Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очистка, физико-химические и кинетические свойства изоферментов малатдегидрогеназы из листьев ячменя и пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ахмад Садун Хуссейн

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика малатдегидрогеназной системы.

1.2. Генезис и физиологическая роль МДГ в растительной клетке.

1.3. Внутриклеточное распределение изоферментов малатдегидрогеназы

1.4. Физико-химические и кинетические свойства малатдегидрогеназы.

1.5. Регуляция функционирования малатдегидрогеназной системы.

1.6. Метаболитная регуляция МДГ.

Экспериментальная часть

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.•.

2.2. Выделение клеточных органелл. . . .г.".'.

2.3. Определение активности ферментов.

2.4. Определение количества белка.

2.5. Выделение и очистка малатдегидрогеназы.

2.5.1. Экстракция.

2.5.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония.

2.5.3. Гель-фильтрация.

2.5.4. Ионообменная хроматография.

2.6. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов.

2.7. Аналитический электрофорез.

2.8. Ингибиторный анализ.

2.9. Определение молекулярной массы.

2.10. Аминокислотный анализ.

2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных.

Глава 3. СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ИЗОФЕРМЕНТНЫЙ

СОСТАВ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ.

3.1. Изозимный спектр МДГ.

3.2. Субклеточная локализация МДГ.

Глава 4. ВЛИЯНИЕ СОЛЕВОГО СТРЕССА НА

МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗНУЮ СИСТЕМУ.

4.1. Динамика активности МДГ.

4.2. Изоферментный состав МДГ.

Глава 5. ОЧИСТКА ИЗОФЕРМЕНТОВ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И

ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА.

5.1. Очистка изоферментов МДГ.

5.2. Аминокислотный состав изоферментов.

5.3. Хранение высокоочищенных препаратов ферментов.

Глава 6. КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА

ИЗОФЕРМЕНТОВ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ.

6.1. Каталитические характеристики изоферментов МДГ.

6.2. Влияние температуры на изоферменты МДГ.

6.3. Влияние концентрации ионов водорода на активность изоферментов МДГ.

6.4: Регуляция активности изоферментов МДГ нуклеотидами.

6.5. Метаболитная регуляция изоферментов МДГ.ПО

6.6. Структура активного центра МДГ и механизм его действия.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Очистка, физико-химические и кинетические свойства изоферментов малатдегидрогеназы из листьев ячменя и пшеницы"

Актуальность проблемы. Изучение регуляции метаболических процессов является важнейшим условием развития представлений о биохимических механизмах адаптации к стрессовым условиям. Важнейшую роль в сопряжении метаболических путей растительной клетки играют органические кислоты: малат, цитрат, сукцинат и др. Данные соединения, являясь субстратами основного окислительного метаболического пути цикла трикарбоновых кислот, участвуют в формировании других биосинтетических и энергетических процессов.

Динамика содержания названных интермедиатов определяется активностью, каталитическими характеристиками, изоферментным составом и субклеточной локализацией ферментов, осуществляющих их превращения. Доминирующую роль в метаболизме малата играет малатдегидрогеназная система, включающая две оксидоредуктазы: НАД-зависимую малатдегидрогеназу (К.Ф. 1.1.1.37, МДГ), и НАДФ-зависимую малатдегидрогеназу (К.Ф. 1.1.1.82, НАДФ-МДГ) и две декарбоксилирующих малатдегидрогеназы - НАД- (К.Ф. 1.1.1.39, НАД-МЭ) и НАДФ-зависимую (К.Ф.1.1Л.40, НАДФ-МЭ). В последнее время МДГ посвящены много разнообразных исследований. При этом, основное внимание было уделено изучению этого фермента в растениях, функционирующих в нормальных условиях внешней среды. Однако, известно, что помимо восстановления оксалоацетата до малата, МДГ выполняет важнейшую функцию в стабилизации окислительно-восстановительных процессов переноса дикарбоновых кислот через мембрану органоидов, что обуславливает ее важную роль в адаптации растительного организма.к стрессовым факторам, в частности, к засолению. Особенно интересна роль изоферментов малатдегидрогеназной системы в адаптационных процессах, обеспечивающих нормальный гомеостаз растительной клетки. Для решения данных проблем необходимо развивать исследования каталитических и физико-химических характеристик индуцируемых изоформ малатдегидрогеназы в растениях в условиях солевого стресса. Подобные исследования позволят приблизиться к пониманию регуляции метаболических путей, протекающих в различных компартментах клетки к изменению факторов внешней среды.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является исследование физико-химических и кинетических характеристик изоферментов малатдегидрогеназной системы из ячменя и пшеницы: выяснению их распространения, субклеточной локализации, изоферментного спектра, выделение изоформ, индуцированных солевым стрессом. Исходя из цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать внутриклеточное распределение и изоферментный состав малатдегидрогеназы в проростках пшеницы и ячменя.

2. Изучить влияние засоления на активность и изоферментный состав фермента в данных растениях.

3. Выделить и очистить до гомогенного состояния изоферменты малатдегидрогеназы, имеющие различную внутриклеточную локализацию.

4. Исследовать физико-химические свойства и аминокислотный состав отдельных изоферментов.

5. Охарактеризовать каталитические свойства и метаболитную регуляцию активности малатдегидрогеназы.

6. Изучить механизм действия активного центра фермента.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований изучено субклеточное распределение изоферментов малатдегидрогеназы в ячмене и пшенице. Показана индукция изоферментов МДГ в этих растениях в условиях солевого стресса (1% NaCI). Установлено, что малатдегидрогеназная система обладает большой вариабельностью активности и спектра множественных молекулярных форм. Выявлена адаптивная реакция изучаемого фермента к засолению, которое проявлялось в изменении активности и синтезе дополнительных изоферментов. Показано, что одним из возможных путей адаптации к стрессовым условиям является интенсификация мобилизаций малата с помощью индуцированного изофермента МДГ. С помощью эффективных способов выделения получены в электрофоретически гомогенном состоянии изоферменты малатдегидрогеназы, в том числе ее индуцированная форма. На очищенном до гомогенного состояния индуцированном цитоплазматическом изоферменте МДГ из листьев пшеницы и ячменя определены физико-химические свойства. Анализ аминокислотного состава индуцированных форм показал, что выделенные молекулярные формы МДГ представляют собой истинные изоферменты. Проведены исследования характеристик различно локализованных изоферментов малатдегидрогеназы. Установлено, что для разных форм характерны существенные отличия: рН-оптимум, сродство к субстратам, температурный оптимум и др., что имеет важное значение в механизме метаболитной адаптации растительной клетки к экстремальным условиям.

Практическая значимость. Модифицированные способы выделения и очистки изоферментов малатдегидрогеназы из пшеницы и ячменя могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Высокоочищенные препараты, полученные в данной работе, имеют высокую удельную активность и чистоту, что позволяет их применять в различных областях. Полученные ферментные препараты рекомендуются к использованию в научно-исследовательских лабораториях для определения концентрации НАД или НАДН для моделирования in vitro надмолекулярных систем клетки. Кроме того, МДГ может найти применение для биохимических анализов в пищевой промышленности и медицине.

Практическая значимость работы состоит в расширении и углублении представлений о роли изоферментов МДГ в адаптационных реакциях растений к изменению факторов внешней среды. Вместе с тем, полученные результаты помогают глубже понять организацию и регуляцию клеточного метаболизма. Это может способствовать разработке путей продуктивности высших растений и их устойчивости к стрессовым воздействиям.

Результаты исследований вошли в курсы лекций по физиологии растений и биохимии, а также спецкурсы по фотосинтезу, дыханию растений, энзимологии, читаемых в Воронежском государственном университете. Кроме того, они используются при проведении практикумов и выполнении дипломных работ.

Апробация работы. Основные результаты исследования выполнены автором в период 1998-2001гг. докладывались и обсуждались на региональных и университетских конференциях. Они были представлены на заседаниях Воронежского отделения Всероссийского общества физиологов растений, на межрегиональной конференции «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (2000г.) и на ежегодных научных конференциях Воронежского госуниверситета (2000,2001гг).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 4 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (145 источников). Иллюстрационный материал включает 20 рисунков, 11 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ахмад Садун Хуссейн

ВЫВОДЫ

1. Малатдегидрогеназа в проростках ячменя и пшеницы характеризуется наличием широкого спектра изоформ, обладающих специфическим внутриклеточным распределением и различной электрофоретической подвижностью. Для пшеницы выявлено 4 изоформы, для ячменя - 5.

2. Солевой стресс, вызываемый 1% NaCl, изменяет общую и удельную активность, а также изоферментный состав малатдегидрогеназы у изучаемых растений. Под действием стрессора появляются дополнительные молекулярные формы фермента.

3. С помощью многостадийной очистки получены в гомогенном состоянии цитоплазматический, глиоксисомальный, митохондриальный и этиопластный изоферменты малатдегидрогеназы из проростков ячменя и пшеницы.

4. Исследования аминокислотного состава, физико-химических и кинетических характеристик показали, что выделенные молекулярные формьгМДГ являются истинными изоферментами.

5. Выделен и очищен до электрофоретически гомогенного состояния препарат индуцированной изоформы малатдегидрогеназы из проростков ячменя, отличающийся по кинетическим и каталитическим свойствам от конституитивной формы фермента.

6. С помощью специфических игнибиторов исследован активный центр малатдегидрогеназы растительного происхождения. Установлено, что в состав активного центра входят по два остатка аргинина и гистидина.

7. Изучена метаболитная регуляция активности отдельных изоферментов малатдегидрогеназы из ячменя и пшеницы. Установлена важная роль органических кислот в регуляции малатдегидрогеназной активности, в частности, показано, что устойчивость растительного фермента к малату, фу Марату и другим органическим кислотам выше, чем для МДГ животного и бактериального происхождения.

8. Показана различная регуляция активности цитоплазматического и митохондриального изоферментов соотношением НАД/НАДН и АДФ/АТФ, что играет важную роль в перераспределении энергии между органоидами клетки и регуляции энергетического заряда клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Малатдегидрогеназа играет центральную роль в изменении метаболических процессов при адаптации растений к факторам внешней среды. Это связано с тем, что малат и оксалоацетат участвуют в изменении концентрации осмолитов в растительной клетке, подвергшейся солевому стрессу. Сложность изоферментного состава малатдегидрогеназной системы обуславливается множественностью метаболических процессов, связанных с этой ферментной системой. Во-первых, митохондриальная малатдегидрогеназа обеспечивает функционирование цикла Кребса -центрального пути катаболизма углеродов. Цитоплазматические изоформы данного фермента отвечают за взаимосвязь таких органоидов клетки, как митохондрии, хлоропласты, вакуоль и транспортно-восстановительных эквивалентов между ними. Пероксисомальная МДГ может обеспечивать как функционирование глиоксилатного цикла, так и транспорт фотодыхательного НАДН из микротелец. Этиопластная изоформа может участвовать в поддержании редо кс-баланса формирующихся пластид, обеспечивает протекание биосинтетических реакций.

Проведенные исследования показывают, что сложный изоферментный состав малатдегидрогеназы у проростков ячменя и пшеницы участвует в адаптивных реакциях организмов при солевом стрессе. Инкубация растений в среде, содержащей 1% NaCl, вызывает как изменение общей, так и удельной активностей, а также изоферментного спектра малатдегидрогеназы у обоих растений. При долгосрочной экспозиции активность малатдегидрогеназы-возрастала в 1,5-2 раза. На начальных этапах адаптации наблюдались значительные осцилляции активности этого фермента в первые 12 часов инкубации. Образование новых молекулярных форм МДГ может объяснять осцилляции активности данной ферментной системы. По-видимому, адаптационная реакция МДГ заключается в синтезе максимально широкого спектра изоферментов, обладающих различными кинетическими свойствами и зависимостью их активности от ионной силы раствора. Синтез новых изоформ обеспечивает изменение суммарной скорости окисления малата или восстановления оксалоацетата, что приспосабливает энергетическую систему клетки к меняющимся условиям внешней среды. Некоторыми авторами также было обнаружено изменение спектра МДГ в органах табака, махериума, кукурузы при их выращивании в разных тепловых режимах и в условиях засоления (De John, 1973; Moore, Szarek, 1983; Епринцев, Попов, 1999).

Для изучения раздельной регуляции и сравнения различных изоформ малатдегидрогеназы нами была разработана схема разделения изоформ МДГ из листьев ячменя и пшеницы и изучены их физико-химические характеристики. Полученные препараты изоферментов из цитоплазмы, митохондрий, глиоксисом и этиопластов были электрофоретически гомогенными. Большинство параметров очистки фермента из ячменя и пшеницы имели сходство с результатами, полученными для других объектов (Иванищев, Курганов, 1992; Епринцев, Попов, 1999).

Большой интерес и значение имеют результаты исследований аминокислотного состава различных изоформ малатдегидрогеназы. Отличие аминокислотного состава митохондриальной, цитоплазматической и глиоксисомальной изоформ свидетельствует о различной генетической детерминированности молекулярных форм, то есть изучаемые изоформы являются истинными изоферментами. Анализ кинетических и каталитических свойств малатдегидрогеназы показал, что ее изоферменты отличаются между собой по рН, температурному оптимуму, каталитической эффективности, значениям Км и другим каталитическим параметрам. Интересно, что митохондриальный изофермент имел более низкое значение рН-оптимума, что по-видимому, определяется физиологическими особенностями данных органелл. Для всех изоферментов МДГ характерно более высокое сродство к оксалоацетату, чем к малату. Изучаемые изоферменты показывали большую устойчивость к малату, к фумарату и другим органическим кислотам, способным накапливаться в растительной клетке в значительных количествах (Niedziala et al., 1993). Аналогичные данные получены при исследование кинетических свойств изоферментов малатдегидрогеназы из листьев шпината (Ziegler, 1974) и из. сердца быка (Bush, 1985). Цитоплазматическая и глиоксисомальная форма МДГ обладают большей устойчивостью к высоким концентрациям НАДН, чем митохондриальная. Подобная регуляция метаболических процессов, связанных с запасанием энергии в виде макроэргических связей и синтезом восстановительных эквивалентов может определять соотношение и направление анаболических и катаболических реакций в растительной клетке.

Важное значение представляют данные, полученные при исследовании физико-химических и кинетических свойств индуцированной изоформы малатдегидрогеназы, выделенной из цитоплазмы листьев пшеницы. Этот изофермент появлялся в растительном организме под влиянием солевого стресса (1% NaCl). С помощью пятистадийной очистки получен электрофоретически гомогенный препарат изофермента с удельной активностью 1304 ФЕ/мг белка. Данная форма МДГ обладала отличным аминокислотным составом от других изоферментов, что указывает на ее генетическую детерминированность. Индуцированный изофермент характеризовался большим сродством к малату, что указывает на сдвиг равновесия катализируемой реакции в сторону образования оксалоацетата. Сходные результаты были получены ранее для индуцированной формы малатдегидрогеназы из кукурузы (Епринцев,1995). .

Возможность индуцированного синтеза МДГ, по мнению некоторых авторов, связана с избыточностью генетического материала в растительной клетке. Так, Гудман и др. (Goodman et al., 1980) и Ньютон, Шварц (Newton,

Scheartz, 1980) установили наличие шести ядерных и трех митохондриальных генов, ответственных за синтез этого белка. Молекулярные основы механизма индуцированного синтеза МДГ пока не установлены, однако можно предположить, что влияние индуктора на клеточный геном может оуществляться двумя различными путями. Во-первых, индуктор действует непосредственно на состояние оперона, то есть по механизму, предложенному Жакобом и Моно (1964). Сложность эукариотического генома и его распределения между компартментами делают более реальным другой механизм - опосредованное влияние малата на геном с помощью различных медиаторов, возможно имеющих белковую природу. Повышение концентрации малата внутри клетки может привести к изменению электрохимического потенциала клеточных мембран и режиму работы специфических рецепторов, способных послать в ядро соответствующие сигналы о состоянии окружающей среды.

Полученные кинетические свойства индуцированной дополнительной изоформы МДГ подтверждают важную роль малатдегидрогеназной системы в адаптивной реакции растительного организма к солевому стрессу. По нашему мнению дополнительный изофермент обеспечивает эффективную мобилизацию яблочной кислоты для энергизации метаболизма растительной клетки. Кроме того, он может участвовать в интенсификации поставок углеродных скелетов для образования осмолитов (оксалоацетат).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ахмад Садун Хуссейн, Воронеж

1. Блюменфельд Л.А., Плешанов П.Г. Единичные циклы прямой ферментативной реакции на примере МДГ // Биофизика. 1986.-T.XXXI. Вып.5.-С.760-763.

2. Боннер Дж., Вернер Дж. Биохимия растений. М.: Мир. 1968.-624с.

3. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделениибиологических макромолекул.-М.: Мир, 1982.-c.446.

4. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений.- Киев: Наукова думка. 1973.-273с.

5. ДетерманГ. Гель-хроматография. М.: Мир. 1970.-252с.

6. Жакоб Ф., Моно Ж. Биохимические и генетические механизмы регуляции вбактериальной клетке. //Молекулярная биология. Проблемы и перспективы.1. М.:Мир.1964.-с.140.

7. Иванищев В.В. Кинетические свойства НАД-МДГ из хлоропластов хлопчатника // Доклады АН Таджикистана. 1990.-Т.733. N 12. С.839-842.

8. Иванищев В.В., Курганов Б.И. Выделение и кинетические свойства НАД-зависимой МДГ из хлоропластов листьев // Биохимия. 1993.-Т.58. N4.-c.606-611.

9. Иванищев В.В., Курганов Б.И. Ферменты метаболизма малата: характеристика, регуляция активности и биологическая роль биохимия, 1992. - Т.57, N 5, с.653-662.

10. Игамбердиев А.У. Микротельца в метаболизме растений.-Воронеж: Изд-во ВГУ,1990.-148с.

11. Игамбердиев А.У. Логика организации живых систем.-Воронеж: Изд-во ВГУ, 1995.-151с. '.Игамбердиев А.У., Попов В.Н., Фалалеева М.И. Особенности метаболизма сукцината в жирозапасающей ткани прорастающих семян злаков //

12. Физиология раст., 1995.-Т.42, N 1, С. 114-120.

13. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов.-М.: Мир, 1980.-417с.

14. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы.-М.: Мир. 1986. 374с.

15. Хавкин Э.Е. Индуцированный синтез ферментов в процессах роста и морфогенеза растений.-М.: Наука, 1969.-168с.

16. Хавкин Э.Е., Вараксина Н.Н. Цикл трикарбоновых кислот в растущих и стареющих колеоптилях кукурузы // Физиол. и биох. культ.раст., 1970.-T.2.N3 .-с.282-287.

17. Хавкин Э.Е. Формирование метаболических систем в растущих клетках растений.- Новосибирск: Наука, 1977.- 221с.

18. Харборн Дж. Введение в экологическую биохимию.-М.: Мир.1985.-с.33-39.

19. Хватова Е.М., Гарсия-А. Способ получения МДГ из митохондрий головного мозга // Ас. 1165402 А.СССР. Заявление 2109.83. N 3645228/28-13 опубликовано в БИ. 1985.- N 25.- МКИ. А61. К 35/30.А 61 К 37/48.

20. J. Хроматография на бумаге / Под ред.Хайса И.М., Мацека К.М.-М.: Изд-во иностр.лит. 1962.-851с.

21. Ходос В.Н. Роль компартментов метаболитов в процессах регуляции и адаптации метаболизма в растительных клетках.-Киев: Наукова думка, 1975.- 98с.

22. ХочачкаП., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация.-М.: Мир. 1988.- 567с.

23. Чернядьев И.И., Успенская В.Э., Доман Н.Г. Фиксация углекислоты на СЗ-акцепторах при фотосинтезе у Rhodopseudomonas palustris // Биохимия. 1972.-T.37.N5 .-С.948-951.

24. Эйринг Г., Эрри Д. Термодинамика и химическая кинетика. Теоретическая и математическая биология.-М.: Мир,1968.-894с.

25. Яковлева Т.В., Мансурова С.Э., Кулаев И.С. Исследование пирофосфатазы проростков пшеницы: общая характеристика, множественные формы, изменение активности в процессе развития // Физиология растений. 1981.-Т.28. В.1.-С.94-102.

26. J.Anderson В.Н., Robin B.R. Alkylation studies on a reactivehistidine in pig

27. Malate dehydrogenase 11 European Journal Biochemistry. 1970.-V.15. N.3.-P.568-573.

28. Ashton A.R., Hatch M.D. Regulation of C4- photosynthesis physical and kinetic properties of active (dithiol)and a inactive(disulfide)NADP+- Malate dehydrogenase from Zea mays // Arch.Biochem. and Biophys.1983.-Y.227.N2.-P.406-415.

29. Benveniste K., Munker K.D. Cytoplasmatic and mitochondrial Malate dehydrogenase of Neurospora. Regulatory and enzymic properties // Biochim. et Вiophys.Acta. 1970.-V.220. N2.-P.161-177.

30. Berkemeyer M., Scheibe R., Ocheretina O. A novel, non-redox-regulated NAD-dependent malate dehydrogenase from chloroplasts of Arabidopsis thaliana L.// J. Biol. Chem. 1998. Oct.23. 273:43 P.27927-33.

31. Birnberg P.R., Hanson Y.B. Mechanism of citrate transport and exchange in corn mitochondria // Plant Physiol. 1983.-V.71. N4.-P.803-809.

32. Canellas P.F., Randolph Т., Wedding A. Kinetic properties of NAD-Malic enzyme from cauliflower // Arch.Biochem. and Biophys. 1984.-V.229. N2.-P.414-425.

33. Consiglio E., Varrone S., Covelli I. Characterization of the heavy form (9S) of mitochondrial Malate dehydrogenase // European Journal Biochem. 1970.-V.17.N3.-P.408-414. '

34. Contel E.P.B., Mestriner M.A., Martins E.Genetic control and developmental expression of Malate dehydrogenase in Apis mellifera // Anim. Blood Groups and Biochem. Genetic. 1977.-V.8. N1.-P.24-25.

35. De John D.W. Effect of temperature and daylenght on peroxidase and Malate dehydrogenase isozyme composition in tabacco leaf extracts // American Journal of Botanic.l973.-V.60.N9.-P.846-852.

36. Dordal A., Mazo A., Gelpi J.L., Cortes A.Factors affecting L-malate activation of mitochondrial malate dehydrogenase from chicken liver.// Biochem Int. 1990. 20:1. P. 177-82.

37. Ebbighaus H.,Chen Jia, Heldt H.W. Oxaloacetate Translocato Plant Mitochondria // Biochimica et Biophysica Acta. 1985.-V.8.-P.711-716.

38. Evidence for catabolite degradation in the glucose dependent inactivation of yeast cytoplasmic Malate dehydrogenase /Neeff J., Hagele E.,Nauhaus J.,Heer I. et al.//Eur Journal Biochem. 1978.-V.87.N3.-P.489-495.

39. Feierabend J., Beevers H. Developmental studies on microbodies in wheat leaves.I.Conditions influencing enzyme development // Plant Physiol. 1972.-V.49.Nl.-p.28-32.

40. Foster M., Brady J.W., Harrison J.H. // Journal Biol.Chem.1975.-V.250. N16.-P.6222-6227.

41. Genetic control of Malate dehydrogenase isozymes in maize /Goodman M.M., Stuber C.W., Lee C.-M., Johnson F.M. // Genetic USA.1980.-V.94. Nl.-P.153-168.

42. Gerchardt B.P., Beevers H. Developmental studies on glyoxysomes in Ricinus endosperm//J.Cell.Biol. 1970.-V.44. N1. -p.94-102.

43. Humphries B.A., Rohrbach M.S., Harrison J.H. 4,4-bis-dime-thylaminodiphenylcarbinol: a new reagent for selective chemical modification. Interaction with porcine Malate dehydrogenase // Biochem. and Biophys. Res.Communs.-1973.-V.50. N2.-P.493-499.

44. Jacob F., Monod J. Genetic Regulatory Mechanisms in the synthesis of Proteins // Journal Molecular Biology. 1961.N3.-P.318-356.

45. Jacquot J.P., Vidal J., Gadal P. Identification of an protein factor involved in dithiothreitol activation of NADPMalate dehydrogenase from French bean leaves // FEBS Lett.l976.-V.71.N 2.-P.223-227.

46. Folin-phenol reagent // J.Biol.Chem.l951.-V.194.-p.265-275.

47. Ma H., Kubicek C.P., Rohr M. Malate dehydrogenase isoenzymes in Aspergillusniger //FEMS Microbiology Letters. 1982.-V. 12. N 2.-p.l47-151.

48. Madern D., Zaccai G. Stabilisation of halophilic malate dehydrogenase from

49. Haloarcula marismortui by divalent cations — effects of temperature, waterisotope, cofactor and pH.//Eur J. Biochem. 1997. Oct.15. 249:2. P.607-11.

50. Machado M.F., Prioli A.J., Mangolin C.A.Malate dehydrogenase (MDH; EC 1.1.1.37) isozymes in tissues and callus cultures of Cereus peruvianus (Cactaceae).// Biochem Genet. 1993. Apr. 31:3-4. P. 167-72.

51. Mader M.,Schloss P. Isolation of Malate dehydrogenase from cell walls of Nicotina tabacum // Plant Scienc Letters. 1979. -V.17. N 1 .-p.75-80.

52. Malate dehydrogenase species in the cytosolic fraction of chicken liver / Domenech C., Mazo A., Artigas R., Cortes A.,Bozal J.// Biological Chemistry Hoppe-Seyler.1986.-V.367. N 10.-P. 1069-1976.

53. Malatdehydrogenasen unter chiedlicher Herkuft;Hemmung durch thyroxin/Graszunski K., Siebers D., Tofante I., Brunner I.//Z.Naturforsch.l969.-V.24.b.N6.-P.783-784.

54. Malic dehydrogenase isozymes in plants/Ting I., Fuhr I.,Curry R., Zschoche W.C.//in: Isozymes.New.York.l975.-V.2.-P.369-384.

55. McEvily A.J.,Flint A.,Harrison J. Concomitant purification of three porcine heart mitochondrial enzymes: citrate synthase, aspartate aminotransferase and Malate dehydrogenase // Analytical Biochemistry. 1985.-V.144.N1.-P. 159-164.

56. Mikulaova D., Kollarova M., Miginiac-Maslow M., Decottignies P., Jacquot J.P., Kutejova E., Mernik N., Egyudova I., Musrati R., Horecka T.

57. Purification and characterization of the malate dehydrogenase from Streptomyces aureofaciens.//FEMS Microbiol Lett. 1998. Feb. 15. 159:2. P.299-305.

58. Miller S.S., Driscoll B.T., Gregerson R.G., Gantt J.S., Vance C.P. Alfalfa malate dehydrogenase (MDH): molecular cloning and characterization of five different forms reveals a unique nodule-enhanced MDH.// Plant'J. 1998. Jul. 15:2.P. 173-84.

59. Mladenova J. Influence of salt stress on primary metabolism of Zea mays L. seedings ofvodel genotypes //Plant and Sod.1990.-V.123. N2.-P.217-222.

60. Morgunov I., Srere P.A. Interaction between citrate synthase and malate dehydrogenase. Substrate channeling of oxaloacetate.// J. Biol. Chem. 1998. Nov. 6. 273:45 P.29540-4.

61. Mottran J.C.,Graham H.C. Purification of particulate Malate dehydrogenase and phosphoenolpyruvate carboxykinase from Leishmania mexicana mexicana // Biochimica etBiophysica.1985.-V.827. N3.-p.310-319.

62. Munkres K.D. Allosteric and multifunctional properties of Neurospora mitochondrial Malate dehydrogenase //Biochim. et Biophys. acta.1970.-V.220. N 2.-P.149-160.

63. Musrati R.A., Kollarova M., Mernik N., Mikulaova D. Malate dehydrogenase: distribution, function and properties.// Gen Physiol. Biophys. 1998. Sep. 17:3. P.193-210.

64. Nainawatee H.S., Das N.B. Malate dehydrogenase isoenzymes in wheat seeds imbided in saline medium // Biochem. und Physiol.Pflanz.1972.-V.163. N 6.-S.608-610.

65. Nakamoto H., Edwards G.E. Light activation of Pyruvate, PiDiKinase and NADP. Malate dehydrogenase in Nesophyll protoplasts of maize // Plant Physiology. 1986.-V.82. N1.- P.312-315.

66. Neff J., Heer U. Catabolite inactivation of yeast cytoplasmatic Malate dehydrogenase. A process independent of protein synthesis // FEBS Lett. 1978.-V.85. N2.-P.233-236.

67. Newton K.J., Schwartz D. Genetic basis of the major Malate dehydrogenase isozymes in maize // "Genetics" USA.-1980.-V.95. N2.-P.425-442. .

68. Nishiyama M., Kinoshita M., Kudo H., Horinouchi S., Tanokura M. Enhancement of the turnover number of thermostable malate dehydrogenase by deleting hydrogen bonds around the catalytic site. //Biochem Biophys Res Commun. 1996. Aug.23. 225:3. P.844-8.

69. Park H.J., Kreutzer R. Expression cloning of the nox, mdh and ldh genes from Thermus species encoding NADH oxidase, malate dehydrogenase and lactate dehydrogenase.//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. Jan. 40:5. P.676-81.

70. Possner D.,Ruffner H., Rast D. Isolation and biochemical characterization of grape Malic enzyme //Planta. 1981 .-V. 151. N6.-P.549-554.

71. Properties and function of Malate enzyme from Pseudomonas putida/Garrido-Pertierra A., Martinez M.C., Martin F.M., Ruiz-Amie M.// Biochimie.1993.-V.65. N 11-12.-P.629-635.

72. Purification procedure and N terminal aminoacid sequence of yeast Malate dehydrogenase isoenzymes/Kopetzki E., Entian K.D., Lottspeich F., Mecke D.//Biochim. et Biophys. Acta. Protein Structural and Molecular Enzymology. 1987.-V.912. N 3.-P.398-403.

73. Rustin P., Lance C. Malate metabolism in leaf mitochondria from the crassulacean Acid Metabolism plant Kalanchoe blossfeldiana. Pelln.// Plant Physiology. 1986.-V.81. N 4.- p.854-858.

74. D. Sanchez S.A., Hazlett T.L., Brunet J.E., Jameson D.M.

75. Aggregation states of mitochondrial malate dehydrogenase.// Protein Sci. 1998.1. Oct. 7:10. P. 184-9.

76. П. Scheibe R., Fickenscher К. The dark (oxidized ) from the light activatabie NADP Malate dehydrogenase from pea Chloroplasts in catalytically active in presence of guanidine HC1 //FEBS Lett.1985.-V.80. N 2.-P.317-320.

77. Schnarrenberger C.,Ooser A.,Tolbert N.E. Development of microbodies in sunflower cotyledons and castor bean endosperm during germination // Plant Physiology. 1971.-V.48. N 5.-P.566-574.

78. Shikano S., Iwai Y., Shimada Т., Ono K., Suzuki N. Isoenzyme patterns of glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase and lactate dehydrogenase in Babesia rodhaini and Babesia microti.// J. Vet. Med. Sci. 1995. Feb. 57:1. P. 129-31.

79. Stabilization of halophilic Malate dehydrogenase / Zaccai G., Cendrin F., Haik Y., Borochov N., et al.//Journal Mol.Biol.1989.-V.208. N 3.-P.491-500.

80. Tobin A., Givan C. ATP inhibition of Malate dehydrogenase from mung bean hypocotyl mitochondria // Plant Science Zett.1989.-V.34. N 1.-P.51-59.

81. Tripathi G. Molecular weight of cytoplasmic malate dehydrogenase, mitochondrial malate dehydrogenase and lactate dehydrogenase of a freshwater catfish.//Biomed Environ Sci. 1994. Jun. 7:2. P.122-9.

82. Torquato E.F., Prioli A.J., Machado M. Differential alcohol dehydrogenase and malate dehydrogenase isozyme expression in long-term callus tissue cultures of Cereus peruvianus (Cactaceae).// Biochem Genet. 1995. Dec. 33:11-12. P.389-99.

83. J8. Ugochukwu E.N., Anosike E.O. Effect of storage under nitrogen, ethanol, lactate, malate and their dehydrogenases in yam tibers // Phytochemistry.1979. N 18.-P.1621-1624.

84. V., Mukerji S.K., Ting LP. Chloroplast Malic dehydrogenase: a new dehydrogenase isoenzyme from spinach // Biochem. and Biophys. Res. Communs. 1968.-V.31 .N6.-P.890-894.

85. Valenti V., Pupillo P. Activation kinetics of NAD-dependent malic enzymes of cauliflower bud mitochondria // Plant Physiology.1982.-V.68. N 5.-P.1191-1196. P.414-425.

86. Walk R.A.,Michaeli S.JHock B. Glyoxysomal and mitochondrial Malate dehydrogenase watermelon (citrullus vulgaris) cotyledons.I.Molecular properties of the purified isoenzymes // Planta.1977.-V.136. N 3.-P.211-220.

87. Walk R.-A., Hock B. Glyoxyssomal and mitochondrial Malate dehydrogenase of watermelon (citrullus vulgaris) cotyledons. II.Kinetic properties of purified isoenzymes//Planta. 1977. -V.136. N3.-P.221-228.

88. Walk R.A., Hock B. Glyoxysomal Malate dehydrogenase of watermelon cotyledons: de novo synthesis on cytoplasmatic ribosomes // Planta. 1977.-V.134. N3.-P.277-285.

89. Wall A.S., Mattoo A.K. Malate dehydrogenase from thermophilic Humicola lanuginosa and Mucor pusillus: purification and comparative properties of the enzyme//Canadian Journal Biochem. cell Biology.1984.-V.62. N7.-P.559-565.

90. Webb L.E., Hill Ed.J., Banaszak L.J. Conformation of nicotinamide adenine dinucleotide bound to cytoplasmic Malate dehydrogenase //Biochemistry. 1973.-V.12. N25.-p.5101-5109.

91. Wedding R.T. Malic enzyme of higher plants. Characteristics, regulation and physiological function // Plant Physiology. 1989.-V.90.N2.-P.367-371.

92. Yamazaki R.K.,Tolbert N.E. Malate dehydrogenase in leaf peroxisomes //Biochim.et Biophys.Acta. 1969.-V. 178.N1.-P. 11-20.

93. Yoshida A. Enzymic properties of Malate dehydrogenase of Bacillus subtilis//Journal Biological Chemistry. 1965.-V.204.N 3.-P.1118-1124.

94. Yueh A.Y.,Chung C.-S., Lai Y.-K. Purification and molecular properties of malate dehydrogenase from marine diatom Nitzschia alba // The Biochemical Journal. 1989.-V.258(1).-P.221--228.

95. Ziegler I. Malate dehydrogenase of spinach: substrate kinetics of different forms//Phytochemistry.l 974.-V. 13. N 11. -P.2403-2410.

96. Zschoche W.C.,Ting LP. Purification and properties of microbody Malate dehydrogenase from spinacia obracca leaf tissue // Arch.Biochemistry and Biophys. 1973.-V. 159. N 2.-P.767-776.rOtC>",!' ~ 4 j