Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессионная и метаболитная регуляция функционирования аконитатгидратазы в клетках печени крыс в условиях экспериментального диабета
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессионная и метаболитная регуляция функционирования аконитатгидратазы в клетках печени крыс в условиях экспериментального диабета"

На правах рукописи

Альнассер Амин

Экспрессионная и метаболитная регуляция функционирования аконитатгидратазы в клетках печени крыс в условиях экспериментального диабета

Специальность 03.01.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о / лтэ

Воронеж-2010

4854609

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Защита состоится 25 февраля 2011 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет».

Автореферат разослан 21 января 2011 года.

Пашков Александр Николаевич,

кандидат биологических наук, доцент Шуваева Галина Павловна

Ведущая организация Всероссийский научно-исследовательский

ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович М.Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последнее время ферменты глиоксилатного цикла являются объектами значительного количества исследований. Однако, основное внимание уделяется изучению этих ферментов из растений и микроорганизмов. Глиоксилатный цикл, являясь важнейшим этапом глюконеогенеза, осуществляет синтез из двух молекул ацетил-КоА одной молекулы сукцината, используемой для синтеза углеводов. Появились серьезные публикации об индукции глиоксилатного цикла в животных тканях. Наличие ферментов р-окисления жирных кислот в животных пероксисом и феномен ресинтеза гликогена в печени крыс при некоторых патологиях позволяет предположить возможность индукции ферментов глиоксилатного цикла (Лебкова, 1984, Епринцев, 2005, Попов, 1996). Ранее на нашей кафедре была выявлена индукция изоцитратлиазы и малатсинтазы в гепатоцитах крыс в условиях пищевой депривации и экспериментального диабета (Popov, 1996, 1998). Особый интерес вызывает функционирование аконитатгидратазы (АГ; КФ 4.2.1.3), участвующей в функционировании, как цикла Кребса, так и глиоксилатного пути. Рядом авторов было показано наличие двух изоферментных форм растительной аконитатгидратазы в цитоплазме и глиоксисомах, а также в митохондриях (Епринцев и др., 1995). В работах по изучению распространения аконитазной активности в животных тканях установлено аналогичное распределение локализации данного фермента (Kennedi et al., 1992, Konstantinova et al., 2000).

Огромную важность имеет проблема воздействия стрессовых факторов на функционирование живых организмов, как для теории, так и для практики. Ранее нами было установлено, что такие ферменты, как изоцитратлиаза, малатсинтаза, малатдегидрогеназа, индуцируются в печени крыс при пищевой депривации и экспериментальном сахарном диабете (Popov et al, 1996, Попов и др.,2001).

Особенности функционирования других ферментов, обеспечивающих протекание цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного пути, практически не известны. Это в полной мере относится к работе аконитатгидратазы, участвующей в ферментативном катализе так называемого «аконитазного равновесия», обеспечивающего тонкую регуляцию анаболических и катаболических процессов и поддерживающих внутриклеточный гомеостаз в условиях нарушения факторов внешней среды.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование особенностей функционирования ферментной

аконитатгидратазной системы в животных клетках печени у крыс в условиях экспериментального сахарного диабета.

Исходя из цели, были определены следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную модель сахарного диабета с использованием инъекций индуктора аллоксана исследуемым животным.

2. Изучить изменение активности ряда ферментов глиоксилатного цикла и цикла Кребса в различных тканях крыс, находящихся в условиях аллоксанового диабета.

3. Получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты аконитаттидратазы из клеток печени опытных и контрольных групп животных.

4. Исследовать каталитические свойства и метаболитную регуляцию изоформ аконитаттидратазы.

5. Разработать высокоспецифические праймеры для идентификации генов аконитатгидратазы с использованием методов сравнительной геномики.

6. Провести ОТ-ПЦР анализ матричной РНК для идентификации генов, кодирующих изоферменты аконитаттидратазы.

7. Провести количественный анализ уровня экспрессии генов аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального сахарного диабета.

8. Разработать гипотетическую схему регуляции клеточного метаболизма на уровне аконитатгидратазной реакции в печени крыс при аллоксановом диабете.

Научная новизна. Получены новые экспериментальные данные особенностей функционирования аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета. Применение многостадийной схемы очистки позволило получить исследуемый фермент в электрофоретически гомогенном состоянии из опытной и контрольной групп крыс. Выяснено субклеточное распределение аконитазной активности в животных клетках, которое связано с глиоксисомами, пероксисомами и цитоплазмой. Было выявлено, что значительная часть активности аконитатгидратазы сосредоточена в цитоплазматической фракции животных клеток. Анализ полученных результатов свидетельствует о полифункциональности действия аконитатгидратазы в условиях аллоксанового диабета. При этом выявлен

индуцированный синтез аконитатгидратазы, повышающий скорость превращения трикарбоновых кислот, как в энергетическом, так и в анаболическом обменах.

Практическая значимость. Модифицированные схемы очистки высокоочищенных и электрофоретически гомогенных препаратов аконитатгидратазы из животных тканей могут найти широкое применение для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях, а также в научно-исследовательских работах, связанных с моделированием ферментных систем, обеспечивающих возникновение адаптивной реакции. Предлагается способ хранения аконитатгидратазы, обеспечивающий сохранность ее активности в течение длительного времени, что повышает эффективность применения препарата для биохимических анализов в лабораторной практике.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета при чтении лекций по биохимии, а также в спецкурсах по энзимологии. Кроме того, они применяются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях и были представлены на 12-й международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», международной научно-практической конференции «Высокие технологии. Фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии», Санкт-Петербург, 2010, межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2009-20Югт.), ежегодных научных секциях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (160 источников). Иллюстрационный материал включает 21 рисунок, 11 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объектов исследования использовали самцов беспородных лабораторных крыс (Rattus rattus L.) массой 200-300г.,

которые выращивались при обычных условиях питания, а затем были инвестированы подкожно 5% аллоксаном (100 мг/кг веса, раствор в 0,9% NaCl). Контрольные животные выращивались при обычном пищевом режиме; без введения аллоксана.

Контроль за индукцией сахарного диабета. Индукция диабета контролировалась по изменению концентрации глюкозы в крови. Кровь брали из хвостовой вены крысы. Определение глюкозы производили с помощью глюкометра "Сателлит плюс" (Россия).

Получение материала для исследования. Для получения печени опытных животных проводили декапитацию. Выделение фермента производили гомогенизацией 2 г печени в 10 мл среды выделения (1:5), содержащей 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 0,25 М сахарозу; 2 мМ цитрат Na, 1 мМ MgCl2, 4 мМ дитиотрейтол (ДТТ) и 1 мМ ЭДТА с последующей фильтрацией через 4-х слойную марлю. Осаждение неразрушенных тканей осуществляли центрифугированием при 7000g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость, содержащую изучаемый фермент, использовали для дальнейшей очистки.

Определение активности ферментов. Активность АГ определяли спектрофотометрическим методом на СФ - T70+UV-VIS «PG Instruments Ltd» (Англия), основанным на учёте разности поглощения цитрата и изоцитрата по сравнению с цис-аконитатом, при длине волны 240 нм.

За единицу активности принимали количество фермента, превращающее 1 мкМ субстрата или образующее 1 мкМ продукта за 1 минуту при 25°С и оптимальном значении pH.

Методы очистки аконитатгидратазы. Для получения высокоочищенных препаратов фермента использовали методы, включающие несколько стадий очистки: фракционирование животного экстракта сульфатом аммония, гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-25, ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, гель-хроматография на колонке с сефадексом G-200, гель-фильтрация на Toyopearl HW-65.

Электрофоретические исследования.

Аналитический электрофорез. Для изучения электрофоретической подвижности и выявления множественных молекулярных форм АГ проводили электрофорез в полиакриламидном геле по методу Дэвиса (Davis B.J., 1994).

Определение гомогенности ферментных препаратов. Для определения гомогенности очищенных препаратов АГ использовали методику с нитратом серебра (Nesterenko M.V. et al., 1994).

Специфическое проявление аконитатдегидрогеназы, Специфическое проявление аконитатгидратазы осуществляли тетразолиевым методом с использованием вспомогательного фермента изоцитратдегидрогеназы (Детерман Г., 1970). Четко локализующийся в месте образования диформазан указывал на положение АГ в пластинке геля.

Определение молекулярной массы субъединиц АГ. Для определения молекулярной массы АГ методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия пользовались детергентной системой, описанной Лэммли (Laemmly U.K., 1970). Для расчета молекулярной массы субъединиц фермента с помощью Ds-Na-ПААГ электрофореза строили калибровочную кривую по белкам с известной молекулярной массой.

Определение молекулярной массы нативного фермента. Для исследования четвертичной структуры и определения молекулярной массы нативной АГ использовали гель-хроматографию через Toyopearl HW-65 (Остерман JI.A., 1985).

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента. Кинетические и регуляторные свойства ферментов изучали на электрофоретически гомогенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, ингибирования, субстратного ингибирования, расчет термодинамических параметров осуществляли с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов (Варфоломеев С.Д., 1999).

Влияние рН на скорость ферментативной реакции определяли путем проведения серии измерений скорости ферментативной реакции при различных значениях рН. Влияние температуры на стабильность малатдегидрогеназы определяли путем инкубации фермента при различных значениях температуры за определенный период времени.

Определение количества белка. Определение общего количества белка проводили по методу Лоури (Lowry О.Н. et al., 1951).

Выделение суммарной клеточной популяции РНК. Для выделения суммарной клеточной РНК использовался метод гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной экстракции с использованием в качестве осадителя LiCI (Chomczynski P., SacchiN., 1987).

Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы. Для визуализации и анализа качества выделенной РНК использовался электрофорез в агарозном геле в присутствии интеркалирующего красителя - бромистого этидия.

Обратная транскрипция. Обратная транскрипция РНК осуществлялась с использованием обратной транскриптазы вируса Moloney лейкоза мышей М-MULVRT (Fermentas, Литва) для синтеза первой цепи кДНК согласно рекомендациям производителя.

Проведение обратнотранскриптазной полимеразной реакции. Полимеразную цепную реакцию генспецифичными праймерами проводили с помощью набора реактивов AmpliSence (Хеликон, Россия). Праймеры для ПЦР анализа имели следующие нуклеотидные последовательности: для acol прямой 5-GCTGAGCGGTACCAGCAGGC-31 обратный - 5'-GCGGGTCTCCTGAGAGGCCA-3'; для асо2 прямой - 5'-CCGCCTTCCTGTTCAGTTTG-3', обратный - 5'-

TGTAGAGGGAGTGCTGTCATCAA-3'.

Реакция ПЦР проводилась на приборе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и Biometra Personal Cycler (Biometra, Германия) со следующими параметрами амплификации: предварительная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 40 циклов: 95°С - 20 с, 58°С - 30 с, 72°С - 40 с, и, наконец, 72°С -4 мин.

Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени. ПЦР

в реальном времени проводили на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green. В качестве праймеров, подобранных с помощью программного обеспечения РптегЗ, использовали нуклеотидные последовательности к генам митохондриальной и цитоплазматической форм АГ. Параметры амплификации: предварительная денатурация 95 °С - 5 мин., затем цикл: 95 °С - 30 сек., 60 °С -30 сек., 72 °С - 30 сек. (детекция), финальная элонгация - 72 °С - 10 мин. Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации фактора элонгации ef-la с ген-специфичными праймерами (Nicot N. et al., 2005). В качестве отрицательного контроля использовали суммарную РНК без этапа обратной транскрипции.

Определение относительного уровня экспрессии исследуемых генов проводили с применением 2"лйс'-метода (Livak K.J., 2001) с использованием программного обеспечения Opticon Monitor™ Software (Biorad, США).

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 3-кратных биологических повторностях, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в 3-х повторностях. Для контроля достоверности результатов исследований применяли метод вариационной статистики. Полученные данные

обрабатывали с использованием стандартных статистических методов с помощью критерия Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990). В таблицах по очистке приводятся значения типичных опытов; каждое значение есть среднее из трех аналитических определений.

РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ИЗОФЕРМЕНТНЫЙ СОСТАВ АГ В ОРГАНАХ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ Результаты проведенного исследования (табл. 1) показывают, что АГ обнаруживается во всех исследуемых органах у крыс, содержащихся в нормальных условиях. Обнаружено варьирование активности фермента в зависимости от органа. Максимальное увеличение активности обнаружено в сердце и составило 2,594 Е/г сырой массы и почках - 2,003 Е/г сырой массы. Наименьшее значение активности аконитазы выявлено в печени (0,601 Е/г сырой массы) и мозге (0,711 Е/г сырой массы). Определяя значение активности изучаемого фермента в расчете на мг белка, было обнаружено, что максимальная аконитазная активность проявляется в мышечной ткани (0,062 Е/мг белка) и мозге (0,067 Е/мг белка), а минимальная - в сердце (0,012 Е/мг белка) и почках (0,011 Е/мг белка).

Таблицд 1.

Распределение активностей аконитаггидратазы и маркерных ферментов по клеточным фракциям у контрольных животных (п = 8, р < 0,05)

Орган Фракция Активность, %

ЛДГ СДГ Каталаза АГ

Мозг 1 95,0±3,6 3,2±0,1 0,0 97,2±5,2

2 4,7 ±0,4 96,8±4,8 0,0 2,8±0,1

Сердце 1 86,1±2,5 19,9±0,7 0,0 84,5±3,9

2 13,9±0,6 80,1 ±3,0 0,0 15,5±0,7

Поджелуд. 1 81,0±3,1 15,4±0,6 0,0 95,5±5,0

железа 2 19,0±0,7 84,6±3,4 0,0 4,5±0,2

Легкие 1 98,1±4,2 8,9±0,4 0,0 98,1±5,5

2 1,9±0,1 91,1±5,2 0,0 1,9±0,1

Мышцы 1 86,2±3,2 20,0±0,5 0,0 78,5±3,0

2 13,8±0,7 80,0±3,2 0,0 21,5±0,8

Почки 1 79,5±3,5 11,2±0,4 0,0 80,6±3,5

2 20,5±0,9 88,8±3,5 0,0 19,4±0,4

Печень 1 73,9±2,9 5,6±0,1 0,0 75,0±2,8

2 26, Ш,8 94,4±4,1 0,0 25,0±0,6

1 - щпоплазматическая фракция; 2 - мигохоцдриальная фракция

Изучение распространения аконитатгцдратазной активности показало, что имеет место значительная вариация активности фермента в различных органах крыс, вероятно, обусловленная функциональным назначением органов и протекающих в них метаболических процессов. Показано наличие аконитатпщратазной активности во всех изучаемых тканях контрольных животных. На четвертый день аллоксанового диабета наблюдалось увеличение общей активности фермента в исследуемых тканях крысы.

Исследование изоферментного состава АГ в органах крыс показало наличие двух множественных молекулярных форм фермента. После специфического проявления в ПААГ обнаружены во всех органах контрольных животных быстро- и медленнодвижущаяся изоформы аконитазы.

£ ■"" 12 3 4 5 6 7

Рис. 1. Изоферментный состав аконитатгидратазы из различных органов крыс. Р - фронт красителя (бромфеноловый синий); к - контроль; о - опыт; стрелка показывает направление движения белка в геле; 1 - легкие; 2 - мозг; 3 - поджелудочная железа; 4 - печень; 5 - почки; 6 - сердце; 7 - мышечная ткань; 8 - в митохондриях.

Так, АГ, выделенная из почек, имеет быстродвижущуюся изоформу с Иг 0,55 и медленнодвижугцуюся - с 0,67, для гепатоцитов эти значения составили 0,62 и 0,7, а для сердца 0,53 и 0,59 соответственно (рис. 1).

Известно о разделении изоферментов АГ из цитоплазматической и митохондриальной фракций сердца свиньи. При проявлении АГ у опытных животных с аллоксановым диабетом наблюдалось появление третьей белковой полосы, отличной по электрофоретической подвижности от вышеупомянутых изоформ. К примеру, индуцированная изоформа из клеток печени характеризовалась более медленной скоростью движения по гелю и ее К, составила 0,82.

ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКООЧИЩЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗОФОРМ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ

Для выяснения механизмов регуляции АГ из гепатоцитов крыс в норме и в условиях аллоксанового диабета была проведена очистка цитоплазматической и митохондриальной изоформ исследуемого фермента. Результаты типичных очисток аконитазы, выделенной из печени опытных и контрольных животных, представлены в таблице 2.

Использование 5-ти стадийной схемы очистки открыло возможность для получения цитозольной фракции фермента из гепатоцитов опытных животных с удельной активностью 9,716 Е/мг белка, что соответствует очистке в 219 раз и выходу - 10% и митохондриальной - с удельной активностью - 6,105 Е/мг белка, очисткой - в 121 раз и выходом -12%.

Таблица 2.

Результаты очистки аконитатгидратазы из печени крыс в норме и в условиях аллоксанового диабета (п = 5, р < 0,05)

Клеточная Вариант Удельная Выход, Степень

фракция активность, Е/мг белка % очистки

Цитоплазма Норма 1,736 ±0,024 6 115

Диабет 9,716 ±0,154 10 219

Митохондрии Норма 1,256 ±0,024 6,5 79

Диабет 6,105 ±0,129 12 121

Были очищены изучаемые изоформы аконитазы из цитоплазмы и митохондрий гепатоцитов крыс, содержащихся в нормальных условиях (табл.2). Удельная активность цитозольной АГ, выделенной из печени контрольных животных, составила 1,736 Е/мг белка, что соответствует очистке в 115 раз и выходу - 6%, а митохондриальная - с удельной активностью - 1,256 Е/мг белка, очисткой - в 79 раз и выходом - 6,5%.

А Б В А Б В

Рис. 2. Электрофореграммы аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс: I - цитоплазматическая аконитатгидратаза; II - митохондриальная аконитатгидратаза; А - универсальное окрашивание амидом черным (контроль); Б - универсальное окрашивание амидом черным (опыт - 4ЬЩ день голодания); В - специфическое проявление; Р - белковая полоса; Р - фронт красителя бромфенолового синего.

Электрофоретические исследования в ПААГ полученных препаратов цитоплазматической и митохондриальной изоформ аконитазы показали наличие на электрофореграммах после использования нитрата серебра одной белковой полосы с 1^0,7 и 0,62 соответственно. Таким образом, можно говорить о гомогенности полученных изоформ фермента (рис. 2).

Специфическое проявление на активность АГ гелей показало, что полученные электрофоретически гомогенные препараты фермента имеют аконитазную активность.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ

Получение изоферменгов в электрофоретически гомогенном состоянии позволило изучить их физико-химические и каталитические свойства. Такие исследования необходимы для выяснения физиологической роли АГ, которая принимает участие в осуществлении, как энергетического, так и конструктивного метаболизма (Ишкег, 1971). Кроме того, принципиальным является вопрос о четвертичной структуре аконитазы. Известно, что фермент из растений, по некоторым данным, имеет мономерное строение (Землянухин и др., 1986). Неясной остается проблема участия железа в каталитическом акте, осуществляемом этим ферментом (Епринцевидр., 1995, Кош1апйюуа 8.0., 2000).

Значения молекулярной массы АГ из гепатоцитов крыс, определенные гель-фильтрацией на сефадексе Тоуореаг1 Н\У-65, составляют 96±4,8 кДа (диабет) и 91±5,2 кДа (норма) для цитоплазматической изоформы, а также для митохондриальной - 80±3,9 кДа (опыт) и 84±4,1 кДа (контроль) (рис 3).

Определенные рядом исследователей ранее гель-фильтрацией на сефадексе С-150 значения молекулярной массы АГ, выделенной из щитков кукурузы, составляли 102±1,5 кДа, при этом указывалось на мономерное строение молекулы фермента, так как методом диск-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия были определены данные значения, имеющие близкие результаты и составившие 98±1,1 кДа (Епринцев и др., 1995).

Рис. 3. Определение молекулярной массы изоформ аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс методом гель-фильтрации на Тоуореаг1 Н\У-65: 1 - каталаза; 2 - бычий сывороточный альбумин; 3 - яичный альбумин; 4 - пероксидаза; 5 - цитохром С; 6 - цитоплазматическая изоформа (опыт - диабет: 4 день); 7 - цитоплазматическая изоформа (контроль); 8 - митохондриальная изоформа (опыт - диабет: 4 день); 9 - митохондриальная изоформа (контроль); (п = 6, р<0,05).

Определение молекулярной массы аконитазы из печени крысы с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия показало результаты, отличные от полученных методом гель-фильтрации на ТоуореаН 1Ш-65 (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма аконитатгидратазы и

маркерных белков в присутствии додецилсульфата натрия: 1 - лизоцим; 2 - ангидраза; 3 - овальбумин; 4 - бычий сывороточный альбумин; 5 - целлюлаза;

6 - цитоплазматическая изоформа аконитатгидратазы;

7 - митохондриальная изоформа аконитатгидратазы.

Молекулярная масса цитоплазматической аконитазы из гепатоцитов опытных и контрольных крыс, а также митохондриальный фермент, имели значение молекулярной массы одного порядка - от 40 до 45 кДа. Было установлено, что выделенные и очищенные до гомогенного состояния изоформы фермента, состоят из двух одинаковых субьединиц с молекулярной массой 45 кДа для цитоплазматической фракции фермента и 41 кДа - фракции, локализованной в митохондриях. Следовательно, АГ из гепатоцитов крыс представляет собой изологический димер, что согласуется с данными, полученными другими авторами (Villafranca, Mildvan, 1971, Kennedy et al., 1992). При исследовании каталитических характеристик аконитазы было установлено, что фермент подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Так, определена величина Км по цитрату для цитоплазматической изоформы - 83,52 мкМ в нормальных условиях и 93,70 мкМ - при экспериментальном диабете. Для фракции, локализованной в митохондриях, эти значения Км составили 20,12 мкМ и 24,31 мкМ соответственно. При рассмотрении данных о влиянии изоцитрата и цис-аконитата на активность фермента, были установлены намного меньшие значения данной константы. Например, по цис-аконитату для цитоплазматической изоформы в опыте Км составила 14,65 мкМ, а в контроле - 10,20 мкМ, а для митохондриальной - 4,20 мкМ и 2,91 мкМ, соответственно в опыте и эксперименте. Значения Vmax для цитоплазматической и митохондриальной изоформ, выделенных из гепатоцитов опытных крыс, равнялись 2,06±0,017 Е/мг белка и 0,045±0,009 Е/мг белка (субстрат - цитрат).

Для изучения рН-оптимума исследуемых изоформ фермента, выделенных из гепатоцитов крыс, использовались различные буферные системы. Максимальная активность АГ проявлялась в интервале рН 6,8-8,0. Выявлено, что цитозольная форма имела рН оптимум, сдвинутый в щелочную область по сравнению с митохондриальной изоформой, что, по-видимому, обусловлено состоянием среды в цитоплазматической фракции (Игамбердиев А.У., 1990).

МЕТАБОЛИТНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ Исследование влияния интермедиатов клеточного метаболизма на активность изоформ АГ из гепатоцитов крыс позволило обнаружить, что малат, сукцинат, глиоксилат, оксалоацетат, фумарат, транс-аконитат, глкжозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат ингибируют обе изоформы фермента по конкурентному типу (рис. 5).

■ч. с:* на \п

-! (I 1 2 3

I Ч. СД нп М!

-1 о I Б

[I]. мМ/л

1 V. сл на V.! 1/\'. ел иа VI 1.5 1.0

1.5 1.0 ... 2

-5ч,Ж5 '» „ 1 О ° о 0.5 -К ,, '' "

у' ^ X 1 !

-л -2-1 п 1 г з -з ,'1|. \>М;.1 А -2 -10 12 3 |1|.мМ Б

Рис. 5. Определение константы ингибирования митохондриальной аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс: (А - глюкозо-1-фосфатом; Б - глюкозо-6-фосфатом)

1 - 4 мМ изоцитрат; 2-2 мМ изоцитрат.

Величины констант ингибирования цитоплазматической АГ для глюкозо-

1-фосфата и глюкозо-6-фосфата равнялись 2,1 мМ и 2,4 мМ, а для митохондриальной - 0,78 и 1,17 мМ соответственно. Применение малоната и 2-оксоглутарата не вызывало ингибирующего действия аконитазной активности во всех экспериментальных экспозициях.

Предполагается участие данных органических кислот в регуляции функционирования ГЦ и ЦТК в условиях экспериментального диабета. Причем, устойчивость к этим интермедиатам значительно выше у цитозольной формы фермента. Наиболее эффективными ингибиторами митохондриальной аконитазы были глиоксилат, сукцинат и фумарат.

Проведение опытов по исследованию влияния ионов железа на цитоплазматическую и митохондриальную аконитазу, выделенных из гепатоцитов голодающих крыс, показало, что при использовании РеС12 в концентрации 0,1-1 мМ и цистеина - 0,05-0,5 мМ наблюдалось активирование данных изоформ фермента. При использовании РеС12 в концентрации 0,55 мМ и цистеина - 0,35 мМ обнаружено максимальное увеличение активности цитоплазматического фермента, которое составляло 18,5 Е/мг белка (рис. 6). Дальнейшее изучение влияния данных соединений на активность АГ, выделенной из цитоплазмы, показало, что увеличение их концентраций не приводило к росту активности исследуемого фермента.

Рис. 6. Влияние ионов Ре и цистеина на активность изоформ аконитатгидратазы из печени опытных крыс (концентрация изоцитрата - 2 мМ):

1 - цитоплазматическая изоформа;

2 - мнтохондриальная изоформа; (п = 6, р < 0,05).

[Цистекн], мМ

О 0.1 0,2 0,3 ад 0,5 0,6 0,7 0.8 0.9 1,0 [Ге), мМ

Установленное активирующее влияние РеС12 (0,1-1 мМ) совместно с цистеином (0,05-0,5мМ) на активность обеих изоформ аконитатгидратазы и выявленное ингибирующее действие перекиси водорода свидетельствует о важной роли Ре в каталитическом акте и регуляции активности фермента.

Проведенные исследования объяснили этот факт тем, что в железодефицитных тканях формируется неполная ферментная система, что подтверждает значение железа не только для выполнения активирования, но и играющего роль интегрального компонента энзимной системы.

ЭКСПРЕССИЯ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ

Применение гуанидинтиоцианата позволило выделить тотальную РНК практически без следов деградации, о чем свидетельствует более высокое содержание в них 28S рРНК, по сравнению с количеством 18S рРНК. Качество полученного препарата тотальной РНК проанализировано с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (рис 1).

4- 28S рРНК

рРНК рис Результаты выделения суммарной клеточной РНК из контрольных (к) и крыс с аллоксановым диабетом (о).

Выделенную суммарную РНК использовали для синтеза кДНК методом обратной транскрипции с М-МиЬУ-обратной транскриптазой и праймерами олиго(с1Т)18 (рис 7) (Алексеев В.П., Каминский В.А., 2005). Использование этого метода дало возможность получить набор комплементарных ДНК с длиной от 4500 до 300 нуклеотидных пар (рис 8). Полученную кДНК использовали в дальнейшем для проведения полимеразной цепной реакции (Ребриков Д.В., 2006).

Проведенный ПЦР-анализ кДНК с полученными ген-специфическими праймерами и последующий электрофорез продуктов реакции в 1% агарозном геле показал наличие одной полосы после гель-электрофореза (рис. 9). Один продукт полимеразной цепной реакции с подобранными нами праймерами

является результатом специфического связывания праймеров с матрицей, что подтверждает наличие мРНК гена митохондриальной формы аконитатгидратазы в суммарной вытяжке РНК.

5000 а и.

500 п. н.

Рис 8. Продукты обратной транскрипции суммарной клеточной РНК контрольных и опытных крыс с использованием ревертазы М-МиЬУ и олиго-(ёТ)|8 праймера.

Единственная полоса на геле после ПЦР показывает, что взаимодействие между ними является результатом специфического связывания праймеров и кДНК. Специфичность праймеров была подтверждена реамплификацией экстрагированного из геля ПЦР-продукта, что подтверждается также наличием только одной полосы в геле.

Рис. 9. Анализ ПЦР-продукта, полученного с кДНК, с использованием генспецифических праймеров для митохондриальной формы

аконитатгидратазы.

Р - продукт амплификации.

Данные ОТ-ПЦР свидетельствуют о том, что в печени крыс активно экспрессируется ген, кодирующий аконитатгидратазу, что указывает на наличие белковой молекулы АГ, способной осуществлять каталитическую реакцию.

Подтверждением данного заключения служит наличие ферментативной активности АГ в печени крыс (табл. 1).

Для оценки количественных показателей интенсивности работы гена, кодирующего митохондриальную аконитатгидратазу, использовали метод ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя Sybr Green. Этот метод позволяет количественно оценить скорость транскрипции гена. Кроме того, ПЦР-РВ дает возможность оценить изменения в интенсивности работы гена в зависимости от экспериментальных условий и действия внешних факторов. Данный метод позволяет оценивать результат работы гена, т.е. концентрацию мРНК, на основе анализа кДНК (Tzachi В. et al., 2003). Для этого суммарную РНК, выделенную из животных, в разных экспериментальных условиях подвергали обратной транскрипции с целью получения кДНК.

* 4'5 S 4

2 S 2,5

р 5 1.5

S 0,5° 0

вариант опыта

Рис. 10. Концентрация продуктов

амплификации после проведения ПЦР-РВ с кДНК крыс контрольной группы (к) и с аллоксановым диабетом (о) и генспецифическими праймерами для гена митохондриальной формы АГ.

Расчетные значения относительной концентрации кДНК гена митохондриальной аконитатгидратазы в разных образцах отличаются между собой. Из показателей, приведенных на рисунке 10, видно, что в печени крыс с аллоксановым диабетом концентрация транскрипта выше такового показателя у контрольных в 3,76 раза. Это свидетельствует о разнице в количестве транскрипта в исследуемых образцах после проведения ПЦР, а соответственно и о разнице в содержании начальной матрицы мРНК в исследуемых образцах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Функционирование глиоксилатного цикла в животных тканях остается дискуссионным вопросом. Однако, ранее наблюдался феномен ресинтеза гликогена в печени крыс при голодании (Лебкова, 1982). Вторичное накопление

полисахарида обеспечивалось процессом деградации запасных жиров. На нашей кафедре было установлено, что биохимическим механизмом этого процесса является индукция ферментов глиоксилатного цикла. Ключевые ферменты глиоксилатного цикла - изоцитратлиаза и малатсинтаза - индуцируются в печени крыс на третий день голодания и при экспериментальном диабете (Волвенкин, 1999). Очень мало информации об организации и функционировании других ферментных систем, обеспечивающих работу глиоксилатного пути. В частности, ключевым энзимом, обеспечивающим протекание разных метаболических путей, является аконитатгидратаза. В нашей работе показана индукция активности цитоплазматической и митохондриальной изоформ АГ у крыс при экспериментальном диабете, что свидетельствует об ускорении метаболических процессов, связанных с так называемым аконитазным равновесием. Митохондриальный изофермент АГ обеспечивает работу цикла трикарбоновых кислот, катализируя метаболизм трикарбоновых кислот. Активация окислительных процессов, по всей вероятности, играет важнейшую роль в энергообеспечении клетки в стрессовых условиях, когда затраты организма на поддержание гомеостаза испытывают напряжение. Цитоплазматическая аконитатгидратаза может играть несколько ролей. Прежде всего, участвует в анаплеротических реакциях цикла Кребса, то есть образовании аминокислот из 2-оксоглутарата и в глюконеогенезе, функционируя в глиоксилатном цикле. Индукция цитоплазматической формы исследуемого фермента, по-видимому, катализирует взаимопревращение цитрата, цис-аконитата и изоцитрата для обеспечения функционирования глиоксилатного цикла, возникающего в гепатоцитах при аллоксановом диабете. Ранее сообщалось об аналогичной реакции данной ферментной системы в клетках печени при пищевой депривации (Епринцев и др., 2001).

Успешное применение многостадийной схемы очистки аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс при аллоксановом диабете позволило получить электрофоретически гомогенные или высокоочищенные препараты этого фермента. Сравнительное изучение кинетических и регуляторных свойств аконитатгидратазы из опытных и контрольных крыс позволило выявить определенные закономерности. Показано, что исследуемый фермент из клеток печени может ингибироваться различными интермедиатами, в частности, органическими кислотами (сукцинат, малат, глиоксилат и др.). Выявлены некоторые отличия по уровню удельной активности, значению кинетических свойств, рН оптимуму и другим важным характеристикам. Митохондриальная

изоформа характеризовалась гораздо более высоким сродством практически ко всем субстратам аконитатгидратазы. Цитозольная форма аконитатгидратазы хранилась более эффективно и проявляла большую устойчивость к перекиси водорода, разрушающей железосерные кластеры белковой молекулы, что вызывало ингибирование аконитазной активности. Проведенные исследования установили наличие нуклеотидной последовательности в геноме крысы гомологичной аконитатгидратазе из растений и микроорганизмов. Проведение лолимеразной цепной реакции с праймерами, разработанными по наиболее консервативным последовательностям в составе белка, подтвердили это предположение. Полимеразная цепная реакция проводилась с комплементарной ДНК, полученной в результате обратной транскрипции всех мРНК, выделенных из печени крыс при аллоксановом диабете.

На основании полученных результатов и литературных данных можно предположить следующую гипотетическую схему, показывающую роль изоформ АГ в ферментативной регуляции глюконеогенеза в печени крыс в условиях аллоксанового диабета.

Л1. КЧ.' ановый дпибгт

перокшгемя

мнтохондрия

Рис. 11. Гипотетическая схема участия изоформ аконитатгидратазы в трансформации метаболических процессов в гепатоцитах крыс в условиях аллоксанового диабета.

1. Установлено, что в клетках печени контрольных и опытных крыс существует два основных пула аконитазной активности. Электрофоретические исследования выявляют две изоформы АГ, специфически локализованные в митохондриальной и цитоплазматической фракциях. В условиях экспериментального диабета происходит индукция активности, как цитоплазматической, так и митохондриальной изоформ. Кроме того, наблюдается возникновение новой формы аконитатгидратазы с относительной электрофоретической подвижностью 0,82).

2. Использование модифицированной схемы очистки позволило получить элекгрофоретически гомогенные препараты изоферментов аконитатгидратазы из контрольных и опытных крыс. Удельная активность высокоочищенной изоформы, имеющей цитоплазматическую локализацию, составляла 1,8 Е/мг белка, что соответствовало очистке более чем в 100 раз. Для митохондриальной формы характерно более низкое значение этой характеристики, которая составляла 1,2 Е/мг белка.

3. Установлено методами гель-хроматографии на сефадексе й-150 и Тоуореаг1 и Оз-Иа ПААГ-электрофорезом субъединичное строение изоформ аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс. Исследуемый фермент имеет димерное строение, причем субъединицы изологичны и имеют молекулярную массу 45 кДа (цитоплазма) и 41 кДа (митохондрии).

4. Сравнительное изучение кинетических и регуляторных свойств аконитатгидратазы у крыс опытных и контрольных групп позволило выявить определенные закономерности. Значения Кт для всех субстратов свидетельствуют об увеличении сродства аконитазы в ряду цитрат —* цис-аконитат —» изоцитрат. Величина оптимума рН аконитатгидратазы из цитоплазматической фракции сдвинута в щелочную область по сравнению с митохондриальной изоформой.

5. Влияние различной концентрации интермедиатов - малата, сукцината, глиоксилата, глкжозо-1-фосфата, глюкозо-6-фосфата и других показало, что большинство из них вызывает ингибирование по конкурентному типу. Причем, тормозящий эффект характерен для всех изучаемых изоформ аконитатгидратазы.

6. Было установлено, что воздействие перекиси водорода зависит от пределов используемой концентрации. При ее высоких значениях наблюдается

полная инактивация цитоплазматической и митохондриальной форм АГ в норме и при патологии.

7. Подбор специфических праймеров к генам acol и асо2 позволил идентифицировать генетический материал, обеспечивающий синтез изоформ аконитатгидратазы в гепатоцитах печени крыс. Наличие ПЦР-продуктов в гепатоцитах опытных и контрольных животных свидетельствует об активной экспрессии исследуемых генов.

8. Экспрессия генов acol и асо2 в клетках печени у крыс при экспериментальном сахарном диабете резко увеличивалась. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов четко коррелирует с динамикой активности аконитатгидратазы в гепатоцитах, являясь важнейшим механизмом ее регуляции.

9. Разработана гипотетическая схема регуляции функционирования изоформ аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс в условиях аллоксанового сахарного диабета. Индукция активности и появление новой изоформы аконитатгидратазы в печени крыс при диабете указывают на участие аконитатгидратазной ферментной системы в адаптивной реакции организма в стрессовых условиях.

Список публикаций по теме диссертации

1. Альнассер А. Регуляция аконитазной активности в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального аллоксанового диабета / А. Альнассер, H.A. Карпеченко, В.Ю. Башмаков, А. Саба X. // Материалы международной научно-практической конференции «Высокие технологии. Фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии». - Санкт-Петербург. -2010, № 1, секция 2. С.99-100.

2. Альнассер А. Выделение и регуляторные свойства цитоплазматической формы аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс в условиях аллоксанового диабета / А. Альнассер, Ю.А. Стольникова, H.A. Карпеченко, А.Т. Епринцев // Межрегиональный сборник научных работ. Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - ВГУ. - 2010. - Выпуск 12. -С. 28-35.

3. Альнассер А. Применение ионообменной хроматографии для получения высокоочищенных препаратов аконитатгидратазы из животных и растительных объектов / А. Альнассер, М.В. Зайчикова, Ю.А. Стольникова [и др.] Н Сорбционные и хроматографические процессы. - 2010. - Т. 10. - Вып. 6. С.943-949.

4. Зайчикова М.В. Регуляторные и кинетические характеристики цитоплазматической аконитатгидратазы из растительных и животных тканей / М.В. Зайчикова, А. Альнассер, А.Т. Епринцев [и др.]// Вестник ВГУ: серия биология, химия. - 2010. - № 2. - С.81-84.

5. Зайчикова М.В. Очистка цитоплазматической аконитатгидратазы и исследование ее регуляторных свойств / М.В. Зайчикова, А. Альнассер, А.Т. Епринцев [и др.] // Межрегиональный сборник научных работ «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов». 2010. - Выпуск 12. - С. 97102.

6. Альнассер А. Эпигенетические нарушения онкогенного сигнального пути ^^Т при хроническом В-клеточном лейкозе / А. Альнассер, Е.А. Москалев, А.Т. Епринцев [и др.] // Биология - наука XXI века: 13-я Путинская школа-конференция молодых ученых. - Пущино, 28 сентября - 2 октября, 2009. -С.31.

Работы № 3 и № 4 опубликованы в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.

Подписано в печать 20.01.10. Формат 60*84 '/]6. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 72.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидат биологических наук , Альнассер Амин

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности биохимических нарушений при диабете.

1.1.1. Сахарный диабет и метаболизм глюкозы в животной клетке.

1.1.2. Понятие об аллоксановом диабете.

1.1.3. Молекулярные механизмы адаптации при диабете.

1.1.4. Процесс глюконеогенеза в тканях животных.

1.1.5. Функционирование глиоксилатного цикла в тканях животных и человека.

1.2. Трансформация глюконеогенеза у животных в экстремальных условиях.

1.2.1. Биохимические сведения о трансформации жирных кислот в углеводы.

1.2.2. Роль глюконеогенетических ферментов и интермедиатов в адаптивной реакции при патологическом состоянии.

1.3. Особенности функционирования аконитатгидратазы.

1.3.1.Физиологическая роль аконитатгидратазы в обеспечении протекания различных физиолого-биохимических процессов в живых организмах.

1.3.2. Внутритканевая локализация и изоферментный состав аконитазы.

1.3.3. Очистка аконитатгидратазы.

1.3.4. Физико-химические и каталитические свойства.

1.3.5 Регуляция и экспрессия аконитазной активности под влиянием различных факторов.

1.3.6. Роль аконитатгидратазы в обмене железа.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Объект и методы исследования.

2.1.1. Объект исследования.

2.1.2. Методы исследования.

2.1.2.1. Контроль за индукцией диабета.

2.1.2.2. Получение материала для исследования.

2.1.2.3. Определение активности ферментов.

2.1.2.4. Методы очистки аконитатгидратазы.

2.1.2.5. Электрофоретические исследования.

2.1.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента.

2.1.2.7. Ингибиторный анализ.

2.1.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента.

2.1.2.9. Определение количества белка.

2.1.2.10. Определение молекулярной массы изоформ аконитатгидратазы.

2.1.2.11. Исследование кинетических характеристик фермента.

2.1.3. Выделение суммарной клеточной популяции РНК.

2.1.3.1. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы.

2.1.3.2. Обратная транскрипция.

2.1.3.3. Проведение обратнотранскриптазной полимеразной реакции.

2.1.3.4. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени.

2.1.4. Статистическая обработка результатов.

2.2. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.2.1. Внутритканевое распространение аконитатгидратазы.

2.2.2. Субклеточная локализация и изоферментный состав фермента в различных органах крыс.

2.2.3. Динамика, субклеточная локализация и изоферментный состав аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс.

2.2.3.1. Динамика активности аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс в условиях пищевой депривации.

2.2.3.2. Субклеточная локализация фермента.

2.2.3.3. Множественные молекулярные формы аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс.

2.2.4. Очистка изоформ аконитатгидратазы.

2.2.5. Разработка условий хранения фермента.

2.2.6. Электрофоретические исследования гомогенности полученных ферментных препаратов аконитатгидратазы.

2.2.7. Физико-химические и каталитические свойства аконитатгидратазы.

2.2.7.1. Определение молекулярной массы и субъединичного строения аконитатгидратазы.

2.2.7.2. Определение Кт.

2.2.7.3. Влияние рН среды на активность изоформ фермента.

2.2.8. Метаболитная регуляция.

2.2.8.1. Влияние различных интермедиатов клеточного метаболизма на активность фермента.

2.2.8.2. Влияние перекиси водорода на работу изоформ аконитатгидратазы.

2.2.8.3. Роль железа в каталитическом действии фермента.

2.2.9. Выделение тотальной клеточной РНК из печени крыс.

2.2.9.1. Идентификация гена митохондриальной формы аконитатгидратазы в печени крыс.

2.2.9.2. Изменение экспрессии гена митохондриальной формы аконинатгидратазы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессионная и метаболитная регуляция функционирования аконитатгидратазы в клетках печени крыс в условиях экспериментального диабета"

Актуальность проблемы. В последнее время ферменты глиоксилатного цикла являются объектами значительного количества исследований. Однако, основное внимание направлено на изучение этих ферментов из растений и микроорганизмов. Глиоксилатный цикл, являясь важнейшим этапом глюконеогенеза, осуществляет синтез из двух молекул ацетил-КоА одной молекулы сукцината, используемой для синтеза углеводов. Появились серьезные публикации об индукции глиоксилатного цикла в животных тканях. Наличие ферментов (3-окисления жирных кислот в животных пероксисом и феномен ресинтеза гликогена в печени крыс при некоторых патологиях позволяет предположить возможность индукции ферментов глиоксилатного цикла [33, 18, 456 138]. Ранее на нашей кафедре была выявлена индукция изоцитратлиазы и малатсинтазы в гепатоцитах крыс в условиях пищевой депривации и экспериментального диабета [46, 129, 130]. Особый интерес вызывает функционирование аконитатгидратазы (АГ; КФ 4.2.1.3), участвующей в функционировании, как цикла Кребса, так и глиоксилатного цикла. Рядом авторов было показано наличие двух изоферментных форм растительной аконитатгидратазы в цитоплазме и глиоксисомах, а также в митохондриях [10]. В работах по изучению распространения аконитазной активности в животных тканях установлено аналогичное распределение локализации данного фермента [105, 109].

Огромную важность имеет проблема воздействия стрессовых факторов на функционирование живых организмов, как для теории, так и для практики. Ранее нами было установлено, что некоторые ферменты (изоцитратлиаза, малатсинтаза, малатдегидрогеназа) индуцируются в печени крыс при пищевой депривации и экспериментальном диабете [130, 46].

Особенности функционирования других ферментов, обеспечивающих функционирование циюта трикарбоновых кислот и глиоксилатного цикла, практически не известны. Это в полной мере относится к работе аконитатгидратазы, участвующей в ферментативном катализе так называемого «аконитазного равновесия», обеспечивающего тонкую регуляцию анаболических и катаболических процессов и поддерживающих внутриклеточный гомеостаз в условиях нарушения факторов внешней среды.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование функционирования аконитатгидратазной системы в животных клетках в условиях экспериментального диабета.

Исходя из цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка экспериментальной модели диабета с использованием инъекций индуктора диабета аллоксана экспериментальным животнйм.

2. Изучить изменение активности ряда ферментов глиоксилатного цикла и цикла Кребса в различных тканях крыс, находящихся в условиях аллоксанового диабета.

3. Получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты аконитатгидратазы из опытных и контрольных животных.

4. Исследовать физико-химические и каталитические свойства аконитатгидратазы.

5. Разработать высокоспецифические праймеры для идентификации генов аконитатгидратазы с использованием методов сравнительной геномики.

6. Провести ОТ-ПЦР анализ матричной РНК для идентификации генов, кодирующих изоферменты аконитатгидратазы.

7. Провести количественный анализ уровня экспрессии генов аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс на разных этапах экспериментального диабета.

8. Разработать гипотетическую модель регуляции клеточного метаболизма на уровне аконитатгидратазной реакции в печени крыс при аллоксановом диабете.

Научная новизна. Получены новые экспериментальные данные особенностей функционирования аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс в условиях экспериментального диабета. Применение многостадийной схемы очистки позволило получить исследуемый фермент в электрофоретически гомогенном состоянии из опытных и контрольных крыс. Выяснено субклеточное распределение аконитазной активности в животных клетках, которое связано с глиоксисомами, пероксисомами и цитоплазмой. Значительная часть активности аконитатгидратазы сосредоточена в цитоплазматической фракции животных клеток. Анализ полученных результатов указывает на полифункциональность действия аконитатгидратазы в условиях аллоксанового диабета. При этом выявлен индуцированный синтез аконитатгидратазы, повышающий скорость превращения трикарбоновых кислот, как в энергетическом, так и в анаболическом обменах.

Практическая значимость. Модифицированные схемы очистки высокоочищенных и электрофоретически гомогенных препаратов аконитатгидратазы из животных тканей могут найти широкое применение для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях, а также в научно-исследовательских работах, связанных с моделированием ферментных систем, обеспечивающих возникновение адаптивной реакции. Предлагается способ хранения фермента, обеспечивающий сохранность его активности в течение длительного времени, что повышает эффективность применения препарата для биохимических анализов в лабораторной практике.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета при чтении лекций по биохимии, а также в спецкурсах по энзимологии. Кроме того, они применяются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях и были представлены на 12-й международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», международной научно-практической конференции «Высокие технологии. Фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии», Санкт-Петербург, 2010, межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2009-2010 гг), ежегодных научных секциях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в пяти публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы 160 источников. Иллюстрационный материал включает 21 рис., 11 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Альнассер Амин

1. Установлено, что в клетках печени контрольных и опытных крыс существуют два основных пула аконитазной активности. Электрофоретические исследования выявляют две изоформы АГ, специфически локализованные в митохондриальной и цитоплазматической фракциях. В условиях экспериментального диабета происходит индукция активности, как цитоплазматической, так и митохондриальной изоформ. Кроме того, наблюдается возникновение новой формы аконитатгидратазы с относительной электрофоретической подвижностью (Ш!" 0,81).

2. Использование модифицированной схемы очистки позволило получить электрофоретически гомогенные препараты изоферментов аконитатгидратазы из контрольных и опытных крыс. Удельная активность высокоочищенной изоформы; имеющей цитоплазматическую локализацию, составляла 1,8 Е/мг белка, что соответствовало очистке более чем в 100 раз. Для митохондриальной формы характерно более низкое значение этой характеристики, которая составляла 1,2 Е/мг белка.

3. Методами гель-хроматографии на сефадексе О-150 и Тоуореаг1 Н\У-65 и Бэ^а ПААГ-электрофорезом исследовано субъединичное строение изоформ аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс. Установлено, что исследуемый фермент имеет димерное строение, причем субъединицы изологичны и имеют молекулярную массу 45 кДа (цитоплазма) и 41 к Да (митохондрии).

4. Сравнительное изучение кинетических и регуляторных свойств аконитатгидратазы из опытных и контрольных крыс позволило выявить определенные закономерности. Значение Кт для всех субстратов свидетельствует об увеличении сродства аконитазы в ряду цитрат —> цис-аконитат —» изоцитрат. Величина оптимума рН аконитатгидратазы из цитоплазматической фракции сдвинута в щелочную область по сравнению с митохондриальной изоформой.

5. Влияние различной концентрации интермедиатов - малата, сукцината, глиоксилата, глюкозо-1-фосфата, глюкозо-6-фосфата и других показало, что большинство из них вызывает ингибирование по конкурентному типу. Причем, тормозящий эффект характерен для всех изучаемых изоформ аконитатгидратазы.

6. Было установлено, что воздействие перекиси водорода зависит от пределов используемой концентрации. При ее высоких значениях наблюдается полная инактивация цитоплазматической и митохондриальной форм АГ в норме и при патологии.

7. Подбор специфических праймеров к генам acol и асо2 позволил идентифицировать генетический материал, обеспечивающий синтез изоформ аконитатгидратазы в гепатоцитах печени крыс. Наличие ПЦР-продуктов в гепатоцитах опытных и контрольных животных свидетельствует об активной экспрессии исследуемых генов.

8. Экспрессии генов acol и асо2 в клетках печени у крыс при экспериментальном диабете резко увеличивалась. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов четко коррелирует с динамикой активности аконитатгидратазы в гепатоцитах, являясь важнейшим механизмом ее регуляции.

9. Разработана гипотетическая схема регуляции функционирования аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс в условиях аллоксанового диабета. Индукция активности и появление новой изоформы аконитатгидратазы в печени крыс при диабете указывают на участие аконитатгидратазной системы в адаптивной реакции организма при стрессовых условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Функционирование глиоксилатного цикла в животных тканях остается дискуссионным вопросом. Однако, ранее наблюдался феномен ресинтеза гликогена в печени крыс при голодании [33, 45]. Вторичное накопление полисахарида обеспечивалось процессом деградации запасных жиров. На нашей кафедре было установлено, что биохимическим механизмом этого процесса является индукция ферментов глиоксилатного цикла. Ключевые ферменты глиоксилатного цикла - изоцитратлиаза и малатсинтаза -индуцируются в печени крыс на третий день голодания и при экспериментальном диабете [1]. Очень мало информации об организации и функционировании других ферментных систем, обеспечивающих работу глиоксилатного пути. В частности, ключевым энзимом, обеспечивающим протекание разных метаболических путей, является аконитатгидратаза. В нашей работе показана индукция активности цитоплазматической и митохондриальной изоформ АГ у крыс при экспериментальном диабете, что свидетельствует об ускорении метаболических процессов, связанных с так называемым аконитазным равновесием. Митохондриальный изофермент АГ обеспечивает работу цикла трикарбоновых кислот, катализируя метаболизм трикарбоновых кислот. Активация окислительных процессов, по всей вероятности, играет важнейшую роль в энергообеспечении клетки в стрессовых условиях, когда затраты организма на поддержание гомеостаза испытывают напряжение. Цитоплазматическая аконитатгидратаза может играть несколько ролей. Прежде всего,, она участвует в анаплеротических реакциях цикла Кребса, то есть образовании аминокислот из 2-оксоглутарата и в глюконеогенезе, функционируя в глиоксилатном цикле. Индукция цитоплазматической формы исследуемого фермента, по-видимому, катализирует взаимопревращение цитрата, цис-аконитата и изоцитрата для обеспечения функционирования глиоксилатного цикла, возникающего в гепатоцитах при аллоксаиовом диабете. Ранее сообщалось об аналогичной реакции данной ферментной системы в клетках печени при пищевой депривации.

Успешное применение многостадийной схемы очистки аконитатгидратазы из гепатоцитов крыс при аллоксановом диабете позволило получить электрофоретически гомогенные или высокоочищенные препараты этого фермента. Сравнительное изучение кинетических и регуляторных свойств аконитатгидратазы из опытных и контрольных крыс позволило выявить определенные закономерности. Показано, что исследуемый фермент из клеток печени может ингибироваться различными интермедиатами, в частности, органическими кислотами (сукцинат, малат, глиоксилат и др.). Выявлены некоторые отличия по уровню удельной активности, значению кинетических свойств, рН оптимуму и другим важным характеристикам. Митохондриальная изоформа характеризовалась гораздо более высоким сродством практически ко всем субстратам аконитатгидратазы. Цитозольная форма аконитатгидратазы хранилась более эффективно и проявляла большую устойчивость к перекиси водорода, разрушающей железосерные кластеры белковой молекулы, что вызывало ингибирование аконитазной активности. Проведенные исследования установили наличие нуклеотидной последовательности в геноме крысы гомологичной аконитатгидратазе из растений и микроорганизмов. Применение полимеразной цепной реакции с праймерами, разработанными по наиболее консервативным последовательностям в составе белка, подтвердили это предположение. Полимеразная цепная реакция проводилась с комплементарной ДНК, полученной в результате обратной транскрипции всех м-РНК, выделенных из печени крыс при аллоксановом диабете.

На основании полученных результатов и литературных данных можно предположить следующую гипотетическую схему, показывающую ферментативную регуляцию глюконеогенеза в печени крыс в условиях аллоксанового диабета (рис. 21).

Ацетил-СоА

Аллоксановый диабет н2о2 глиоксилат сукцинат сукцинат пероксисома увеличение активности митохондрия глюкоза

Рис. 21. Гипотетическая схема участия изоформ аконитатгидратазы в трансформации метаболических процессов в гепатоцитах крыс в условиях аллоксанового диабета

Библиография Диссертация по биологии, кандидат биологических наук , Альнассер Амин, Воронеж

1. Волвенкин С. В. Субклеточная локализация и свойства ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс с аллоксановым диабетом / С. В. Волвенкин, В. Н. Попов, А. Т. Епринцев // Биохимия. 1999. - Т.64, №. 9. -С. 1185-1191.

2. Гродзинский A.M. Краткий справочник по физиологии растений / A.M. Гродзинский, Д.М. Гродзинский. Киев.: Наукова думка, 1985. - 273 с.

3. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. М.: Мир, 1970.352 с.

4. Диксон М. Ферменты / М. Диксон Э. Уэбб М.: Наука, 1982. - 478 с.

5. Дюв К. Де. Путешествие в мир живой клетки / К.Де Дюв. М.: Мир, 1987.-225 с

6. Епринцев А.Т. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации?/ А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, М.Ю. Шевченко. М.: ИКЦ «Академкнига», 2007. - 228 с.

7. Епринцев А.Т. Идентификация и исследование экспрессии генов / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Д.Н.Федорин/ Учебно-методическое пособие для вузов // Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета. 2008. - 62с.

8. Епринцев А.Т. Новый метод определения активности аконитатгидратазы в растениях / А.Т. Епринцев, J1.A. Землянухин, И.М. Суворова // В кн.: Регуляция физиологических-процессов растений. — Воронеж, 1982.-С. 51-56.

9. Епринцев А.Т. Особенности структурной организации и экспрессионной регуляции изоформ малатдегидрогеназы из Rhodobacter sphaeroides Штамма 2г / А.Т. Епринцев и др. // Биохимия. 2009. - Т.74, вып. 7. - С. 977-984.

10. Епринцев А.Т. Очистка и некоторые свойства аконитатгидратазы изщитков кукурузы / А.Т. Епринцев, JI.A Землянухин, М.П. Алексюк // Биохимия. 1995. - 80, № 8. - С. 1244-1250.

11. Епринцев А.Т. Очистка и физико-химические свойства малатдегидрогеназы из бактерий p. Beggiatoa / А.Т. Епринцев и др. // Биохимия. 2003. - Т.68, вып.2. - С. 207-211.

12. Епринцев А.Т. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из куколок бабочки P. machaon L. / А. Т. Епринцев, М. Ю. Шевченко, В. Н. Попов // Биохимия. 2004. - Т.69, № 4. - С. 467-472.

13. Епринцев А.Т. Полимеразная цепная реакция как универсальный метод диагностики и идентификации генов / А.Т. Епринцев, Е.А. Москалев, В.Н. Попов// Системный анализ и управление в биомедицинских системах. -М.: 2001. С.9-14.

14. Епринцев А.Т. Структурно-функциональная трансформация малатдегидрогеназной системы бактерий Sphaerotilus sp. Штамм Д-507 в зависимости от типа питания / А.Т. Епринцев и др. //Известия РАН, сер. биологическая. 2009. - № 3. - С. 269-275.

15. Епринцев А.Т. Углеводный метаболизм в печени крыс при пищевой депривации и экспериментальном диабете/ А.Т. Епринцев, М.Ю. Шевченко, В.Н. Попов // Известия РАН, серия биологическая. 2008. - № 1. - С. 115118.

16. Епринцев А.Т. Ферментативная регуляция метаболизма дикарбоновых и трикарбоновых кислот / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов. -Воронеж: ВГУ, 1999. 192 с.

17. Епринцев А.Т. Физиолого-биохимическая характеристика аконитатгидратазы высших растений. Автореф. дисс. канд. биол. наук. -Воронеж, 1982.-24 с.

18. Епринцев А. Т. Экспрессия и регуляция ферментов глиоксилатного цикла / А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, М.Ю. Шевченко. Воронеж: Центрально-Черноземное книжное изд-во, 2005. - 224 с.

19. Землянухин A.A. Большой практикум по физиологии и биохимии растений. / A.A. Землянухин, JI.A. Землянухин // Воронеж: ВГУ, 1996. 188 с.

20. Игамбердиев А.У. Логика организации живых систем / А.У. Игамбердиев // Воронеж: ВГУ, 1995.- 152 с.

21. Игамбердиев А.У. Микротельца в метаболизме растений/ А.У. Игамбердиев // Воронеж: Изд-во ВГУ, 1990. 148 с.

22. Климова М.А. Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств / М.А. Климова, А.Т. Епринцев //Учебно-методическое пособие для вузов (практикум). Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета. 2008. - 34с.

23. Клиническая патофизиология. Учеб. пособие для студентов вузов /I

24. В. А. Алмазов и др.. С-П.: Питер, - 3-е изд., переработанное и дополненное, 1999.-217 с.

25. Клиническая эндокринология / Н. Т. Старкова и др.. С-П.: Питер, 3-е изд., переработанное и дополненное, 2002. — 576 с. • •

26. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты / Б.И.Курганов. М.: Мир, 1987.-248 с.

27. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990.352 с.

28. Лебкова Н. П. Арх. Патол. / Н.П. Лебкова // 1982. - С. 68-75.

29. Лебкова Н.П. Изучение субклеточной локализации гликоген-УД Ф-глюкозилтрансферазы в печени голодающих крыс/ Н.П. Лебкова // Цитология. 1985. - Т. 27, №2.-С. 35-40.

30. Лебкова Н.П. Современные представления о внутриклеточных механизмах обеспечения энергетического гомеостаза в норме и при патологии / Н.П. Лебкова // Вестник РАМН. 2000. - № 9. - С. 3-12.

31. Лебкова Н.П. Субклеточная локализация карнитинацилтрансферазы в клетках различных органов интактных и голодающих крыс / Н.П. Лебкова// Бюл. экспер. биол. и мед. 1983. - № 7. - С. 32-35.

32. Лебкова Н.П. Субстратное обеспечение энергетического гомеостаза при голодании / Н.П. Лебкова// Бюл.экспер.биол. и мед. 1991. - № 11. - С. 475-479

33. Лебкова Н.П. Ультраструктурные проявления ранних метаболических нарушений в миокарде собак при аллоксановом диабете / Н.П. Лебкова, М.Ф. Бондаренко, O.E. Колесова и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 1980. -№6.-С. 614-617.

34. Лебкова Н.П., Внутриклеточное превращение жирных кислот в гликоген у крыс с аллоксановым диабетом по данным электронной авторадиографии / Н.П. Лебкова, O.E. Колесова, В.Д. Горбунова и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 1984. - № 12. - С. 734-736.

35. Лебкова Н.П. Ультраструктурные и цитохимические изменения в печени крыс при тренировке к гипоксии / Н.П. Лебкова, А .Я. Чижов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1992. - № 6. - С. 663-666.

36. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. /А. Ленинджер. М.:Мир, 1985. - 975с.

37. Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека / У. Мак-Мюррей. -М.:Мир, 1980. 368 с.

38. Матасова Л.В. Аконитаза млекопитающих при окислительном стрессе / Л.В. Матасова, Т.Н. Попова // Биохимия. 2008. - Т.73, вып. 9. - С. 1189-1198.

39. Мауэр Г. Диск-электрофорез / Г Мауэр. М.: Мир, 1971. - 222 с.

40. Мецлер Д.Е. Биохимия / Д.Е. Мецлер. -М.: Мир, 1987. 358 с.

41. Михайлов В. В. Основы патологической физиологии: Руководство для врачей. / В.В. Михайлов, Б. М. Сагалович. М.: Медицина, 2001. - 704 с.

42. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул / Л.А. Остерман. М.: Мир, 1983. - 297 с.

43. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса / Л.Е. Панин. — Новосибирск, 1983. 213 с.

44. Панченко Л.Ф. Роль пероксисом в патологии клетки / Л.Ф. Панченко, A.M. Герасимов, В.Д. Антоненко. М.: Мир, 1981. - 312 с.

45. Попов В.Н. Влияние ингибиторов электронного транспорта на образование активных форм кислорода при окислении сукцината митохондриями гороха / В.Н. Попов, Э.К. Рууге, A.A. Старков // Биохимия. 2003. Т. 68, № 7. - С. 910-916.

46. Попов В. Н. Индукция ферментов глиоксилатного цикла в различных тканях голодающих крыс / В. Н. Попов и др. // Известия РАН. Серия биологическая. 2000. - № 6 - С. 663-667.

47. Попов В.Н. Сравнительный анализ ключевого фермента глиоксилатного цикла, изоцитралиазы, из организмов разных систематических групп / В.Н. Попов и др. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2005. - № 6. - С. 317-329.

48. Сахарный диабет: Учебно-методическое пособие. Вып.1: Этиология, патогенез,. клиника, дифференциальный диагноз, принципы лечения / М.Е. Стаценко и др.. Волгоград: ВолГУ, 2002. - 64 с.

49. Семенова Е.В. Очистка, физико-химические и регуляторные свойства аконитатгидратазы из гепатоцитов голодающих крыс / Е.В. Семенова // Дисс. на соискание ст. канд. биол. наук. Воронеж: ВГУ - 2001. - 142 с.

50. Страйер Л. Биохимия / Л. Страйер. М.: Мир, 1985. - Т. 2. - 312 с.

51. Субклеточная локализация изоформ аконитатгидратазы в высших растениях / A.A. Землянухин и др. // Физиология растений. -1984. Т. 31, вып. 2. - С. 337-343.

52. Уоткинс П.Дж. Сахарный диабет / П. Дж. Уоткинс. М.: Москва: Бином, - 2-е изд. пер. с англ. 2006. - 134 с.

53. Хочачка П. Биохимическая адаптация. / П.Хочачка, Дж.Сомеро. -М. : Мир, 1988.-567 с.

54. Чернышев Г.А. Вероятность и статистика в биологии и химии / Г.А. Чернышев, В.Н. Стариков. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 1998. - 270 с.

55. Agrawal P.K. Studies on two isozymes from Bacillus cereus. Enzymatic properties / P.K. Agrawal, G.K. Garg, K.G. Gollakota // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1976. - V. 70, № 3. - P. 987-996.

56. Alen C. Bacillus subtilis aconitase is an RNA-binding protein // C. Alen, A.L. Sonenshein // Proc. of the Nation, acad. of sci. of the USA. 1999. - T. 96, 1 18.-P. 10412-10417.

57. Beinert H. Engineering of protein bound iron-sulfur clusters. A tool for the study of protein and cluster chemistry and mechanism of iron-sulfur enzymes / H. Beinert, M.C. Kennedy // Eur. J. Biochem. 1989. - V. 186. - P.5-15.

58. Beinert H. Aconitase, a two-faced protein: enzyme and iron regulatory factor / H. Beinert, M.C. Kennedy // FASEB Lett. 1993. - V. 7, ' 12. - P. 1442 -1449.

59. Beinert H. Aconitase as iron-sulfur protein, enzyme, and iron-regulatory protein / H. Beinert, M.C. Kennedy, C.D. Stout // Chem. Rev. 1996. - V. 96. - P. 2335 -2373.

60. Bajpai M. Changes in carbohydrate metabolism of testicular germ dells during-meiosis in the rat / M. Bajpai, G. Gupta, B.S. Setty // Eur. J. Endocrinol. -1998.-V. 138, '3.-P. 322-327.

61. Barrett E.L. Hepatic glucose metabolism and insulin resistance in NIDDM and obesity / E.L. Barrett, Z. Liu // Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. -1993.-Vol.7, №4.-P. 875-901.

62. Basilion J.P. The iron-responsive element- binding protein: Localization of the RNA-binding site to the aconitase active cleft / J.P. Basilion, T.A. Rouault, C.M. Massinople // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. - V. 91, 1 1. - P. 574 -578.

63. Berg J.M. Biochemistry. / J.M. Berg. 5th Edition. - WH Freeman and Company, 2002. - 476 p.

64. Characterization of the human mitochondrial aconitase gene (AC02) / D.B. Mierel et. al. // Gene. 1998. - V. 213, № 1-2. - P. 205:218.

65. Chen O.S. Dietary iron intake modulates the activity of iron regulatory proteins and the abundance of ferritin and mitochondrial aconitase in rat liver / O.S. Chen., K.L. Schalinske, R.S. Eisenstein // J. Nutr. 1997. - V. 127, 1 2. -P. 238-248.

66. Cheung P.Y. Thiols protect the inhibition of myocardial aconitase by peroxynitrite / P.Y. Cheung, H. Danial, J. Jong et. al. // Arch. Biochem. Biophys. 1998. - V. 350, 11. - P. 104-108.

67. Chomczynski P. Single-Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. 1987. - Y.162. - P. 156-159.

68. Costello L.C. Zinc causes a shift toward citrate at equilibrium of the m-aconitase reaction of prostate mitochondria / L.C. Costello, R.B. Franklin, Y. Liu et.al. // J. Inorg. Biochem. 2000A. - V. 78, № 2. - P. 161-165.

69. Costello L.C. Zinc inhibition of mitochondrial aconitase and its importance in citrate metabolism of prostate epithelial cells / L.C. Costello, Y. Liu, R.B. Franklin et. al. // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272, 1 46. - P. 28875-28881.

70. Courtois-Verniquet F. Lack of aconitase in glyoxysomes and peroxisomes / F. Courtois-Verniquet, R. Douce // Biochem. J. 1993. - 1 294. - P. 103-107.

71. Crystallization and reconstitution of yeast aconitase / T. Suzuki et. al. // J. Biochem. 1975. - V. 77, №2. - P. 249-264.

72. Cytosolic Aconitase and Ferritin Are Regulated by Iron in Caenorhabditis elegans / L. Brett et. al. // J. Biological Chemistry. 2003. - P. 3227-3234.

73. Davis B J. Disk Electrophoresis. Method and application to human surum proteins / B. J. Davis, R.G. Jones, G.R. Farmer // Ann. N.Y. acad. sci. -1964.-V. 121.-P. 404-427.

74. Davis W.L. Hibernation activates glyoxylate cycle and gluconeogenesis in black bear brown adipose tissue / W.L. Davis // Biochim. Biophys. Acta. 1990. - V. 1051. - P. 276-278.

75. Dickman S.R. Factors affecting the activite of mitochondrial and soluble aconitase / S.R. Dickman, J. Speyer // J. Biochem. 1964. - V. 206, № 1. - P. 6778.

76. Dietzen D.J. Oxidation of pyruvate, malate, citrate, and cytosolic reducing equivalents by AS-30D hepatoma mitochondria / D.J. Dietzen, E.J. Davis // Arch. Biochem. Biophys. 1993. - V. 305, 1 1. - P. 91-102.

77. Eisenstein R.S. Isolation, characterization, and functional studies of rat liver iron regulatory protein 1 /R.S. Eisenstein, H.A. Barton, WH.Jr. Pettingell et. al. // Arch. Biochem. Biophys. 1997. - V. 343, 1 1. - P. 81-91.

78. Escher C.L. Lipid mobilization and gluconeogenesis in plants: do glyoxylate cycle enzyme activities conctitute a real cycle? A hypothesis / C.L. Escher, F. Widmer // Biol. Chem. 1997. - V. 378,1 8. - P. 803-813.

79. Evelson P. Time course and quantitative analysis of the adaptive responses to 85% oxygen in the rat lung and heart / P. Evelson, B. Gonzalez-Flecha // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - V. 1523, № 1-2. - P. 209-216.

80. Exercise decreases cytosolic aconitase activity in the liver, spleen, and bone marrow in rats / K.P. Ho et. al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. -V. 282, № l.-P. 264-267.

81. Festa M. Oxalomalate, a competitive inhibitor of aconitase, modulates the RNA-binding activity of iron- regulatory proteins / M. Festa, A. Colonna, C. Pietropaolo et. al. // Biochem J. 2000. - V. 348 - P. 315-320.

82. Foury F. Low iron concentration and aconitase deficiency in a yeast frataxin homologue deficient strain / F. Foury // FEBS Lett. 1999. - V. 456 - P. 281-284.

83. Frishman D. Conservation of aconitase residues revealed by multiple sequence analysis. Implications for structure/function relationships / D. Frishman, M.W. Hentse // Eur. J. of Biochem. 1996. - V. 239, 1 1. - P. 197-200.

84. Gardner P. R. Aconitase is a sensitive and critical target of oxygen poisoning in cultured mammalian cells and in rat lungs / P.R. Gardner, D.H. Nguyen, C.W. White // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91, № 12. - P. 12248-12252.

85. Gardner P.R. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells / P.R. Gardner, I. Raineri, L.B. Epstein et. al. // J. Biol. Chem. -1995.-V. 270, »22. P. 13399-13405.

86. GehringN.H. Inactivation of both RNA binding and aconitase activities of iron regulatory protein-1 by quinone-induced oxidative stress / N.H. Gehring, M.W. Hentze, K. Pantopoulos // J. of Biol. Chem. 1999. - V. 274, 1 10. - P. 6219-6225.

87. Glusker J.P. Aconitase / J.P. Glusker // Enzymes. New York London. -1971.-V. 5.-P. 413-439.

88. Graham R.M. Characterisation of citrate and iron citrate uptake by cultured rat hepatocytes / R.M. Graham, E.H. Morgan, E. Baker // J. Hepatol. -1998.-V. 29, '4. -P. 603-613.

89. Gruer M.J. The aconitase family: Three structural variations on a common theme / M.J. Gruer, P.J. Artymiuk, J.R. Guest // Trends in biochem. sci. -1997.-V. 22, № l.-P. 3-6.

90. Grune O. Peroxynitite increases the degradation of aconitase and other cellular proteins by proteasome / O. Grune, I.E. Blasig, N. Sitte et. al. //J. of Biol. Chem. 1998. - V. 273, 1 18. - P. 10857-10862.

91. Guarriero-Bobyleva W.Kinetic studies of cytoplasmic and mitochondrial aconitase hydratases from rat liver / W. Guarriero-Bobyleva, A. Masini, M.A. Volpi-Becchi et. al. // Ital. J. Biochem. 1978. - V. 27, 1 5. - P. 287 -299.

92. Gutteridge J.M.C. «Free» iron in neonatal plasma activities aconitase: Evidence for biologically reactive iron / J.M.C. Gutteridge, S. Mumby, M. Koizumi et. al. // Biochem. and Biophys. Res. Comm. 1996. - V. 229, 1 3. -P. 806-809.

93. Ho K.P. Exercise decreases cytosolic aconitase activity in the liver, spleen, and bone marrow in rats / K.P. Ho, D.S. Xiao, Y. Ke et. al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 282, № 1. - P. 264-267.

94. Henson C.P. Purification and kinetic studies of beef liver cytoplasmic aconitase / C.P.Henson, W.W. Clenand // J. Biol. Chem. 1967. - V. 258. - P. 3833-3838.

95. Inactivation of aconitase and oxoglutarate dehydrogenase in skeletal muscle in vitro by superoxide anions and/or nitric oxide / U. Andersson et. al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - V. 249, № 2. - P. 512-516.

96. Inactivation of iron responsive element-binding capacity and aconitase function of iron regulatory protein-1 of skin cells by ultraviolet A / A. Giordani et. al. // Photochem. And Photobiol. 2000. - V. 72, № 6. - P. 746-752.

97. Isolation, characterization, and functional studies of rat liver iron regulatory protein 1 / R.S. Eisenstein et. al. // Arch. Biochem. Biophys. 1997. -V. 343, № 1.-p. 81-91.

98. Jones J.D. The glyoxylate cycle: does it function in the dormant or active bear? / J.D. Jones, P.Burnett, P.Zollman // Comp. Biochem. Physiol. B. -1999. Vol.124. - P. 177-179.

99. Kim H.Y. Identification of a conserved and functional iron-resposive element in the 5'-untranslated region of mammalian mitochondrial aconitase II/

100. H.Y. Kim, O. La Vaute, K. Iwai et. al. // J. of Biol. Chem. 1996. - V. 271, № 39. - P. 24226-24230.

101. Kohler S.A. Molecular cloning of mouse glycolate oxidase. High evolutionary conservation and presence of an iron-responsive element-like sequence in the mRNA / S.A. Kohler, E. Menotti, L.C. Kuhn // J. Biol. Chem. -1999. V. 274, 1 4. - P. 2401-2407.

102. Konstantinova S.G. Aconitase activity in rat liver / S.G. Konstantinova, E.M. Russanov // Comp. Biochem. Phisiol. 1996. - V. 113B, №1.-P. 125-130.

103. Konstantinova S.G. Studies on paraquat-induced oxidative stress in rat liver / S.G. Konstantinova, E.M. Russanov // Acta Physiol. Pharmacol. Bulg. 1999.-V. 24, '4.-P. 107-111.

104. Laemmli U.K. SDS-electrophoresis / U.K. Laemmli // Nature. — 1970. -V. 227.-P. 680-685.

105. LaubleH. Crystal structure of aconitase with isocitrate and nitoisocitrate bound / H. Lauble, M.C. Kennedy, H. Beinert et. al. // Biochemistry. 1992. - V. 3 1.- P. 2735-2748.

106. LaubleH. The reaction of fluorocitrate with aconitase and the crystal structure of the enzyme-inhibjtor complex / H. Lauble, M.C. Kennedy, M.H. Emptage et. al.// Proc. of the nation, acad. of sei. of the USA. 1996. - V. 93, № 24.-P. 13699-13703.

107. LenzenS. Inhibition of aconitase by alloxan and the differential modes of protection of glucose, 3-O-methylglucose, and mannoheptulose / S. Lenzen, M. Mirzaie-Petri //Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1992. - V. 346, 1 5. -P. 532-536.

108. Livak K.J. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2"AACt method / K.J. Livak, T.D. Schmittgen // Methods. -2001. V.25. - P. 402-408

109. Liu Y. Prolactin specifically regulates citrate oxidation and m-aconitase of rat prostate epithelial cells / Y. Liu, L.C. Costello, R.B. Franklin // Metabolism. 1996. - V. 45,1 4. - P. 442-449.

110. Lowry O. Protein measurement with the Folinphenol reagent / O. Lowry, N. Rosenbrough, A. Farr // J. Biol. Chem. 1951. - V. 194. - P. 265-275.

111. Maria I. Lind. Of Two Cytosolic Aconitases Expressed in Drosophila, Only One Functions as an Iron-regulatory Protein / Maria 1. Lind, Fanis Missirlis, Öjar Melefors et. al. // Journal of Biological Chemistry, 281, p. 18707-18714.

112. Mass spectrometric sequncing of proteins froni silver-stained Polyacrylamide gels / A. Shevchenko et. al. // Anal. Chem. 1996. - V. 68. - P. 850-858.

113. Melnick J.Z. Renal citrate metabolism and urinary citrate excretion in the infant rat / J.Z. Melnick, P.A. Preisig, R.J. Alpern et. al. // Kidney Int. 2000. - V. 57, 1 3. -P. 891-897.

114. Melnick J.Z. Renal cortical mitochondrial aconitase is regulated in hypo- and hypercitraturia / J.Z. Melnick, P.A. Preisig, O.W. Iiä et. al.// Kidney Int. 1998.-V. 54, 1 l.p. 160-165.

115. Mirel D.B. Characterization of the human mitochondrial aconitase gene (AC02) / D.B. Mirel, K. Marder, J. Graziano et. al. // Gene. 1998. - V. 213,1 1-2.-P. 205-218.

116. Morrison J.F. The kinetics of the reaction catalysed by aconitase / J.F. Morrison // Austral. J. exper. biol. and med. sei. 1955. - V. 32, № 6. - P. 867876.

117. Mullis K.B. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction / K.B. Mullis, F.A. Faloona // Methods Enzymol. 1987. - №155.-P. 335-350.

118. Mumby S. Reactive iron species in biological fluids activate the iron-sulphur cluster of aconitase / S. Mumby, M. Koizumi, N. Taniguchi et. al. / Bioch. etbioph. Acta-Gen. subj. 1998. - V. 1380, 1 1. - P. 102-108.

119. Mutational analysis of active site residues in pig hearts aconitase / L. Zheng et. al. // J. Biol. Chem. 1992. - № 267. - P. 7895-7903.

120. Narahari J. The aconitase function of iron regulatory protein 1-Genetic studies in yeast implicate its role in iron-mediated redox regulation / J. Narahari, R. Ma, M. Wang et. al. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275, 1 21. - P. 16227-16234.

121. Popov V.N. Glioxilate cycle enzymes are present in liver peroxisomes of alloxan-treated rats / V.N. Popov, S.V. Volvenkin, A.T. Eprintsev et. al. // FEBS Lett. 1998. V. 440. Ü P. 55-58.

122. Popov V.N. Induction of the Glyoxylate Cycle Enzymes in rat liver upon food starvation / V.N. Popov, A.U. Igamberdiev, C. Schnarenberger et. al. //FEBS Lett. 1996.- V. 390. - P. 258-260.

123. Protection of astrocytes by fructose 1,6-bisphosphate and citrate ameliorates neuronal injury under hypoxic conditions / J.A. Kelleher et. al. // Brain Res. 1996.-V. 726, № 1-2.-P. 167-173.

124. Purification and chacterizanion of cytosolic aconitase from beef liver and its relationship to the iron-responsive element binding protein / M.C. Kennedy et. al. //Proc. natl. acad. sei. USA. 1992. -V. 89. - P. 11730-11734.

125. Rotig A. Aconitase and mitochondrial iron-sulphur protein deficiency in Friedreich ataxia / A. Rotig, P. DeLonlay, D. Chretien et. al. //Nat. Genet. -1997.-V. 17, 1 2.-P. 215-217.

126. Rozen S., Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers / S. Rozen, H. Skaletsky // Methods Mol. Biol. 2000. -V.132. - P. 365-386.

127. Rzymkiewicz D.M. Induction of heme oxygenase-1 modulates cis-aconitase activity in lens epithelial cells / D.M. Rzymkiewicz, J.R. Reddan, U.P. Andley // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 2000. - V. 270, № 1. - P. 324328.

128. Sadka A. Aconitase activity and expression during the development of lemon fruit / A. Sadka, E. Dahan, L. Cohen et. al. . // Phys. Plantarum 2000. -V. 108, №3.-P. 255-262.

129. Schnarrenberger C. Evolution of the enzymes of the citric acid cycle and the glyxylate cycle of higher plants. A case study of andosymbiotic gene transfer / C. Schnarrenberger // Eur.J. Biochem. FEBS. 2002. - Vol. 269. - P. 868-883.

130. Shevchenko A. Mass spectrometry sequncing of proteins froni silver-stained polyacrylamide gels / A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm et. al. // Anal. Chem. 1996. - V. 68. - P. 850-858.

131. Siddiqui A. A. Cloning and expression of isocitrate lyase from human round Strongyloides stercoralis / A. A. Siddiqui, C. S. Stanley, S. L. Berk // Parasite. 2000. - Vol. 7. - P.233-236

132. Shi-Jin Zhang. Activation of aconitase in mouse fast-twitch skeletal muscle during contraction-mediated oxidative stress / Shi-Jin Zhang, E. Marie Sandstrom et. al. // Am J Physiol Cell Physiol, Sep 2007; 293: CI 154 CI 159.

133. Slaughter C. The distribution and properties of aconitase isozymes in man / C. Slaughter // J. Biol. Chem. 1977. - V. 10, № 2. - P. 287-292.

134. Song S. Can the glyoxylate pathway contributes to fat-indused hepatic insulin resistance? / S. Song // Med. Hypotheses. 2000. - Vol.54. - P. 739-747.

135. Structural investigations by extended X-ray absorption fine structure spectroscopy of the iron center of mitochondrial aconitase in higher plant cells / J. Jordanov et. al. //J. Biol. Chem. 1992. -V. 267, № 24. - P. 16775-16778.

136. Stumvoll M. Renal glucose production and utilization: new aspects in humans / M. Stumvoll et. al. // Diabetologia. 1997. - Vol.40, №7. - P.749-757.

137. Szkudelski T. The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in B Cells of the Rat Pancreas / T. Szkudelski // Physiol. Res. 50. 2001. - P. 536546.

138. The regeneration of reduced glutathione in rat forebrain mitochondria identifies metabolic pathways providing the NADPH required / R. Vogel et. al. // Neurosci Lett. 1999. - V. 275, № 2. - P. 97-100.

139. Thompson J.F. Determination of aconitate isomerase in plants / J.F. Thompson, S.C. Schaefer, J.T. Madison // Anal. Biochem. 1990. - V. 184, № 1. -P. 39-47.

140. Toth I. Hypoxia alters iron- regulatory protein-1 binding capacity and modulates cellular iron homeostasis in human hepatoma and erythroleukemia cells / I. Toth, L. Yuan, J.T. Rogers et. al. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274, 1 7.-P. 4467-4473.

141. Tzachi B. Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR / B. Tzachi et al. // Nucleic Acids Research. 2003. - Vol. 31. - P. 105-109:

142. Vasquez-Vivar J. Mitochondrial aconitase is a source of hydroxyl radical-An electron spin resonance investigation / J. Vasquez-Vivar, B. Kalyanaraman, M.C. Kennedy // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275, № 19. - P. 14064-14069.

143. Villafranca J. The mechanism of aconitase action. Evidence for an enzyme isomerisation by studies of inhibition by tricarboxylis acids / J. Villafranca // J. Biol. Chem. 1974. - V. 249, № 19. - P. 6149-6155.

144. Villafranca J. The mechanism of aconitase action. Magnetic resonance studies of the complex of enzyme, manganese, iron and substrates / J. Villafranca, A. Mildvan //J.Biol. Chem.-1971.-V. 246, № 18.-P. 5791-5798.

145. Welsh N. Protective action by hemin against interleukin-1 beta induced inhibition of rat pancreatic islet function / N. Welsh, S. Sandler // Mol. cell, endocrinol.- 1994.-V. 103,№ 1-2.-P. 109-114.no) Ja

146. Yan L.J. Oxidative damage during aging targets mitochondrial aconitase / L.J. Yan, R.L. Levine, R.S. Sohal // Proc. of the nation, acad. of sci. of the USA. 1997. -V. 94, ^l.-P. 11168-11172

147. Yih-Fong Liew. Mitochondrial Cysteine Desulfurase Iron-Sulfur Cluster S and Aconitase Are Post-transcriptionally Regulated by Dietary Iron in Skeletal Muscle of Rats / Yih-Fong Liew, Ning-Sing Shaw // J. Nutr.135. 2005. -P. 2151-2158.

148. Zatta P. Effects of aluminum on activity of krebs cycle enzymes and glutamate dehydrogenase in rat brain homogenate / P. Zatta, E. Lain, C. Cagnolini // Eur. J. Biochem. 2000. - V. 267, 11>. - P. 3049-3055.