Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Малатдегидрогеназная и аконитазная ферментные системы высших растений: физиолого-биохимическая характеристика, регуляция и роль в адаптации к факторам внешней среды

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Малатдегидрогеназная и аконитазная ферментные системы высших растений: физиолого-биохимическая характеристика, регуляция и роль в адаптации к факторам внешней среды"

На правах рукописи

Р Г и од

2 3 ОПТ 1335

ЕПРИНЦЕВ АЛЕКСАНДР ТРОФИМОВИЧ

МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗНАЯ И АКОНИТАЗНАЯ ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ: ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, РЕГУЛЯЦИЯ И РОЛЬ В АДАПТАЦИИ К ФАКТОРАМ ВНЕШНЕЙ

СРЕДЫ

(03.00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических паук

Воронеж, 1995

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений Воронежского государственного университета

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Т.В.Чиркова

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

В.К.Гинс

доктор биологических наук, профессор

А.Н. Пашков

Ведущая организация: Институт почвоведения и фотосинтеза РАН.

диссертационного < 1 по защите диссертаций на соисканш

ученой степени доктора биологических наук при Воронежскок государственном универсипете (394693, Воронеж,Университетская пл.,1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Воронежской госуниверситета.

Загщгга состоится

1995 года в /часов на заседании

Автореферат разослан ".9........................1995 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование регуляции метаболических оцессов организма является одним из приоритетных направлений разви-я физиологии и биохимии растений. Известно, что в сопряжении важ-й1гих метаболических путей растительной клетки центральную роль иг-ют малат и цитрат, которые неравномерно распределяются в ее ксм-ртментах (Lance,Rustin,1984; Hiedziela et al.,1993), что обусловле-возможной раздельной регуляцией двух половин цикла трикарбоновкх слот и различием их интенсивностей. Каждая половина цикла связана своим депо и колебания между ними могут быть обусловлены балансом оростей двух его ветвей: реакций UTK от сукцинил КоА до оксалоаце-та и от цитрата до 2 оксоглутарата. Главнее депо цикла Кребса обыч-представлено малатом, но во многих растениях второй по интенсив-оти накопления кислотой является цитрат. Между этими пулами возмон-колебания, причем при интенсификации биосинтетических процессов гут усиливаться накопление цитрата и расход малата (Игамберди-,1995).

Изменения концентрации названных интермедиатов обусловливаются гивностью, каталитическими характеристиками, изоферментным составом зубклеточной локализацией ферментов, осуществляющих их биокаталити-:кое превращение. Доминирующую роль в метаболизме малата играет ма-гдегидрегеказная система, включающая две оксидоредуктазы: НАД-зави-лую малатдегидрогеназу (К.Ф. 1.1.1.37, МДГ), и НАДФ-зависимую ма-гдегидрогеназу (К.Ф. 1.1.1.82, НАДФ-МДГ) и две декарбоксилирующих натдегидрогеназы - НАД- (К.Ф. 1.1.1.39, НАД-МЭ) и НАДФ-зависимую Ф. 1.1.1.40, НАДФ-МЭ). Основная роль в утилизации и регуляции на-тления цитрата принадлежит аконитатгидратазе, или аконитазе (К.Ф. 2.1.3, АГ).

В последнее время МДГ и АГ являлись объектами значительного ко-гества исследований. Однако основное внимание было уделено изучению гих ферментов из животных и микроорганизмов, что обусловлено большей ¡тупностью и меньшими методическими трудностями при выделении и 5стке. Исследования сзойств МДГ и АГ из растений малочисленны. Это ?зано, в частности, с тем, что при гомогенизации растительного нажала происходит освобождение и выход из вакуолей клеточного сока с жим значением pH, таннинов, полифенолоксидаз, протеаз, понижающих логическую активность фермента.

В растительной клетке число ферментов и их молекулярных форь обладающих малатдегидрогеназной и аконитазной активностью, значитель но больше, чем у животных и микроорганизмов. Сложная компартментащ' растительной клетки и наличие множества альтернативных метаболически путей приводит к появлению динамического равновесия между различныь изоформами этих ферментов. До сих пор отсутствует полная карти? субклеточной локализации множественных молекулярных форм МДГ и АГ, V каталитических свойств, регуляции генезиса и роли в сопряжении основ ных физиологических процессов в растениях, а имеющиеся сведения требуют дальнейшей систематизации и осмысления.

Для решения данных проблем необходимо развитие исследований г изучению каталитических и физико-химических характеристик отдельш молекулярных форм МДГ и АГ, что позволит приблизиться к понимании регуляции связанных с этими изоформами метаболических путей, протекг ющих в различных компартментах клетки. Вместе с тем,-это дает возмол ность понять механизмы раздельной регуляции двух половин цикла Кребс и физиолого-биохимическую роль малатдегидрогеназной и аконитатгидра-тазной систем, в адаптации растительного организма к изменению факте ров внешней среды.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являет ся исследование физиолого-биохимических характеристик малатдегидроге назной и аконитазной систем высших растений: выяснение их распространения, особенностей тканевой и субклеточкой локализации, изофер-ментного спектра, механизмов регуляции и каталитических свойств отдельных изоферментов, их роли в различных процессах растительной клетки и в адаптации к изменениям факторов внешней среды. Исходя из цели были поставлены следующие задачи:

- изучить распространение, генезис активности, видовую и тканевз специфичность субклеточной локализации МДГ и АГ;

- исследовать влияние факторов внешней среды (свет, газовый состав, засоление, температура) на функционирование малатдегидрогеназной аконитазной ферментных систем и выяснить их роль в адаптивной реа! ции растительного организма ;

- провести исследование механизмов биосинтеза митохондриальной МДГ

- разработать эффективные методы получения и стабилизации гомогенны) препаратов изоферментов МДГ и АГ из различных растений и способы I длительного хранения;

- изучить возможность индуцированного синтеза МДГ и АГ под действш

экзогенных органических кислот;

изучить и сравнить физико-химические свойства, аминокислотный состав отдельных изоферментов;

исследовать каталитические свойства и метаболитную регуляцию активности МДГ и АГ;

разработать на основании свойств различных изоферментов МДГ и АГ модель регуляции метаболических процессов в клетке на уровне ферментных систем, обусловливающей адаптивные возможности растений к изменению фактора внешней среды.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований ¡учено распространение, генезис активности изоферментов малатдегид-)геназы и аконитатгидратазы в онтогенезе высших растений. Показана 1довая и тканевая внутриклеточная специфичность активности и изофер-штногс состава, обусловленная интенсивностью протекания метаболи-эских процессов и типом обмена на разных этапах развития. Установле-), что малатдегидрогеназная система большинства растений обладает >льшей вариабельностью активности и спектра множественных молекуляр-.IX форм, чем аконитатгидратазная.

Впервые показана адаптивная реакция изучаемых ферментных систем экстремальным условиям внешней среды, которая проявлялась в измене-ш активности и увеличении количества изоферментов МДГ. С помощью биоактивных предшественников и применения специфических ингибиторов юсинтеза белка установлено, что образование новых изоформ связано с синтезом de novo. Показано, что одним из возможных путей адаптации юших растений к стрессовым условиям является интенсификация мобили-щии пула малата через оксидоредуктазные и декарбоксилирующие малат-¡гидрогеназы.

Впервые обнаружена возможность индуцированного синтеза изучаемых фментов в высших растениях. Для малатдегидрогеназы установлена гбстраткая индукция новых дополнительных изоформ. С помощью радиои-¡топного анализа ферментативных фракций, полученных в ходе очистки [Г и АГ, выращенных в присутствии индуктора, показано, что имеет :сто синтез фермента de novo.

Разработаны эффективные способы выделения и получены электрофо-¡тически гомогенные препараты изоэнзимов малатдегидрогеназы и акони-.тгидратазы из митохондрий, глиоксисом, цитоплазмы и этиопластов задающих органов кукурузы, клещевины и гороха. Кроме того, впервые ша очищена индуцированная цитоплазматическая изоформа МДГ из щитка

кукурузы. Анализ аминокислотного состава и физико-химических свойст! показал, что выделенные молекулярные формы МДГ представляют собой ш тинные изоферменты.

Проведены исследования свойств и дана сравнительная характера тика различно компартментализованных форм МДГ и АГ. Показано, что д. разных изоферментов, наряду со сходными чертами, характерны существ! ные отличия (pH-оптимум, сродство к субстратам, температурный ошч мум, чувствительность к различным интермедиатам метаболизма). Вперв; установлено, что индуцированная форма МДГ из кукурузы обладает бол! высоким сродством к малату и более низким - к оксалоацетату.

Показано участие хондриома в синтезе гетерологического митохон; риального изофермента МДГ. Полученные результаты указывают на биосш тез "тяжелой" субъединицы энзима в этих органеллах под контролем м; тохондриальной ДНК.

На основе проведенных экспериментальных исследований механизмо; функционирования и регуляции биосинтеза различных изоферментов Mj предлагается модель участия ферментативной системы в адаптивной ■реакции к изменению условий окружающей среды.

Практическая значимость. Разработанные способы выделения и пол; чения электрофоретически гомогенных изоферментов МДГ и АГ из pacTi тельных источников могут быть широко использованы для получения пре паратов ферментов в производственных и лабораторных условиях. Высок( очищенные препараты, получаемые данным способом, имеют удельную акт! ность и чистоту, соответствующие характеристикам МДГ и АК выпускаемым, фирмой "Sigma". Найдены оптимальные условия хранения МДГ в npi сутствии эффективных стабилизаторов, позволяющих сохранять активное; фермента в течение года без значительных потерь. Разработанные cxei выделения и хранения характеризуются целым рядом преимуществ (дешевизна, простота, эффективность хранения) по сравнению с другими методами.

Полученные ферментные препараты могут быть использованы в нау< но-исследовательских лабораториях для регенерации НАД или НАДН, д. изучения других энзиматических систем или для моделирования in viti надмолекулярных систем клетки. Кроме того МДГ может использоваться медицине для биохимических анализов и в пищевой промышленности д.; изучения качества продуктов.

На основе полученных данных по тканевой, сортовой и видовой сш цифичнссти, а также по характеру ответной реакции малатдегидрогена:

ой системы на стрессовые воздействия возможна разработка биотестов ля индикации экологических нарушений в растительных сообществах и ¡^пользование изоферментов как маркеров в селекционных исследованиях систематической классификации растений.

Практическая значимость работы состоит в расширении и углублении редставлений о роли изоферментов в адаптационных реакциях растений, изменению факторов Енешней среды. Кроме того, полученные данные пособствуют пониманию организации и регуляции клеточного метаболиз-а, что монет способствовать разработке путей повышения продуктивнсс-л высших растений и их устойчивости к стрессовым воздействиям.

Результаты исследований вошли в курсы лекций по физиологии рас-зний и биохимии, а также спецкурсы по фотосинтезу, дыханию растений, ({зимологии, читаемых в ряде ВУЗов. Оки используются при проведении оактикумов и выполнении дипломных работ.

Апробация работы. Основные результаты исследований, выполненных зторсм в период 1977-1995гг., докладывались и обсуждались на между-ародных, всесоюзных, республиканских и региональных конференциях, ни были представлены на 19-м (Рим,Италия.1989) 20-м (Будапешт,Венг-;-1я, 1990) и 23-м (Базель, Швейцария) Конгрессах Федерации Европейских лохимических обществ; на 7-м (Умео,Швеция,1990), 8-м (Антвер-эн,Бельгия,1992) и 9-м (Брно,Чехия,1994) Конгрессах Федерации Евро-эйских обществ физиологов растений; на 4-м Международном Конгрессе

0 молекулярной биологии растений, Амстердам, Голландия,1994;на 10-м эждународном фотосинтетическом конгрессе (Монпелье, Франция, 1995),

1 6-м объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (Таллин, Эстония, 1981) ; на 2-м (Минск,1990) и 3-м (Санкт-Петербург,1993) оесоюзкых съездах физиологов растений;.на 8-м Всесоюзном биохимичес-эм съезде (Киев,1986), на 8-м делегатском съезде Всесоюзного ботани-зского общества (Алма-Ата, 1988). на 4-ой (Алма-Ата,1978). 6-й и 7-ой 1ьвов,1980,1984) Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений; а Всесоюзной конференции "Проблемы физиологии и биохимии древесных астений" (Красноярск,1982), на 4-ой и 5-ой Всесоюзной конференции по юлогии клетки (Тбилиси,1985,1987), на 6-ой и 7-ой Всесоюзной кокфе-энции "Иониты" (Воронеж,1986,1991); на 4-ой Всесоюзной конференции Физиология растительной клетки" (Минск,1990); на Международней науч-ул конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва,1993); а Международной научней конференции "Промышленная ботаника: состоите и перспективы развития" (Донецк,1993); на межреспубликанской на-

учно-технической конференции "Проблемы азотистого метаболизма" (Во. гоград,1990); на 13-16-й конференциях молодых ученых МГУ (Мое ва, 1982-1985); на 2-й Всесоюзной конференции молодых ученых по физи логии растительной клетки (Москва.1986); на заседаниях Воронежско отделения Всесоюзного общества физиологов растений и Всесоюзного би химического, общества (1985,1988) и на ежегодных научных конференци Воронежского госуниверситета.

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной рабо изложены в двух монографиях и в более 60 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 457 страница машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экс риментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводо списка литературы (351 источник) к приложения. Иллюстрационный материал включает 117 рисунок, 58 таблиц.

Объекты и методы исследования

Объекты исследования. Основными объектами исследований служи проростки культурных растений: кукурузы (Zea mays L.) сорта Воронеж кая 76; клещевины (Ricinus communis L.); подсолнечника (Helianth annuus L.) с.Передовик; гороха (Plsum sativum L.) с.Рамонский 77. В некоторых исследованиях использовали другие виды и сорта, описан которых приводится по ходу изложения экспериментальных данных. Раст ния выращивали в темноте или на свету при 25°С гидропонным способ или в открытом грунте. Семена различных видов и сортов культурн растений, различающиеся по типу основного обмена и продуктивност получены из Всесоюзного института растениеводства им.Н.И.Вавило (Санкт-Петербург), Орловской опытной станции, Краснодарского ВН масличных культур и Воронежского ботанического сада.

Определение активности ферментов. Для определения активное ферментов использовали спектрофотометрические методы. Активность ак нитатгидратазы, фумаратгидратазы и каталазы проводили при 240 нм убыли соответственно цис-аконитата, фумарата и пероксида водорода ходе ферментативной реакции (Breidenbach et. al.,1968). Активность м латдегидрогеназы осуществляли при 340 нм по изменению оптическ плотности реакционных смесей, определяемых скоростью образования ил расходования НАДН (Ochoa, 1955). Активность НАДФ+-МДГ, НАД1"

АДФ+-малик-энзимов определяли по методике Магомедова и Тищенко 1978). Измерение активности цитохром с оксидазы вели при 550 нм Schnarrenberger et al., 1971).

Определение активности ферментов в гомогенатах исследуемых рас-ений проводили после предварительной гель-фильтрации через сефадекс -25 для удаления низкомолекулярнкх примесей.

За единицу ферментативной активности (ФЕ) принимали количество ермента, катализирующее образование 1 мкмоль продукта за 1 мин. при 5° С.

Выделение клеточных органелл. Выделение субклеточных фракций митохондрий, микротелец, пластид) осуществляли дифференциальным ентрифугированием и изоплстностнкм центрифугированием в градиенте лотности сахарозы (Huang et.al.. 1973) на ультрацентрифуге УЦПЗ-47 Львов). Чистоту органельных фракций контролировали с помощью измере-ия активности маркерных ферментов: каталазы для микротелец, фумарат-идратазы и цитохром с оксидазы для митохондрий. Для солюбилизации ерментов из органелл и их мембран использовали осмотический шок, де-ергекты (дигитонин. Тритон Х-100, Твин-8С) и обработку ультразвуком 15-20 КГЦ).

Определение количества белка. Определение общего количества бела проводили по методу Лоури (Lcwry et al.,1951) и с модификацией Юу Стика (1975) для определения белка в растворах, содержащих Три-он-Х-100. Содержание белка в высокоочищенных препаратах определяли акже по поглощению при 280 и 260 нм (Мешкова, Северин,1979).

Выделение и очистка малатдегидрогеназь; и аконитатгидратазы. Поучение гомогенных препаратов ферментов осуществляли, используя метод яогостадийной очистки, модифицированный нами. После гомогенизации атериала проводили фракционирование белков сульфатом аммония. От лзкомолекулярных соединений фермент отделяли гель-фильтрацией на се-адексе G-25. Затем применяли ионнообменную хроматографию на ДЗ-Э-целлюлозе (Whatman, Великобритания); ультрафильтрацию и гель-хро-атографию на сефадексах G-100 и G-150. При очистке органельных фер-энтов сначала выделяли органельные фракции и осуществляли солюбили-ацию ферментов. Последующую очистку проводили с помощью ионообменной гель-хроматографии. Были определены и отработаны конкретные условия эоведения каждой стадии и особенности ее протекания в зависимости от мстительного объекта и органа, из которого выделялся фермент, что озволило разработать оптимальные параметры осуществления очистки

ферментов. Все операции проводили при 0...4°С.

■ Выделение физиологически активных митохондрий. Полученные диффс ренциальным центрифугированием митохондрии отделяли от глиоксисод Для этого ресуспендированный осадок органелл наносили на 1,5 М pací вор сахарозы и центрифугировали в течение 40 мин при 16000 g. Изолированные митохондрии инкубировали о течение 18-20 часов при t 4-6°С в среде инкубации специального состава (Шея, 1985).

Аналитический электрофорез. Электрофоретическое разделение 6ej ков осуществляли в 7,5 % полиакриламидном геле по методу Дэвиса (Davis, 1964). Определение субъединичной молекулярной массы белков прс водили по методике, разработанной Лэммли (Laemmli,1980). Для специфического проявления МДГ и АГ использовали нитросиний тетразолий (Ге аль и др.,1982). Для специфической идентификации АГ в гелях был модифицирован метод с использованием вспомогательного фермента изощп ратдегидрогеназы.

Универсальное окрашивание белков в гелях осуществляли амидочер-ным или кумасси голубым.

Для проведения электрофореза применяли прибор фирмы "Reanal (Венгрия).

Определение молекулярной массы Ферментов проводили с помощью гель-хроматографии на сефадексах G-100 и G-150 и диск-электрофорезо в присутствии додецилсульфата натрия (Детерман,1970, Laemmli,1970).

Определение аминокислотного состава изоферментов проводили мето дом кислотного гидролиза белка с последующим анализом гидролизата н аминокислотном анализаторе ААА-881 (Чехословакия).

Изучение кинетических характеристик. Кинетические и регуляторны свойства изоферментов исследовали на гомогенных или высокоочищенны препаратах. Определение констант Михазлиса, ингибкрования, расче термодинамических параметров осуществляли по Диксону и Уэбб (1983) с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьши квадратов.

Идентификация функциональных групп активного центра ферментов.

Для определения аминокислотных остатков активного центра изучае мых изоферментов использовали различные специфические ингибиторы: дл аргинина - бутакдион (Borders et al.,1978), для гистидина - диэтилпи рокарбонат (Fan et al..1977), для лизина - пиридоксаль-5-фосфат (Ве-ekmans,1984), для цистеина -п-хлормеркурибензоат (Торчинский,1977). Количество остатков аминокислот в активном центре рассчитывали по ме

- и -

:оду Майлза (Miles. 1978).

При электрофэретических исследованиях применяли специфические шгибиторы протеаз: п-хлормеркурибензоат и фенилметилсульфонилфторид '.Яковлева и др., 1981).

Радиоизотопные исследования. Для изучения механизмов появления ювых изоферментов при воздействии факторов различной природы исполь-¡овали радиоактивные предшественники 2-14С-лейцин, 2,З-Н-лейцин, :-14С-аланин и 2-14С-глицин. Меченые аминокислоты (50-100 МБк) добавили в питательную среду контрольных и опытных растений. После инку->ации растений в присутствии радиоактивных аминокислот проводили вычленив органельных фракций и осуществляли очистку изоферментов для ^следующего изучения включения радиоактивной метки.

Для опытов по декарбоксилированию и метаболизации экзогенного ра-(иоактивного малата были подобраны оптимальные условия (рН и состав реды инкубации, вакуум-инфильтрация среды и др.). Учет выделяющегося 4 С02 осуществляли после улавливания его моноэтаноламином.

ХроматограФическое разделение меченых продуктов осуществляли :ссле фиксации растительного материала кипящим этанолом. Разделение а фракции аминокислот, органических кислот и Сахаров проводили путем оследовательного пропускания экстрактов через колонки с ионообменны-и смолами КУ-2 и АВ-17. ХроматограФическое разделение органических ислот и аминокислот осуществляли на бумаге "Ленинградская медлен-ая", "Ленинградская средняя" и FN-15 в соответствующих системах астворителей (Пасхина,1964, Солдатенков, Мазурова. 1971). Радиоактив-ость полученных образцов определяли на установке УМФ-1500 или сцин-илляционном счетчике СБС-2 в сцинтилляционной жидкости ЖС-8И.

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили не менее -4 раз, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в рех повторностях. В таблицах и на рисунках приводятся данные типич-ых опытов, причем каждое значение есть среднее арифметическое из оех определений. При математической обработке использовали статисти-эский критерий Стьюдента (Ллойд, Ледерман,1989). Для построения гра-жов использовали программы линейной и параболической аппроксимации.

<

01 1Л

и 2

1,5

',0

ил

0,5

л.

1 1

0 1 2 3 456 78 3

0123 4 5678

10

х? ^

2,0

<

Ц 1,5

(У ю

4,1.0

ил"

•е-

0,5

■горох -I- фасоль

• клевера—кенац'-*-гшенииа

дни после

кабачок-*~ткква прорасташ доцсолнечнгк-е-дыня

\

\

\

1 -

0 1 23 45-6 78 3 10 0123456789 10

дни посл! прораста;

Кукурузы

щеток*—лист -*- корень

илещевина

энцосперм-1—корень семядоли

РисЛ. Изменение удельной активности МДГ в органах разных растений. .

Распространение, генезис активности и внутриклеточная локализация малатдегидрогеназной и аконитазной систем в высших растениях

Изучение распространения МДГ и АГ в высших растениях показало, что генезис активности, субклеточная локализация и изоферментный состав ферментных систем определяются их видовыми и сортовыми признаками, а также особенностями основного обмена. Характерной чертой динамики активности МДГ и АГ в онтогенезе растений является увеличение ферментативной активности в органах растений с интенсивным метаболизмом, связанным с мобилизацией запасных питательных веществ, с ростом л дифференциацией тканей: в прорастающих семенах, формирующих цветках, созревающих плодах и молодых листьях (рис.1,2). Максимальная

я т Я Е-1

3 о

3

л н о о аз я

55

е-> М Л

40

32

24

16

Л С-1

О) \

« ы

/ / \ \

// 1 1/ \ ^ \ \ \ \ 1

• ^ ч \ v i1

\ N

6

дни

н

РЗ р

я

о ^

се

я л о

е-| о о кз о й

я«

5! о

а а

о

> /, // V/ \

V ' / V/ 1А/ X Л V Л \\

> / / 'л\ / \ / N V

/ ! / > N \

Г ч N

1 2 3 4 5 6 дни

Рис.2. Изменение аконитазной активности при прорастании семян

клещевины и льна

1 - эндосперм этиолированых проростков клещевины

2 - эндосперм зеленых проростков клещевины

3 - семядоли этиолированных проростков льна

4 - семядоли зеленых проростков льна

активность МДГ и АГ обнаружена в 4-5 дневных щитках кукурузы и эндосперма клещевины, в которых активно функционирует глиоксилатный цикл, осуществляя превращение запасных жиров в углеводы.

Электрофоретический анализ изучаемых ферментных систем свидетельствует, что высшие растения характеризуйся наличием их множественных' молекулярных форм. При этом изоферментный состав МДГ более сложен (рис.3,4) и детерминирован типом ткани, компартментацией и сложностью организации метаболизма.

С г

w

о

(D

Н

о) 14

о

о о,

Ен X <и

$0,5

и о

я <=г

о

о 6. к

о

о

1,с L

□

—

I 2 3 4 5 е 7 Рис.3. Олектро^орег^амлк МДГ из различнкх организмов.

т. Иасгогпопа& b'lp^nciata, Z. Spirillum wino-■ ВолЦия, 4 - Горох, 5- Пшеница, ? - Кукуруза.

rod ski;

- Клещевина,

Так, у прокариотов имеется, как правило, один изофермент, что может быть связано с отсутствием компартментации и множественности метаболических путей (Waters et al.,1985). Для вольфии бескорневой характерно наличие двух изоформ МДГ вследствие упрощения организации

¡етаболизма при переходе к гетеротрофному типу питания. Для пшеницы 'Писано наличие четырех множественных молекулярных форм этого фермен-■а, а максимальное их число присутствует у растений С4-типа, в частости, кукурузы. Эти данные подтверждаются сведениями о наличии у :.со11 лишь одного гена, кодирующего МДГ (Мс Alister-Henn et il.,1987), тогда как в колеоптилях кукурузы обнаружено девять генов, ;одернащих наследственную информацию о синтезе этого фермента (Good-ian et al., 1980).

МДГ обнаруживается во всех важнейших компартментах растительной ;летки. При этом проявляется специфичность внутриклеточной локализа-¡ии молекулярных форм. В глиоксисомах, этиопластах и пероксисомах

м о о с

К

н

о

с?

о •г,

м

CD

К а

а> И

о

о

д

ь о

0,3

л

г. п - »

0,8 1.0^

0,0

0,2

0,4 0,6 -

0,8 1,0|

12 3 4 клещевина

12 3 4 лен

3 4 ячкекь

сзес

.. 71 _ о пшеница orjpiia

3 i

доколь Kggggne

Рис.4. Электрофореграммы изоформ АГ из разных растений. 1 - семена. 2 - корни. 3 - этиолированные листья.

4 - зеленые листья.

растений обычно обнаруживается по одной изоформе МДГ. Наиболее консервативной по электрофоретической подвижности является пластидна5 форма. У всех исследованных растений она обладает наименьшей электрофоретической подвижностью, что указывает на сходный аминокислотные состав и молекулярное строение данного изофермента и его эволюционные консерватизм в растительных организмах. Изоферментный синтез МДГ ] митохондриях и цитоплазме является наиболее вариабельным и в зависимости от видовой специфичности может содержать несколько молекулярные форм фермента.

■ ■ Результаты изучения внутриклеточного распределения АГ в растениях с различным основным типом обмена веществ показали, что преимущественно фермент сосредоточен в цитоплазме. Так. у подсолнечника содержится в растворимой фракции клетки 88%, а у ячменя 96% активносте АГ от общего содержания. Кроме цитоплазмы фермент обнаружен в митохондриях и микротельцах. Содержание аконитазы в микротельцах различных растений колеблется. У ячменя, гороха и кукурузы оно во много ра; меньше, чем в этих же органоидах подсолнечника, что объясняется более интенсивным функционированием глиоксилатного цикла в глиоксисомае подсолнечника (Игамбердиев,1990). Преимущественная локализация АГ I цитоплазме связана с участием фермента в обеспечении функцконированиз многих анаболических процессов, протекающих в этом компартменте. ! первую очередь сюда относятся реакции накопления и утилизации органических кислот: лимонной, изолимонной, аконитовой, оксилимонной и других.

Влияние факторов внешней среды на функционирование малатдегидрогеназной и аконитазной ферментных систем у растений

Исследование влияния различных факторов внешней среды на изуча! мые ферментные системы показало, что их изменение вызывает либо перестройку изоферментного спектра, либо изменение каталитические свойств существующих изоферментов.

При изучении влияния светового режима было установлено, что ако-нитазная активность на свету практически всегда была на 20-25 % ниже, по сравнению с растениями, выращенными в темноте. Освещенность оказывала неодинаковое влияние на активность малатдегидрогеназ, имеющих в качестве кофермента НАД+ и НАДФ". Полученные данные (рис.5'

свидетельствуют о переключении путей утилизации малата при биохимической адаптации вольфии к световому режиму. Такая регуляция определяется динамической активностью, субклеточной локализацией и изофер-ментным спектром малатдегидрогеназной системы. В модельных опытах показано, что в темноте утилизация экзогенного малата осуществляется через НАД-зависимое окисление в митохондриях и цитоплазме, а на свету - через НАДФ-зависимую метаболизацию в хлоропластах. что достигается субстратной к фотоиндукцией различных форм МДГ.

Инкубация растений в условиях анаэробиоза, вызванного заменой атмосферы воздуха инертным газом гелием или С02 приводит к подавлению активности аконитазы в семядолях подсолнечника, листьях кукурузы и гороха. При этом С02-анаэробиоз оказывал большее ингибирующее действие на АГ, что свидетельствует о возможном специфическом ингибирова-нии этого фермента двуокисью углерода. Подавление аконитазнсй активности под действием анаэробиоза в семядолях подсолнечника было меньше, чем в листьях кукурузы и гороха. АГ участвует в работе как ЦТК,

в вольйии. :;ад-!лдг /а/, надс-мдг /б/, КАД-МЗ /в/ и

11АДС-МЭ /г/. □ на свету Е2 в темноте

1. Активность ферментов в СЕ/г скрой массы.

2. Удельная активность ферментов в £Е/мг белка.

так и глиоксилатного цикла, причем их раздельное функционирование обеспечивают различно локализованные изоферменты.

У 4-дневных семядолей подсолнечника преобладает глиоксисомальная изоформа АГ, более устойчивая к диоксиду углерода.

Малатдегидрогеназная система растений проявляет более сложный характер ответной реакции на гипоксические условия (рис.6). Для боль-

0,12

Рис. 6 Влияние концентраии СОо на активность глиоксисо-касьно? ЖГ из эндосперма клещевины.

— без С0о; +-16ММ НаПСО

з

200 250 мкнутк

иинства изученных растений характерно снижение активности МДГ в корнях и незначительное увеличение этого показателя в листьях, что, возможно, обусловливается различной восприимчивостью отдельных изофер-ментов к действию анаэробиоза. В модельных опытах при изучении непосредственного влияния С02 на молекулы фермента установлено, что мито хондриальный, этиопластный и глиоксисомальный изоферменты МДГ облада ют различной чувствительностью. Наибольшей устойчивостью характеризу ется этиопластный белок из листьев кукурузы. Механизм действия СО, одинаков для всех изоферментов МДГ и заключается в синергической кон

курентной активации белка. При этом происходит снижение Кн для малага, a Vmax не меняется. Такой механизм действия С02, по-видимому, оп-оеделяет повышение каталитической эффективности изоэнзимов МДГ в стрессовых условиях, сдвигая равновесие в катализируемой реакции. Злияние солевого стресса на активность МДГ-системы изучали с помощью инкубации растений в 1% растворе NaCl. Полученные данные показывают, что в первые-три часа наблюдаось снижение активности МДГ на 25-40% то сравнению с контролем. В дальнейшем активность МДГ возрастала и оставалась выше контрольных значений. Сходный характер носило изменение декарбоксилирования экзогенного 1,4-14С-малата (табл.1).

Таким образом, динамика адаптационной реакции малатдегидрогеназ-зой системы соответствует классическим представлениям ответа на стрессовую ситуацию, предложенную Г.Селье (1968). Наиболее значительные изменения активности МДГ наблюдаются у вольфии (увеличение в 110

ICO SO

s

° 80

Си

Щ 70

а н

¡i 40

0

° 30

1 20

ч

cu

а Ю

rq

0,5 I 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 G час

ТД

Рис.7. Интенсивность утилизации 1,4" С-малата листьями пшеншш при-температурном стрессе.

1-контрольнке растения

2-растания, подвергнутое' тепловому шоку /45°С/

Таблица 1

Радиоактивность 14С02 при декарбоксилировании экзогенного 1,4-14С-малата при солевом стрессе у кукурузы ■

Время, ч Контроль имп/мин г сырой массы Опыт | имп/мин Г 1 сырой массы | I % к контролю

0,5 69 + 5 32 + 1 5 1 1 47

1 200 + 10 120 + 1 8 I 1 60

1,5 427 + 15 210 + I 10 | 1 49

2 550 + 22 301 + 1 14 | I 55

2,5 540 + 25 414 + 1 15 | I 77

3 642 + 23 511 + 1 19 I 1 80

3,5 742 + 26 587 + 1 24 | 1 79

4 996 + 27 678 + 1 20 | 1 68

4.5 1100 + 30 875 + 1 28 | 1 81

5 1200 + 32 983 + 1 23 | 1 82

5,5 1300 + 40 1100 + 1 30 1 1 84

6 1400 + 45 1200 + 1 35 | 1 84

3,5-4 раза). Уровень активности фермента из пшеницы и кукурузы менялся в меньших пределах (в 1,5-1,8 раза). Следовательно, для растений с

более высоким уровнем организации метаболизма характерна большая устойчивость изучаемой МДГ-системы к стрессовым воздействиям.

Сходные результаты были получены при изучении реакции МДГ-системы на температурный стресс у проростков кукурузы, выращенных при 45°С (контроль - 25°С). Было установлено, что в первые 3 часа инкубации активность МДГ и интенсивность декарбоксилирования экзогенного 1,4-14С-малата снижались, а впоследствии незначительно превышали контрольные значения (рис.7).

При изучении распределения радиоактивной метки из 2,3-14С малата в органические кислоты через 24 часа инкубации установлено, что при высокой температуре интенсифицируется метаболизация яблочной кислоты. При этом наблюдается неравномерное распределение радиоактивной метки среди дикарбоновых и трикарбоновых кислот. Обнаружено значительное увеличение радиоактивности цитрата (270 % от контроля), изоцитрата (133%) и снижение включения 14С метки в дикарбоновые интермедиаты ЦТК (сукцинат 90 %, фумарат - 79 %). Наблюдается также резкое снижение радиоактивности глиоксилата (40% от контроля).

Таким образом, одним из возможных путей адаптации к повышенной температуре является мобилизация пула малата через оксидредуктазные и декарбоксилирующие малатдегидрогеназы, приводящая к синтезу восстановительных эквивалентов. Т.к. активность малатдегидрогеназной системы потенциально значительно выше, чем аконитазной и изоцитратдегидроге-казной систем, эти реакции становятся лимитирующими для дальнейшего функционирования ЦТК и приводят к накоплению трикарбоновых кислот (Moller,Palmer,1984, Wiskich, Dry,1985).

Солевой и тепловой стрессы вызывали увеличение количества изо-Ззерментов в различных органах кукурузы, пшеницы и вольфии. Наибольшее дзменение изоэнзимного состава обнаружено нами в щитках кукурузы, где тод действием стрессора синтезировалось 4 новых изофермента (рис.8). Некоторыми авторами также было обнаружено изменение изоэнзимного зпектра МДГ в органах табака и махериуса при их выращивании в разных тепловых режимах (De John,1973; Moore, Szarek,1983; Nainawatee,1972), a з пшенице при повышении концентрации солей в среде.

Образование новых молекулярных форм малатдегидрогеназы может объяснять и значительные осциляции активности этого фермента в первые Ii часа солевого стресса. По-видимому, адаптационная реакция малатдегидрогеназной системы заключается в синтезе максимально широкого

спектра изоферментов, обладающих различными кинетическими характеристиками и зависимостью их активности от ионной силы раствора. Появление новых изоформ приводит к изменению суммарной скорости окисления малата или восстановления оксалоацетата, что позволяет максимально приспособить энергетическую систему клетки к меняющимся условиям среды и перейти на новый стационарный устойчивый уровень функционирования.

Возможность дифференциальной активации репрессированных генов, несущих информацию о изоферментах МДГ,подтверждают результаты исследования влияния обработки семян кукурузы синтетическим ретардантом. После 24-часовой инкубации семян с 2, 3-дихлоризобутиратом в корнях j щитке четырехдневных проростков кукурузы появлялись новые изоформы (рис.9) МДГ и возрастала концентрация отдельных существовавших ранее изоферментов. С использованием меченых предшественников (2-14С-гли-цин) было показано, что синтез этих белков идет de novo.

л н о о

33 W

о е

ж о

са &

ш О

о ■Эч

н «

о)

ч

гэ

о

0,5

1,0

в

0,5

о) El

о

11,0 о

2

3

п

А-щкток кукурузь:;

Б-корни кукурузы;

В-листья кукурузы; Г-таллом вользии.

I-контроль; 2-экспозищ 3 часа; З-эксиоэиция 1< 4-контроль; 5-экспозкш 6 часов.

в

г

Рис.8. Влияние солевого стресса на изо^ерментный состав МЛ из кукурузы и больший.

О

Рис.9. Электрофорегракмы МДГ кукурузы.

■1 - контроль. 2 - 4-чассвая инкубация в ДХИ5.

3 - 20-часоЕая инкубация в ДХИБ.

А - щиток (2-й день). Б - щиток (3-й день).

В - корень (4-й день).

Регуляция биосинтеза изсферментов МДГ и АГ

Белковый полиморфизм и дифференциальная активация генов малатде-гидрогеназы обусловливают возможность ее индуцированного синтеза. Субстратная индукция МДГ описана для грибов и бактерий (На et al.,1982, Sutherland, Мс Allster-Henn, 1985), однако была неизвестна для высших растений. Нами было показано, что при выращивании растений в присутствии малата происходит индуцированный синтез дополнительных изоферментов МДГ. Наибольший эффект на активность и изоэнзимный спектр МДГ растений оказывают О, 25 и 0,5 % растворы малата (рис.10). Фумарат и цитрат в тех же концентрациях вызывают незначительные изменения. Возрастание активности МДГ под действием экзогенного малата происходит за счет митохондриальной и глиоксисомальной изоформ.

малатом.

Злектрофоретические исследования показали, что в щитках индуцированных растений появляются 5 дополнительных изоформ, имеющих специфическое внутриклеточное распределение (рис.11).

Для выявления механизма возрастания активности МДГ в щитках кукурузы под действием экзогенного малата была проведена инкубация контрольных и опытных растений в 0,05 М растворе 2-14С-глицина. После этого осуществлялась пятистадийная очистка изоферментов МДГ из мито-хондриально-глиоксисомальной фракции щитка контрольных и опытных растений . Анализ распределения радиоактивной метки показал, что при выращивании растений в присутствии малата происходит индуцированный синтез de novo дополнительных изоферментов МДГ.

Наличие субстратной индукции также характерно для аконитатгидра-тазы из подсолнечника. Интересно, что индукция аконитатгидратазной активности осуществлялась под действием среды выращивания, содержащей ацетат или цитрат (рис.12). С использованием радиоактивной аминокислоты 2-14С-лейцина и последующей очистки установлено, что наблюдаемый эффект усиления активности АГ обусловлен синтезом фермента de novo.

л •

н

о

0

1

3

м о

§3 и о <и

£

о

о >а< о

Гц

и

ш

3

к л

4 0) в й о о я н о

0,5

0,5

2 а

553

23

—"

— —

— —

—

щт

га мая

на

гз

!2Э

ЕЭ

СЭ

Рис.11. Электрсфореграммы МДГ из проростков кукурузы сорта Воронежская 76, выращенных в разных питательных средах

A. Этиолированные листья. 1. Нг0. 2. 0,25 % малата,

3. 0,5 % малата.

Б.Корни. 1. Н20. 2. 0,25% малата. 3. 0,5% малата.

B. Щиток. 1. Н20. 2. 0,25% малата. 3. 0,5% малата.

4. 0,5 % малата, 50 мкМ актиномицин Д.

5. 0,5 % малата, 50 мкМ циклогексимид.

Наличие индуцированного синтеза МДГ и АГ в высших растениях подтверждает результаты исследования влияния на этот процесс ингибиторов белкового синтеза. Актиномицин Д (50 мкг/мл) и циклогексимид (10 мкг/мл) приводили к полному снятию индуцирующего эффекта и сокращению изоферментного спектра МДГ и АГ. Уровень концентрации малата и цитрата внутри клеток определяет функциональное состояние изучаемых ферментных систем и обуславливает количественный и качественный изо-

5

4

2

I

ферментный состав МДГ и АГ.

Зависимость функционального состояния МДГ от метаболических потребностей растений была установлена при изучении генезиса этой ферментной системы в высоко- и низкомасличных линиях кукурузы сортов Зубовидная белая и Зубовидная желтая. В щитках высокомасличных лини] наблюдается более высокая активность (на 10-15 %) МДГ. При этом электрофоретический анализ показал, что малатдегидрогеназная систем; высокомасличных растений характеризуется меньшим белковым полиморфизмом, чем низкомасличные линии. Так в щитках низкомасличных лини! К-15573 выявляются 8 изоформ фермента, а в этих же органах высокомасличной линии кукурузы К-15544 6 изоферментов. Данные о субклеточно]

3

о о я ё

о

Ги

о и

И м

а т а к->

о ьй га

л

И О О

я к

Е-•А

6,0

5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 о

/ \ \ . —

2 У \ \ \ \ N

I с' / -ч

4 3

—II— II-II—

Рис.12. Влияние ингибиторов белкового синтеза на индуцировании

синтез аконитазы в семядолях подсолнечника 1 - вода; 2 - ацетат 0,05 55; 3 - ацетат 0,05 % + циклогексими, (5 мкг/мл); 4 - ацетат 0,05 % + актиномицин Д (10 мкг/мл).

Таблица 3

Субклеточная локализация малатдегидрогеназы щитка проростков высокомасличной линии К-15544 сорта Зубовидная желтая

Субклеточная | Обшая | Удельная |

фракция | активность | активность [ % активности | ФЕ. | ФЕ/мг белка |

Цитозоль 13,5 + 1,08 1,8 + 0,06 58,4

Надосадочная

жидкость гра- 6,9 + 0,08 2,6 + 0.02 29,9

диента

Митохондрии 1,3 + 0,06 3, 1 + 0,04 5,6

Этиопласты 0,3 + 0, 01 0,8 + 0,02 1,3

Глиоксисомы 1.1 + 0,03 2,2 0,05 4,8

Таблица 4

Субклеточная локализация малатдегидрогеназы щитка проростков низкомасличной линии К-15573 сорта Зубовидная желтая

Субклеточная | Общая | Удельная |

фракция | активность | активность | % активности | ФЕ | ФЕ/мг белка |

Цитозоль 12, 3 + 0, 18 2, 2 + 0,08 68,3

Надосадочная

жидкость гра- 4,4 + 0. 09 2.4 + 0,05 24,4

диента

Митохондрии 0.5 + 0, 02 1,8 + 0,04 2,8

Этиопласты 0,2 + 0, 0 0,5 + 0,01 1,1

Глиоксисомы 0,6 + 0,03 1,5 + 0,06 3,3

локализации МДГ в этих линиях кукурузы (табл.3,4) показывают, что уровень активности МДГ в митохондриях и глиоксисомах щитков высокомасличных растений превышает содержание фермента в соответствующих компартментах низкомасличных линий на 110 и 62 %. Следовательно увеличение активности МДГ в щитке высокомасличной линии осуществляется за счет молекулярных форм, локализованных в митохондриях и глиоксисомах, т.е. обусловлено активацией дыхательных и мобилизационных процессов.

Вероятно, что у высокомасличных линий усиление продуцирования ацетил-КоА обусловливает доминирование отдельных изоформ МДГ, способных более интенсивно их метаболизировать. Мобилизация липидов во время прорастания семян обеспечивается меньшим числом молекулярных форм фермента. Пониженное содержание липидов интенсифицирует мобилизацию других форм запасных веществ (в первую очередь, углеводов). Это, в свою очередь, определяет потребность в новых специфических изоферментах МДГ-системы, необходимых для обеспечения функционирования этих процессов.

Таким образом, разные линии и сорта кукурузы могут нести приблизительно одинаковую информацию для синтеза изоферментов МДГ, которая может экспрессироваться в той или иной степени в зависимости от уровня специализации клеточного метаболизма. При этом углубление такой специализации, по-видимому, всегда сопровождается уменьшением диапазона экспрессирующихск в клетке молекулярных форм ферментных белков, в том числе МДГ.

В серии опытов по исследованию митохондриального генетического контроля за синтезом органельной МДГ показана возможность двойного кодирования гетерологического митохондриального изофермента. Физиологически активные митохондрии выделяли из эндосперма клещевины (Войни-ков и др.,1986) и инкубировали в среде, содержащей 2-14С-лейцин, 0,1% эритромицин, все необходимые для биосинтеза белка аминокислоты, АТФ и фосфоенолпируват (Шея,1985; Palmer,1985).

Наибольшее увеличение активности МДГ наблюдается в митохондриях, инкубированных в среде, несодержащей эритромицина. После 4-х стадийной очистки (табл.5) установлено, что удельная активность митохондри-альной МДГ возросла до 89 ФЕ/мг белка. Электрофоретический анализ препарата указывает на гомогенность полученной митохондриальной МДГ и на-присутствие в ее молекулах 2-14С-лейцина.

Исследование распределения радиоактивной метки между субъедини-

цами митохсндриальной МДГ с помощью электрофоретического разделения в присутствии додецилсульфата натрия, что практически вся радиоактивность обнаруживается в "тяжелой" субъединице МДГ (1000 имп/мин), тогда как в "легкой" субьедикице - лишь следовые количества. Полученные данные свидетельствуют о митохондриальном происхождении "тяжелой" субъединицы МДГ и,следовательно, о двойном (ядерном и митохондриальном) контроле синтеза митсхондриальной МДГ.

Таблица 5

Очистка и исследование включения меченого 2-14С-лейцина в МДГ из инкубированных физиологически активных митохондрий эндосперма клещевины

Стадия |Объем|Общая актив-1Белок, |Удель- |Радиоак-|Удельная) Сте-I мл. |ность,ЕД. | мг !нак акти-|тивность|радиоак-| пень | | | |вность, (фракций |тивность| очист

|Ед/мг ¡имп/мин |имп/мг | ки

Инкубированные 4,0 37,6± 23.5+ 1,6± 150240,0± 6393,2± 1,0 митохондрии 1,3' 3,6 0,02 238,0 840,5

Осаждение 1,5

(МН4)2304

21,8+ 1, О

17,8+ 1,2± 125600,0± 7056,2+ 0,8 3,1 0,02 79,5 1317,4

Фракционирование сульфатом аммония

1,5 19,3+

0,9

9,7+ 2,0+ 69900,0± 7206,2± 1,3 2,0 0,02 40,0 1228,4

Гель-фильт- 7,2 рация на й-25

18,0+ О, 3

2,3± 7,8+ 23300,0+ 2987.2+ 4.9 0,8 0,19 13,5 583,7

Ионно-

обменная 13,8 8,9+ хроматогра- 0,2

фия на ДЭАЭ-целлюлозе

0. 1± 89,0+ 1518, 0± 0,0 2,0 2,1

15180,0± 55,6 21, О

Очистка изоферментов малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы и их физико-химические свойства

С помощью разработанной схемы очищены до электрофоретически гомогенного состояния изоферменты МДГ из цитоплазмы, митохондрий, микротелец, этиопластов, эндосперма клещевины и щитка кукурузы. Харак-

Таблица 6

Очистка цитоплазматической малатдеидрогеназы из щитка кукурузы

Объем Активность Белок Удельная Степень

Стадия мл общая, ФЕ общий. активность очистки ВЫХОД,

очистки мг ФЕ/мг белка %

Гомогенат 22.0 240.0+6.0 99.90+1.20 2.40+0.02 1.00 100.00

Высаливание

(Ш4)гБ04 1.6 148.1+4.1 23.36+0.30 6. 50+0. 20 2.70 61.70

Гель-

фильтрация 9.2 150.7+2.8 20. 01+0. 21 7. 60+0. 10 3.20 62.80

на С-25

Хроматография

ДЭАЭ-

целлюлозе 8.0 61.7+1.3 0. 23+0. 01 268. 50+6. 02 111.90 25.70

Ультра-

фильтрация

под давле-

нием 1.3 41.2+1.1 0.12+0.01 355.20+15.90 148.00 17.20

Гель-

фильтрация

на 0-150 2.7 14.3+0.7 0. 01+0. 00 1305.10+55.10 543.80 6.00

терные результаты очистки цитоплазматической МДГ из щитка кукурузы приведены в табл.6. Полученный ферментный препарат обладал удельной активностью 1305 ФЕ/мг белка при 543-кратной степени очистки. При электрофорезе в полиакриламидном геле МДГ оказалась локализованной в

Таблица 7

Очистка индуцированной цитоплазматической МДГ из щитка кукурузы

N Стадия • Объем Актив- Общий Удельная Степень Выход очистки ность, белок, актив- очистки %

мл ФЕ мг ность,

ФЕ/мг белка

1 Гомогенат 25,0 220,0+ 8,О

2 50-70% 2, 0 136, 0± 6, О фракция

насыщения (NH4)2S04

3 Гель- 10,0 '142± 4,5 фильтрация

на сефадексе G-25

1 Хроматография

на ДЭАЗ- 7,0 65+ 1,3 целлюлозе

5 Гель-фильтрация на сефадексе

G-150 2.5 16± 0,5

102,0+2,0 2,05 1 100

6,6+ 0,7 5,23 2,55 61,8

25,2± 0,4 5,61 2.73 64,1

0,29+ 0,1 224,1 109,8 29,5

0.01± 0 1630 795,1 7,04

одной белковой зоне с 0,43. Сопутствующего белка выявлено не было, что свидетельствует о гомогенности ферментного препарата. При специфическом проявлении на активность обнаруживалась также одна белковая полоса с ИГ 0,43.

Впервые очищен до гомогенного состояния индуцированный экзогенным малатом цитоплазматический изофермент из щитков кукурузы (табл.7)

Таблица 8

Очистка аконитатгидратазы из зеленых листьев гороха

Стадия Обьем, Общий белок. Активность, Удельная Степень очистки мл мг ФЕ активность, очистки

ФЕ/кг

Гомсге- 320 3681,0+ 183,0 95,39+ 3,16 0, 025± 0,001 1

нат

(55-70)* 16 199, 0± 9,7 54,40± 1,71 0,273± 0, 009 10,5

Гель-

хромато-

графия

G-25 30 158,6+ 6,6 54,50+ 1,80 0, 344+ 0,011 13,3

(55-70)* 2,3 40,04+ 2,00 17,66+ 0,68 0, 441± 0, 017 17,0

Гель-

хромато-

графия на

сефадексах:

G-100 4, 470± 0,213 7,891+ 0,352 1,765± 0, 079 68,1

G-150J 0,5 0,171± 0,006 0,379+ 0,015 2, 217± 0, 088 85,6

G-1502 0,5 0,140+ 0,005 0, 490± 0,020 3, 506± 0, 143 135,4

G-1503 0,5 0, 163± 0,007 0,736+ 0,030 4,511+ 0, 184 174,2

G-1504 0,5 0,070+ 0,001 0, 329+ 0,012 4,690+ 0,171 180,0

G-150s 0,5 0,119+ 0,005 0, 542± 0,017 4,527+ 0, 143 174,8

*) фракция насыщения сульфатом аммония (%),

**) фракция насыщения сульфатом аммония {%) после обессоливания

Сравнение параметров очистки изоферментов МДГ показывает,что они сильно отличаются по своей удельной активности и каталитической эффективности. Величины удельных активностей цитоплазматических и глиоксисомальных МДГ из щитка кукурузы и эндосперма клещевины имеют близкие значения (1305 и 1355 ФЕ/мг белка). В то же время удельные активности митохондриальной (597,5 ФЕ/мг белка) и этиопластной (52,3 ФЕ/мг белка) в МДГ являются значительно более низкими.

С помощью иестистадийной очистки была получена электрофорети-чески гомогенная АГ из листьев гороха, щитка кукурузы и других растений (табл.8). Очищенные нами препараты фермента имели удельную активность в пределах 4,5-5,0 ФЕ/мг белка, что почти в 4 раза выше по сравнению с активностью аконитазы, выделенной из листьев горчицы (Palmer,1964). Однако эта характеристика на несколько порядков ниже удельной активности гомогенных препаратов МДГ из тех же растений. При этом высокоочищенные ферменты имеют удельную активность и чистоту, соответствующие характеристикам препаратов МДГ и АГ, выпускаемых фирмой "Sigma" (США). С учетом возможности длительного хранения МДГ по найденной нами методике, ферментативные препараты могут иметь широкое практическое применение.

Получение изоферментов в гомогенном состоянии позволило исследовать их Физико-химические свойства и регуляцию активности в растениях.

С использованием гель-фильтрации через сефадекс G-150 и диск-электрофореза в присутствии додецилсульфата Na установлено, что аконитатгидратаза является мономернкм белком, то есть состоит из одной субъединицы с моекулярной массой 95-105 кДа.

При изучении субъединичного строения изоэнзимов МДГ из эндосперма клещевины и щитка кукурузы были установлены как димерные, так и тетрамерные функционально активные молекулы фермента. Цитоплазмати-ческие, митохондриальная и глиоксисомальная МДГ являются димерными молекулами с молекулярной массой 65-90 кДа. Причем показано, что ми-тохондриальный изофермент из эндосперма клещевины состоит из двух неидентичных субъединиц с молекулярной массой 42 и 35 кДа. Этиопластная НАД+-зависимая МДГ из эндосперма клещевины представляет собой изоло-гический тетрамер с молекулярной массой 115,0+3,6 кДа.

Сравнение аминокислотного состава митохондриального, цитоплазма-тического и глиоксисомального изоферментов МДГ показывает наличие значительного сходства между этими белками, прежде всего в их качест-

венном составе. Отличия аминокислотного состава изоферментов заключается в'количественном содержании отдельных аминокислот. Так, в молеку лах глиоксисомальной МДГ содержится больше аспарагиновой кислоты, се-рина и валина, молекулы митохондриального изоэнзима обогащены лизином, треонином, глицином, цистеином, цитоплазматического - аланинок серином.

Каталитические свойства и регуляция активности малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы из высших растений

Изучение кинетических и каталитических свойств малатдегидроге-назной и аконитатдегидрогеназной систем показало, что составляющие их изоферменты отличаются между собой по рН и температурному оптимуму, каталитической эффективности, значениям Км и констант субстратногс ингибирования К3 г. При превращении субстратов изоферменты МДГ и АГ подчиняются кинетике Михаэлиса-Ментен.

Таблица 10.

Некоторые свойства аконитатгидратазы из разных компартментов кукурузы и подсолнечника

Органоид | Ки,мМ | Утах | Кн.мМ| Утах I рН

I I МКМ/Ш1п| I МКМ/Ш1П| оптимум

Изоцитрат | Цитрат

Листья цитоплазма 1,95 0,699 11,8 0,384 8,0 куку- Глиоксисомы 2,08 0,728 12,6 ' 0,360 8,0 РУЗЫ Митохондрии 1,88 0,840 26,3 0,410 7,2

Семя- Цитоплазма 1,82 0,985 12,8 0,522 8,0

доли Глиоксисомы 1,78 1,015 12,5 0,500 8,0

подсол- Митохондрии 1,90 0,928 19,4 0,398 7,8

нечника

Сродство к цитрату и изоцитрату у различно локализованных форм АГ имело особенности. Если сродство аконитазы из разных компартментов клетки к изоцитрату отличались незначительно, то по отношению к цитрату данная характеристика имела определенные отличия для изоформ этого фермента. При использовании в качестве субстрата лимонной кислоты значение Км составляло для цитоплазматической и глиоксисомальной АГ меньшую величину, чем для митохондриального фермента (табл.10). Для аконитазы из цитоплазмы и глиоксисом подсолнечника сродство к цитрату было в полтора раза выше, чем для фермента из митохондрий. Такая же примерно тенденция наблюдается в отношении цитрата у разных форм аконитазы из кукурузы. При этом следует подчеркнуть, что сродство к цитрату и изоцитрату у глиоксисомального и цитоплазматического фермента практически одинаково.

Для всех изученных изоферментов МДГ установлена общая закономерность в том, что их сродство к оксалоацетату значительно выше, чем к малату (табл.11), накапливающемуся в растительной клетке в значительных количествах (Шебг1е1а е1 а1.,19ЭЗ).

Отличия в сродстве изоферментов МДГ из эндосперма клещевины, щитка кукурузы к субстратам, а также чувствительность митохондриального и глиоксисомального белков к оксалоацетату и НАДН позволяют растению осуществлять регуляцию интенсивности протекания различных метаболических' процессов.

Как видно из данных, приведенных в табл.11, изоферменты МДГ отличаются между собой по зависимости их каталитической активности от концентрации ионов водорода в раствое. Полученные кривые описывают широкий рН оптимум, сдвинутый в щелочную область (от 7,5 до 10,0). Смещение рН оптимума МДГ для окисления малата в сторону щелочной области, по-видимому, имеет регуляторное значение. В физиологических условиях восстановление оксалоацетата протекает с максимальной скоростью и любое минимальное отклонение в значениях рН приводит к заметным изменениям в активности и сродстве МДГ для данного субстрата. Тогда как окисление малата в этой области рН осуществляется в условиях, когда энзим еще не насыщен и не достиг максимальной скорости реакции, поэтому любые отклонения в сторону увеличения рН приводят к ее возрастанию.

Исследование влияния температуры на параметры переходного состояния фермент-субстратного комплекса МДГ показывает, что для реакции восстановления оксалоацетата график Аррениуса в интервале температур

Таблица 11

Физико-химические и кинетические свойства малатдегидрогеназы из разных источников

Изофорыа МДГ Мапат рН- Оксало-ацетат Окисление малата Восстановление оксалоацетата Окисление малата Восстановление оксалоацетата

оптимум рн- оптимум малата мМ н!Лд+ мы Кр, окса-лоацетат мм нХдн мМ Кз; малата мМ моль 1 оксалоацетата мМ 1С, НАДН мМ моль

Цитоплазматическая из щитка кукурузы 9.5 8,5 18,2 0,13 2 0,10 50,0 - 4,5 - 11,0

Индуцированная цитоплазматическая из щитка кукурузы 9,2 8,5 12,5 0,10 3,9 0,10 43,0 - 4,2 - -

Митохондр иальная из эндосперма клещевины 9,0 8,0 5,8 0, 56 1.4 0. 25 34,6 9,3 3,9 0, 53 5, 4

Глиоксисомальная из эндосперма клещевины 9.25 8,25 34,6 0.87 1,9 0,36 97,1 34,3 4,1 0,71 13,0

Зтиопластная из эндосперма клещевины 10,0 8,5 25,1 0,93 0,6 0,45 - 8,8 - - -

Цитоплазматическая из эндосперма клещевины 9,4 8,4 20,3 0,16 2,1 0,11 46,0 - 4,8 - -

Рис.13. Влияние температуры на активность мктохондркальноГ-МДГ из эндосперм клещевины. А - восстановление оксалоацетата Б - окисление малата

от 0 до 50° описывается ломаной линией с одной точкой изгиба. Следовательно, фермент катализирует эту реакцию в двух разных конформаци-онных состояниях, зависящих от температуры среды. Для реакции окисления -малата график Аррениуса представлял прямую линию, т.е. МДГ функционирует в одном конформационном состоянии (рис.13).

Отрицательные значения ДБ (энтропии) указывают, что при каталитическом акте происходит значительное упорядочивание фермент-субстратного комплекса . Для растительной АГ установлено существование во время каталитического акта одного конформационного состояния.

Исследования показали, что изоферменты МДГ имеют различную чувствительность к соединениям нуклеотидной,природы. АТФ, АДФ и АМФ влияют на скорость прямой и обратной реакции митохондриальной и глиокси-сомальной МДГ. Эффективность действия этих соединений уменьшается согласно ряду АТФ-АДФ-АМФ . При этом митохондриальный фермент проявляет большую чувствительность к АТФ, чем глиоксисомальный. Для ци-

6 V

5 / 'I

4 /

3 /

2 / /

I

-3-2-1 С I 2 3 4 5

.мкн-Гу^/МКМ

т

г I

1 1

1 1

1

1 1

1 1 —и ж i

-8 -С -4 -2 0 2 4 6 8 10 12

Рис. 14. Определение К; аконитазк из листьев гороха транс-аконита

А - субстрат цитрат; I - концентрация 1к2Д; 2 - концентр

ция 4мМ. Е-субстрат цис-аконитат. I-концентрация ЬМ; 2-концентрация

00

30

30

40 20 0

-0,5 -I

-1.5

1п А/А 0 -—12

-3

) 2 4 е 3 10 12 минуты

— 10м?," бутандион —+ 6мМ бутандион <г-*-2ъ&\ бутандион

О Г)

4 5 6

20 30

30

:о

10 20 0

\ч 1

\

\

0 2 4 6 —- 10м?Л бутандион

8 10 минуты

7 8 3 10 минуты

— Юм",'" бутандион

— + 6м."," бутандион, -й- 2м?' бутанцио:

О I" ,А/Ао,

-0,5 -I

-1,5

8 10 12 • минуты

ТСмМ бутандион

—+

10м№ <5утандион+3,5мМ 0А —+10кМ бутанцкон+ 3,£мМ О Я

I0r.iV. бутанцион+0,М 11АД1 н*Л(М! бутандион+0,1гл!а

Рис.15. Кинетика инактивации цитоплазматической МДГ из щитка кукуруз! бутандионом /для восстановления оксалоацетата/.

топлазматической МДГ показано практически полное отсутствие влияния АТФ в физиологических концентрациях.

Цитоплазматический и глиоксисомальный изоферменты оказываются более устойчивыми к высоким концентрациям НАДН, чем митохондриаль-ная МДГ. Такая регуляция метаболических процессов, связанных с запасанием энергии в виде макроэргических связей и синтезом восстановительных эквивалентов, обусловливает соотношение и направление анаболических и катаболических реакций и их сопряжение в растительной клетке.

■ Изоферменты АГ и МДГ обладали различной устойчивостью к метаболитам (транс-аконитовая, малоновая, фумаровая, гликолевая и др.кислоты). Так, обнаружено, что аконитатгидратаза ингибировалась по конкурентному типу транс-аконитатом (рис.14), проявляя при этом во много раз большую устойчивость, чем фермент из животных тканей.

Фумарат и малонат оказывают наибольшее ингибирующее действие на активность этиопластной МДГ,'по сравнению с другими изоферментами. Из полученных данных делается заключение о различной роли изоферментов МДГ и АГ в характерном только для растений накоплении органических кислот.

Идентификация функциональных групп специфическими ингибиторами показала, что в активный центр входят по два остатка аргинина (рис.15' и гистидина и по одному радикалу лизина и цистеина.

На основании полученных данных предлагается гипотетическая модель активного центра и механизм каталитического превращения малата. Важная роль в котором определяется парой гистидин-лизин, участвующих в атаке и переносе гидрид-ионов из молекул малата на А-сторону че-вертого положения кольца НАД+.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Регуляция клеточного метаболизма растений основывается на изменении активности ферментативного аппарата клетки, осуществляющегося на надмолекулярном или функционально-молекулярном уровне. При адаптации клеточного метаболизма к факторам внешней среды важное место занимают ферменты, способные реагировать на изменение микроокружения, а также чувствительные к влиянию различных медиаторов.

Полученные в нашей работе данные позволяют отнести к числу таких

регуляторных белков малатдегидрогеназную и аконитаттидратазную ферментные системы. Эти ферменты имеют универсальное распространение в природе. Так,нами обнаружена активность МДГ и-АГ в разных органах 35 видов растений, величина которой колебалась в пределах одного порядка. Это объясняется участием изучаемых ферментов в обеспечении функционирования цикла трикарбоновых кислот, глиоксилатного цикла и других физиолого-биохимических процессов.

Растительная малатдегидрогеназная и аконитатгидратазная системы отличаются от ферментов бактериального и животного происхождения своим полиморфизмом и мультифункциснальностью.

Проведенные нами исследования показывают, что генезис активности, изоферментный состав МДГ в растениях определяются их видовыми и сортовыми признаками, а также типом основного обмена. Максимальная активность МДГ и АГ наблюдается на первых этапах онтогенеза в запасающих органах и молодых быстрорастущих тканях растений, причем активность ферментов выше в тканях высокомасличных растений, что обусловлено участием АГ и МДГ в функционировании глиоксилатного цикла.

Анализ изоферменткого состава изучаемых ферментных систем свидетельствует о большой сложности внутриклеточного распределения МДГ. Максимальное количество изоформ МДГ (9) обнаружено в кукурузе, она локализована в глиоксисомах, пероксисомах, митохондриях, пластидах и цитоплазме. Изоферментный спектр МДГ разных растений зависит от уровня дифференциации тканей, метаболических потребностей и условий развития организма.

Анализ литературных данных и наших исследований показывает, что ложность МДГ-системы определяется также эволюционным уровнем организма и пространственной организацией метаболизма.

Исследования влияния различных стрессовых факторов на ферментные системы свидетельствуют,что они вызывают либо перестройку изоферменткого спектра и синтез de novo дополнительных молекулярных форм фермента, либо изменение каталитических характеристик существующих изо-энзимов.

Так,при изучении влияния газовой среды на малатдегидрогеназную и аконитатгидратазную системы было установлено, что избыток в атмосфере С02 вызывает ингибирование растительной аконитатгидратазы. Для изо-ферментов МДГ показано наличие синергической конкурентной активации углекислым газом, определяющее изменение каталитической эффективности МДГ и сдвигающее равновесие данной ферментативной реакции в стрессо-

вых условиях (Milthouse, Wlsklch, 1986).

Ответная реакция растительной малатдегидрогеназной системы на солевой и тепловой стрессы носила сходный характер. Динамика изменения активности МДГ соответствовала классической реакции на стрессовые условия (Селье,1968) и выражалась в снижении в первые 3 часа общей активности и скорости утилизации меченого радиоактивного малата к последующего их повышения и стабилизации на более высоком уровне.

Механизмом изменения активности при солевом и тепловом стрессе является синтез дополнительных изоферментов МДГ.Образование новых молекулярных форм малатдегидрогеназы может объяснять и значительные осцилляции активности этого фермента в первые 24 часа солевого стресса. По-видимому, адаптационная реакция малатдегидрогеназной системы заключается в синтезе максимально широкого спектра изоферментов, обладающих различными кинетическими характеристиками и зависимостью их активности от ионной силы раствора. Появление новых изоформ приводит к изменению суммарной скорости окисления малата или восстановления ок-салоацетата, что позволяет максимально приспособить энергетическую систему клетки к меняющимся условиям среды к перейти на новый стационарный устойчивый уровень функционирования.

Увеличение активности и синтез новых изоформ изучаемых ферментов вызывается повышением концентрации экзогенных субстратов. Возрастание активности МДГ и АГ в растениях связано не с простой активацией, а с синтезом этих ферментов de novo.

Возможность индуцированного синтеза непосредственно связана с избыточностью генетического материала в растительной клете. Так для МДГ Гудман и др. и Ньютон, Шварц обнаружили 6 ядерных и 3 митохондри-альных гена, ответственных за синтез этого белка. АГ кодируется 4 ло-кусами, причем цитоплазматический и митохондриальный изоферменты детерминируются различными генами.

Молекулярные основы механизма индуцированного синтеза МДГ и АГ пока не установлены, однако можно предположить, что влияние индуктора на клеточный геном может осуществляться двумя различными путями. Во-первых, индуктор действует непосредственно на состояние оперона, возможно функционирующего у эукариот, то есть по механизму, предложенному Жакобом и Моно. Сложность эукариотического генома и его распределение между компартментами делают более реальным другой механизм - опосредованное влияние малата на геном с помощью различных медиаторов, возможно имеющих белковую природу. Повышение концентрации малата

внутри клетки может привести к изменению электрохимического потенциала клеточных мембран и режима работы специфических рецепторов, способных послать в ядро соответствующие сигналы о состоянии среды.

Исследование митохондриального генетического контроля синтеза органельной МДГ показало возможность двойного наследования при образовании гетерологического изофермента. Митохондриальный геном регулирует синтез "тяжелой" субъедикицы данного изоэнзима. Это подтверждается наличием генов, кодирующих МДГ, в хондрисме. Для окончательного решения вопроса о наличии двойного генетического контроля органельных изоэнзимов МДГ необходимы локализация и секвенирование органельных генов и сравнительный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности.

Для исследования механизмов регуляции активности изоферментов МДГ и АГ на функциональном уровне были разработаны способы их выделения и очистки. Значения молекулярных масс АГ из различных растений-близки, а изученный фермент является мсномерным белком, то есть состоит из одной субъединицы. Большинство изоферментов МДГ представляют собой димерк с молекулярной массой в пределах от 60 до 90 кДа. Только эти-опластная МДГ имеет тетрамерное строение. Изофермекты МДГ из эндосперма клещевины и щитка кукурузы представляют собой изологические олигомеры. Исключение составляет митохондриальный фермент, имеющий гетерологическую структуру, и состоящий из двух неидентичных субъединиц с молекулярной массой 42 и 35 кДа. Отличие аминокислотного состава митохондриальной, цитоплазматической и глиоксисомальной изоформ МДГ свидетельствует о различной генетической детерминированности молекулярных форм. Следовательно, изучаемые изоформы МДГ являются истинными изоферментамм.

Изучение кинетических и каталитических свойств малатдегидроге-назной и аконитатгидратазной систем показало, что составляющие их изоферменты отличаются между собой по рН и температурному оптимуму, каталитической эффективности,значениям Км и констант субстратного ингибирования К3!.

Особый интерес представляют данные, полученные при изучении физико-химических свойств индуцированной дополнительной изоформы МДГ, выделенной из цитоплазмы щитка кукурузы. Полученный электрофоретичес-ж гомогенный препарат имеет тот же уровень удельной активности, значение молекулярной массы, димерное изологическое строение,что и конститутивная цитоплазматическая МДГ. Но при этом обнаружено возраста-

ние почти в 1,5 раза сродства изофермента к малату и одновременное увеличение значения Км по оксалоацетату, что указывает на смещение равновесия катализируемой реакции в сторону образования оксалоацета-та. Об этом же свидетельствует увеличение сродства дополнительного изофермента к НАД+. Впервые полученные кинетические характеристики индуцированной изоформь: МДГ подтверждают ванную роль малатдегидроге-назной системы в адаптивной реакции растительного организма. Физиологическим смыслом синтеза нового изофермента является, по нашему мнению, эффективная мобилизация пула малата для энергизации растительной клетки/ поставки углеродных скелетов для биосинтетических процессов и образования осмолитов (оксалсацетат).

Поскольку малат и цитрат являются основными запасными органическими кислотами, чрезвычайно важна их роль в первичной реакции на стрессовые условия из-за возможности их быстрой утилизации. Полученные нами данные показывают несколько уровней регуляции метаболизма этих органических кислот, в том числе возможность несинхронного функционирования двух ветвей цикла Кребса. Различия кинетических характеристик (удельной активности, числа оборотов фермента, констант Михаэ-лиса и' ингибироваиия различными интермедиатами и др.) обеспечивают возможность раздельной регуляции двух его половик и их разную интенсивность. Результатом может быть отток субстратов одной половины цикла на анаплеротические реакции, во многом определяющие адаптацию растений на изменение факторов внешней среды.

Наши исследования позволяют представить гипотетическую модель участия малатдегидрогеназной системы в адаптации растительных организмов к стрессовым воздействиям. Стрессоры различной природы вызывают синтез новых изоферментов МДГ, обусловленный экспрессией репрессированных генов. В механизме реализации генетической избыточности, по-видимому, ключевая роль принадлежит концентрационным колебаниям яблочной кислоты (Рис.16).

ядро

вдг

ЭТИО(АЛОРО)ПЛАСТ

к*, сл

Рис.16.

Гипотетическая схема участия малатдегидрогеназной системы в адаптации растения к изменению факторов внешней среди

Гонституитивная (МДГ) и индуцибельная (МДГХ) малатдегидрогеразы

-- активация; —■—торможение; —сильное торможение;

СО - изологический димер; сф - готерологическия димер; Со - изологический тетрамер

Предположение о ключевой роли малата в регуляции экспрессии генетической информации было подтверждено в модельных опытах по индуцированному синтезу изоферментов МДГ в высших растениях. Синтез новых изоформ имеет два основных значения.

Во-первых, открывает возможность для компенсаторной адаптации, т.е. поддержание в изменившихся условиях характерного для данного вида гомеостаза. Это предполагает биохимические изменения, восстанавли-вающие-'функциональные способности организма до их прежнего уровня. Во-вторых, определяет потенциальную возможность для эксплуатативной адаптации, т.е. биохимической трансформации, которая может открыть перед организмом совершенно новые возможности использования окружающей среды. Наличие значительного количества изоферментов МДГ, определяет потенциальную возможность системы к расщеплению метаболических потоков, что обусловливает возможность генерации альтернативных путей с предпочтительным участием определенного изофермента. Это способствует усложнению структуры метаболических путей и формированию дополнительных потоков, что может привести к возникновению новых свойств организма, имеющих приспссобиельное значение.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Малатдегидрогеназная и аконитатгидратазная ферментные системы растительной клетки характеризуются наличием различно компартментали-зованных форм, обладающих специфичной субклеточной локализацией. Активность и количество изоформ изучаемых ферментов, находящихся в отдельных компартментах, обусловливается метаболическими, тканевыми, возрастными и видовыми особенностями. Выявлена зависимость изофер-ментного состава МДГ от эволюционного уровня организма и пространственной организации метаболизма.

2. В высокомасличных линиях кукурузы глюконеогенез осуществляется меньшим числом молекулярных форм МДГ, чем в низкомасличных линиях. Увеличение количества изоформ МДГ обусловлено тем, что в низкомасличных линиях, кроме утилизации липидов, интенсифицируется метаболизацкя других форм запасных веществ. Белковый полиморфизм МДГ может быть использован в качестве маркера в селекционных исследованиях.

3. Стрессовые факторы различной природы вызывают перестройку

изоферментного спектра МДГ, обусловленную появлением дополнительных молекулярных форм фермента или (и) изменением каталитических характеристик существующих изоэнзимов. солевой и тепловой стрессы вызывают синтез 4-х дополнительных изоферментов. Обработка семян синтетическим ретардантом (2,3 дихлоризобутират) приводит к появлению двух новых изоформ. Синтез дополнительных изоферментов МДГ происходит de novo.

АГ реагирует на стресс изменением активности, но при этом ее изоферментный состав остается постоянным.

4. Впервые установлено, что малатдегидрогеназная и аконитатгид-ратазная ферментные системы в высших растениях являются индуцибельны-ми. Индуктором МДГ является малат. вызывающий синтез новых дополнительных и изменение активности существующих изоформ. Для АГ показано-, что индукция под действием экзогенного цитрата и ацетата, приводит к повышению активности цитоплазматического и глиоксисомального изоферментов.

5. Получены электрофоретически гомогенные препараты цитоплазма-тической, митохондриальной, этиопластной и глиоксиссмальной изоформ МДГ. Исследования аминокислотного состава, физико-химических и кинетических характеристик показали, что выделенные молекулярные формы МДГ являются истинными изоферментами, т.е. генетически детерминированными белками. Изоферменты МДГ представляют собой изологические ди-меры с молекулярной массой 65-85 кДа. Исключением является этиоп-ластная МДГ, имеющая тетрамерное строение (115 кДа).

6. Митохондриальная МДГ из эндосперма клещевины и щитка кукурузы является гетерологическим димером (молекулярная масса субъединиц 43 и 47 кДа). Впервые установлено, что синтез "тяжелой" субъединицы контролируется хондриомом, а "легкой" - ядерным геномом.

7. Аконитатгидратаза из высших растений имеет мономерное строение с молекулярной массой 100-108 кДа. Митохондриальная и цитоплазма-тическая изоформы, имея сходные физико-химические свойства, отличаются по электрофоретической подвижности, кажущимся Км. рН-оптимумам и чувствительности к различным концентрациям органических кислот.

8. Адениновые нуклеотиды не принимают непосредственного участия в регуляции растительной АГ. Активность малатдегидрогеназной системы зависит от уровня НАД/НАДН и АДФ/АТФ в клетке. При этом характер их регуляторного воздействия зависит от локализации изоформ МДГ. Наибольшую чувствительность проявляют органелькые изоферменты, что играет роль в обеспечении регуляции соотношения анаболических и катаболи-

ческкх процессов. Определенный вклад в регуляцию- активности изофермен-тов МДГ и АГ вносят транс-аконитат, фумарат, малонат, глиоксилат, двух- и одновалентные ионы металлов. Устойчивость растительной АГ и МДГ к органическим кислотам выше, чем ферментов животного и бактериального происхождения.

9. Изучены активные центры растительных МДГ и АГ. В состав активного центра МДГ входят по два остатка аргинина и гистидина и по одному лизина и у митохондриального изофермента - цистеина. В активном центре растительной АГ в отличие от животного и бактериального ферментов не обнаружено остатков цистеина и ионов Ге2+.

10. Впервые получен электрофоретически гомогенный препарат индуцированной изоформы МДГ из кукурузы. Этот изофермент отличается кинетическими и каталитическими свойствами от конститутивной МДГ. Обнаруженное повышение сродства к малату и Км по оксалоацетату указывает на возможность смещения равновесия катализируемой реакции в сторону образования оксалоацетата, приводящее к эффективной мобилизации пула малата и энергизации растительной клетки, поставке углеродных скелетов для биосинтетических процессов.

И. Стрессоры различной природы вызывают синтез широкого спектра новых изсферментов малатдегидрогеназы. В механизме реализации генетической избыточности важная роль, по-видимому, принадлежит повышению концентрации яблочной кислоты. Синтез дополнительных изоферментоз дает возможность для компенсаторной адаптации, т.е. поддержания характерного для данного вида гомеостаза, и для эксплуатативной адаптации, заключающейся в возможной генерации альтернативных метаболических путей.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Монографии

1. Землянухин А.А.,Землянухин Л.А.,Епринцев А.Т.,Игамбердиев А.У. Глиоксилатный цикл растений.Воронеж,Изд-во ВГУ.1986. 148с.

2. М.А.А.Пинейру де Карвалью, Землянухин А.А., Епринцев А.Т. Малат-дегидрогеназа высших растений. Воронеж: Изд-во ВГУ,1991.215с.

Экспериментальные работы

3. Землянухин Л.А., Епринцев А. Т. Индукция аконитатизомеразы у высших растений //Докл.АН СССР.1979.Т.246. N4. С.1020-1023.

4. Землянухин Л.А.,Епринцев А.Т. Простой метод обнаружения и определения относительной активности аконитатизомеразы в растениях.// Физиол. раст. 1979. Т. 26. В. 4. С. 873-876.

5. Землянухин Л.А.,Епринцев А.Т. Индуцированный синтез аконитатизомеразы в различных видах растений. //Фотосинтез,дыхание и органические кислоты. Воронеж: Изд-во ВГУ.1980.С.106-112.

6. Zemlyanukhin L.A., Eprlntsev А.Т., Suvorova I.М. Regulation of trans-aconitate exchange in plants //Abstracts 6th joint symposium of the biochemical societies of the GDR and USSR.-Tallin, 1981.-P.17.

7. Епринцев А. Т.,Землянухин Л.A., Суворова И.М. Новый метод определения активности аконитатгидратазы в растениях// Регуляция физиологических процессов. Воронеж: Изд-во ВГУ.1982.С.51-56.

8. Землянухин Л.А.,Епринцев А.Т.,Игамбердиев А.У. Выделение, очистка и некоторые физико-химические свойства аконитатгидратазы из кукурузы/научные доклады высшей школы. Биол. науки.1982.N 10.С.77-82.

9. Епринцев А. Т., Землянухин Л.А.,Игамбердиев А.У. Физико-химические свойства аконитатгидратазы из различных компартментов растительной клетки. //Труды ХШ конференции молодых ученых биологического ф-та Московского университета. 1982. 4.2. N 5150-82.С.157-162.

10. Епринцев А.Т. Индукция аконитазной активности в семядолях подсолнечника. Там же,с.163-167.

11. Землянухин А. А., Епринцев А.Т.,Землянухин Л.А. Очистка аконитат-

. гидратазы из семядолей подсолнечника.//Ферменты, ионы и биоэлект-

рогенез у растений. Горький: Изд-во ГГУ.1982.С.32-36.

12. Землянухин Л.А.,Епринцев А.Т.,Суворова И.М. Активность аконитатгидратазы в онтогенезе некоторых растений. Там же, с.55-61.

13. Землянухин А. А., Епринцев А.Т.,Землянухин Л.А.,Игамбердиев А.У. Субклеточная локализация изоформ аконитатгидратазы в высших растениях. //Физиология растений. 1984. Т. 31. Вып. 2. С. 337-343.

14. Землянухин Л.А..Епринцев А.Т.,Суворова И.М. Очистка и некоторые свойства аконитатгидратазы из гороха. //Докл. АН СССР. 1984.

Т.275. N5. С.1211-1213.

15. Епринцев А. Т., Головина Н.В. Идентификация аминокислотных остатков в активном центре аконитатгидратазы из щитка кукурузы // Труды

IV Всесоюзной межуниверс.конф. по биологии клетки. Тбилиси.1985. Ч. 1.С. 262-264.

16. A.c. N 1305929 СССР, А61 К 35/78. Способ получения изоцитратде-

гидрогеназы из растительного сырья / А.А.Зенлянухин,Т.Н.Попова, Л.А. Землянухин,А.Т.Епринцев. 1986.

17. Землянухин А. А., Землянухин Л.А.,Епринцев А.Т.,Игамбердиев А.У. Очистка и свойства аконитатгидратазы к изоцитратлиазы из растений // V Всесоюзный биохимич.съезд. Тез.стенд.ссобщ.,М., 1986,т.2,с.42

18. Епринцев А.Т., Землянухин Л.А. Получение гомогенных препаратоЕ аконитатгидратазы и малатдегидрошгеназы из высших растений //

■ Применение биотехнологии в народном хозяйстве. Материалы Всесо-юз. науч.-практ.конф.,Уфа. 1987. С.18-22.

19. Землянухин А. А., Игамбердиев А. У., Епринцев А.Т., Лось А.А. Альтернативный путь метаболизма глиоксилата в растениях // Физиология растений. Т. 34. Вып. 5. 1987. С. 956-962.

20. Епринцев А.Т.,Землянухин Л.А. Влияние органических кислот на индукцию аконитатгидратазной активности у растений // Физиология растений и регуляторы роста. Саранск. Изд-во Мордовского ун.-та.1987.С.112-115.

21. Землянухин А.А., Епринцев А. Т. .Пинейру М. Очистка МДГ из щитка кукурузы // Труды V Всесоюзной конф.по биологии клетки. Тбилиси.

1987. Ч. 1.С. 321-324.

22. Епринцев А.Т.,Землянухин Л.А., Горевалова С.Ю. Очистка и некоторые свойства аконитатгидратазы из семядолей кенафа // Регуляция ферментативной активности у растений. Горький. Изд-во ГГУ.

1988. С. 57-61.

23. Pinhelro de Carvalho М., Zemlyanukhin A. A., Eprlntsev А. Т. Regulation of malate dehydrogenase activity in plant cell.// Abstracts 19th Meeting of FEBS. Rome, 1989. TU 127.

24. Землянухин A.A.,Епринцев А.Т.,Попова Т.Н.,Пинейру M.А. Ферментативная регуляция метаболизма ди и трикарбоновых кислот в растительной клетке // Тезисы докл.II съезда Всес.общества физиологов растений.Акад.наук СССР.Минск.1990.С. 35.

25. Pinheiro de Carvalho М.,Eprintsev А.Т., Zemlyanukhin А.А.,Saa-kashvili N. К. Stimulation of malate dehydrogenase synthesis In higher plants.// Abstracts of 7 th Congress of FESPP. Physiolo gia Plantarum, 1990. V. 79. N 2. Part. 2. Abst.410. A 331.

26. Eprintsev А.Т., Pinhelro de Carvalho M.,Zemlyanukhin A.A. Physical and chemical properties of malate dehydrogenase isoenzymes from castor bean endosperm.// 20 th Meeting of FEBS. Budapest. 1990.Abstr.book.P-Tu,140.

11. Епринцев А.Т.,Пинейру М.А., Землянухин А.А. Очистка и свойства ци-топлазматической малатдегидрогеназы из щитка кукурузы // Научные доклады высшей школы. Биол. науки.1990.Т.324. N 12.С.93-101.

18. Епринцев А.Т..Землянухин А.А..Пинейру М.А. Очистка и изофермент-ный спектр малатдегидрогеназы // Регуляция ферментативной активности у растений. Горький.Изд-во ГГУ.1990.С.95-99.

19. Епринцев А.Т.,Пинейру М.А..Селимов Л.Н. Применение ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе для разделения изоферментов малатдегидрогеназы из растений //Иониты. Труды Vn Всес.конф.по применению ионообменных материалов в промышленной и аналитической химии. 1991. С.391-392.

Ю. Plnheiro de Carvalho М.А., Zemlyanukhin A.A.. Eprintsev А.Т. The function of raalate dehydrogenase system in regulation of cell metabolism of higher plants // Physiologia plantarum. 1992. V.85. N 3. Part. 2. Abstr. 547.

51. Епринцев А.Т.,Эрдели Г.С.,Шиллинг Г. Влияние 2,3-дихлоризобутира-та натрия на каталитические и кинетические свойства малатдегидрогеназы из высших растений // Ш Съезд Рос.общ. физ. раст. Тез. докл. С. -Петербург. 1993. С. 703.

52. Епринцев А.Т.,Землянухин А.А.. Пинейру М.А. Изоферментный состав малатдегидрогеназы в онтогенезе высших растений. Там же. с.301.

53. Eprlnzev А.Т.,Plnheiro de Carvalho М.А. Catalytic properties of malate dehydrogenase Isoenzymes from castor bean endosperm.

' // Physiologia plantarum.1994. V.36. Abstr.1102.S.175.

!4. Eprintsev А.Т., Popova Т.Н., Plnheiro de Carvalho M.A. Induction of malate dehydrogenase and isocitrate dehydrogenase synthesis in highe plants // 4-th International Congress of Plant Molecular Biology, Amsterdam. 1994. Abstr.Book.P.586.

!5. Епринцев А.Т., Землянухин А.А..Пинейру M. Идентификация аминокислотных остатков в активном центре изоферментов малатдегидрогеназы из щитка кукурузы // "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов". Материалы международного симпозиума Воронеж. 1995." С. 48-51.

56. Епринцев А.Т.,Землянухин Л. А. Физико-химические свойства растительной аконитатгидратазы.Там же, с.51-53.

57. Епринцев А.Т..Землянухин Л.А..Ашнин Л. Очистка и каталитические свойства НАДФ-малатдегидрогеназк (декарбоксилирующей) из листьев пшеницы. Там же, с. 53-56.

38. Епринцев А.Т., Землянухин Л. А. ,Алексюк М. П. Очистка и некоторы свойства аконитатгидратазы из щитка кукурузы //Биохи МИЯ. 1995. Т. 60. N8. С. 1244-1250.

39. Епринцев А.Т.,Игамбердиев А. У. Активность и изоформы малатдегид рогеназы в высоко- и низкомасличных линиях кукурузы // Физиологи растений. 1995. Т. 42, N 5, С. 760-767.

40. Eprintsev А.Т., Igamberdiev A.U. .Achnine L. Kinetic properties a Physiological role of NADP-dependent malic enzyme from pea leave //Abstracts of 23rd Meeting of FEBS. Basel, 1995.

41. Achnine L.. Eprintsev А.Т.. Regulatory properties of NADP-mall enzyme from wheat chloroplasts // Proceedings of the 10th Inter national Photosynthesis Congress, August 1995. Montpellier, Fran ce. P. 169.

42. Епринцев А. Т.,Игамбердиев А.У., Ашнин Л. Малатдегидрогеназна система вольфии: физиолого-биохимическая характеристика и регуля ция // Физиология растений. 1996. Т.43. N 1. С. 61-71.

Заказ 343 от 4.10.95 г. Тир. 100 экз. Формат 60 X 90 I/I6. Объем 1,5 п.л. Офсетная лаборатория ВГУ.