Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессионная и метаболитная регуляция функционирования аконитатгидратазы в клетках печени крыс в условиях экспериментального диабета
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессионная и метаболитная регуляция функционирования аконитатгидратазы в клетках печени крыс в условиях экспериментального диабета"

На правах рукописи

Альнассер Амин

Экспрессионная и метаболитная регуляция функционирования аконитатгидратазы в клетках печени крыс в условиях экспериментального диабета

Специальность 03.01.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о / лтэ

Воронеж-2010

4854609

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Защита состоится 25 февраля 2011 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет».

Автореферат разослан 21 января 2011 года.

Пашков Александр Николаевич,

кандидат биологических наук, доцент Шуваева Галина Павловна

Ведущая организация Всероссийский научно-исследовательский

ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович М.Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последнее время ферменты глиоксилатного цикла являются объектами значительного количества исследований. Однако, основное внимание уделяется изучению этих ферментов из растений и микроорганизмов. Глиоксилатный цикл, являясь важнейшим этапом глюконеогенеза, осуществляет синтез из двух молекул ацетил-КоА одной молекулы сукцината, используемой для синтеза углеводов. Появились серьезные публикации об индукции глиоксилатного цикла в животных тканях. Наличие ферментов р-окисления жирных кислот в животных пероксисом и феномен ресинтеза гликогена в печени крыс при некоторых патологиях позволяет предположить возможность индукции ферментов глиоксилатного цикла (Лебкова, 1984, Епринцев, 2005, Попов, 1996). Ранее на нашей кафедре была выявлена индукция изоцитратлиазы и малатсинтазы в гепатоцитах крыс в условиях пищевой депривации и экспериментального диабета (Popov, 1996, 1998). Особый интерес вызывает функционирование аконитатгидратазы (АГ; КФ 4.2.1.3), участвующей в функционировании, как цикла Кребса, так и глиоксилатного пути. Рядом авторов было показано наличие двух изоферментных форм растительной аконитатгидратазы в цитоплазме и глиоксисомах, а также в митохондриях (Епринцев и др., 1995). В работах по изучению распространения аконитазной активности в животных тканях установлено аналогичное распределение локализации данного фермента (Kennedi et al., 1992, Konstantinova et al., 2000).

Огромную важность имеет проблема воздействия стрессовых факторов на функционирование живых организмов, как для теории, так и для практики. Ранее нами было установлено, что такие ферменты, как изоцитратлиаза, малатсинтаза, малатдегидрогеназа, индуцируются в печени крыс при пищевой депривации и экспериментальном сахарном диабете (Popov et al, 1996, Попов и др.,2001).

Особенности функционирования других ферментов, обеспечивающих протекание цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного пути, практически не известны. Это в полной мере относится к работе аконитатгидратазы, участвующей в ферментативном катализе так называемого «аконитазного равновесия», обеспечивающего тонкую регуляцию анаболических и катаболических процессов и поддерживающих внутриклеточный гомеостаз в условиях нарушения факторов внешней среды.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование особенностей функционирования ферментной

аконитатгидратазной системы в животных клетках печени у крыс в условиях экспериментального сахарного диабета.

Исходя из цели, были определены следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную модель сахарного диабета с использованием инъекций индуктора аллоксана исследуемым животным.

2. Изучить изменение активности ряда ферментов глиоксилатного цикла и цикла Кребса в различных тканях крыс, находящихся в условиях аллоксанового диабета.

3. Получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты аконитаттидратазы из клеток печени опытных и контрольных групп животных.

4. Исследовать каталитические свойства и метаболитную регуляцию изоформ аконитаттидратазы.

5. Разработать высокоспецифические праймеры для идентификации генов аконитатгидратазы с использованием методов сравнительной геномики.

6. Провести ОТ-ПЦР анализ матричной РНК для идентификации генов, кодирующих изоферменты аконитаттидратазы.

7. Провести количественный анализ уровня экспрессии генов аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального сахарного диабета.

8. Разработать гипотетическую схему регуляции клеточного метаболизма на уровне аконитатгидратазной реакции в печени крыс при аллоксановом диабете.

Научная новизна. Получены новые экспериментальные данные особенностей функционирования аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета. Применение многостадийной схемы очистки позволило получить исследуемый фермент в электрофоретически гомогенном состоянии из опытной и контрольной групп крыс. Выяснено субклеточное распределение аконитазной активности в животных клетках, которое связано с глиоксисомами, пероксисомами и цитоплазмой. Было выявлено, что значительная часть активности аконитатгидратазы сосредоточена в цитоплазматической фракции животных клеток. Анализ полученных результатов свидетельствует о полифункциональности действия аконитатгидратазы в условиях аллоксанового диабета. При этом выявлен

индуцированный синтез аконитатгидратазы, повышающий скорость превращения трикарбоновых кислот, как в энергетическом, так и в анаболическом обменах.

Практическая значимость. Модифицированные схемы очистки высокоочищенных и электрофоретически гомогенных препаратов аконитатгидратазы из животных тканей могут найти широкое применение для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях, а также в научно-исследовательских работах, связанных с моделированием ферментных систем, обеспечивающих возникновение адаптивной реакции. Предлагается способ хранения аконитатгидратазы, обеспечивающий сохранность ее активности в течение длительного времени, что повышает эффективность применения препарата для биохимических анализов в лабораторной практике.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета при чтении лекций по биохимии, а также в спецкурсах по энзимологии. Кроме того, они применяются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях и были представлены на 12-й международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», международной научно-практической конференции «Высокие технологии. Фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии», Санкт-Петербург, 2010, межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2009-20Югт.), ежегодных научных секциях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (160 источников). Иллюстрационный материал включает 21 рисунок, 11 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объектов исследования использовали самцов беспородных лабораторных крыс (Rattus rattus L.) массой 200-300г.,

которые выращивались при обычных условиях питания, а затем были инвестированы подкожно 5% аллоксаном (100 мг/кг веса, раствор в 0,9% NaCl). Контрольные животные выращивались при обычном пищевом режиме; без введения аллоксана.

Контроль за индукцией сахарного диабета. Индукция диабета контролировалась по изменению концентрации глюкозы в крови. Кровь брали из хвостовой вены крысы. Определение глюкозы производили с помощью глюкометра "Сателлит плюс" (Россия).

Получение материала для исследования. Для получения печени опытных животных проводили декапитацию. Выделение фермента производили гомогенизацией 2 г печени в 10 мл среды выделения (1:5), содержащей 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 0,25 М сахарозу; 2 мМ цитрат Na, 1 мМ MgCl2, 4 мМ дитиотрейтол (ДТТ) и 1 мМ ЭДТА с последующей фильтрацией через 4-х слойную марлю. Осаждение неразрушенных тканей осуществляли центрифугированием при 7000g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость, содержащую изучаемый фермент, использовали для дальнейшей очистки.

Определение активности ферментов. Активность АГ определяли спектрофотометрическим методом на СФ - T70+UV-VIS «PG Instruments Ltd» (Англия), основанным на учёте разности поглощения цитрата и изоцитрата по сравнению с цис-аконитатом, при длине волны 240 нм.

За единицу активности принимали количество фермента, превращающее 1 мкМ субстрата или образующее 1 мкМ продукта за 1 минуту при 25°С и оптимальном значении pH.

Методы очистки аконитатгидратазы. Для получения высокоочищенных препаратов фермента использовали методы, включающие несколько стадий очистки: фракционирование животного экстракта сульфатом аммония, гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-25, ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, гель-хроматография на колонке с сефадексом G-200, гель-фильтрация на Toyopearl HW-65.

Электрофоретические исследования.

Аналитический электрофорез. Для изучения электрофоретической подвижности и выявления множественных молекулярных форм АГ проводили электрофорез в полиакриламидном геле по методу Дэвиса (Davis B.J., 1994).

Определение гомогенности ферментных препаратов. Для определения гомогенности очищенных препаратов АГ использовали методику с нитратом серебра (Nesterenko M.V. et al., 1994).

Специфическое проявление аконитатдегидрогеназы, Специфическое проявление аконитатгидратазы осуществляли тетразолиевым методом с использованием вспомогательного фермента изоцитратдегидрогеназы (Детерман Г., 1970). Четко локализующийся в месте образования диформазан указывал на положение АГ в пластинке геля.

Определение молекулярной массы субъединиц АГ. Для определения молекулярной массы АГ методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия пользовались детергентной системой, описанной Лэммли (Laemmly U.K., 1970). Для расчета молекулярной массы субъединиц фермента с помощью Ds-Na-ПААГ электрофореза строили калибровочную кривую по белкам с известной молекулярной массой.

Определение молекулярной массы нативного фермента. Для исследования четвертичной структуры и определения молекулярной массы нативной АГ использовали гель-хроматографию через Toyopearl HW-65 (Остерман JI.A., 1985).

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента. Кинетические и регуляторные свойства ферментов изучали на электрофоретически гомогенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, ингибирования, субстратного ингибирования, расчет термодинамических параметров осуществляли с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов (Варфоломеев С.Д., 1999).

Влияние рН на скорость ферментативной реакции определяли путем проведения серии измерений скорости ферментативной реакции при различных значениях рН. Влияние температуры на стабильность малатдегидрогеназы определяли путем инкубации фермента при различных значениях температуры за определенный период времени.

Определение количества белка. Определение общего количества белка проводили по методу Лоури (Lowry О.Н. et al., 1951).

Выделение суммарной клеточной популяции РНК. Для выделения суммарной клеточной РНК использовался метод гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной экстракции с использованием в качестве осадителя LiCI (Chomczynski P., SacchiN., 1987).

Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы. Для визуализации и анализа качества выделенной РНК использовался электрофорез в агарозном геле в присутствии интеркалирующего красителя - бромистого этидия.

Обратная транскрипция. Обратная транскрипция РНК осуществлялась с использованием обратной транскриптазы вируса Moloney лейкоза мышей М-MULVRT (Fermentas, Литва) для синтеза первой цепи кДНК согласно рекомендациям производителя.

Проведение обратнотранскриптазной полимеразной реакции. Полимеразную цепную реакцию генспецифичными праймерами проводили с помощью набора реактивов AmpliSence (Хеликон, Россия). Праймеры для ПЦР анализа имели следующие нуклеотидные последовательности: для acol прямой 5-GCTGAGCGGTACCAGCAGGC-31 обратный - 5'-GCGGGTCTCCTGAGAGGCCA-3'; для асо2 прямой - 5'-CCGCCTTCCTGTTCAGTTTG-3', обратный - 5'-

TGTAGAGGGAGTGCTGTCATCAA-3'.

Реакция ПЦР проводилась на приборе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и Biometra Personal Cycler (Biometra, Германия) со следующими параметрами амплификации: предварительная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 40 циклов: 95°С - 20 с, 58°С - 30 с, 72°С - 40 с, и, наконец, 72°С -4 мин.

Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени. ПЦР

в реальном времени проводили на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green. В качестве праймеров, подобранных с помощью программного обеспечения РптегЗ, использовали нуклеотидные последовательности к генам митохондриальной и цитоплазматической форм АГ. Параметры амплификации: предварительная денатурация 95 °С - 5 мин., затем цикл: 95 °С - 30 сек., 60 °С -30 сек., 72 °С - 30 сек. (детекция), финальная элонгация - 72 °С - 10 мин. Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации фактора элонгации ef-la с ген-специфичными праймерами (Nicot N. et al., 2005). В качестве отрицательного контроля использовали суммарную РНК без этапа обратной транскрипции.

Определение относительного уровня экспрессии исследуемых генов проводили с применением 2"лйс'-метода (Livak K.J., 2001) с использованием программного обеспечения Opticon Monitor™ Software (Biorad, США).

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 3-кратных биологических повторностях, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в 3-х повторностях. Для контроля достоверности результатов исследований применяли метод вариационной статистики. Полученные данные

обрабатывали с использованием стандартных статистических методов с помощью критерия Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990). В таблицах по очистке приводятся значения типичных опытов; каждое значение есть среднее из трех аналитических определений.

РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ИЗОФЕРМЕНТНЫЙ СОСТАВ АГ В ОРГАНАХ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ Результаты проведенного исследования (табл. 1) показывают, что АГ обнаруживается во всех исследуемых органах у крыс, содержащихся в нормальных условиях. Обнаружено варьирование активности фермента в зависимости от органа. Максимальное увеличение активности обнаружено в сердце и составило 2,594 Е/г сырой массы и почках - 2,003 Е/г сырой массы. Наименьшее значение активности аконитазы выявлено в печени (0,601 Е/г сырой массы) и мозге (0,711 Е/г сырой массы). Определяя значение активности изучаемого фермента в расчете на мг белка, было обнаружено, что максимальная аконитазная активность проявляется в мышечной ткани (0,062 Е/мг белка) и мозге (0,067 Е/мг белка), а минимальная - в сердце (0,012 Е/мг белка) и почках (0,011 Е/мг белка).

Таблицд 1.

Распределение активностей аконитаггидратазы и маркерных ферментов по клеточным фракциям у контрольных животных (п = 8, р < 0,05)

Орган Фракция Активность, %

ЛДГ СДГ Каталаза АГ

Мозг 1 95,0±3,6 3,2±0,1 0,0 97,2±5,2

2 4,7 ±0,4 96,8±4,8 0,0 2,8±0,1

Сердце 1 86,1±2,5 19,9±0,7 0,0 84,5±3,9

2 13,9±0,6 80,1 ±3,0 0,0 15,5±0,7

Поджелуд. 1 81,0±3,1 15,4±0,6 0,0 95,5±5,0

железа 2 19,0±0,7 84,6±3,4 0,0 4,5±0,2

Легкие 1 98,1±4,2 8,9±0,4 0,0 98,1±5,5

2 1,9±0,1 91,1±5,2 0,0 1,9±0,1

Мышцы 1 86,2±3,2 20,0±0,5 0,0 78,5±3,0

2 13,8±0,7 80,0±3,2 0,0 21,5±0,8

Почки 1 79,5±3,5 11,2±0,4 0,0 80,6±3,5

2 20,5±0,9 88,8±3,5 0,0 19,4±0,4

Печень 1 73,9±2,9 5,6±0,1 0,0 75,0±2,8

2 26, Ш,8 94,4±4,1 0,0 25,0±0,6

1 - щпоплазматическая фракция; 2 - мигохоцдриальная фракция

Изучение распространения аконитатгцдратазной активности показало, что имеет место значительная вариация активности фермента в различных органах крыс, вероятно, обусловленная функциональным назначением органов и протекающих в них метаболических процессов. Показано наличие аконитатпщратазной активности во всех изучаемых тканях контрольных животных. На четвертый день аллоксанового диабета наблюдалось увеличение общей активности фермента в исследуемых тканях крысы.

Исследование изоферментного состава АГ в органах крыс показало наличие двух множественных молекулярных форм фермента. После специфического проявления в ПААГ обнаружены во всех органах контрольных животных быстро- и медленнодвижущаяся изоформы аконитазы.

£ ■"" 12 3 4 5 6 7

Рис. 1. Изоферментный состав аконитатгидратазы из различных органов крыс. Р - фронт красителя (бромфеноловый синий); к - контроль; о - опыт; стрелка показывает направление движения белка в геле; 1 - легкие; 2 - мозг; 3 - поджелудочная железа; 4 - печень; 5 - почки; 6 - сердце; 7 - мышечная ткань; 8 - в митохондриях.

Так, АГ, выделенная из почек, имеет быстродвижущуюся изоформу с Иг 0,55 и медленнодвижугцуюся - с 0,67, для гепатоцитов эти значения составили 0,62 и 0,7, а для сердца 0,53 и 0,59 соответственно (рис. 1).

Известно о разделении изоферментов АГ из цитоплазматической и митохондриальной фракций сердца свиньи. При проявлении АГ у опытных животных с аллоксановым диабетом наблюдалось появление третьей белковой полосы, отличной по электрофоретической подвижности от вышеупомянутых изоформ. К примеру, индуцированная изоформа из клеток печени характеризовалась более медленной скоростью движения по гелю и ее К, составила 0,82.

ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКООЧИЩЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗОФОРМ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ

Для выяснения механизмов регуляции АГ из гепатоцитов крыс в норме и в условиях аллоксанового диабета была проведена очистка цитоплазматической и митохондриальной изоформ исследуемого фермента. Результаты типичных очисток аконитазы, выделенной из печени опытных и контрольных животных, представлены в таблице 2.

Использование 5-ти стадийной схемы очистки открыло возможность для получения цитозольной фракции фермента из гепатоцитов опытных животных с удельной активностью 9,716 Е/мг белка, что соответствует очистке в 219 раз и выходу - 10% и митохондриальной - с удельной активностью - 6,105 Е/мг белка, очисткой - в 121 раз и выходом -12%.

Таблица 2.

Результаты очистки аконитатгидратазы из печени крыс в норме и в условиях аллоксанового диабета (п = 5, р < 0,05)

Клеточная Вариант Удельная Выход, Степень

фракция активность, Е/мг белка % очистки

Цитоплазма Норма 1,736 ±0,024 6 115

Диабет 9,716 ±0,154 10 219

Митохондрии Норма 1,256 ±0,024 6,5 79

Диабет 6,105 ±0,129 12 121

Были очищены изучаемые изоформы аконитазы из цитоплазмы и митохондрий гепатоцитов крыс, содержащихся в нормальных условиях (табл.2). Удельная активность цитозольной АГ, выделенной из печени контрольных животных, составила 1,736 Е/мг белка, что соответствует очистке в 115 раз и выходу - 6%, а митохондриальная - с удельной активностью - 1,256 Е/мг белка, очисткой - в 79 раз и выходом - 6,5%.

А Б В А Б В

Рис. 2. Электрофореграммы аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс: I - цитоплазматическая аконитатгидратаза; II - митохондриальная аконитатгидратаза; А - универсальное окрашивание амидом черным (контроль); Б - универсальное окрашивание амидом черным (опыт - 4ЬЩ день голодания); В - специфическое проявление; Р - белковая полоса; Р - фронт красителя бромфенолового синего.

Электрофоретические исследования в ПААГ полученных препаратов цитоплазматической и митохондриальной изоформ аконитазы показали наличие на электрофореграммах после использования нитрата серебра одной белковой полосы с 1^0,7 и 0,62 соответственно. Таким образом, можно говорить о гомогенности полученных изоформ фермента (рис. 2).

Специфическое проявление на активность АГ гелей показало, что полученные электрофоретически гомогенные препараты фермента имеют аконитазную активность.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ

Получение изоферменгов в электрофоретически гомогенном состоянии позволило изучить их физико-химические и каталитические свойства. Такие исследования необходимы для выяснения физиологической роли АГ, которая принимает участие в осуществлении, как энергетического, так и конструктивного метаболизма (Ишкег, 1971). Кроме того, принципиальным является вопрос о четвертичной структуре аконитазы. Известно, что фермент из растений, по некоторым данным, имеет мономерное строение (Землянухин и др., 1986). Неясной остается проблема участия железа в каталитическом акте, осуществляемом этим ферментом (Епринцевидр., 1995, Кош1апйюуа 8.0., 2000).

Значения молекулярной массы АГ из гепатоцитов крыс, определенные гель-фильтрацией на сефадексе Тоуореаг1 Н\У-65, составляют 96±4,8 кДа (диабет) и 91±5,2 кДа (норма) для цитоплазматической изоформы, а также для митохондриальной - 80±3,9 кДа (опыт) и 84±4,1 кДа (контроль) (рис 3).

Определенные рядом исследователей ранее гель-фильтрацией на сефадексе С-150 значения молекулярной массы АГ, выделенной из щитков кукурузы, составляли 102±1,5 кДа, при этом указывалось на мономерное строение молекулы фермента, так как методом диск-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия были определены данные значения, имеющие близкие результаты и составившие 98±1,1 кДа (Епринцев и др., 1995).

Рис. 3. Определение молекулярной массы изоформ аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс методом гель-фильтрации на Тоуореаг1 Н\У-65: 1 - каталаза; 2 - бычий сывороточный альбумин; 3 - яичный альбумин; 4 - пероксидаза; 5 - цитохром С; 6 - цитоплазматическая изоформа (опыт - диабет: 4 день); 7 - цитоплазматическая изоформа (контроль); 8 - митохондриальная изоформа (опыт - диабет: 4 день); 9 - митохондриальная изоформа (контроль); (п = 6, р<0,05).

Определение молекулярной массы аконитазы из печени крысы с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия показало результаты, отличные от полученных методом гель-фильтрации на ТоуореаН 1Ш-65 (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма аконитатгидратазы и

маркерных белков в присутствии додецилсульфата натрия: 1 - лизоцим; 2 - ангидраза; 3 - овальбумин; 4 - бычий сывороточный альбумин; 5 - целлюлаза;

6 - цитоплазматическая изоформа аконитатгидратазы;

7 - митохондриальная изоформа аконитатгидратазы.

Молекулярная масса цитоплазматической аконитазы из гепатоцитов опытных и контрольных крыс, а также митохондриальный фермент, имели значение молекулярной массы одного порядка - от 40 до 45 кДа. Было установлено, что выделенные и очищенные до гомогенного состояния изоформы фермента, состоят из двух одинаковых субьединиц с молекулярной массой 45 кДа для цитоплазматической фракции фермента и 41 кДа - фракции, локализованной в митохондриях. Следовательно, АГ из гепатоцитов крыс представляет собой изологический димер, что согласуется с данными, полученными другими авторами (Villafranca, Mildvan, 1971, Kennedy et al., 1992). При исследовании каталитических характеристик аконитазы было установлено, что фермент подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Так, определена величина Км по цитрату для цитоплазматической изоформы - 83,52 мкМ в нормальных условиях и 93,70 мкМ - при экспериментальном диабете. Для фракции, локализованной в митохондриях, эти значения Км составили 20,12 мкМ и 24,31 мкМ соответственно. При рассмотрении данных о влиянии изоцитрата и цис-аконитата на активность фермента, были установлены намного меньшие значения данной константы. Например, по цис-аконитату для цитоплазматической изоформы в опыте Км составила 14,65 мкМ, а в контроле - 10,20 мкМ, а для митохондриальной - 4,20 мкМ и 2,91 мкМ, соответственно в опыте и эксперименте. Значения Vmax для цитоплазматической и митохондриальной изоформ, выделенных из гепатоцитов опытных крыс, равнялись 2,06±0,017 Е/мг белка и 0,045±0,009 Е/мг белка (субстрат - цитрат).

Для изучения рН-оптимума исследуемых изоформ фермента, выделенных из гепатоцитов крыс, использовались различные буферные системы. Максимальная активность АГ проявлялась в интервале рН 6,8-8,0. Выявлено, что цитозольная форма имела рН оптимум, сдвинутый в щелочную область по сравнению с митохондриальной изоформой, что, по-видимому, обусловлено состоянием среды в цитоплазматической фракции (Игамбердиев А.У., 1990).

МЕТАБОЛИТНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ Исследование влияния интермедиатов клеточного метаболизма на активность изоформ АГ из гепатоцитов крыс позволило обнаружить, что малат, сукцинат, глиоксилат, оксалоацетат, фумарат, транс-аконитат, глкжозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат ингибируют обе изоформы фермента по конкурентному типу (рис. 5).

■ч. с:* на \п

-! (I 1 2 3

I Ч. СД нп М!

-1 о I Б

[I]. мМ/л

1 V. сл на V.! 1/\'. ел иа VI 1.5 1.0

1.5 1.0 ... 2

-5ч,Ж5 '» „ 1 О ° о 0.5 -К ,, '' "

у' ^ X 1 !

-л -2-1 п 1 г з -з ,'1|. \>М;.1 А -2 -10 12 3 |1|.мМ Б

Рис. 5. Определение константы ингибирования митохондриальной аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс: (А - глюкозо-1-фосфатом; Б - глюкозо-6-фосфатом)

1 - 4 мМ изоцитрат; 2-2 мМ изоцитрат.

Величины констант ингибирования цитоплазматической АГ для глюкозо-

1-фосфата и глюкозо-6-фосфата равнялись 2,1 мМ и 2,4 мМ, а для митохондриальной - 0,78 и 1,17 мМ соответственно. Применение малоната и 2-оксоглутарата не вызывало ингибирующего действия аконитазной активности во всех экспериментальных экспозициях.

Предполагается участие данных органических кислот в регуляции функционирования ГЦ и ЦТК в условиях экспериментального диабета. Причем, устойчивость к этим интермедиатам значительно выше у цитозольной формы фермента. Наиболее эффективными ингибиторами митохондриальной аконитазы были глиоксилат, сукцинат и фумарат.

Проведение опытов по исследованию влияния ионов железа на цитоплазматическую и митохондриальную аконитазу, выделенных из гепатоцитов голодающих крыс, показало, что при использовании РеС12 в концентрации 0,1-1 мМ и цистеина - 0,05-0,5 мМ наблюдалось активирование данных изоформ фермента. При использовании РеС12 в концентрации 0,55 мМ и цистеина - 0,35 мМ обнаружено максимальное увеличение активности цитоплазматического фермента, которое составляло 18,5 Е/мг белка (рис. 6). Дальнейшее изучение влияния данных соединений на активность АГ, выделенной из цитоплазмы, показало, что увеличение их концентраций не приводило к росту активности исследуемого фермента.

Рис. 6. Влияние ионов Ре и цистеина на активность изоформ аконитатгидратазы из печени опытных крыс (концентрация изоцитрата - 2 мМ):

1 - цитоплазматическая изоформа;

2 - мнтохондриальная изоформа; (п = 6, р < 0,05).

[Цистекн], мМ

О 0.1 0,2 0,3 ад 0,5 0,6 0,7 0.8 0.9 1,0 [Ге), мМ

Установленное активирующее влияние РеС12 (0,1-1 мМ) совместно с цистеином (0,05-0,5мМ) на активность обеих изоформ аконитатгидратазы и выявленное ингибирующее действие перекиси водорода свидетельствует о важной роли Ре в каталитическом акте и регуляции активности фермента.

Проведенные исследования объяснили этот факт тем, что в железодефицитных тканях формируется неполная ферментная система, что подтверждает значение железа не только для выполнения активирования, но и играющего роль интегрального компонента энзимной системы.

ЭКСПРЕССИЯ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ

Применение гуанидинтиоцианата позволило выделить тотальную РНК практически без следов деградации, о чем свидетельствует более высокое содержание в них 28S рРНК, по сравнению с количеством 18S рРНК. Качество полученного препарата тотальной РНК проанализировано с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (рис 1).

4- 28S рРНК

рРНК рис Результаты выделения суммарной клеточной РНК из контрольных (к) и крыс с аллоксановым диабетом (о).

Выделенную суммарную РНК использовали для синтеза кДНК методом обратной транскрипции с М-МиЬУ-обратной транскриптазой и праймерами олиго(с1Т)18 (рис 7) (Алексеев В.П., Каминский В.А., 2005). Использование этого метода дало возможность получить набор комплементарных ДНК с длиной от 4500 до 300 нуклеотидных пар (рис 8). Полученную кДНК использовали в дальнейшем для проведения полимеразной цепной реакции (Ребриков Д.В., 2006).

Проведенный ПЦР-анализ кДНК с полученными ген-специфическими праймерами и последующий электрофорез продуктов реакции в 1% агарозном геле показал наличие одной полосы после гель-электрофореза (рис. 9). Один продукт полимеразной цепной реакции с подобранными нами праймерами

является результатом специфического связывания праймеров с матрицей, что подтверждает наличие мРНК гена митохондриальной формы аконитатгидратазы в суммарной вытяжке РНК.

5000 а и.

500 п. н.

Рис 8. Продукты обратной транскрипции суммарной клеточной РНК контрольных и опытных крыс с использованием ревертазы М-МиЬУ и олиго-(ёТ)|8 праймера.

Единственная полоса на геле после ПЦР показывает, что взаимодействие между ними является результатом специфического связывания праймеров и кДНК. Специфичность праймеров была подтверждена реамплификацией экстрагированного из геля ПЦР-продукта, что подтверждается также наличием только одной полосы в геле.

Рис. 9. Анализ ПЦР-продукта, полученного с кДНК, с использованием генспецифических праймеров для митохондриальной формы

аконитатгидратазы.

Р - продукт амплификации.

Данные ОТ-ПЦР свидетельствуют о том, что в печени крыс активно экспрессируется ген, кодирующий аконитатгидратазу, что указывает на наличие белковой молекулы АГ, способной осуществлять каталитическую реакцию.

Подтверждением данного заключения служит наличие ферментативной активности АГ в печени крыс (табл. 1).

Для оценки количественных показателей интенсивности работы гена, кодирующего митохондриальную аконитатгидратазу, использовали метод ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя Sybr Green. Этот метод позволяет количественно оценить скорость транскрипции гена. Кроме того, ПЦР-РВ дает возможность оценить изменения в интенсивности работы гена в зависимости от экспериментальных условий и действия внешних факторов. Данный метод позволяет оценивать результат работы гена, т.е. концентрацию мРНК, на основе анализа кДНК (Tzachi В. et al., 2003). Для этого суммарную РНК, выделенную из животных, в разных экспериментальных условиях подвергали обратной транскрипции с целью получения кДНК.

* 4'5 S 4

2 S 2,5

р 5 1.5

S 0,5° 0

вариант опыта

Рис. 10. Концентрация продуктов

амплификации после проведения ПЦР-РВ с кДНК крыс контрольной группы (к) и с аллоксановым диабетом (о) и генспецифическими праймерами для гена митохондриальной формы АГ.

Расчетные значения относительной концентрации кДНК гена митохондриальной аконитатгидратазы в разных образцах отличаются между собой. Из показателей, приведенных на рисунке 10, видно, что в печени крыс с аллоксановым диабетом концентрация транскрипта выше такового показателя у контрольных в 3,76 раза. Это свидетельствует о разнице в количестве транскрипта в исследуемых образцах после проведения ПЦР, а соответственно и о разнице в содержании начальной матрицы мРНК в исследуемых образцах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Функционирование глиоксилатного цикла в животных тканях остается дискуссионным вопросом. Однако, ранее наблюдался феномен ресинтеза гликогена в печени крыс при голодании (Лебкова, 1982). Вторичное накопление

полисахарида обеспечивалось процессом деградации запасных жиров. На нашей кафедре было установлено, что биохимическим механизмом этого процесса является индукция ферментов глиоксилатного цикла. Ключевые ферменты глиоксилатного цикла - изоцитратлиаза и малатсинтаза - индуцируются в печени крыс на третий день голодания и при экспериментальном диабете (Волвенкин, 1999). Очень мало информации об организации и функционировании других ферментных систем, обеспечивающих работу глиоксилатного пути. В частности, ключевым энзимом, обеспечивающим протекание разных метаболических путей, является аконитатгидратаза. В нашей работе показана индукция активности цитоплазматической и митохондриальной изоформ АГ у крыс при экспериментальном диабете, что свидетельствует об ускорении метаболических процессов, связанных с так называемым аконитазным равновесием. Митохондриальный изофермент АГ обеспечивает работу цикла трикарбоновых кислот, катализируя метаболизм трикарбоновых кислот. Активация окислительных процессов, по всей вероятности, играет важнейшую роль в энергообеспечении клетки в стрессовых условиях, когда затраты организма на поддержание гомеостаза испытывают напряжение. Цитоплазматическая аконитатгидратаза может играть несколько ролей. Прежде всего, участвует в анаплеротических реакциях цикла Кребса, то есть образовании аминокислот из 2-оксоглутарата и в глюконеогенезе, функционируя в глиоксилатном цикле. Индукция цитоплазматической формы исследуемого фермента, по-видимому, катализирует взаимопревращение цитрата, цис-аконитата и изоцитрата для обеспечения функционирования глиоксилатного цикла, возникающего в гепатоцитах при аллоксановом диабете. Ранее сообщалось об аналогичной реакции данной ферментной системы в клетках печени при пищевой депривации (Епринцев и др., 2001).

Успешное применение многостадийной схемы очистки аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс при аллоксановом диабете позволило получить электрофоретически гомогенные или высокоочищенные препараты этого фермента. Сравнительное изучение кинетических и регуляторных свойств аконитатгидратазы из опытных и контрольных крыс позволило выявить определенные закономерности. Показано, что исследуемый фермент из клеток печени может ингибироваться различными интермедиатами, в частности, органическими кислотами (сукцинат, малат, глиоксилат и др.). Выявлены некоторые отличия по уровню удельной активности, значению кинетических свойств, рН оптимуму и другим важным характеристикам. Митохондриальная

изоформа характеризовалась гораздо более высоким сродством практически ко всем субстратам аконитатгидратазы. Цитозольная форма аконитатгидратазы хранилась более эффективно и проявляла большую устойчивость к перекиси водорода, разрушающей железосерные кластеры белковой молекулы, что вызывало ингибирование аконитазной активности. Проведенные исследования установили наличие нуклеотидной последовательности в геноме крысы гомологичной аконитатгидратазе из растений и микроорганизмов. Проведение лолимеразной цепной реакции с праймерами, разработанными по наиболее консервативным последовательностям в составе белка, подтвердили это предположение. Полимеразная цепная реакция проводилась с комплементарной ДНК, полученной в результате обратной транскрипции всех мРНК, выделенных из печени крыс при аллоксановом диабете.

На основании полученных результатов и литературных данных можно предположить следующую гипотетическую схему, показывающую роль изоформ АГ в ферментативной регуляции глюконеогенеза в печени крыс в условиях аллоксанового диабета.

Л1. КЧ.' ановый дпибгт

перокшгемя

мнтохондрия

Рис. 11. Гипотетическая схема участия изоформ аконитатгидратазы в трансформации метаболических процессов в гепатоцитах крыс в условиях аллоксанового диабета.

1. Установлено, что в клетках печени контрольных и опытных крыс существует два основных пула аконитазной активности. Электрофоретические исследования выявляют две изоформы АГ, специфически локализованные в митохондриальной и цитоплазматической фракциях. В условиях экспериментального диабета происходит индукция активности, как цитоплазматической, так и митохондриальной изоформ. Кроме того, наблюдается возникновение новой формы аконитатгидратазы с относительной электрофоретической подвижностью 0,82).

2. Использование модифицированной схемы очистки позволило получить элекгрофоретически гомогенные препараты изоферментов аконитатгидратазы из контрольных и опытных крыс. Удельная активность высокоочищенной изоформы, имеющей цитоплазматическую локализацию, составляла 1,8 Е/мг белка, что соответствовало очистке более чем в 100 раз. Для митохондриальной формы характерно более низкое значение этой характеристики, которая составляла 1,2 Е/мг белка.

3. Установлено методами гель-хроматографии на сефадексе й-150 и Тоуореаг1 и Оз-Иа ПААГ-электрофорезом субъединичное строение изоформ аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс. Исследуемый фермент имеет димерное строение, причем субъединицы изологичны и имеют молекулярную массу 45 кДа (цитоплазма) и 41 кДа (митохондрии).

4. Сравнительное изучение кинетических и регуляторных свойств аконитатгидратазы у крыс опытных и контрольных групп позволило выявить определенные закономерности. Значения Кт для всех субстратов свидетельствуют об увеличении сродства аконитазы в ряду цитрат —* цис-аконитат —» изоцитрат. Величина оптимума рН аконитатгидратазы из цитоплазматической фракции сдвинута в щелочную область по сравнению с митохондриальной изоформой.

5. Влияние различной концентрации интермедиатов - малата, сукцината, глиоксилата, глкжозо-1-фосфата, глюкозо-6-фосфата и других показало, что большинство из них вызывает ингибирование по конкурентному типу. Причем, тормозящий эффект характерен для всех изучаемых изоформ аконитатгидратазы.

6. Было установлено, что воздействие перекиси водорода зависит от пределов используемой концентрации. При ее высоких значениях наблюдается

полная инактивация цитоплазматической и митохондриальной форм АГ в норме и при патологии.

7. Подбор специфических праймеров к генам acol и асо2 позволил идентифицировать генетический материал, обеспечивающий синтез изоформ аконитатгидратазы в гепатоцитах печени крыс. Наличие ПЦР-продуктов в гепатоцитах опытных и контрольных животных свидетельствует об активной экспрессии исследуемых генов.

8. Экспрессия генов acol и асо2 в клетках печени у крыс при экспериментальном сахарном диабете резко увеличивалась. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов четко коррелирует с динамикой активности аконитатгидратазы в гепатоцитах, являясь важнейшим механизмом ее регуляции.

9. Разработана гипотетическая схема регуляции функционирования изоформ аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс в условиях аллоксанового сахарного диабета. Индукция активности и появление новой изоформы аконитатгидратазы в печени крыс при диабете указывают на участие аконитатгидратазной ферментной системы в адаптивной реакции организма в стрессовых условиях.

Список публикаций по теме диссертации

1. Альнассер А. Регуляция аконитазной активности в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального аллоксанового диабета / А. Альнассер, H.A. Карпеченко, В.Ю. Башмаков, А. Саба X. // Материалы международной научно-практической конференции «Высокие технологии. Фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии». - Санкт-Петербург. -2010, № 1, секция 2. С.99-100.

2. Альнассер А. Выделение и регуляторные свойства цитоплазматической формы аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс в условиях аллоксанового диабета / А. Альнассер, Ю.А. Стольникова, H.A. Карпеченко, А.Т. Епринцев // Межрегиональный сборник научных работ. Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - ВГУ. - 2010. - Выпуск 12. -С. 28-35.

3. Альнассер А. Применение ионообменной хроматографии для получения высокоочищенных препаратов аконитатгидратазы из животных и растительных объектов / А. Альнассер, М.В. Зайчикова, Ю.А. Стольникова [и др.] Н Сорбционные и хроматографические процессы. - 2010. - Т. 10. - Вып. 6. С.943-949.

4. Зайчикова М.В. Регуляторные и кинетические характеристики цитоплазматической аконитатгидратазы из растительных и животных тканей / М.В. Зайчикова, А. Альнассер, А.Т. Епринцев [и др.]// Вестник ВГУ: серия биология, химия. - 2010. - № 2. - С.81-84.

5. Зайчикова М.В. Очистка цитоплазматической аконитатгидратазы и исследование ее регуляторных свойств / М.В. Зайчикова, А. Альнассер, А.Т. Епринцев [и др.] // Межрегиональный сборник научных работ «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов». 2010. - Выпуск 12. - С. 97102.

6. Альнассер А. Эпигенетические нарушения онкогенного сигнального пути ^^Т при хроническом В-клеточном лейкозе / А. Альнассер, Е.А. Москалев, А.Т. Епринцев [и др.] // Биология - наука XXI века: 13-я Путинская школа-конференция молодых ученых. - Пущино, 28 сентября - 2 октября, 2009. -С.31.

Работы № 3 и № 4 опубликованы в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.

Подписано в печать 20.01.10. Формат 60*84 '/]6. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 72.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидат биологических наук , Альнассер Амин

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессионная и метаболитная регуляция функционирования аконитатгидратазы в клетках печени крыс в условиях экспериментального диабета"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Альнассер Амин

Библиография Диссертация по биологии, кандидат биологических наук , Альнассер Амин, Воронеж