Клонирование и экспрессия генов литических эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp. XL1

Лаптева, Юлия Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клонирование и экспрессия генов литических эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp. XL1
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия генов литических эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp. XL1"

На правах рукописи

00505625/

Лаптева Юлия Сергеевна

Клонирование и экспрессия генов литических эндопептидаз ІЛ и Ь5 ЬуяоЬасіег ер. ХЬ1

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012

6 ДЕК 2012

005056257

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Грановский Игорь Эдуардович

ФГБУН ИБФМ РАН

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, Кошелева Ирипа Адольфовна

ФГБУН ИБФМ РАН

кандидат химических наук, Залунин Игорь Арсеньевич

ФГУП «ГосНИИгенетика»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится «/<■? » декабря 2012 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-ый Дорожный пр., д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика» Автореферат разослан «-/б*» ноября 2012 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

Кандидат химических наук, доцент Т.Л. Воюшипа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Литические ферменты представляют собой чрезвычайно разнообразную группу белков, которые осуществляют гидролиз различных структурных компонентов клеточных стенок микроорганизмов, что приводит к их лизису. Бактериолитические ферменты разрушают пептидогликан, главный структурный компонент бактериальной клеточной стенки. В зависимости от того, какой участок пептидогликана они гидролизуют, бактериолитические ферменты разделяются на четыре группы. Глюкозаминидазы и мурамидазы расщепляют различные участки глюкановых цепей пептидогликана, амидазы гидролизуют амидную связь между мурамовой кислотой и пептидной субъединицей, и пептидазы (эндопептидазы) расщепляют пептидные связи в пептидных субъединицах или межпептидных мостиках.

Все живущие в настоящее время организмы — от высших животных и человека до бактерий и вирусов - способны синтезировать бактериолитические ферменты. Лизоцимы слизистых оболочек животных обеспечивают им защиту от проникновения патогенных микроорганизмов. Секретируемые в окружающую среду бактериолитические ферменты микроорганизмов обеспечивают их питанием, источниками энергией, строительным материалом за счет других организмов и собственных отмерших клеток. Бактериолитические ферменты выполняют также регуляторные функции: участвуют в сложных процессах развития микробных клеток и вирусов, в частности, в спорообразовании и фаговой инфекции, соответственно.

Бактериолитические ферменты используются для проведения экспериментов в молекулярной и клеточной биологии: при изучении строения и функционирования бактериальных клеточных стенок, в реакциях протеолиза для изучения структуры белков. Препараты на основе бактериолитических ферментов применяются для борьбы с антибиотико-устойчивыми патогенными микроорганизмами: ахромопептидаза из Achromobacter lyticus, лизостафин из Staphylococcus simulans, лизобакт, ларипронт и яичный лизоцим.

Бактерии рода Lysobacter представляют интерес для прикладной и фундаментальной науки и интенсивно изучаются уже с 1970-х гг, поскольку синтезируют различные литические ферменты. Антимикробный препарат лизоамидаза, получаемый на основе культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1, активен против бактерий родов Staphylococcus, Bacillus, Streptococcus, Corynebacterium, Streptomyces и др., дрожжей, например, родов Saccharomyces и Candida. Показано, что антимикробное действие препарата обеспечивают пять бактериолитических ферментов и дрожжелитическая металлопротеаза. Бактериолитические ферменты лизоамидазы представлены тремя эндопептидазами LI, L4 и L5, а также N-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидазой L2 и мурамидазой L3. В настоящее время все они выделены из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1 и в различной степени охарактеризованы.

По данным ингибиторного анализа эндопептидазы LI, L4 и L5 отнесены к семейству сериновых протеаз. По отношению к бактериальным пептидогликанам эндопептидаза L1 (-22 кДа) проявляет амидазную и

эндопептидазную активности (гидролизует амидную связь между мурамовой кислотой и аланином, пептидные связи между диаминопимелиновой кислотой и аланином, а также между глицинами межпептидного мостика). Наиболее выражена у LI именно эндопептидазная активность.

Эндопептидаза L5 (-26 кДа) содержится в культуральной среде в существенно меньших количествах, чем LI, и ее ферментативные свойства мало изучены. В отличие от LI, эндопептидаза L5 обладает только эндопептидазной активностью.

Эндопептидазы LI и L5 являются термостабильными ферментами с оптимумом реакции 70 и 80 °С, соответственно. Они проявляют различный спектр антимикробной активности. Так, например, клетки Bacillus subtilis и Micrococcus luteus разрушают оба фермента. В тоже время, только эндопептидаза LI способна разрушать живые клетки Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis, а эндопептидаза L5, в отличие от LI, способна разрушать живые клетки Kocuria rosea, Corynebacterium flavum, Alcaligenesfaecalis.

К началу данной работы информация о структуре генов литических ферментов Lysobacter sp. XL1 отсутствовала. Поэтому, актуальным для дальнейших научных исследований и прикладных разработок являлось их идентификация и характеристика.

Цель исследования. Цель данной работы заключалась в клонировании и определении нуклеотидной последовательности генов бактериолитических эндопептидаз LI и L5 Lysobacter sp.XLl и создании штаммов-продуцентов этих ферментов на основе бактерий рода Pseudomonas. Задачи исследования:

1. Клонировать гены бактериолитических эндопептидаз LI и L5 Lysobacter sp.XLl и определить их нуклеотидную последовательность;

2. Проанализировать экспрессию генов эндопептидаз LI и L5 на уровне транскрипции в Lysobacter sp. XL1;

3. Сконструировать систему экспрессии генов эндопептидаз LI и L5 Lysobacter sp. XL1 в бактериях рода Pseudomonas и проанализировать её эффективность.

Научная новизна работы. В данной работе определена нуклеотидная последовательность фрагмента хромосомы ДНК Lysobacter sp. XL1 размером 9017 п.н., в котором локализованы гены эндопептидаз LI и L5 (alpA и alpB, соответственно).

На основании анализа выведенных аминокислотных последовательностей определены структурные особенности эндопептидаз LI и L5. В частности показано, что они синтезируются в виде препробелков: на N-конце расположен сигнальный пептид, за ним следует про-часть и затем зрелый фермент. Установлено, что эндопептидазы LI и L5 являются близкими по размеру гомологичными белками, последовательности их препробелков идентичны на 62%. По результатам проведенного филогенетического анализа эндопептидазы LI и L5 были отнесены к подсемейству SIE семейства S1 клана РА сериновых пептидаз.

В данной работе впервые проведен анализ экспрессии генов эндопептидаз LI и L5. Установлено, что данные гены транскрибируются индивидуально,

каждый с собственного промотора, а транскрипты обнаруживаются на поздней экспоненциальной стадии роста. Определены размеры 5'- нетранслируемых областей мРНК alpA и alpB. На основании анализа нуклеотидной последовательности предсказаны промоторные области генов alpA и alpB, а также наличие Rho-независимых терминаторов транскрипции.

Впервые сконструирована система экспрессии секретируемых бактериолитических эндопептидаз на основе P. fluorescens. Полученные рекомбинантные штаммы-продуценты эффективно секретируют активные эндопептидазы LI и L5 в культуральную жидкость.

Научно-практическое значение работы. Полученные в данной работе результаты имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. Рекомбинантные эндопептидазы могут быть использованы в молекулярной и клеточной биологии для разрушения клеток различных микроорганизмов и определения структурных компонентов их клеточных стенок. Кроме этого, в медицине и фармакологии эндопептидазы, как по отдельности, так и в комбинации друг с другом, или другими литическими ферментами, могут быть использованы для создания антимикробных препаратов.

Результаты данного исследования открывают возможности дальнейшего изучения механизмов регуляции экспрессии генов бактериолитических эндопептидаз Lysobacter sp. XL1.

Сконструированная на основе бактерий рода Pseudomonas система экспрессии может быть использована для наработки в псевдомонадах рекомбинантных белков, продукция которых в других продуцентах затруднена вследствие их токсичности, нерастворимости и низкого уровня экспрессии.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, декабрь 2005), на 10-, 11- и 12-ой Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2006, 2007, 2008), на международной конференции «Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting» (Madison, 2007), на IV-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, июнь 2009), на международном конгрессе и выставке по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010», на Всероссийский симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011).

Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре лабораторий молекулярной микробиологии, биологии плазмид и биохимии клеточной поверхности микроорганизмов ФГБУН Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе две статьи и два патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, приложение и список цитируемой литературы. Работа изложена на /.3.3 страницах машинописного текста и содержит Ъ5_ рисунков и таблиц. Список цитируемой литературы содержит ,2/}источников, в том числе JT на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Поиск и определение нуклеотидной последовательности генов эндопептидаз L1 и L5.

Для идентификации фрагмента генома Lysobacter sp. XL1, кодирующего гена эндопептидазы L1, были использованы данные о нуклеотидной последовательности участка гена эндопептидазы LI Lysobacter sp. XL1 размером 426 п.н. (Золова О.Э., личное сообщение). Данный фрагмент нарабатывали при помощи ПЦР и использовали в качестве зонда для идентификации рестрикционных фрагментов геномной ДНК, содержащих ген эндопептидазы L1 методом ДНК-ДНК гибридизации (Рис. 1).

T.II.H.

Рисунок 1. Гибридизация по Саузерну рестрикционных фрагментов геномной ДНК Lysobacter species XL1 с ДНК-зондом к — ~5>7 последовательности гена, кодирующего зрелую _/~3,2 часть эндопептидазы L1. Цифрами отмечены —эндонуклеазы рестрикции £coRI (1), НтбШ (2), ' Xbal (3), Xhol (4), ВатШ (5), SaR (6). Справа указаны размеры фрагментов в тыс. пар нуклеотидов.

По результатам гибридизации были отобраны ЕсоШ и ЛгЛ-фрагменты геномной ДНК ¿^оАас/ег Бр. ХЬ1. Для их наработки был применен подход инвертированной ПЦР и была установлена их нуклеотидная последовательность. Компьютерный анализ контига позволил идентифицировать две протяженные ОРС размером 1197 и 1200 п.н., обозначенные нами как а1рА и а1рВ, соответственно (Рис. 2). ОРС а!рА кодирует литическую эндопептидазу Ы, а продукт ОРС а1рВ проявляет высокую степень гомологии с А1рА (см. ниже). Анализ показал, что предполагаемый белок А1рВ содержит аминокислотную последовательность, соответствующую экспериментально установленной последовательности № концевого пептида зрелой части фермента Ь5 Ьу5оЬас1ег Бр. ХЬ1 (ишРгоЖВ асс.# Р85158). Поскольку ОРС эндопептидаз Ы и Ь5 расположены рядом, было сделано предположение, что в геноме Ьу5оЪаМег Бр. Х1Л гены литических ферментов формируют единый кластер. Поэтому, были определены последовательности участков генома, фланкирующих ОРС а1рА и а1рВ. Для этого была получена мини-библиотека геномной ДНК ¿^обяс/ег ер. ХЬ1, при помощи гибридизации отобраны клоны, содержащие интересующие участки генома, и определена их нуклеотидная последовательность. В результате был составлен контиг размером 9017 п.н. в котором на расстоянии 2,4 т.п.н. выше а1рА и 3,6 т.п.н. ниже а1рВ генов других литических ферментов обнаружено не было (Рис. 2, ОепВапк асс.# ОШ88567). На правом фланге секвенированного фрагмента была идентифицирована ОРС, обозначенная ог/А, имеющая противоположную ориентацию по отношению к а1рА и а1рВ. Анализ базы

данных Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk, Finn et al., 2010) показал, что белок OrfA длиной 600 а.о. предположительно относится к семейству АВС-транспортеров и содержит характерные для этих белков TMD (от англ., transmembrane domain, pf00664) и ABC (от англ., ATP binding cassette, pf00005) домены.

EcoRI Sail

-1

1 Т.П.Н.

9017 П.Н.

Рисунок 2. Структура кластера генов alpA, alpB и orfA Lysobacter sp. XL1 (№ GU188567, GenBank). Серыми стрелками отмечено расположение и направление ОРС. Р1 и Р2 - промоторы генов alpA и alpB, соответственно. Над картой указано положение сайтов эндонуклеаз рестрикции.

AlpA и AlpB являются секретируемыми литическими протеазами.

Поскольку секретируемые протеазы микроорганизмов синтезируются, как правило, в виде неактивных предшественников (препроферментов), был проведен анализ аминокислотных последовательностей белков AlpA и AlpB с целью идентификации участков сигнальных пептидов, границ про-частей и зрелых ферментов. С использованием он-лайн сервиса SignalP 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) был проведен поиск сигнальных пептидов. Согласно предсказанию, положение сайтов процессинга с вероятностью 1,000 находится между 33 и 34 а.о. для AlpA и между 28 и 29 а.о. для AlpB. Границы и длину про-частей и зрелых ферментов рассчитывали на основании экспериментально установленных N-концевых пептидов зрелых ферментов L1 и L5. На основании анализа установлено, что сайт процессинга пробелка находится между 199 и 200 а.о. для AlpA, и 194 и 195 а.о. для AlpB. Суммируя данные анализа аминокислотных последовательностей можно заключить, что эндопептидазы AlpA и AlpB имеют традиционную для секретируемых протеаз микроорганизмов и синтезируются в виде препробелков, созревание которых происходит в процессе секреции (Рис. 4).

С целью установления родства белков AlpA и AlpB был проведен поиск гомологичных белковых последовательностей в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) с помощью программы BLAST.

Аминокислотные последовательности, соответствующие зрелым частям белков, выравнивали между собой с помощью программы CLUSTAL X. Построение дерева производили с помощью пакета программ TREECON с использованием метода «объединения соседних пар» (neighbor-joining).

Статистическая достоверность ветвления оценивалась с помощью бутстреп-анализа 1000 альтернативных деревьев, используя соответствующую

Xho I JJcoRI ffmdIII Sail

ЕсоЮ Sail Xhol

функцию программы TREECON. Эволюционное расстояние выражено как число замен на 100 аминокислот.

Филогенетический анализ последовательностей зрелых ферментов AlpA и AlpB показал их родство с белками клана РА, класса S сериновых пептидаз, семейства S1, подсемейства SIE, типовым ферментом которого является химотрипсин А (Рис.3).

Наибольшую гомологию последовательности AlpA и AlpB проявляют с а-литической протеазой (а-ЛП) L. enzymogenes: предшественник этого фермента идентичен на 78% и 58% с предшественниками AlpA и AlpB, соответственно.

На основании выравнивания последовательностей белков а-ЛП, AlpA и AlpB (Рис. 4) было выявлено наличие у последних каталитической триады His (Н235 для AlpA, Н234 для AlpB), Asp (D262 для AlpA, D261 для AlpB), Ser (S343 для AlpA и AlpB), порядок расположения аминокислотных остатков в которой характерен для сериновых протеаз клана РА. Окружение остатка серина активного центра (-Asp-Ser-Gly-Gly-) характерно для всего семейства химотрипсина класса сериновых протеаз. Что позволяет отнести белки AlpA и AlpB, как и а-литическую протеазу L. enzymogenes, к этому семейству.

lytic endopeptidaseA(D2K8B3) alpha-lytlc endopeptldase (P00778) lytic endopeptldase В (D2K8B4) streptogrlsln С (P52320)

yeast-lytic peptidase (Q05308) SFase-2 endopeptldase (P411J0) streptogrlsln E(Q03424) streptogrlsln E (Q07006)

protease IV (Q9HWK6) lysyl peptidase (P15636) EspC peptidase (Q9EZE7) SepA peptidase (Q8VSL2)

IgAI-spediic serine peptidase (CAA00270)_

glutamyl peptidase 1 (P0C1U8)

SplA serine protease (Q9FD08)

- papain (P00784)

PA SIE

PA SID PAS6

PA SIB CA CIA

Рисунок 3. Дендрограмма родства сериновых протеаз, построенная на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей зрелых ферментов.

На рисунке указаны номера последовательностей в базе данных UniProt. Представлены ферменты из следующих организмов: Р00778 - Lysobacter enzymogenes, D2K8B3 и D2K8B4 - Lysobacter sp. XL1, P52320 и Q07006 - Streptomyces griseus, Q03424 и P41140 -Streptomyces fradiae, Q05308 - Rarobacter faecitabidus, P0C1U8 и Q9FD08 -Staphylococcus aureus, P15636 - Achromobacter lyticus, Q9HWK6 - Pseudomonas aeruginosa PAOl, Q8VSL2 - Shigella flexneri, CAA00270 (номер последовательности в базе данных GenBank) - Neisseria gonorrhoea, Q9EZE7 - Escherichia coli, P00784 - Carica papaya. В качестве корневого вида выбран папаин. В правой части рисунка указаны кланы (РА и CA) и семейства (SIE, SIB, SID, S6 и CIA) протеаз в соответствии с базой данных пептидаз MEROPS (Rawlings et al., 2010, http://merops.sanger.ac.uk/).

(1)

АІрА (1) АІрВ (1) Р00778 (1)

(91) 91_

-> сигнальным пептид

10_20 .30

ШіЩСЕАВ&ЗУРСЛ?,

¡квніа----

ЯНЕДЮШУЗУЗСІ/ 100

Аїр А (91) АІрВ (86) Р00778 (91)

(181) 181 Аїр А( 181) АІрВ( 176) Р00778(181)

(271) 271 АІрА(267) ЦІ АІрВ(26б) Р00778(267)

(361) 361 АІрА(356) АІрВ(35б) Р00778(355)

110

120

130

140

150

,160

170

180

Рисунок 4. Выравнивание аминокислотных последовательностей эндопептидаз АІрА и АІрВ ЬуяоЬааег. ер. ХІЛ и а-литической протеазы епіутозепея. Крупными стрелками отмечены участки сигнального пептида, про-областии и зрелого фермента. Рамками выделены аминокислотные остатки каталитической триады Нів-Азр-Зег. Маленькими стрелками указаны остатки метионинов субстрат-связывающего кармана. Горизонтальной линией отмечены остатка поверхностной петли._

Хорошо изученная а-ЛП L. enzymogenes специфична к пептидным субстратам с небольшими гидрофобными боковыми цепями перед расщепляемой связью. Ключевыми аминокислотными остатками, определяющими субстратную специфичность а-ЛП, являются Met в положениях 343 и 363, которые выстилают полость субстрат-связывающего кармана, а также большинство остатков поверхностной петли, примыкающей к карману - это а.о. в положениях с Asn367 по Ser385 (Рис.4). Замена этих остатков на Ala и некоторые другие аминокислотные остатки значительно расширяла ее субстратную специфичность и приводила к тому, что а-ЛП расщепляла пептиды с большими гидрофобными боковыми цепями пред расщепляемой связью: Met, Phe, Leu, Val, Туг и Тф. Субстратная специфичность LI и L5 практически не изучена. Из результатов выравнивания аминокислотных последовательностей этих ферментов и а-ЛП видно, что аминокислотные остатки в последовательности AlpA и а-ЛП в этих положениях идентичны, тогда как у AlpB значительно различаются. У AlpB Met в положениях 343 и 363 замещены Thr, а также имеются замены в 11-ти из 19-ти положений последовательности поверхностной петли. Ряд аминокислотных остатков в этой области у AlpB соответствует аминокислотным остаткам у исследованных мутантных форм а-ЛП. На основании этого мы предполагаем, что фермент AlpB будет более активен на пептидных субстратах, содержащих остатки с большими гидрофобными боковыми цепями перед расщепляемой связью. Очевидно, что субстратная специфичность AlpA и а-ЛП сходная, тогда как у AlpB значительно отличается. Различный спектр антимикробной активности AlpA и AlpB свидетельствует в пользу этого предположения.

Гены alpA и alpB кодируют функционально активные бактериолитические ферменты.

Для проверки того, что идентифицированные гены alpA и alpB кодируют функционально активные бактериолитические ферменты, они были индивидуально клонированы в плазмидном векторе рЕТ-29а под контролем промотора Т71ас и экспрессированы в Е. coli. Клетки E.coli BL21(DE3) трансформировали соответствующими плазмидами и выращивали в присутствии индуктора (ИПТГ) на агаризованной среде, содержащей разрушенные клетки золотистого стафилококка (S. aureus 209-Р). О наличии литической активности судили по появлению зон лизиса вокруг растущих колоний. Как видно из результатов анализа (Рис. 5) литическая активность наблюдалась только вокруг колоний клеток Е. coli, экспрессирующих гены alpA и alpB, в то время как у контрольных клеток, трансформированных вектором рЕТ-29а, она отсутствовала. Стоит отметить, что продукты генов alpA и alpB оказались токсичными для клеток Е. coli. Это проявлялось в существенном замедлении скорости их роста на минимальной среде Дэвиса в присутствии индуктора. Очевидно, что пептидогликан бактерии S. aureus 209-Р чувствителен к действию эндопептидаз AlpA и AlpB.

На основании проведенного анализа можно сделать вывод о том, что гены а!рА и а1рВ действительно кодируют секретируемые бактериолитические эндопептидазы Ы и Ь5 Ъу$оЪас1ег эр. ХЫ.

Рисунок 5. Экспрессия генов литических эндопептидаз AIpA и AlpB Lysobacter sp. XL1 в E. coli. Представлен тест на наличие бактериолитической активности по отношению к клеточным стенкам S. aureus. Клетки Е. coli BL21(DE3) (3), трансформированные плазмидами с геном alpA (1, 2) или alpB (4-6), выращивали на агаризованной среде, содержащей клеточные стенки Staphylococcus aureus 209-Р. Лизис клеточных стенок S. aureus проявляется в виде зон просветления вокруг колоний.

ОРС а1рА и а1рВ транскрибируются с собственных промоторов.

ЬувоЬааег ер. ХЫ продуцирует в культуральную жидкость в ~ 10-20 раз больше эндопептидазы А1рА, чем А1рВ. Для того чтобы объяснить различие в уровне продукции этих эндопептидаз, был проведен анализ сигналов трансляции и транскрипции для этих ОРС.

При анализе нуклеотидных последовательностей выше ОРС а1рА и а1рВ было установлено, что на расстоянии 8 н.о. для а!рА и 7 н.о. для а1рВ перед инициирующим АТв-кодоном находится последовательность Шайна -Дальгарно. Для обеих ОРС она представляет собой полипуриновую последовательность АООАО, которая комплементарна 3'-концевой области последовательности генов 16Э рРНК различных видов ЬуяоЬааег, представленных в базе данных вепБапк (Рис. 6А). Наличие на каноническом расстоянии от инициирующего кодона последовательности Шайна-Дальгарно, а также отсутствие в этой области структур типа «стебель - петля» (данные не приведены) не позволяет предположить существенную разницу в эффективности инициации трансляции мРНК а1рА и а1рВ.

Был проведен анализ нуклеотидных последовательностей, расположенных за стоп-кодоном ОРС а1рА и а!рВ, который позволил идентифицировать потенциальные терминаторы транскрипции (Рис. 6Б).

Так, на расстоянии 26 н.о. от стоп-кодона ОРС а!рА располагается 29-членная палиндромная последовательность, способная образовывать богатую парами С/С структуру типа «шпильки» из 12 п.н. (75%) и 5 неспаренными основаниями на вершине. Столь высокое содержание О/С пар обычно характерно для Юго-независимых терминаторов транскрипции. На расстоянии 27 н.о. от стоп-кодона ОРС а1рВ также находится 24-членная палиндромная последовательность, формирующая структуру типа «стебель-петля» из 20 спаренных (80% О/С) и 4 неспаренных оснований. Непосредственно за шпилькой следует олиго(и)-участок.

(i)

(2)

16S 3'-UUCCUCCACUAGGU..> -5'

(1) .....

alpA S ' -CASGAGUUCaUCGCAOC -3'

16S 3'-UUCCUCCACUAGGU...-5' (2) 11 I I I

v alpB 5 '-CAGGAGUUCUUACAPS -3'

С - G

s - С

С - G

A - U

С - G

do = - 24,6 ккал/моль

С - G G - С

dG=-21,6 ккал/моль

5' - CCA - CCGUU

ACGA - UUUU - 3'

Рисунок 6. Анализ трансляционных и транскрипционных сигналов для alpA (1) и alpB (2) Lysobacter sp XL1. А. Приведены фрагменты последовательностей 5'-нетранслируемых областей мРНК генов alpA (2391 - 2407 н.о.) и alpB (4190 - 4205 и.о.), а также З'-концевого участка 16S рРНК Lysobacter sp. Shinshu-th3 (1530 - 1543 и.о., GenBank № АВ121774). Предполагаемый сайт связывания с рибосомой в мРНК alpA и alpB выделен жирным шрифтом и подчеркнут. Инициаторный кодон выделен жирным шрифтом, курсивом и подчеркнут. Б. Приведены фрагменты последовательностей З'-нетранслируемых областей мРНК генов alpA (3628 - 3656 н.о.) и alpB (5430 - 5453 н.о.), способные формировать структуры типа «стебель -петля». Анализ последовательностей проводили при помощи программы UNAFold flittp://mfold.rna.albanv.edii/). Справа указана свободная энергия шпильки в ккал/моль. Положения сайтов связывания рибосом и структур типа «стебель - петля» приведены в соответствии с последовательностью № GUI88567 (GenBank).

Наличие потенциальных терминаторов транскрипции, а также удаленность ОРС а!рА и а1рВ друг от друга на 602 н.о. позволяют предположить, что каждый из генов имеет собственный промотор. Для проверки этого предположения была проведена гибридизация по Нозерну тотальной РНК Lysobacter эр. ХЬ1 с ДНК-зондами, специфичными к ОРС а1рА или а1рВ (Рис. 7). Как видно из результатов гибридизации, в клетках Lysobacter Бр. ХЬ1 обнаруживаются транскрипты размером около 1,5 т.н.о., содержащие ОРС а1рА или а!рВ. Транскриптов большего размера, которые бы могли потенциально содержать обе ОРС, обнаружено не было. Вследствие чего можно сделать вывод, что мРНК а1рА или а1рВ являются моноцистронными, гены а1рА или а1рВ не организованны в оперон, а транскрибируются каждый с собственного промотора.

Кроме того, мРНК а!рА обнаруживается в середине экспоненциальной фазы роста и ее уровень значительно увеличивается к концу экспоненциальной - началу стационарной фазы роста. При этом, количество мРНК а1рВ существенно ниже (примерно на порядок), чем а!рА, и транскрипт детектируется лишь в конце экспоненциальной фазы роста. Вероятно, ген а1рА находится под контролем более сильного промотора, чем а1рВ.

Рисунок 7. Анализ экспрессии генов alpA и alpB на уровне транскрипции. Тотальную РНК клеток Lysobacter sp. XL I, находящихся в середине (1) или конце логарифмической (2) фазы роста, гибридизовали с 32Р-меченным ДНК-зондом к гену alp А или alpB.

С целью предсказания промоторов мы определили стартовую точку транкрипции для генов alpA и alpB. С использованием метода 5'-RACE (от англ. Rapid Amplification of cDNA Ends) были определены 5'-концы мРНК alpA и alpB. Результаты анализа и секвенирования клонов кДНК представлены в таблице 1). Для 8 из 11 клонов в случае alpA и 7 из 9 клонов alpB положение стартовых точек транскрипции совпадало. 3 клона кДНК alpA и 2 клона кДНК alpB соответствовали более короткому 5'-UTR. Предположительно, это могло быть обусловлено преждевременной терминацией синтеза кДНК, или частичной деградацией мРНК с 5'-конца. Таким образом, как следует из представленных данных, длина 5-нетранслируемой области мРНК а/рА составляет 134 и.о., а мРНК alpB имеет длину 140 и.о. Для обеих мРНК 5'-концевым нуклеотидным остатком является G.

Таблица 1. Данные по определению стартовых точек транскрипции для генов alp А и alpB Lysobacter sp. XL1 методом 5'-RACE.

ген положение стартовой точки длина 5'-UTR количество

транскрипции по № GU188567 (н.о.) клонов

2271 134 8

alpA 2275 130 1

2276 129 1

2287 118 1

alpB 4063 140 7

4092 111 1

4111 92 1

Транскрипция у бактерий рода Lysobacter практически не исследовалась, и данные по консервативным элементам промоторов этих бактерий, а также о структуре РНК-полимеразы отсутствуют. На каноническом расстоянии - 35 и -10 от стартовой точки транскрипции генов alpA и alpB мы идентифицировали предполагаемые промоторы и сравнили их соответствующими консенсусами для а70-промотора Е. coli (рис. 8). В случае alpA обнаружено совпадение 3 из б н.о. с консенсусом Е. coli в области - 35 и 2 - в области - 10. В случае alpB в области - 35 5 из 6 н.о. соответствуют консенсусу Е. coli, в области - 10 так же совпадают только 2 н.о.

-35 -10 +1

alpA GACCTTGÇGÇATAAAGCGCACATC-TTTTTAGCTGGAACGGCC

*** * *

E. coli NNNNTTGAÇA-------N;',------TATAATNNNNNN

+** ** * *

alpB TGCCTTGCCAATCCCGATGGCATCGTCTTTATCTGTTTGCGTC

Рнсунок 8. Анализ областей - 35 и - 10 генов alpA и alpB в сравнении с соответствующими консенсусами для о70-промотора E. coll. Области консенсусов выделены жирным шрифтом и подчёркнуты. Стартовая точка транскрипции (+1) выделена жирным шрифтом. Звездочками отмечены совпадающие нуклеотидные остатки.

Результаты анализа, тем не менее, не позволяют делать выводы о силе промоторов этих генов. Несмотря на эволюционную консервативность а , очевидно, что последовательности промоторов бактерий рода Lysobacter в областях -35 и -10 могут существенно отличаться от консенсусов а -промотора Е. coli. В частности, для Xanthomonas campestris, которая, как и Lysobacter sp. XL1, относится к семейству Xanlhomonadaceae, анализ частоты встречаемости потенциально сильных промоторов генов, проведённый на основе а -консенсусов Е. coli, показал, что такие промоторы в геноме практически отсутствуют. Кроме того, активность промоторов генов alpA и alpB может регулироваться транскрипционными факторами, либо зависеть от альтернативных ст-факторов. В пользу этого свидетельствует существенное увеличение количества мРНК alpA и alpB в клетках на поздней экспоненциальной стадии роста. Вовлечение транскрипционных факторов в регуляцию экспрессии литических ферментов было показано для Lysobacter enzymogenes штамма СЗ. В этом штамме продукция литических ферментов регулируется продуктом гена clp, принадлежащего к CRP-семейству глобальных регуляторов.

Таким образом, различие в уровне продукции белков LI и L5 Lysobacter sp. XL1 обусловлено различным содержанием в клетках мРНК генов alpA и alpB. Последнее может быть вызвано, как различной силой промоторов генов alpA и alpB, либо альтернативной регуляцией любого из них, либо различной стабильностью их мРНК.

Локализация генов эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1.

Для штамма Lysobacter sp. XL1 была отмечена нестабильность в продукции ряда литических ферментов, в частности эндопептидаз LI и L5. При условии локализации генов данных ферментов на плазмиде, феномен можно было бы объяснить утратой частью клеток популяции плазмидной ДНК. Был проведен анализ штамма Lysobacter sp. XL1 на наличие в нем плазмид с использованием электрофореза в пульсирующих полях, а также выделением плазмидной ДНК методом щелочного лизиса. В результате анализа было показано отсутствие в клетках Lysobacter sp. XL1 плазмид. На основании этого можно сделать вывод о том, что гены alpA и alpB имеют хромосомную локализацию.

Продукция рекомбинантных эндопептидаз AIpA и AlpB в клетках бактерий рода Pseudomonas. Продукция эндопептидаз LI и L5 природным штаммом Lysobacter sp. XL1 невысока (около 0,5-1,0 и 0,05 мг/л культуральной жидкости, соответственно), а очистка белков затруднена в следствие того, что они обладают близкими физико-химическими свойствами. В связи с этим, актуальным является использование гетерологичных систем экспрессии для продукции данных ферментов. Ранее нами была проведена работа по созданию штаммов-продуцентов бактериолитических эндопептидаз AlpA и AlpB на основе E.coli (неопубликованные данные). Для этого был протестирован целый ряд штаммов Е. coli, систем и условий экспрессии. Тем не менее, добиться удовлетворительного выхода ферментов, секретируемых из клетки естественным путем, нам не удалось. Культивирование в условиях экспрессии сопровождалось лизисом клеток-продуцентов и освобождением ферментов в культуральную среду. По-видимому, причиной этого являлось накопление активных ферментов AlpA и AlpB в периплазматическом пространстве клеток, что приводило к деградации пептидогликана. Перечисленное выше делает невозможным использование Е. coli для наработки препаративных количеств рекомбинантных белков AlpA и AlpB. Поэтому на следующем этапе работы была поставлена задача поиска альтернативного продуцента бактериолитических эндопептидаз AlpA и AlpB.

В качестве альтернативного продуцента литических ферментов Lysobacter были выбраны бактерии рода Pseudomonas. Оба этих рода достаточно близки. Кроме того, из литературы известно, что бактерии рода Pseudomonas, так же как и Lysobacter, секретируют в окружающую среду широкий спектр белков, в том числе и протеаз, в частности эластазу, которая синтезируется в виде препрофермента. Кроме того, в последнее время псевдомонады успешно используются в качестве альтернативы Е. coli для наработки рекомбинантных белков. Поэтому следующий этап работы заключался в разработке системы экспрессии генов эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1 на основе бактерий рода Pseudomonas.

Конструирование системы экспрессии генов alpA и alpB на основе бактерий рода Pseudomonas. В данной работе в качестве потенциальных штаммов-продуцентов литических эндопептидаз AlpA и AlpB первоначально рассматривались 8 различных штаммов псевдомонад: 7 штаммов P.ßuorescens -М4-80, 2-7q, Pf-5, Q2-87, Q8rl-q6, 38a, 2-79, и 1 штамм P. putida KT2440. Данные бактерии были проверены на соответствие ряду требований, существенных для использования их в качестве продуцентов. В первую очередь будущий продуцент не должен обладать собственной бактериолитической активностью, так как секреция им во внеклеточную среду собственных литических ферментов усложняет анализ экспрессии исследуемых рекомбинантных белков и затрудняет их выделение. Поэтому все штаммы были проанализированы на наличие эндогенной бактериолитической активности.

Для этого их выращивали на индикаторной агаризованной среде CY, содержащей разрушенные клетки золотистого стафилококка (S. aureus). В качестве положительного контроля использовали штаммы Lysobacter sp. XL1 и

ХЬ2. О наличии литической активности судили по появлению зон лизиса вокруг растущих бактерий (Рис. 9).

Тест на индикаторной среде не выявил эндогенной бактериолитической активности ни у одного из исследуемых штаммов псевдомонад. При этом хорошо проявлялась бактериолитическая активность у контрольных штаммов ЬузоЬасгег эр. ХЬ1 и ХЬ2.

отношению к клеточным стенкам S. aureus для штаммов Р'. fluorescens М4-80 (Psi), 2-7q (Ps2), Pf-5 (Ps3), Q2-87 (Ps4), Q8rl-96 (Ps5), 38a (Ps6), 2-79 (Ps7), P. putida KT2440 (Ps8), a также Lysobacter sp. XL1 (XLI) и XL2 (XLII).

Поскольку конструирование системы экспрессии требует проведения генно-инженерных манипуляций с использованием плазмидных векторов, был проведен анализ устойчивости всех штаммов псевдомонад к интересующим нас антибиотикам (Таблица 2). По совокупности вышеописанных свойств в качестве потенциальных штаммов-продуцентов были выбраны штаммы Р. fluorescens М4-80 и Q2-87.

Таблица 2. Анализ устойчивости штаммов Pseudomonas к антибиотикам.

№ Штамм/ антибиотик Рифампицин 100 мкг/мл Тетрациклин мкг/мл Ампициллин 1000 мкг/мл Канамицин мкг/мл

1 Р. fluorescens М4-80 + (10) + (50)

2 Р. fluorescens 2-7q + (10) + (150)

3 Р. fluorescens Pf-5 + (75) + (50)

4 P. fluorescens Q2-87 + (10) + (50)

5 P. fluorescens Q8rl-96 + (10) + (50)

6 P. fluorescens 38a + + (100) + (50)

7 P. fluorescens 2-79 + (SO) + (150)

8 P. putida KT2440 + (50) + + (150)

"+" и "-" - устойчивость или чувствительность к антибиотику, соответственно. В скобках указана пороговая концентрация антибиотика.

Далее, для решения поставленной задачи мы решили сконструировать систему экспрессии в псевдомонадах на основе «промотор/РНК-полимераза фага Т7». Конструирование проводили при помощи полученных в ходе выполнения данной работы плазмид (Рис. 10). Принцип данной системы экспрессии близок к аналогичной системе экспрессии, разработанной для Е. coli, с некоторыми различиями (Рис.11).

А Б

Рнсунок 10. Карты плазмид, использованных для конструирования системы экспрессии в псевдомонадах. А - плазмида для интеграции в хромосому псевдомонад генов alpA (или alpB) и lad, Б - плазмида с геном РНК-полимеразы фага Т7.

А именно, гены alpA или alpB, находящиеся под контролем гибридного промотора Т7lac, а также ген репроссора 1ас\, в составе плазмидного вектора интегрировали в бактериальную хромосому при помощи системы сайт-специфической рекомбинации псевдомонадного фага (fCTX (Рис.10, А). Затем векторную последовательность удаляли из хромосомы при помощи дрожжевой FLP-рекомбиназы по FRT1 и FRT2 сайтам. Ген РНК-полимеразы фага Т7 был клонирован в составе челночного вектора под контроль /ас-промотора. В результате была получена плазмида pUT7-pol (Рис. 10, Б), несущая ген устойчивости к тетрациклину и способная реплицироваться в клетках Е. coli и Pseudomonas.

Рнсунок 11. Схема экспрессии генов alpA и alpB в псевдомонадах.

Использование репрессора Lacl делает систему индуцибельной и позволяет запускать синтез AlpA и AlpB опосредованно, после индукции /ас-промотора при помощи индуктора ИПТГ и накопления в клетках РНК-полимеразы фага Т7 (Рис. 11).

ColEI

Таким образом, были получены рекомбинантные штаммы P. fluoresceins М4-80/А, М4-80/В, Q2-87/A и Q2-87/B, несущие в хромосоме ген эндопептидазы AlpA или AlpB, соответственно.

Для проверки бактериолитической активности полученных рекомбинантных штаммов P. fluorescens их трансформировали плазмидой pUT7-pol и выращивали в присутствии индуктора на агаризованной среде CY, содержащей разрушенные клетки 5. aureus 209-Р. О наличии бактериолитической активности судили по появлению зон лизиса вокруг растущих колоний псевдомонад. Как видно из результатов анализа (рис. 12) Литическая активность наблюдалась только вокруг колоний клеток псевдомонад экспрессирующих гены alpA и alpB, в то время как в контрольных клетках (штаммы P. fluorescens М4-80 и Q2-87, трансформированные плазмидой pUT7-pol) она отсутствовала.

Рисунок 12. Экспрессия генов литических эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1 в штаммах P. fluorescens. Представлен тест на наличие бактериолитической активности при росте на агаризованной среде CY, содержащей клеточные стенки S. aureus, в присутствии ИПТГ. Клетки Q2-87 и М4-80 -контроль; Q2-87/A или В и М4-80/А или В - содержащие, соответственно, гены alpA или alpB.

Экспрессия генов alpA и alpB при выращивании рекомбинантных штаммов на жидких средах. Для природного штамма Lysobacter sp. XL1 была установлена зависимость продукции литических ферментов от состава среды. Для проверки зависимости экспрессии генов alpA и alpB от состава среды культивирования рекомбинантные штаммы P. fluorescens выращивали в колбах на средах с различным содержанием дрожжевого экстракта, пептона, триптона и минеральных солей:

1 - 0,3% триптон, 0,1% дрожжевой экстракт, 0,1% СаС12, рН 7,4;

2 - 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, рН 7,4;

3 - 0,2% пептон, 0,2% дрожжевой экстракт, 0,5% глюкозу,

0,42% Na2HP04xl2H20, 0,1% КН2Р04, 0,06% КС1, 0,5% MgS04*7 Н20, 0,01% FeS04x7 Н20, рН 7,2;

4 - LB: 1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, рН 7,2;

Штаммы P. fluoresces M4-80/A и M4-80/B плохо росли на жидких средах, возможно ввиду токсичности продуктов генов alpA и alpB, или нестабильности плазмид в этих клетках. Поэтому для дальнейшей работы были использованы штаммы P. fluoresceins Q2-87/A и Q2-87/B (таблицы 3 и 4).

Таблица 3. Рост и бактериолнтнческая активность штамма P. fliiorescens Q2-87/A.

Среда Оптическая плотность, А540 Литическая активность, ЛЕ/мл

24 часа 48 часов 24 часа 48 часов

1 1,9 1,4 2,4 10,9

2 2,4 0,8 10,0 26,1

3 4,4 4,2 12,0 35,0

4 3,4 2,5 25,2 46,4

Таблица 4. Рост и бактериолнтнческая активность штамма P. fluorescens Q2-87/B.

Среда Оптическая плотность, А540 Литическая активность, ЛЕ/мл

24 часа 48 часов 24 часа 48 часов

1 2,1 1,1 28,8 37,2

2 1,6 0,5 39,6 22,8

3 2,9 3,0 15,0 26,8

4 3,9 3,1 23,8 30,8

Представлены данные через 24 и 48 часов индукции.

Измерение бактериолитической активности в культуральной жидкости проводили турбидиметрическим методом на основании уменьшения оптической плотности суспензии автоклавированных клеток S. aureus при добавлении соответствующего препарата. За 1 единицу активности принимали количество фермента, которое приводило к уменьшению оптической плотности суспензии клеток S. aureus на 0,01 за 1 минуту.

Из результатов анализа следует, что рекомбинантные штаммы P. fluorescens Q2-87/A и Q2-87/B на всех средах продуцируют активные бактериолитические ферменты, что выявляется по наличию бактериолитической активности в культуральной жидкости, которая детектируется уже к 24 часам индукции и достигает максимума к 48 часам индукции. Дальнейшее увеличение времени индукции не приводило к увеличению активности. Максимальная литическая активность для AlpA наблюдалась при экспрессии на средах 3 и 4, а для AlpB - на средах 1 и 4.

Поскольку AlpA и AlpB являются секретируемыми белками, то для анализа процесса созревания и секреции ферментов было исследовано наличие в культуральной жидкости и клетках зрелых пептидаз и их предшественников при помощью иммуноблоттинга с поликлональными антителами к пробелкам AlpA и AlpB. Как видно из рисунка 13, в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов P. fluorescens Q2-87/A и Q2-87/B содержатся зрелые белки AlpA и AlpB, соответственно.

Среда 12 3

Время (ч) 24 48 24 48 24 48

24 48

А1рА

А1рВ

Рисунок 13. Секреции эндопептидаз А1рА и А1рВ клетками Р. ¡1иоге$сеп$ 02-87 в культуральную жидкость в зависимости от состава среды.

Иммуноблоттинг белков культуральной жидкости рекомбинантных штаммов Р. Аиогезсет (32-87/А и (22-87/В, выращенных на разных средах.

При этом, предшественники А1рА и А1рВ в культуральной жидкости не обнаруживаются, а в клетках Р. /¡иогехсет <32-87/А и <32-87/В не было детектировано ни зрелых белков, ни их предшественников (данные не приведены). Содержание ферментов в культуральной жидкости коррелирует с уровнем литической активности (см. таблицы 3 и 4). Количество зрелого А1рА увеличивается к 48 часам индукции при росте на всех средах. Увеличение количества зрелого А1рВ в культуральной жидкости наблюдалось при росте на средах 1, 3 и 4. Тогда как на среде 2 к этому времени было выявлено некоторое снижение количества А1рВ.

Экспрессия генов а!рА и а1рВ при выращивании на некоторых средах сопровождалась лизисом клеток, что проявлялось в уменьшении оптической плотности культур. Наибольший лизис клеток наблюдался при росте на среде 2. При выращивании на среде 3 лизиса клеток в условиях индукции не происходило. Таким образом, оптимальной для продукции бактериолитических эндопептидаз является среда 3, которая, в частности, применяется для выращивания природного штамма ЬуяоЪаМег эр. ХЬ1 при получении лизоамидазы.

Уровень продукции эндопептидазы А1рА рекомбинантным штаммом сопоставим с природным продуцентом - выход ферментов с одного литра культуральной жидкости составляет примерно 1 мг. В то время как эффективность продукции эндопептидазы А1рВ в 50 раз выше по сравнению с природным штаммом и составляет 2-3 мг с литра культуральной жидкости. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в полученных рекомбинантных штаммах Р. Аиогевсепь происходит эффективная продукция, правильное сворачивание, созревание и секреция рекомбинантных литических эндопептидаз А1рА и А1рВ ЬуяоЬаМег Бр. ХЬ1.

выводы

1. Определена нуклеотидная последовательность хромосомного фрагмента генома Lysobacter sp. XL1 размером 9017 п.н., содержащего гены alpA и alpB литических эндопептидаз LI и L5 соответственно.

2. Эндопептидазы LI и L5 являются близкими по размеру гомологичными белками, имеющими сходную структурную организацию. На основании результатов филогенетического анализа эндопептидазы LI и L5 отнесены к клану РА, семейству S1 класса сериновых пептидаз и подсемейству SIE — химотрипсина.

3. На основании сравнительного анализа аминокислотных последовательностей предсказано, что эндопептидазы AlpA и AlpB имеют различную субстратную специфичность. AlpA гидролизует пептидные связи после аминокислотных остатков с короткими, а AlpB - с длинными гидрофобными боковыми цепями.

4. Показано, что мРНК генов alpA и alpB являются моноцистронными и обнаруживаются на поздней экспоненциальной стадии роста. Более высокое содержание мРНК alpA по сравнению с alpB коррелирует с более высоким содержанием эндопептидазы LI в культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1.

5. Сконструирована система экспрессии эндопептидаз LI и L5 на основе бактерий рода Pseudomonas. Рекомбинантные штаммы-продуценты эффективно секретируют активные зрелые эндопептидазы AlpA и AlpB в культуральную жидкость.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лаптева Ю.С., Золова О.Э., Соколов А.С., Степная О.А., Грановский Н.Э. Штаммы Lysobacter sp. XL1 и XL2 не содержат плазмид. Учен. зап. Казан, ун- та. Сер. Естеств. науки. - 2011. - Т. 53, кн. 2. - С. 63-72.

2. Yu. S. Lapteva. О.Е. Zolova, M.G. Shlyapnikov, I.M. Tsfasman, Т. A. Muranova O.A. Stepnaya, I. S. Kulaev, I.E. Granovsky. Cloning and expression analysis of genes of lytic endopeptidases LI and L5 from Lysobacter sp. XL1. Appl. Environ. Microbiol. Oct. 2012., vol. 78., No. 19., p. 7082-7089.

3. Грановский И. Э., Калинин А. Е., Лаптева Ю. С.. Латыпов О. Р., Васильева Н. В., Цфасман И. М., Степная О. А., Кулаев И. С., Муранова Т. А., Красовская Л.А. Литическая протеаза AlpA бактерии Lysobacter sp. XL1, фрагмент ДНК, кодирующий литическую протеазу AlpA бактерии Lysobacter sp. XL1, и способ получения литической протеазы AlpA бактерии Lysobacter sp. XL1. Патент 2407782 Российская Федерация. № 2009105828/10, заявл. 20.02.2009, опубл. 27.12.2010, Бюл. № 36. - 16 с.

4. Грановский И. Э., Калинин А. Е., Лаптева Ю. С., Латыпов О. Р., Васильева Н. В., Цфасман И. М., Степная О. А., Кулаев И. С., Муранова Т. А., Красовская Л.А. Литическая протеаза AlpB бактерии Lysobacter sp. XL1, фрагмент ДНК, кодирующий литическую протеазу AlpB бактерии Lysobacter sp. XL1, и способ получения литической протеазы AlpB бактерии Lysobacter sp. XL1. Патент 2408725 Российская Федерация. № 2009105830/10, заявл. 20.02.2009, опубл. 10.01.2011, Бюл. № 1. - 15 с.

5. Кулаев И.С., Лаптева Ю.С.. Калинин А.Е., Хохлова О.В., Шляпников М.Г., Цфасман И.М., Степная О.А., Грановский Н.Э. Антимикробный препарат лизоамидаза: клонирование и экспрессия в E.coli генов бактериолитических эндопептидаз Л1 (alpА) и Л 5 (alp В). Материалы конференции «Фундаментальные науки - медицине». Москва, 14-16 декабря, 2005, С. 171-172.

6. Лаптева Ю.С.. Калинин А.Е., Хохлова О.В., Цфасман И.М., Степная О.А., Шляпников М.Г., Грановский Н.Э. Литические эндопептидазы Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1: обнаружение генов и экспрессия в E.coli. Материалы 10-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», Пущино, 17-21 апреля, 2006, IX.68, С. 380.

7. Julia Lapteva, Andrey Kalinin, Olga Khokhlova, Irina Tsfasman, Olga Stepnaya, Igor Granovskiy. Cloning and Expression of Bacteriolytic Endopeptidase Genes from Lysobacter sp. XL1. The 2007 "Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting". University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, 7 -12 August, 2007, P. 194.

8. Лаптева Ю.С.. Грановский Н.Э. Литические эндопептидазы Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1: молекулярный анализ генов и сравнительная характеристика ферментов. Материалы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», Пущино, 29 октября - 2 ноября, 2007, С. 96.

9. Лаптева Ю.С.. Анисимова E.B. Экспрессия генов литических эндопептидаз Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1 в бактериях рода Pseudomonas. Материалы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», Пущино, 29 октября - 2 ноября, 2007, С. 208.

Ю.Лаптева Ю.С., Михайлова И.М., Красовская Л.А., Цфасман И.М., Степная О.А, Грановский И.Э. Создание гетерологичной системы экспрессии генов бактериолитических эндопептидаз Л1 и Л5 Lysobacter species XL1 на основе бактерий рода Pseudomonas. Материалы 12-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука 21 века», Пущино, 10 -14 ноября, 2008, С. 212.

П.Лаптева Ю.С.. Михайлова И.М., Красовская Л.А., Цфасман И.М., Степная О.А, Грановский И.Э. Создание гетерологичной системы экспрессии генов бактериолитических эндопептидаз Л1 и Л5 Lysobacter species XLl на основе бактерий рода Pseudomonas. Материалы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, 23-27 июня, 2009, С. 374.

12.Кулаев И.С., Степная O.A., Цфасман И.М., Красовская Л.А., Васильева Н.В., Грановский И.Э., Латыпов О.Р., Лаптева Ю.С.. Шишкова H.A., Маринин Л.И. Получение рекомбинантных литических эндопептидаз антимикробного препарата лизоамидаза и проверка их лечебной эффективности на моделях сибиреязвенной инфекции. Материалы 2-го Международного Конгресса-Партнеринга и Выставки по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010», Москва, 13-15 апреля, 2010, С. 115.

13.Красовская Л.А., Васильева Н.В., Лаптева Ю.С.. Грановский И.Э., Руденко Н.В., Цфасман И.М., Степная O.A., Кулаев И.С. Получение рекомбинантных литических эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacter sp. XLl в гетерологичной системе Pseudomonas. Материалы всероссийского симпозиума с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее», Москва, 2011, Сборник тезисов, с.70.

Подписано в печать: 09.11.2012

Заказ № 7819 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \vwvv. аи1огеГега1. ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лаптева, Юлия Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бактериолитические ферменты.

1.2. Классификация пептидаз.

1.3. Сериновые протеазы.

1.4. Структурная организация протеаз.

1.5. Литические протеазы Lysobacter enzymogenes.

1.6. Структурная организация а-литической протеазы Lysobacter enzymogenes.

1.7. Секреция протеаз.

1.7.1 Внеклеточные протеазы микроорганизмов, I (TISS) тип секреции и ABC транспортеры.

1.7.2 ABC транспортеры.

1.7.3 Внеклеточные протеазы микроорганизмов и II (T2SS) тип секреции.

1.7.4 Внеклеточные протеазы микроорганизмов V тип секркции (T5SS).

1.7.5 Секреция при помощи везикул.

1.8. Регуляция экспрессии генов микробных сериновых протеаз.

1.9. Системы экспрессии для наработки рекомбинантных белков.

1.10. Продукция рекомбинантных белков в бактериях рода Pseudomonas.

1.11. Бактерии рода Lysobacter.

1.12. "Лизоамидаза" - препарат, получаемый на основе культуральной жидкости бактерии Lysobacter sp. XL1.

1.13. Эндопептидазы LI и L5 Lysobacter sp. XL1.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Штаммы бактерий.

2.1.2. Плазмидные вектора и рекомбинантные плазмиды.

2.1.3. Среды и основные буферы.

2.1.4. Реактивы.

2.1.5. Олигонулеотидные праймеры.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение хромосомной ДНК бактерий.

2.2.2. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.2.3. ДНК-ДНК гибридизация по Саузерну.

2.2.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.2.5. Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.

2.2.6. Цитирование фрагментов ДНК.

2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности.

2.2.8. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация.

2.2.9. Получение электрокомпетентных клеток бактерий рода Pseudomonas и электропорация.

2.2.10. Конъюгативный перенос плазмид.

2.2.11. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.12. Анализ рекомбинантных клонов на наличие вставки в плазмиде.

2.2.13. Экспрессия ОРС alpA и alpB в E.coli и анализ литической активности.

2.2.14. Анализ бактериолитической активности рекомбинантных штаммов Pseudomonas на индикаторной среде.

2.2.15. Культивирование Pseudomonas в жидких средах.

2.2.16. Анализ аминокислотных последовательностей.

2.2.17. Выделение РНК из клеток.

2.2.18. Электрофорез РНК в геле, содержащим формальдегид.

2.2.19. РНК-ДНК гибридизация.

2.2.20. Определение стартовых точек транскрипции генов методом 5'-RACE.

2.2.21. Приготовление агарозных блок- вставок с интактной ДНК бактерий.

2.2.22. Обработка блок-вставок с ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.2.23. Электрофорез в пульсирующих полях.

2.2.24. Скрининг плазмид по методу Экхардта.

2.2.25. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.2.26. Иммуноблоттинг.

2.2.27. Измерение бактериолитической активности.

ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение.

3.1. Поиск и определение нуклеотидной последовательности участка ДНК Lysobacter sp. XL1, кодирующего литические эндопептидазы LI и L5.

3.2. AlpA и AlpB являются секретируемыми литическими протеазами.

3.3. Обнаруженные гены alpA и alpB кодируют функционально активные литические ферменты.

3.4. ОРС alpA и alpB транскрибируются с собственных промоторов.

3.5. Определение стартовых точек транскрипции.

3.6. Определение локализации генов alpA и alpB Lysobacter sp. XL1.

3.6.1. Детекция плазмид в клетках по модифицированному методу Экхардта.

3.6.2. Анализ генома Lysobacter sp. XL1 при помощи электрофореза в пульсирующих полях.

3.7. Продукция рекомбинантных эндопептидаз AlpA и AlpB в клетках бактерий рода Pseudomonas.

3.7.1. Конструирование системы экспрессии.

3.7.2. Отбор штаммов бактерий рода Pseudomonas.

3.7.3. Анализ бактериолитической активности штаммов псевдомонад.

3.7.4. Спектр устойчивости штаммов Pseudomonas к антибиотикам.

3.7.5. Анализ спектра секретируемых белков.

3.8. Конструирование рекомбинантных штаммов для экспрессии генов alpA и alpB в Pseudomonas.

3.9. Анализ эффективности системы экспрессии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование и экспрессия генов литических эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp. XL1"

Литические ферменты представляют собой чрезвычайно разнообразную группу белков (гидролаз), которые разрушают различные структурные компоненты клеточных стенок микроорганизмов, что приводит к их лизису. Литические ферменты были впервые обнаружены в слюне человека и описаны Александром Флемингом в 1922 году. Вещество назвали лизоцимом, что означает «фермент, растворяющий бактерии». Позже стало известно, что синтезировать литические ферменты способны все живущие в настоящее время организмы - от высших животных и человека до бактерий и вирусов. Литические ферменты слизистых оболочек животных обеспечивают им защиту от проникновения патогенных микроорганизмов. Секретируемые в окружающую среду литические ферменты микроорганизмов обеспечивают их питанием, источниками энергии, строительным материалом за счет других организмов и собственных отмерших клеток. Литические ферменты выполняют также регуляторные функции: участвуют в сложных процессах развития микробных клеток и вирусов, в частности, в спорообразовании и фаговой инфекции, соответственно. Кроме того, литические ферменты, наряду с поринами, нуклеазами, бактериоцинами, антибиотиками, токсинами и др., являются одним из факторов микробного антагонизма, используемых бактериями для подавления конкурирующих микроорганизмов (Michel-Briand and Baysse, 2002) (Abriouel et al., 2011) (Riley and Wertz, 2002a; Riley and Wertz, 2002b) (Cascales et al., 2007; Severinov et al., 2007; Fischetti, 2008).

Среди бактерий обнаружены продуценты ферментов, активно лизирующих не только клетки бактерий-конкурентов, но и клетки микроорганизмов других систематических групп - дрожжей, мицелиальных грибов, простейших. Благодаря антимикробному действию литические ферменты рассматривают в качестве альтернативных антибиотикам препаратов, которые можно использовать в медицине, фармакологии, а также пищевой промышленности и сельском хозяйстве для борьбы с антибиотико-устойчивыми патогенными микроорганизмами. Накопленные к настоящему моменту данные о многих литических ферментах и их продуцентах, а также развитие методов генной инженерии способствуют этому. Так, например, созданы породы крупного рогатого скота, которые экспрессируют в молоко лизостафин, благодаря чему они устойчивы к появлению маститов, вызываемых Staphylococcus aureus. На основе яичного лизоцима и лизоцимов бактериофагов разработаны и применяются в медицине лекарственные препараты (Лизобакт и Ларипронт). Постоянно проводится работа по поиску новых продуцентов и изучению спекрта литического действия их ферментов.

Бактерия Lysobacter sp. XL1 секретерует в окружающую среду целый ряд литических ферментов. Антимикробный препарат лизоамидаза, получаемый на основе культуральной жидкости этой бактерии, активен против грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей, препарат препятствует прорастанию бактериальных и грибных спор (Ryazanova et al., 2005; Begunova et al., 2006). Успешные клинические испытания лизоамидазы позволили зарегистрировать ее в качестве лекарственного средства для лечения наружных инфекций, вызванных грамположительной микрофлорой. Показано, что антимикробное действие препарата обеспечивают дрожжелитическая металлопротеаза и пять бактериолитических ферментов: эндопептидазы LI, L4 и L5, И-ацетилмурамоил-Ь-аланин амидаза L2 и мурамидаза L3.

В настоящее время достигнуты большие успехи в изучении биохимических свойств эндопептидаз LI и L5, однако, совершенно отсутствуют данные об их генетической организации. Идентификация и характеристика генов литических ферментов Lysobacter sp.XLl необходимы для проведения дальнейших научных исследований этих ферментов, а так же для прикладных разработок.

Цель работы.

Цель данной работы заключалась в клонировании и определении нуклеотидной последовательности генов бактериолитических эндопептидаз LI и L5 Lysobacter sp.XLl и создании штаммов-продуцентов этих ферментов на основе бактерий рода Pseudomonas.

Задачи исследования:

S Клонировать гены бактериолитических эндопептидаз LI и L5 Lysobacter sp.XLl и определить их нуклеотидную последовательность; S Проанализировать экспрессию генов эндопептидаз LI и L5 на уровне транскрипции в Lysobacter sp. XL1;

S Сконструировать систему экспрессии генов эндопептидаз LI и L5 Lysobacter sp. XL1 в бактериях рода Pseudomonas и проанализировать её эффективность.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Лаптева, Юлия Сергеевна

выводы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До проведения данной работы отсутствовала информация о структуре генов литических ферментов бактерии ЬузоЬаМег эр. ХЬ1, причем и данные об их аминокислотных последовательностях были неполными. В ходе выполнения данной работе были обнаружены и охарактеризованы гены эндопептидаз Ы и Ь5 ЬуяоЬаМег эр. ХЬ1 (а1рА и а1рВ, соответственно). Определение их нуклеотидной последовательности позволило установить полную аминокислотную последовательность эндопептидаз Ы и Ь5. На основании анализа выведенных аминокислотных последовательностей было показано, что они являются близкими по размеру гомологичными белками, имеют сходную структурную организацию и относятся к семейству химотрипсина класса сериновых протеаз.

Анализ установленных аминокислотных последовательностей белков А1рА и А1рВ и сравнение их с хорошо изученным гомологичным ферментом - а-литической протеазой Ь. enzymogenes - позволили нам предсказать, что субстратная специфичность белков А1рА и А1рВ будет отличаться. Так, следует ожидать, что А1рА будет гидролизовать пептидные связи после аминокислотных остатков с короткими, а А1рВ - с длинными гидрофобными боковыми цепями. Полученные данные требуют экспериментального подтверждения и будут полезны при выборе субстратов при проведении работы по сравнительному изучению субстратной специфичности данных ферментов.

Для улучшения биотехнологических свойств штамма ЬузоЬаМег эр. ХЫ актуально изучение регуляции экспрессии генов а1рА и а1рВ. В данной работе впервые проведен анализ экспрессии генов эндопептидаз Ы и Ь5 ЬувоЪаМег эр. ХЬ1 на уровне транскрипции. Показано, что более высокое содержание эндопептидазы Ы по сравнению с Ь5 в культуральной жидкости ЬузоЪаМег эр. ХЫ объясняется более высоким содержанием мРНК а1рА в клетках.

С одной стороны, это может быть обусловлено разной силой промоторов генов а1рА и а1рВ. Обнаруженные нами различия в последовательностях промоторов генов а1рА и а1рВ, вероятно, способствуют тому, что они по-разному узнаются РНК-полимеразой ЬузоЪаМег эр. ХЬ1. Вследствие отсутствия данных по консервативным элементам промоторов, а также о структуре РНК-полимеразы бактерий рода ЬузоЬаМег, оказывается невозможным сделать однозначные выводы о силе промоторов. Ввиду значительных отличий промоторов ЬузоЪаМег от Е.соИ, РНК-полимераза последней не подходит для проведение экспериментов по определению силы взаимодействия ее с промоторами генов alpA и alpB. Поэтому, необходимо проведение экспериментов по поиску и клонированию гена РНК-полимеразы Lysobacter sp. XL1.

С другой стороны, динамика накопления мРНК генов alpA и alpB в клетках Lysobacter sp. XL1 (существенное увеличение количества мРНК на поздней экспоненциальной стадии роста) свидетельствует о том, что активность промоторов генов alpA и alpB может регулироваться транскрипционными факторами, либо зависеть от альтернативных а-факторов. Проведение экспериментов в этом направлении пока ограничено в связи с тем, что на данный момент нам не удалось подобрать каких-либо плазмид, способных реплицироваться в Lysobacter sp. XL1. Но планируется проведение дальнейших работ в этом направлении. В любом случае, полученные на данном этапе работы данные вносят значительный вклад в малоизученную область регуляции экспрессии генов бактерий рода Lysobacter и расширяют представления данной области знаний в целом.

В рамках данной работы была проведена попытка прояснить вопрос и причинах появления в популяции клеток штамма Lysobacter sp. XL1 малоактивных, в отношении продукции литических ферментов, клеток Lysobacter sp. XL2. Наиболее вероятной казалась гипотеза о локализации литических ферментов на плазмиде и ее утраты клетками в процессе роста. Однако анализ штаммов Lysobacter sp. XL1 показал, что плазмиды в нем отсутствуют. Таким образом, вопрос о диссоциации штамма Lysobacter sp. XL1 остается открытым. Следует провести секвенирование и сравнительный анализ фрагментов генома Lysobacter sp. XL1 и Lysobacter sp. XL2 с целью идентификации геномных перестроек, вызванных мобильными элементами (интегронами, транспозонами, IS элементами), и, возможно, приводящих к диссоциации штамма. Отработанные в данной работе методики по проведению электрофореза в пульсирующих полях могут быть полезны при выполнении этой работы.

В рамках данной работы, сотрудниками лаборатории была проведена попытка создания штамма-продуцента белков AlpA и AlpB на основе бактерии E.coli. Добиться продукции зрелых, активных эндопептидаз, однако, не удалось. Ренатурация из телец включения оказалась малоэффективной и дорогостоящей. В тоже время, в системе промотор/РНК-полимераза фага Т7 были наработаны пробелки данных ферментов, применяемые для получения поликлональных антител, которые активно используются в работе сотрудниками нескольких лабораторий.

В данной работе впервые сконструирована уникальная система экспрессии бактериолитических эндопептидаз LI и L5 на основе бактерии P. fluorescens. По сравнению с системой на основе E.coli, в разработанной системе эффективно происходит созревание и секреция эндопептидазы. Полученные рекомбинантные штаммы обеспечивают пока невысокий уровень экспрессии (3 мг/л). Хотя мы считаем, что для токсичных, имеющих непростое строение (три дисульфидные связи) белков, это достаточно хорошие выходы. В задачи данной работы входило проверить принципиальную возможность использования бактерий рода Pseudomonas для продукции литичсеких эндопептидаз LI и L5. Дальнейшая работа по оптимизации условий культивирования поможет увеличить выходы данных ферментов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лаптева, Юлия Сергеевна, Москва

1. Abriouel, H., Franz, C.M., Ben Omar, N. and Galvez, A. Diversity and applications of Bacillus bacteriocins. FEMS Microbiol Rev, 2011. 35(1): p. 201-32.

2. Ahmed, K., Chohnan, S., Ohashi, H., Hirata, T., Masaki, T. and Sakiyama, F. Purification, bacteriolytic activity, and specificity of beta-lytic protease from Lysobacter sp. IB-9374. J Biosci Bioeng, 2003. 95(1): p. 27-34.

3. Anderson, D.E., Peters, R.J., Wilk, B. and Agard, D.A. alpha-lytic protease precursor: characterization of a structured folding intermediate. Biochemistry, 1999. 38(15): p. 4728-35.

4. Bae, H.S., Im, W.T. and Lee, S.T. Lysobacter concretionis sp. nov., isolated from anaerobic granules in an upflow anaerobic sludge blanket reactor. Int J Syst Evol Microbiol, 2005. 55(Pt 3): p. 1155-61.

5. Baker, D., Silen, J.L. and Agard, D.A. Protease pro region required for folding is a potent inhibitor of the mature enzyme. Proteins, 1992a. 12(4): p. 339-44.

6. Baker, D., Sohl, J.L. and Agard, D.A. A protein-folding reaction under kinetic control. Nature, 1992b. 356(6366): p. 263-5.

7. Barequet, I.S., Ben Simon, G.J., Safrin, M., Ohman, D.E. and Kessler, E. Pseudomonas aeruginosa LasA protease in treatment of experimental staphylococcal keratitis. Antimicrob Agents Chemother, 2004. 48(5): p. 1681-7.

8. Barrett, A.J., Tolle, D.P. and Rawlings, N.D. Managing peptidases in the genomic era. Biol Chem, 2003. 384(6): p. 873-82.

9. Begunova, E.A., Stepnaya, O.A., Lysanskaya, V.Y. and Kulaev, I.S. Specificity of the action of lysoamidase on Staphylococcus aureus 209P cell walls. Biochemistry (Mose), 2003. 68(7): p. 735-9.

10. Beveridge, T.J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol, 1999. 181(16): p. 4725-33.

11. Binet, R., Letoffe, S., Ghigo, J.M., Delepelaire, P. and Wandersman, C. Protein secretion by Gram-negative bacterial ABC exporters—a review. Gene, 1997. 192(1): p. 7-11.

12. Bleves, S., Viarre, V., Salacha, R., Michel, G.P., Filloux, A. and Voulhoux, R. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol, 2010. 300(8): p. 534-43.

13. Blow, D.M., Birktoft, J.J. and Hartley, B.S. Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotrypsin. Nature, 1969. 221(5178): p. 337-40.

14. Bone, R., Frank, D., Kettner, C.A. and Agard, D.A. Structural analysis of specificity: alpha-lytic protease complexes with analogues of reaction intermediates. Biochemistry, 1989a. 28(19): p. 7600-9.

15. Bone, R., Fujishige, A., Kettner, C.A. and Agard, D.A. Structural basis for broad specificity in alpha-lytic protease mutants. Biochemistry, 1991. 30(43): p. 10388-98.

16. Bone, R., Silen, J.L. and Agard, D.A. Structural plasticity broadens the specificity of an engineered protease. Nature, 1989b. 339(6221): p. 191-5.

17. Braun, P., Tommassen, J. and Filloux, A. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol, 1996. 19(2): p. 297-306.

18. Brayer, G.D., Delbaere, L.T. and James, M.N. Molecular structure of the alpha-lytic protease from Myxobacter 495 at 2.8 Angstroms resolution. J Mol Biol, 1979. 131(4): p. 743-75.

19. Bychkova, V.E. and Ptitsyn, O.B. The state of unfolded globules of protein molecules is more quickly becoming a rule, rather than an exception. Biofizika, 1993. 38(1): p. 58-66.

20. Cascales, E., Buchanan, S.K., Duche, D., Kleanthous, C., Lloubes, R., Postle, K., Riley, M., Slatin, S. and Cavard, D. Colicin biology. Microbiol Mol Biol Rev, 2007. 71(1): p. 158-229.

21. Chen, R. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotechnol Adv, 2011. 30(5): p. 1102-7.

22. Chohnan, S., Nonaka, J., Teramoto, K., Taniguchi, K., Kameda, Y., Tamura, H., Kurusu, Y., Norioka, S., Masaki, T. and Sakiyama, F. Lysobacter strain with high lysyl endopeptidase production. FEMS Microbiol Lett, 2002. 213(1): p. 13-20.

23. Choi, E.Y., Oh, E.A., Kim, J.H., Kang, D.K. and Hong, S.K. Distinct regulation of the sprC gene encoding Streptomyces griseus protease C from other chymotrypsin genes in Streptomyces griseus IF013350. J Microbiol Biotechnol, 2007. 17(1): p. 81-8.

24. Choi, J.H. and Lee, S.Y. Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol, 2004. 64(5): p. 625-35.

25. Christensen, P. and Cook, F.D. Lysobacter, a new genus of nonfruiting, gliding bacteria with a high base ratio. Int J Syst Bacteriol, 1978. 28(p. 367-393.

26. Ciofu, O., Beveridge, T.J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J. and Hoiby, N. Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa. J Antimicrob Chemother, 2000. 45(1): p. 9-13.

27. Coutte, L., Antoine, R., Drobecq, H., Locht, C. and Jacob-Dubuisson, F. Subtilisin-like autotransporter serves as maturation protease in a bacterial secretion pathway. EMBO J, 2001. 20(18): p. 5040-8.

28. Cunningham, E.L., Mau, T., Truhlar, S.M. and Agard, D.A. The pro region N-terminal domain provides specific interactions required for catalysis of alpha-lytic protease folding. Biochemistry, 2002. 41(28): p. 8860-7.

29. Damas, J.M., Oliveira, A.S., Baptista, A.M. and Soares, C.M. Structural consequences of ATP hydrolysis on the ABC transporter NBD dimer: molecular dynamics studies of HlyB. Protein Sci, 2011. 20(7): p. 1220-30.

30. Dammeyer, T., Steinwand, M., Kruger, S.C., Dubel, S., Hust, M. and Timmis, K.N. Efficient production of soluble recombinant single chain Fv fragments by a Pseudomonas putida strain KT2440 cell factory. Microb Cell Fact, 2011. 10(p. 11.

31. Davis, B.D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci USA, 1949. 35(1): p. 1-10.

32. Demain, A.L. and Vaishnav, P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnol Adv, 2009. 27(3): p. 297-306.

33. Eckhardt, T. A rapid method for the identification of plasmid desoxyribonucleic acid in bacteria. Plasmid, 1978. 1(4): p. 584-8.

34. Eder, J. and Fersht, A.R. Pro-sequence-assisted protein folding. Mol Microbiol, 1995. 16(4): p. 609-14.

35. Ekici, O.D., Paetzel, M. and Dalbey, R.E. Unconventional serine proteases: variations on the catalytic Ser/His/Asp triad configuration. Protein Sci, 2008. 17(12): p. 2023-37.

36. Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G. and Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nat. Protoc., 2007. 2(4): p. 953-71.

37. Epstein, D.M. and Wensink, P.C. The alpha-lytic protease gene of Lysobacter enzymogenes. The nucleotide sequence predicts a large prepro-peptide with homology to propeptides of other chymotrypsin-like enzymes. J Biol Chem, 1988. 263(32): p. 16586-90.

38. Fath, M.J. and Kolter, R. ABC transporters: bacterial exporters. Microbiol Rev, 1993. 57(4): p. 995-1017.

39. Fekkes, P. and Driessen, A.J. Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane. Microbiol Mol Biol Rev, 1999. 63(1): p. 161-73.

40. Filloux, A. The underlying mechanisms of type II protein secretion. Biochim Biophys Acta, 2004. 1694(1-3): p. 163-79.

41. Fischetti, V.A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Curr. Opin. Microbiol., 2008. 11(5): p. 393-400.

42. Fujishige, A., Smith, K.R., Silen, J.L. and Agard, D.A. Correct folding of alpha-lytic protease is required for its extracellular secretion from Escherichia coli. J Cell Biol, 1992. 118(1): p. 33-42.

43. George, A.M. and Jones, P.M. Perspectives on the structure-function of ABC transporters: The Switch and Constant Contact Models. Prog Biophys Mol Biol, 2012. 109(3): p. 95-107.

44. Ghuysen, J.M. Use of bacteriolytic enzymes in determination of wall structure and their role in cell metabolism. Bacteriol Rev, 1968. 32(4 Pt 2): p. 425-64.

45. Gillespie, D.C. and Cook, F.D. Extracellular Enzymes from Strains of Sorangium. Can J Microbiol, 1965. ll(p. 109-18.

46. Gillings, M.R., Holley, M.P., Stokes, H.W. and Holmes, A.J. Integrons in Xanthomonas: a source of species genome diversity. Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(12): p. 4419-24.

47. Gruber, T.M. and Bryant, D.A. Molecular systematic studies of eubacteria, using sigma70-type sigma factors of group 1 and group 2. J. Bacteriol., 1997. 179(5): p. 1734-47.

48. Hartley, B.S. Amino-Acid Sequence of Bovine Chymotrypsinogen-A. Nature, 1964. 201(p. 1284-7.

49. Hashizume, H., Hattori, S., Igarashi, M. and Akamatsu, Y. Tripropeptin E, a new tripropeptin group antibiotic produced by Lysobacter sp. BMK333-48F3. J Antibiot (Tokyo), 2004a. 57(6): p. 394-9.

50. Hashizume, H., Hirosawa, S., Sawa, R., Muraoka, Y., Ikeda, D., Naganawa, H. and Igarashi, M. Tripropeptins, novel antimicrobial agents produced by Lysobacter sp. J Antibiot (Tokyo), 2004b. 57(1): p. 52-8.

51. Hashizume, H., Igarashi, M., Hattori, S., Hori, M., Hamada, M. and Takeuchi, T. Tripropeptins, novel antimicrobial agents produced by Lysobacter sp. I. Taxonomy, isolation and biological activities. J Antibiot (Tokyo), 2001. 54(12): p. 1054-9.

52. Henderson, G., Krygsman, P., Liu, C.J., Davey, C.C. and Malek, L.T. Characterization and structure of genes for proteases A and B from Streptomyces griseus. J Bacteriol, 1987. 169(8): p. 3778-84.

53. Henderson, I.R. and Nataro, J.P. Virulence functions of autotransporter proteins. Infect Immun, 2001. 69(3): p. 1231-43.

54. Hoang, T.T., Karkhoff-Schweizer, R.R., Kutchma, A.J. and Schweizer, H.P. A broad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision of chromosomally-located

55. DNA sequences: application for isolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants. Gene, 1998. 212(1): p. 77-86.

56. Hoang, T.T., Kutchma, A.J., Becher, A. and Schweizer, H.P. Integration-proficient plasmids for Pseudomonas aeruginosa: site-specific integration and use for engineering of reporter and expression strains. Plasmid, 2000. 43(1): p. 59-72.

57. Holland, I.B. and Blight, M.A. ABC-ATPases, adaptable energy generators fuelling transmembrane movement of a variety of molecules in organisms from bacteria to humans. J Mol Biol, 1999. 293(2): p. 381-99.

58. Holland, I.B., Schmitt, L. and Young, J. Type 1 protein secretion in bacteria, the ABCtransporter dependent pathway (review). Mol Membr Biol, 2005. 22(1-2): p. 29-39.

59. Hollenstein, K., Dawson, R.J. and Locher, K.P. Structure and mechanism of ABC transporter proteins. Curr Opin Struct Biol, 2007. 17(4): p. 412-8.

60. Holtje, J.V., Mirelman, D., Sharon, N. and Schwarz, U. Novel type of murein transglycosylase in Escherichia coli. J Bacteriol, 1975. 124(3): p. 1067-76.

61. Howell, C.R. and Stipanovic, R.D. Control of Rhizoctonia solani on Cotton Seedlings with Pseudomonas fluorescens and With an Antibiotic Produced by the Bacterium. Phytopathology 1979. 69(p. 480-482.

62. Hu, Z., Haghjoo, K. and Jordan, F. Further evidence for the structure of the subtilisin propeptide and for its interactions with mature subtilisin. J Biol Chem, 1996. 271(7): p. 3375-84.

63. Hynes, M.F. and McGregor, N.F. Two plasmids other than the nodulation plasmid are necessary for formation of nitrogen-fixing nodules by Rhizobium leguminosarum. Mol Microbiol, 1990. 4(4): p. 567-74.

64. Ikemura, H., Takagi, H. and Inouye, M. Requirement of pro-sequence for the production of active subtilisin E in Escherichia coli. J Biol Chem, 1987. 262(16): p. 7859-64.

65. Iyer, L.M., Koonin, E.V. and Aravind, L. Evolution of bacterial RNA polymerase: implications for large-scale bacterial phylogeny, domain accretion, and horizontal gene transfer. Gene, 2004. 335(p. 73-88.

66. Jones, P.M. and George, A.M. Subunit interactions in ABC transporters: towards a functional architecture. FEMS Microbiol Lett, 1999.179(2): p. 187-202.

67. Jurasek, L. and Whitaker, D.R. Amino acid and metal composition of the alpha- and beta-lytic proteases of Sorangium sp. Can J Biochem, 1967. 45(6): p. 917-27.

68. Jurkevitch, E. Isolation and classification of bdellovibrio and like organisms. Curr Protoc Microbiol, 2006. Chapter 7(p. Unit 7B 1.

69. Kadurugamuwa, J.L. and Beveridge, T.J. Bacteriolytic effect of membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa on other bacteria including pathogens: conceptually new antibiotics. J Bacteriol, 1996. 178(10): p. 2767-74.

70. Kashima, A., Inoue, Y., Sugio, S., Maeda, I., Nose, T. and Shimohigashi, Y. X-ray crystal structure of a dipeptide-chymotrypsin complex in an inhibitory interaction. Eur J Biochem, 1998. 255(1): p. 12-23.

71. Khan, A.R. and James, M.N. Molecular mechanisms for the conversion of zymogens to active proteolytic enzymes. Protein Sci, 1998. 7(4): p. 815-36.

72. Khan, S.R., Mavrodi, D.V., Jog, G.J., Suga, H., Thomashow, L.S. and Farrand, S.K. Activation of the phz operon of Pseudomonas fluorescens 2-79 requires the LuxR homolog

73. PhzR, N-(3-OH-Hexanoyl)-L-homoserine lactone produced by the Luxl homolog Phzl, and a cis-acting phz box. J Bacteriol, 2005. 187(18): p. 6517-27.

74. Kilic-Ekici, O. and Yuen, G.Y. Induced Resistance as a Mechanism of Biological Control by Lysobacter enzymogenes Strain C3. Phytopathology, 2003. 93(9): p. 1103-10.

75. Kim, E.S., Hong, H.J., Choi, C.Y. and Cohen, S.N. Modulation of actinorhodin biosynthesis in Streptomyces lividans by glucose repression of afsR2 gene transcription. J Bacteriol, 2001. 183(7): p. 2198-203.

76. Kok, J., Leenhouts, K.J., Haandrikman, A.J., Ledeboer, A.M. and Venema, G. Nucleotide sequence of the cell wall proteinase gene of Streptococcus cremoris Wg2. Appl Environ Microbiol, 1988. 54(1): p. 231-8.

77. Kok, J., van Dijl, J.M., van der Vossen, J.M. and Venema, G. Cloning and expression of a Streptococcus cremoris proteinase in Bacillus subtilis and Streptococcus lactis. Appl Environ Microbiol, 1985. 50(1): p. 94-101.

78. Kok, J. and Venema, G. Genetics of proteinases of lactic acid bacteria. Biochimie, 1988. 70(4): p. 475-88.

79. Konig, C., Eulberg, D., Groning, J., Lakner, S., Seibert, V., Kaschabek, S.R. and Schlomann, M. A linear megaplasmid, pi CP, carrying the genes for chlorocatechol catabolism of Rhodococcus opacus 1CP. Microbiology, 2004. 150(Pt 9): p. 3075-87.

80. Kostakioti, M., Newman, C.L., Thanassi, D.G. and Stathopoulos, C. Mechanisms of protein export across the bacterial outer membrane. J Bacteriol, 2005.187(13): p. 4306-14.

81. Koster, M., Bitter, W. and Tommassen, J. Protein secretion mechanisms in Gramnegative bacteria. Int J Med Microbiol, 2000. 290(4-5): p. 325-31.

82. Krzeslak, J., Braun, P., Voulhoux, R., Cool, R.H. and Quax, W.J. Heterologous production of Escherichia coli penicillin G acylase in Pseudomonas aeruginosa. J Biotechnol, 2009. 142(3-4): p. 250-8.

83. Kuehn, M.J. and Kesty, N.C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes Dev, 2005. 19(22): p. 2645-55.

84. Kulaev, I.S., Stepnaya, O.A., Tsfasman, I.M., Tchermenskaja, T.S., Ledova, L.A., Zubrizkaja, L.G. and Akimenko, V.K.: Bacteriolytic complex, method for producing said complex and strain for carrying out said method. (2006).

85. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

86. Lee, J.W., Im, W.T., Kim, M.K. and Yang, D.C. Lysobacter koreensis sp. nov., isolated from a ginseng field. Int J Syst Evol Microbiol, 2006a. 56(Pt 1): p. 231-5.

87. Li, S., Norioka, S. and Sakiyama, F. Purification, staphylolytic activity, and cleavage sites of alpha-lytic protease from Achromobacter lyticus. J Biochem, 1997. 122(4): p. 772-8.

88. Likhosherstov, L.M., Senchenkova, S.N., Knirel, Y.A., Shashkov, A.S., Shibaev, V.N., Stepnaya, O.A. and Kulaev, I.S. Structure of an acidic polysaccharide present in the bacteriolytic complex lysoamidase. FEBS Lett, 1995. 368(1): p. 113-6.

89. Liu, S.L., Hessel, A. and Sanderson, K.E. Genomic mapping with I-Ceu I, an intron-encoded endonuclease specific for genes for ribosomal RNA, in Salmonella spp., Escherichia coli, and other bacteria. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(14): p. 6874-8.

90. Mace, J.E. and Agard, D.A. Kinetic and structural characterization of mutations of glycine 216 in alpha-lytic protease: a new target for engineering substrate specificity. J. Mol. Biol., 1995. 254(4): p. 720-36.

91. Mahillon, J. and Chandler, M. Insertion sequences. Microbiol Mol Biol Rev, 1998. 62(3): p. 725-74.

92. Markham, N.R. and Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol. Biol., 2008. 453(p. 3-31.

93. McBroom, A.J. and Kuehn, M.J. Release of outer membrane vesicles by Gram-negative bacteria is a novel envelope stress response. Mol Microbiol, 2007. 63(2): p. 545-58.

94. Mclver, K.S., Kessler, E., Olson, J.C. and Ohman, D.E. The elastase propeptide functions as an intramolecular chaperone required for elastase activity and secretion in Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol, 1995. 18(5): p. 877-89.

95. Mergulhao, F.J., Summers, D.K. and Monteiro, G.A. Recombinant protein secretion in Escherichia coli. Biotechnol Adv, 2005. 23(3): p. 177-202.

96. Michel-Briand, Y. and Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie,2002. 84(5-6): p. 499-510.

97. Muranova, T.A., Krasovskaya, L.A., Tsfasman, I.M., Stepnaya, O.A. and Kulaev, I.S. Structural investigations and identification of the extracellular bacteriolytic endopeptidase LI from Lysobacter sp. XL1. Biochemistry (Mosc), 2004. 69(5): p. 501-5.

98. Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. and Chin, J.W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol, 2008. 4(4): p. 232-4.

99. Newnham, E., Chang, N. and Taylor, D.E. Expanded genomic map of Campylobacter jejuni UA580 and localization of 23S ribosomal rRNA genes by I-Ceul restriction endonuclease digestion. FEMS Microbiol Lett, 1996.142(2-3): p. 223-9.

100. Novick, R.P. and Brodsky, R. Studies on plasmid replication. I. Plasmid incompatibility and establishment in Staphylococcus aureus. J. Mol. Biol., 1972. 68(2): p. 285-302.

101. Nudler, E. and Gottesman, M.E. Transcription termination and anti-termination in E. coli. Genes Cells, 2002. 7(8): p. 755-68.

102. Oldham, M.L., Davidson, A.L. and Chen, J. Structural insights into ABC transporter mechanism. Curr Opin Struct Biol, 2008. 18(6): p. 726-33.

103. Olson, M.O., Nagabhushan, N., Dzwiniel, M., Smillie, L.B. and Whitaker, D.R. Priaary structure of alpha-lytic protease: a bacterial homologue of the pancreatic serine proteases. Nature, 1970. 228(5270): p. 438-42.

104. Page, M.J. and Di Cera, E. Serine peptidases: classification, structure and function. Cell Mol Life Sci, 2008. 65(7-8): p. 1220-36.

105. Paget, M.S. and Helmann, J.D. The sigma70 family of sigma factors. Genome Biol.,2003. 4(1): p. 203.

106. Pohlner, J., Halter, R., Beyreuther, K. and Meyer, T.F. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease. Nature, 1987. 325(6103): p. 458-62.

107. Polgar, L. The catalytic triad of serine peptidases. Cell Mol Life Sci, 2005. 62(19-20): p. 2161-72.

108. Pugsley, A.P. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol Rev, 1993. 57(1): p. 50-108.

109. Raaijmakers, J.M. and Weller, D.M. Natural plant protection by 2,4-diacetylphloroglucinol-producing Pseudomonas spp. in take-all decline soils. Mol. Plant-Microbe Interact., 1998. ll(p. 144-152.

110. Raaijmakers, J.M., Weller, D.M. and Thomashow, L.S. Frequency of Antibiotic-Producing Pseudomonas spp. in Natural Environments. Appl Environ Microbiol, 1997. 63(3): p. 881-7.

111. Rao, M.B., Tanksale, A.M., Ghatge, M.S. and Deshpande, V.V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol Mol Biol Rev, 1998. 62(3): p. 597635.

112. Rawlings, N.D. and Barrett, A.J. Evolutionary families of peptidases. Biochem J, 1993. 290 (Pt l)(p. 205-18.

113. Rawlings, N.D. and Barrett, A.J. Families of serine peptidases. Methods Enzymol., 1994. 244(p. 19-61.

114. Rawlings, N.D., Barrett, A.J. and Bateman, A. MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res, 2010. 38(Database issue): p. D227-33.

115. Rawlings, N.D., Barrett, A.J. and Bateman, A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Res, 2012. 40(Database issue): p. D343-50.

116. Recsei, P.A., Grass, A.D. and Novick, R.P. Cloning, sequence, and expression of the lysostaphin gene from Staphylococcus simulans. Proc Natl Acad Sci USA, 1987. 84(5): p. 1127-31.

117. Retallack, D.M., Jin, H. and Chew, L. Reliable protein production in a Pseudomonas fluorescens expression system. Protein Expr Purif, 2012. 81(2): p. 157-65.

118. Retallack, D.M., Schneider, J.C., Mitchell, J., Chew, L. and Liu, H. Transport of heterologous proteins to the periplasmic space of Pseudomonas fluorescens using a variety of native signal sequences. Biotechnol Lett, 2007. 29(10): p. 1483-91.

119. Riley, M.A. and Wertz, J.E. Bacteriocin diversity: ecological and evolutionary perspectives. Biochimie, 2002a. 84(5-6): p. 357-64.

120. Riley, M.A. and Wertz, J.E. Bacteriocins: evolution, ecology, and application. Annu Rev Microbiol, 2002b. 56(p. 117-37.

121. Roberts, J.W., Shankar, S. and Filter, J.J. RNA polymerase elongation factors. Annu. Rev. Microbiol., 2008. 62(p. 211-33.

122. Romanenko, L.A., Uchino, M., Tanaka, N., Frolova, G.M. and Mikhailov, V.V. Lysobacter spongiicola sp. nov., isolated from a deep-sea sponge. Int J Syst Evol Microbiol, 2008. 58(Pt 2): p. 370-4.

123. Ryazanova, L.P., Stepnaya, O.A., Suzina, N.E. and Kulaev, I.S. Antifungal action of the lytic enzyme complex from Lysobacter sp. XL 1. Proc. Biochem., 2005. 40(p. 557-564.

124. Saitou, N. and Nei, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol, 1987. 4(4): p. 406-25.

125. Sambrook, J., Fritch, E.F. and Maniatis, T.: Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab. Press., N.Y (1989).

126. Sandkvist, M. Biology of type II secretion. Mol Microbiol, 2001. 40(2): p. 271-83.

127. Schleifer, K.H. and Kandler, O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bacteriol Rev, 1972. 36(4): p. 407-77.

128. Schwartz, D.C. and Cantor, C.R. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell, 1984. 37(1): p. 67-75.

129. Schweizer, H.P. Allelic exchange in Pseudomonas aeruginosa using novel ColEl-type vectors and a family of cassettes containing a portable oriT and the counter-selectable Bacillus subtilis sacB marker. Mol Microbiol, 1992. 6(9): p. 1195-204.

130. Serkina, A.V., Shevelev, A.B. and Chestukhina, G.G. Structure and functions of bacterial proteinase precursors. Bioorg Khim, 2001. 27(5): p. 323-46.

131. Severinov, K., Semenova, E., Kazakov, A., Kazakov, T. and Gelfand, M.S. Low-molecular-weight post-translationally modified microcins. Mol Microbiol, 2007. 65(6): p. 138094.

132. Shinde, U.P., Liu, J.J. and Inouye, M. Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones. Nature, 1997. 389(6650): p. 520-2.

133. Sidhu, S.S., Kalmar, G.B., Willis, L.G. and Borgford, T.J. Streptomyces griseus protease C. A novel enzyme of the chymotrypsin superfamily. J Biol Chem, 1994. 269(31): p. 20167-71.

134. Sidhu, S.S., Kalmar, G.B., Willis, L.G. and Borgford, T.J. Protease evolution in Streptomyces griseus. Discovery of a novel dimeric enzymes. J Biol Chem, 1995. 270(13): p. 7594-600.

135. Silen, J.L. and Agard, D.A. The alpha-lytic protease pro-region does not require a physical linkage to activate the protease domain in vivo. Nature, 1989. 341(6241): p. 462-4.

136. Silen, J.L., Frank, D., Fujishige, A., Bone, R. and Agard, D.A. Analysis of prepro-alpha-lytic protease expression in Escherichia coli reveals that the pro region is required for activity. J Bacteriol, 1989. 171(3): p. 1320-5.

137. Silen, J.L., McGrath, C.N., Smith, K.R. and Agard, D.A. Molecular analysis of the gene encoding alpha-lytic protease: evidence for a preproenzyme. Gene, 1988. 69(2): p. 237-44.

138. Simon, R., Priefer, U. and Puhler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram-negative bacteria. Biotechnology, 1983. l(p. 784-791.

139. Simonen, M. and Palva, I. Protein secretion in Bacillus species. Microbiol Rev, 1993. 57(1): p. 109-37.

140. Sinoquet, C., Demey, S. and Braun, F. Large-scale computational and statistical analyses of high transcription potentialities in 32 prokaryotic genomes. Nucleic Acids Res., 2008. 36(10): p. 3332-40.

141. Smillie, L.B. and Whitaker, D.R. Amino acid sequence around the histidine residue of the alpha-lytic protease of Sorangium sp., a bacterial homolog of the pancreatic serine proteases. J Am Chem Soc, 1967. 89(13): p. 3350-2.

142. Sohl, J.L., Jaswal, S.S. and Agard, D.A. Unfolded conformations of alpha-lytic protease are more stable than its native state. Nature, 1998. 395(6704): p. 817-9.

143. Sohl, J.L., Shiau, A.K., Rader, S.D., Wilk, B.J. and Agard, D.A. Inhibition of alpha-lytic protease by pro region C-terminal steric occlusion of the active site. Biochemistry, 1997. 36(13): p. 3894-902.

144. Stahl, M.L. and Ferrari, E. Replacement of the Bacillus subtilis subtilisin structural gene with an In vitro-derived deletion mutation. J Bacteriol, 1984. 158(2): p. 411-8.

145. Stepnaya, O.A., Begunova, E.A., Tsfasman, I.M. and Kulaev, I.S. Bacteriolytic enzyme lysoamidase preparation: purification and some properties of bacteriolytic peptidase LI. Biochemistry (Mosc), 1996a. 61(p. 477-482.

146. Stepnaya, O.A., Kudryavtseva, A.I., Severin, A.I., Krupyanko, V.l., Kozlovsky, A.G. and Kulaev, I.S. Some properties of bacteriolytic protease L2. Prikl. Biokhim. Mikrobiol. , 1992. 28(5): p. 666-673

147. Stepnaya, O.A., Severin, A.I., Krupyanko, V.l. and Kulaev, I.S. Purification and some properties of neutral phosphatase of the enzyme preparation of lysoamidase isolated from Pseudomonadaceae bacteria. Biokhimiya (Mose) 1986a. 51(4): p. 684-690

148. Stepnaya, O.A., Severin, A.I. and Kulaev, I.S. Some physico-chemical properties of lytic proteinase L2 of the enzyme preparation lysoamidase isolated from bacteria of Pseudomonadaceae family. Biokhimiya (Mose), 1986b. 51(p. 909-915

149. Stepnaya, O.A., Tsfasman, I.M., Chaika, I.A., Muranova, T.A. and Kulaev, I.S. Extracellular yeast-lytic enzyme of the bacterium Lysobacter sp. XL 1. Biochemistry (Mose),2008. 73(3): p. 310-4.

150. Stepnaya, O.A., Tsfasman, I.M., Logvina, I.A., Ryazanova, L.P., Muranova, T.A. and Kulaev, I.S. Isolation and characterization of a new extracellular bacteriolytic endopeptidase of Lysobacter sp. XL1. Biochemistry (Mose), 2005. 70(9): p. 1031-7.

151. Stroud, R.M., Kossiakoff, A.A. and Chambers, J.L. Mechanisms of zymogen activation. Annu Rev Biophys Bioeng, 1977. 6(p. 177-93.

152. Studier, F.W. and Moffatt, B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., 1986. 189(1): p. 113-30.

153. Swartz, J.R. Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. Curr Opin Biotechnol, 2001. 12(2): p. 195-201.

154. Thomashow, L.S. and Weller, D.M. Role of a phenazine antibiotic from Pseudomonas fluorescens in biological control of Gaeumannomyces graminis var. tritici. J Bacteriol, 1988. 170(8): p. 3499-508.

155. Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D.G. The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res, 1997. 25(24): p. 4876-82.

156. Toda, T. and Itaya, M. I-Ceul recognition sites in the rrn operons of the Bacillus subtilis 168 chromosome: inherent landmarks for genome analysis. Microbiology, 1995. 141 ( Pt 8)(p. 1937-45.

157. Tsai, C.S., Whitaker, D.R., Jurasek, L. and Gillespie, D.C. Lytic enzymes of Sorangium sp. Action of the alpha- and beta-lytic proteases on two bacterial mucopeptides. Can J Biochem, 1965. 43(12): p. 1971-83.

158. Van de Peer, Y. and De Wächter, R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput Appl Biosci, 1994. 10(5): p. 569-70.

159. Vasilyeva, N.V., Tsfasman, I.M., Suzina, N.E., Stepnaya, O.A. and Kulaev, I.S. Secretion of bacteriolytic endopeptidase L5 of Lysobacter sp. XL1 into the medium by means of outer membrane vesicles. FEBS J, 2008. 275(15): p. 3827-35.

160. Viarre, V., Cascales, E., Ball, G., Michel, G.P., Filloux, A. and Voulhoux, R. HxcQ liposecretin is self-piloted to the outer membrane by its N-terminal lipid anchor. J Biol Chem,2009. 284(49): p. 33815-23.

161. Vieira, J. and Messing, J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 1982. 19(3): p. 259-68.

162. Vincent, M.N., Harrison, L.A., Brackin, J.M., Kovacevich, P.A., Mukerji, P., Weiler, D.M. and Pierson, E.A. Genetic analysis of the antifungal activity of a soilborne Pseudomonas aureofaciens strain. Appl Environ Microbiol, 1991. 57(10): p. 2928-34.

163. Vivian, A., Murillo, J. and Jackson, R.W. The roles of plasmids in phytopathogenic bacteria: mobile arsenals? Microbiology, 2001. 147(Pt 4): p. 763-80.

164. Volonte, F., Piubelli, L. and Pollegioni, L. Optimizing HIV-1 protease production in Escherichia coli as fusion protein. Microb Cell Fact, 2011. 10(p. 53.

165. Walsh, K.A., Kauffman, D.L., Kumar, K.S. and Neurath, H. On the Structure and Function of Bovine Trypsinogen and Trypsin. Proc Natl Acad Sei USA, 1964. 51(p. 301-8.

166. Walsh, K.A. and Neurath, H. Trypsinogen and Chymotrypsinogen as Homologous Proteins. Proc Natl Acad Sei USA, 1964. 52(p. 884-9.

167. Weller, D.M., Howie, W.J. and Cook, R.J. Relationship between in vitro inhibition of Gauemannomyces graminis var. tritici and suppression of take-all of wheat by fluorescent pseudomonads. Phytopathology 1988. 78(p. 1094-1100.

168. Weon, H.Y., Kim, B.Y., Kim, M.K., Yoo, S.H., Kwon, S.W., Go, S.J. and Stackebrandt, E. Lysobacter niabensis sp. nov. and Lysobacter niastensis sp. nov., isolated from greenhouse soils in Korea. Int J Syst Evol Microbiol, 2007. 57(Pt 3): p. 548-51.

169. Whitaker, D.R., Cook, F.D. and Gillespie, D.C. Lytic enzymes of Sorangium sp. Some aspects of enzyme production in submerged culture. Can J Biochem, 1965. 43(12): p. 1927-33.

170. Wiederanders, B. The function of propeptide domains of cysteine proteinases. Adv Exp Med Biol, 2000. 477(p. 261-70.

171. Wong, C.F., Salleh, A.B., Basri, M. and Abd Rahman, R.N. Organic-solvent stability of elastase strain K overexpressed in an Escherichia-Pseudomonas expression system. Biotechnol Appl Biochem, 57(1): p. 1-7.

172. Wong, M.S., Wu, S., Causey, T.B., Bennett, G.N. and San, K.Y. Reduction of acetate accumulation in Escherichia coli cultures for increased recombinant protein production. Metab Eng, 2008.10(2): p. 97-108.

173. Wong, S.L. and Doi, R.H. Determination of the signal peptidase cleavage site in the preprosubtilisin of Bacillus subtilis. J Biol Chem, 1986. 261(22): p. 10176-81.

174. Wright, C.S., Alden, R.A. and Kraut, J. Structure of subtilisin BPN' at 2.5 angstrom resolution. Nature, 1969. 221(5177): p. 235-42.

175. Yanisch-Perron, C., Viera, J. and Messing, J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 1985. 33: p. 103119.

176. Zaitsev, E.N., Zaitseva, E.M., Bakhlanova, I.V., Gorelov, V.N. and Kuz'min, N.P. Cloning and characteristics of recA gene in Pseudomonas aeruginosa. Genetika, 1986. 22(11): p. 2721-7.

177. Zhang, X.X., Kosier, B. and Priefer, U.B. Symbiotic plasmid rearrangement in Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39SM. J Bacteriol, 2001. 183(6): p. 2141-4.

178. Zhu, X.L., Ohta, Y., Jordan, F. and Inouye, M. Pro-sequence of subtilisin can guide the refolding of denatured subtilisin in an intermolecular process. Nature, 1989. 339(6224): p. 483-4.

179. Zuckerkandl, E. and Pauling, L. Molecules as documents of evolutionary history. J Theor Biol, 1965. 8(2): p. 357-66.

180. Антонов, B.K., Химия протеолиза. Издательство: Наука, Москва (1991), с. 504.

181. Дейвиса, П.р., Анализ генома. Методы. Издательство: Мир, Москва (1990), с. 246.

182. Кулаев Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине. Соросовский образовательный журнал, 1997. 3.

183. Насонова, Е.С. Пульс-электрофорез: теория метода, инструментальный арсенал и области применения. Цитология, 2008. 50(11): р. 927-935.

Информация о работе

Лаптева, Юлия Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Клонирование и экспрессия генов литических эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp. XL1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы