Локализация и свойства автолитических ферментов Lysobacter sp. - продуцента внеклеточных бактериолитических ферментов

Ситкин, Борис Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Локализация и свойства автолитических ферментов Lysobacter sp. - продуцента внеклеточных бактериолитических ферментов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Локализация и свойства автолитических ферментов Lysobacter sp. - продуцента внеклеточных бактериолитических ферментов"

На правах рукописи

СИТКИН БОРИС ВИКТОРОВИЧ

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И СВОЙСТВА АВТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ЫЗОБЛСТЕЯ 8Р. - ПРОДУЦЕНТА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2004

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор И.С. Кулаев; кандидат биологических наук, ОА Степная

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Т.С. Калебина

кандидат медицинских наук, О.Н. Окунев

Ведущая организация:

Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита состоится

¿О

2004 г. в

часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.121.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат разослан

Д> МСьЯ

2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

В. М. Вагабов

Актуальность проблемы. Внутриклеточные бактериолитические (автолитические) ферменты, разрушающие ковалентные связи в пептидогликане -основном структурном компоненте клеточной стенки эубактерии, играют важную роль в процессах роста и деления бактериальной клетки. Они являются жизненно необходимыми для любой эубактерии. Кроме того, некоторые эубактерии в определенных условиях продуцируют не только автолитические, но и внеклеточные бактериолитические ферменты, которые необходимы им для завоевания экологической ниши и обеспечения их клеток пищей и энергией. В этом случае в клетках эубактерии идет параллельный синтез и передвижение через цитоплазматическую мембрану к месту своего действия как автолитических ферментов, которые могут локализоваться в мембране, периплазме и клеточной стенке, так и внеклеточных бактериолитических ферментов, секретируемых в окружающую среду. В связи с этим встает вопрос о механизме и регуляции процесса одновременного функционирования этих ферментов, о том могут ли автолитические ферменты являться предшественниками внеклеточных бактериолитических ферментов?

К настоящему времени опубликовано большое количество работ, посвященных выделению и характеристике как внеклеточных, так и внутриклеточных бактериолитических ферментов эубактерии. Однако до сих пор в литературе нет сведений по сравнительному изучению у одной и той же бактерии вне- и внутриклеточных бактериолитических ферментов, в которых они были бы достаточно полно исследованы.

Автолитические ферменты хорошо изучены у многих представителей грамположительных бактерий (Shockman, Holtje, 1994), у грамотрицательных, за исключением Escherichia coli (Holtje, Tuomanen, 1991), их подробно не изучали.

Грамотрицательная бактерия Lysobacter sp. (ранее Xanthomonas campestris) относится к числу таких бактерий, которые в определенных условиях продуцируют внеклеточные бактериолитические ферменты: мурамидазу, эндопептидазу Jl и N-ацетилмурамоил^-аланин амидазу Л2. Эти ферменты входят в состав применяемого в медицине антибактериального препарата лизоамидаза (Машковский, 1998), поэтому их свойства хорошо изучены. Все они являются положительно заряженными низкомолекулярными белками, проявляющими наибольшую активность в среде с низкой ионной силой и высоким значением рН (Степная и др.,

Ранее в цитозоле этой бактерии был обнаружен автолитический фермент с глюкозаминидазной активностью, не выявленный среди внеклеточных бактериолитических ферментов (Цфасман и др., 2000). Его физико-химические свойства существенно отличались от свойств внеклеточных ферментов Lysobacter sp. Однако подробный анализ автолитических ферментов этой бактерии не проводили. Вместе с тем изучение автолитических ферментов Lysobacter sp. в сравнении с ее уже изученными внеклеточными бактериолитическими ферментами позволит приблизиться к пониманию механизма функционирования этих двух "пулов" бактериолитических ферментов у одной бактерии.

1999).

Цель данной работы - изучение автолитических ферментов бактерии ЬузоЬаМвгър.

Задачи работы:

1. Изучение химической структуры пептидогликана бактерии Ьу8оЬае1гг 8р. -субстрата ее автолитических ферментов.

2. Выявление автолитических ферментов бактерии и установление их локализации.

3. Определение субстратной специфичности автолитических ферментов бактерии Ьу8оЬае1гг 8р. по отношению к связям пептидогликана.

4. Выделение и очистка наиболее активных автолитических ферментов бактерии.

5. Изучение свойств автолитических ферментов Ьу8оЬае1гг 8р. и сравнение их со свойствами изученных ранее внеклеточных бактериолитических ферментов этой бактерии.

Научная новизна работы. Установлена химическая структура пептидогликана грамотрицательной бактерии Ьу8оЬае1гг 8р.

Впервые на примере Ьу8оЬае1гг 8р. проведено сравнение вне- и внутриклеточных бактериолитических ферментов у одной и той же бактерии. При этом в клетках- Ьу8оЬае1гг 8р. ХЬ 1, не секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты, обнаружено 9 внутриклеточных (автолитических) ферментов. В условиях секреции внеклеточных ферментов в клетках Ьу8оЬае1гг 8р. ХЬ 1, выявлен дополнительный автолитический фермент. В клетках Ьу8оЬае1гг 8р. ХЬ 2, утративших способность секретировать внеклеточную эндопептидазу, этот дополнительный автолитический фермент не обнаружен. Показано, что спектр этих ферментов Ьу8оЬае1гг 8р. включает в себя глюкозаминидазы, мурамидазы, N ацетилмурамоил-Ь-аланин амидазы и эндопептидазы. Он существенно отличается от спектра внеклеточных бактериолитических ферментов- по количеству, субстратной специфичности и свойствам.

Установлено, что автолитические ферменты присутствуют в цитозоле клеток, в периплазме и во фракции клеточных стенок и мембран.

Показано, что спектр и уровень активности автолитических ферментов изменяется в процессе роста бактерии.

Получен очищенный препарат цитозольной эндопептидазы, выявленной только в клетках Ьу8оЬае1гг 8р. ХЬ 1, секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты. Показано, что этот фермент имеет ряд свойств аналогичных свойствам внеклеточной эндопептидазы Ль Это и тот факт, что цитозольная эндопептидаза отсутствует в клетках Ьу8оЬае1гг 8р. ХЬ 2, утративших способность секретировать внеклеточную эндопептидазу позволило

предположить, что цитозольная эндопептидаза может являться предшественником внеклеточной эндопептидазы.

быть использованы для оптимизации условий секреции внеклеточных бактериолитических ферментов Lysobacter sp/ XL 1, выяснения перспективности обогащения автолитическими ферментами медицинского препарата лизоамидаза, и как следствие - улучшение его качества и бактериолитических свойств.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 142 страницах, содержит 13 таблиц и 29 рисунков. Библиографический указатель содержит 246 источников литературы.

Апробация; работы и публикации. Материалы диссертации были представлены, на российских, и международных конференциях: международный симпозиум «Modern problems of microbial biochemisty and biotechnology» (Pushchino, 2000), школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино,

2000), 5м конференция молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пущино,

2001), международная конференция «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001), 3-ий съезд Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах "Биохимия", "Микробиология11 и "Доклады Академии Наук", и 5 тезисов в сборниках российских и международных конференций:

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом данной работы была бактерия Lysobacter sp., способная секретировать внеклеточные бактериолитические ферменты. Использовали активный штамм Lysobacter sp. XL 1, секретирующий три бактериолитических фермента: эндопептидазу Л мурамидазу, М-ацетилмурамоил-аланин амидазу Л2 и малоактивный штамм Lysobacter sp. XL 2, секретирующий только мурамидазу и М-ацетилмурамоил-аланин амидазу Л2 (Степная и др., 19966). Активный штамм Lysobacter sp. XL 1 выращивали на среде 5/5, разработанной в ИБФМ РАН, содержащей дрожжевой экстракт, соевый экстракт, гидролизат казеина и аминопептид, а также на среде LB "супер-бульон", которая содержит 33 г/л триптона и 20 г/л дрожжевого экстракта (Дэвис и др., 1984). Культивирование вели в колбах, на качалке при 29°С, получая клетки логарифмической (9 ч) и стационарной стадий роста (18 ч). Малоактивный штамм Lysobacter sp. XL 2 выращивали в течение 12 ч (логарифмическая стадия роста) при 29°С на среде 5/5. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин и промывали 3 раза 0,01 М трис-НС1-буфером, рН 8,0 центрифугированием при той же скорости.

Периплазматическую фракцию получали осмотическим шоком по методу Носсала и Хэппела (Nossal, Heppel, 1966). После обработки осмотическим шоком клетки суспендировали в 0,05 М трис-НС1-буфере, рН 8,0, замораживали при -70°С, а затем разрушали продавливанием под давлением 9 атмосфер на прессе, разработанном в ИБФМ РАН. Полученную массу центрифугировали при 8000g в течение 10 мин для удаления неразрушенных клеток. Затем надосадочную жидкость

центрифугировали при 18000g в течение 30 мин. Осадок содержал клеточные стенки и мембраны, надосадочная жидкость - цитозоль.

Солюбилизацию автолитических ферментов из фракции клеточных стенок и мембран проводили последовательно 5 М раствором LiCl и 1% тритоном Х-100 в 0,05 М трис-НС1-буфере, рН 7,5 (Brown, 1973; Mett et al., 1980).

Чистоту получаемых после фракционирования клеточных фракций определяли по активности маркерных ферментов. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли по скорости восстановления NADP (Kornberg, Horecker, 1955). Активность лактатдегидрогеназы определяли по скорости окисления NADH (Kornberg, 1966). Активность циклической фосфодиэстеразы определяли по скорости образования л-нитрофенола, используя в качестве субстрата натриевую соль бис(р-нитрофенил)фосфата (Neu, Heppel, 1965).

Автолитическую активность клеточных фракций определяли по их способности лизировать автоклавированные клетки Lysobacter sp. XL 1, вплавленные в 1%-ный агарозный гель в 0,05 М трис-НС1-буфере, рН 8,0, в концентрации 1 мг/мл. В геле делали лунки, в которые вносили клеточные фракции, и инкубировали при 29°С в течение 24-27 часов. Об активности судили по появлению и интенсивности зон лизиса в геле вокруг лунок. Автолитическую активность ферментных препаратов определяли по уменьшению оптической плотности суспензии автоклавированных клеток Lysobacter sp XL 1 при 400 нм. Реакционная смесь содержала 0,1 мл ферментного препарата и 0,5 мл суспензии клеток Lysobacter sp. XL 1, приготовленной с использованием соответствующего буфера (оптическая плотность при400 нм 0,3-0,4 оп. ед.).

Содержание белка измеряли по поглощению при 280 нм и методом Лоури (Lowryetal., 1951).

Электрофоретический анализ автолитических ферментов клеточных фракций Lysobacter sp. XL 1 и XL 2 проводили в неденатурирующих условиях в полиакриламидном геле (ПААГ), используя анодную систему Орнстейна и Дэвиса (Ornstein, Devis, 1964) и катодную систему Рейсфельда (Reisfeld et al., 1962).

Электрофорез в присутствии SDS-Na проводили в системе Лэммли (Laemmli, 1970).

Пептидогликан Lysobacter sp XL 1 получали в два этапа. На первом этапе выделяли пептидогликан-липополисахаридный комплекс бактерии с помощью модифицированных методов Брауна и соавт. (Braun, Sieglin, 1970) и Гудвина и соавт. (Goodwin, Shedlarsk, 1975). На втором этапе получали пептидогликан по методу Стрешинской и сотр. (Стрешинская и др., 1979).

Для определения структуры пептидогликана образцы гидролизовали в 6 н НС1 в запаянных ампулах в атмосфере азота при 105-107 °С в течение 18 ч. Полученные гидролизаты упаривали в роторном испарителе при 40 °С, следы НС1 удаляли в вакуумном эксикаторе над твердым КОН. Сухой остаток растворяли в Na-цитратном буфере, рН 2,2 и анализировали по методу Спакмана, Стейна и Мура (Spackman, Stein, Moore, 1958) в ускоренной модификации на автоматическом анализаторе аминокислот Т. 339 ("Microtehna", Чехославакия). Определение конфигурации диаминопимелиновой кислоты проводили методом нисходящей

бумажной хроматографии на бумаге Whatman №1 в системе растворителей метанол : вода: Юн НС1: пиридин (8:0,75:0,25:1) (Rhuland et al., 1955).

Для определения свойств автолитических ферментов Lysobacter sp. XL 1, после электрофореза в нативных условиях их элюировали из ПААГ 0,1М NaCl в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 8,0.

Автолитическую эндопептидазу А7 выделяли из цитозоля методами дробного осаждения белков цитозоля сульфатом аммония, нативного электрофореза в системе Рейсфельда и ионообменной хроматографии на SP-сефадексе С-50.

Субстратную специфичность автолитических ферментов определяли по их способности расщеплять />-нитрофенил-2-ацетамидо-2-дезокси-Р-П-глюкопиранозид (NADG) - субстрат для глюкозаминидаз (Досон и др., 1991), 3,4-динитрофенил-тетра-Н-ацетил-Р-О-хитотетраозид (DTAC) - субстрат для мурамидаз (Ballardie, Capon, 1972) и пептидные связи пептидогликана Lysobacter sp. XL 1 с освобождением ЫНг-групп. Присутствие в гидролизате свободных NH2-rpynn определяли методом Гюзена и Строминджера (Ghuysen et a/., 1966).

Молекулярную массу цитозольной эндопептидазы А7 определяли методами гельфильтрации на колонке с Toyopearl HW-50F и электрофореза в присутствии SDS-Na.

Определение оптимального значения рН действия автолитических ферментов проводили в 0,05 М Na-ацетатном буфере с рН 5,0; 6,0; 6,5; трис-HCl буфере с рН 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0. Определение оптимального значения концентрации буфера для действия автолитических ферментов проводили в трис-HCl буферных растворах с рН 7,0-7,5 различной концентрации: 0,01 М; 0,025 М; 0,05 М; 0,1 М; 0,2 М; 0,3 М; 0,4 М. Для выявления зависимости автолитической активности ферментных препаратов от температуры инкубацию реакционной смеси проводили при температурах: 20, 29, 35, 40,45°С. Для определения термостабильности ферментные препараты инкубировали при температурах: 30, 40, 45, 50, 55, 60°С в течение 15 минут, охлаждали, а затем определяли автолитическую активность как было описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Химическая структура пептидогликана Lysobacter sp. XL 1.

Установлена химическая структура пептидогликана грамотрицательной бактерии Lysobacter sp. XL 1 - субстрата ее автолитических ферментов. Пептидогликан бактерии в сооответсвии с существующей классификацией может быть отнесен к А1у типу (Schleifer, Kandier, 1972), который характерен для большинства изученных грамотрицательных бактерий (рис. 1). В пептидогликанах этого типа каждый остаток мурамовой кислоты несет тетрапептид с аминокислотной последовательностью: L-аланин- Y-D-глугаминовая кислота-мезо-диаминопимелиновая кислота-Б-аланин. В пептидогликане А1у типа отсутствуют межпептидные мостики, а пептидные субъединицы соседних гликановых цепей

Рис. 1. Структура пептидогликана бактерии Ьу$оЪас1вг эр. ХЬ 1. Ы-АцГлю-Ы - ацетилглюкозамин, ^АцМур - N-ацетилмурамовая кислота, L-Ala - L-аланин, D-Ala - D-аланин, D-Glu - D-глутаминовая кислота, ш-Агрш - мезо-диаминопимелиновая кислота.

соединены при помощи мезо-диаминопимелиновой кислоты в 3 положении одной субъединицы и D-аланина в 4 положении другой субъединицы.

2. Автолитические ферменты активного штамма Lysobacter sp. XL 1, не секретирующего внеклеточные бактериолити чески е ферменты.

Были исследованы спектр и локализация автолитических ферментов клеток активного штамма Lysobacter sp. XL 1, выращенных на богатой (LB "супербульон") среде, когда клетки не секретировали внеклеточные бактериолитические ферменты. Для характеристики автолитических ферментов Lysobacter sp. XL 1 исследовали клетки логарифмической фазы роста и клетки, находящиеся в стационарной стадии роста, поскольку из литературы известно, что в этих случаях бактериальным клеткам необходимы различные автолитические ферменты (Beгnadsky et я1., 1994; Komatsuzava et я1., 1995).

Для установления локализации автолитических ферментов Lysobacter sp. XL 1 клетки логарифмической и стационарной стадий роста подвергали фракционированию, получая периплазматическую, цитозольную фракции, а также фракцию клеточных стенок и мембран. В полученных фракциях определяли автолитическую активность по отношению к собственным клеткам бактерии, вплавленным в агарозный гель. Автолитическая активность была обнаружена во всех клеточных фракциях Lysobacter sp. XL 1 (рис. 2), что свидетельствует о присутствии в них автолитических ферментов. На рис. 2 представлены данные для клеток стационарной стадии роста. Аналогичные результаты получены и для клеток логарифмической стадии роста.

• О »

1 2 3 4 5

Рис. 2. Автолитическая активность клеточных фракций Lysobacter sp. XL 1 по отношению к клеткам ЬуъоЬаегег sp. ХЪ 1, вплавленным в агарозный гель. В

лунки вносили по 20 мкл каждой фракции и инкубировали при 29°С в течение 24-27 ч до появления зон лизиса. 1 - третья промывка клеток 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 8,0; 2 - периплазма; 3 -цитозоль; 4 - фракция клеточных стенок и мембран; 5 - третья промывка клеточных стенок и мембран 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 8,0.

Представляло интерес выяснить, насколько прочно автолитические ферменты связаны с клеточными стенками и (или) мембранами, а также получить их в водорастворимом, солюбилизированном виде. Для этого использовали последовательную экстракцию белков из этой фракции трис-HQ буфером, трис-НС1

буфером с 0,01 М MgCl2, 5 М ПС1 и 1% тритоном Х-100. В полученных экстрактах анализировали автолитическую активность (рис. 3).

Как следует из рис. 3, часть автолитической активности клеточных стенок и мембран удавалось перевести в растворимое состояние только при высокой концентрации ЫС1, другую часть после последующей обработки тритоном Х-100. Приведенные результаты говорят о том, что автолитические ферменты связаны с клеточными стенками и (или) мембранами достаточно прочно как ионными, так и гидрофобными взаимодействиями.

1 2

Рис. 3. Автолитическая активность в экстрактах после обработки фракции клеточных стенок и мембран различными агентами. 1 - клеточные стенки и мембраны до обработки; 2-6 - экстракты после обработки: 2 - 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 8,0; 3 - 0,01 М MgCl2 (20°С); 4 - 0,01 М MgCl2 (37°С); 5 - 5 М LiCl; 6 -1 % тритоном Х-100.

Полученные данные согласуются с литературными для связанных с клеточными стенками автолитических ферментов из других бактерий (Sugai et al., 1990; Foster, 1992; Ursinus, Holtje, 1994; Smith et al., 2000).

Автолитическая активность клеточных фракций, выявленная используемым нами методом, могла быть результатом действия нескольких ферментов. Чтобы выяснить, сколько автолитических ферментов содержится в каждой из клеточных фракций Lysobacter sp. XL 1, проводили электрофоретический анализ белков цитозоля, периплазмы и экстрактов из клеточных стенок и мембран 5 М LiCl и 1% тритоном Х-100 в неденатурирующих условиях. Для разделения кислых и нейтральных белков использовали анодную систему, а для разделения щелочных белков катодную систему. После электрофореза ПААГ накладывали на агарозный гель с клетками Lysobacter sp. XL 1 и инкубировали при 29°С. Образование зон лизиса клеток Lysobacter sp. XL 1 в агарозном геле свидетельствовало о присутствии автолитической активности в соответствующих зонах полиакриламидного геля.

С помощью анодной системы в цитозоле клеток Lysobacter sp. XL 1 были выявлены шесть зон автолитической активности с Rf 0,02; 0,13; 0,38; 0,55; 0,69; 0,79 соответственно (АрАб), а с помощью катодной - ни одной (рис. 4).

Далее мы будем употреблять термин - автолитический фермент вместо зона автолитической активности, хотя мы понимаем, что каждая зона автолитической активности может содержать более чем один автолитический фермент. Как видно из рис. 4, ферменты Aj, A5, Аб имели наибольшую активность и давали четкие и прозрачные зоны лизиса. По электрофоретической подвижности фермент Ai совпадал с ранее очищенной из цитозоля глюкозаминидазой (Цфасман и др., 2000).

№

Иг

а, А2

а,

А4

а5

А«

0,020,12-

0,380,550,690,79-

о»

* "«'Г

г?

Рис. 4 Электрофореграмма автолитических ферментов цитозоля активного штамма Lysobacter sp. XL 1, выращенного на среде LB. Электрофорез проводили в неденатурирующих условиях в анодной (а) и катодной (б) системах. Концентрация ПААГ - 7,5%. 1,2 - цитозоль (1 - логарифмическая стадия роста, 2 - стационарная стадия роста). A1-A6 - цитозольные автолитические ферменты.

Рис. 5. Электрофореграмма автолитических ферментов периплазмы (1), экстрактов после обработки фракции клеточных стенок и мембран 5 М LiCl (2) и 1% раствором тритона Х-100 (3) активного штамма Lysobacter sp. ХЬ 1, выращенного на богатой среде ЬВ. Периплазма и фракция клеточных стенок и мембран получены из клеток логарифмической стадии роста. Электрофорез проводили в анодной (а) и катодной (б) системах. Концентрация ПААГ 7,5%. Ag-Aio - автолитические ферменты.

В периплазматической фракции был обнаружен лишь один автолитический фермент с Rf 0,05 - А8 (рис. 5).

Электрофоретический анализ экстракта клеточных стенок и мембран раствором LiCl выявил автолитический фермент с Rf 0,05 - А9. В тритоновом экстракте из клеточных стенок и мембран, предварительно обработанных LiCl, обнаружен автолитический фермент с Rf 0,13 - Аю (рис. 5).

Таким образом, показано, что клетки Lysobacter sp. XL 1, выращенные на богатой среде LB "супербульон" в условиях отсутствия секреции внеклеточных бактериолитических ферментов, синтезируют как минимум 9 автолитических ферментов. Эти ферменты обнаруживаются во всех исследованных клеточных фракциях - периплазме, цитозоле и клеточных стенках и (или) мембранах, что согласуется с литературными данными. Так, на разных объектах (Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) было выявлено, что в клетках бактерий присутствует множество автолитических ферментов с различной локализацией (Shockman, Holtje, 1994; Holtje, 1995; Smith et al., 2000).

Показано, что в процессе роста исследуемой бактерии спектр и уровень активности цитозольных автолитических ферментов изменялся (рис. 4). В цитозоле клеток стационарной стадии роста не был обнаружен автолитический фермент А2, присутствующий в клетках логарифмической стадии роста. В клетках стационарной стадии роста активность фермента А значительно увеличивалась, а активность ферментов А5 и Аб уменьшалась. Спектр и уровень активности автолитических ферментов периплазмы и клеточных стенок и мембран в процессе роста Lysobacter sp. XL 1 не изменялся.

3. Субстратная специфичность автолитических ферментов по отношению к пептидогликану LysoЬacter эр. ХЬ 1.

Представляло интерес определить субстратную специфичность выявленных автолитических ферментов Lysobacter ер. ХЬ 1. Для этого по окончании электрофореза зоны автолитической активности были элюированы из ПААГ 0,1 М №С1 в 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 8,0. В полученных элюатах определяли субстратную специфичность автолитических ферментов по их способности гидролизовать синтетические субстраты для глюкозаминидаз - р-нитрофенил-2-ацетамидо-2-дезокси-р-0-глюкопиранозид и мурамидаз - 3,4-динитрофенил-тетра-Ы-ацетил-Р-В-хитотетраозид, а также пептидогликан бактерии. Полученные данные представлены в табл. 1.

Как видно из таблицы, глюкозаминидазной активностью обладали периплазматический фермент А, цитозольный фермент А и фермент Аю, присутствующий в экстракте клеточных стенок и мембран тритоном Х-100. Мурамидазная активность была выявлена у цитозольного фермента А4 и фермента А9, присутствующего в ЫС1 экстракте клеточных стенок и мембран. N ацетилмурамоилл-аланин амидазной активностью обладали цитозольные ферменты Аз и Аб, а диаминопимелиноил-аланин эндопептидазной активностью - цитозольный фермент А5.

Таблица 1. Субстратная специфичность автолитических ферментов Lysobacter sp. XL 1.

Автолитичес кий фермент Внутриклеточная локализация Субстратная специфичность

А, цитозоль глюкозаминидаза

А, цитозоль М-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидаза

A4 цитозоль мурамидаза

а5 цитозоль диаминопимелиноил-аланин эндопептидаза

А6 цитозоль Ы-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидаза

Ag периплазма глюкозаминидаза

А, клет. стенка и мембр. мурамидаза

Am клет. стенка и мембр. глюкозаминидаза

Таким образом, каждой зоне автолитической активности соответствовала одна определенная субстратная специфичность. Следовательно, одна зона автолитической активности, скорее всего, содержит один автолитический фермент.

Вместе с тем нельзя исключать, что в этом районе может присутствовать несколько автолитических ферментов с одинаковой субстратной специфичностью.

Таким образом, бактерия Lysobacter sp. XL 1 в условиях отсутствия секреции внеклеточных бактериолитических ферментов, как и большинство других изученных бактерий, продуцирует автолитические ферменты различной субстратной специфичности.

4. Свойства автолитических ферментов As и Аб цитозоля Lysobacter sp. XL 1,

Изучены свойства наиболее активных автолитических ферментов цитозоля Lysobacter sp. XL 1 - эндопептидазы As и М-ацетилмурамоил-аланин амидазы Аб. Для этого использовали препараты, полученные элюцией из ПААГ после электрофореза в анодной системе.

Свойства ферментов А5 и Аб представлены в табл. 2 в сравнении со свойствами ранее изученных внеклеточных бактериолитических ферментов Lysobacter sp. XL 1.

Как видно из табл. 2, цитозольные эндопептидаза А5 и М-ацетилмурамоилл-аланин амидаза Аб имели схожие и типичные для большинства изученных автолитических ферментов свойства (Захарова, Павлова, 1985; Shockman, Holtje, 1994). Они проявляли максимальную активность в широком диапазоне концентраций буфера, при слабо щелочной реакции среды, при невысокой температуре, а также являлись сравнительно термолабильными кислыми белками. Внеклеточные ферменты Lysobacter sp. XL 1 с аналогичной субстратной специфичностью, в отличие от внутриклеточных ферментов, проявляли максимальную активность в среде с низкой ионной силой, при достаточно высокой температуре и являлись термостабильными щелочными белками (Степная и др., 1999).

Таблица 2. Свойства вне - и внутриклеточных бактериолитических ферментов Ьу$оЪас1вг sp. XL 1.

Фермент Оптимальные условия для активности Температура полуинактива ции

рН Молярность буфера, мМ Т,°С

Внутриклеточные (автолитические) ферменты

эндопептидаза А; 7,5 50,0-200,0 29,0 45,0

Ы-ацетилмурамоил -Ь-аланин амидаза А« 7,5-8,0 50,0-200,0 29,0 40,0

Внеклеточные бактериолитические ферменты (Степная и др., 1999)

мурамидаза 8,0 0,1 60,0 65,0

Ы-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидаза Лг 8,0 5,0 65,0 65,0

эндопептидаза Л) 7,0-11,0 50,0 70,0 50,0

Таким образом, свойства автолитических ферментов бактерии Ьу$оЪас1ег¡р. ХЬ 1 значительно отличаются от свойств ранее изученных внеклеточных бактериолитических ферментов этой бактерии, что может говорить в пользу независимости функционирования этих двух ферментных систем.

5. Автолитические ферменты активного штамма бактерии Lysobacter sp. XL 1, секретирующего внеклеточные бактериолитические ферменты.

На следующем этапе работы исследовали автолитические ферменты в клетках активного штамма бактерии LysoЪacter ер. ХЬ 1, выращенных в условиях, когда они продуцируют не только автолитические, но и внеклеточные бактериолитические ферменты. Для этого клетки LysoЪacter ер. ХЬ 1 выращивали на среде 5/5. У таких клеток были выявлены те же основные закономерности распределения и состава автолитических ферментов в клеточных фракциях, а также изменения спектра и уровня активности этих ферментов в процессе роста, за исключением единственного существенного отличия - в цитозоле этих клеток обнаружен дополнительный фермент А7, не выявленный в клетках, выращенных на среде ЬВ (рис. 6). Это позволило предположить, что фермент А7 может быть либо связан с секрецией внеклеточных бактериолитических ферментов, либо являться предшественником или измененной молекулярной формой одного из внеклеточных бактериолитических ферментов.

На рис. 6 для сравнения - приведены данные по составу внеклеточных бактериолитических ферментов бактерии. Как видно из рис. 6, электрофоретическая подвижность автолитического фермента А7 совпадала с подвижностью внеклеточного фермента Л. На этом основании можно было думать, что фермент А,

является предшественником или измененной молекулярной формой именно этого внеклеточного фермента. Далее мы попытались прояснить этот вопрос.

Рис. 6. Электрофореграмма внутриклеточных автолитических ферментов цитозоля и внеклеточных бактериолитических ферментов активного штамма Ьу$вЬас1ег sp. ХЬ 1, выращенного на среде 5/5. Электрофорез проводили в неденатурирующих условиях в анодной (а) и катодной (б) системах. Концентрация ПААГ - 7,5%. 1,2 - цитозоль (1 - логарифмическая стадия роста, 2 - стационарная стадия роста), 3 - культуральная жидкость клеток стационарной стадии роста, 4 -очищенный препарат внеклеточной эндопептидазы Л. А1-А7 - цитозольные автолитические ферменты. 1-5 - внеклеточные бактериолитические ферменты.

6. Сравнение субстратной специфичности автолитического фермента А7 и внеклеточного фермента Л |.

Для подтверждения высказанного предположения была определена субстратная специфичность внутриклеточного фермента А7 по отношению к пептидогликанам Staphylococcus aureus, Lysobacter sp. XL 1 и внеклеточного фермента JIi no отношению к пептидогликану Lysobacter sp. XL 1. Ранее было установлено, что фермент JTj по отношению к пептидогликану S. aureus обладал Gly-Gly-эндопептидазной и Ы-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидазной активностью (Бегунова и др., 2003). Полученные результаты представлены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что ферменты А7 и JI обладают одинаковой эндопептидазной активностью как по отношению к пептидогликану Lysobacter sp. XL 1, так и к пептидогликану S. aureus. Отличие между этими ферментами по субстратной специфичности состоит в том, что фермент Я обладает дополнительно N-ацетилмурамоил-аланин амидазной активностью как по отношению к

пептидогликану Lysobacter sp. XL 1, так и по отношению к пептидогликану S. aureus.

Таблица 3. Субстратная специфичность ферментов А7 и Л, по отношению к пептидогликанам S. aureus и Lysobacter sp. XL 1.

Фермент Субстратная специфичность

по отношению к пептидогликану Lysobacter sp. XL 1. по отношению к пептидогликану S. aureus.

фермент A^ диаминопимелиноил-аланин эндопептидаза глицил-глицин эндопептидаза

фермент Л] диаминопимелиноил-аланин эндопептидаза и Ы-ацеталмурамоил-Ь-аланин амидаза глицил-глицин эндопептидаза и Ы-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидаза

7. Автолнтические ферменты малоактивного штамма Lysobacter sp. ХЬ 2.

Исследован спектр автолитических ферментов клеток малоактивного варианта Lysobacter sp. XL 2, так как известно, что он не секретирует внеклеточный фермент Ль но секретирует другие внеклеточные бактериолитические ферменты (Степная и др., 19966). Таким образом, если автолитический фермент Ау является предшественником-внеклеточного фермента Ли то он должен отсутствовать в клетках малоактивного штамма бактерии.

Малоактивный штамм Lysobacter sp. XL 2 выращивали в условиях, стимулирующих секрецию внеклеточных ферментов, то есть на среде 5/5. Для анализа его автолитических ферментов использовали клетки логарифмической стадии роста.

Во всех клеточных фракциях клеток Lysobacter sp. XL 2 была обнаружена автолитическая активность (рис. 7).

1 2 3

Рис. 7. Автолитическая активность клеточных фракций Lysobactersp. ХЬ 2 по отношению к клеткам Lysobacter sp. ХЬ 1, вплавленным в агарозный гель.

В лунки вносили по 20 мкл каждой фракции и инкубировали при 29 С. 1 - периплазма, 2 - цитозоль, 3 - фракция клеточных стенок и мембран.

Активность цитозольной фракции клеток Lysobacter ер. ХЬ 2 оказалась заметно меньше активности цитозольной фракции клеток Lysobacter ер. ХЬ 1, секретирующих внеклеточные ферменты (рис. 2). Уровни активности периплазматической фракции и фракции клеточных стенок и мембран были сопоставимы.

Электрофоретический анализ автолитических ферментов клеток Lysobacter ер. ХЬ 2 в неденатурирующих условиях выявил, что состав автолитических ферментов периплазматической и мембранной фракций был идентичен составу тех же фракций Lysobacter ер. ХЬ 1. В то же время спектр и уровень активности автолитических ферментов цитозоля Lysobacter ер. ХЬ 2 отличались от спектра и уровня активности ферментов цитозоля Lysobacter ер. ХЬ 1 (рис. 7). Так, в цитозоле клеток Lysobacter ер. ХЬ 2 было обнаружено уменьшение активности фермента Л1 и отсутствие фермента А7, присутствующего в цитозоле клеток Lysobacter ер. ХЬ 1, секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты.

Рис. 8. Сравнение цитозольных автолитических ферментов штаммов

Lysobacter sp. XL 1 и XL 2. Электрофорез проводили в неденатурирующих условиях в анодной (а) и катодной (б) системах. Концентрация ПААГ - 7,5%, 1 - Lysobacter sp. XL 2,2 - Lysobacter sp. XL 1. A1-A7 - цитозольные автолитические ферменты.

Отсутствие в клетках малоактивного штамма Lysobacter ер. ХЬ 2, секретирующих все внеклеточные бактериолитические ферменты, кроме эндопептидазы Л, фермента А7 позволило, на наш взгляд, с большей уверенностью предполагать, что внутриклеточный фермент А7 является предшественником внеклеточного фермента Л.

8. Выделение, очистка и свойства цитозольной эндопептидазы А7.

UI 4 1

В связи с высказанным предположением представляло интерес изучить некоторые физико-химические свойства цитозольного фермента А, и сравнить их с уже изученными свойствами внеклеточных ферментов, в частности внеклеточной эндопептидазы Л Поэтому следующей задачей работы являлось выделение и очистка цитозольной эндопептидазы А,.

Эндопептидазу А, выделяли из цитозольной фракции клеток Lysobacter sp. XL 1, выращенных на среде 5/5, используя схему очистки, представленную на рис. 9.

цитозоль

У осаждение (NH^SCX» 0-30%

осадок надосадочная жидкость

| осаждение (NH4)2S04 30-50%

осадок

I электрофорез в системе Рейсфельда

активная зона в ПААГ

элюция 0,1 M NaCl

элюат с автолитической активностью

ионообменная хроматография I на SP-сефадехсе рН 4,5

препарат фермента А7 (объединенные активные фракции)

Рис. 9. Выделение и очистка цитозольной эндопептидазы А7.

Электрофоретический анализ ферментного препарата в присутствии SDS-Na показал наличие в нем нескольких белковых полос. При этом только интенсивность полосы с молекулярной массой 45 кДа зависела от уровня автолитической активности в процессе очистки. Этот факт позволил предположить, что именно этот белок является эндопептидазой А7. Молекулярная масса фермента определена также методом гельфильтрации на Toyopearl HW-55F. Она составила примерно 40 кДа, что согласуется с данными, полученными методом электрофореза.

Установлены оптимальные условия действия фермента А7: оптимум рН - 7,0; оптимум концентрации буфера - 50 мМ (25-100 мМ) трис-HCl; оптимум температуры реакции - 29°С. Показано, что температура полуинактивации фермента - 50°С. Таким образом, эндопептидаза А, проявляла максимальную активность при невысокой температуре и была устойчива к повышению ионной силы реакционной среды. Внеклеточная эндопептидаза Л проявляла максимальную активность при

более высокой температуре (70°С) и была чувствительна к повышению ионной силы реакционной среды (табл. 3).

В тоже время эндопептидаза А7 являлась щелочным и термостабильным белком, чем была похожа на внеклеточную эндопептидазу Л и другие внеклеточные бактериолитические ферменты (табл. 3).

Ферменты А7 и Л обладают также одинаковой эндопептидазной активностью как в отношении к пептидогликану Lysobacter sp. XL 1, так и к пептидогликану S. aureus. Отличие между этими ферментами по субстратной специфичности состоит в том, что фермент Л обладает дополнительно М-ацетилмурамоил^-аланин амидазной активностью как по отношению к пептидогликану Lysobacter sp. XL 1, так и по отношению к пептидогликану S. aureus (табл. 2).

Молекулярная масса эндопептидазы А7 (40-45 кДа) оказалась почти в 2 раза больше молекулярной массы внеклеточной эндопептидазы Jli (21 кДа) (Степная и др., 1996в). Возможно, внеклеточная эндопептидаза JIj является продуктом протеолитического расщепления цитозольной эндопептидазы А7.

В последнее время была показана высокая степень гомологии внеклеточной эндопептидазы. Л с внеклеточной а-литической протеиназой из Lysobacter enzymogenes (Муранова и др., 2004), что позволило идентифицировать фермент Л как а-литическую протеиназу (ЕС 3.4.21.12). Известно, что а-литическая протеиназа Lysobacter enzymogenes синтезируется в виде препробелка с молекулярной массой 40 кДа (Epstein, Wensink, 1988). То есть зрелый белок имел молекулярную массу вдвое меньше, чем препробелок. Однако авторами- не было показано, обладал ли препробелок ферментативной активностью.

Возможно, что цитозольная эндопептидаза А7 Lysobacter sp. также является препробелком • внеклеточной эндопептидазы Ль обладающим ферментативной активностью.

Протеолиз препробелка может приводить к тому, что зрелая форма отличается от него не только по молекулярной массе, но и по ферментативным свойствам.-

Чтобы окончательно выяснить, является ли автолитический фермент А7 предшественником внеклеточной эндопептидазы Л необходимо выделить фермент А7 в электрофоретически гомогенном виде для изучения аминокислотной последовательности этого белка, и сравнения ее с аминокислотной последовательностью фермента Я\.

выводы

1. Установлена химическая структура пептидогликана бактерии Lysobacter ер.

2. В клетках Lysobacter ер. ХЬ 1, не секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты обнаружено 9 внутриклеточных (автолитических) ферментов. В этих же клетках, в условиях секреции внеклеточных бактериолитических ферментов, выявлен дополнительный автолитический фермент.

3. В клетках Lysobacter ер. ХЬ 2, утративших способность секретировать внеклеточную эндопептидазу, этот дополнительный автолитический фермент не обнаружен.

4. Автолитические ферменты LysoЬacter 8р. ХЬ 1 и LysoЬacter 8р. ХЬ 2 выявлены во всех клеточных фракциях: цитозоле, периплазме и во фракции клеточных стенок и мембран. Показано, что большая часть автолитических ферментов локализована в цитозоле.

5. Спектр и уровень активности автолитических ферментов зависит от стадии роста культуры.

6. Определена субстратная специфичность автолитических ферментов Lysobacter ер. ХЬ 1. Среди них выявлены глюкозаминидазы, мурамидазы, N ацетилмурамоилЛ-аланин амидазы и эндопептидазы. Свойства автолитических ферментов Lysobacter ер. ХЬ 1 были близки между собой и отличались от свойств внеклеточных бактериолитических ферментов.

7. Получен очищенный препарат цитозольной эндопептидазы, выявленной только в клетках Lysobacter ер. ХЬ 1, секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты, и охарактеризованы его свойства. Сходство свойств этого фермента со свойствами внеклеточной эндопептидазы Lysobacter ер. ХЬ 1 и отсутствие его в в клетках Lysobacter ер. ХЬ 2, позволяет выдвинуть предположение о том, что данный фермент является препробелком внеклеточной эндопептидазы.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Stepnaya O.A., Tsfasman I.M., Ledova L.A., Ryazanova L.P., Sitkin B.V., Kulaev I.S. Bacteriolytic enzymes of Xanthomonas campestris XL 1. International symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology", Pushchino, 2000, p. 80-81.

2. Ситкин Б.В.. Фирсова M.B. Бактериолитические ферменты Xanthomonas campestris В-124. Школа конференция "Горизонты физико-химической • биологии", Пущино, 2000, том 1, с.207-208.

3. Ситкин Б.В., Цфасман И.М., Степная О.А. Внутриклеточные. пептидогликангидролазы бактерии Xanthomonas campestris XL 1.

5-ая Путинская конференция молодых ученых "Биология-наука 21 го века", Пущино, 2001, с. 51-51.

4. СИТКИН Б.В., Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С. Внутриклеточные бактериолитические ферменты Xanthomonas campestris XL 1 - продуцента антибактериального препарата лизоамидазы. Международная конференция "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий", Саранск, 2001, с. 199-201.

5. Ситкин Б.В.. Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С. Внутриклеточные пептидогликангидролазы бактерии Xanthomonas campestris XL 1. 3-ий Съезд биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, с. 106-107.

6. Ситкин Б.В.. Лысанская В.Я., Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С. Структура пептидогликана бактерии Lysobacter sp. - продуцента внеклеточных бактериолитических ферментов. Микробиология, 2003, т.72, №1, с. 136-137.

7. Ситкин Б.В., Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С. Внутриклеточные пептидогликангидролазы бактерии Xanthomonas campestris XL1. Биохимия,. 2003,т.68,№4,с.562-569.

8. Ситкин Б.В.. Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С. Могут ли автолизины бактерий являться: предшественниками внеклеточных бактериолитических ферментов? Доклады Академии наук, 2003, т.392, №3, с.406-409.

»10429

Подписано в печать 30 амрсмя 2001 ^ Заказ 405 Формат 60 х 90-16. Тираж Ю0 экз Опечатано в салоне оперативной печати АртПолш раф. Москва, Б. Якиманка. 13, оф. 410. Те.1. 778-97-47

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ситкин, Борис Викторович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Распространенность бактериолитических ферментов в природе.

ГЛАВА 2. Структура клеточной стенки бактерий - субстрата бактериолитических ферментов.

2.1. Клеточная стенка грамположительных бактерий.

2.2. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий.

2.3. Строение пептидогликана бактерий.

ГЛАВА 3. Субстратная специфичность бактериолитических ферментов.

ГЛАВА 4. Бактериолитические ферменты бактерий.

4.1. Внеклеточные бактериолитические ферменты.

4.2. Автолитические ферменты бактерий.

4.2.1. Физиологическая роль ферментов.

4.2.2. Спектр и субклеточная локализация автолититических ферментов бактерий.

4.2.3. Свойства автолитических ферментов.

4.2.4. Регуляция и контроль активности автолитических ферментов.

4.3. Взаимосвязь биосинтеза внутриклеточных и внеклеточных бактериолитических ферментов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. Материалы и методы.

5.1. Материалы.

5.2. Микроорганизмы и условия их культивирования.

5.3. Субклеточное фракционирование.

5.4. Солюбилизация автолитических ферментов из фракции клеточных стенок и мембран.

5.5. Определение ферментативных активностей клеточных фракций.

5.5.1. Определение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности.

5.5.2. Определение лактатдегидрогеназной активности.

5.5.3. Определение активности циклической фосфодиэстеразы.

5.5.4. Определение автолитической активности.

5.6. Турбидиметрический метод определения автолитической активности ферментных препаратов.

5.7. Определение белка.

5.8. Электрофоретический анализ автолитических ферментов клеточных фракций Lysobacter sp. XL 1 и XL 2.

5.8.1. Электрофоретический анализ в анодной системе.

5.8.2. Электрофоретический анализ в катодной системе.

5.9. Выделение пептидогликана бактерии Lysobacter sp. XL 1.

5.10. Определение состава пептидогликана Lysobacter sp. XL 1.

5.11. Определение конфигурации диаминопимелиновой кислоты в пептидогликане Lysobacter sp. XL 1.

5.12. Элюция автолитических ферментов из ПААГ.

5.13. Определение субстратной специфичности автолитических ферментов.

5.13.1. Обнаружение ферментов с глюкозаминидазной активностью.

5.13.2. Обнаружение ферментов с мурамидазной активностью.

5.13.3. Обнаружение ферментов с амидазной и эндопептидазной активностями.

5.14. Осаждение белков цитозоля сульфатом аммония.

5.15. Ионообменная хроматография элюата из ПААГ на SP-сефадексе С-50.

5.16. Определение молекулярной массы цитозольной эндопептидазы А7.

5.16.1. Гельфильтрация.

5.16.2. Электрофорез в присутствии SDS-Na.

5.17. Характеристика ферментных препаратов, содержащих эндопептидазы

As, Aj и 1Ч-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидазу Аб.

5.17.1. Определение оптимального значения рН для действия автолитических ферментов.

5.17.2. Определение оптимального значения концентрации буфера для действия автолитических ферментов.

5.17.3. Определение влияния температуры на активность автолитических ферментов.

5.17.4. Определение термостабильности ферментных препаратов.

ГЛАВА 6. Результаты исследования и их обсуждение.

6.1. Химическая структура пептидогликана Lysobacter sp. XL 1.

6.2. Автолитические ферменты активного штамма Lysobacter sp. XL 1, не секретирующего внеклеточные бактериолитические ферменты.

6.3. Субстратная специфичность автолитических ферментов по отношению к пептидогликану бактерии Lysobacter sp. XL 1.

6.4. Определение свойств наиболее активных автолитических ферментов цитозоля Lysobacter sp. XL 1.

6.4.1. Оптимум рН действия эндопептидазы А5 и Ы-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидазы Аб.

6.4.2. Зависимость активности эндопептидазы А5 и М-ацетилмурамоил-L-аланин амидазы Аб от ионной силы раствора.

6.4.3. Оптимум температуры реакции эндопептидазы А и ]Ч-ацетилмурамоил-1^аланин амидазы Аб.

6.4.4. Термостабильность эндопептидазы А5 и ацетилмурамоил-1^аланин амидазьт Аб.

6.5. Автолитические ферменты активного штамма Lysobacter sp. XL 1, секретирующего внеклеточные бактериолитические ферменты.

6.6. Сравнение субстратной специфичности автолитического фермента А и внеклеточного фермента JIi.

6.7. Автолитические ферменты малоактивного штамма

Lysobacter sp. XL 2.

6.8. Выделение, очистка и свойства цитозольной эндопептидазы Ау.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Локализация и свойства автолитических ферментов Lysobacter sp. - продуцента внеклеточных бактериолитических ферментов"

Актуальностьпроблемы. Внутриклеточные бактериолитические автолитические) ферменты, разрушающие ковалентные связи в пептидогликане — основном структурном компоненте клеточной стенке эубактерии, играют важную роль в процессах роста и деления бактериальной клетки. Они являются жизненно необходимыми для любой эубактерии. Кроме того, некоторые эубактерии в определенных условиях продуцируют не только автолитические, но и внеклеточные бактериолитические ферменты, которые необходимы им для завоевания экологической ниши и обеспечения их клеток пищей и энергией. В этом случае в клетках эубактерий идет параллельный синтез и передвижение через цитоплазматическую мембрану к месту своего действия как автолитических ферментов, которые могут локализоваться в мембране, периплазме и клеточной стенке, так и внеклеточных бактериолитических ферментов, секретируемых в окружающую среду. В связи с этим встает вопрос о механизме и регуляции процесса одновременного функционирования этих ферментов, о том могут ли автолитические ферменты являться предшественниками внеклеточных бактериолитических ферментов?

К настоящему времени опубликовано большое количество работ, посвященных выделению и характеристике как внеклеточных, так и внутриклеточных бактериолитических ферментов эубактерий. Однако, до сих пор в литературе нет сведений по сравнительному изучению у одной и той же бактерии вне- и внутриклеточных бактериолитических ферментов, в которых они были бы достаточно полно исследованы.

Грамотрицательная бактерия Lysobacter sp. (ранее определенная как Xanthomonas campestris) относится к числу таких бактерий, которые в определенных условиях продуцируют внеклеточные бактериолитические ферменты: мурамидазу, эндопептидазу

JIi и К-ацетилмурамоил-Ь-аланин амид азу JI2. Эти ферменты входят в состав применяемого в медицине антибактериального препарата лизоамидаза (Машковский, 1998), поэтому их свойства хорошо изучены. Все они являются положительно заряженными низкомолекулярными белками, проявляющими наибольшую активность в среде с низкой ионной силой и высоким значением рН (Степная и др., 1999).

Ранее в цитозоле этой бактерии был обнаружен автолитический фермент с глюкозаминидазной активностью, не выявленный среди внеклеточных бактериолитических ферментов (Цфасман и др., 2000). Его физико-химические свойства существенно отличались от свойств внеклеточных ферментов Lysobacter sp. Однако, подробный анализ автолитических ферментов этой бактерии не проводили. Вместе с тем изучение автолитических ферментов Lysobacter sp. в сравнении с ее уже изученными внеклеточными бактериолитическими ферментами позволит приблизиться к пониманию механизма функционирования этих двух "пулов" бактериолитических ферментов у одной бактерии.

Цель работы - изучение автолитических ферментов бактерии Lysobacter sp.

Задачи работы:

1. Изучение химической структуры пептидогликана бактерии Lysobacter sp. -субстрата ее автолитических ферментов.

2. Выявление автолитических ферментов бактерии и установление их локализации.

3. Определение субстратной специфичности автолитических ферментов бактерии Lysobacter sp. по отношению к связям пептидогликана.

4. Выделение и очистка наиболее активных автолитических ферментов бактерии.

5. Изучение свойств автолитических ферментов Lysobacter sp. и сравнение их со свойствами изученных ранее внеклеточных бактериолитических ферментов этой бактерии.

Научная новизна работы. Установлена химическая структура пептидогликана грамотрицательной бактерии Lysobacter sp.

Впервые на примере Lysobacter sp. проведено сравнение вне- и внутриклеточных бактериолитических ферментов у одной и той же бактерии. При этом в клетках Lysobacter sp. XL 1, не секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты, обнаружено 9 внутриклеточных (автолитических) ферментов. В условиях секреции внеклеточных ферментов в клетках Lysobacter sp. XL 1 выявлен дополнительный автолитический фермент. В клетках Lysobacter sp. XL 2, утративших способность секретировать внеклеточную эндопептидазу, этот дополнительный автолитический фермент не обнаружен. Показано, что спектр этих ферментов Lysobacter sp. включает в себя глюкозаминидазы, мурамидазы, 1Ч-ацетилмурамоил-1^аланин амидазы и эндопептидазы. Он существенно отличается от спектра внеклеточных бактериолитических ферментов по количеству, субстратной специфичности и свойствам.

Показано, что спектр и уровень активности автолитических ферментов изменяется в процессе роста бактерии.

Получен очищенный препарат цитозольной эндопептидазы, выявленной только в клетках Lysobacter sp. XL 1, секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты. Показано, что этот фермент имеет ряд свойств, аналогичных свойствам внеклеточной эндопептидазы Ль Это и тот факт, что цитозольная эндопептидаза отсутствует в клетках Lysobacter sp. XL 2, утративших способность секретировать внеклеточную эндопептидазу Ль позволило предположить, что цитозольная эндопептидаза может являться предшественником внеклеточной эндопептидазы.

Научно-практическое значение. Полученные в работе новые данные расширяют наше представление о механизме функционирования внутриклеточных и внеклеточных бактериолитических ферментов бактерий. Настоящая работа по своему характеру относиться к разряду фундаментальных исследований. Однако, полученные результаты имеют также и практическое значение, так как они могут быть использованы для оптимизации условий секреции внеклеточных бактериолитических ферментов Lysobacter sp. XL 1, выяснения перспективности обогащения автолитическими ферментами медицинского препарата лизоамидаза, и как следствие - улучшение его качества и бактериолитических свойств.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Распространенность бактериолитических ферментов в природе.

Бактериолитическими ферментами принято называть ферменты, способные разрушать клеточные стенки бактерий и, тем самым, вызывать лизис бактериальной клетки.

Еще в начале XX века ученые обратили внимание на способность выделений и экстрактов тканей животных лизировать суспензии некоторых грамположительных бактерий. Так, в 1909 г русский ученый Н. Лященко впервые описал бактериолитические свойства белка куриного яйца и предположил, что это может быть связано с присутствием в нем специфического энзима (Егоров, 1986). Спустя 13 лет английский микробиолог А. Флеминг открыл и выделил из некоторых биологических жидкостей и тканей человека лизоцим - бактериолитический фермент, разрушающий клеточные стенки бактерий (Fleming, 1922) С тех пор и до настоящего времени ведется интенсивная работа по изучению бактериолитических ферментов.

Сейчас известно, что способность продуцировать и использовать бактериолитические ферменты является одной из общих черт всех живых организмов, от вирусов до человека (Salton, 1957; Kato et al., 1960; Hash et al., 1964; Ghuysen et al., 1966; Tsugita, 1971; Imoto et al., 1972; Головина, 1972; Головина и др., 1973; Fermor, Wood, 1981; Звягинцева, 1981; Бухарин, Усвяцов, 1981; Кузнецов и др., 1982; Valinger et al., 1982; Taylor, 1983; Кулаев и др., 1984; Mollner et al., 1984; Захарова, Павлова, 1985; Holtje, Tuomanen, 1991; Shockman, Holtje, 1994; Holtje, 1995; Степная и др., 1999; Smith et al., 2000).

Наиболее распространенными и изученными бактериолитическими ферментами растительного, грибного и животного происхождения являются лизоцимы. Они были обнаружены в молоке, слизи, моче и тканях животных, а также в некоторых тканях растений и грибов (Salton, 1957; Hash et al., 1964; Imoto et al., 1972; Hara, Matsushima,

1972; Phillips, 1974; Fermor, Wood, 1981; Taylor, 1983). Кроме лизоцимов, в сыворотках человека и некоторых млекопитающих также были обнаружены бактериолитические М-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидазы (Valinger et al., 1982; Mollner et al., 1984).

Принято считать, что бактериолитические ферменты растений, животных и других высших организмов являются частью их иммунной системы и выполняют защитные функции (Imoto et al., 1972; Strominger, Tipper, 1974; Valinger et al., 1982).

Самый широкий спектр бактериолитических ферментов обнаружен у бактерий. Бактериолитические ферменты бактерий по функции и локализации принято разделять на две группы. Первую группу составляют внутриклеточные (автолитические) ферменты, выявленные у всех изученных бактерий. Они играют ключевую роль в росте и делении бактериальной клетки и поэтому являются для них жизненно необходимыми (De Boer et al., 1990; Holtje, Tuomanen, 1991; Shockman, Holtje, 1994; Holtje, 1995; Blackman et al., 1998; Smith et al., 2000). К этой группе также относятся литические ферменты бактериальных спор, которые активируются в период их прорастания (Gombas, Labbe, 1981; Makino et al., 1994; Sekiguchi et al., 1995; Atrih et al., 1998; Boland et al., 2000; Smith et al., 2000).

Вторая группа - это внеклеточные бактериолитические ферменты. Способность секретировать внеклеточные бактериолитические ферменты широко распространена как у грамотрицательных, так и у грамположительных бактерий. У грамотрицательных бактерий наибольшее количество активных культур встречается среди представителей рода Pseudomonas, а у грамположительных - Bacillus, Staphylococcus, Streptomyces и Clostridium (Звягинцева, 1981; Shockman, Holtje, 1994; Smith et al., 2000). Внеклеточные бактериолитические ферменты бактерий, с одной стороны выполняют защитные функции, а с другой - являются факторами агрессии и участвуют в завоевании бактерией-продуцентом области обитания и в снабжении ее пищей (Strominger, Ghuysen, 1967; Кулаев и др., 1984; Степная и др., 1999).

Особую группу составляют бактериолитические ферменты, гены которых локализованы на хромосомах бактериофагов. Эти ферменты, экспрессируемые бактериофагами на поздних этапах их развития, необходимы для разрушения клеточной стенки бактерии-хозяина и освобождения зрелых инфекционных фаговых частиц. Наиболее изученными ферментами этого класса являются: лизоцим бактериофага лямбда Е. coli (Black, Hogness, 1969), лизоцим бактериофага Т4 (Szewczyk, Skorko, 1983) и М-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидаза бактериофага Т7 (Kleppe et al., 1977).

ГЛАВА 2. Структура клеточной стенки бактерий - субстрата бактериолитических ферментов.

Специфическим субстратом бактериолитических ферментов являются клеточные стенки бактерий. Они представляют собой многокомпонентную структуру, защищающую содержимое бактериальной клетки и осуществляющую ее связь с внешней средой (Koch, 1995).

Клеточные стенки бактерий интенсивно изучались на протяжении нескольких десятков лет. За этот период накоплен большой фактический материал по структуре и функциям бактериальных клеточных стенок, который изложен в ряде обзоров (Salton, 1952; Rogers et al., 1980; Archibald et al., 1993; Salton, 1994; Labishinski, Maidhof, 1994; Koch, 1995).

По способности окрашиваться по Граму все эубактерии принято разделять на грамположительные, которые окрашиваются по Граму, и грамотрицательные бактерии -неокрашиваемые по Граму. Такое различие связано с принципиально разным строением клеточных стенок у этих бактерий (рис. 1а,б). а. б.

Рис. 1. Структура клеточной стенки микроорганизмов (White, 1995). а. Структура клеточной стенки грамположительных бактерий.

Р, Pr, Pg, Pw, Pm - белки, PI - фосфолигхид, G1 - гликолипид, PG - пептидогликан, SP -тейхоевые кислоты, тейхуроновые кислоты, полисахариды, aLTA, LTAt, LTAx, dLTAx — липотейхоевые кислоты, L - липиды. б. Структура клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

LPS - липополисахарид, О - О-антигенный специфический полисахарид, С - кор, А -липид А, Р - порин, PL - фосфолипид, MLP - липопротеин, Рг - белок, от - внешняя мембрана, pg - пептидогликан, cm - цитоплазматическая мембрана.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ситкин, Борис Викторович

выводы

1. Установлена химическая структура пептидогликана бактерии Lysobacter sp.

2. В клетках Lysobacter sp. XL 1, не секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты обнаружено 9 внутриклеточных (автолитических) ферментов. В этих же клетках, в условиях секреции внеклеточных бактериолитических ферментов, выявлен дополнительный автолитический фермент.

3. В клетках Lysobacter sp. XL 2, утративших способность секретировать внеклеточную эндопептидазу, этот дополнительный автолитический фермент не обнаружен.

4. Автолитические ферменты Lysobacter sp. XL 1 и Lysobacter sp. XL 2 выявлены во всех клеточных фракциях: цитозоле, периплазме и во фракции клеточных стенок и мембран. Показано, что большая часть автолитических ферментов локализована в цитозоле.

5. Спектр и уровень активности автолитических ферментов зависит от стадии роста культуры.

6. Определена субстратная специфичность автолитических ферментов Lysobacter sp. XL 1. Среди них выявлены глюкозаминидазы, мурамидазы, Г^-ацетилмурамоил-Ц-аланин амидазы и эндопептидазы. Свойства автолитических ферментов Lysobacter sp. XL 1 были близки между собой и отличались от свойств внеклеточных бактериолитических ферментов.

7. Получен очищенный препарат цитозольной эндопептидазы, выявленной только в клетках Lysobacter sp. XL 1, секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты, и охарактеризованы его свойства. Сходство свойств этого фермента со свойствами внеклеточной эндопептидазы Lysobacter sp. XL 1 и отсутствие его в клетках Lysobacter sp. XL 2, позволяет выдвинуть предположение о том, что данный фермент является препробелком внеклеточной эндопептидазы.

6.9. Заключение.

В настоящей работе было проведено изучение автолитических ферментов грамотрицательной бактерии Lysobacter sp. При этом в клетках Lysobacter sp. XL 1, не секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты, обнаружено 9 автолитических ферментов различной локализации. Шесть из них были выявлены в цитозоле (Ai-A$), один в периплазме (Ag) и два во фракции клеточных стенок и мембран (А9, Аю). В условиях секреции внеклеточных ферментов в клетках Lysobacter sp. XL 1 выявлен дополнительный цитозольный автолитический фермент А7. В клетках Lysobacter sp. XL 2, утративших способность секретировать внеклеточную эндопептидазу JIi, этот дополнительный автолитический фермент не обнаружен.

При переходе культуры от логарифмической к стационарной стадии роста наблюдались изменения в спектре и в уровне активности отдельных автолитических ферментов бактерии. Возможно, это обусловлено тем, что на разных стадиях роста бактериальной клетке необходимы различные автолитические ферменты.

Установлена химическая структура пептидогликана - субстрата автолитических ферментов Lysobacter sp. XL 1. Показано, что пептидогликан бактерии в соответствии с существующей классификацией может быть отнесен к А1у типу, который характерен для большинства изученных грамотрицательных бактерий. Знание структуры пептидогликана Lysobacter sp. XL 1 позволило определить субстратную специфичность у большинства обнаруженных автолитических ферментов бактерии по отношению к связям этого полимера. Оказалось, что ферменты Ai, Ag, Аю - глюкозаминидазы, А4, Ад - мурамидазы, A3, Аб - М-ацетилмурамоил-1^-аланин амидазы и А5, А7 - эндопептидазы. Следует отметить, что среди внеклеточных ферментов не выявлено глюкозаминидаз.

Показано, что свойства наиболее активных автолитических ферментов бактерии (А5 и Аб) значительно отличались от свойств внеклеточных бактериолитических ферментов. Так, эти автолитические ферменты проявляли максимальную активность в широком диапазоне концентраций буфера, при слабо щелочной реакции среды, при невысокой температуре, а также являлись термолабильными белками. Внеклеточные ферменты, в отличие от внутриклеточных ферментов, наоборот проявляли максимальную активность в среде с пониженной ионной силой, при достаточно высокой температуре и являлись термостабильными белками.

Получен очищенный препарат цитозольной эндопептидазы А7, выявленной только в клетках Lysobacter sp. XL 1, секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты. Показано, что этот фермент имеет ряд свойств аналогичных свойствам внеклеточной эндопептидазы JIi. Это и тот факт, "то цитозольная эндопептидаза отсутствует в клетках Lysobacter sp. XL 2, утративших способность секретировать внеклеточную эндопептидазу Ль позволило предположить, что цитозольная эндопептидаза может являться предшественником внеклеточной эндопептидазы.

Интересно, что молекулярная масса цитозольной эндопептидазы А7 (40-45 кДа) почти в 2 раза больше молекулярной массы внеклеточной эндопептидазы Ль Возможно внеклеточная эндопептидаза Лг является продуктом протеолитического расщепления цитозольной эндопептидазы А7.

К настоящему моменту уже известна N-концевая аминокислотная последовательность внеклеточной эндопептидазы Ль Сравнение полученной последовательности с белковыми последовательностями, представленными в базе данных DNASTAR в системе ATLAS (http://vms.mips. biochem. mpg. del mips/programs/atlas, html) показало высокую степень гомологии с N-концевой последовательностью а-литической протеиназы из Lysobacter enzymogenes (ЕС 3.4.21.12). Сравнение аминокислотной последовательности пептидов, полученных из эндопептидазы Лх (в сумме 62 аминокислотных остатка), с аминокислотной последовательностью а-литической протеиназы из Lysobacter enzymogenes (198 аминокислотных остатка) также выявило их большую гомологию (92%) со структурой соответствующих участков аминокислотной последовательности а-литической протеиназы. Это позволило идентифицировать внеклеточную бактериолитическую эндопептидазу JIi бактерии Lysobacter sp. XL1 как а-литическую протеиназу (ЕС 3.4.21.12) (Муранова и др., 2004).

Известно, что внеклеточная а-литическая протеиназа из Lysobacter enzymogenes имеет молекулярную массу 19 кДа и обладает М-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидазной и эндопептидазной активностями. По этим свойствам фермент идентичен эндопептидазе Лг. а-Литическая протеиназа Lysobacter enzymogenes синтезируется в цитозоле клеток бактерии в виде препробелка с молекулярной массой 40 кДа. То есть зрелый белок, также как и в нашем случае, имел молекулярную массу вдвое меньше, чем предшественник. Однако, авторами не было показано, обладал ли цитозольный препробелок ферментативной активностью (Epstein, Wensink, 1997).

Возможно, что цитозольная эндопептидаза А7 является препробелком внеклеточной эндопептидазы Л1 и обладает при этом ферментативной активностью.

Чтобы окончательно выяснить, является ли А7 предшественником внеклеточной эндопептидазы Лг необходимо выделить фермент А7 в электрофоретически гомогенном виде в достаточном для установления аминокислотной последовательности этого белка количестве и сравнить аминокислотные последовательности ферментов А7 и Л]. Однако, это исследование будет являться задачей наших будущих исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ситкин, Борис Викторович, Пущино

1. Бегунова Е.А., Степная О.А., Лысанская В.Я., Кулаев И.С. 2003. Специфичность действия ферментов препарата лизоамидаза на клеточные стенки Staphylococcus aureus 209 Р. Биохимия, 68: 896-901.

2. Бухарин О.Б., Усвяцов. 1981. Лизоцимная активность микроорганизмов. Антибиотики, 10: 782-793.

3. Головина И.Г., Гужова Э.П., Богданова Т.И., Логинова Л.Г. 1972. О литических ферментах, образуемых термофильным актиномицетом Mictomonospora vulgaris DA II-4. Микробиология, 42: 620-624.

4. Головина И.Г. 1973. Литические ферменты микроорганизмов. Успехи микробиологии, 8:108-136.

5. Доссон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонсон К. 1991. Справочник биохимика. Мир, Москва, 544 с.

6. Дэвис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Мир, Москва, 142 с.

7. Егоров Н.С. 1986. Основы учения об антибиотиках. Высшая школа, Москва, 447 с.

8. Захарова И.Я., Павлова И.Н. 1985. Литические ферменты микроорганизмов. Наукова думка, Киев, 216 с.

9. Звягинцева И.С. 1981. Внеклеточные гидролазы грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов. Успехи микробиологии, 16: 81-103.

10. Клесов А.А. 1984. Ферментативный катализ. Изд-во МГУ, Москва, 216 с.

11. Кузнецов В.Д., Гуреева М.Н., Шпокенс А.П., Уискуренас А.П. 1982. Образование литических ферментов актиномицетами. Изв. АН СССР. Биология, 3: 440-443.

12. Кулаев И.С., Северин А.И., Абрамочкин Р.В. 1984. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине. Вестн. АМН СССР, 8: 64-69.

13. Машковский М.Д. 1998. Лекарственные средства. "Торсинг", Харьков, т.2, изд. 13: 117-118.

14. Муранова Т.А., Красовская Л.А., Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С. 2004.

15. Структурные исследования и идентификация внеклеточной бактериолитической эндопептидазы Л1 Lysobacter sp. XL 1. Биохимия, 69: 617-622.

16. Наумова И.Б. 1978. Тейхоевые кислоты в регуляции биохимических процессов у микроорганизмов. Биохимия, 43: 195-207.

17. Наумова А.Б., Шашков А.С. 1997. Анионные полимеры клеточных стенок грамположительных бактерий. Биохимия, 62: 947-982.

18. Остерман Л.А. 1981. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Наука, Москва, 536 с.

19. Полевая Л.К. 1982. Гомология лизоцимов бактериального и животного происхождения. Молекулярная биология, 16:1211-1222.

20. Степная О.А., Северин А.И., Кудрявцева А.И., Крупянко В.И., Козловский А.Г., Кулаев И.С. 1992. Ферменты бактериолитического комплекса лизоамидаза. Некоторые свойства бактериолитической протеиназы Лг. Прикладная биохимия и микробиология, 228: 666-673.

21. Степная О.А., Бегунова Е.А., Цфасман И,М., Кулаев И.С. 1996а. Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза: выделение и некоторые физико-химические свойства внеклеточной мурамидазы бактерии Xanthomonas sp. Биохимия, 61: 648-655.

22. Степная О.А., Цфасман И.М., Ледова Л.А., Петрикевич С.Б., Бегунова Е.А., Кулаев И.С. 1996в. Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза. Очистка и некоторые свойства бактериолитической пептидазы Li. Биохимия, 61: 656-663.

23. Степная О.А., Ледова Л.А., Кулаев И.С. 1999. Бактериолитические ферменты. Успехи биологической химии. 39: 327-354.

24. Стрешинская Г.М., Наумова И.Б., Панина Л.И. 1979. Химический состав клеточной стенки Streptomyces chrysomallus, образующего антибиотик аурантин. Микробиология, 48: 814-819.

25. Цфасман И.М., Степная О.А., Бажанова Н.В., Кулаев И.С. 2000. Внутриклеточная глюкозаминидаза бактерии Xanthomonas campestris ИБФМ В-124: очистка и некоторые свойства. Биохимия, 65:1225-1230.

26. Archibald A.R. 1980. Receptors and recognition. In: Virus receptors, ser. B, 7, (Randall L.L., Philipson L., eds), Chapman and Hall, London: 7-26.

27. Aksnes L., Grov A. 1974. Studies on the bacteriolytic activity of Streptomyces albus culture filtrates. 1. The effect of variations in cultivation conditions and the screening of various enzyme specificities. Acta Chem. Scandinavica, 28:185-192.

28. Archibald A.R., Amstrong J.J., Baddiley J., Hay J.B. 1961. Teichoic acids and the structure of bacterial cell wall. Nature, 191: 570-572.

29. Archibald A.R. 1974. The structure, biosynthesis and function of teichoic acid. Adv. Microb. Physiol., 11:53-59.

30. Archibald A.R., Hancock I.C., Harwood C.R. 1993. Cell wall struchure, synthesis and turnover. In: Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria (Hoch J.A., Losick R., eds), American Society for Microbiology, Washington D.C.: 381-410.

31. Atrih A., Foster S.J. 1999. The roles of peptidoglycan structure and structural dynamics during dormancy and germination. Antonie Leeuwenhoek, 75: 299-307.

32. Atrin A., Bacher G., Allmanier G., Williamson M.F., Foster S.J. 1999. Analysis of peptidoglycan structure from Bacillus subtilis 168 and the role of PBP 5 in its maturation. J. bacterilogy, 181:3956-3968.

33. Baddiley J. 1972. Teichoic acids in cell walls and membranes of bacteria. Essays Biochem., 8: 35-77.

34. Baddiley J., Hancock I.C., Scherwood P.M.A. 1973. X-ray photoelectron studies of magnesium ions bound to the cell walls of gram-positive bacteria. Nature, 243: 43-45.

35. Baddiley J. 1988. The function of teichoic acids in walls and membranes of bacteria. In: The Roots of Mordern Biocemistry (Kleinkauf von Dohren, Jaenicke S., eds.), Walter de Gruyter and C°, Berlin-New York: 223-229.

36. Ballardie F.W., Capon B. 1972. 3,4-Dinitrophenyl tetra-N-acetyl-p-D-chitotetraoside a good chromophoric substrate for hen's egg-white lysozyme. J. Chem. Soc. Commun, 14: 828-829.

37. Benz R. 1994. Uptake of solutes through bacterial outer membranes. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds), Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands: 397-424.

38. Bernadsky G., Beveridge T.J., Clarke A.J. 1994. Analysis of the sodium dodecyl sulfate-stable peptidoglycan autolysins of select gram-negative phatogens by using renaturing polyacrylamide gel electrophoresis. J. Bacteriol., 176:5225-5232.

39. Beveridge T.J. 1981. Ultrastructure chemistry and function of the bacterial wall. Intern. Rev. Cytol., 72: 229-317.

40. Beveridge T J. 1999. Structure of gram-negative cell walss and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol., 181: 4725-4733.

41. Black L.W., Hogness D.S. 1969. The lysozyme of baceriophage lambda. I. Purification and molecular weight. J. Biol. Chem., 244:1968-1975.

42. Blackmail S.A., Smith T.J., Foster S.J. 1998. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology, 144: 73-82.

43. Boland F.M., Atrin A., Chirakkal H., Foster S.J., Moir A. 2000. Complete spore-cortex hydrolysis during germination of Bacillus subtilis 168 requires Sle В and Ype B. Microbiology, 146: 57-64.

44. Braun V., Sieglin U. 1970. The covalent murein-lipoprotein structure of Escherichia coli cell wall. Eur. J. Biochem., 13: 336-346.

45. Braun V., Wu H.C. 1994. Lipoproteins, structure, function, biosynthesis and model to protein export. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds), Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands: 319-342.

46. Briese Т., Hakenbeck R. 1985. Interaction of the pneumococcal amidase with lipoteichoic acid and choline. Eur. J. Biochem., 146: 417-427.

47. Broun W.C., Wilson C.R., Lukehart S. 1976. Analysis of autolysins in temperature-sensitive mutant of Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 125:166-173.

48. Brown W.C. 1973. Rapid methods to extracting autolysins from Bacillus subtilis. Appl. Microbiol., 25: 295-300.

49. Buist G., VenemaG., Kok J. 1998. Autolysis of Lactococcus lactis is influenced by proteolysis. J. Bacteriol., 180: 5947-5953.

50. Burget I.D.J., Murray R.G.E. 1974. Septum formation in Escherichia coli: characterization of septae structure and the effects of antibiotics on cell division. J. Bacteriol., 119: 20522056.

51. Chaloupka J., Kreckova P., Richova L. 1962a. Changes in the character of the cell wall in growth of Bacillus megaterium cultures. Folia Microbiol. (Prague), 7, 269-274.

52. Chaloupka J., Kreckova P., Richova L. 1962b. The mucopeptide turnover in the cell walls of growing cultures of Bacillus megaterium K.M. Experientia, 18: 362-364.

53. Chatterjee A.N., Park J.T. 1964. Biosynthesis of cell wall mucopeptide by a particulate fraction from Staphylococcus aureus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 54: 9-16.

54. Cleveland R.F., Wicken A.J., Daneo-Moore L., Shockman G.D. 1976. Inhibition of wall autolysis in Streptococcus faecalis by lipoteichoic acid and lipids. J. Bacteriol., 126: 192197.

55. Cornett J.B., Johnson C.A., Shockman G.D. 1979. Release of autolytic enzyme from Streptococcus faecalis cell wall by treatment with dilute alcali. J. Bacteriol., 138: 699-704.

56. Costerton J.W., Ingram J.M., Cheng L. 1974. Structural and function of the cell envelope of gram-negative bacteriae. Bacteriol. Rev., 81: 87-110.

57. Coyette J., Shockman G.D. 1973. Some properties of the autolytic N-acetylmuramidase of Lactobacillus acidophilus. J. Bacteriol., 114:34-41.

58. Croux C., Canard В., Goma G., Soucaille P. 1992. Purification and characterization of an extracellular muramidase of Clostridium acetobutylicum ATCC-824 that acts on non-N-acetylated peptidoglycan. Appl. Env. Microbiol., 58:1075-1081.

59. Croux C., Ronda C., Lopez R., Garcia J.L. 1993. Role of the C-terminal domain of the lysozyme of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 in a chimeric pneumococcal-clostridial cell wall lytic enzyme. FEBS, 336:111-114.

60. Croux C., Ronda C., Lopez R., Garcia J.L. 1998. Interchange of functional domains switches enzyme specificity: construction of a chimeric pneumococcal-clostridial cell wall lytic enzyme. Mol. Microbiol., 9:1019-1025.

61. De Boer PA., Cook W.R., Rothfield L.1.1990. Bacterial cell divisioin. Annu. Rev. Genet., 24: 249-274.

62. Duez C., Lakaye В., Houba S., Dusart J., Ghuysen J.M. 1990. Cloning, nucleotide sequence and amplified expression of the gene encoding the extracellular metallo (Zn) DD-peptidase of Streptomyces albus G. FEMS Microbiol. Lett., 59: 215-219.

63. Dijkstra A.J., Keck W. 1996. Peptidoglycan as barrier to transenvelope transport. J. Bacteriol., 178: 5555-5562.

64. Doyle R.J., Koch A.L. 1987. The function of autolysins in the growth and division of Bacillus subtilis. Crit. Rev. Microbiol., 15: 169-222.

65. Doyle R.J., Chaloupka J., Vinter V. 1988. Turnover of cell walls in microorganisms. Microbiol. Rev., 52:554-567.

66. Duong F., Eichler J., Price A., Leonard M.R., Wickner W. 1997. Biogenesis of the Gram-negative bacterial envelope. Cell, 91:567-573.

67. Ehlert K., Holtje J.V., Templin M.F. 1995. Cloning and expression of a murein hydrolase lipoprotein from Escherichia coli. Mol. Microbiol., 16: 761-768.

68. Engel H., Smink A.J., Van Wijngaarden L., Keck W. 1992. Murein-metabolizing enzymes from Escherichia coli: on the existence of a second lytic transglycosylase. J. Bacteriol., 175:120-210.

69. Epstein D.M., Wensink P.C. 1988. The a-lytic protease gene of Lysobacter enzymogenes. J. Biol. Chem., 263:16586-16590.

70. Fan D.P. 1970. Cell wall binding properties of the Bacillus subtilis autolysin(s). J. Bacteriol., 103: 488-493.

71. Fan D.F., Beckman M.M. 1971. Mutant of Bacillus subtilis demonstrating requirement of lysis for growth. J. Bacteriol., 105: 629-636.

72. Fan D.P., Beckman M.M. 1972. New centrifugation technique for isolating enzymes from large cell structure: isolation and characterization of two Bacillus subtilis autolysins. J. Bacteriol., 109:1258-1265.

73. Fan D.P., Beckman M.M. 1973a. Micrococcus lysodeikticus bacterial wall as a substrate specific for the autolytic glycosidase of Bacillus subtilis. J. Bacterid., 114: 804-813.

74. Fan D.P., Beckman B.E. 1973b. Structural difference between walls from hemispherical caps and partial septa of Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 114: 790-797.

75. Fairbanks J., Steck Т., Wallach D. 1971. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry, 10: 2606-2617.

76. Fein J.E., Rogers H.J. 1976. Autolytic enzymes-deficient mutants of Bacillus subtilis 168. J. Bacteriol., 127:1427-1442.

77. Fein J.E. 1979. Possible involvement of bacterial autolytic enzymes in flagellar morphogenesis. J. Bacteriol., 137: 933-946.

78. Fermor T.R., Wood DA. 1981. Degradation of bacteria by Agaricus bisporus and other fungi. J. Gen. Microbiol., 126: 377-388.

79. Fischer W. 1994. Lypoteichoic acids and lipoglycans. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds), Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands: 199-216.

80. Fleming A. 1922. Proc. R. Soc. (London, ser. B), 93: 306-317.

81. Formanek M., Formanek K.S., Wawra H. 1974. A three-dimensional atomic model of the murein layer of bacteria. Eur. J. Biochem., 46: 279-294.

82. Formanek M., Schleifer R.H., Seidle H.P., Lindemann R., Zundel G. 1976. Three-dimensional structure of peptidoglycan of bacterial cell walls: infrared investigation. FEBS Lett., 70:150-154.

83. Formanek M. 1985. Three-dimensional model of the carbohydrate moieties of murein and pseudomurein. Z. Naturforsch, 40:555-561.

84. ForsbergC.W., Rogers H.J. 1974. Characterization of Bacillus licheniformis 6346 mutants with have altered lytic enzymes activities. J. Bacteril., 118: 358-368.

85. Foster S.J. 1992. Analysis of the autolysins of Bacillus subtilis 168 during vegetative growth and differentiation by using renaturing polyacrylamide gel electrophoresis. J. Bacterid., 174: 464-470.

86. Ghuysen J.M., Tipper D.T., Birge C.H., Strominger J.L. 1963. Structure of the cell wall of Staphylococcus aureus strain Copenhagen. Preparetion of fragments of enzymatic hydrolysis. Biochim. Biophys. Acta, 2:1110-1119.

87. Ghuysen J.M., Tipper D.T., Strominger J.L. 1966. Enzymes that degrade bacterial cell wall. In: Methods in Enzymology (Colowick S.P. and Kaplan N.O., eds), Acad. Press, New York, 8: 685-699.

88. Ghuysen J.M. 1968. Use of bacteriolytic enzymes in determination of wall structure and they role in cell metabolism. Вас. Rev., 32:425-464.

89. Ghuysen J.M. 1991. Serine beta-lactamases and penicillin-binding proteins. Annu. Rev. Microbiol., 45: 37-67.

90. Ghuysen J.M., Brasseur J.L., Joris В., Shockman G.D. 1994. Binding site-shaped repeated sequences of bacterial wall peptidoglycan hydrolases. FEBS Lett., 342: 23-28.

91. Glauner В., Holtje J,V., Schwarz U. 1988. Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 263:10088-10095.

92. Gombas D.E., LabbeRG. 1981. Extraction of spore-lytic enzyme from Clostridium perfingens spores. J.Gen. Microbiol., 126: 37-44.

93. Goodell E.W. 1985. Recycling of murein by Escherichia coli. J. Bacteriol., 163: 305-310.

94. Goodwin S.D., Shedlarski J.C. 1975. Purification of cell wall peptidoglycan of dimorphic bacterium Caulobacter crescentus. Arch. Biochem. Biophys, 170: 23-36.

95. Groicher K.H., Firek В .A., Fujimoto D.F., Bayles K.W. 2000. The Staphylococcus aureus lrg AB operon modulates murein hydrolase activity and penicillin tolerance. J. Bacteriol., 2000,182:1794-1801.

96. Hara S., Matsushima I. 1972. Stadies on the substrate specificity of egg white lysozyme. A comparative study of the substrate specificity of lysozyme from different sources. J. Biochem., 72: 993-1000.

97. Hase S., Matsushima I. 1977. The structure of the branching point between acidic polysaccharide and peptidoglycan in Micrococcus lysodeikticus cell wall. J.Biochem., 81: 1181-1186.

98. Hash J.H., Wishnick M., Miller PA. 1964. Formation of «protoplasts» of Staphylococcus aureus with a fungal N-acetylhexosaminidase. J. Bacteriol. 87: 432-437.

99. Haska I. 1972. Purification and properties of lytic enzymes from Myxococcus virescenens. Physiol. Plant, 27:139-142.

100. Heidrich С., Ursinus A., Berger J., Schwarz H., Hcltje J.V. 2002. Effects of multyple deletions of murein hydrolases on viability, septum cleavage and sensitivity to large toxic molecules in Escherichia coli. J. Bacteriol., 184: 6093-6099.

101. Hendersen ТА., Templin M, Young K.D. 1995. Indntification and cloning of the gene encoding penicillin-binding protein 7 of Escherichia coli. J. Bacteriol., 177: 2074-2079.

102. Higgins M.L., Pooley H.M., Shockman G.D. 1970. Site of initiation of cellular autolysis in Streptococcus faecalis as seen by electron microscopy. J. Bacteriol., 103: 504512.

103. Holtje J.V. 1975. Novel type of murein transglycosylase in Escherichia coli. J. Bacteriol., 124:1067-1076.

104. Holtje J.V., Tomasz A. 1975. Lypoteichoic acid: a specific inhibition of autolysin in Pneumococcus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72:1690-1694.

105. Holtje J.V., Glauner B. 1990. Structure and metabolism of the murein sacculus. Res. Microbiol., 141: 75-89.

106. Holtje J.-V., and Tuomanen E.I. 1991. The murein hydrolases of Escherichia coli: properties, function and impact on the course of infection in vivo. J. Gen. Microbiol., 137: 441-454.

107. Holtje J.V. 1995. From growth to autolysis: the murein hydrolases in Escherichia coli. Arch. Microbiol., 164: 243-254.

108. Holtje J.V., 1998. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62:181-203.

109. Honore N., Nicolas M.H., Cole S.T. 1986. Inducible cephalosporinase production in clinical isoletes of Enterobacter cloacae is controlled by a regulatory gene that has been deleted from Escherichia coli. EMBO J., 5:3709-3714.

110. Huang J.Z., Schell MA. 1990. Evidence that extracellular export of the endoglucanase encoded by egl Pseudomonas solanacearum occurs by a two-step process involving a lipoprotein intermediate. J. Biol. Chem., 265: 11628-11632.

111. Huang J.Z., Schell MA. 1992. Role of the two component leader sequence and mature acid sequences in extracellular export of endoglucanase EGL from Pseudomonas solanacearum. J. Bacterid., 174: 1314-1323.

112. Imoto Т., Jonson L.N. North A.C.T., Phillips D.C., Rupley JA. 1972. Vertebrate lysozyme. In: The enzymes (Boyer P.D., ed), New York-London: Acad. Press, 7: 665-868.

113. Irhuma A., Gallagher J., Hackett T.J., McHale A.P. 1991. Studies on N-acetylglucosaminidase activity produced by Streptomyces hydroscopicus. Biochim. Biophys. Acta, 1074:1-5.

114. Ishikawa S., Hara Y., Ohnishi R., Sekiguchi J. 1998. Regulation of a new cell wall hydrolase gene cwlF, which affects cell separation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 180: 2549-2555.

115. Iversen O.J., Grov A. 1973. Studies of lysostaphin. Separation and characterization on three enzymes. Eur. J. Biochem., 38: 293-300.

116. Kamamura Т., Shockman G.D. 1983. Purification and some properties of the endogenous, autolytic N-acetylmuramylhydrolase of Streptococcus faecium, a bacterial glycoenzyme. J. Biol. Chem., 258: 9514-9521.

117. Kariyama R., Shockman G.D. 1992. Extracellular and cellular distribution of muramidase-2 and muramidase-1 of Enterococcus hirae ATCC 9790. J. Bacteriol., 174, 3236-3241.

118. Kato К., Matsubara Т., Mori J., Kotani S. 1960. «Protoplasts» formation in Staphylococcus aureus using the lytic enzyme produced by a Flavobacterium. Biken'S J., 3: 201-203.

119. Kato K., Umemoto Т., Fukuhara H., Sagawa H., Kotani S. 1981. Variation in dibasic amino acid in the wall peptidoglycan of bacteria of genus Fusobacterium. FEMS Microbiol., Lett., 10: 81-85.

120. Kawata S., Takemura Т., Takase Y., Yokogawa K. 1984. Purification and characterization of N-acetyl-muramyl-L-alanine amidase from Streptomyces globisporus 1829. Agr. Biol. Chem., 48: 261-269.

121. Keck W., Van Leeuwen A.M., Leuber M., Goodell E.W. 1990. Cloning and characterization of mep A, the structural gene of the penicillin-insensitive murein hydrolase from Escherichia coli. Mol. Microbiol., 4: 209-219.

122. Kehoe MA. 1994. Cell-wall-associated proteins in Gram-positive bacteria. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell-wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds), Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands: 217-261.

123. Kim S.Y., Ohk S.H., Bai D.H., Yu J.H. 1999. Purification and properties of bacteriolytic enzymes from Bacillus licheniformis YS-1005 against Streptococcus mutants. Bioscience biotechnology and biochemistry, 63: 73-77.

124. Kleppe Y., Jensen H.B., Pryme I.F. 1977. Purification and characterization of the lytic enzyme N-acetylmuramyl-L-alanine amidase of Bacteriophage T-7. Eur. J. Biochem., 76: 317-326.

125. Koch A.L. 1995. Bacterial growth and form. Chapmen and Hall, New York, 385 p.

126. Koch A.L. 2000. The exoskeleton of bacterial cells (the sacculus): still a highly specific target for antibacterial agents that will last for a long time. Crit. Rev. Microbiol., 25: 275307.

127. Kohlrausch U., Holtje J.V. 1991. Murein and murein precursor analysis during antiobiotic-induced lysis of Escherichia coli. J. Bacteriol., 173: 3425-3431.

128. Komatsuzawa H., Sugai M., Nakashima S., Suginaka H. 1995. Alteration of bacteriolytic enzymes profile of Staphylococcus aureus during growth. Microbiol. Immunol., 39: 629-633.

129. Komatsuzawa H., Sugai M., Nakashima S., Yamada A., Matsumoto Т., Oshida Т., Suginaka H. 1997. Subcelullar localization of the major autolysin ATL and its processed proteins in Staphylococcus aureus. Microbiol. Immunol., 41:469-479.

130. Korat В., MotH H., Keck W. 1991. Penicillin-binding protein 4 of Escherichia coli: molecular cloning of the dac В gene, controlled overexpression and alterations in murein composition. Mol. Microbiol., 5: 675-684.

131. Romberg A., Horecker B.L. 1955 Glucose-6-phosphate dehydrogenase. In: Methods in Enzymology (Colowick S.P., Kaplan, N.O., eds), Acad. Press, New York, 2: 323-325.

132. Romberg A. 1955. Lactic dehydrogenes. In: Methods in Enzymology (Colowick S.P., Kaplan, N.O., eds), Acad. Press, New York, 2:441-443.

133. Kulakauskas S., Wikstrom P.M., Berg D.E. 1991. Efficient introduction of cloned mutant alleles into the Esherichia coli chromosome. J. Bacteriol., 173: 2633-2638.

134. Ruroda A., Sekiguchi J. 1990. Cloning, sequencing and genetic mapping of a Bacillus subtilis cell wall hydrolase gene. J. Gen. Microbiol., 136: 2209-2216.

135. Ruroda A., Sekiguchi J. 1991. Molecular cloning and sequencing of a major Bacillus subtilis autolysins gene. J. Bacteriol., 173: 7304-7312.

136. Ruroda A., Sugimoto Y., Funahashi Т., Sekiguchi J. 1992. Genetic structure, isolation and characterization of a Bacillus licheniformis cell wall hydrolases. Mol. Gen. Genet., 234: 129-137.

137. Kuroda A., Sekiguchi J. 1993. High-level transcription of the major Bacillus subtilis autolysin operon depends on expression of the sigma D gene and is affected by a sin (aD) mutation. J. Bacteriol., 175: 795-801.

138. Labischinski H., Maidhof H. 1994. Bacterial peptidoglycan: overview and evolving concepts. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell-wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds), Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands: 23-28.

139. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T-4. Nature, 277: 680-685.

140. Lederer E., Adam A., Ciorbaru R., Petit J.F., Wietzerbin J. 1975. Cell walls of mycobacteria and related organisms: chemistry and immunostimulant properties. Mol. Cell Biochem., 7: 87-104.

141. Leyh-Bouille M., Ghuysen J.M., Tripper D.J., Strominger J.L. 1966. Structure of the cell wall of Micrococcus lysodeikticus I. Study of the structure of the glycan. Biochemistry, 10: 3079-3090.

142. Lindsay В., Glaser L. 1976. Characterization of the N-acetylmuramic acid L-alanine amidase from Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 127: 803-811.

143. Lopez R., Garcia E., Garcia O., Garcia J.P. 1997. The pneumococcal cell wall degrading enzymes: a modular design to create new lysins? Microb. Drug Resist., 2: 199211.

144. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193: 265-275.

145. Makino S., Ito N., Inoue Т., Miyata S., Moriyama R. 1994. A spore-lytic enzyme released from Bacillus cereus spores during germination. Microbiology, 140: 1403-1410.

146. Margot P., Mauel C., Karamata D. 1994. The gene of the N-acetylglucosamidase, a Bacillus subtilis 168 cell wall hydrolase not involved in vegetative cell wall autolysis. Mol. Microbiol., 144:535-545.

147. Margot P., Pagni M., Karamata D. 1999. Bacillus subtilis 168 gene lyt F encodes a y-D-glutamate-meso-diaminopimelate muropeptidase expressed by the alternative gevetative sigma factor, cD. Microbiology, 145: 57-65.

148. Mauk J., Glaser L. 1970. Turnover of the cell wall of Bacillus subtilis W-23 during logariphmic growth. Biochem. Byophys. Res. Communs, 39: 699-706.

149. Mauk K., Chan L., Glaser L. 1971. Turnover of the cell wall of gram-positive bacteria. J. Biol. Chem., 246:1820-1827.

150. McDowell T.D., Lemanski C.L. 1988. Absence of autolytic activity (peptidoglycan nicking) in penicillin-induced nonlytic death in a group a Streptococcus. J. Bacteriol., 170: 1783-1788.

151. McLaughlan A.M., Foster S.J. 1998. Molecular characterization of an autolytic amidase of Listeria monocytogenes. EGD. Micribiol., 144:1359-1367.

152. Mesnage S., Fouet A. 2002. Plasmid-encoded autolysin in Bacillus anthracis: modular structure and catalytic properties. J. Bacteriol., 184: 331-334.

153. Mollner S., Braun V. 1984. Murein hydrolase (N-acetylmuramyl-L-alanine amidase) in human serum. Arch. Microbiol., 140: 171-177.

154. Moreillon P., Markiewicz Z., Nachman S., Tomasz A. 1990. Two bactericidal targets for penicillin in pneumococci: autolysis-dependent and autolysis-independent killin mechanisms. Antimicrob. Agents Chemother., 34:33-39.

155. Morrissey J. 1981. Silver stainig of proteins in polyacrylamide gels: increased sensitivity by a blue toning. Anal. Biochem., 117: 307-310.

156. Munoz E., Ghuysen J.M., Leyh-Bouille M., Petit J.F., Tinelli R. 1966. Structural variation in bacterial ceel wall peptidoglycans studied with Streptomyces F1 endo-N-acetylmuramidase. Biochemistry, 5: 3091-3098.

157. Murao S., Takahara G. 1973. Lytic enzymes for gram-negative bacteria prodused by Bacillus subtilis YT-25. Agr. Biol. Chem., 37: 2671-2673.

158. Naumova I.B. 1988. The teichoic acids of actinomycetes. Microbiol. Sci, 5: 275-279.

159. Navarre W.W., Schneewind O. 1999. Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiology And Molecular Biology Reviews, 63:174-229.

160. Neu H., Heppel LA. 1965. The release of enzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during the formation of spheroplasts. J. Biol. Chem., 240: 3685-3692.

161. Nossal N.G., Heppel LA. 1966. The release of enzymes by osmotic shock from Escherichia coli in exponential phase. J. Biol. Chem., 241: 3055-3062.

162. Ohnishi R., Ishikawa S., Sekiguchi J. 1999. Peptidoglycan hydrolase Lyt F plays a role in cell separation with Cwl F during vegetative growth of Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 181: 3178-3184.

163. Ornstein L., Devis B.J. 1964. Disc electrophoresis. I. Background and theory. Ann. N.Y. Acad. Sci., 121:321-403.

164. Park L.C., Shockman G.D., Higgins M.L. 1980. Growth of Streptococcus mutants protoplast is not inhibited by penicillin. J. Bacteriol., 143:1491-1497.

165. Park J.T. 1995. Why does Escherichia coli recycle its cell wall peptides? Mol. Microbiol., 17: 421-426.

166. Phillips D.C. 1965. The structure and function of lysozyme. Proc. Roy. Inst. Gt. Brit., 40:530 p.

167. Pink D., Moeller J., Quinn В., Jericho M., Beveridge T.J. 2000. On the architecture of the gram-negative bacterial murein sacculus. J. Bacteriol., 182: 5925-5930.

168. Pochlner J., Halter R., Beyreuther K., Meyer T.F. 1987. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease. Nature, 325: 458-462.

169. Pooley H.M. 1976. Turnover and spreading of old wall during surface growth of Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 125:1127-1138.

170. Pooley H., Karamata D. 1984a. Flagellation and the control of autolysisns in Bacillus subtilis. In: Microbial, cell wall synthesis and autilysis (Nombela C., ed.), Elsevier Sciense B.V., Amsterdam, The Netherlands: 13-19.

171. Pooley H., Karamata D. 1984b. Genetic analysis of autol у sin-deficient and agellaless mutants of Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 160:1123-1129.

172. Reevers P. 1994. Biosynthesis and assembly of lipopolysaccharide. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds), Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands: 281-318.

173. Reisfeld RA., Lewis U.J., Williams D.E. 1962. Disk electrophoresis of basic protein and peptides on polyacrylamide gel. Nature, 195: 281.

174. Rhuland L.E., Work E., Denman R.F., Hoare D.S. 1955. The behavior of the isomers of a,£-diaminopimelic acid on paper chromatograms. J. Am. Chem. Soc., 77: 959-966.

175. Robinnson J.M., Hardman J.K., Sloan G.L. 1980. The characteristics of extracellular protein secretion by Staphylococcus staphylolyticus. J. Gen. Microbiol., 118: 529-533.

176. Rogers H.J. 1967. Killing of Staphylococci by penicillins. Nature, 213: 31-33.

177. Rogers H.J., McConnell M., Burdet G.D.J. 1970. The isolation and characterization of mutants of Bacillus licheniformis with disturbed morphology and cell division. J. Gen. Microbiol., 61:155-171.

178. Rogers H.J., Forsberg C.W. 1971. Role of autolysins in killing of bacteria by some bacterial antibiotics. J. Bacteriol., 108:1236-1243.

179. Rogers H.J., Pooley H.M., Thurman P.F., Taylor C. 1974. Wall and membrane growth in Bacilli and their mutants. Ann. Microbiol., 125:135-147.

180. Rogers H.J., Perkins H.R., Ward J.B., 1980. Microbial cell walls and membranes. Chapman and Hall, Ltd., London, United Kingdom, 564 p.

181. Rogers H.J., Taylor C., Rayter S., Ward J.B. 1984. Purification and properties of an autolytic endo-P-glucosaminidase and the N-acetylmuramyl-I^alanine amidase from Bacillus subtilis strain 168. J. Gen. Microbiol., 130: 2395-2402.

182. Salton M.R. 1952. The nature of the cell walls of some Gram-positive and Gram-negative bacteria. Biochim. Biophys. Acta., 9: 334-335.

183. Salton M.R.J. 1957. The properties of lysozyme and its action on microorganisms. Bacterial. Rev. 21: 82-99.

184. Salton M.R.J. 1994. The bacterial cell envelope a historical perspective. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds), Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands: 1-22.

185. Sanz J.M., Diaz E., Garcia J.L. 1992. Studies on the structure and function of the N-terminal domain of the pneumococcal murein hydrolases. Mol. Microbiol., 6: 921-931.

186. Schindler CA., Schuhardt V.T. 1964. Lysostaphin: a new bacteriolytic agent for the staphylococcus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 51: 414-421.

187. Schleifer K.N., Kandler O. 1972. Peptidoglycan types of bacterial cell wallsand their taxonomic implications. Bact. Rev, 36: 407-477.

188. Schleifer K.H., Joseph R. 1973. A directly cross-linked ^ornithine containing peptidoglycan in cell walls of Spirochaeta stenostera. FEBS Lett., 36: 83-86.

189. Schmelzer E., Weckesser J., Warth R., Mayer M. 1982. Peptidoglycan of Rhodopseudomonas viridis: partial lack of N-acetyl substitutionof glucosamine. J. Bacteriol., 88: 815-816.

190. Sekiguchi J., Akeo K., Yamamoto H., Khasov F.K., Alonso J.C., Kuroda A. 1995.

191. Nucleotide sequence and regulation of a new putative cell wall hydrolase gen, cwl D, which affects germination in Bacillus subtilis. J. Bacterilogy, 177:5582-5589.

192. Shockman G.D., Kolb J.J., Toennie S.G. 1958. Relations between bacterial cell wall synthesis, growth phase and autolysis. J. Biol. Chem., 230: 961-977.

193. Shockman G.D., Daneo-Moore L., Cornet J.B., Mychajlonka M. 1979. Does penicillin kill bacteria? Rev. Infect. Dis., 1: 787-796.

194. Shockman G.D. 1992. The autolytic (suicide) system of Enterococcus hirae: from lysine depletion autolysis to biochemical and molecular studies of the two muramidase of Enterococcus hirae ATCC 9790. FEMS Microbiol. Lett., 79: 261-267.

195. Shockman G.D., and Holtje J.-V. 1994. Microbiol peptidoglycan (murein) hydrolases. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial Cell Wall (Ghuysen, J.M., and Hakenbeck, R. eds), Elsevier Sciense B.V., Amsterdam, The Netherlands: 131-165.

196. Shockman G.D., Daneo-Moore L., Karyama R., Massidda O. 1996. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins and autolysis. Microb. Drug Resist., 2: 95-98.

197. Sinha R.K., Rosental R.S. 1980. Release of soluble peptidoglycan from growing gonococci: demonstration of anhydromuramyl-containing fragments. Infect. Immun., 29: 914-925.

198. Sleytr U.B., Messner P., Pim D., Sara M. 1993. Crysrtalline bacterial cell surface layers. J. Bacteriol., 10: 911-916.

199. Sleytr U.B. 1997. Basic and applied S-layer research: an overview. FEMS Microbiol. Rev., 20:5-12.

200. Smith T.J., Blackman SA., Foster S.J. 1996. Peptidoglycan hydrolases of Bacillus subtilis 168. Microb. Drug Resist., 2:113-118.

201. Smith T.J., Blackman SA., Foster S.J. 2000. Autolysins of Bacillus subtilis: multiple enzymes with multiple function. Microbiology, 146: 249-262.

202. Spackman D.H., Stein W.H., Moore S., 1958. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. Anal. Chem., 30:1190-1210.

203. Stevens L. 1996. Egg proteins: what are their functions? 79: 65-87.

204. Strominger J.L., Ghuysen J.M. 1967. Mechanisms of enzymatic bacteriolysis. Science, 156: 213-221.

205. Strominger J.L., Tipper D.J. 1974. Structure of bacterial cell wall: the lysozyme substrate. In: Lysozyme (Osserman E.F.,Canfield R.E., Beychok S. eds), Acad. Press, NewYork-London: 169-184.

206. Szewczyk В., Skorko R. 1983. Purification and some properties of bacteriophage T-4 particle associated lysozyme EC 3.2.1.17. Eur. J. Biochem., 133: 717-722.

207. Sugai M., Akiyama Т., Komatsuzawa H., Miyake Y., Suginaka H. 1990.

208. Characterization of sodium dodecyl sulfate-stable Staphylococcus aureus bacteriolytic enzymes by polyacrylamide gell electrophoresis. J. Bacteriol., 172: 6494-6498.

209. Sutcliffe I.C., Russel R.R. 1995. Lipoprroteins of gram-positive bacteria. J. Bacteriol., 177:1123-1128.

210. Taylor A., Das B.C., Van Heijenoort J. 1975. Bacterial cell wall peptidoglycan fragments produced by phage lambda or Vi II endolysin and containing 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid. J. Biochem., 53: 47-54.

211. Taylor P.W. 1983. Bactericidal and bacteriolytic activity of serum against gram-negative bacteria. Microbiol. Rev.,47: 46-83.

212. Tempest D.W. 1969. In: Microbial Growth (Meadow P.N., Pirt S.J., eds ), 19-th Symposium of the Socierty for Gen. Microbiol., Cambridge University Press, Cambige, UK: 87-111.

213. Tomasz A. 1968. Biological consequences of the replacement of choline by ethanolamine in the cell wall of pneumococcus: chain formation loss of transformability and loss of autolysis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 59: 86-93.

214. Tomasz A., Albino A., Zanati E. 1970. Multiple antibiotic resistence in a bacterium with suppressed autolytic system. Nature, 227:138-140.

215. Tomioko S., Matsuhashi M. 1978. Purification of penicillin-insensitive DD-endopeptidase: a new cell wall peptidoglycan-hydrolysing enzymes in Escherichia coli and it's inhibition by deoxyribonucleic acids. Biochem. Biophys. Res. Commun., 84: 978-984.

216. Tripper D.J., Ghuysen J.M., Strominger J.L. 1965. Structure of the cell wall of Staphylococcus aureus, strain Copenhagen. III. Further studies of the disaccharides. Biochemistry, 4: 468-473.

217. Tsugita A. 1971. Phage lysozyme and other lytic enzymes. In: The enzymes (Boyer P.D., ed), New York-London: Acad. Press, 5: 343-413.

218. Uchido К., Aido К. 1979. Taxonomic significance of cell-wall acyl type in Corynebacterium-Micobacterium-Nocardia group by a glycolate test. J. Gen. Apll. Microbiol., 25:169-183.

219. Umemoto Т., Ota Т., Sagawa H., Kato K., Takasa H., Tsujimoto M., Kawasaki A., Ogawa Т., Harada K., Kotani S. 1981. Chemical and biological properties of a peptidoglycan isolated from Treponema palladium Uasan. Infect. Immun., 31:161-11 A.

220. Ursinus A., Holtje J.V. 1994. Purification and properties of a membrane-bound lytic transglycosylase from Escherichia coli. J. Bacteriol., 176: 338-343.

221. Valence F., Lortal S., 1995. Zymogram and preliminary characterization of Lactobacillus helveticus autolysins. Appl. Environ. Microbiol., 61:3391-3399.

222. Vallinger Z., Ladesic В., Tomasic J. 1982. Partial purification and characterization of N-acetylmuramyl-L-alanine amidase from human and mouse serum. Biochim. Biophis. Acta, 701: 63-71.

223. Vasstrand E.N., Jensen H.B., Miron Т., Hofstad T. 1982. Composition of peptidoglycan in Bacteroidacea: determination and distribution of lanthionine. Infect. Immun., 36:114-122.

224. Wadstrom Т., Hisatsune K. 1970. Bacteriolytic enzymes from Staphylococcus aureus: purification of an endo-p-N-acetylglucosaminidase. Biochem. J., 120: 725-734.

225. Vanderwinkel E., De Vlieghere M., De Tanhoffer L. 1981. Activity of N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase in phospholipid^ environments. Biochim. Biophys. Acta, 663: 46-57.

226. Vanderwinkel E., De Vlieghere M. 1985. Modulate of Escherichia coli N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase activity by phosphatidylglycerol. Biochim. Biophys. Acta, 838: 54-59.

227. Ward J.B. 1981. Teichoic and teichuronic acids: Biosynthesis, assembly and location. Microbiol. Rev., 45: 211-243.

228. Ward J.B., Williamson R. 1984. Bacterial autolysins: specificity and function. In: Microbial, cell wall synthesis and autolysis (Nombela C., ed.), Elsevier Sciense B.V., Amsterdam, The Netherlands: 159-166.

229. White D. 1995. The Physiology and Biochemistry of Prokaryotes. Oxford University Press, N.Y., 378 p.

230. Weibull 1953. The isolation of protoplasts from Bacillus megaterium by controlled treatment with lysozyme. J. Bacteriol., 66: 688-695.

231. Williamson R., Ward J.B. 1981. Deficiency of autolytic activity in Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae is associated with a decreased permeability of the wall. J. Gen. Microbiol., 125: 325-334.

232. Wren B.V. 1991. A family of clostridial and streptococcal ligand-binding proteins with conserved C-terminal repeat sequences. Mol. Microbiol., 5: 797-803.

233. Yem D.W., Wu H.C. 1976. Purification and properties of (3-D-acetylglucosaminides from Escherichia coli. J. Bacteriol., 125:324-331.

234. Yokogawa K., Kawata S., Yoshimura Y. 1973. Lytic enzyme from Streptomyces globisporus 1829. Agr. Biol. Chem., 37: 799-808.

235. Yokogawa K., Kawata S., Takemura Т., Yoshimura Y. 1975. Purification and properties of lytic enzymes from Streptomyces globisporus 1829. Agr. Biol. Chem., 39: 1533-1543.

236. Yoshimoto Т., Tsuru D. 1972. Studies on bacteriolytic Enzymes. II. Purification and someproperties of two types of staphylolytic enzymes from Streptomyces griseus. J. Biochem., 72:379.390.

237. Yoshino S., Ogata S., Hayashida S. 1982. Some properties of autolysins of Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum. Agr. Biol. Chem., 46:1243-1248.

Информация о работе

Ситкин, Борис Викторович
кандидата биологических наук
Пущино, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Локализация и свойства автолитических ферментов Lysobacter sp. - продуцента внеклеточных бактериолитических ферментов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы