxAl аллель. Последний аллеломорф характеризует структуру гена коклюшного токсина современных штаммов В. pertussis (в 100% случаев). Все три вакцинных штамма В. pertussis имели «вакцинные» аллели гена коклюшного токсина: штамм серотипа 1.2.3 - ptxA4 аллель и серотипов 1.2.0 и 1.0.3 - ptxA2 аллели. «Невакцинный» ptxAl аллель отличается от других аллелей «немолчащей» мутацией в положении 684 нуклеотидной последовательности, приводящей к замене аминокислоты метионина на изолейцин (M228I) в молекуле белка коклюшного токсина. Учитывая существенные различия свойств этих аминокислот, происходит снижение способности к молекулярным взаимодействиям, что не может не оказывать влияние на функциональное состояние белка коклюшного токсина [2].

Наиболее существенные изменения произошли в структуре гена пертактина (prri) у 97,9% современных штаммов В. pertussis. Структура ргп гена циркулирующих штаммов В. pertussis соответствовала одному из трех выявленных аллелей - prnl, ртЗ, ргп2. Вакцинные штаммы характеризовались наличием «вакцинного» prnl аллеля гена пертактина. «Невакцинные» аллели ргп2 и ргпЗ отличались от «вакцинного» prnl аллеля «немолчащей» мутацией - заменой триплета gcg на ttc в положениях 832 -834, приводящей к замене аминокислоты аланина на фенилаланин (A278F), относящихся к разным классам аминокислот, а также «немолчащей» мутацией в положении 836 с заменой аминокислоты валин на глицин (V279G), которые принадлежат к одному классу аминокислот, но имеют разные свойства. Такие различия свойств аминокислот могут привести, согласно [2], к снижению способности молекулярных взаимодействий, что не может не оказывать влияние на функциональное состояние белка пертактина. Наряду с вышеописанными изменениями, ргп2 аллель несет вставку дополнительного фрагмента в 15 п.н., которые кодируют новые аминокислоты в белковой молекуле пертактина, что существенно отличает её от молекулы белка пертактина вакцинных штаммов. Очевидно, дополнительный фрагмент в 15 п.н. является «адаптационным фактором», способствующим более широкому распространению (селекции) штаммов В. pertussis, несущих ргп2 аллель гена пертактина (в 76,0% случаев), на современном этапе развития эпидпроцесса коклюшной инфекции.

Значительно меньшие изменения обнаружены в fim2 и ßm3 генах, кодирующих фимбриальные белки, и не обнаружены в tcfA гене, кодирующем фактор колонизации трахеи, который присутствует только в штаммах В. pertussis и оказывает существенное влияние на процесс адгезии и колонизации в респираторном эпителии дыхательных путей, у 70 штаммов В. pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции. Структура fim2 и ßm3 генов циркулирующих штаммов В. pertussis соответствовала одному из двух аллелей fim2 гена -fim2-l или fim2-2, и, в основном, одному из двух аллелей fim3 гена - fim3A или ßm3B. Вакцинные штаммы характеризовались наличием «вакцинных» fim2-l и fim3A аллелей фимбриальных генов. У «невакцинных» fim2-2 и fim3B аллелей обнаружены «молчащие» мутации в положении 521 нуклеотидной последовательности fim2 гена и в положении 87 нуклеотидной последовательности ßm3 гена, не приводящие к замене на аминокислотном уровне. Вместе с тем, в «невакцинном» fim3B аллеле выявлена «немолчащая» мутация в положении 260 нуклеотидной последовательности fim3 гена, сопровождающаяся заменой на аминокислотном уровне — аланина на глутаминовую кислоту (А87Е), т.е. заменой гидрофобной аминокислоты на гидрофильную, что является контрастной заменой и, согласно [2], оказывает влияние на функциональное состояние фимбриального Fim3 белка, в то время как незначительные изменения в fim2 гене не оказывают влияния на структуру и функции фимбриального Fim2 белка.

Таким образом, в настоящее время в популяции штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем, доминируют штаммы новых невакцинных» аллелей всех четырех основных генов патогенности. Вся циркулирующая популяция штаммов В. pertussis (в 100% случаев) имеет «невакцинный» ptxAl аллель гена коклюшного токсина; доминируют штаммы с «невакцинными» ргп2 и ргпЗ аллелями гена пертактина (в 76,0% и 21,9% случаев, соответственно) и отмечается тенденция к увеличению штаммов с «невакцинными» fim.2-2 и fim3B аллелями фимбриальных генов (в 66,7% и 87,5% случаев, соответственно). Наряду с этим остается циркуляция единичных штаммов со старыми «вакцинными» аллелями гена пертактина и фимбриальных генов (prnl, fim2-l, fim3A) и штаммы, имеющие «невакцинные» аллели ргп гена (ргп2 и ргпЗ) и сочетания «вакцинных» и «невакцинных» аллелей фимбриальных генов (prn2,ßm2-J,ßm3B; prn3,ßm2-l,fim3B\ ргпЗ, fim2-l, fim3A и ргпЗ, fim2-2, fim3Ä). Мутации, приводящие к изменению аминокислотного состава белков основных факторов патогенности, выявленные в трех генах ptxA, ргп, ßm3, кодирующих коклюшный токсин, пертактин и фимбриальный Fim3 белок, характеризуют основную часть популяции современных штаммов В. pertussis. Мутаций, приводящих и не приводящих к изменениям генов патогенности, в штаммах В. pertussis, входящих в состав АКДС-вакцины, не выявлено, что свидетельствует о сохранении состава и функций белков основных факторов патогенности у вакцинных штаммов.

Такое быстрое распространение штаммов В. pertussis с новыми «невакцинными» аллелями ptxA и ргп генов (примерно за сорок лет) можно объяснить с позиций микроэволюционной изменчивости. Появившиеся мутационные изменения зафиксировались в геноме возбудителя коклюша и эти патогенные аллеломорфы («невакцинные» аллели) явились «успешными» для циркулирующей популяции и в последующих поколениях получили преимущественное распространение. Мутационные изменения в гене коклюшного токсина, пертактина и фимбриальном гене появились еще в начале 70-х годов (в 16,7%), 10,5% и 5,7%, соответственно) - через 10 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной, т.е. в период стабилизации заболеваемости и высокого охвата профилактическими прививками детей. Однако широкое распространение этих новых аллелей происходило в 80 - 90-е годы, когда процент охвата прививками не превышал 32,0% - 33,4%, и, следовательно, отсутствовало влияние иммунитета, формирующегося при вакцинации. Можно полагать, что период отсутствия или снижения охвата прививками явился «стрессовым» фактором, позволившим «закрепиться» новым мутационным изменениям в циркулирующей популяции и «запустить» распространение штаммов В. pertussis с новыми «невакцинными» аллелями генов, несущими эти мутации. Процесс распространения штаммов В. pertussis с изменениями в фимбриальных генах протекает медленнее.

Изменения вирулентных свойств циркулирующих штаммов В. pertussis явились проявлением микроэволюционной изменчивости, происходящей на генотипическом уровне. Вирулентные свойства штаммов В. pertussis, выделенных на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, изучены в пробе in vivo на мышах. Сопоставляя данные литературы [38, 53, 115, 118, 132, 157] по изучению вирулентных и токсических свойств штаммов В. pertussis прошлых лет и собственных исследований современных штаммов получено полное представление о свойствах возбудителя коклюша в процессе его циркуляции в различные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции. Показано, что в 60-е годы прошлого столетия в популяции возбудителя коклюша преобладали высоковирулентные штаммы, доля слабовирулентных штаммов составляла 12,0%. Начиная с 1973 г. в течение 10 лет не выявляли высоковирулентные штаммы, доля слабовирулентных увеличилась к 1984 г. до 81,5%, т.е. в период стабилизации заболеваемости в 70-е годы штаммы с высокой степенью вирулентности и токсичности не регистрировали. Однако, в период снижения охвата профилактическими прививками (80-е годы) и закрепления в популяции штаммов В. pertussis с «невакцинными» аллелями, среди циркулирующих штаммов появились высокопатогенные штаммы В. pertussis, удельный вес которых составил

6,0% - 8,0%, а к началу 90-х годов, когда штаммы с «невакцинными» аллелями генов заняли доминирующее положение в популяции, удельный вес высокопатогенных штаммов вырос до 11,1%. В настоящее время, когда охват профилактическими прививками достиг 95,0%, циркулируют штаммы В. pertussis с «невакцинными» аллелями генов, кодирующих основные факторы патогенности, и в 72,2% случаев — с высокой степенью вирулентности. Таким образом, отсутствие или снижение охвата профилактическими прививками, возможно, послужило «пусковым механизмом» распространения высоковирулентных штаммов В. pertussis, имеющих новую генетическую структуру основных факторов патогенности.

Генетическая структура современных штаммов В. pertussis с новыми «невакцинными» аллеломорфами генов, кодирующих основные факторы патогенности возбудителя коклюша и несущих мутации, приводящие к изменению аминокислотного состава белков коклюшного токсина, пертактина, фимбриального Fim3 белка, отличается от генетической структуры вакцинных штаммов, входящих в АКДС-вакцину еще с 50-х годов XX столетия, что является весомым основанием для подбора и использования новых штаммов при конструировании корпускулярного компонента АКДС-вакцины.

Совместно с сотрудниками лаборатории иммуномодуляторов института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (руководитель лаборатории - к.м.н. Н.С. Захарова) подобраны три штамма В. pertussis. Из них два штамма В. pertussis (серотипов 1.0.3 и 1.2.0) характеризовались новой генетической структурой основных генов патогенности, т.е. несли «невакцинные» ptxAl, prn2/prn3, fim2-2 иßm3B аллели генов, и один штамм В. pertussis (серотипа 1.0.3) имел как «невакцинные» ptxAl, ргп2 и fim2-2 аллели гена коклюшного токсина, пертактина и фимбриального гена, так и старый «вакцинный» аллель фимбриального гена — fim3A аллель. Исследования иммунобиологических свойств этих штаммов показали [159] возможности их использования в качестве штаммов-кандидатов для производства как корпускулярного компонента АКДС-вакцины, так и бесклеточной коклюшной вакцины.

При постановке задач по изучению дифтерийной инфекции были учтены результаты исследований, проводимых ранее в ФРЛДДИ (руководитель - д.м.н., профессор И.К. Мазурова) сотрудниками лаборатории при нашем участии, по изучению фено- и генотипических свойств С. diphtheriae, выявлению особенностей формирования структуры популяции и раскрытию механизмов эпидемического распространения возбудителя дифтерии. Показано, что возбудитель дифтерии гетерогенен и также подвержен микроэволюционным изменениям, способствующим адаптации возбудителя к изменяющимся условиям существования [12, 14, 46, 48, 50, 51, 78, 80, 81, 81, 82, 83, 84, 104, 105, 187, 188, 305, 306, 307, 309, 327, 328]. Выявлены особенности структуры tox и dtxR генов, ответственных за экспрессию и регуляцию основного фактора патогенности возбудителя дифтерии - дифтерийного токсина (ДТ), а также мутации в dtxR гене, приводящие к повышенному уровню его экспрессии. Структура tox гена считалась консервативной [358, 359]. Однако, последние наши исследования [52, статья «Полиморфизм генов tox и dtxR у циркулирующих штаммов возбудителя дифтерийной инфекции» (С.Ю. Комбарова, О.Ю. Борисова, В.Г. Мельников и др.), принятая к публикации в ЖМЭИ] выявили мутационные изменения в tox гене С. diphtheriae. К началу наших исследований отсутствовали данные по изучению структуры других генетических детерминант, кодирующих факторы патогенности возбудителя дифтерии, не связанные с токсином.

Вышеуказанное, а также методологический подход, использованный при изучении структуры генов патогенности возбудителя коклюша, поиска «мишеней» и разработки новых ускоренных методов диагностики, послужили основанием для постановки задач дальнейшего изучения штаммов С. diphtheriae'.

- изучение структуры гена дифтерийного токсина (tox) и проведение наблюдения за распространением штаммов С. diphtheriae, имеющих изменения в структуре этого гена; изучение структуры генетической детерминанты - ату гена, определяющего амилазную активность С. diphtheriae;

- определение «мишени» - нуклеотидной последовательности ДНК, ответственной за принадлежность к биовару gravis или mitis, и на этой основе разработка нового метода дифференциальной диагностики биоваров С. diphtheriae.

Особенности структуры tox гена изучены у 80 токсигенных штаммов С. diphtheriae (29 штаммов биовара gravis и 51 штамм биовара mitis), выделенных от больных дифтерией и бактерионосителей в периоды эпидемических подъемов и спада заболеваемости дифтерией (1985 -2006 гг.). Обнаружено, что у большинства штаммов С. diphtheriae (в 66,7% случаев) имеются единичные мутационные изменения в структурном tox гене дифтерийного токсина, которые не приводили к заменам на аминокислотном уровне белка дифтерийного токсина, и только у 2 штаммов С. diphtheriae (в 2,5% случаев) выявлена мутация (замена нуклеотида в положении 1252), приводящая к контрастной замене на аминокислотном уровне — аминокислоты глицина на аргинин (G393R), что может оказывать влияние на функциональное состояние белка дифтерийного токсина. Поэтому появление даже единичных штаммов со значительными мутационными изменениями в tox гене дифтерийного токсина у циркулирующих штаммов возбудителя дифтерии свидетельствует о «подвижности» генетической структуры С. diphtheriae и может привести к снижению эффективности анатоксина, полученного из токсина С. diphtheriae PW8.

С другой стороны, накопление штаммов с множественными мутационными изменениями, не приводящими к аминокислотным заменам, также может влиять на формирование генетической вариабельности вида, что способствует адаптации возбудителя дифтерии к изменяющимся условиям существования. Поэтому, по-прежнему, необходимо проводить микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг по разработанной системе [52]. Наиболее актуально наблюдение за распространением штаммов С. diphtheriae с измененной структурой tox гена, так как возможное широкое распространение штаммов с описанными мутациями в tox гене, особенно, при смене циркулирующей популяции штаммов биовара gravis на биовар mitis, может оказать влияние на тяжесть течения эпидемического и инфекционного процессов дифтерийной инфекции.

Способность микроорганизмов продуцировать амилазу и утилизировать углеводы, как дополнительный источник энергии, широко распространена и дает возможность патогенным микроорганизмам участвовать в многофакторном процессе колонизации и быстрее заселять слизистые оболочки человека, что является одним из важнейших этапов запуска инфекционного процесса [160, 240, 430]. Поэтому, уже этот факт позволяет отнести фермент амилазу к факторам патогенности.

Анализ структуры генома возбудителя дифтерии по данным EMBL/GenBank позволил нам в островке патогенности, включающие локусы DIP0334 - DIP0357, выявить нуклеотидную последовательность - ген DIP0357 (ату ген), состоящий из 7737 п.н. и кодирующий синтез амилазы, отвечающей за разложение углеводов. Были сконструированы 10 пар праймеров, фланкирующих 10 взаимноперекрывающихся участков ату гена, амплификация которых обнаружила, что только штаммы С. diphtheriae биовара gravis несут эту генетическую детерминанту - ату ген, определяющую амилазную активность, в то время как штаммы С. diphtheriae биовара mitis имеют делецию этого фрагмента генома. Поэтому, можно полагать, что штаммы С. diphtheriae биовара gravis, несущие генетическую детерминанту, определяющую амилазную активность, имеют дополнительный фактор патогенности — фермент амилазу.

Способностью штаммов С. diphtheriae биовара gravis продуцировать амилазу и использовать дополнительные источники энергии (крахмал и гликоген) можно объяснить различия и во времени генерации (in vitro) штаммов биоваров gravis и mitis. У штаммов биовара gravis оно составляет 60 минут, в то время как у штаммов биовара mitis - 180 минут. Быстрорастущие штаммы формируют колонии большего размера на питательной среде и на слизистых человека имеют возможность более быстрого захвата железа из инфицированных тканей, приводя тем самым к более ранней и высокой продукции дифтерийного токсина [437]. При изучении уровня токсинообразования (УТ) штаммов С. diphtheriae двух биоваров нами показано, что у штаммов биовара gravis УТ в два — четыре раза превышал УТ штаммов биовара mitis [12, 13, 78, 81]. Возможно, этими механизмами, запускающими инфекционный процесс, и, в первую очередь, продукцией высокого уровня дифтерийного токсина, можно объяснить взаимосвязь между тяжестью клинического течения дифтерии и выделением возбудителя биовара gravis. Так, многолетние клинико-микробиологические исследования [12, 13, 46, 51, 78, 80, 81, 83, 84,120, 188, 309], проводимые в лаборатории ФРЛДДИ при нашем непосредственном участии, показали, что в 90-е годы, в период эпидемического подъема заболеваемости дифтерией на фоне формирования генетически однородной высокотоксигенной популяции С. diphtheriae при выделении от больных штаммов биовара gravis наблюдали утяжеление клинической картины дифтерии у непривитых детей, по сравнению с 80-ми годами XX века, когда у больных выделяли штаммы С. diphtheriae биовара mitis. Такое положение подкрепляется и данными литературы прошлых лет, показавшими более тяжелую клиническую картину дифтерии при выделении штаммов С. diphtheriae биовара gravis [112, 144]. М.П. Корженкова [61, 62] так же подтверждает связь тяжелого клинического течения дифтерии с выделением возбудителя биовара gravis.

Способность штаммов С. diphtheriae биовара gravis продуцировать амилазу создает преимущественно перед штаммами биовара mitis в скорости роста и, вместе с другими особенностями структуры биовара gravis, в широком и более длительном распространении этого биовара [46, 51, 78, 80, 81, 83, 84, 188, 309]. Показано, что цикл распространения штаммов С. diphtheriae биовара mitis (в 80-е годы прошлого столетия) составил 7-8 лет, в то время как штаммы биовара gravis доминировали и циркулировали многие десятилетия (40 - 70-е годы). В настоящее время, доминирующее распространение (18 лет) имеют штаммы биовара gravis, которое продолжается после смены биовара mitis на gravis с конца 80-х годов.

Таким образом, генетически детерминированную способность продуцировать амилазу штаммами С. diphtheriae биовара gravis можно рассматривать как дополнительный фактор патогенности возбудителя дифтерии, дающий микроорганизму большие возможности колонизировать слизистые оболочки ротоглотки и, вследствие этого, более широко и длительно циркулировать среди населения.

Современный мониторинг и лабораторная диагностика инфекционных заболеваний базируются на молекулярно-генетических методах исследования, выявляющих специфические генетические «мишени» и с большей достоверностью, по сравнению с фенотипической диагностикой, идентифицируют возбудителей инфекций, а также значительно сокращают сроки исследования.

Если в системе мониторинга дифтерийной инфекции для наблюдения за штаммами возбудителя дифтерии в ФРЛДДИ разработан целый комплекс методов, включающих как классические микробиологические, так современные молекулярно-генетические методы исследования, в том числе ускоренные методы типирования (ПЦР с универсальными праймерами), позволяющие проводить всестороннее изучение фено- и генотипических свойств штаммов С. diphtheriae, то для проведения наблюдения за возбудителем коклюша существуют такие методы как секвенирование, пульс-электрофорез, мультилокусное секвенирование и др., применение которых затруднено из-за сложности и длительности их выполнения, отсутствия отечественных реактивов, некоторые методы (например, определения серотипа в РА) низкочувствительные и низкоспецифичные.

Нами разработан новый метод мониторинга штаммов В. pertussis на основе молекулярно-генетического изучения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ), основанный на выявлении специфических генетических «мишеней», позволяющих дифференцировать штаммы с новыми особенностями структуры ptxA гена, кодирующего основной фактор патогенности возбудителя коклюша - коклюшный токсин. Метод позволяет после проведения рестрикции амплифицированного определенного фрагмента ДНК со специфической рестриктазой и последующего электрофореза, получить характерный рестрикционный профиль, являющийся генетическим «маркером», тесно связанным с генотипом микроорганизма.

Учитывая выявленные особенности структуры различных аллеломорфов ptxA гена, кодирующего S1 субъединицу гена коклюшного токсина, в качестве «мишени» в ПЦР-ПДРФ выбран фрагмент ДНК этого гена размером 1030 п.н. Из большого спектра существующих рестриктаз, на основании сочетания двух факторов (наличия определенной последовательности в изучаемом гене и активности исследуемой рестриктазы к этим последовательностям) подобраны две рестриктазы (Ehel и Bful), с помощью которых получен специфический рестрикционный профиль ДНК. Наличие мутации в положении 684 ptxAl аллеля (замена нуклеотида g на а), создающей сайт рестрикции для фермента-рестриктазы Ehel, определило выбор специфической «мишени» для дифференциации штаммов В. pertussis, имеющих новый «невакцинный» ptxAl аллель гена от штаммов, несущих старые «вакцинные» ptxA2, ptxA4, ptxA5 аллели. Наличие мутации в положении 586 (замена t на с), создающей сайт рестрикции для рестриктазы BfuI, определило выбор другой специфической «мишени», с помощью которой можно дифференцировать штаммы В. pertussis с уникальным ptxA5 аллелем гена от штаммов с «вакцинными» ptxA2 и ptxA4 аллелями.

Разработанный нами метод типирования штаммов В. pertussis может явиться инструментом в системе мониторинга эпидемиологического надзора за коклюшной инфекцией, позволяющий проводить наблюдение за циркулирующей популяцией штаммов В. pertussis, выявлять штаммы с измененной генетической структурой ptxA гена и следить за их распространением. На новый молекулярно-генетический способ типирования штаммов В. pertussis, имеющих различную структуру гена коклюшного токсина, получен патент на изобретение № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.05.2007 г.

Лабораторная диагностика коклюша в России до сих пор основана на микробиологических и серологических методах исследования [106], которые являются недостаточно чувствительными и эффективными. Бактериологическая диагностика коклюша от начала исследования до выдачи ответа занимает от 5 до 7 дней [106] и ее диагностическая эффективность в клинической практике, как правило, не превышает 10,0%, и в редких случаях достигает 20,0% [10, 68, 91, 117, 152]. Такая низкая высеваемость микроорганизмов рода Bordetella обусловлена сниженной выживаемостью во внешней среде, поздним обследованием больных, низким качеством питательных сред, применением антибиотиков до начала бактериологического обследования, медленным ростом, контаминацией исследуемого материала другими микроорганизмами, недостаточной кратностью обследования, неправильным взятием исследуемого материала. Большие трудности имеют и серологические методы диагностики, которые эффективны только на 4-ой неделе заболевания и используются для ретроспективного анализа [67, 68, 109, 117, 118, 126, 152]. Кроме того, представители рода Bordetella имеют большую гомологию их геномов, поэтому все используемые в настоящее время амплификационные технологии в лабораторной диагностике для выявления возбудителя коклюша не обладают высокой специфичностью, чувствительностью, а также дают ложноположительные результаты [170, 175, 222, 229, 238, 257, 274, 288, 303, 318, 326, 367, 408, 432].

Одним из ключевых моментов разработки ускоренных молекулярно-генетических методов диагностики возбудителей инфекционных заболеваний является возможность выявления возбудителей в кратчайшие сроки, непосредственно из клинического материала больных без этапа получения «чистой» культуры.

Нами впервые разработан прямой, ускоренный и эффективный метод лабораторной диагностики коклюша - LAMP-вариант, основанный на современной амплификационной технологии - loop-mediated isothermal amplification (LAMP) — «петлеопосредованной» изотермальной амплификации.

Первым этапом разработки нового метода было воспроизведение LAMP - технологии [365]. Однако использование этой технологии представляло серьезные затруднения вследствии отсутствия реагентов, используемых в LAMP, трудности их приобретения и высокую стоимость. Поэтому проведены предварительные эксперименты по оптимизации параметров амплификации - подобраны реагенты, отработаны концентрации и условия постановки реакции. Вместе с тем, такой вариант применим только при изучении «чистой» культуры возбудителя коклюша. Поэтому, перед нами стояла цель разработки прямого метода ускоренной лабораторной диагностики коклюша для выявления возбудителя непосредственно из клинического материала (с тампонов от больных коклюшем).

Принимая во внимание, что чувствительность амплификационных технологий высокая только при работе с «чистыми» культурами микроорганизмов и автоматически не распространяется на чувствительность метода при работе с клиническим материалом, где на эффективность метода влияет методика подготовки клинического образца, способ выделения ДНК, освобождение от ингибиторов фермента амплификации, а также низкая концентрация первичной матрицы в малом объеме клинического образца, разработка прямого молекулярно-генетического метода включала несколько этапов экспериментальных исследований: предварительную обработку клинического образца (смыв клинического материала с тампона от больного и его первичная обработка), подготовку клинического образца (разрушение клеточной стенки возбудителя коклюша в клиническом образце различными детергентами), выделение ДНК из клинического материала (изучены методы выделения ДНК с использованием сорбентов, детергентов, магнитных частиц, а также метода кипячения).

В результате большого числа предварительных экспериментов с использованием музейных штаммов представителей рода Bordetella, Corynebacterium и Staphylococcus, показано, что прямой ускоренный метод лабораторной диагностики коклюша LAMP-вариант обладает высокой специфичностью (100%), высокой чувствительностью (выявляет 100 м.кл. возбудителя) и позволяет идентифицировать возбудителя заболевания в течение 9-10 часов от начала исследования непосредственно в клиническом материале от больного без этапа выделения «чистой» культуры.

Клинические испытания разработанного метода ускоренной лабораторной диагностики коклюша проводили совместно с инфекционистами клинического отдела ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» на базе ИКБ № 1 (г. Москва) — к.м.н. М.С. Петровой и к.м.н. О.П. Поповой, с врачами-бактериологами филиала ФГУЗ ЦГиЭ в Северо-Западном административном округе (СЗАО) (г. Москва) В.Г. Скачковой и B.C. Савинковой и младшим научным сотрудником ФРЛДДИ ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» Н.Т. Гадуа.

Применение LAMP-варианта для ускоренного выявления В. pertussis апробировали на клиническом материале 86 больных, из них 53 больных с клиническим диагнозом «коклюш» разной степени тяжести (у 9,4% больных коклюш протекал в легкой форме, у 66,0% — в среднетяжелой форме и у 24,6% — в тяжелой форме), обследованных на различные сроки от начала заболевания (7,5% больных обследованы на 1— неделе заболевания, 30,2% -на 2^, 41,5% - на 3—, 15,1% - на 4- и 5,7% - на 5^ неделях заболевания) и 33 больных с другими заболеваниями верхних дыхательных путей. Основную группу больных коклюшем (67,9%) составили дети в возрасте до 1 года, обследованных на 2— — 3— неделях заболевания.

Проведенные клинические испытания разработанного прямого метода LAMP-варианта, показали его высокую специфичность (100%) и высокую диагностическую эффективность, которая составила 84,9% ± 4,9% (р < 0,001), по сравнению с бактериологическим методом, эффективность которого не превышала 22,7% ± 5,7% (р < 0,001).

Проведен сравнительный анализ диагностической эффективности нового прямого ускоренного метода LAMP-вариант и бактериологической диагностики коклюша при обследовании больных с различными клиническими формами заболевания и в разные сроки от начала болезни. Показана высокая диагностическая эффективность LAMP-варианта при обследовании больных с различными клиническими формами заболевания -не только при среднетяжелых (в 91,4% ± 4,7% случаев) и тяжелых формах (в 61,5% ± 13,4% случаев), но и при легких формах заболевания (в 100% случаев); в то время как бактериологическим методом возбудитель коклюша выявлен только при среднетяжелых (в 22,8% ± 7,1% случаев) и тяжелых формах заболевания (в 30,7% ± 12,7% случаев).

Показана высокая эффективность LAMP-варианта при обследовании больных коклюшем в различные сроки от начала заболевания - от 72,7% ±

9,4% на 3— неделе заболевания до 100% на 1~, 2м, 4- и 5м неделях заболевания, в то время как бактериологическим методом удалось выявить возбудителя коклюша в небольшом проценте случаев только на 3— неделе (в 31,8% ± 9,9% случаев) и на 4— неделе (в 12,5% ±11,6% случаев) заболевания.

Таким образом, использование LAMP-варианта расширило возможности обследования больных с различной тяжестью клинического течения болезни, в различные сроки от начала заболевания (начиная с ранних сроков и вплоть до 31 дня болезни, т.е. даже в период обратного развития заболевания), а также при обследовании детей до 1 года, больных коклюшем, осложненным другими заболеваниями и в очагах инфекции (в первую очередь, в детских специализированных учреждениях) для быстрого подтверждения или опровержения клинического диагноза «коклюш».

Апробация LAMP-варианта проведена на 447 клинических образцах, полученных из 13 лечебно-профилактических учреждений СЗАО г. Москвы, поступивших в филиал ФГУЗ ЦГиЭ в СЗАО г. Москвы от лиц, обследованных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания. Среди 447 клинических образцов, 81 (18,1% ± 1,8%, р < 0.001) образец был положительным в LAMP-варианте, в то время как в бактериологическом методе положительными были только 19 (4,2% ± 0,9%, р < 0.001) образцов.

Из 81 положительного LAMP-образца, бактериологически подтвержденными оказались только 23,4% ± 4,7% (р < 0.001) образца. Проведенные клинико-микробиологические исследования при апробации LAMP-варианта выявили высокую эффективность применения разработанного метода для диагностики больных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, которая в 4,3 раза превышала результаты бактериологического обследования, а также в 5 - 7 раз сокращала срок выдачи окончательного ответа.

На новый метод LAMP-вариант подана заявка на изобретение № 2007147797/13 (052390) от 25.12.2007 г. в Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам и 16.09.2008 г. получено положительное решение о выдаче патента.

Система бактериологической диагностики дифтерии, разработанная в России несколькими поколениями исследователей и практических микробиологов и используемая в настоящее время, направлена на то, чтобы в максимально короткий срок (4-5 дня) с помощью минимального набора тестов выявить в исследуемом материале (в мазках из ротоглотки и носа, или других мест локализации) возбудителя дифтерии - токсигенные С. diphtheriae. Существующая ускоренная лабораторная диагностика при дифтерийной инфекции основана на ПЦР-технологиях, требующих выделение «чистой» культуры [207, 350, 351, 360, 375].

Определение принадлежности штаммов С. diphtheriae к биовару проводится классическим бактериологическим методом - биохимической реакцией разложения крахмала на среде Грисса. Однако результаты проведения биохимической идентификации С. diphtheriae зависят от большого числа факторов, таких как качество питательных сред и реагентов, условий их приготовления, определения рН среды, а также квалификации персонала и др. Поэтому, выявление генетической детерминанты амилазной активности (фрагмента ату гена) в геноме возбудителя дифтерии с помощью ПЦР является более точным и достоверным методом определения принадлежности к биовару, по сравнению с биохимической идентификацией.

На основании выявленных особенностей структуры генетической детерминанты (ату ген), определяющей амилазную активность, нами разработан новый способ, основанный на выявлении в ПЦР специфической «мишени» - фрагмента ату гена, позволяющего дифференцировать штаммы С. diphtheriae по принадлежности к биоварам. Разработанный нами способ определения биовара штаммов С. diphtheriae может явиться инструментом при наблюдении за возбудителем дифтерии при микробиологическом мониторинге в системе эпидемиологического надзора за дифтерийной инфекцией. На разработку способа дифференцирования штаммов С. diphtheriae биовара gravis от штаммов mitis подана заявка на изобретение № 2007140879/13 (044745) от 07.11.2007 г. в Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам. Разработка данного метода явилась одним из этапов создания новых мультиплексных тест-систем для ускоренного выявления возбудителя дифтерии по специфическим генам — tox и ату генам.

Для оценки возможностей использования разработанных «мишеней» в ату гене в качестве дагностического критерия определения принадлежности к биовару в ускоренной лабораторной диагностике дифтерии совместно с руководителем лаборатории молекулярной диагностики и геноинженерных препаратов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск) к.б.н. Н.В. Воложанцевым и сотрудником этой лаборатории В.В. Банновым предпринята попытка применения мультиплексной амплификационной технологии для выявления возбудителя дифтерии в клиническом материале больных, позволяющей одновременно в одной пробирке определять фрагменты ату гена, ответственного за амилазную активность, и tox гена, кодирующего токсинообразование. Из вышеуказанной лаборатории получены праймеры и протоколы для проведения мультиплексной амплификации. Апробирование полученного материала на 147 штаммах С. diphtheriae, как токсигенных (100 штаммов), так и нетоксигенных (47 штаммов), двух биоваров - gravis (76 штаммов) и mitis (71 штаммов) подтвердило специфичность «мишеней» в ату гене для определения биовара gravis и показало возможности использования мультиплексной ПЦР-технологии для диагностических целей.

Нами предпринята попытка выделения возбудителя дифтерии по наличию фрагментов tox и ату генов непосредственно в клиническом материале от больных дифтерией. Учитывая особенности применения амплификационных технологий при работе с клиническим материалом от больных, проведены эксперименты по оптимизации условий обследования больного, подготовки клинического образца, выделению ДНК. В нашей работе не представлены данные по нуклеотидным последовательностям праймеров, методике постановки мультиплексной ПЦР и предварительной подготовке клинического материала, так как это является основой формируемого совместно с Н.В. Воложанцевым и В.В. Банновым патента на изобретение.

Обследовано 9 больных в возрасте от 28 до 60 лет, госпитализированных в ИКБ № 1 (г. Москва) с подозрением на дифтерию и находящихся под наблюдением инфекциониста лаборатории эпиднадзора за дифтерией ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора к.м.н. М.П. Корженковой. Патологический материал собирали двумя тампонами из ротоглотки и носа для дальнейшего изучения в бактериологическом методе и мультиплексной ПЦР. С помощью мультиплексной ПЦР клинический диагноз «дифтерия» удалось подтвердить у трех больных: у больного (С., 44 года) с диагнозом «комбинированная дифтерия ротоглотки и носа»; у больной (И., 54 года) с клиническим диагнозом «комбинированная локализованная дифтерия ротоглотки и носа»; у больной (Е., 60 лет) с клиническим диагнозом «токсическая дифтерия ротоглотки II - III степени в комбинации с дифтерией гортани». У первых двух больных также получено бактериологическое подтверждение, в то время как бактериологическое обследование последней больной дало отрицательные результаты. У остальных шести больных, госпитализированных в стационар с подозрением на дифтерию, при поступлении поставлены диагнозы, «лакунарная ангина» и при бактериологическом обследовании и в мультиплексной ПЦР получены отрицательные результаты. Проведенное исследование показало возможности использования «мишеней» в ату гене, выявление которых с помощью ПЦР позволяет определять принадлежность к биоварианту, с целью коплексирования в мультиплексной ПЦР для разработки ускоренного метода обследования больных с подозрением на дифтерию. В настоящее время исследования по разработке ускоренного метода лабораторной диагностики дифтерии продолжаются.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Борисова, Ольга Юрьевна, Москва

1. Адаме М. Бактериофаги. ИМ., ИЛ. - 1961. - 527 С.

2. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. // Академкнига. 2003. - 431 С.

3. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1. // Мол. ген. микробиол. вирусол. 2002. - № 3. -С. 3-23.

4. Бабаченко И.В., Тимченко В.Н., Мартынкин A.C. Особенности эпидемиологии и клиники коклюша в г. Санкт-Петербурге. // Здравоохранение Российской Федерации. 2002. - № 4 - С. 31 - 33.

5. Баснакьян И.А., Алексахина H.H., Сюндюкова С.А., Захарова Н.С. и др. Коклюшный токсин и перекрестно-реагирующие антигены в динамике культивирования В. pertussis. II Журн. Микробиол. 2007. -№5.-С. 54-57.

6. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условнопатогенных бактериях. // Журн. Микробиол. 1999. - № 5. - С. 34-39.

7. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса. // Журн. Микробиол. 1997. - № 4. -С. 20-26.

8. Бондаренко В.М., Шахмарданов М.З. Современные представления о молекулярно-биологических основах патогенеза шигеллезов. // Журн. Микробиол. 1998. - № 6. - С. 88 - 92.

9. Бондаренко В.М. Острова патогенности бактерий. // Журн. Микробиол. 2001. - № 4. - С. 67 - 74.

10. Борисенко Ю.В., Шмыглева В.И., Милейковская М.М и др. // Бактериальные токсины: тезисы докладов, Юрмала. 1989. - 18 С.

11. Борисова И.Э., Селезнева Т.С. Антигенный дрейф коклюшного микроба. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2008. - № 1. - С. 39-44.

12. Борисова О.Ю. Патогенные и молекулярно-генетические свойства штаммов С. diphtheriae, циркулирующих на территории России в течение 1994 1998 гг. // Автореф. дис. канд. мед. наук. - М. —1999.- 183 С.

13. Бочкова В.А. Антибактериальный иммунитет при дифтерийной инфекции. // Автореф. дис. докт. мед. наук. М. - 1978.

14. Бухарин О.В., Литвин В.Ю. Патогенные бактерии в природных экосистемах. // Екатеринбург. 1997.

15. Бухарин О.В. Персистенция бактериальных патогенов как результат отношений в системе паразит-хозяин. // Журн. Микробиол. — 1997.-№4. -С. 3-9.

16. Владимиров В.Г., Карищенко А.И., Скворцов С.В. и др. Медицинские лабораторные технологии: справочник (под ред. Карпищенко А.И.). // Санкт-Петербург. 1999 - т. 2. - С. 579 - 602.

17. Волянский А.Ю., Ярмаш А.Д., Ямчинская А.А. Опыт применения комбинированных вакцин, содержащих ацеллюлярный коклюшный компонент. // Новости вакцинопрофилактики: Вакцинация. 2004. - № 5.-С. 10-11.

18. Высоцкий В.В., Шмелева Е.А., Мазурова И.К. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение 8 представителей рода Corynebacterium, выращенных на твердой питательной среде в стационарной фазе развития. // Журн. Микробиол. 1976. - № 10. - С. 121 - 126.

19. Высоцкий В.В., Шмелева Е.А., Мазурова И.К. К вопросу об экстрацеллюлярном материале некоторых представителей рода Corynebacterium (электронно-микроскопический аспект). // Журн. Микробиол. 1977. - № 8. - С. 90.

20. Гаврилова Н.А. Особенности роста, биосинтеза дифтерийного токсина и клеточных белков при культивировании Corynebacterium diphtheriae в условиях дефицита железа. // Автореф. дис. канд. биол. наук. М. - 2000.

21. Гараев М.М., Казеннова Е.В., Бобков А.Ф., Казаков Б.Г., Ковган А.А., Бобкова М.Р., Жданов В.М. Рестрикционный анализ ДНК токсигенных коринефагов BF, (р 984, ср 9 и С. // Вопросы вирусологии. 1987. - № 5. - С. 554 - 560.

22. Гараев М.М., Бобкова М.Р., Бобков А.Ф., Лукашевич Н.В. Клонирование и экспрессия гена дифтерийного токсина и егоотдельных субъединиц в бактериях Е. coli. //Генетика. 1990. - Т. 26. -№ 6. - С. 990 - 999.

23. Герасимова А.Г., Петрова М.С., Тихонова Н.Т. Клинико-эпидемиологическая характеристика современного коклюша. // Новости вакцинопрофилактики: Вакцинация. 2004. - № 5. - С. 4 - 5.

24. Гинцбург A.JI. Генодиагностика инфекционных заболеваний. // Журн. Микробиол. 1998. - № 3. - С. 86-95.

25. Гинцбург A.JL, Зигангирова H.A., Романова Ю.М. Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов в решении задач медицинской микробиологии. // Журн. Микробиол. -1999.-№5.-С. 22-26.

26. Гланц С. Медико-биологическая статистика. // М., Практика. -1999.-459 С.

27. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. // Перевод с англ. под ред. Янковского H.K. М., Мир. -2002.-590 С.

28. Говорун В.М., Момыналиев К.Т. Клиническая лабораторная аналитика (под. ред. Меньшикова В.В.). // Москва. 2002. - т. 1. - С. 365-420.

29. Гриценко В.А., Дерябин Д.Г., Брудастов Ю.А., Бухарин О.В. Механизмы уропатогенности бактерий. // Журн. микробиол. 1998. -№6.-С. 93-98.

30. Далин М.В., Фиш Н.Г. Белковые токсины микробов. // М., Медицина.- 1980.-224 С.

31. Доморадский И.В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий к окружающей среде. // Журн. Микробиол. 1997. - № 4. - С. 31-35.

32. Доморадский И.В. Вирулентность бактерий как функция адаптации. // Журн. Микробиол. 1997. - № 4. - С. 16 - 20.

33. Доморадский И.В. Вопросы патогенности Helicobacter pylori. II Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - № 2. - С. 45 - 47.

34. Доморадский И.В. Молекулярно-биологические аспекты изменчивости Helicobacter pylori. II Журн. Микробиол. 2002. - № 3. — С. 79-84.

35. Дин А., Хиншельвуд С. Адаптация микроорганизмов. // Москва. -1956.

36. Зайцев В.М. Применение моноклональных антител для изучения антигенного строения и выявления дифтерийного токсина. // Автореф. дис. канд. мед. наук. М. - 1988.

37. Захарова Н.С., Бажанова И.Г., Ремова Т.Н., Озерецкая М.Н., Шмелева Е.И. Новая субклеточная коклюшная вакцина. // В сборн. научн. трудов «Проблемы эпидемиологии, микробиологии и клиники капельных и кишечных инфекций». М. Том. 1. 1996. - С. 30 - 31.

38. Зверякина Н.Н., Ценева Г.Я., Курова Н.Н., Лосева Л.В., Курова Г. А., Лямина В.П. К вопросу о повышении эффективности бактериологического метода диагностики коклюшной инфекции. // Клиническая лабораторная диагностика. 2002. - № 2. - С. 44-45.

39. Каратаев Г.И. Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша. // Автореф. дис. докт. биол. наук. М. - 2008.

40. Ковган А.А., Бобков А.Ф., Карамов Э.В., Гараев М.М., Маныкин А.И., Жданов В.М. Биология и некоторые физико-химические свойства фагов Corynebacterium diphtheriae (3 (Freeman), ф 9, ф 984. // Вопросы вирусологии. 1986. - № 5. - С. 577 - 584.

41. Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Мельников В.Г., Костюкова H.H., Волковой К.И., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Efstratiou А.

42. Генетическая структура штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России при разной интенсивности эпидемического процесса дифтерии. // Журн. Микробиол. 2001. -№3.-C.3-8.

43. Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Мазурова И.К. Комплексная система наблюдения за циркулирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae. II Пособие для врачей. М. - 2004. - 34 С.

44. Комбарова С.Ю. Микробиологический молекулярно-генетический мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции. // Автореф. дис. докт. биол. наук. М. - 2007.

45. Кондратьева А.М. Характеристика возбудителя коклюша в период массовой специфической профилактики. // Дис. канд. мед. наук. -М.- 1977.

46. Костюкова H.H., Блинова H.H. Изучение вирулентности свежевыделенных культур Corynebacterium diphtheriae на куриных эмбрионах. // Журн. Микробиол. 1967. - № 8. - С. 37 - 42.

47. Костюкова H.H., Фаворова JI.A. Патогенные свойства дифтерийных бактерий, выделенных в течение эпидемического процесса. // Журн. Микробиол. 1968. - № 5. - С. 69 - 75.

48. Костюкова H.H. Дифтерийное бактерионосительство (бактериологические и иммунологические исследования). // Автореф. дис. докт. мед. наук. М. - 1971.

49. Костюкова H.H., Переверзев H.A. Адгезия С. diphtheriae. //Журн. Микробиол. 1985. - № 11. - С. 30 - 33.

50. Костюкова H.H., Карась С.Р. Адгезивная активность дифтерийных штаммов в зависимости от вызываемого ими инфекционного процесса. // Журн. Микробиол. 1991. - № 11. - С. 24 -27.

51. Костюкова H.H. Микробиологические факторы, определяющие носительство при воздушно-капельных инфекциях. // Журн. Микробиол. 1997. - № 4. - С. 10 - 15.

52. Костюкова H.H. Уроки дифтерии. // Журн. Микробиол. 1999. -№ 2. - С. 92-96.

53. Корженкова М.П., Платонова Т.В., Черкасова В.В., Малышев H.A., Кудряшова О.В., Берко А.И., Арсеньев В.А. Особенности клиники дифтерии в условиях циркуляции возбудителя дифтерии высокой степени токсигенности. // Пособие для врачей. М. - 2002. -31 С.

54. Корженкова М.П. Клиника дифтерии в период высокой и низкой заболеваемости. // Бюллетень «Вакцинация». — 2006. № 14 (3). - С. 4-6.

55. Крылова М.Д. Вирусы коринебактерий дифтерии в генетическом маркировании и таксономии. // Автореф. дис. докт. мед. наук. М. -1973.

56. Крылова М.Д. Дифтерийная инфекция (биологические, генетические и эпидемиологические аспекты). // М., Медицина. 1976.

57. Кузнецов Е.А. Биологические закономерности антигенной изменчивости коклюшных бактерий. // Автореф. дис. докт. мед. наук. — М.,- 1975.

58. Курова H.H. Молекулярно-биологическая характеристика В. pertussis, циркулирующих в период подъема заболеваемости исовершенствование лабораторной диагностики коклюша. // Автореф. дис. канд. мед. наук. 2003.

59. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. // Москва. 1998.

60. Лыткина И.Н., Чистякова Г.Г., Филатов H.H. Заболеваемость коклюшем в Москве и организация мероприятий по ее снижению. // Новости вакцинопрофилактики: Вакцинация. 2004. - № 5 (35). - С. 8 -9.

61. Мазурова И.К. Разработка и применение реакции пассивной гемагглютинации для обнаружения дифтерийных противомикробных антител у больных дифтерией. // Автореф. дис. канд. мед. наук. М. -1971.

62. Мазурова И.К., Бочкова В.А., Филллиппова Л.М. Гуморальные показатели антимикробного иммунитета при дифтерии. // Журн. Микробиол. 1971. - № 4. - С. 86 - 89.

63. Мазурова И.К., Потемкина Е.Е., Свиридов В.В., Зайцев Е.М. Детекция токсина и оценка степени токсинообразования с помощью иммуноферментного анализа. // Журн. Микробиол. 1989. - № 6. - С. 66-71.

64. Мазурова И.К. Комплексная система лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерии. // Автореф. дис. докт. мед. наук.-М.- 1993.

65. Мазурова И.К., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. // Руководство. М., Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России. -1995.-76 С.

66. Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю. Характеристика штаммов С. diphtheriae, выделенных в России (1984 -1995 гг.). // Информационное письмо для МЗ РФ. 1997. - 6 С.

67. Мазурова И.К., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Жилина Н.Я. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. // Методические указания. МУ 4.2.698-98. М., Интэрсэн. - 1998. -47 С.

68. Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мельников

69. B.Г., Платонова Т.В. Наблюдение за нетоксигенными штаммами

70. C. diphtheriae в период снижения заболеваемости дифтерией в России. // Матер, междунар. конф. «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». Санкт-Петербург, 2-4 сентября. 1998. - 186 С.

71. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Мельников

72. Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Бугаев Е.В. Ускоренные методы лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции. // Методические рекомендации. М. - 2001. - 12 С.

73. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Алешкин В.А. Динамика изменчивости основных генов патогенностиштаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в Москве (1948-2005 гг.). //Молекулярная медицина. -2008. -№ 1.-С. 40-45.

74. Максимова Н.М., Маркина С.С., Костюкова H.H. Дифтерия. // В кн. Покровский В.В., Онищенко Г.Г., Черкасский В.Л. «Эволюция инфекционных болезней в России в XX веке». М., Медицина. - 2003. -С. 214-236.

75. Маляренко В.Н., Зиерова H.H., Коцюруба В.П. // Детские инфекции: сборн. научн. трудов, Киев. — 1992. - вып. 22. - С. 37 - 41.

76. Мамаева Е.А. Изучение антигенных и иммуногенных свойств различных фаз коклюшного микроба. // Дис. канд. мед. наук. М. -1953.- 160 С.

77. Мамаева Е.А. Паракоклюш. Экспериментальные исследования, клинико-иммунологические и эпидемиологические наблюдения. // Дис. докт. мед. наук. — М. 1969. - 461 С.

78. Маркина С.С. Метод фаготипирования токсигенных коринебактерий дифтерии типа gravis и его применение в эпидемиологии дифтерийной инфекции. // Автореф. дис. канд. мед. наук.-М.- 1971.

79. Маркина С.С., Тымчаковская И.М., Максимова Н.М., Сухорукова Н.Л. Эпидемический процесс дифтерийной инфекции в РСФСР в условиях внедрения эпидемиологического надзора. // Журн. Микробиол. 1989. - № 5. - С. 38 - 40.

80. Маркина С.С., Максимова Н.М., Богатырева Э.Я. Заболеваемость дифтерией в России в 1992 г. // «Здоровье населения и среда обитания». Ежемесячный информационный бюллетень 1993. - № 1. - С. 3 - 8.

81. Маркина С.С., Монисов A.A., Максимова Н.М., Богатырева Э.Я. Дифтерия в России в 1990 — 1994 гг. // В сборн. научн. трудов «Проблемы эпидемиологии, микробиологии и клиники капельных и кишечных инфекций». — М. — 1996. Часть 1. — С. 18 - 20.

82. Маркина С.С., Максимова Н.М., Котова Е.А., Жилина Н.Я. Заболеваемость дифтерией в России в 1993 1995 гг. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1997. - № 4. - С. 8 - 10.

83. Маркина С.С., Максимова Н.М., Петина B.C., Кошкина Н.И., Фисенко В.А. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии в России. // В сборн. научн. трудов «Проблемы инфекционных болезней». Часть 1. -М.- 2000-С. 4-10.

84. Маркина С.С., Максимова Н.М. Характеристика эпидемического процесса дифтерии в начале нового тысячелетия. // Матер. VIII Всерос. съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М. - 2002. -Том 1.-81 С.

85. Маркина С.С., Максимова Н.М., Лазикова Г.Ф. Заболеваемость дифтерией в настоящее время. // Журн. Микробиол. 2005. - № 1. - С. 31-37.

86. Маркина С.С., Максимова Н.М., Черкасова В.В., Кошкина Н.И. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии в настоящее время. // Бюллетень «Вакцинация». 2006. - № 1 (43). - С. 7 - 11.

87. Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Воложанцев

88. Н.В., Веревкин В.В., Волковой К.И.,| Мазурова И.К Характеристиканетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae, несущих ген дифтерийного токсина. // Журн. микробиол. 2004. - № 1. - С. 3 - 7.

89. Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мазурова И.К. Нетосигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, несущие ген дифтерийного токсина. // Пособие для врачей. М. - 2002. - 12 С.

90. Министерство здравоохр. СССР. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше. // М. 1984. - 20 С.

91. Михайлович В.М., Заикин В.Л., Мазурова И.К. Использование метода ДНК-ДНК гибридизации для изучения штаммов Corynebacterium diphtheriae. II Мол. ген. микробиол. вирусол. 1994. — №6.-С. 27-29.

92. Михайлович В.М. Разработка и адаптация молекулярно-биологических технологий для диагностики дифтерийной инфекции и изучения штаммов Corynebacterium diphtheriae. // Автореф. дис. канд. биол. наук. М. - 1995.

93. Нарвская О.В., Мокроусов И.В. Применение полимеразной цепной реакции для диагностики дифтерии и изучения возбудителя. // Пособие для врачей. СПб. - 1995.

94. Мокроусов И.В., Нарвская О.В., Ценева Г.Я., Михайлов Н.В., Попель И.Р. Генетическое типирование штаммов Corynebacterium diphtheriae с помощью полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами. // Журн. Микробиол. 1996. - № 5. - С. 73-75.

95. Нисевич Н.И. Течение дифтерии в связи с типом дифтерии. // Педиатрия. 1947. - № 3. - С. 44 - 51.

96. Озерецковский Н.А., Чупрынина Р.П. Вакцинопрофилактика коклюша итоги и перспективы. // Новости вакцинопрофилактики: Вакцинация. - 2004. - № 5 (35) - С. 6 - 7.

97. Определитель бактерий Берджи. ТII. // М., Мир. 1997. - 368 С.

98. Петрова М.С. Коклюш в 70-е годы по материалам очагов инфекций. // Автореф. дис. канд. мед. наук. М. - 1978.

99. Петрова М.С., Сигаева Л.А., Антонова Н.А. Клиника коклюша на этапах массовой вакцинопрофилактики. // В сборн. научн. трудов «Вакцинопрофилактике 200 лет». - М. - 1997. - С. 54 - 56.

100. Петрова М.С., Попова О.П., Москалева Т.Н. Коклюш и паракоклюш (профилактика, клиника, лечение). // Методические рекомендации. — М. — 2000. 25 С.

101. Петрова М.С., Сигаева Л.А., Попова О.П., Маркелов В.П., Звонарева С.В. Особенности эпидемиологии и клиники коклюша в период эпидемического неблагополучия. // В сборн. научн. трудов «Проблемы инфекционных болезней». Часть 1. 2000. - С. 80 - 86.

102. Платонова Т.В. Клинико-иммунологические особенности дифтерии в период спорадической заболеваемости. // Автореф. дис. канд. мед. наук. М. - 1991.

103. Попова О.П., Селезнева Т.С., Милюкова В.И. Клинико-эпидемиологические аспекты коклюшной инфекции в современныхусловиях. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999. -№ 3. -С. 24-26.

104. Попова О.П., Петрова М.С., Чистякова Г.Г. и др. Клиника коклюша и серологические варианты коклюшного микроба в современных условиях. // Эпидемиология и инфекционные болезни. -2005.-№ 1.-С. 44-46.

105. Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий. // Молекулярная генетика. 1999. - № 2. - С. 22 - 29.

106. Ряпис Л.А., Липницкий А.В. Микробиологические и популяционно-генетические аспекты патогенности бактерий. // Журн. Микробиол. 1998. - № 6. - С. 109 - 113.

107. Селезнева Т.С., Титова Н.С., Заргарьянц А.И., Максимова Н.М., Маркина С.С. Влияние вакцинопрофилактики на эпидемический процесс управляемых инфекций в Российской Федерации. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. - № 2. - С. 6 - 11.

108. Селезнева Т.С. Серологический мониторинг за инфекциями, управляемыми средствами вакцинопрофилактики. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2004. - № 5 (18). - С. 14 - 16.

109. Семенов БФ. Вакцинопрофилактика детских инфекций. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2002. - № 3 (4). С. 17-21.

110. Семенов Б.Ф., Захарова Н.С., Мазурова И.К. Подъем заболеваемости коклюшем на фоне массовой вакцинации. Гипотезы, объясняющие этот феномен. // Журн. Микробиол. 2003. - № 6. - С. 70 -73.

111. Сергиев В.П. Болезни человека как отражение межвидовой борьбы. // Журн. Микробиол. 2007. - № 3. - С. 97 - 102.

112. Сигаева Л.А., Кузнецова Л.С. Заболеваемость коклюшем в условиях отмены второй ревакцинации. // В сборн. научн. трудов

113. Эпидемиология, микробиология и профилактика капельных инфекций». М. - 1983. - С. 67 - 73.

114. Сигаева Л.А., Кузнецова Л.С., Окиншевич Е.А. Заболеваемость коклюшем и состояние привитости. // Журн. Микробиол. 1986. - № 3. -С. 43-47.

115. Сигаева Л.А., Петрова М.С., Шакирова Р.Г. Осуществление эпидемиологического надзора за коклюшем. // В сборн. научн. трудов «Эпидемиологический надзор как основа профилактики капельных и кишечных инфекций». М. 1990. - С. 95 - 102.

116. Сомов Г.П., Литвин В.Ю. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий. //Новосибирск. 1998.

117. Сухинин М.В. Коклюш. Требуется новая стратегия диагностики и вакцинопрофилактики. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. -2005.-№6(25).-С. 17-21.

118. Сухорукова Н.Л. Эпидемиологическая оценка дифтерийной инфекции в условиях высокого уровня противодифтерийного иммунитета. // Дис. докт. мед. наук. М. - 1978.

119. Таточенко В.К. Коклюш управляемая инфекция. // Новости вакцинопрофилактики: Вакцинация. - 2004. - № 5 (35). - С. 2 - 3.

120. Тренин С.А. Гетерогенность дифтерийных коринебактерий. // Журн. Микробиол. 1986. - № 6. - С. 92 - 97.

121. Трофимова О. Д. Метод корицинотипирования и корициногенотипирования и его использование в эпидемиологическом анализе. // Автореф. дис. канд. мед. наук. М. - 1986.

122. Фаворова Л.А., Сухорукова Н.Л., Иванова Л.М. Об эпидемиологическом надзоре. // Журн. Микробиол. 1981. - № 8. - С. 8-13.

123. Фаворова Л.А., Астафьева Н.В., Корженкова М.П., Черкасова В.В., Шмелева Е.А. Дифтерия. // М., Медицина. 1988. - 208 С.

124. Херрингтон С., Макги Д. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. // Мир, Москва. 1999. - 558 С.

125. Хрущева В.А., Меклер С.С. Микробиологическая характеристика возбудителя дифтерии в послевоенные годы. // В кн. «Дифтерия». -Казань. 1964.-С. 45-48.

126. Черкасова В.В., Сухорукова Н.Л., Маркина С.С. Биологические свойства коринебактерий дифтерии, циркулирующих в детском коллективе. // В сборн. научн. трудов «Проблемы эпидемиологии и клиники инфекционных болезней». М. 1975. - С. 49 - 53.

127. Черкасова В.В. Возбудитель дифтерии и его свойства. // В кн. Фаворова Л.А., Астафьева Н.В., Корженкова М.П., Черкасова В.В., Шмелева Е.А. «Дифтерия». М., Медицина. - 1988. - С. 6 - 29.

128. Чистякова Г.Г., Филатов H.H., Корженкова М.П., Солодовников Ю.П., Лыткина И.Н., Максимова Н.М., Маркина С.С. Крупная эпидемия дифтерии в Москве в последние годы: закономерности развития. // Журн. Микробиол. 2001. - № 1. - С. 18-21.

129. Чистякова Г.Г., Борисова О.Ю., Лыткина И.Н., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Петрова М.С., Мельникова Ф.М., Скачкова В.Г. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции в Москве. // Журн. Микробиол. 2005. - № 5 - С. 18 - 21.

130. Чупрынина Р.П. Вакцинопрофилактика коклюша в национальных программах иммунизации. // Матер. VI Всерос. съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. Нижний Новгород. 1991. - Том 2. -С. 206-207.

131. Чупрынина Р.П., Алексеева И. А., Озерецковский H.A. Профилактика коклюша: разработка и применение бесклеточной коклюшной вакцины. // Журн. Микробиол. 2006. - № 1. - С. 99 - 105.

132. Ценева Г.Я., Курова H.H. Микробиологическая характеристика возбудителя коклюша и лабораторная диагностика коклюша. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003. -№4 (5).-С. 329-341.

133. Шагинян И. А. Генетические маркеры в эпидемиологии бактериальных инфекций. // Журн. Микробиол. 1997. - № 4. - С. 54 -59.

134. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. — Том 2. -№ 3. - С. 82-95.

135. Шагинян И.А. Идентификация и типирование патогенных бактерий: современные подходы. // Вестник РАМН. 2000. - № 1. - С. 22-28.

136. Шагинян И. А., Гинцбург A.JI. Молекулярно-генетические технологии в изучении эволюции возбудителей инфекционных заболеваний. // Сборн. трудов 5-ой Всерос. научно-практ. конф.

137. Генодиагностика инфекционных болезней», 19-21 октября 2004 г. -М. 2004. - Том 2. - С. 145 - 149.

138. Шакирова Р.Г. Патогенные свойства коклюшного микроба в различные периоды вакцинопрофилактики. // Автореф. дис. канд. мед. наук.-М.-1987.

139. Шемякин И.Г. Молекулярно-биологическая характеристика и методы идентификации клинических штаммов М. tuberculosis. II Автореф. дис. докт. биол. наук. М. - 2005.

140. Шлегель Г. Общая микробиология. // Москва. 1972.

141. Шмелева Е.А. Биологическая функция клеточной стенки Corynebacterium diphtheriae и научно-производственная разработка иммуномодулирующего препарата. // Автореф. дис. докт. биол. наук. -М.- 1991.

142. Шмелева Е.А., Макарова С.И., Корженкова М.П. Некоторые показатели иммунитета при дифтерийной инфекции. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2002. - № 3; 4. - С. 31 - 35.

143. Шмелева Е.А., Макарова С.И., Батурина И.Г., Корженкова М.П., Чистякова Г.Г., Ксенофонтова М.К., Филатов H.H. Специфические антитела и их роль в формировании противодифтерийного иммунитета. // Журн. Микробиол. 2005. - № 1. - С. 38 - 43.

144. Эмироглоу Н. Заболеваемость дифтерией в Европейском регионе ВОЗ. Рекомендации ВОЗ по лечению и профилактике дифтерии. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2001. — Т. 3. № 3. - С. 247 - 249.

145. Якубович Н.В., Земляная Н.Ю., Ермакова Л.М., Новикова И.С., Крылова М.Д., Янковский Н.К., Дебабов В.Г. Клонирование в Escherihia coli мутантного гена, кодирующего дифтерийный токсин. // Мол. ген. микробиол. вирусол. 1985. - № 1. - С. 17 - 22.

146. Ясинский А.А., Котова Е.А., Перевощикова А.Л., Скворцова Е.Г., Лазикова Г.Ф. Эпидемиологическая ситуация в Российской Федерации в 2004 году. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2005. - № 2 (21).-С. 6-14.

147. Ясинский А.А., Котова Е.А., Чернявская О.П., Ершов А.Е., Перевощикова А.Л. Вакцинопрофилактика управляемых инфекционных заболеваний в Российской Федерации (1995 2004 гг.). // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2005. - № 5 (24). - С. 8 -14.

148. Advani A., Donnelly D., Hallander Н. Reference system for characterization of Bordetella pertussis pulsed-field gel electrophoresis profiles. // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42. - P. 2890 - 2897.

149. Akopyants N.S., Clifton S.W., Kersulyte D., Crabtree J.E et all. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylory. II J. Molecular Microbiology. 1998. - № 28 (1). - P. 37 - 53.

150. Anderson Т., Beynon K., Murdoch D. Comparison of real-time PCR and conventional hemi-nested PCR for the detection of Bordetella pertussis in nasopharyngeal samples. // J. Clin. Microbiol. Infect. 2003. - № 9. - P. 746-749.

151. Arber W. Genetic variation: molecular mechanisms and impact on microbial evolution. // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - № 24. - P. 1 - 7.

152. Ashworth L.A.E., Irons L.I., Dowsett A.B. Antigenic relationship between serotype-specific agglutinogen and finbriae of Bordetella pertussis. //J. Infect. Immunity. 1982. - Vol. 37. -№ 3. - P. 1278 - 1281.

153. Babu M.M., Bhargavi J., Saund R., Singh S.K. Virulence factors of Bordetella pertussis. II Current science. 2001. - Vol. 80. - № 12. - P. 1512- 1522.

154. Backman A., Johansson B., Olcen P. Nested PCR optimized for detection of Bordetella pertussis in clinical nasopharyngeal samples. // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 2544 - 2548.

155. Bass J.W., Wittier R.R. Return of epidemic pertussis in the United States. // J. Pediatr. Infect. Dis. 1994. - Vol. 13. - P. 343 - 345.

156. Barksdale W., Pappenheimer A.M. Phage-host relationships in nontoxigenic and toxigenic diphtheria bacilli. // J. Bacteriology. 1954. -Vol. 67. - № 2. - P. 220 - 232.

157. Belkum A., Struelens H., de Vissser A., Verbruhgh H., Tibayrenc M. Role of genomic typing in taxonomy, evolutionary, genetics and microbial epidemiology. // J. Clin. Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 14. - № 3. - P. 547 -560.

158. Belkum A. Use of genomic typing in microbial diagnisis and epidemiology. // Ferns. Microbial. Lett. 2003. - Vol. 222. - Suppl. I. - P. 12-13.

159. Belkum A. Hight throughput epidemiologic typing in clinical microbiology. // J. Clin. Microbiol. Infect. 2003. - Vol. 9. - № 2. - P. 86 -100.

160. Betsou F., Sebo P., Guiso N. The C-terminal domain is essential for protective activity of the Bordetella pertussis adenylate cyclase-hemolysin. // J. Infect. Immunity. 1995. - Vol. 63. - № 9. - P. 3309 - 3315.

161. Blaskett A.C., Gulasekharam J., Fulton L.C. The occurrence of Bordetella pertussis serotypes in Australia, 1950-1970. // Med. J. Aust. -1971.-Vol. l.-P. 781-784.

162. Bodley J.W., Dunlop P.C. Diphthamid elongation factor 2: ADP ribosylation, purification and properties. // J. Methods Enzymol. 1984. -Vol. 106.-P. 378-387.

163. Boursaux-Eude C., Guiso N. Polymorphism of repeated regions of pertactin in Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica.il J. Infect. Immunity. 2000. - № 68. - P. 4815 - 4817.

164. Brennan M.J., Shahin R.D. Pertussis antigens that abrogate bacterial adherence and elicit immunity. // Am. J. Respirat. Crit. Care Med. 1996. -№ 154 (4 Pt 2). - P. 145 - 149.

165. Brownlie R.M., Parton R., Coote J.G. The effect of growth conditions on adenylate cyclase activity and virulence-related properties of Bordetella pertussis. II J. Gen. Microbiol. 1985. - Vol. 131. - Pt 1. - P. 17 - 25.

166. Buck G.A., Cross R.E., Wong T.P., Loeta J., Groman N. DNA relationhip among some tox-bearing corynebacteriophages. // J. Infec. Immunity. 1985. - Vol. 49. - № 3. - P. 679 - 684.

167. Burns D.A. Biochemistry of type IV secretion. // J. Curr. Opin. Microbiol. 1999. - № 2. - P. 25 - 29.

168. Cabiaux V., Mindell J., Collier R.J. Membrane translocation and channel-forming activities of diphtheria toxin are blocked by replacing isoleucine 364 with lysine. // J. Infect. Immunity. — 1993. Vol. 61. - № 5. - P.2200 - 2202.

169. Carniel E. The Yersinia high-pathogenicity island: an iron-uptake Iisland. // J. Microb. Infect. Vol. 3. - № 7. - P. 561 - 569.

170. Carniel E., Guilvout I., Prentice M. Characterization of a large choromosomal «high — pathogenicity island» in biotype IB Yersinia enterocolitica. II J. Bacteriology. 1996. - Vol. 178. - № 23. - P. 6743 -6751.

171. Cassiday P., Sanden G., Heuvelman K., Mooi F., Bisgard K.M., Popovic T. Polymorphism in Bordetella pertussis pertactin and pertussis toxin virulence factors in the United States, 1935-1999. // J. Infect. Dis. -2000. Vol. 182. - P. 1402 - 1408.

172. Cherry J.D., Olin P. The science and fiction of pertussis vaccines. // J. Pediatrics.-1999.-Vol. 104.-P. 1381 1383.

173. Cianciotto N.P., Groman N.B. Characterization of bacteriophages from tox-containing non-toxigenic isolates of Corynebacterium diphtheriae. II J. Microb. Pathog. 1997. - Vol. 22. - № 6. - P. 343 - 351.

174. Claridge III J.E., Spigel C.A. Corynebacterium and miscellaneous irregular gram-positive rods, Erisipelopthirix, and Gardnerella. // In:

175. Manual of clinical microbiology / Daron E.D., Pfalleer M.F., Tenover F.C., Wolken R.H. (eds). Sixth Edition, Washington, DC, ASM Press. - 1995. -P. 357-378.

176. Claridge III J.E. Impact of 16S tRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. // J. Clin. Microbiol. Rev. 2004 - Vol. 4. - № 4. - P. 840 - 862.

177. Collier R.J., Kandej J. Structure and activity of diphtheria toxin. I. Thiol-dependent dissociation of a fraction of toxin into enzymically active and inactive fragments. // J. Biol. Chem. 1971. - Vol. 246. - № 5. - P. 1496- 1453.

178. Collier R.J. Diphtheria toxin: mode of action and structure. // J. Bacteriol. Rev. 1975.-Vol. 39. -№ l.-P. 54-85.

179. Cookson B.T., Vandamme P., Carlson L.C. Bacteremia caused by a novel Bordetella species, «Bordetella hinzii». II J. Clin. Microbiol. 1994 — Vol. 32.-P. 2569-2571.

180. Cordova S.P., Gilles M.T., Beers M.Y. The outbreak that had to happen: Bordetella pertussis in north-west Western Australia in 1999. // Commun. Dis. Intell. 2000. - Vol. 24. - P. 375 - 379.

181. Coyle M.B., Groman N.B., Russell J.Q., Harnishch J.R., Rabin M., Holmes R. The molecular epidemiology of three biotypes of Corynebacterium diphtheriae in the Seatle outbreak, 1972-1982. // J. Infect. Dis. 1989.-Vol. 159,-№4.-P. 670-679.

182. Cryz S.J., Russel L.M., Holmes R.A. regulation of toxinogenesis in Corynebacterium diphtheriae: mutations in bacterial genome that alter the effect of iron on toxin productions. // J. Bacteriology. 1983. - Vol. 154. -№ l.-P. 245-252.

183. Daum R.S., Ito T., Hiramatsu K., Hussain F et all. A novel methicillin-resistanse cassette in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates of diverse genetic backgrounds. // J. Infect. Dis. 2002. - № 186.-P. 1344- 1347.

184. Doolittle W.F. Phylogenetic classification and the universal tree. // Science. 1999. - № 284. - P. 2124 - 2129.

185. Dragsted D., Dohn B., Madsen J., Jensen J. Comparison of culture and PCR for detection of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis under routine laboratory conditions. // J. Medical Microbiol. 2004. - № 53. -P. 749-754.

186. Efstratiou A., Roure C., Members of the European Laboratory Working Group on Diphtheria. The European laboratory working group on diphtheria: a global microbiological network. // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - Suppl. l.-P. 146-151.

187. Emsley P., Charles I.G., Fairweather N.F., Isaacs of the N.W. Structure Bordetella pertussis virulence factor P. 69 pertactin. // Nature. -1996.-№381.-P. 90-92.

188. Farizo K.M., Huang T., Burns D.A. Importance of holotoxin assembly in Ptl-mediated secretion of pertussis toxin from Bordetella pertussis. II J. Infect. Immunity. 2000. - № 68. - P. 4049 - 4054.

189. Feil E. Poppulation structure and ultra-species divergence of bacterial pathogens. // Ferns. Microbiol. Lett. 2003. - Vol. 222. - Suppl. 1. - P. 7.

190. Forbes K.J., Bruce K.D., Jordens J.Z., Ball A., Peninfusion T.H. Rapid method for DNA fingerprinting. // J. Gen. Microbiol. 1991. - Vol. 137. -№ 9. - P. 2051-2058.

191. Finlay B.B., Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity. // J. Microbiol. Rev. 1989. - № 53. - P. 210 - 230.

192. Finlay B.B., Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity revisited. // J. Microbiology and Molecul. Biology Reviews. 1997. - Vol. 61. -№ 2. - P. 136- 169.

193. Finn T.M., Stevens L.A. Tracheal colonization factor: a Bordetella pertussis secreted virulence determinant. // J. Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 16. -№ 4. - P. 625-634.

194. Fitzgerald J.R., Monday S.R., Foster T.J., Bohach G.A., Hartigan P.J. et all. Characterization of a putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens. // J. Bacteriology. — 2001.-Vol. 183. -№ l.-P. 63 -70.

195. Fleischmann R.D., Adams M.D., White O., Clayton R.A., et all Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenza. II Science. 1995. - № 269. - P. 496 - 512.

196. Fry N., Tzivra O., Li Y.T., McNiff A., Doshi N., Maple C., Crocroft N., Miller E., Goerge R., Harrison T. Laboratory diagnosis of pertussisinfection: the role of PCR and serology. // J. Medical Microbiol. 2004. -№53.-P. 519-525.

197. Funke G., von Geaeventiz A., Claridge III J.E., Bernard K.A. Clinical microbiology coryneform bacteria. // J. Clin. Microbiol. Rev. 1997. - Vol. 10.-№ l.-P. 125-129.

198. Funke G., Altwegg M., Frommelt L., von Gravenitz A. Emergence of related nontoxigenic Corynebacterium diphtheriae biotypes mitis strains in Western Europe. 11 J. Emerg. Infect. Dis. 1999. -Vol. 5. - № 3. - P. 983 -989.

199. Galazka A.M., Robertson S.E., Oblapenko G.P. Resurgence of Diphtheria. // Eur. J. Epidemiol. 1995. - Vol. 11. - P. 95 - 105.

200. Gandon S., MacRinnon M., Nee S., Read F. Imperfect vaccines and the evolution of the pathogen virulence. // Nature. 2001. - Vol. 414 (6865).-P. 751 -756.

201. Gandon S., MacRinnon M., Read A. Imperfect vaccination: some epidemiological and evolutionary consequences. // Proc. Biol. Sci. — 2003. — Vol. 7.-№270 (1520).-P. 1129- 1136.

202. Gandom S., Day T. The evolutionary epidemiology of vaccination. // J. R. Soc. Interface. 2007. -№ 4. - P. 803-817.

203. Garcia Vallve S., Romeu A., Palau J. Horizontal gene transfer of glycosyl hydrolases of the rumen fungi. // J. Mol. Biol. Evol. - 2000. - № 17. - P. 352-361.

204. Geuijen C.A., Willems R.J., Bongaerts M., Top J., Gielen H., Mooi F.R. Role of the Bordetella pertussis minor fimbrial subunit, FimD, in colonization of the mouse respiratory tract. // J. Infect. Immunity. 1997. -Vol. 65 (10). - P. 4222 - 4228.

205. Geuijen C.A., Willems R.J., Hoogerhout P., Puijk W.C., Meloen R., Mooi F.R. Identification and characterization of heparin binding refions of the fim2 subunit of Bordetella pertussis. II J. Infect. Immunity. 1998. -Vol. 66. - № 5. - P. 2256 - 2263.

206. Gill D.M., Dinius L.L. Observations on the structure of diphtheria toxin. // J. Biol. Chem. 1971. - Vol. 246. - №. 5. - P. 1485 - 1491.

207. Gill D.M., Pappenheimer A.M.J. Structure-activity relationships in diphtheria toxin. // J. Biol. Chem. 1971. - Vol. 246. - № 5. - P. 1492 -1495.

208. Gill D.M., Uchida R.A., Singer R.A. Expression of the diphtheria toxin genes carried by integrated and non-integrated phage beta. // J. Virology. 1972. - Vol. 50. - № 3. - P. 664 - 668.

209. Gulber J., Huber-Schneiner C., Altwegg C. An outbreak of non-toxigenic Corynebacterium diphtheriae infection among swiss drug users. // J. Clin. Infect. Dis. 1998. - Vol. 27. - № 5. - P. 1295 - 1298.

210. Graves L.M., Swaminathan B. Universal DNA isolation procedure. // In diagnostic molecular molecular microbiology. Principles and applications. Prsing D.H., Smith T.F., Tennover F.C., White T.J., eds. -Washington, ASM Press. 1993. - P. 573 - 583.

211. Greenfild L., Bjorn M.J., Horn G. nucleotide sequence of the structure gene for diphtheria toxin carried by toxigenic corynebacteriophage beta. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983 - Vol. 80. - № 22. - P. 6853 - 6857.

212. Grimont P.A.D., Grimont F., Efstratiou A., Zoysa A., Mazurova I., Ruckly C., Lejy-Collin M., Martin-Delautre S., Regnault B. International nomenclature for Corynebacterium diphtheriae ribotypes. // J. Res. Microbiol. 2004. - Vol. 155.-№3.-P. 162- 166.

213. Grimprel E., Begue P., Anjak I., Betsou F., Guiso N. Comparison of polymerase chain reaction, culture and western immunoblot serology for diagnosis of Bordetella pertussis infection. // J. Clin. Microbiol. 2004. -Vol. l.-P. 2745-2750.

214. Groman N.B. The relation of bacteriophage to the change of Corynebacterium diphtheriae from avirulence to virulence. // Science. -1953. Vol. 117. - P. 297 - 299.

215. Groman N.B., Cianciotto N., Bjorn M., Rabin M. Detection and expression of DNA homologous to the toxin nontoxigenic isolates of Corynebacterium diphtheriae. II J. Infect. Immunity. 1983. - Vol. 42. - № l.-P. 48-56.

216. Groman N. Conversion by corynephages and its role in the natural history of diphtheria. // J. Hyg. 1984. - Vol. 93. - № 3. - P. 405 - 412.

217. Groman N.B., Cianciotto N. A beta related corynebacteriophages wich lack a tox allele that can acquire it by recombination with converting phage. //J. Infect. Immunity. 1985.-Vol. 49.-№ l.-P. 32-35.

218. Gustafsson L., Hallander H.O., Olin P., Reizenstein E., Storsaeter J. A controlled trial of a two component acellular, a five component acellular, and a whole cell pertussis vaccine. // N. Engl. J. Med. 1996. - Vol. 334. -P. 349-355.

219. Gzyl A., Augustynowicz E., Rabczenko D., Gniadek G., Slusarczyk J. Pertussis in Poland. // Int. J. Epidemiol. 2004. - Vol. 33. - P. 358 - 365.

220. Gzyl A., Augustynowicz E., van Loo I., Slusarczyk J. Temporal nucleotide changes in pertactin and pertussis toxin genes in Bordetella pertussis strains isolated from clinical cases in Poland. // Vaccine. 2001. — Vol. 20.-P. 299-303.

221. Hacker J. Genetic determinantscoding for fimbriae and adhesions of extraintestinal Escherichia coli. II J. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990. -№> 151.-P. 1-27.

222. Hacker J., Bllum-Ochers G., Muhldorfer I., Ischape H. Pathogenecity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution. // J. Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 23. - № 23. - P. 1089 - 1097.

223. Hacker J., Kaper J.B. Pathogenicity islands and the evolution of microbes. // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - № 54. - P. 641 - 679.

224. Hacker J., Bllum-Ochers G., Hochhut B., Dobrindt U. The molecular basis of infectious diseases: pathogenicity islands and other mobile genetic elements. A review. // Act. Microbiol. Immunol. Hung. 2003. - № 50 (4). -P. 321 -330.

225. Hacker J., Carniel E. Ecological fitness, genomic islands and bacterial pathogenicity. // EMBO reports. 2001. - Vol 2. - № 5. - P. 376 - 381.

226. Halperin S.A, Bortolussi R., Wort A.J. Evaluation of culture, immunofluorescence, and serology for the diagnosis of pertussis // J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol. 27 (4). - P.752 - 757.

227. Halperin S. Pertussis-a disease and vaccine for all ages. // The new England Journal of Medicine. 2005. - Vol. 353. - № 15. - P. 1615 — 1617.

228. Hantke K. Iron and metal regulation in bactera. // J. Curr. Opin. Microbiol. 2001. - Vol. 4. - № 2. - P. 172 - 177.

229. Hardwick T.H., Cassiday P., Weyant R.S., Bisgard K.M., Sanden

230. G.N. Changes in predominance and diversity of genomic subtypes of Bordetella pertussis isolated in the United States, 1935 to 1999. // J. Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8. - P. 44 - 49.

231. He Q., Makinen J., Berbers G., Mooi F.R., Viljanen M.K., Arvilommi

232. H., Mertsola J. Bordetella pertussis protein pertactin induces type-specific antibodies: one possible explanation for the emergence of antigenic variants? // J. Infect. Dis. 2003. - Vol. 187. - P. 1200 - 1205.

233. Hellwing S.M., Rodriguez M.E., Berbers G.A., van de Wilkel J.G, Mooi F.R. Crucial role of antibodies to pertactin in Bordetella pertussis immunity. // J. Infect. Dis. 2004. - Vol. 189. - № 2. - P. 354.

234. Hentschel U., Hacker J. Pathogenicity islands: the tip of the iceberg. // J. Microbes and Infect. 2001. - Vol. 3. - P. 545 - 548.

235. Hoiby N., Hertz J.B., Andersen V., Baekgaard P. Crossed immunoelectrophoretic analysis of Bordetella pertussis antigens and of corresponding antibodies in human sera. // Acta Pathol. Microbiol. Scand. -1976. Vol. 84 B. - P. 386 - 394.

236. Hoiby N., Hertz J.B., Andersen V. Cross-reactions between Bordetella pertussis and 28 other bacterial species. // Acta Pathol. Microbiol. Scand. -1976. Vol. 84 B. - P. 395 - 400.

237. Holmes R., Barksdale W. Comparative studies with tox+ and tox~ corynebacteriophages. // J. Virology. 1970. - Vol. 5. - № 6. - P. 783 -794.

238. Holmes R. Genetic aspects of toxinogenesis in bacteria. // In: Microbiology. Schlessinger D., ed. Washington, ASM. 1975. - P. 296 -301.

239. Holmes R. Biology and molecular biology of diphtheria toxin and tox gene. // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 5. - № 6. - P. 156 - 167.

240. Houard S., Hackel C., Herzog A., Bollen A. Specific identification of Bordetella pertussis by polymerase chain reaction. // J. Res. Microbiol. -1989. Vol. 140. - P. 477 - 487.

241. Hsia J.A. Moss J., Hewlett E.L., Vaughan M. ADP-ribosylation of adenylate cyclase by pertussis toxin: effects on inhibitory agonist binding. // J. Biol. Chem. 1984. - № 259. - P. 1086 - 1090.

242. Isenberg H.D. Clinical microbiology procedures handbook. // Washington, ASM Press. 2004.

243. Ito T., Katayama Y., Hiramatsu K. Cloning and nucleotide sequence determination of the entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus N 315. // J. Antimibiol. agents chemother. 1999. -№43.-P. 1449- 1458.

244. Jansen D.L., Gray G.C., Putnam S.D., Lynn F., Meade B.D. Evaluation of pertussis in U.S. Marine Corps trainees. // J. Clin. Infect. Dis. 1997.-Vol. 25.-№5.-P. 1099- 1107.

245. Jefferson T., Rudin M., Di Pietrantonj C. Systematic review of the effects of pertussis vaccines in children. // Vaccine. 2003. - Vol. 21. - P. 2003-2014.

246. Kaper J.B., Hakcer J. Pathogenicity island and other mobile virulence elements. // Washington, ASM. 1993.

247. Karaolis D.K.R., Johnson J.A., Bailey C.C., Boedeker E.C., Kaper J.B., Reeves P.R. A Vibrio cholera pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. // Protocl. Natl. Acad. Sci. 1998. - Vol. 95.-P. 3134-3139.

248. Karaolis D.K.R., Somara S., Manevil J.D.R., Johnson J.A., Kaper J.B. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria. // Nature. 1999. - № 399. - P. 375 -379.

249. King A.J., Berbers B., Van Oirschot H.F.L.M., Hoogerhout P., Knipping K., Mooi F.R. Role of the polymorphic region 1 of the Bordetellapertussis protein pertactin in immunity. // J. Microbiology. 2001. - Vol. 147.-P. 2885 -2895.

250. Knapp S., Hacker J., Jarchau T., Goebel W. Large, unstable inserts in the chromosome affect virulence properties of uropathogenic Escherichia coli 06 strain 536. // J. Bacteriology. 1986. - № 168. - P. 22 - 30.

251. Koidl C., Bozic M., Burmeister A., Hess M., Marth E., Kessler H. Detection and differention of Bordetella spp. by real-time PCR. // J. Clin. Microbiol. Vol. 45. - № 2. - P. 347 - 350.

252. Kolodkina V., Titov L., Sharapa T., Grimont F., Grimont P.A.D., Efstratiou A. Molecular epidemiology of C. diphtheriae strains during different phases of the diphtheria epidemic in Belarus. // BMC Infect. Dis. -2006.-Vol. 6.-P. 129.

253. Kombarova S., Melnikov V., Borisova O., Mazurova I. Ribotyping of C. diphtheriae isolated in Russia, 1945 2002. // FEMS Microbiol. Lett. -2003.-Vol. 222.-Suppl. 1.-P.497.

254. Kunkle C.A., Schmitt M.P. Analisis of a DtxR-regulated iron transport and siderophorebio synthesis gene cluster in Corynebacterium diphtheriae. II J. Bacteriology. 2005. - Vol. 187. - № 2. - P. 422 - 433.

255. Lee Y.S., Yang C.Y., Lu C.H., Tseng Y.H. Molecular epidemiology of Bordetella pertussis isolated in Taiwan, 1992 1997. // J. Microbiol. Immunol. - 2003. - Vol. 47. - P. 903 - 909.

256. Leusch M.S., Paulaitis S., Friedman R.L. Adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis: production, purification, and partial characterization. // J. Infect. Immunity. 1990. - Vol. 58. - № 11. - P. 3621 - 3626.

257. Li Z.M., Brennan M J., David J.L., Carter P.H., Cowell J.L., Manclark C.R. Comparison of type 2 and type 6 fimbriae of Bordetella pertussis by using agglutinating monoclonal antibodies. // J. Infect. Immunity. 1988. -Vol. 56. -P. 3184-3188.

258. Lind-Brandberg L., Welinder-Olsson C., Lagergard T., Tarager J., Trollfors B., Zackrisson G. Evalution of PCR for diagnosis of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis infections. // J. Clin. Microbiol. -1998. Vol. 36. - P. 679 - 683.

259. Livey I., Duggleby C.J., Robinson A. Cloning and nucleotide sequence of the serotype 2 fimbrial subunit gene of Bordetella pertussis. II J. Mol. Microbiol. 1987. - Vol. 1. - P. 203 - 209.

260. Locht C., Keith J.M. Pertussis toxin gene: nucleotide sequence and genetic organization. // Science. 1986. - № 232. - P. 1258 - 1264.

261. Locht C., Bertin P., Menozzi F.D., Renauld G. The filamentous haemagglutinin, a multifaceted adhesion produced by virulent Bordetella spp. II J. Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 9. - № 4. - P. 653 - 660.

262. Locht C., Antoine R. A proposed mechanism of ADP-ribosylation by the pertussis toxin SI subunit. // J. Biochimie. 1995. - № 77. - P. 333 -340.

263. Locht C., Antoine R., Veithen A., Raze D. Pertussis toxin: structure-function relationship. // In handbook of Experimental pharmacology. Bacterial protein toxin (ed. By Aktories K., Just I.). 2000. - Vol. 145. - P. 167- 185.

264. Locht C., Antoine R., Lemoine Y., Jacob-Dubuisson F. Bordetella pertussis molecular pathogenesis under multiple aspects. // J. Microbiology. -2001.-Vol. 4.-P. 82-89.

265. Locht C., Antoine R., Rase D., Mielcarek N., Hot D., Mascart F. Bordetella pertussis from functional genomics to intranasal vaccination. // Int. J. Med. Microbiol. 2004. - Vol. 293. - № 7 - 8. - P. 583 - 588.

266. Mazurova I.K., Melnikov V.G., Kombarova S.Yu., Borisova O.Yu. et all. Project INTAS 2001-2289 «Study of the role of nontoxigenic Corynebacterim diphtheriae in the epidemiology of diphtheria». 2004.

267. Maksimova N.M., Markina S.S. Current state of diphtheria in Russia. // Programme and abstracts book of the Eighth international meeting of the

268. European laboratory working group on diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network (DIPNET), 16-18 June 2004: ed. by A. Efstratiou. Copenhagen, Denmark. 2004. - P. 27.

269. Manson J.M., Gilmore M.S. Pathogenicity island integrase cross-talk: a potential new tool for virulence modulation. // J. Molecular Microbiology.- 2006. № 61 (3). - P. 555 - 559.

270. Matsuda M.L., Barksdale L. Phage-directed synthesis of diphtherial toxin gene in non-toxigenic Corynebacterim diphtheriae. II Nature. 1966. -Vol.210.-№ 5039.-P. 911-913.

271. Matsuda M.L., Barksdale L. System for the investigation of the bacteriophage-directed synthesis of diphtherial toxin. // J. Bacteriology. -1967. Vol. 93. - P. 722 - 730.

272. McDaniel T.K., Jarvis M.S., Donnenberg M.S., Kaper J.B. A genetic locus of enterocyte effacement conserved among diverse enterobacterial pathogens. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. - № 92. - P. 1664 - 1668.

273. Miller J.F., Mekalanos J.J., Falkow S. Coordinate regulation and sensory transduction in the control of bacterial virulence. // Science. 1989. -№243.-P. 916-922.

274. Mokrousov I., Narvskaya O., Limeshenko E., Vyazovaya A. Efficent discrimination within Corynebacterim diphtheriae clonal group by a noval macroarray-based method. // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - № 4. -P. 662-668.

275. Mooi F.R., ter Avest A., van der Heide H.G.J. Structure of the Bordetella pertussis gene coding for the serotype 3 fimbrial subunit. // FEMS Microbiol. Lett. 1990. - Vol. 66. - P. 327 - 332.

276. Mooi F.R., He Q., van Oirschot H., van der Heide H.G.J. Antigenic variants in Bordetella pertusis strains isolated from vaccinated and unvaccinated children. // J. Microbiology. 1999. - Vol. 145. - P. 2069 -2075.

277. Mooi F.R., He Q., van Oirschot H., Mertsola J. Variation in the Bordetella pertussis virulence factors pertussis toxin and pertactin in vaccine strains and clinical isolates in Finland. // J. Infect. Immunity. 1999. - Vol. 67. - P. 3133-3134.

278. Mooi F.R., Hallander H., Wirsing C.H., Hoet B., Guiso N. Epidemiological typing of Bordetella pertussis isolates: recommendations for a standard methodology. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2000. -Vol. 19.-P. 174-181.

279. Morschhauser J., Kohler G., Ziebuhr W., Blum-Oehler G., Dobrindt U., Hacker J. Evolution of microbial pathogens. // Phil. Trans. Royal Society Lond. 2000. - № 355. - P. 695 - 704.

280. Mothershed E.A., Cassiday P.K., Pielson K., Mayer L.W., Popovic T. Development of a real-time PCR assay for rapid detection of the diphtheria toxin gene. // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - № 12. - P. 4713 -4719.

281. Moxon E.R., Rainey P.B., Nowak M.A., Lenski R.E., Adaptive evolution of highly mutable loci in pathogenic bacteria. // J. Curr. Biol. -1994-№4.-P. 24-33.

282. Mullis K., Fallona F., Schart S., Saiki R., Horn G., Erich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. // Gold Spring Harbor Symp. Quant. Bröl. 1986. - Vol. 51 (Pt. 1). - P. 263 -273.

283. Murphy J.R., Pappenheimer A.M., Borms S.T. Synthesis of a tox-gene products in Escherichia coli extracts. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1974. -Vol. 71.-№ l.-P. 11 - 15.

284. Murphy J.R., Skiver Y., McBride G. Isolation and partial characterization of a corynebacteriophage ß, tox operator constitutive-like mutant lysogen of Corynebacterim diphtheriae. II J. Virology. 1976. — Vol. 18. -№ i.p. 235-244.

285. Nakao H., Pruckler J.M., Mazurova I.K., Narvskaya O.V., Gushkevich T., Marievski V.F., Kravetz A.N., Fields B.S., Wachsmuth I.K.,

286. Popovic T. Heterogeneity of diphtheria toxin gene, tox, and its regulatory element, dtxR, in Corynebacterim diphtheriae strains cousing epidemic diphtheria in Russia and Ukraine. // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. -№ 7.-P. 1711 - 1716.

287. Nakao H., Mazurova I.K., Glushkevich T., Popovic T. Analysis of heterogeneity Corynebacterim diphtheriae toxin gene, tox, and its regulatory element, dtxR, by direct sequencing. // J. Res. Microbiol. 1997. - Vol. 148. - № l.-P. 45-54.

288. Nakao H., Popovic T. Development of a direct PCR assay for detection of the diphtheria toxin gene. // J. Clin. Microbiol. Vol. 35. — №7.-P. 1651 - 1655.

289. Neiladss J.B. Siderophores: structure and functions of microbial iron transport compounds. // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - № 45. - P. 26723 - 26726.

290. Njamkepo E., Rimlinger F., Thiberge S., Guiso N. Thirty-five years experience with the whole-cell pertussis vaccine in France: vaccine strains analysis and immunogenicity. // Vaccine. 2002. - Vol. 20. - P. 1290 -1294.

291. Nielsen A., Larsen S.O. Epidemiology of pertussis in Denmark: the impact of herd immunity. // Int. J. Epidemiol. 1994. - Vol. 23. - P. 1300 -1308.

292. Nygren M., Reizenstein E., Ronaghi M., Lundeberg J. Polymorphism in the pertussis toxin promoter region affecting the DNA-based diagnosis of Bordetella infection. // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 55 - 60.

293. Ochman H., Moran N.A. Genes lost and genes found: evolution of bacterial pathogenesis and symbiosis. // Science. 2001. - № 292 (5519). -P. 1096- 1099.

294. Ohad Gal-Mor, Finlay B.B. Pathogenicity islands: a molecular toolbox for bacterial virulence.// J. Cellular Microbiology. 2006. - № 8 (11). -P. 1707- 1719.

295. Olin P., Gustafsson L., Barreto L., Hessel L., Mast T.C., Rie A.V., Bogaerts H., Storsaeter J. Declining pertussis incidence in Sweden following the introduction of acellular pertussis vaccine. // Vaccine. 2003. - Vol. 21. -P. 2015-2021.

296. Olive D.M., Bean P. Principles and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37.- № 6. P. 1661 - 1669.

297. Oppenheimer N.J., Bodley J.W. Diphtheria toxin. Site and configuration of ADP-ribosylation of diphthamid in elongation factor 2. // J. Biol. Chem. 1981. - Vol. 256. - № 16. - P. 8579 - 8581.

298. Packard E.R., Parton R., Coote J.G., Fry N.K. Sequence variation and conservation in virulence-related genes of Bordetella pertussis isolates from the UK. // J. Med. Microbiol. 2004. - Vol. 53. - P. 355 - 365.

299. Pallen M.J., Haj A.J., Puckey L.H., Efstratiou A. Polymerase chain reaction for screening clinical isolates of corynebacteria for the production of diphtheria toxin. // J. Clin. Pathology. 1994. - Vol. 47. - № 4. - P. 353 -356.

300. Pappenheimer A.M., Uchida T., Harper A.A. An immunological study of the diphtheria toxin molecula. // J. Immunochemistry. 1972. - Vol. 9. -P. 891 -906.

301. Pappenheimer A.M. Diphtheria toxin. // Annu. Rev. Biochem. 1977. -Vol. 46.-P. 69-94.

302. Pappenheimer A.M. The story of a toxic protein, 1888 -1992. // Protein sei. 1993. - Vol. 2. - № 2. - P. 292 - 298.

303. Pappenheimer A.M., Murphy J. The study of the molecular epidemiology of diphtheria. // Lancet. 1983. - Vol. 2 (8356). - P. 923 -926.

304. Peerbooms P.G.H., Verweij A.M.J.J., MacLaren D.M. Vero cell invasiveness of Proteus mirabilis. II J. Infect. Immunity. 1984. - Vol. 43. -№ 3. - P. 1068- 1071.

305. Peppier M.S., Schrumpf M.E. Isolation and characterization of Bordetella pertussis phenotype variants capable of growing on nutrient agar: comparison with phases III and IV. // J. Infect. Immunity. 1984. - Vol. 43. - № 1.-P. 217-223.

306. Pierce N.F., Kaper J.B., Mekalanos J.J., Cray W.C. Role of Cholera toxin in enteric colonization by Vibrio cholera Ol in rabbits. // J. Infect. Immunity. 1985.-Vol. 50.-№3.-P. 813-816.

307. Pohl E., Quix A., Must L.M., Holmes R.K., Hoi W.G. Comparisson of high resolution structures of the diphtheria toxin repressor in complex with cobalt and zinc at the cation-anion binding site. // Protein Sci. 1997. - Vol. 6. - № 5.-P. 1114-1118.

308. Popovic T., Dopp C.A., Olsvik O., Kiehlbauch J.A. Ribotyping in molecular epidemiology. // In: Diagnostic molecular microbiology. Persing D.H., Smith T.F., Tenover F.C., White F.J. (eds). ASM, Washington. -1993.-P. 573 -583.

309. Popovic T., Kim Ch., Ries J., Reeves M., Nakao H., Golaz A. Use of molecular subtyping to document long-term persistence of Corynebacterim diphtheriae in South Dakota. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - № 4. -P. 1092- 1099.

310. Popovic T., Mazurova I.K., Efstratiou A., Vuopio-Varkila J., Reeves M., Zoysa A., Glushkevich T., Grimont P. Molecular epidemiology of diphtheria. //J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - Suppl. 1. - P. S168 - S177.

311. Poetre J.F., Connor K., Donachie W. Isolation and characterization of Bordetella parapertussis — like bacteria from ovine lungs. // J. Microbiology. 1994. - № 140. - P. 255 - 261.

312. Poynten M., Mclntyre P.B., Mooi F.R., Heuvelman K.J., Gilbert G.L. Temporal trends in circulating Bordetella pertussis strains in Australia. // Epid. Infect.-2004.-Vol. 132.-№2.-P. 185- 193.

313. Preston N.W. Prevalent serotypes of Bordetella pertussis in non-vaccinated communities. // J. Hyg. 1976. - Vol. 77. - P. 85-91.

314. Preston N.W. Essential immunogens in human pertussis: the role of fimbriae. // Dev. Biol. Stand. 1985. - Vol. 61. - P. 137 - 141.

315. Preston N.W., Carter E.J. Serotype specificity of vaccine-induced immunity to pertussis. // Commun. Dis. Rep. CDR Rev. 1992. - Vol. 2. -P. R155 -R156.

316. Preston N.W., Matthews R.C. Components of acellular pertussis vaccines. // Lancet. 1996. - № 347. - P. 764.

317. Preston G.M., Hauboldt B., Rainey P.B. Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis. // Curr. Op. Microbiol. 1998. - P. 589 - 597.

318. Preston A. Bordetella pertussis: the intersection of genomics and pathobiology. // CMAJ. 2005. - Vol. 173. - № 1.

319. Rappuoli R., Michel J.L., Murphy J. Restriction endonuclease map of corynebacteriophage coctox+ isolated from the Park-Williams 8 strain of Corynebacterim diphtheriae. II J. Virology. 1983. - Vol. 45. - № 2. - P. 524-530.

320. Rappuoli R., Ratti G. Physical map of the chromosomal region of Corynebacterim diphtheriae containing corynephage attachment sites attBl and attB2. // J. Bacteriology. 1984. - Vol. 158. - № 1. - P. 325 - 330.

321. Rappuoli R., Perugini M., Enevold F. Molecular epidemiology of the 1984 1986 outbreak of diphtheria in Sweden. // N. Engl. J. Med. - 1988. -Vol. 318.-№ l.-P. 12-14.

322. Ratti G., Rappuoli R., Giannini G. The complete nucleotide sequence of the gene coding for diphtheria toxin in the corynebacteriophage omega (tox +) genome. II Nucleic Acids Res. 1983. - Vol. 11. - № 19. - P. 6589 -6595.

323. Ratti G., Covacci A., Rappuoli R. A tRNA2 arg gene of Corynebacterim diphtheriae is the chromosomal integration site for toxigenic corynebacteriophages. // J. Mol. Microbiol. 1997. - № 25. - P. 1179-1181.

324. Reacher M., Ramsay M., White J., Zoysa A., Efstratiou A., Mann G., MacKay A., Georg R. Non-toxigenic Corynebacterim diphtheriae an emerging pathogen in England and Wales? // J. Emerg. Infect. Dis. 2000. — Vol. 6.-№6.-P. 640-645.

325. Redhead K., Watkins J., Barnard A., Mills K.H.G. Effective immunization against Bordetella pertussis respiratory infection in mice is dependent on induction of cellmediated immunity. // J. Infect. Immunity. -1993.-№61.-P. 3190-3198.

326. Regnault B., Grimont F., Grimont P.A.D. Universal ribotyping method using a chemically labeled oligonucletide prope mixture. // J. Res. Microbiol. 1997. - Vol. 148. - № 8. - P. 649 - 659.

327. Reischl U., Lehn N., Sanden G.N., Loeffelholz M.J. Real-time PCR assay targeting IS481 of Bordetella pertussis and molecular basis for detecting Bordetella holmesii. II J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 1963 - 1966.

328. Riffelmann M., Wirsing von Konig C.H., Caro V., Guiso N. Nucleic acid amplification tests for diagnosis of Bordetella infections. // J. Clin. Microbiol. Vol. 43. - № 10. - P. 4925 - 4929.

329. Ronaghi M., Uhlen M., Nyren P. A sequencing method based on realtime pyrophosphate. // Science. 1998. - Vol. 281. - P. 363 - 365.

330. Russel L.M., Holmes R.K. Initial characterization of the ferric iron transport system of Corynebacterim diphtheriae. II J. Bacteriology. 1983. -Vol. 155.-№3.-P. 1439-1442.

331. Russel L.M., Holmes R.K. Highly toxigenic but avirulent ParkWilliams 8 strain Corynebacterim diphtheriae does not produce siderophore. // J. Infect. Immunity. 1985. - Vol. 47. - № 2. - P. 575 - 578.

332. Sanger F., Nicklen S., Coulsoen A.R. DNA sequencing and chain terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - № 12.-P. 5463-5467.

333. Savelkoul P.H.M, Aarts H.J.M., Haas J., Dykshoorn L., Duim B., Otsen M., Rademarker W., Schoults L., Lentstra J.A. Amplified-fragment length polymorphism analysis: the state of art. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - № 10. - P. 1661 - 1669.

334. Smith A.M., Guzman C.A., Walker M.J. The virulence factors of Bordetella pertussis: a matter of control. // FEMS Microbiol Rev. 2001. -Vol. 25. - № 3. - P. 309 - 333.

335. Schmidt H., Hensel M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 17. - № 1. - P. 14 - 56.

336. Selander R.K., Caugant D.A., Ochman H., Musser J.M., Gilmour M.N., Whittman T.S. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetic and systematics. // Appl. and Env. Microbiol. -1986. Vol. 55. - № 5. - P. 873 - 883.

337. Schiller Y., Groman N., Coyle M. Plasmid in Corynebacterim diphtheriae and diphtheroids mediating erytromicin resistance. // J. Antimicrob. Agents. Chemother. 1980. - Vol. 18. - № 5. - P. 814 - 821.

338. Skogen V., Cherkasova V.V., Maksimova N.M., Marston Ch., Sjursen H., Reeves M., Olsvik O., Popovic T. Molecular characterization of Corynebacterim diphtheriae isolates, Russia, 1957 1987. // J. Emerg. Inf. Dis. - 2002. - Vol. 8. - № 5. - P. 125 - 128.

339. Shahin R.D., Brennan M.J., Li Z.M., et al. Characterization of the protective capacity and immunogenity of the 69 — kD outer membrane protein of Bordetella pertussis. II J. Exp. Med. 1990. - № 171. - P. 63 -73.

340. Spiering M.N., Ringe D., Murphy J.R., Marietta M.A. Metal stoichionary and functional studies of the diphtheria toxin repressor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100. - № 7. - P. 3809 - 3813.

341. Swaminathan D., Matar G. Molecular typing methods. // In: Diagnostic molecular microbial. Principles and application. Persing D.H., Smith T.F., Tenover F.C., White T.J. (eds). Washington, ASM. - 1993. -P. 26-50.

342. Swierczynski A., Ton-That H., Type III pilus of corynebacteria: pilus length is determined by the level of its major pilin subunit. // J. Bacteriology. -2006.-Vol. 188. -№ 17.-P. 6318-6325.

343. Tamura M., Nogimori L., Murai S., et all. Subunit structure of islet-activating protein, pertussis toxin, in conformity with A-B model. // J. Biochemistry. 1982. - № 21. - P. 5516 - 5522.

344. Tang Y.W., Hopkins M.K., Kolbert C.P. Bordetella holmesii-hke organisms associated with septicemia, endocarditis and respiratory failure. // J. Clin. Infect. Dis. 1998. - № 26. - P. 389 - 392.

345. Tao X., Murphy J.R. Determination of the minimal essential nucleotide sequence for diphtheria tox repressor binding by in vitro affinity selection. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - № 20. - P. 9646 - 9650.

346. Templeton K., Scheltinga S., van der Zee A., Diederen B.M.W., Kruijssen A., Goossens H., Kuijper E., Claas E. Evalution of real-time PCR for detection of and discrimination between Bordetella pertussis,

347. B. parapertussis and B.holmesii for clinical diagnosis. // J. Clin. Microbiol. -Vol. 41.-№ 9.-P. 4121 -4126.

348. Tiru M., Askelof P., Granstrom M., Hallander H. Bordetellapertussis serotype of clinical isolates in Sweden during 1970 1995 and influence of vaccine efficacy studies. // Dev. Biol. Stand. - 1997. - Vol. 89. - P. 239 -245.

349. Todar K. Diphtheria. University of Wisconsin-Madison. 2002. -(http//www.textbookofbacteriology.net).

350. Ton-That H., Schneewind O. Assambly of pili on the surface of Corynebacterim diphtheriae. II J. Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 50. - № 4. -P. 1429-1438.

351. Ton-That H., Marrafini L., Schneewind O. Sortases and pilin elements involved in pilus assembly of Corynebacterim diphtheriae. // J. Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 53. - № 1. - P. 251 - 261.

352. Troy D., Graham A.L., Read A. Evolution of parasite virulence when host responses cause disease. // Proc. R. Soc. 2007. - № 274. - P. 2685 -2692.

353. Tsang R.S.W., Lau A.K.H., Sill M.L., Halperin S.A., van Caeseele P., Jamieson F., Martin I.E. Polymorphisms of the Fimbria fim3 Gene of Bordetella pertussis Strains Isolated in Canada. // J. Clin. Microbiol. 2004. -Vol. 42.-P. 5364-5367.

354. Tuomanen E., Weiss A. Characterization of two adhesins of Bordetella pertussis for human ciliated respiratory-epithelial cells. // J. Infect. Dis.- 1985.-Vol. 152.-№ l.-P. 118-125.

355. Tyler K.D., Wang G., Tyler S.D., Jonson W.M. Factors affecting reliability and reproducibility of amplification-based DNA fingerprinting of representative bacterial pathogens. // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. -№2.-P. 339-346.

356. Versalovic J., Lipski J.R. Molecular detection and genotyping of pathogens: more accurate and rapid answers. // Trends Microbiol. 2002. -Vol. 10. - Suppl. 10.-P. 15-21.

357. Welkos S., Holmes R.K. regulation of toxinogenesis in Corynebacterim diphtheriae. I. Mutations in bacteriophage (3 that alter the effect of iron on toxin production. // J. Virology. 1981. - Vol. 37. - № 3. -P. 936-945.

358. Welsh J., McClelland M.F. Fingerprintig genomes using PCR with arbitrary primers. // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - № 24. - P. 7213 -7218.

359. Weiss M.S., Dlanke S.R., Collier R.J., Eisenberg D. Structure of the isolated catalytic domain of diphtheria toxin. // J. Biochemistry. 1995. -Vol. 34. -№ 3. - P. 773-781.

360. Weyant R.S., Hollis D.G., Weaver R.E. Bordetella holmesii sp. nov., a new gram-negative species associated with septicemia. // J. Clin. Microbiol. 1995.-№33.-P. 1-7.

361. Willems R., Paul A., van der Heide H.G., ter Avest A.R., Mooi F.R. Fimbrial phase variation in Bordetella pertussis: a novel mechanism for transcriptional regulation. // EMBO. J. 1990. - Vol. 9. - P. 2803 - 2809.

362. Williams J.G.K., Hubelic A.R., Li Var K.J., Rafalski J.A., Tunsey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. // Nucl. Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P. 6531 - 6535.

363. Williamson P., Matthews R. Epitope mapping the Fim2 and Fim3 proteins of Bordetella pertussis with sera from patients infected with or vaccinated against whooping cough. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -1996.-№ 13.-P. 169- 178.

364. Wilson K.E., Cassiday P.K., Popovic T., Sanden G.N. Bordetella pertussis isolates with a heterogeneous phenotype for erythromycin resistance. // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - P. 2942 - 2944.

365. Yanagawa R., Honda E. Presence of pili in spesies of human and animal parasites and pathogens of the genes Corynebacterium. II J. Infect. Immunity. 1976. - Vol. 13. - № 4. - P. 1293 - 1295.

366. Zaidi N., Konstantinou L., Zervos M.D. The role of molecular biology and nucleic acid technology in the study of human infection and epidemiology. II Arch, of Path, and Lab. Medicine. 2003. - Vol. 127. - № 9.-P. 1098- 1105.

367. Zasada A.A., Zaleska M., Podlasin R.B., Seferyska I. The first case of septicemia due to nontoxigenic Corynebacterim diphtheriae in Poland: case report. // Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2005. - Vol. 4. - P. 8.

368. Zoysa A., Efstratiou A., Georg R.C., Vuopio-Varkila J., Jakhola M., Rikushin Y. Diphtheria and travel (letter). II Lancet. 1993. - Vol. 342 (8868).-P. 446.

Информация о работе

Борисова, Ольга Юрьевна
доктора медицинских наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики при этих инфекциях. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы