Инсерционная инактивация оперона вирулентности бактерий Bordetella pertussis в диагностике типичных и атипичных форм коклюша

Медкова, Алиса Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Инсерционная инактивация оперона вирулентности бактерий Bordetella pertussis в диагностике типичных и атипичных форм коклюша
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Инсерционная инактивация оперона вирулентности бактерий Bordetella pertussis в диагностике типичных и атипичных форм коклюша"

На правах рукописи

Медкова Алиса Юрьевна

Инсерционная инактивация оперона вирулентности бактерий Bordetella pertussis в диагностике типичных и атипичных форм коклюша

03.02.03 — микробиология 14.01.09 — инфекционные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

/ ФЕВ 2013 005049495

Москва 2013

005049495

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Доктор биологических наук

Доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярных основ патогенности ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ

Доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой инфекционных болезней у детей №2 педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ

Каратаев Геннадий Иванович Боковой Александр Григорьевич

Белый Юрий Федорович

Шамшева Ольга Васильевна

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «22» февраля 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения РФ по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения РФ

Автореферат разослан «21» января 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Коклюш - инфекционное респираторное заболевание человека, вызываемое грамотрицательными бактериями Bordetella pertussis, характеризующееся тяжелым течением и высокой летальностью у новорожденных и детей первого года жизни. Летальность при коклюше обусловлена развитием осложнений: апноэ, нарушения мозгового кровообращения, кровотечения из задне-глоточного пространства и бронхов, внутричерепные кровоизлияния, надрывы диафрагмы, коклюшная пневмония, эмфизема легких и др. Массовая противококлюшная вакцинация, проводимая в нашей стране с помощью АКДС-вакцины, начиная с 1950-х гг. прошлого столетия, значительно снизила летальность и заболеваемость коклюшем в типичной форме (Захарова М.С., 1969, Сигаева Л.А, 1986, Озерецков-ский H.A., 2004). Несмотря на клиническую и лабораторную гиподиагности-ку коклюша, по данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется до 50 миллионов случаев заболевания, умирает около 300 тысяч детей, преимущественно в возрасте до 1 года (WHO, 2003). В последние десятилетия во всем мире наблюдается рост заболеваемости коклюшем среди подростков и взрослых (Cherry J.D. et al„ 2004, Отвагин С.А., 2005, Тимченко В.Н., 2009). Типичную клиническую картину коклюша наблюдают сегодня все реже, в основном, у не вакцинированных, наиболее восприимчивых к коклюшной инфекции младенцев до 5-6 месяцев и у детей старше 10 лет (Wood N. et al., 2008). Увеличивается число случаев атипичных форм коклюша: стертых, бессимптомных, абортивных, транзиторного бактерионосительства (Лобзин Ю.В., 2011). Эпидемиологические исследования подтвердили, что для восприимчивой группы детей источником инфекции являются подростки и взрослые, у которых коклюш, как правило, протекает в атипичных формах. Носителями возбудителя коклюша могут быть практически здоровые люди (Герасимова А.Г., 2004, Heininger U., 2004, Mattoo S., 2005).

Диагностика атипичных форм коклюша затруднена из-за отсутствия характерной клинической картины и адекватных лабораторных методов. Бактериологический метод на ранних стадиях коклюша выявляет возбудитель не более чем в 10% случаев даже при типичных формах заболевания (Борисова О.Ю., 2010), серологические методы (РНГА, РГТГА, ИФА) подтверждают заболевание только на поздних стадиях, а нарастания титров специфических антител у бактерионосителей, как правило, не наблюдается (Ценева Г .Я., 2003). Раннее лабораторное подтверждение диагноза «Коклюш» особенно актуально в клинической практике для диагностики атипичных форм, определения тактики лечения и проведения противоэпидемических мероприятий в семейных очагах и организованных детских коллективах (Сипачева Н.Б., 2011).

Бактерии Bordetella pertussis - микроорганизмы, обладающие значительной изменчивостью, проявляющейся в появлении бактерий разной степени вирулентности. Это зависит от условий культивирования, длительности заболевания, лечения, ранее проведенной вакцинации (Friedrich M.J., 2011). Впервые на изменчивость B.pertussis in vivo было указано еще Трушиной-Тумановой Е.Ф. в 1949 г., выделившей непосредственно от 39 больных с различной клинической картиной коклюша 40 атипичных культур B.pertussis. Экспрессия генов вирулентности бактерий B.pertussis контролируется оперо-ном вирулентности bvgAS. B.pertussis в I фазе (Bvg+) экспрессируют все факторы вирулентности. В результате мутаций, нарушающих структуру оперона bvgAS, происходит переход из I вирулентной фазы в IV авирулентную (Bvg-) фазу и изменение экспрессии факторов вирулентности (фазовые модуляции). Частичная потеря вирулентности наблюдается у B.pertussis во II и III фазах вирулентности, объединенных в понятие промежуточной фазы (Bvg1) (Tracy L. Nicholson et al., 2012).

Исследования по изучению регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша, проводимые в ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ, показали, что перемещение инсерционных последовательностей (IS-элементов 481

и 1002) в оперон bvgAS является одним из механизмов, обеспечивающих переход бактерий B.pertussis из вирулентной I фазы в авирулентную IV фазу. Популяции бактерий B.pertussis in vitro были гетерогенны и содержали разное, зависящее от условий культивирования, количество вирулентных Bvg+ бактерий и авирулентных инсерционных Bvg- мутантов. Соотношение между числом вирулентных и авирулентных бактерий было названо фазовым составом популяции бактерий B.pertussis (Каратаев Г.И., 2008). Вероятно, in vivo с течением инфекционного процесса происходит накопление авирулентных инсерционных мутантов возбудителя коклюша и формирование бактерионосительства.

Разработка метода быстрой идентификации возбудителя коклюша и определения фазового состава популяции бактерий B.pertussis поможет улучшить диагностику атипичных форм коклюша. Установление корреляции между фазовым составом популяции бактерий B.pertussis и клинической картиной заболевания позволит определить тактику лечения и проведения противоэпидемических мероприятий.

Цель работы: регистрация инсерционных авирулентных Bvg— мутантов бактерий B.pertussis in vivo и выявление корреляции между клинической картиной заболевания у больных типичными и атипичными формами коклюша и фазовым составом популяции возбудителя.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Разработка тест-системы ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ)

для количественного определения ДНК бактерий B.pertussis в клинических образцах, содержащих инсерции IS481 и IS 1002 в опероне вирулентности bvgAS.

2. Выявление бактерий B.pertussis с помощью ПЦР-РВ в сравнении с бак-

териологическим методом в назофарингеальных мазках от больных типичными и атипичными формами коклюша и практически здоровых детей и взрослых, контактировавших и не контактировавших с больными.

3. Количественное определение авирулентных бактерий B.pertussis, со-

держащих инсерцнии IS481 и IS1002 в опероне bvgAS в ПЦР-РВ положительных клинических образцах.

4. Установление корреляции между клинической картиной заболевания у

больных типичными и атипичными формами коклюша и фазовым составом популяции бактерий B.pertussis.

5. Изучение сроков персистенции и фазового состава популяции бактерий

B.pertussis разработанным методом ПЦР-РВ при экспериментальном заражении мышей вирулентными бактериями B.pertussis.

Научная новизна. Впервые разработан неинвазивный количественный метод для выявления возбудителя коклюша и его инсерционных авирулентных (Bvg-) мутантов для изучения фазового состава популяции бактерий B.pertussis у больных типичными и атипичными формами заболевания.

Впервые показано, что популяции бактерий B.pertussis у больных различными формами коклюша гетерогенна, установлена корреляция между её фазовым составом и клинической картиной заболевания: абсолютное большинство бактерий B.pertussis у больных типичными формами коклюша содержит интактный оперон вирулентности (I фаза, Bvg+), тогда как у больных атипичными формами коклюша - в среднем 0,2% инсерционных авирулентных Bvg- мутантов, у бактерионосителей - от 10 до 90%.

Впервые показано, что ДНК возбудителя коклюша выявляется у 55,6% больных с диагнозом «ОРВИ» и смешанными респираторными инфекциями, у 31% больных — с симптомом «длительный кашель».

ДНК B.pertussis была выявлена у 75% «практически здоровых» детей и взрослых, контактировавших с больными.

Научно-практическая значимость работы. Разработанная тест-система ПЦР-РВ предназначена для дифференциальной диагностики респираторных инфекций, трудно поддающихся этиотропной терапии, в комплексе с общепринятыми методами диагностики коклюша (бактериологическому и серологическому).

С помощью созданной тест-системы ПЦР-РВ будет возможно проведение развернутых эпидемиологических обследований для изучения сроков персистенции бактерий и проведения адекватных санитарных мероприятий (карантина и т.д.).

Использование тест-системы ПЦР-РВ необходимо для оценки эффективности коклюшных вакцин, совершенствования и разработки новых профилактических препаратов, а также в фундаментальных научно-исследовательских работах, направленных на дальнейшее изучение механизмов образования персистирующих форм бактерий.

По результатам работы подготовлены Методические рекомендации «Способ выявления авирулентных бактерий Bordetella pertussis, сформированных в результате инсерций IS-элементов 481 и 1002 в оперон вирулентности bvgAS, у больных атипичными формами коклюша», утвержденные Советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России 22 ноября 2012 г., протокол № 22.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана тест-система ПЦР-РВ, позволяющая в клинических образцах выявлять бактерии возбудителя коклюша и изучать фазовый состав популяции бактерий Bordetella pertussis у больных типичными и атипичными формами коклюша.

2. С помощью разработанной тест-системы ПЦР-РВ показана широкая распространенность возбудителя коклюша среди больных с инфекционной респираторной патологией, а также возможность носитель-ства бактерий B.pertussis практически здоровыми людьми.

3. Установлена корреляция между клинической картиной коклюша у больных типичными и атипичными формами и фазовым составом популяции бактерий B.pertussis.

4. Разработанный способ выявления авирулентных инсерционных мутантов B.pertussis позволяет изучать механизмы изменения популя-

ции возбудителя коклюша в процессе развития инфекционного процесса.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоно-сов-2008», 3-е место (Москва), на научно-практической конференции Научного Центра Здоровья Детей РАМН «Актуальные проблемы педиатрии» в рамках конкурса молодых ученых (Москва, 2009), на Международной школе по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010), на XIV Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», в рамках конкурса молодых ученых, 1-е место (Санкт-Петербург, 2011), на международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, 2012). Защищена дипломная работа на факультете фундаментальной медицины Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова «Диагностическое значение фазовых состояний возбудителя коклюша (Bordetella pertussis), выявляемого в клинических образцах детей и взрослых с диагнозом «ОРЗ» (Москва, 2009).

Апробация работы состоялась 8 июня 2012 г. на совместной научной конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий и отдела медицинской микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе две статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и одна статья - в зарубежном издательстве. По результатам работы подана заявка на получение патента (2011 г).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список использованной литературы, содержащий

ссылки на 34 отечественных и 151 иностранный источник. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 8 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ходе работы обследовано 157 детей и взрослых, госпитализированных в детское инфекционное отделение ФГБУ ЦКБ с поликлиникой УДП РФ, в инфекционную клиническую больницу №1 г. Москвы, а также направленных на консультацию для уточнения диагноза в ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России: 15 больных с диагнозом «Коклюш, типичная форма», 18 больных с диагнозом «ОРВИ», смешанными вирусно-бактериальными респираторными инфекциями, 26 пациентов с симптомом «длительный кашель», а также 98 практически здоровых детей и взрослых, контактировавших и не контактировавших с больными (таблица. 3). Для лабораторного подтверждения клинического диагноза в стационаре применялись бактериологический, серологический и молекулярно-биологический методы. Диагнозы верифицировали на основании клинико-эпидемиологических и лабораторных данных в соответствии с общепринятой классификацией (МКБ-10).

Для бактериологического посева и ПРЦ-РВ исследования назофаринге-альные мазки брали от больных на 3-4-й день госпитализации, до начала специфического антибактериального лечения в соответствии с «Требованиями к взятию и транспортировке материала для лабораторной диагностики коклюша» Комитета Здравоохранения г. Москвы от 25 ноября 2002 года № 539/№ 230 с помощью ватного тампона типа Оасгоп. Одновременно обследовали матерей по уходу за ребенком и ближайших родственников, контактировавших с больными.

Микробиологическую идентификацию возбудителя коклюша проводили в соответствии с «Инструкцией по отбору, проверке и хранению штаммов В.рег/гти для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин» (1987).

Штаммы бактерий, использованные в работе. В работе использованы бактерии из коллекции музея ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Бактерии Bordetella ssp. культивировали на плотной питательной среде КУА с добавлением 15% дефибринированной крови барана в течение 3-5 суток, Е. со!i - на L-arape, другие бактерии - на соответствующих специфических питательных средах.

Лабораторные животные. Беспородные белые мыши обоего пола, 3-4-х недельного возраста, весом 10-12 г.

Мышей экспериментально заражали живыми вирулентными бактериями B.pertussis 134 I фазы (Bvg+) внутривенно и интраназально по 80 мышей в каждой группе. В хвостовую вену мыши вводили 30 мкл суспензии, содержащей 3x109 MOE/мл бактерий B.pertussis. При интраназальном заражении в каждую ноздрю вводили 25 мкл суспензии, содержащей 3x107 MOE/мл бактерий B.pertussis. Мышей усыпляли Нембуталом (Синяшин Н.И., 1986). Контрольным мышам (по 24 мыши в каждой группе) вводили стерильный 0,85% раствор хлорида натрия, 25 и 30 мкл интраназально и внутривенно соответственно.

Микробиологическое исследование и выделение ДНК от экспериментально зараженных мышей. У 10 мышей из каждой группы извлекали легкие через 2 и 24 часа, 7-й, 14-й, 28-й, 42-й, 49-й и 63-й дни после заражения. Легкие гомогенизировали в 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия (pH 7,2-7,4), инкубировали 15 мин при температуре 35°С и центрифугировали при 3000 об/мин 7 мин. Надосадочную жидкость разводили в 100, 10 000 и 1000 000 раз, затем по 0,1 мл из каждого разведения высевали на три чашки Петри с селективной средой КУА, по 500 мкл супернатанта без разведения использовали для выделения ДНК. В каждой точке наблюдения подсчитывали число выросших колоний на всех чашках Петри. Среднее количество КОЕ в легких каждой мыши (М, КОЕ/мл) рассчитывали по формуле:

Е КОЕ на 3 — х чашках Петри X 10 (коэффициент разбавления)

М =-з-

Ъ объем разведении, мл

Для выделения ДНК В.pertussis из клинических образцов и супернатан-тов гомогенатов легких мышей в соответствии с инструкцией к набору Wizard Genomic DNA Purification System (Promega, США) использовали магнитный сорбент.

ПЦР-РВ проводили на приборе АНК-32™ (Россия) с использованием праймеров и зондов, синтезированных ЗАО «Синтол» и «Евроген». Nested-ПЦР - на приборе «Терцик» (Россия).

Секвенирование фрагментов ДНК проводили на приборе 373A Automatic Sequencer (Applied Biosystems, USA) с рекомендуемым набором реактивов.

Статистическая обработка результатов выполнена с помощью программы Microsoft Excel 2007 и статистических методов, принятых в биологии и медицине (Гланц С., 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Разработка тест-системы ПЦР-РВ для выявления ДНК возбудителя коклюша и анализа фазового состава популяции бактерий Bordetella pertussis

На первом этапе работы была создана тест-система ПЦР-РВ, позволяющая выявлять ДНК возбудителя коклюша, регистрировать наличие инсер-ционных последовательностей IS481 и IS 1002 в cctagg сайте оперона вирулентности bvgAS B.pertussis и изучать фазовый состав популяции возбудителя. Для анализа фазового состава популяции бактерий B.pertussis рассчитывали значения Лщ и пюог - отношение числа инсерций IS481 и IS 1002 (N48i и N1002) в оперон bvgAS к общему количеству ДНК B.pertussis в 5 мкл анализируемого образца (Qbp).

Выбор праймеров и зондов. В основу выбора праймеров и зондов для определения количества геном-эквивалентов (ГЭ) ДНК B.pertussis и количества геномов B.pertussis, содержащих интеграции IS481 и IS 1002 в cctagg сайте оперона bvgAS, положена схема, представленная на рисунке 1.

Тест-система ПЦР-РВ включает две независимые реакции, протекающие в одной пробирке. Первая реакция позволяет определить количество 1Б481 (N451) в исследуемом образце ДНК, а вторая -181002 (N1002)- В первой и второй реакциях использовали праймеры Вр481-42-Вр111, Вр 1002-33-Вр111 и зонды 1160-481, КОХ-1002 соответственно (таблица 1).

Таблица 1. Последовательности праймеров и зондов, использованные для детекции IS481 и IS1002 и их интеграций в cctagg сайт оперона bvgAS B.pertussis и для конструирования плазмид pIS481 и pIS1002

Праймер/ зонд Последовательность нуклеотидов Примечание

Вр481-42 GAACCGGATTTGAGAAACTGGAAA 1S481

Bplll TTCAGGCACACAAACTTGATGGGCG IS481, IS100

Вр1002-33 AGGCCGGACCTGGGATG IS 1002

SF GTCGCTGGTGGAACTGATAG bvgAS

Ar ACGAGGTGCGAGGTGGTCAG bvgAS

Вр2 TTCAGGCACACAAACTTGATGGGCG IS481

Rox-1002 (ROX)ACCFCGCCATCGCAACTCAGGGCA(RTQ2) зонд IS1002

R6G-481 (R6G)TCGCCGACCCCCCAGTTCACTCAAG(BHQ2) зондIS481

* - положение праймеров и зондов изображено на рисунке 1

Условия амплификации приведены в таблице 2. Объем реакционной смеси 25 мкл (ЗАО «Синтол», Россия) содержал 2,5 ед. Hot-Rescue Taq-полимеразы, 2,5 мкл 10-кратного KCl-ПЦР-буфера, по 250 мкМ dNTP, праймеры по 10 pmol и зонды по 5 pmol на одну реакцию, 5 мкл исследуемого образца ДНК B.pertussis.

Таблица 2. Температурно-временной профиль ПЦР-РВ

Температура Время, секунды Количество циклов

95°C 300 1

65°C 50 50

95°C 20 50

Конструирование плазмид pIS481 и pIS1002 для определения количественных характеристик популяции бактерий B.pertussis в реакции ПЦР-РВ. Для построения калибровочных кривых для определения количества ГЭ ДНК

В.pertussis и инсерций IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS были сконструированы плазмиды pIS1002 и pIS481, включающие фрагменты последовательностей хромосомы B.pertussis, сформированные в результате искомых инсерций.

Вр481-42 Bplll

bvgA S F bvgS

Рис. 1. Структура фрагмента хромосомы B.pertussis, содержащего инсер-цию IS481 или IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS

Для конструирования плазмиды pIS 1002 использован фрагмент амплификации хромосомы B.pertussis 54.1, Bvg- мутант, содержащий инсерцию IS1002 в cctagg сайте оперона bvgAS (Sinyashina L.N. et al., 2008), с прайме-рами Sp—Ar, для конструирования плазмиды pIS481 - продукт амплификации ДНК B.pertussis Tohama I фазы с праймерами SF-Bp2 (таблица 1). Клонирование проводили с использованием системы pGemT (Promega, США) согласно руководству к её применению. Структуру рекомбинантных плазмид определяли с помощью ПЦР, рестрикции и секвенирования клонированного фрагмента.

По результатам ПЦР-РВ серии разведений pIS481 и pIS 1002 с праймерами Вр481-42-Вр111, Bp 1002-3 3-Bpl 11 и зондами R6G-481, ROX-1002 были построены калибровочные кривые, позволяющие выявлять количество копий IS481 и IS 1002 в исследуемом образце (Q48i И Qi002)- С помощью по-

строения аналогичных калибровочных кривых ПЦР-РВ с праймерами SF-Bplll и зондами R6G-481h ROX-1002 определяли количество ДНК В.pertussis, содержащей инсерции IS 1002 и IS481 в опероне bvgAS (N481 и N1002)-

Количество молекул ДНК В.pertussis, содержащих инсерции IS 1002 и IS481 в cctagg сайте оперона bvgAS, было определено как соотношение Щек Ю02 = N451, kkk/Qbp, где количество ГЭ В.pertussis - QBp рассчитано как среднее значение величин QBp48i = Q481/ 238 и QBpioo2= Q1002/ 6. Числа 238 и 6 соответствуют количеству копий IS481 и IS 1002 в секвенированной хромосоме B.pertussis Tohama I фазы (Julian Parkhill et al., 2003).

Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы ПЦР-РВ. С помощью ПЦР-РВ серии разведений ДНК B.pertussis 54.1, Tohama I и pIS481 и pIS1002 было установлено, что чувствительность тест-системы составляет одну копию ГЭ ДНК B.pertussis и порядка 10-20 копий последовательностей IS481 и IS 1002 в cctagg сайте оперона. Высокая чувствительность при определении количества ГЭ ДНК B.pertussis объясняется копийностью повторяющихся последовательностей IS481h IS 1002 (238 и 6, соответственно), используемой в качестве мишени при постановке ПЦР.

Проверку специфичности выбранных праймеров и зондов проводили в поисковой системе BLAST, а также в ПЦР-РВ на образцах ДНК различных микроорганизмов, в том числе вызывающих респираторные инфекции:

B.parapertussis, B.bronchiseptica, Staph.aureus, Staph.epidermidis, Neisseria meningitidis, M.tuberculosis, E.coli K12, L.pneumophilia, K.pneumoniae,

C.diphteriae, S.typhimurium, Sh.sonnei, Sh.flexneri, Y.pseudotuberculosis, Chi.pneumoniae, Myc.pneumoniae, Str.pneumoniae. Результаты анализа ДНК всех перечисленных микроорганизмов с помощью разработанной нами тест-системы ПЦР-РВ не выявили достоверных сигналов амплификации.

Таким образом, нами разработана специфичная и высокочувствительная тест-система ПЦР-РВ, позволяющая выявлять в клинических образцах

единичные копии ДНК В.pertussis и 10 ГЭ ДНК B.pertussis, содержащих ин-серции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS.

2. Выявление возбудителя коклюша у больных типичными и атипичными формами заболевания и анализ фазового состава популяции бактерий B.pertussis

Для проведения исследования были собраны назофарингеальные мазки от больных с диагнозом: «Коклюш, типичная форма» — 15 образцов, с диагнозом «ОРВИ» и со смешанными вирусно-бактериальными респираторными инфекциями - 18, с симптомом «длительный кашель» - 26, «практически здоровых» детей и взрослых, контактировавших с больными, — 16 и от «практически здоровых» взрослых и детей, не контактировавших с больными, — 82. Образцы были исследованы с помощью бактериологического метода и ПЦР-РВ. Результаты анализа представлены на рисунке 2 и в таблице 3.

Таблица 3. Сравнительные результаты бактериологического метода и ПЦР-

РВ по выявлению возбудителя коклюша в клинических образцах

Клинический диагноз Количество образцов Идентификация B.pertussis, бак. метод Идентификация ДНК B.pertussis, ПЦР-РВ

Коклюш 15 6 (40%) 14(93,3%)

ОРВИ, смешанные респираторные инфекции 18 2(11,1%) 10 (55,6%)

Длительный кашель 26 2 (7,7%) 8(31%)

Практически здоровые взрослые и дети, контактировавшие с больными 16 не обнаружено 12 (75%)

Практически здоровые дети и взрослые, не контактировавшие с больными 82 не обнаружено 6 (7,3%)

Общее количество образцов 157 10 50

Из представленных данных видно, что у больных типичными формами коклюша ДНК возбудителя методом ПЦР-РВ выявлена в 93,3% случаев, бак-

териологическим методом — в 40%. ДНК В.pertussis выявлена у 55,6% больных с диагнозом «ОРВИ» и смешанными вирусно-бактериальными респираторными инфекциями, в то же время бактериологическим методом возбудитель коклюша был обнаружен в 11%. У больных с симптомом «длительный кашель» в 31% случаев - методом ПЦР-РВ, в 7,7% - бактериологическим методом. У практически здоровых детей и взрослых, контактировавших с больными, методом ПЦР-РВ возбудитель коклюша был обнаружен в 75% случаев, в группе не контактировавших с больными - 7,3%. Бактериологическим методом B.pertussis в этой группе не выявлена.

Сравнение результатов бактериологического посева и ПЦР-РВ показало высокую эффективность метода ПЦР-РВ и разработанной нами тест-системы.

■ Коклюш, типичные формы

■ ОРВИ, смешанные респира горные инфекции

Длительный кашель

■ Практически здоровые, контактировавшие с больными

■ Практически здоровые, не кон так тировавшие с больными

Рис. 2. Выявление возбудителя коклюша бактериологическим методом и ПЦР-РВ

По результатам количественного ПЦР-РВ анализа ДНК возбудителя коклюша пациенты были разделены на три группы для изучения фазового состава популяций бактерий B.pertussis.

В первую группу включили 14 пациентов с максимальным количеством ДНК B.pertussis - 106-107 ГЭ в 5 мкл образца. Относительное количество интеграции IS481 и IS1002 составляло в среднем 10°. Следовательно, абсолют-

80,00%

60,00%

30,00%

10,00%

Бактериологический ПЦР-РВ

метод

ное большинство бактерий в популяции находились в I фазе, вирулентном состоянии Независимо от возраста и сопутствующих инфекций у

больных этой группы наблюдали типичную клиническую картину коклюша (таблица 4).

Во вторую группу отнесли 18 пациентов, в клинических образцах которых зарегистрировано 103 -104 ГЭ ДНК Частота интеграции 15481 и 181002 у этих пациентов составила в среднем 10"3 (таблица 4). В этой группе оказались пациенты с диагнозом «ОРВИ», смешанными вирусно-бактериальными респираторными инфекциями, с симптомом «длительный кашель».

Третья группа - 20 пациентов с количеством ДНК в образ-

цах от нескольких десятков до нескольких сотен ГЭ — практически здоровые дети и взрослые, контактировавшие и не контактировавшие с больными. Частота регистрации инсерционных авируленных Bvg- мутантов в этой группе достигала 90% (таблица 4).

Таблица 4. Анализ фазового состава популяций бактерий Дрег/гти

Клинический диагноз, число обследованных больных Количество ДНК В.рег/иххм Относительное количество интеграции (п)

П481 "1002

Коклюш, типичные формы, п=14 (5,6±1,6)*10ь (4,8±4,4)*10"5 (7,1 ±6,2)* КГ"

ОРВИ, смешанные респираторные инфекции, длительный кашель, п=18 (9,7±2,7)*103 (1,6±1,5)*10° (1,4±1,3)*10'4

Практически здоровые, контактировавшие и не контактировавшие с больными, п=20 (1,3±0,9)*102 0,5±0,4 0,4±0,4

Для подтверждения того, что регистрируемые нами продукты ПЦР действительно представляют собой структуры, сформированные в результате интеграции ^-элементов в cctagg сайт оперона bvgAS, проведено секвениро-

вание продуктов амплификации 3-х образцов ДНК, в которых в 5 мкл было выявлено 10-30 инсерций ^-элементов.

Продукты амплификации для секвенирования получены в результате постановки пез1ес1-ПЦР: первая ПЦР с праймерами 8Р-Вр2, вторая - с прай-мерами Бр-ВрШ (рис. 1). Определённая последовательность полностью совпадала с ожидаемой, сформированной в результате интеграции 18481 в сМа^ сайт оперона bvgAS. Не было обнаружено каких-либо изменений ни в последовательности 18-элемента, ни в прилегающей последовательности оперона bvgAS.

Таким образом, с помощью разработанной тест-системы ПЦР-РВ впервые получены лабораторно подтвержденные данные о значительной распространенности атипичных форм коклюша у больных ОРВИ и смешанными респираторными инфекциями, носительстве возбудителя коклюша практически здоровыми людьми.

Анализ фазового состава показал гетерогенность популяций бактерий В.реПизз/з у обследованных пациентов. У больных типичными формами коклюша бактерии В.регШхяЬ находились в I фазе и содержали интактный опе-рон вирулентности (Ву§+). Популяции бактерий В.рег1ш$1$ у больных атипичными формами коклюша содержали в среднем 0,2% инсерционных ави-рулентных Ву§- мутантов, у практически здоровых бактерионосителей их количество составляло от 10 до 90%.

Организационные сложности, возникающие при длительном наблюдении и повторном обследовании больных, не позволяют изучать фазовый состав популяции возбудителя коклюша, накопление авирулентных инсерционных Ву§- мутантов В.регШБз'м с течением инфекционного процесса и формирование бактерионосительства. В связи с этим нами было предпринято изучение сроков персистенции и фазового состава популяции бактерий Д.регГмллй с помощью разработанной тест-системы ПЦР-РВ при экспериментальном заражении мышей.

3. Изучение сроков персистенции и фазового состава популяции бактерий В.pertussis при экспериментальном заражении мышей

Лабораторные мыши являются общепринятой моделью для изучения степени вирулентности бактерий B.pertussis, токсичности и безвредности коклюшных вакцин для переноса результатов экспериментов in vivo непосредственно на людей.

Для изучения сроков персистенции возбудителя коклюша и накопления инсерционных авирулентных мутантов B.pertussis в процессе развития инфекционного процесса экспериментально инфицировали вирулентными бактериями B.pertussis 134 беспородных белых мышей.

Для идентификации возбудителя коклюша и анализа фазового состава бактерий B.pertussis в гомогенатах легких мышей использовали те же методы, что и при изучении клинических образцов.

Определение сроков персистенции бактерий B.pertussis при экспериментальном заражении мышей.

Внутривенно и интраназально заражали по 80 мышей. В каждой группе было по 24 контрольные мыши, которым вводился стерильный 0,85% раствор хлорида натрия.

Идентификацию возбудителя коклюша в легких зараженных (10 мышей из каждой группы) и контрольных (3 мыши из каждой группы) животных проводили с помощью бактериологического метода путем посева супер-натантов гомогенатов легких на среду КУА через 2 и 24 часа, 7-й, 14-й, 28-й, 42-й, 49-й и 63-й дни после заражения.

Независимо от способа инфицирования при посеве на селективную среду КУА супернатантов гомогенатов легких мышей максимальное число КОЕ наблюдали до 14-ого дня после заражения. На 28-й день регистрировались единичные колонии (рис. 3).

5 4,5 4 3,5

I ^ s 2

1,5 1

0,5 0

2 24 7 14 28 42 49 63 часа часа день день день день день день

Сроки наблюдения, дни

Рис. 3. Обнаружение B.pertussis 134 бактериологическим методом в легких мышей после внутривенного и интраназального заражения

Результаты средних значений М — количества КОЕ в 1 мл гомогенатов легких 10 мышей в каждой группе, рассчитанных по формуле, рекомендованной ВОЗ для подсчета КОЕ B.pertussis в легких зараженных мышей, -представлены в таблице 5.

Таблица 5. Сравнительное выявление бактерий B.pertussis в легких мышей бактериологическим методом и ПЦР-РВ при экспериментальном заражении

■ внутривенное заражение I итраназальноезаражение

Срок Бактериологический посев, ПЦР-РВ, количество ГЭ ДНК

наблю- КОЕ/мл, п=10 B.pertussis, п=10

дения в/в* и/н** в/в и/н

2 часа роста нет (4±0,4)*103 н/о (3,7±1,3)*102

24 часа роста нет (2,6±0,4)*103 (1,1±0,25) *102 (8,5±1,2)*10/

7 день (2,8±0,5)*103 (3±0,9)*10J (З,7±5,7)*103 (1,5±0,8)*108

14 день (2,5±0,2)*104 (2,6±0,2)*104 (6,5±4,4)*105 (1,4±0,8)*106

28 день (8,2±1,02)*10'! (4,9±1,54)*10J (4,9±7,7)*104 (5,2±2,7)*10J

42 день роста нет роста нет (8,7±5,2)*103 (9,7±4,2)*10J

49 день роста нет роста нет (1,9±1,2)*10J (4,2±2,3)*10J

63 день роста нет роста нет (5,3±1,9)*1(У (3,4±2,1)*Ю2

* внутривенное заражение

* * интраназальное заражение

роста нет — не обнаружен рост B.pertussis как при посеве разведений супернатантов гомогенатов легких, так и без разведения н/о — не обнаружено

В легких контрольных мышей бактерии B.pertussis 134 не были обнаружены ни бактериологическим методом, ни ПЦР-РВ.

Результаты определения количества ГЭ ДНК бактерий B.pertussis в легких мышей на разных сроках после внутривенного и интраназального заражения B.pertussis 134 представлены на рисунке 4. Точки на графике соответствуют количеству геном-эквивалентов в 5 мкл образца ДНК B.pertussis, определенному как среднее значение этого показателя у десяти мышей (таблица 5).

9 8 7

00 5

тг

1ь 4

2 1 О

Сроки наблюдения, дни

Рис. 4 .Динамика изменения содержания ГЭ ДНК B.pertussis в легких мышей после экспериментального заражения

Максимальное количество ДНК B.pertussis, независимо от способа заражения, было зарегистрировано в лёгких мышей на 7 и 14 дни, а затем снижалось с течением инфекционного процесса, что соответствовало срокам развития заболевания у людей в типичной форме (рис. 4). ДНК B.pertussis выявляли с помощью разработанной тест-системы ПЦР-РВ в легких мышей до 63 дня после заражения (срок наблюдения). Таким образом, с помощью разработанной тест-системы ПЦР-РВ бактерии B.pertussis выявляли в легких мышей до 63-го дня наблюдения, и, возможно, эти сроки переживания возбудителя коклюша у животных соответствуют времени персистенции бактерий

-внутривенное заражение

-интраназальное заражение

2 24 7 14 28 42 48 63 часа часа день день день день день день

в организме человека, более длительного, чем установлено карантином — 21 день.

Изучение фазового состава популяции бактерий B.pertussis в легких мышей при экспериментальном инфекционном процессе

В каждой точке наблюдения определяли фазовый состав популяции бактерий B.pertussis. Для этого в ДНК B.pertussis, выделенной из легких инфицированных мышей, с помощью разработанной нами тест-системы ПЦР-РВ определяли количество интеграций IS481 и IS1002 в опероне bvgAS. Результаты эксперимента представлены на рис 5. По оси ординат отложены значения десятичного логарифма n (lg п), где n=N481/QBp

Сроки наблюдения

Внутривенное заражение И нтраназальное заражение

Рис. 5. Динамика накопления авирулентных (Bvg-) инсерционных мутантов B.pertussis 134 в легких мышей при экспериментальном инфекционном процессе

Через 2 и 24 часа после интраназального и внутривенного заражения вирулентным штаммом B.pertussis только 10"3-10"6 бактерий содержали интеграции IS481 или IS1002 в опероне вирулентности bvgAS. При обоих способах заражения относительное число авирулентных мутантов B.pertussis в анализируемой популяции нарастает, начиная с 7-ого дня, и достигает к 63-му дню 50% от общего объёма бактериальной популяции (рис. 5). Достоверность определения параметров популяции не вызывала сомнения, поскольку

количество ГЭ ДНК B.pertussis в 5 мкл исследуемого образца у большинства животных в течение времени наблюдения не регистрировалось ниже, чем 102-103 молекул, при этом количество авирулентных мутантов B.pertussis было в среднем 102, что было значительно выше предельной чувствительности метода.

Нами показано, что бактерии возбудителя коклюша персистировали в легких мышей до 63-ого дня. Степень гетерогенности популяции бактерий B.pertussis возрастала за счет увеличения доли авирулентных инсерционных мутантов, количество которых к 49-63 дню после заражения достигало 50% от общего числа бактерий в популяции.

Таким образом, экспериментальный инфекционный процесс у мышей показал, что в результате персистенции возбудителя коклюша в макроорганизме происходит изменение фазового состава бактерий B.pertussis, накопление инсерционных авирулентных мутантов, формирование бактерионосительства, что согласуется с данными, полученными при изучении разработанным методом ПЦР-РВ клинических образцов от больных типичными и атипичными формами коклюша.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана тест-система ПЦР-РВ, позволяющая выявлять в клинических образцах бактерии возбудителя коклюша, содержащие интеграции IS481 и IS1002 в опероне вирулентности bvgAS, и изучать фазовый состав популяции бактерий Bordetella pertussis.

2. С помощью разработанной тест-системы ПЦР-РВ возбудитель коклюша выявлен у больных с клиническим диагнозом «ОРВИ» и смешанными респираторными инфекциями в 55,6% случаев, с симптомом «длительный кашель» — в 31% случаев.

3. В 75% случаев бактерионосительство B.pertussis выявлено у «практически здоровых» детей и взрослых, контактировавших с больными.

4. Клиническая картина коклюша коррелирует с фазовым составом популяции возбудителя: у больных типичными формами заболевания попу-

ляция бактерий B.pertussis практически не содержит авирулентных ин-серционных Bvg- мутантов, у больных атипичными формами количество авирулентных мутантов составляет в среднем 0,2%, у практически здоровых бактерионосителей достигает 90%.

5. Выявлено накопление авирулентных мутантов B.pertussis, содержащих интеграции IS481 и IS1002 в опероне вирулентности bvgAS, в процессе экспериментальной коклюшной инфекции у мышей.

6. Разработанная тест-система ПЦР-РВ позволяет проводить лабораторную диагностику типичных и атипичных форм коклюша, бактерионосительства и изучать изменения фазового состава популяции возбудителя коклюша.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. А.Ю. Медкова, Ю.С. Аляпкина, Л.Н. Синяшина, И.П. Амелина, Я.И. Алексеев, А.Г. Боковой, Г.И. Каратаев. Выявление инсер-ционных мутантов авирулентных bvg'-мутантов Bordetella pertussis у больных коклюшем, острой респираторной вирусной инфекцией и практически здоровых людей. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2010. - №4. — с. 9-13.

2. А.Ю. Медкова, Ю.С. Аляпкина, Л.Н. Синяшина, И.П. Амелина, Я.И. Алексеев, Г.И. Каратаев, А.Г. Боковой. Распространенность стертых форм коклюша и анализ фазовых состояний бактерий Bordetella pertussis. // Детские инфекции. - 2010. - №4. - с. 19-22.

3. Ludmila N. Sinyashina, Alisa Yu. Medkova, Evgeniy G. Semin, Alexander V. Chestkov, Yuriy D. Tsygankov, and Gennadiy I. Karataev. IS481-Induced Variability of Bordetella pertussis. // In "National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH: Frontiers in Research" Ed. Vassil St. Georgiev, Humana Press, Totowa, NJ.-2008.-p.227-231.

4. А.Ю. Медкова, Г.И. Каратаев. Разработка тест-системы ПЦР для диагностики стертых и атипичных форм коклюша. // Материалы

международной конференции студентов и молодых ученых «Ломо-носов-2008». - Москва, 8-11 апреля 2008 г. - секция «Фундаментальная медицина», с. 16-17.

5. А.Ю. Медкова, Г.И. Каратаев, JI.H. Синяшина, А.Г. Боковой. Диагностическое значение фазовых состояний бактерий Bordetella рег-tussis.H Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы педиатрии». - Калуга, 10-11 ноября 2009 г.

6. А.Ю. Медкова, Г.И. Каратаев, Л.Н. Синяшина, А.Г. Боковой. Распространенность стертых форм коклюша и анализ фазовых состояний бактерий Bordetella pertussis.// Материалы IV Международной Школы молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки». - Звенигород, 29 ноября - 3 декабря 2010 г.

7. Д.Т. Кубрава, А.Ю. Медкова, З.В. Шевцова, А.З. Матуа, Л.Н. Синяшина, И.Г. Конджария, Г.И. Каратаев. Иммунный ответ у обезьян вида Масаса mulatta при интраназальном введении искусственно ат-тенуированных бактерий Bordetella pertussis, перспективных для совершенствования противококлюшных вакцин. // Материалы XIV Всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». - Санкт-Петербург, 23-26 мая 2011 г.

8. А.Ю. Медкова, Л.Н. Синяшина, А.Г. Боковой, Г.И. Каратаев. Перси-стенция бактерий Bordetella pertussis и изменение структуры популяции возбудителя коклюша, регистрируемые методом полимераз-ной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). // Материалы международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы». -Минск, 8-11 октября 2012 г.

Заявка на патент: Г.И. Каратаев, Л.Н. Синяшина, А.Ю. Медкова «Способ диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя и диагностический набор» №2011120790 от 24.05.2011г.

Список сокращений

АКДС - адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина

гэ - геном-эквивалент

ИФА - иммуноферментный анализ

КОЕ - колониеобразующая единица

МКБ-10 - Международная классификация болезней десятого пересмотра

МОЕ - международные оптические единицы

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

РИГА - реакция непрямой гемагглютинации

РПГА - реакция прямой гемагглютинации

Bvg - bordetella virulence gene

dNTP - дезокситрифосфаты

IS - inserted sequence

БЛАГОДАРНОСТИ

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность научным руководителям Г.И. Каратаеву и А.Г. Боковому за постоянное внимание, всестороннюю помощь, полученные знания и навыки.

За предоставленную возможность работать на приборе АНК-32 благодарю руководителя лаборатории хламидиозов ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России д.б.н. Зигангирову H.A. Искренне признательна Ю.С. Аляпкиной и руководству ЗАО «Синтол» за оказанное содействие и большую помощь в разработке тест-системы ПЦР-РВ на начальных этапах работы. За многочисленные советы, помощь в проверке и отработке тест-системы, в организации проведения ПЦР-РВ, за прочтение рукописи диссертации, сделанные ценные замечания благодарю Ю.П. Пашко. Глубокую признательность выражаю заведующей отделением подопытных животных ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Ветковой Л.Г. за решение организационных вопросов и неоценимую помощь при работе с животными. За предоставленные препараты ДНК, выделенной из назофарингеальных смывов от детей с клиническим диагнозом «Коклюш», благодарю д.б.н. Борисову О.Ю.

За всестороннюю помощь в работе, прочтение рукописи диссертации, ценные критические замечания и советы, поддержку выражаю глубокую благодарность Синяшиной Л.Н. За полученные знания, навыки, умения, поддержку благодарю Амелину И.П., Семина Е.Г., Алешкина Г.И., Смирнова Г.Б., Маркова А.П., Большакову Т.Н. Отдельную благодарность выражаю Корольковой Г.М. и Сильченко М.П.

Глубокую благодарность выражаю администрации ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России за предоставленную возможность заниматься научной работой и оказанное содействие в организации и проведении научных исследований.

Искреннюю благодарность и признательность выражаю ученому секретарю диссертационного совета ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России д.м.н., проф. Русаковой Е.В., а также Асратян A.A., Гащенко Т.А. и Кожевниковой Л.К. за помошь при подготовке диссертации к защите.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Медкова, Алиса Юрьевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Биологические свойства бактерий Bordetella pertussis.

1.1. Морфология и культуральные свойства бактерий Bordetella pertussis

1.2. Факторы патогенности бактерий Bordetella pertussis.

2. Молекулярные основы вариабельности бактерий B.pertussis и изменения фазового состава популяции возбудителя коклюша.

3. Современное течение коклюша на фоне массовой вакцинопрофилактики

3.1. Типичные и атипичные формы коклюша.

3.1.1. Типичные формы коклюша.

3.1.2. Атипичные формы коклюша.

3.2. Специфическая профилактика коклюша.

4. Лабораторное подтверждение диагноза и причины гиподиагностики коклюша.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Разработка тест-системы ПЦР-РВ для выявления ДНК возбудителя коклюша и анализа фазового состава популяции бактерий Bordetella pertussis.

1.1. Количественное определение ДНК B.pertussis и геномов бактерий B.pertussis, содержащих интеграции IS481 и IS1002 в cctagg сайте оперона bvgAS.

1.2. Конструирование плазмид pIS481 и pIS1002 для определения в ПЦР-РВ количества ГЭ ДНК бактерий B.pertussis и их инсерционных авирулентных мутантов.

1.3. Оптимизация условий амплификации.

1.4. Проверка чувствительности и специфичности разработанной тест-системы ПЦР-РВ.

2. Выявление возбудителя коклюша у больных типичными и атипичными формами заболевания бактериологическим методом и ПЦР-РВ.

2.1. Сбор клинических образцов от больных коклюшем, другими респираторными инфекциями и от «практически здоровых» детей и взрослых.

2.2. Идентификация возбудителя коклюша в клинических образцах бактериологическим методом.

2.3. Идентификация и количественное определение ДНК Bordetella pertussis в клинических образцах с помощью разработанной тест-системы ПЦР-РВ.

3. Анализ фазового состава популяции бактерий В.pertussis у больных типичными и атипичными формами коклюша и практически здоровых бактерионосителей.

4. Изучение сроков персистенции и фазового состава популяции бактерий B.pertussis при экспериментальном заражении мышей.

4.1. Определение сроков персистенции бактерий Bordetella pertussis при экспериментальном заражении мышей с помощью бактериологического метода.

4.2. Определение сроков персистенции бактерий Bordetella pertussis при экспериментальном заражении мышей с помощью разработанной тест-системы ПЦР-РВ.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Инсерционная инактивация оперона вирулентности бактерий Bordetella pertussis в диагностике типичных и атипичных форм коклюша"

Актуальность проблемы. Коклюш - инфекционное респираторное заболевание человека, вызываемое грамотрицательными бактериями Bordetella pertussis, характеризующееся тяжелым течением и высокой летальностью у новорожденных и детей первого года жизни. Летальность при коклюше обусловлена развитием осложнений: апноэ, нарушения мозгового кровообращения, кровотечения из задне-глоточного пространства и бронхов, внутричерепные кровоизлияния, надрывы диафрагмы, коклюшная пневмония, эмфизема легких и др. Массовая противококлюшная вакцинация, проводимая в нашей стране с помощью АКДС-вакцины, начиная с 1950-х гг. прошлого столетия, значительно снизила летальность и заболеваемость коклюшем в типичной форме [8, 20, 25]. Несмотря на клиническую и лабораторную гиподиагностику коклюша, по данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется до 50 миллионов случаев заболевания, умирает около 300 тысяч детей, преимущественно в возрасте до 1 года [37]. В последние десятилетия во всем мире наблюдается рост заболеваемости коклюшем среди подростков и взрослых [21, 30, 58, 59]. Типичную клиническую картину коклюша наблюдают сегодня все реже, в основном, у не вакцинированных, наиболее восприимчивых к коклюшной инфекции младенцев до 5-6 месяцев и у детей старше 10 лет [174]. Увеличивается число случаев атипичных форм коклюша: стертых, бессимптомных, абортивных, транзиторного бактерионосительства [14]. Эпидемиологические исследования подтвердили, что для восприимчивой группы детей источником инфекции являются подростки и взрослые, у которых коклюш, как правило, протекает в атипичных формах. Носителями возбудителя коклюша могут быть практически здоровые люди [7, 99, 123].

Диагностика атипичных форм коклюша затруднена из-за отсутствия характерной клинической картины и адекватных лабораторных методов. Бактериологический метод на ранних стадиях коклюша выявляет возбудитель не более чем в 10% случаев даже при типичных формах заболевания [4], серологические методы (РНГА, РПГА, ИФА) подтверждают заболевание только на поздних стадиях, а нарастания титров специфических антител у бактерионосителей, как правило, не наблюдается [34]. Раннее лабораторное подтверждение диагноза «Коклюш» особенно актуально в клинической практике для диагностики атипичных форм, определения тактики лечения и проведения противоэпидемических мероприятий в семейных очагах и организованных детских коллективах [26].

Бактерии Bordetella pertussis - микроорганизмы, обладающие значительной изменчивостью, проявляющейся в появлении бактерий разной степени вирулентности. Это зависит от условий культивирования, длительности заболевания, лечения, ранее проведенной вакцинации [81]. Впервые на изменчивость B.pertussis in vivo было указано еще Трушиной-Тумановой Е.Ф. в 1949 г., выделившей непосредственно от 39 больных с различной клинической картиной коклюша 40 атипичных культур B.pertussis [31]. Экспрессия генов вирулентности бактерий B.pertussis контролируется опероном вирулентности bvgAS. B.pertussis в I фазе (Bvg+) экспрессируют все факторы вирулентности. В результате мутаций, нарушающих структуру оперона bvgAS, происходит переход из I вирулентной фазы в IV авирулентную (Bvg-) фазу и изменение экспрессии факторов вирулентности (фазовые модуляции). Частичная потеря вирулентности наблюдается у B.pertussis во II и III фазах вирулентности, объединенных в понятие промежуточной фазы (Bvg1) [135]. Изменение условий культивирования также может привести к нарушению экспрессии факторов вирулентности (фазовым модуляциям).

Исследования по изучению регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша, проводимые в ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи МЗ

РФ, показали, что перемещение инсерционных последовательностей (ISэлементов 481 и 1002) в оперон bvgAS является одним из механизмов, обеспечивающих переход бактерий B.pertussis из вирулентной I фазы в 8 авирулентную IV фазу. Популяции бактерий В.pertussis in vitro были гетерогенны и содержали разное, зависящее от условий культивирования, количество вирулентных Bvg+ бактерий и авирулентных инсерционных Bvg-мутантов. Соотношение между числом вирулентных и авирулентных бактерий было названо фазовым составом популяции бактерий B.pertussis [10]. Вероятно, in vivo с течением инфекционного процесса происходит накопление авирулентных инсерционных мутантов возбудителя коклюша и формирование бактерионосительства.

Цель работы: регистрация инсерционных авирулентных Bvg-мутантов бактерий B.pertussis in vivo и выявление корреляции между клинической картиной заболевания у больных типичными и атипичными формами коклюша и фазовым составом популяции возбудителя.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Разработка тест-системы ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для количественного определения ДНК бактерий B.pertussis в клинических образцах, содержащих инсерции IS481 и IS 1002 в опероне вирулентности bvgAS.

2. Выявление бактерий B.pertussis с помощью ПЦР-РВ в сравнении с бактериологическим методом в назофарингеальных мазках от больных типичными и атипичными формами коклюша и практически здоровых детей и взрослых, контактировавших и не контактировавших с больными.

3. Количественное определение авирулентных бактерий В.pertussis, содержащих инсерциии IS481 и IS1002 в опероне bvgAS в ПЦР-РВ положительных клинических образцах.

4. Установление корреляции между клинической картиной заболевания у больных типичными и атипичными формами коклюша и фазовым составом популяции бактерий B.pertussis.

5. Изучение сроков персистенции и фазового состава популяции бактерий

B.pertussis разработанным методом ПЦР-РВ при экспериментальном заражении мышей вирулентными бактериями B.pertussis.

Впервые показано, что ДНК возбудителя коклюша выявляется у 55,6% больных с диагнозом «ОРВИ» и смешанными респираторными инфекциями, у 31% больных с симптомом «длительный кашель».

ДНК B.pertussis была выявлена у 75% «практически здоровых» детей и взрослых, контактировавших с больными.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана тест-система ПЦР-РВ, позволяющая выявлять возбудитель коклюша в клинических образцах и изучать фазовый состав популяции бактерий Bordetella pertussis у больных типичными и атипичными формами коклюша.

2. С помощью разработанной тест-системы ПЦР-РВ показана широкая распространенность возбудителя коклюша среди больных с инфекционной респираторной патологией, а также возможность носительства бактерий B.pertussis практически здоровыми людьми.

4. Разработанный способ выявления авирулентных инсерционных мутантов B.pertussis позволяет изучать механизмы изменения популяции возбудителя коклюша в процессе развития инфекционного процесса.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», 3-е место (Москва), на научно-практической конференции Научного Центра Здоровья Детей РАМН «Актуальные проблемы педиатрии» в рамках конкурса молодых ученых (Москва, 2009), на Международной школе по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010), на XIV Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», в рамках конкурса молодых ученых, 1-е место (Санкт-Петербург, 2011), на международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, 2012). Защищена дипломная работа на факультете фундаментальной медицины Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова «Диагностическое значение фазовых состояний возбудителя коклюша {Bordetella pertussis), выявляемого в клинических образцах детей и взрослых с диагнозом «ОРЗ» (Москва, 2009).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 105 страницах

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Медкова, Алиса Юрьевна

выводы

4. Клиническая картина коклюша коррелирует с фазовым составом популяции возбудителя: у больных типичными формами заболевания популяция бактерий B.pertussis практически не содержит авирулентных инсерционных Bvg- мутантов, у больных атипичными формами количество авирулентных мутантов составляет в среднем 0,2%, у практически здоровых бактерионосителей достигает 90%.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Медкова, Алиса Юрьевна, Москва

1. Артемьев М. И. Количественная оценка мишени методом ПЦР/ М.И. Артемьев и др.// Тез. докл. 3-ей Всероссийской научно-практической конференции. М., 2000. - С. 341-342.

2. Баранов А. А. Научное обоснование вакцинации детей с отклонениями в состоянии здоровья/А.А. Баранов, JI.C. Намазова-Баранова, В.К. Таточенко// Педиатрическая фармакология. 2010. - №2. - С. 6-24.

3. Боковой А. Г. Специфическая диагностика коклюша у детей методом ДНК-зондирования/ А.Г. Боковой и др.// Клинический вестник. -1996. -№3. С.15-16.

4. Борисова О. Ю. Прямой ускоренный метод выявления возбудителя коклюша/ О.Ю. Борисова и др.// Клиническая лабораторная диагностика. 2010. - №5. - С. 53-55.

5. Галазка А. Иммунологические основы иммунизации / А. Галазка// ВОЗ. Женева, 1993. - Вып. 4. Коклюш.

6. Гланц С. Медико-биологическая статистика/ С. Гланц: М.: Практика, 1999.

7. Герасимова А. Г. Клинико-эпидемиологическая характеристика современного коклюша/ А.Г. Герасимова и др.// Вакцинация. 2004. -№5(35).-С. 4-5.

8. Захарова М. С. Проблемы эпидемиологии и иммунологии коклюша и паракоклюша в СССР/ М.С. Захарова. М., 1969.

9. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше// Министерство здравоохранения СССР.-М., 1984.

10. Коклюш (микробиология, иммунология, специфическая профилактика)/ В.И. Иоффе и др. М.: Медицина, 1964. - 284 с.

11. Краснова Е. И. Эволюция коклюша в Новосибирске / Е.И. Краснова, J1.M. Панасенко, В.Г. Кузнецова // Детские инфекции. 2010. - №2. -С. 15-18.

12. Ларшутин С. А. Лабораторная диагностика коклюша/ С.А. Ларшутин и др.// Эпидемиология и инфекционные болезни. 1998. - №4. - С. 50-52.

13. Лобзин Ю. В. Клинико-эпидемиологическая характеристика коклюша у детей первых месяцев жизни/ Ю.В. Лобзин и др.// Детские инфекции.-2011.-№4.-С. 5-9.

14. Лыткина И. Н. Выявление возбудителя коклюша в клинических образцах с помощью ПЦР/ И.Н. Лыткина// Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. 1997. - Вып. 2. - С.144-148.

15. Лыткина И. Н. Заболеваемость коклюшем в Москве и организация мероприятий по ее снижению / И.Н. Лыткина, Г.Г. Чистякова, H.H. Филатов // Информационный бюллетень «Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики». 2004. - №5. - С. 8-9.

16. Мамаева Е. А. Антигенные и иммуногенные свойства различных фаг коклюшного микроба/ Е.А. Мамаева// Ж. микробиол. 1956. - №4. - С. 13-17.

17. Машков А. В. Ответные реакции организма ребенка на антиген коклюшного микроба при инфекции и вакцинации/ A.B. Машков, З.М. Михайлова, И.В. Дядюнова// Проблемы коклюша. М, 1961. - С. 5762.

18. Медкова А. Ю. Распространенность стертых форм коклюша и анализ фазовых состояний бактерий Bordetella pertussis/ А.Ю. Медкова и др.// Детские инфекции. 2010. - №4. - С. 19-22.

19. Озерецковский Н. А. Вакцинопрофилактика коклюша — итоги и перспективы/ H.A. Озерецковский, Р.П. Чупринина// Вакцинация.2004. № 5(35). - С. 6-7.

20. Попова О. П. Особенности сочетанного течения коклюша и острых респираторных вирусных инфекций у детей/ О.П. Попова// Детские инфекции. 2011.-№3.-С. 18-20.

21. Попова О. П. Особенности течения коклюша на фоне цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста/ О.П. Попова и др.// Детские инфекции. 2011. - №2. - С. 25-28.

22. Селезнева Т. С. Мониторинг иммуноструктуры детского населения к коклюшу в современных условиях/ Т.С. Селезнева// Эпидемиология и инфекционные болезни. 2009. - №2. - С. 45-48.

23. Сигаева Л. А. Заболеваемость коклюшем и состояние привитости// Л.А. Сигаева и др. // Журн. микробиол. 1986 - №3. - С. 43-48.

24. Сигаева JI. А. Заболеваемость коклюшем и состояние привитости// JI.A. Сигаева и др. // Журн. микробиол. 1986 - №3. - С. 43-48.

25. Сипачева Н. Б. Эпидемиология и вакцинопрофилактика коклюша/ Н.Б. Сипачева и др. // Здоровье населения и среда обитания. 2011. - №12.- С. 34-36.

26. Синяшин Н. И. Модификация модели интраназального заражения белых мышей/ Н.И. Синяшин и др. // Докл. АН УзССР. 1986. - №7. -С. 55-56.

27. Синяшина J1. Н. bvg-негативная регуляция перемещений повторяющихся последовательностей в клетках Bordetella pertussis/ Л.H. Синяшина и др. // Генетика. 2005. - Т. 41, №12. - С. 1-9.

28. Степаншина В. Н. Взаимосвязь состава питательных сред с ростовыми и биологическими свойствами B.pertussis/ В.Н. Степаншина и др. // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунол. 1994. - №6. - С. 26-27.

29. Тимченко В. Н. Коклюшная инфекция у детей в современных условиях/ В.Н. Тимченко и др. // Детские инфекции. 2009. - №3. -С. 28-30.

30. Трушина-Туманова Е. Ф. Изучение изменчивости коклюшного микроба/ Е.Ф. Трушина-Туманова // Журнал микробиология. 1949. -Т. 5.-С. 61-68.

31. Учайкин В. Ф. Национальный календарь профилактических прививок: достоинства и недостатки/ В.Ф. Учайкин// Детские инфекции. 2004. -№2. - С. 4-8.

32. Фельдблюм И. В. Стандартное эпидемиологическое определение случая коклюша и его использование при расследовании вспышки коклюшной инфекции / И.В. Фельдблюм и др. // Здоровье населения и среда обитания. 2011. - №3. - С. 24-28.

33. Ценева Г. Я. Микробиологическая характеристика возбудителя коклюша и лабораторная диагностика коклюша / Г .Я. Ценева, Н.Н. Курова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.- 2003. Т. 5, №4. - С. 329-340.

34. Чупринина Р. П. Бесклеточная коклюшная вакцина. Новый этап вакцинопрофилактики коклюша / Р.П. Чупринина, Н.А. Озерецковский, И. А. Алексеева // Биопрепараты. 2001. - №3. - С. 1922.

35. André Ph. Comparison of Serological and Real-Time PCR Assays To Diagnose Bordetella pertussis Infection in 2007 / Ph. André et al. II J Clin Microbiol. 2008. - №46(5). - P. 1672-1677.

36. Ayme G. Biological activities of fragments derived from Bordetella pertussis endotoxin: isolation of a nontoxic, Shwartzman-negative lipid A possessing high adjuvant properties / G. Ayme et al. // Infect Immun. -1980.-№49.-P. 739-745.

37. Backman A. Nested PCR optimized for detection of Bordetella pertussis in clinical nasopharyngeal samples / A. Backman, B. Johansson, P. Oleen // J. Clin. Microbiol. 1994. - №32. - P. 2544-2548.

38. Baker J. P. Childhood vaccine development: an overview / J.P. Baker, S.L. Katz // Pediatr Res. 2004. - №55(2). - P. 347-356.

39. Berbers G.A.M. Improving pertussis vaccination / G.A.M. Berbers, S. de Greeff, F. Mooi // Hum Vaccines. -2009. -№5. P. 497-503.

40. Betsou F. The C-terminal domain is essential for protective activity of the Bordetella pertussis adenylate cyclase-hemolysin / F. Betsou, P. Sebo, N. Guiso // Infect Immun. -1995. №63. - P. 3309-3315.

41. Bidet P. Real-time PCR measurement of persistence of Bordetella pertussis DNA in nasopharyngeal secretions during antibiotic treatment of young children with pertussis / P. Bidet et al. // J Clin Microbiol. 2008. -№46(11).-P. 3636-3638.

42. Birkebaek N. H. Bordetella pertussis diagnosed by polymerase chain reaction / N. H. Birkebaek, I. Heron, K. Skjodt. // APMIS. 1994. - №102. -P. 291-294.

43. Bisgard К. M. Infant pertussis: who was the source? / K.M. Bisgard et al. // Pediatr Infect Dis J.-2004. №23(11). - P. 985-989.

44. Bokoch G. M. Inhibition of receptor-mediated release of arachidonic acid by pertussis toxin / G.M. Bokoch, A.G. Gilman // Cell. 1984. - №39. - P. 301-308.

45. Bonacorsi S. Treatment failure of nosocomial pertussis infection in a very-low-birth-weight neonate / S. Bonacorsi et al. // J Clin Microbiol. 2006. -№44(10). -P. 3830-3832.

46. Bordet J. Note complementair sur le microbe de la coqueluche et sa variabilitean point de vue du sérodiagnostic de la toxicité / J. Bordet // Central f. Bact. u Paraz. 1912.

47. Bordet J. Sérodiagnostic et variability des microbes suivant le milieu de culture / J. Bordet, G. Sleeswyk // Ann. Inst. Pasteure. 1910. - Vol. 24. -P. 476-494.

48. Boucher P. E. The modular architecture of bacterial response regulators: insights into the activation mechanism of the BvgA transactivator of Bordetella pertussis / P.E. Boucher, F.D. Menozzi, C. Locht // J. Mol. Biol. 1994.-V. 241.-P. 363-377.

49. Boucher P. E. Nature of DNA binding and RNA polymerase interaction of the Bordetella pertussis BvgA transcriptional activator at the ftia promoter / P.E. Boucher etal.//J. Bacteriol. 1997. - V. 179.-P. 1755- 1763.

50. Boucher P. E. Synergistic binding of RNA polymerase and BvgA phosphate to the pertussis toxin promoter of Bordetella pertussis / P. E. Boucher, S. Stibitz // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 6486-6491.

51. Brennan M. J. Pertussis antigens that abrogate bacterial adherence and elicit immunity / M.J. Brennan, R.D. Shahin / Am J Respir Crit Care Med. 1996. -№154(4 pt 2). - P. 145-149.

52. Burstyn D. G. Sensitive and specific polymerase chain reaction assays for detection of Bordetella pertussis in nasopharyngeal specimens / D.G. Burstyn et al. II J. Pediatr. 1994. - №124. - P. 421-426.

53. Cherry J. D. Epidemiological, clinical, and laboratory aspects of pertussis in adults / J.D. Cherry// Clin Infect Dis. 1999. - №28, suppl. 2. - P. 112117.

54. Cherry J. D. Comparison of values of antibody to Bordetella pertussis antigens in young German and American men / J.D. Cherry et al. // Clin Infect Dis. -1995. №20. - P. 1271-1274.

55. Cherry J. D. Defining pertussis epidemiology: clinical, microbiologic and serologic perspectives / J.D. Cherry et al. // Pediatr Infect Dis J. 2005. -№24. - P. 25-34.

56. Cherry J. D. Pertussis and other Bordetella infections / J.D. Cherry, U.tVi

57. Heininger, S. Kaplan (ed.) II Textbook of pediatric infectious diseases, 5 ed. The W.B. Saunders Co, Philadelphia, Pa. 2004. - P. 1588-1608.

58. Cotter P. A. BvgAS-mediated signal transduction: analysis of phase-locked regulatory mutants of Bordetella bronchiseptica in a rabbit model / P.A. Cotter, J.F. Miller// Infect. Immun. 1994. -V. 62. - P. 3381-3390.

59. Crowcroft N. S. Severe and unrecognised: pertussis in UK infants / N.S. Crowcroft et al. // Arch Dis Child. 2003. - №88(9). - P. 802-806.

60. Crowcroft N. S. Recent developments in pertussis /N.S. Crowcroft, R. Pebody // Lancet. 2006. - №367. - P. 1926-1936.

61. Davis J. P. Clinical and economic effects of pertussis outbreak / J.P. Davis // Pediatr. Infect. Dis. J. 2005. - V. 24. - P. 109-116.

62. Deen J. L. Household contact study of Bordetella pertussis infections / J.L. Deen et al. // Clin Infect Dis. 1995. - №21. - P. 1211-1219.

63. Deora R. Differential regulation of the Bordetella bipA gene: distinct roles for different BvgA binding sites / R. Deora // J. Bacteriol. 2002. - №184. -P. 6942-6951.

64. Deora R. Diversity in the Bordetella virulence regulation: transcriptional control of a Bvg-intermediate phase gene / R. Deora et al. // Mol. Microbiol. 2001. - V. 40. - P. 669-683.

65. Deville J. G. Frequency of unrecognized Bordetella pertussis infections in adults / J.G. Deville et al. // Clin Infect Dis. 1995. - №21. - P. 639-642.

66. Dobrogosz W. J. Physiology of Bordetella pertussis / W.J. Dobrogosz et al. // Proc. Intern. Symp. on Pertussis, U.S. Dep. Hlth., Educat. and Welf. -1978.-P. 86-93.

67. Douglas E. Identification of Bordetella pertussis in nasopharyngeal swabs by PCR amplification of a region of the adenylate cyclase gene / E. Douglas et al. // J. Med. Microbiol. 1993. - №38. - P. 140-144.

68. Edwards K. M. Comparison of 13 acellular pertussis vaccines: overview and serologic response / K.M. Edwards et al. // Pediatrics. 1995. - №96. -P. 548-557.

69. Espy M. J. Real-time PCR in Clinical Microbiology: Applications for routine laboratory testing / M.J. Espy et al. // Clin. Microbiol. Rew. 2006. -Vol. 19. -№1. - P. 165-256.

70. Farizo K. M. Epidemiological features of pertussis in the United States, 1980-1989 / K.M. Farizo et al. // Clin Infect Dis. 1992. - №14. - P. 708719.

71. Fernandez R. C. Cloning and sequencing of a Bordetella pertussis serum resistance locus / R.C. Fernandez, A.A. Weiss // Infect Immun. 1994. -№62.-P. 4727-4738.

72. Fernandez R. C. Serum resistance in bvg-regulated mutants of Bordetella pertussis / R.C. Fernandez, A.A. Weiss // FEMS Microbiol Lett. 1998. -№163.-P. 57-63.

73. Fild L. H. Differences observed between fresh isolates of B.pertussis and their laboratory passaged derivatives / L.H. Fild, C.D. Parker // Proc. Int. Symp. On Pertussis, U.S., Dep. Hlth., Educat, Welf. 1978. - P. 124-132.

74. Fine P. E. M. Refelections on the efficacy of pertussis vaccines / P.E.M. Fine, J.A. Clarkson // Rev Infect Dis. 1987. - №9. - P. 866-1033.

75. Flosdorf E. W. Studies with H.pertussis. Y. Agglutinogenic relationships of the phages / E.W. Flosdorf, T.F. Dozois, A.C. Kimball // J. Bacteriol. -1941.-V. 41.-P. 457-462.

76. Flosdorf E. W. Intradermal test for susceptibility to and immunization against whooping cough using agglutinogen from phase I H.pertussis / E.W. Flosdorf et al. // Am. J. Med.Sci. 1943. - V. 206. - P. 422-425.

77. Forde C. B. Bioluminescence as a Reporter of Intracellular Survival of Bordetella bronchiseptica in Murine Phagocytes / C.B. Forde, R. Parton, J.G. Coote // Infect Immun. 1998.-№66.-P. 3198-3207.

78. Friedrich M. J. Research aims to boost pertussis control / M.J. Friedrich // JAMA. 2011. - №6;306(1). - P. 27-29.

79. Forsyth K. Pertussis immunization inthe global pertussis initiative international region: recommended strategies and implementation considerations / K. Forsyth et al. // Pediatr Infect Dis J. 2005. - №24(5 Suppl). - P. 93-97.

80. Geuijen C. A. The major fimbrial subunit of Bordetella pertussis binds to sulfated sugars / C.A. Geuijen, R.J. Willems, F.R. Mooi // Infect Immun. -1996.-№64.-P. 2657-2665.

81. Gilchrist M. J. R. Bordetella / M.J.R. Gilchrist, H.J. Shadomy (ed.) // Manual of clinical microbiology. 5-th ed. Washington: ASM Press. -1991. -P. 471-477.

82. Glare E. M. Analysis of a repetitive DNA sequence from Bordetella pertussis and its application to the diagnosis of pertussis using the polymerase chain reaction / E.M. Glare et al. // J. Clin. Microbiol. 1990. -№28.-P. 1982-1987.

83. Graeff-Wohlleben H. Global regulatory mechanisms affect virulence gene expression in Bordetella pertussis / H. Graeff-Wohlleben, H. Deppisch, R. Gross // Mol. Gen. Genet. 1995. - №247. - P. 86-94.

84. Granstrom G. Specific immunoglobulin A to Bordetella pertussis antigens in mucosal secretion for rapid diagnosis of whooping cough / G. Granstrom, P. Askelof, M. Granstrom // J Clin Microbiol. 1988. - №26. - P. 869-874.

85. Granstrom G. Evaluation of serologic assays for diagnosis of whooping cough / G. Granstrom et al. // J Clin Microbiol. 1988. - №26. - P. 18181823.

86. Grimprel E. P. Comparison of polymerase chain reaction, culture and Western immunoblot serology for diagnosis of Bordetella pertussis infections / E.P. Grimprel et al. // J. Clin. Microbiol. 1993. - №31. - P. 2745-2750.

87. Gueirard P. Role of adenylate cyclase-hemolysin in alveolar macrophage apoptosis during Bordetella pertussis infection in vivo / P. Gueirard et al. // Infect Immun. 1998.-№66.-P. 1718-1725.

88. Guthrie J. L. Use of Bordetella pertussis BP3385 to establish a cutoff value for an IS481-targeted real-time PCR assay / J.L. Guthrie et al. // J Clin Microbiol. 2008. - №46(11). - P. 3798-3789.

89. Hallander H. Microbiological and serological diagnosis of pertussis / H. Hallander // Clin Infect Dis. 1999. - №28(Suppl 2). - P. 99-106.

90. He Q. Diagnosis of Bordetella pertussis infection and investigation of pertussis immunity by PCR and EIA serology / Q. He dissertation. // Turku.- 1994.

91. He Q. Factors contributing to pertussis resurgence / Q. He, J. Mertsola // Future Microbiol. 2008. - №3. - P. 329-339.

92. He Q. Sensitive and specific polymerase chain reaction assays for detection of Bordetella pertussis in nasopharyngeal specimens / Q. He et al. // J Pediatr. -1994. №124. - P. 421-426.

93. He Q. Comparison of polymerase chain reaction with culture and enzyme immunoassay for diagnosis of pertussis / Q. He et al. // J. Clin. Microbiol. -1993.-№31.-P. 642-645.

94. He Q. Evaluation of pooled and individual components of B. pertussis as antigens in an enzyme immunoassay for diagnosis of pertussis / Q. He et al. // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1993. - №12. - P. 690-695.

95. Heininger U. A controlled study of the relationship between Bordetella pertussis infection and sudden unexpected deaths in German infants / U. Heininger et al. // Pediatrics. 2004. - №114. - P. 9-15.

96. Hewlett E. L. Induction of a novel morphological response in Chinese hamster ovary cells by pertussis toxin / E.L. Hewlett et al. // Infect Immun.- 1983. №40. - P. 1198-1230.

97. Hoppe J. E. Comparison of three kinds of blood and two incubation atmospheres for cultivation of Bordetella pertussis o n charcoal agar / J.E.

98. Hoppe, M. Scblagenhauf // J Clin Microbiol. 1989. - №27. - P. 21152117.

99. Houard S. Specific identification of Bordetella pertussis by the polymerase chain reaction / S. Houard et al. // Res. Microbiol. 1989. -№140.-P. 477^187.

100. Karimova G. Phosphorylation-dependent binding of BvgA to the upstream region of the cyaA gene of Bordetella pertussis / G. Karimova, J. Bellalou, A. Ullmann // Mol. Microbiol. 1996. - V. 20. - P. 489-496.

101. Karimova G. Characterization of DNA binding sites for the BvgA protein of Bordetella pertussis / G. Karimova, A. Ullmann // J. Bacteriol. -1997. V. 179. - P. 3790-3792.

102. Katada T. The A protomer of islet-activating protein, pertussis toxin, as an active peptide catalyzing ADP-ribosylation of a membrane protein / T. Katada, M. Tamura, M. Ui // Arch. Biochem. Biophys. 1983. - №224. - P. 290-298.

103. Kinnear S. M. Analysis of BvgA activation of the pertactin gene promoter in Bordetella pertussis / S.M. Kinnear et al. // J. Bacteriol. -1999.-V. 181.-P. 5234-5241.

104. Kloos W. E. DNA-DNA hybridization, plasmids and genetic exchange in the genus Bordetella / W.E. Kloos et al. // Prossed. Int. Symp. on Pertussis, U.S., Dep. Hlth., Educat. And Welf. 1978. - P. 70-80.

105. Klumpp S. Phosphorylation and dephosphorylation of histidine residues in proteins / S. Klumpp, J. Krieglstein // Eur. J. Biochem. 2002. -№269. - P. 1067- 1071.

106. Krumwiede C. The existence of more than one immunologic type of Bordetella pertussis / C. Krumwiede, L. Mishulow, C. Oldenbush // J. Int. Dis. 1923. - V. 32. - P. 22-32.

107. Lacey B.W. Antigenic modulation of Bordetella pertussis / B.W. Lacey //J. Hyg. 1960. - V. 31. - P. 423-434.

108. Lanotte Ph. Evaluation of Four Commercial Real-Time PCR Assays for Detection of Bordetella spp. in Nasopharyngeal Aspirates / Ph. Lanotte et al. // J Clin Microbiol. 2011. - №49(11). - P. 3943-3946.

109. Lawler W. R. An office approach to the diagnosis of chronic cough / W.R. Lawler // American Family Physician. 1998. - V. 58. - №9. - P. 678-684.

110. Lawrence G. L. Annual report on surveillance of adverse events following immunisation in Australia, 2006 / G.L. Lawrence et al. // Commun Dis Intell. 2007. - №31. - P. 269-282.

111. Lawson G. M. Immunity studies in pertussis / G.M. Lawson // Am. J. Hyg. 1939. - V. 29.-P. 119-131.

112. Lee C. K. A new assay for invasion of HeLa 229 cells by Bordetella pertussis: effects of inhibitors, phaenotypic modulation, and genetic alterations / C.K. Lee // Infect. Immun. 1990. - №58. - P. 2516- 2522.

113. Leslie P. H. The phases of Haemophilus peertussis / P.H. Leslie, A.D. Gardner//J. Hyg. (Camb). 1931. -V. 31. - P. 423-434.

114. Li Z. M. Identification of Bordetella pertussis infection by shared-primer PCR / Z.M. Li et al. // J. Clin. Microbiol. 1994. - №32. - P. 783789.

115. Li Z. M. Cloning and sequencing of the structural gene for the porin protein of Bordetella pertussis / Z.M. Li et al. // Mol. Microbiol. 1991. -№5.-P. 1649-1656.

116. Martinez de Tejada G. Comparative analysis of the virulence control systems of Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica / G. Martinez de Tejada, J.F. Miller, P.A. Cotter // Mol. Microbiol. -1996. V. 22. - P. 895-908.

117. Mastrantonio P. Polymerase chain reaction for the detection of Bordetella pertussis in clinical nasopharyngeal aspirates / P. Mastrantonio, P. Stefaneiii, M. Giuliano // J Med Microbiol. 1996. - №33. - P. 28682871.

118. Masure H. R. The adenylate cyclase toxin contributes to the survival of Bordetella pertussis within human macrophages / H.R. Masure // Microb. Pathog. 1993. - №14. - P. 253-260.

119. Mattoo S. Molecular Pathogenesis, Epidemiology, and Clinical Manifestations of Respiratory Infections Due to Bordetella pertussis and Other Bordetella Subspecies / S. Mattoo, D. James // Clinical Microbiology Reviews.-2005.-№18.-P. 326-382.

120. Merkel T. J. Identification of a locus required for the regulation of ¿>vg-repressed genes in Bordetella pertussis / T.J. Merkel, S. Stibitz // J. Bacteriol. 1995. - V. 111. - P. 2727-2736.

121. Mertsola J. Serologic diagnosis of pertussis: evaluation of pertussis toxin and other antigens in enzyme-linked immunosorbent assay / J. Mertsola et al. // J Infect Dis. 1990. - № 161. - P. 966-971.

122. Mertsola J. Serological diagnosis of pertussis: comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and bacterial agglutination / J. Mertsola et al. // J Infect Dis. 1983. - №147. - P. 252-257.

123. Meyer C. Cellular immunity in adolescents and adults following acellular pertussis vaccine administration / C. Meyer // Clin Vaccine Immunol. 2007. - №14. - P. 288-292.

124. Miller J. F. Coordinate regulation and sensory transduction in the control of bacterial virulence / J.F. Miller, J.J. Mekalanos, S. Falkow // Science. 1989. - №243. - P. 916-922.

125. Mills K. H. G. Immunity to Bordetella pertussis / K.H.G. Mills // Microbes Infect. 2001. - №3. - P. 655-677.

126. Mink C. M. A search for Bordetella pertussis infection in university students / C.M. Mink et al. // Clin Infect Dis. 1992. - №14(2). - P. 464471.

127. Mooi F. R. Bordetella pertussis and vaccination: The persistence of a genetically monomorphic pathogen / F.R. Mooi // Infect Genet Evol. 2010. -№10(1).-P. 36-49.

128. Morrill W. E. Effects of transport temperature and medium on recovery of Bordetella pertussis from nasopharyngeal swabs / W.E. Morril et al. //J Clin Microbiol. 1988.-№26.-P. 1814-1817.

129. Nakamura Y. Marked difference between adults and children in Bordetella pertussis DNA load in nasopharyngeal swabs / Y. Nakamura et al. // Clin Microbiol Infect. 2011. - №17(3). - P. 365-370.

130. Nicholson T. L. Phenotypic modulation of the virulent Bvg phase is not required for pathogenesis and transmission of Bordetella bronchiseptica in swine / T.L. Nicholson et al. // Infect. Immun. 2012. - №80(3). - P. 1025-1036.

131. Oleen P. Amplification of DNA by the polymerase chain reaction for the efficient diagnosis of pertussis / P. Oleen et al. // Scand. J. Infect. Dis. -1992.-№24.-P. 339-345.

132. Parkhill J. Comparative analysis of the genome sequences of Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica / J. Parkhill et al. // Nat. Genet. 2003. - №35. - P. 32-40.

133. Porter J. F. Long-term survival of Bordetella bronchiseptica in lakewater and in buffered saline without added nutrients / J.F. Porter, A.C. Wardlaw // FEMS Microbiol. Lett. 1993. - V. 110. - P. 33-36.

134. Preston N. W. Components of acellular pertussis vaccines / N.W. Preston, R.C. Matthews // Lancet. 1996. - №16;347(9003). - P. 764.

135. Preziosi M. P. Effects of pertussis vaccination on transmission: vaccine efficacy for infectiousness / M.P. Preziosi, M.E. Halloran // Vaccine. 2003. -№21. - P. 1853-1861.

136. Probert W. S. Identification and evaluation of new target sequences for specific detection of Bordetella pertussis by real-time PCR / W.S. Probert et al. // J Clin Microbiol. 2008. - №46(10). - P. 3228-3231.

137. Recommendations for whole-cell pertussis vaccine, World Health Organization, WHO Technical Report, Series No 941, Annex 6. 2007. - P. 301-333.

138. Redhead K. Effective immunization against Bordetella pertussis respiratory infection in mice is dependent on induction of cellmediated immunity / K. Redhead et al. // Infect Immun. 1993. - №61. - P. 3190-3198.

139. Regan J. Enrichment medium for the isolation of Bordetella / J. Regan, F. Lowe // J Clin Microbiol. 1977. - №6. - P. 303-309.

140. Reizenstein E. Diagnostic evaluation of polymerase chain reaction discriminative for Bordetella pertussis, B.parapertussis, and B. bronchiseptica. / E. Reizenstein et al. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. -1993.-№17.-P. 185-191.

141. Riffelmann M. Preparation of Bordetella pertussis DNA from respiratory samples for real-time PCR by commercial kits / M. Riffelmann et al. // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2008. - №27(2). - P. 145-148.

142. Roberts M. F. N. Construction and characterization of Bordetella pertussis mutants lacking the vir-regulated P.69 outer membrane protein / M.F.N. Roberts et al. // Mol. Microbiol. 1991. - №5. - P. 1393-1404.

143. Rowe J. Th2-associated local reactions to the acellular diphtheria-tetanus-pertussis vaccine in 4- to 6-year-old children / J. Rowe et al. // Infect Immun. 2005. - №73. - P. 8130-8135.

144. Sabella C. Pertussis: old foe, persistant problem / C. Sabella // Cleve Clin J Med. 2005. - №72(7). - P. 601-608.

145. Saukkonen K. Integrin-mediated localization of Bordetella pertussis within macrophages: role in pulmonary colonization / K. Saukkonen et al. // J. Ex P. Med. 1991.-№173.-P. 1143-1149.

146. Scarlato V. Sequential activation and environmental regulation of virulence genes in Bordetella pertussis / V. Scarlato et al. // EMBO J. -1991.-V. 10.-P. 3971-3975.

147. Schlapfer G. Use of the polymerase chain reaction to detect Bordetella pertussis in patients with mild or atypical symptoms of infection / G. Schlapfer et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1993. - №12. - P. 10-14.

148. Schlapfer G. Polymerase chain reaction identification of Bordetella pertussis infections in vaccinees and family members in a pertussis vaccine efficacy trial in Germany / G. Schlapfer et al. // Pediatr. Infect. Dis. J. -1995.-№14.-P. 209-214.

149. Schnitzler N. F. Simultaneous detection of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis using shared-primer PCR including internal control template / N.F. Schnitzler et al. // Abstract-Band Hygiene und Mikrobiologie. 1997. - P. 17-18.

150. Shahin R. D. Characterization of the protective capacity and immunogenity of the 69-kD outer membrane protein of Bordetella pertussis / R.D. Shahin et al. // J Exp Med. 1990. - №171. - P. 63-73.

151. Shibley G. Studies on whooping cough. 1. Type-specific (S) and dissitiation (H) forms of H. pertussis / G. Shibley, S.J. Haelscher // Earp. Med. 1934. - V. 60. - №4. - P. 403-416.

152. Sindt K. A. Pertussis toxin activates platelets through an interaction with platelet glycoprotein lb / K.A. Sindt et al. // Infect. Immun. 1994. -№62.-P. 3108-3114.

153. Sinyashina L. N. IS481-Induced Variability of Bordetella pertussis / L.N. Sinyashina et al. // National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. 2008. - V. 1. - P. 227-232.

154. Steed L. L. Host-parasite interactions between Bordetella pertussis and human polymorphonuclear leukocytes / L.L. Steed, M. Setareh, R.L. Friedman // J. Leukocyte Biol. 1991. - №50. - P. 321-330.

155. Stibitz S. Phase-variation in Bordetella pertussis by frameshift mutation in a gene for a novel two-component system / S. Stibitz et al. // Nature. 1989. - №338. - P. 226-229.

156. Stockbauer K. E. Identification and characterization of BipA, a Bordetella Bvg- intermediate phase protein / K.E. Stockbauer et al. // Mol. Microbiol. -2001,- V. 39.-P. 65-78.

157. Storsaeter J. Levels of anti-pertussis antibodies related to protection after household exposure to Bordetella pertussis / J. Storsaeter et al. // Vaccine. 1998. - №16. - P. 1907-1916.

158. Tamura M. Subunit structure of islet-activating protein, pertussis toxin, in conformity with A-B model / M. Tamura et al. // Biochemistry. -1982.-№21.-P. 5516-5522.

159. Uhl M. A. Integration of multiple domains in a two-component sensor protein: the Bordetella pertussis BvgAS phosphorelay / M.A. Uhl, J.F. Miller // EMBO J. 1996. - №15. - P. 1028-1036.

160. Van der Zee A. C. Polymerase chain reaction assay for pertussis: simultaneous detection and discrimination of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis / A.C. van der Zee et al. // J. Clin. Microbiol. -1993.-№31.-P. 2134-2140.

161. Viljanen M. K. Serological diagnosis of pertussis: IgM, IgA and IgG antibodies against Bordetella pertussis measured by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) / M.K. Viljanen et al. // Scand J Infect Dis. 1982.-№14.-P. 117-122.

162. Vincart B. A specific real-time PCR assay for the detection of Bordetella pertussis / B. Vincart et al. // J Med Microbiol. 2007. -№56(Pt 7).-P. 918-920.

163. Wardlow A. C. Loss of protective antigen, histamine-sensitising factor and envelope polypeptides in cultural variants of Bordetella pertussis / A.C. Wardlow, R. Parton, J.M. Hooken // J. Med. Microbiol. 1976. - V. 9. -№1. - P. 89-100.

164. Weiss A. A. Tn5-induced mutations affecting virulence factors of Bordetella pertussis / A. A. Weiss et al. // Infect Immun. 1983. - №42. -P. 33-41.

165. Wendelboe A. M. Transmission of Bordetella pertussis to young infants / A.M. Wendelboe et al. // Pediatr Infect Dis J. 2007. - №26(4). -P. 293-299.

166. Williamson P. Epitope mapping the Fim2 and Fim3 proteins of Bordetella pertussis with sera from patients infected with or vaccinated against whooping cough / P. Williamson, R. Matthews // FEMS Immunol Med Microbiol. 1996. - №13. - P. 169-178.

167. Wood N. Pertussis: review of epidemiology, diagnosis, management and prevention / N. Wood, P. Mclntyre // Paediatric Respiratory Reviews. -2008.- №9.-P. 201-212.

Информация о работе

Медкова, Алиса Юрьевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Инсерционная инактивация оперона вирулентности бактерий Bordetella pertussis в диагностике типичных и атипичных форм коклюша - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Инсерционная инактивация оперона вирулентности бактерий Bordetella pertussis в диагностике типичных и атипичных форм коклюша - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы