Бактериолитические ферменты микроорганизмов: теоретические и прикладные аспекты

Северин, Анатолий Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бактериолитические ферменты микроорганизмов: теоретические и прикладные аспекты
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Бактериолитические ферменты микроорганизмов: теоретические и прикладные аспекты"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

РГ8 ОД

На правах рукописи УДК 577.152.321:577.152.34

СЕВЕРИН АНАТОЛИЙ ИВАНОВИЧ

БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ: ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ

(специальность 03.00.04 - биохимия)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Пущино - 1993

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор биологических наук доктор химических наук

И.Б. Наумова Д.Н. Островский В.Н. Шибаев

Ведущее учреждение: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов и растений РАН

в 14 час 30 мин на заседании Специализированного Совета при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН г. Пущино Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Защита диссертациии состоится

1993г.

Диссертация разослана

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

В.Ы.Вагабов

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

Общая характеристика работы: 2

Актуальность проблемы • 2

Цель и задачи исследования 4

Научная новизна 4

Основные положения, выносимые на защиту 5

Научно-практическое значение 7

Апробация работы 7

Глава 1. Штериалы и методы 11 Глава 2. Бактериолитические ферменты, продуцируемые

культурой Pseudomonas lytica 15 Глава 3. Выделение и характеристика литической протеиназы

паразитической бактерии Micavibrio arimirandus 22

Глава 4. Бактершгитические ферменты бактерии Pseudomonas sp. 24

4.1. Выделение бакгериолитического комплекса лизоамидазы 24

4.2. Механизм гидролиза клеточных стенок Staphylococcus aureus лизоамидазным комплексом 25

4.3. Механизм гидролиза клеточных стенок Micrococcus

luteus лизоамидазным комплексом 36

4.4. Механизм гидролиза клеточных стенок Streptococcus pneumoniae лизоамидазным комплексом 40

4.5. Выделение и свойства компонентов лизоамидазного комплекса 49

4.6. Реконструкция лизоамидазного комплекса 54 Глава 5. Использование бактериологических ферментов в научных

исследованиях и медицине 59

5.1. Исследование первичной структуры пелтидогликана Eubacterium nodatum и Eubacterium alactolyticum 59

5.2. Получение протопластов Staphylococcus aureus с помощью лизоамидазного комплекса 77

5.3. Исследование структуры пептидоглккана DD-карбокси-пепгидазяых мутантов Streptococcus pneumoniae 82

5.4. Разработка лекарственного препарата на основе бактериолитического комплекса лизоамидазы 87

Заключение 88

Выводы 91

Основные публикации по теме диссертации 93

ОБЩАЯ XAPAKTEPÍÍCTJÍRA РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Литические ферменты, разрувааде клеточные стенки бактерий, грибов к вистах растений, привлекают пристальное внимание ученых. С развитием работ по ферментативному лизису клеточных стенок ьикрооргашзшв связан достигнутый к настоящему времени прогресс в изучении этих структур и в разработке методов генетической инженерии.

Первым ферментом, обладающим литическим действием на клетки микроорганизмов, был лиаоцим, открытый Флемингом в начале двадцатых годов (Fleming, Allison, 1922).

В начале пятидесятых годов появились первые сообщения о бактериологических ферментах бактериального происхождения (fcbCarty, 1952). В настоящее время можно достаточно определённо утверждать, что данные ферменты обнаружены у всех изученных микроорганизмов (Rogers, 1979).

Есе известные литические ферменты можно разбить на два класса по месту их локализации и функции. К первому классу относятся ав-толизины, локализованные внутри бактериальной клетки. Они играют важную роль в жизнедеятельности бактерий (Захарова, Павлова, 1985; Rogers et. al 1980). ГЬкаэаяо участие автолизинов в процессах гидролиза и биосинтеза клеточных стенок (Chatterjee et al., 1976; Hayashi et al., 1931), прорастании спор (Ando, 1979; Goirbas, Labbe, 1985; Foster, Johnstone, 1987), роста и деления клеток (Ayusawa et al., 1975; Rogers, 1970), определении проницаемости клеток к ряду макромолекул и прежде всего ДНК (Ranhand et al., 1971; Seto, Tomasz,1975), чувствительности к антибиотикам (Rogers, Fcrsberg, 1970). В клетке в норме существует равновесие между ферментами, разрушающими и синтезирующими клеточную стенку. Встраивание.вновьсинтезированного материала в клеточную стенку происходит после гидролиза определенных связей в молекуле пепти-догдикана. Процессы лизиса и биосинтеза происходят одновременно в течение роста клетки. И только на поздних стадиях развития, когда биосинтетические процессы затухают, а активность литических ферментов остается на прежнем уровне или даже возрастает, происходит автолиз клетки (Goodell, Tomasz, 1980).

Ко второму классу можно отнести внеклеточные литические фер-

менты. Их биологическая роль, по-видимому, заключается в том, что микроорганизмы, синтезирующие и секретирущие такие ферменты в среду, имеют преимущество перед остальными микроорганизмами прежде всего в источниках питания. Разрушая клетки других шпероорга-низмов, бактерия-продуцент литических ферментов использует аминокислоты, углеводы и другие компоненты лизированной клетки для собственных нулд. В настоящее время данная группа ферментов интенсивно исследуется с точки зрения возможности их практического использования.

Литические ферменты нашли широкое применение для получения протопластов из бактерий (Inouye et al., 1979; Yokogawa et al,. 1975) и дрокяей (Yasurstsu et al., 19665, изучения структуры клеточных стенок бактерий (Jonga, Tonasz, 1993), в генноинженерных работах при выделении ДНК (Щзкина и др., 1983), выделении антигенов (Hamda et al. , 1932) и фрагментов клеточных стенок, обладавши иммуностимулирующей ( Kawata et al 19S4) и противоопухолевой активностями С Pap и др. , 1985), а такяе других компонентов микробной клетки, в частности, белков, липвдов, антибиотиков, пигментов и полисахаридов (Andrews, Asenjo, 1987).

Перспективной областью применения бактериологических ферментов является медицина Епэ в 1064 году было проведено успешное лечение лизостафином мыяей, заражённых патогенными стафилококками (Schuardt, Schindler, 1964). Было показано, что лизостафин в комбинации с рядом антибиотиков и поверхностноактивньк вешэств может быть использован при лечении маститов у животных (Blackburn, Pollack, 1990). Бактериолитические ферменты могут быть использованы при лечении и профилактике кариеса (Yoshimura et al, 1976).

Таким образом, интерес исследователей к поиску новых бактерио-литических ферментов определяется как их ролью в жизнедеятельности бактерий, так и возможностями их практического использования.

В 1975 году в ИВШ РАН под руководством академика F. К. Скрябина, чл. корр. РАН II С. Кулаева и к. б. н. Е А. Ламбиной были начаты исследования бактериолитических ферментов микроорганизмов. Были выделены бактерии, продуцирующие бактериолитические ферменты, и оценена их способность лидировать грашолокительные и грам-отрицательные микроорганизмы.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось выделение и изучение бактериолитических ферментов микроорганизмов для использования их в фундаментальных научных исследованиях структуры клеточных стенок бактерий и медицине. Для достижения указанной цели в работе решались следующие основные задачи:

1. Выделение и характеристика бактериолитических ферментов;

2. Исследование механизма гидролиза пептидогликана клеточных стенок бактерий выделенными багегериолктическими ферментами;

3. Изучение первичной структуры клеточных стенок бактерий с использованием бактериолитических ферментов известной специфичности;

4. Выяснение возможности получения функционально активных протопластов из клеток Staphylococcus aureus с помощью выделенных бактериолитических ферментов;

5. Исследование возможности создания лекарственного препарата на основе бактериолитических ферментов для лечения ран, инфицированных патогенными микроорганизмами.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые охарактеризованы бактериолитические ферменты Pseudomonas lytica, Micavibrio admirandus и Pseudomonos sp. :

- показано, что основными бактериологическими ферментами P. lytica и М admirandus являются лктические протеиназы;

- установлено, что фермент, выделенный из фильтрата культу-ральной жидкости P. lytica, гидролизовал пептидогликан клеточных стенок S. aureus по связям в пентаглициновом мостике;

- определено, что штамм Pseudoironas sp. синтезировал и секре-тировал в культуральную жидкость комплекс бактериолитических ферментов, названный лиаоамидазой. Биосинтез лизоамидазы может осуществляться как свободными, так и иммобилизованными в полиакрила-мидный гель клетками;

- выявлено, что в состав лизоамидазы, кроме бактериолитических ферментов (литической протеиназы, мурамидазы, ацетшшура-мил-аланин амидазы), входят металлопротеиназа, нейтральная фосфа-таза и полисахарид. Изучен вклад каждого компонента в суммарную бактериолитическую активность лизоамидазы;

- установлено, что лизоамидаза лизировала клетки стафилокок-

ксв, в том числе устойчивые к антибиотикам. Только устойчивые к пенициллину штаммы Streptococcus pneumonias гидролизовались лизо-амидазой. Такой характер действия лизоамидазы на клетки S.pneumoniae связан с изменениями в структуре пептидогликана клеточных стенок при развитии устойчивости к пенициллину, а именно, с появлением пептидов, несущих связи, которые гидролизовались зн-допептидазой лизоамидазы.

С использованием бактериолитических ферментов исследована перЕичпая структура пептидогликана клеточных стенок двух штаммов бактерий рода Eubacterlum и ГО-карбокеипептидазного мутанта S.pneumoniae:

- установлено, что пептидогликан птоима E.nodatum относится к новому типу - А5v, а пептидогликан штамма Е. alactolyticum - к А1т типу;

- обнаружено, что мутанты S.pneumoniae, лишённые Ш-карбокси-пептидавы, имеют изменённую структуру пептидогликана. В пептидог-ликзне мутантов обнаружены пептиды, в состав которых входит пептидная субъединица, образованная пентапептидом.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Новый вид бактерии рода Pseudomonas - P.lytlca синтезирует и секретирует в ростовую среду бактериолитический фермент - лити-ческую протеиназу. Фермент способен ливировать клетки бактерий рода Staphylococcus и Spreptococcus. Биосинтез литической протеина-аы контролируется по механизму катаболитной репрессии. Внесение в ростовую среду убитых клеток стафилоюткка приводит к двукратному увеличению выхода фермента. Литическая протеиназа гидролизует пептидогликан клеточных стенок S.aureus по связям в пентаглицино-вом мостике.

2. Охарактеризована бактериолитическая система паразитической бактерии Micavibrio admlrandus. Очищена до гомогенного состояния литическая протеиназа, определены основные физико-химические свойства фермента.

3. Из культуральной жидкости бактерии Pseudomonas sp. выделен

комплекс бактериолитических и прстеолитичееких ферментов и полисахарида, получивший название лизоамидаза. Лиаоамидаза лизировала клетки стафилококков независимо от их устойчивости к антибиотикам. Ферменты лиаоамидазного комплекса гидролизовали пептидогли-кан клеточных стенок S.aureus по связям, образованным двумя глицинами, аланином и мурамовой кислотой, мурамовой кислотой и ацетилглшкозамином.

Только устойчивые к пенициллину штаммы S.pneumoniae гидролизо-валиеь лизоамидаеой, что связано с изменением первичной структуры пептидной части пептидогликана при развитии устойчивости к пенициллину. Появление в пептидогликане устойчивых к пенициллину штаммов разветвлённых пептидов, которые являлись субстратом эндо-пептидааы лиз'оамидазы, приводило в целом к гидролизу этих штаммов.

4. Из лизоамидазы выделены, очищены до электрофоретически гомогенного состояния и охарактеризованы металлопротеиназа, лити-ческая протеиназа Л2, нейтральная фосфатаза. Кроме того, из лизоамидазы выделены: полисахарид и литическая фракция JI1, состоящая из мурамидавы, протеиназы и литического фермента, предположительно, эндопептидазы. Реконструкция лизоамидазы из полученных ферментов показала, что только литическая протеиназа Л2 и литическая фракция JI1 вносят вклад в суммарную бактериолитическую активность лизоамидазы. Полисахарид оказывал стабилизирующее действие как на отдельные ферменты, так и на бактериолитическую активность реконструированного препарата.

5. Логические ферменты являются важным инструментом при исследовании структуры клеточных стенок бактерий. Это было продемонстрировано на примере изучения первичной структуры клеточных стенок двух штаммов бактерий рода Eubacterlum: E.nodatum и E.alafitolytlcum с использованием литического комплекса, выделенного из бактерии Strepomyces albus G. Структура пептидогликана Е. nodatum содержит ъ межпептидном мостике пептид L-Ala-L-Ala-L-Orn, который соединён с орнитином, находящимся в третьем положении одной пептидной субъединицы Ala-Slu(Sly)-Orn-Ala, и аланином в четвертом положении другой пептидной субъединицы. В структуре пептидогликана Е.alactolyticum две пептидные субъединицы Ala-Glu(Gly)-mA2Ptn-Ala непосредственно соединены между собой.

С использованием литического фермента - амидааы S.pneumoniae исследована первичная структура пептидогликана DD-карбоксипепти-дааного мутанта S.pneumoniae, несущего дефект в пеницидлинсвязы-вагацем белке 3. Впервые показано, что пептидогликан в отсутствии нативного пенициллинсвязыващего бедка 3 претерпевает изменения, связанные с накоплением пептидов, в которых пептидная субъединица образована пятью аминокислотами; четвёртое и пятое положения в пептидной субьединице заняты D-аланином.

Научно-практическое значение. Полученные результаты являются частью работы по созданию фундаментальных основ получения бакте-риолитических ферментов с целью их использования в медицине. На основе бактериолитического комплекса лизоамидазы создан лекарственный препарат для лечен::я ран, ожогов и других повреждений кожи, твёрдых и мягких тканей ротовой полости. Созданный препарат не имеет аналогов. Эффективность лечебного действия препарата связана с его составом: протеолитические ферменты очищает рану от некротических масс, бактериодитические ферменты лизиругат находящиеся в ране грамполаяительные патогенные микроорганизмы, полисахарид не только стабилизирует комплекс , ко также, по-видимому, ускоряет регенерацию тканей. С 1989 года лизоамидаза производится в промышленном масштабе и используется в медицинской практике.

Другое возможное использование лизоамидазы связано с её протео-литической активностью. Показано, что лизоамидаза может заменить трипсин при мацерации тканей и отделении растущего монослоя клеток от стекла при работах, проводимых на культуре клеток. Такое действие лизоамидазы связано с входящей в её состав металлопро-теиназой (авт.свид. 1594214).

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на всесоюзных и международных конференциях: Всесоюзном совещании по медицинской энзимологии (Алма-Ата, 1983), Всесоюзной конференции по биосинтезу ферментов микроорганизмами (Кобулети, 1986; Ташкент, 1988), Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), Международном симпозиуме по внеклеточным ферментам микроорганизмов (Бехин, 1986), Всесоюзном симпозиуме по медицинской

энзимологии (Махачкала, 1986), Всесоюзной конференции "Раны и раневая инфекция" (Москва, 1966), Мевдународном симпозиуме по сверхпродукции микробных продуктов (Чешские Будиёвицы, 1988), Лейпцигском симпозиуме по биотехнологии (Лейпциг, 1988), Всесоюзной конференции по регуляции микробного метаболизма (Пущино, 1989), Мевдународном симпозиуме по молекулярной организации биологических структур (Москва, 1989), Международной конференции по биологически активным природным продуктам (Варна, 1989), Международной конференции по антимикробной активности неантибиотиков (Копенгаген, 1990), Европейском конгрессе по биотехнологии (Копенгаген, 1990), Конференции американского общества микробиологов (Новый Орлеан, 1992).

Принятые в работе сокращения: МИК - минимальная ингибирующая концентрация, БВК - белково-витаминный концентрат, МПБ - мясо-пеп-тонный бульон, ВЯИ - высокоразрешающая жидкостная хроматография, ТФК - трифторуксусная кислота, ТХУ - трихлоруксусная кислота, ТХК - .тейхоевая кислота, ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота, ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид, пЖВ - пара-хлормеркурийбенао-ат, т-Агрт - мезо-диаминопимелиновая кислота, ЛЕ - бактериолити-ческая активность, НЕ - протеолитическая активность.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 62 работы (38 статей, 22 тезисов), получено б авторских свидетельств.

Благодарности. Особую благодарность автор выражает руководителю проекта "Создание научных основ получения бактериолитических ферментов с целью их использования в медицине" чл. корр. АН РАН профессору И.С. Кулаеву за постоянную поддержку и чуткое руководство.

Автор выражат глубокую благодарность коллегам, принимавшим участие в выполнении различных этапов данной работы: к.б.н. O.A. Степной, к.б.н. Г.В. Абрамочкину, д.б.н. В.И. Крупянко, д.б.н. А.Г. Козловскому, д.б.н. A.B. Афиногеновой, к.б.н. Е.Л. Таусон,

к.т.н. В.А. Ежову, к.б.н. В.А. Ламбиной, к.б.н. М.В. Богданову, к.б.н. А.Я. Валиахметову, к.б.н. В.В. Петрову, к.б.н. А.Ю. Арин-басаровой, к.б.н. A.B. Прокопович, д.б.н. A.A. Селезнёвой, Л.А. Ледовой, З.С. Плотниковой, E.H. Ратнеру, О.В. Круглой, А.И. Кудрявцевой, а также К. Като и С. Какигучи - сотрудникам лаборатории микробиологии университета г. Огсаяма (Япония) и А. Томасу - зав. лабораторией микробиологии Рокфеллеровского университета, Нью-Йорк, (США) за плодотворное сотрудничество.

Искренняя благодарность и светлая память осталась от сотрудничества с к.б.н. М.А. Бобыком.

Огромная благодарность и признательность академидг Г.К. Скрябину - инициатору работ по созданию научных основ получения лекарственного препарата ливоамидааы.

Цитируемая литература

1. Захарова И.Я., Павлова И.Н., Литические ферменты микроорганизмов, 1985, Киев, Наукова думка, 215с.

2. Pap В.А., Ким Г.И., Коробкина О.Н., и др., Биотехнология, 1985, N4, с. 38-43.

3. ЩёкинаЕ.В., Григорьева С.П., Полумиенко А. Л., Прикл. биохим. микробиол., 1982, N8, с.240-243.

4. AndoY., J.Bacterol., 1979, 140, N1, p. 59-64.

5. Andrews В.A., Asenjo J.A., Trends In Biotechnology, 1987, N10, p. £73-277.

6. Ayusawa D., YonedaY., Yamana K. etal., J.Bacterid., 1975, 124, N1, p. 459-469.

7. Blackburn P., Pollack J., Europ. Pat. N 0359873, 1990.

8. Chatterjee A.N., Wong W., Young F.E. et al-, J.Bacterlol., 1976, 125, N3, p. 961-967.

9. Fleming A., Allison V.D., Brit. J. Exp. Path., 1922, 3, p.252-260.

10. Foster S.J., Johnstone K., Blochem., 1987, 242, N2, p. 573-579.

11. Gombas D.E., Labbe R.G., J. Sen. Microbiol., 1985, 131, p. 1487-1496.

12. Goodell W., Tomasz A., J. Bacterlol., 1980, 144, N3, p. 10091016.

13. Hamada S., Okahashi N.. Klmura S., et al., Japan. J. Med. Scl. Biol. 1982 , 35, N4, p. 171-181.

14. Hayashl K., Kasuml r. ,Kubo N.. Tsumura N.. Agr-. Biol. Chem., 1981, 45, N10, p. £289-2300.

15. Inouye M., Hamada S., Ooshima T. et al., Microbiol. Immunol., 1979, 23, N5, p.319-328.

16. Kawata S., Yokogawa K., Takahashl E. et al., Agrlc. Biol. Chem., 1984, 48, N7, p.1783-1793.

17. McCarty M., J. Exp. Med., 1952, 56, p. 569-580.

18. Ranhand J.M., Leonard C.6., Cole R.M., J.Bacterlol., 1971, 106, N1, p.257-268.

19. Rogers H.J., Bacterol. Rew. , 1970, 34, p.194-214.

20. Rogers H.J., Forsberg C.W., J. Bacterid., 1971, 108, N3, p. 1236-1243.

21. Rogers H.J., Perkins H.R., Ward J.B., Microbial cell walls and membranes, 1980, London, NY, (Chapman, Hall), 541p.

22. Schuhardt V.T., Schlndler C.A., Proc. Nat. Acad. Sol., 1S64., 51, p. 414-421.

23. Seto H., Tomasz A., J. Bacterlol., 1975, 121, N2, p. 344-353.

24. Yasumatsu K,, Ohno M., Fobarl. et al., J. Perm. Technol., 1966, 44, N11, p. 847-853. ■

£5. Yokogawa K., Kawata S., Takemura T. et al., Agr. Elol. Chem., 1975 , 39, N8, p. 1533-1543. • ■

26. YoshlmuraY., Yogawa'K., Kawata S., Pat USA N 3965869, 1976.

Глава 1. Материады и методы.

Условия культивирования штаммов. Культуру Pseudomonas sp. выращивали на среде, содержащей (г/л) глюкозу - 10, бактолептон -Б, ЕВК - 3, МагНР04-12Нг0 - 1,5, КН2РО4 - 0,35, хлористый натрий -0,35, Mg-S04'?H20 - 0,35, FeSQ4-7H20 - 0,05, pH 7,0. Максимальное накопление бактериолитичеких ферментов наблюдали в среде роста к 18- SO часам культивирования при 30°С (Ежов и др., 18389).

Клетки Eubacterlura nodaturn АТСС 33099 и Eubaeterlum alactoly-ticum АТСС 17927 выращивали на среде, содержащей brain heart Infusion broth (37 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л) и цистеин (0,5 г/л) при в течение 2 дней при анаэробных условиях в

смеси азота, водорода и углекислого газа (80:10:10 v/v). Клетки после центрифугирования при 8000xg 30 мин промывали 0,1 М фосфатным буфером (pH 7) и еодой и лиофильно высушивали. Выход составлял 6 г с 20л среды.

Клетки Staphylococcus aureus 209Р и Micrococcus luteus ВКМ В-1314 выращивали на мяео-пептонной среде при 37°С в течение 24 и 16 часов, соотвественно. Культуральную жидкость автоклавировали 30 мин при 1 атм. Клетки осаждали центрифугированием при SOOOxg, промывали водой и лиофильно высушивали.

Выделение ферментов ив лидоамидазы. Для выделения металлопро-теиназы 2 г лиофильно высушенного препарата лиэоамидазы растворяли в 21 л 0.05 М трис-HCl буфера, pH 8,0. Раствор лизоамидазы наносили на колонку с ДЭАЭ-сефадексом А-50 (5 х23), уравновешенным 0,05 М трис-HCl буфером, pH 8.0. Белки элюировали градиентом концентрации NaCl (0-0,5 М), V-1,6 л. Фракции, содержащие фермент, собирали и концентрировали против ПЭГ 20000 до 2,5 мл. Сконцентрированный раствор белков наносили на колонку (2,6x80) с сефадек-сом G-75 (тонкий), уравновешенным 0,1 М трис-HCl буфером, pH 8.0. Злвирование фермента проводили тем же буфером. Фракции, содержащие протеинаэу, собирали, концентрировали и хранили при -40°С.

Получение бактериолитической фракции J11 и разделение её

на фракции Л1а и Л1б осуществляли следующим образом. Фильтрат с ДЭАЭ -сефадекеа наносили на колонку с КМ-сефадексом А-50, уравновешенным 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 8,0 (5x23). Белки злюировади градиентом концентрации N301 (0-0,5 М). Активные фракции собирали, концентрировали против ПЭГ ЕОООО и наносили на колонку с се-фадексом Б-50 (сверхтонкий), уравновешенным 0,1 М трие-НС1 буфером, рН 8,0. После 14 циклов гель-фильтрации колонку промывали тем же буфером. Активные фракции собирали, концентрировали и хранили при - 40°С.

Для получения литической протеиназы Л2 и фосфатазы фильтрат с КМ-сефадекса подкисляли уксусной кислотой до рН 4,5 и наносили на колонку с СП-сефадексом (5x20), уравновешенным 0,05 М Ыа-ацетат-ным буфером, рН 4,5. Зиоирование белков с колонки проводили с помощью градиента концентрации N301 (0-0,5 М). Белки злюировались при концентрации N301, равной 0,1 М. Иротеолитическая, стафилоли-тическая и фосфатазная активности злюировались с колонки одним пиком. Активные фракции собирали, концентрировали и наносили на колонку с сефадексом 05-75 (тонкий), уравновешенным ОД М трис-НС1 буфером, рН 8,0. После четырёх циклов рециркуляции с колонки элю-ировали два симметричных белковых пика. Одному пиру соответствовала фосфатазная, другому - литичеекая и протеиназная активности.

Получение клеточных стенок. Выращенные клетки трижды отмывали десятикратным объёмом 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,0, центрифугированием в течение 15 мин при БОООхе. Отмытые клетки лиофилъно высушивали. Клетки суспендировали в. 0,05 М натрий фосфатном буфере, рН 7,0, добавляли 100 г стеклянных шариков и разрушали на шаровой мельнице в течение 10 мин. Добавляли ДНКазу и РНКазу (0.01 мг/мд) и инкубировали 2 часа при 37°С. Неразрушенные клетки отделяли центрифугированием при 1200хе в течение 20 мин. Препарат клеточных стенок центрифугировали при ЮОООхе в течение £0 мин и инкубировали 24 часа при 37°С с-проказой (ОД мкг/ мл). Суспензию центрифугировали и промывали три раза, как описано ранее, и инкубировали с трипсином (ОД мкг/ мл) при 37°С два часа. Полученные клеточные стенки лиофилъно высушивали.

Анализ клеточных стенок методом выеокоразрешающей жидкостной хроматографии (БЖХ). Продукты гидролиза клеточных стенок амидазой или лизоамидазой лиофильно высушивали. Пептиды экстрагировали смесью, содержащей ацетонитрил-изопропанол-воду (25:25:50), 0,1?. ТФК. Пептиды разделяли на колонке с обращенной фазой С18 (Vydac) градиентом 0-15Z ацетонитрила в 0,1% ТФК при скорости 0,5 мл/мин в течение 80 мин. Пептиды регистрировали измерением поглощения при 210 нм.

Определение гомогенности пептидов. Гомогенность полученных пептидов и мурамилпептидов определяли электрофорезом на бумаге Ватман 1. Образцы, содержащие 20 нмоль аминогрупп, наносили на бумагу и после высушивания анализировали электрофорезом при рН 1,2 (муравьиная кислота: уксусная кислота:вода - 5: 15: 80) и рН 5,0 (0,1 М пиридин - уксусная кислота) при 25 V/см в течение 150 мин. Обнаружение пептидов проводили 0,1% раствором нингидрина.

Масс-спектроскопия. Пептиды (1-2 нмоль) в 0,1% ТСК наносили методом злектронапыления на подложку носителя системы ввода образца, и масс-спектр положительного иона был получен с использованием ионизации калифорнием.

Определение последовательности аминокислот. Для определения последовательности аминокислот методом деградации по Эдману использовали около 1 нмоля пептида. Фенилтиогидантоиновые производные аминокислот были идентифицированы ВЖХ (Lottspelch, 1S85)

Аналитические методы. Для определения аминокислот и аминоса-харов клеточные стенки гидролизовали в 6 N НС1 при 100°С в течение 14 часов и анализировали на аминокислотном анализаторе. N-Концевые аминокислоты определяли по разнице в содержании аминокислот в образцах до и после динитрофенилирования или дансилиро-вания. Аминокислоты, освобождаемые гидразинолизом в безводном гидразине при 100°С в течение 6 часов, были определены как С-кон-цевые (Ghuysen et al., 1968). Коррекция экспериментально найденных величин была проведена путём сравнения потерь С-концевого аланина из пептида Ala-Ala-Ala при гидразинолизе. Выход С-концевого ала-

- 14 -

нина от теоретического составлял 30%.

Редуцирующие группы Сахаров, свободные аминогруппы, гексоз-амин, фосфор и гексозы определяли ранее описанными методами (Ghuy-sen et al., 1968; Park, Johnson,1949; Loury et al., 1954; Ashwel, 1957).

Определение конфигурации аланина проводили с использованием оксидазы D-аминокислот, глютаминовой кислоты - с использованием декарбоксилааы L-глютаминовой кислоты (Kato et al., 1981). Определение конфигурации Agpm проводили тонкослойной хроматографией на силикагеле Б (Brlcas et al., 1967). Конфигурацию орнитина определяли с использованием L-орнитин карбамилтрансфераэы. Продукты реакции анализировали В8К.

Бактериолитическую активность определяли на высушенных клетках S.aureus 209Р. К 2 мл суспензии клеток стафилококка в 0,01 Ы трис-HCl буфере, pH 8,0, (0Д-0,7) добавляли 100 мкл раствора фермента. Смесь инкубировали 10-30 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл насыщенного раствора NaCl. За единицу активности принимали количество фермента, снижающее оптическую плотность бактериальной суспензии на 0,01 ед. в мин.

Протеолетгическую и фосфатазную активности определяли ранее описанными методами с использованием в качестве субстратов казеина (Hull, 1974) и п-нитрофенилфосфата (Несмеянова и др., 1973)

Цитируемая литература

1. Ежов В.Д., Лузина И.Е., Усанкика Г.Г. и др., в сб. Бактерио-литический препарат лиэоамидаза. Физиологические, биохимические и клинические аспекты.'1989, Пущино, с. 43-47.

2. Несмеянова М. А., Дмитриев А. Д., КулаевИ.С., Микробиология, 1973, 42, N3, с. 213-219.

3. Asiwell G., Meth. Enzymol., 1957, 3, p.73-105.

4. Brlcas E., Ghuysen J.M., Dezelee P., Biochemistry, 1967, №, p. 2598-2607.

5. Ghuysen J.M., Tipper D.J., Stromlnger J.L., Meth. Enzymol., 1966, 8, p. 685-699.

- 15 -

6. Hull V. E., J. Dairy Scl., 1974, 30, p. 881-884.

7. Kato K., llmemoto T., Fukuhara H. etal., FEMS Microbiol. Lett., 1981, 10, p. 81-85.

8. Lottspeich F., In. Modert methods In protein chemistry, Berlin, NY, ( Walter), Gruyter Co. 1985, v.S, p. 347-352.

9. Lowry O.H., Roberts N.R., Leiner K.Y. et al., J. Biol. Chem. 1954, 207, p. 1-17.

10. Park J.T., Johnson M., J. Biol. Chem., 1949, 181, p. 149-151.

Глава 2. Бактериодитические ферменты, продуцируемые культурой Pseudomonas lytlca.

Из речной воды был выделен бактериальный штамм, отнесённый к роду Pseudomonas, который при росте на твёрдой среде образовывал зоны лизиса клеток стафилококка. Микроорганизм получил видовое название "lytlca". Подбор жидких сред показал, что среда, содержащая 0,01% дрожжевой экстракт и 0.06Z пептон, pH 8,3, являлась наиболее подходящей для продукции литического фермента. Максимальное накопление бактериолитических и протеолитических ферментов происходило к 8-9 часам роста. Именно на этой стадии роста наблюдали лизис культуры. Добавление хлора»4>еникола (100 мкг/мл) в момент высокой продуктивности культуры приводило к подавлению прироста как литической, так и протеолитической активностей. Эти данные позволили сделать заключение о синтезе ферментов de novo.

Исследована возможность увеличения биосинтеза бактериолити-ческого фермента P. lytica внесением в среду культивирования убитых клеток S.aureus. Известно, что отдельные литические ферменты синтезируются только в присутствии в среде культивирования индуктора - клеток, чувствительных к данному ферменту, или клеточных стенок, выделенных из них (Kitamura et al., 1972; Tanaka, Phaff, 1965). В других случаях бактериолитические ферменты синтезировались в отсутствии в ростовой среде субстрата, но внесение в среду клеток, чувствительных к изучаемым ферментам, приводило к увеличению биосинтеза ферментов. Так, внесение в среду культивирования . Streptomyces levoris (Щелкова и др., 1981) клеточных стенок или

пептидогликана стрептококков увеличивало выход бактериолитическо-го фермента. Однако в некоторых случаях внесение сустрата в ростовую среду не влияло (Hart, Zahler, 1966) или даже ингибировало биосинтез фермента, как это наблюдалось при добавлении клеток S.aureus в среду культивирования штамма Streptomyces S-35 (Yoshlmoto et al., 1971)

Как видно из рис. 1, внесение в ростовую среду культуры P.lytlca убитых клеток стафилококка в концентрации 2,5 мг/мл приводило к увеличению в два раза бактериологической активности в отношении клеток стафилококков. При этом было обнаружено, что добавление в среду культивирования клеток М. luteus не приводило к увеличению стафилолитической активности. Это указывало на то, что культура P.lytica синтезировала бактериолитический фермент, гид-ролизуюций клеточные стенки S. aureus по связям, характерным для пептидогликана стафилококков. По-видимому, таким ферментом может быть глицил-глицин эндопептидаза, гидролизующая связи в межпептидном мостике пептидогликана S.aureus.

Рис. 1. Биосинтез бактериолити-ческого фермента культурой P.lytica при различных концентрациях клеток S. aureus. 1 - среда без стафилококка; 2-0,1 мг/мл; 3-0,5 мг/мл; 4-1,0 мг/мл; 5-2,5 мг/мл клеток стафилококка.

Добавление легко метаболизируемого источника углерода - сахарозы или глюкозы, приводило к снижению биосинтеза ферментов. Это свидетельствовало о том, что биосинтез этих ферментов контролируется по механизму катаболитной репрессии. Известно, что истинным эффектором катаболитной репрессии является циклический 3',5'-аде-

нозинмонофосфат (Pastan, Perlman, 1S70). В клетках животных и микроорганизмов цАМФ гидролизуется до 5'Al® фосфодизстеразой цАМФ. Производные метилкс'аятина - теофиллин и кофеин являются ингибиторами цАМР-фосфодизстеразы у бактерий, причём степень их ингибиру-ющего действия зависит от вида микроорганизма (Stuboi, Yanaglshlma, 1975). В таблице 1 представлены данные по влиянию кофеина и теофиллина на биосинтез бактериолитического и протеоли-тического ферментов P.lytlca в присуствии глюкозы. Оба соединения снимали репрессирующее действие глюкозы в случае бактериолитического фермента, при этом кофеин обладал более сильным действием, чем теофиллин. Репрессия глюкозой биосинтеза протеолитического фермента не снималась этими соединениями, что указывало на иной механизм регуляции биосинтеза этого фермента.

Таблица 1. Влияние кофеина и теофиллина на биосинтез бактериолитического и протеолитического ферментов культурой Р.lytica

Добавки к Активность

ростовой -

среде бактериолитическая протеолитическая

ЛЕ/мл ЛЕ/мл

Контроль (без глюкозы) S,6 3,3

0,05% глюкоза 0,8 1,0

0,05% глюкоза и

75мкг/мл кофеина 5,0 1,3

0,05% глюкоза и

ЮОмкг/мл теофиллина 3,9 0,8

Исследование лизиса патогенных микроорганизмов бактериолити-ческим ферментом Р. 1уиса проводили, используя фильтрат культу-ральной жидкости бактерий. Как видно из таблицу 2, наибольшую

бактериолитическую активность наблюдали в отношении клеток стафилококков. Все исследованные штаммы лизировались на 90-100Х за 5 мин. Менее чувствительными были штамм S.epldermidis "Якунин", стрептококки, Коринебактерии и нейссерии. Полностью устойчивыми оказались гее исследованные штаммы грамотрицательных бактерий.

Таблица 2. Лизис микроорганизмов литическим ферментом, продуцируемым культурой Pseudomonas lytlca.

Исследованные штаммы Кол-во Время Процент

штаммов действия лизирован-(мин) ных клеток

Staphylococcus aureus 60 5-10 90-100

S.epldermldls "Якунин" 1 180 70

S.epldermldls 2124 1 10 100

S.epldermldls 2-1 1 10 100

S.saprophytlcys 1 5 100

Micrococcus luteus (flavus) 1 5 90

M.varlans (Sarclna lutea) 1 60 70

M.luteus 1 5 100

M.varlans 1 5 100

Streptococcus plogenes 6 240 30-70

S.agalactlae 2 90 90

S.faecalls var.llguefaclens 1 90 60

S.faecalls var.zymogenes 3 90 70-90

S. pneumoniae 1 240 0

Corynebacterlum xerosis 5 240 0-30

C.dlphtheroldes 1 240 30

C. pseudodlphtherltlcum 1 240 0

Neisseria meningitidis 10 240-270 30-60

N. gonorrhoeae 6 150 50-60

Такая избирательность гидролиза клеток грамположительных бактерий указывала на наличие в фильтрате культуральной жидкости Р.1у-tica литического фермента, обладающего узкой субстратной специфичное тыо.

Выделение и очистку бактериолитического фермента проводили из фильтрата культуральной жидкости с использованием хроматографии на колонках с гидроксиапатитом и сефадексом G-75. Выход бактериолитического фермента составлял 5,8t, степень очистки 380 раз. Л?смотря на высокую степень очистки, фермент обладал протеолити-ческой активностью и по этому свойству был отнесён к логическим лротеиназам. Молекулярная масса фермента - 10-12 нДа, оптимум температуры и рН: 50-55°С, 8,5-9,5, соответственно. Бактериолити-ческая активность ингибировалась ЗДТА, пХМВ и ФМСФ в концентрации 1 мМ на 43, 30 и 202, соответственно.

Для определения специфичности бактериолитического фермента Р. lytlca была проанализирована динамика изменения содержания свободных аминогрупп аминокислот и редуцирующих групп Сахаров в процессе гидролиза клеточных стенок. Было выявлено, что гидролиз пептидогликана S.aureus сопровождался образованием свободных аминогрупп аминокислот, содержание которых достигало 0,3 ммоль/мг клеточных стенок к четырём часам гидролиза. При этом, содержание редуцирующих групп Сахаров не превышало 0,02 ммоль/мг клеточных стенок. Эти данные свидетельствовали о том, что гидролиз клеточных стенок происходил под действием литической пептидазы.

Более определённая информация о механизме гидролиза была получена при анализе аминокислотного состава клеточных стенок после их гидролиза литическим ферментом. Как видно из таблицы 3, количество N-терминальных глицина и аланина увеличивалось после гидролиза до 0,75 и 0,34 моль/моль лизина, соответственно. Это свидетельствовало о том, что под действием литического фермента происходил гидролиз связей в пентаглициновом мостике. Возможно, что гидролизу также подвергалась связь между мурамовой кислотой и аланином. Амидазная активность, выявляемая в препарате, может принадлежать литической протеиназе. Существование бактериолити-ческих ферментов, обладающих одновременно пептидазной и амидазной активностями, было показано ранее (Kawata et al., 1985; Tipper et al., 1S67).

Таблица 3. Состав пептидогликана клеточных стенок S.aureus 209Р после гидролиза бактериолитическим ферментом P.lytica.

Дансилирование

Аминокислоты

Серии Глютамино-вая к-та

960 1,04

3820 4,15

2020 2,20

920 1,00

130

0,14

830 3150 1710 920

110

0,90 0,14

3,42 0,73

1,86 0,34

1,00 0,00

0,12

0,02

Глицин Алании Лизин

А,- нмоль в пробе Б - моль/моль лизина

С - разница в содержании аминокислот до и после дансилирования ■

Таким образом, полученные нами данные указывали на то, что культура P.lytica синтезировала и секретировала в ростовую среду бактериолигическую протеиназу, лизируюшую клетки стафилококков путём гидролиза межпептидного мостика пептидогликана клеточных стенок. Аналогочным механизмом гидролиза пептидогликана клеточных стенок S.aureus обладали большинство описанных стафилолитических зндопептидаа и литических протеиназ: протеиназа Myxobacter AL-1 (Tipper, 1969), фермент L-11 (Kato, Stromínger, 1968), литические ферменты, выделенные из Pseudormas aeruginosa X (Lache et al., 1969) и Aeromonas hydrophila (Coles et al., 1969), пептидаза Streptomyces grlseus S-35 (Yoshlmoto, Tsuru, 1972), фермент ALE из S.epldermldls (Suglnaca et al., 1968), лизостафин (Broeder et al., 1965), MR-зндопептидаза S.albus G (Ghuysen et al., 1969).

Результаты, представленные в главе II, опубликованы в работах 3, 7, 12-15, 17, 18, 21-23, 28.

- zi -

Цитируемая литература

1. Щелкова Н.С., Савельев Е.П., Петров Г.И. и др., Микробиол., 1981, 50, N3, с. 453-457.

2. Browder Н.Р., Zygmunt W.A., Young Y.R. et al., Blochem. Blo-phys. Res. Commun., 1965, 19, N3, p. 383-389.

3. Coles N.W., Gllbo C.M., Broad A.Y., Blochem. J., 1969, 111, N1, p.7-15.

4. Ghuysen J. M.. Dlerlckz L., Coyette J. et al ..Biochemistry, 1969, 8, N1, p. 213-222.

5. Hart B.A., Zahler S.A., Agr. Biol. Chem., 1980, 44, N9, p. 2129-2133.

6. Kawata S., Takemura T., Yokogawa K. et al., Agrlc. Biol, Chem., 1985, 49, N9, p. 2253-2264.

7. Kato K., Stromlnger J.L., Biochemistry, 19SS, 7, N2, p.2754-2761.

8. Kltamura K., Kaneko Г., Yamamoto Y., J. Gen. Appl. Microbiol.,

1972, 18, HI, p.57-71.

9. Lache M., HearnW.R., Zysklnd J.W. et al., 1969, 100, N1, p.254-259.

10. Pastan I., Perlman R.L., Arch. Microbiol., 1975, 105, N2, p.83-87.

11. Suglnaka H., Kotanl S., Kato K. et al., Blken J., 1968, 11, N1, p.13-24.

12. Tanaka H., Phaff H.J., J. Bacterlol., 1965, 89, N6, p.1570-1580.

13. Tipper D.J., Stromlnger J.L., Biochemistry, 1967, 6, N3, p.906-920.

14. Tipper D.J., Biochemistry, 1969, 8, N5, p.2192-2202.

15. Stuboi M., Yanaglshlma N., Arch. Mlcroboil., 1975, 105, N2, p. 83-87.

16. Yoshimoto Т., ilakanlshl Т., Fukuiroto J. et al., Agr. Biol. Chem., 1971, 35, N11, p.1775-1782.

17. Yoshimoto Т., Tsuru D., J. Blochem., 1972, 72, N2, p.379-390.

Глава 3. Выделение и характеристика литической протеиназы паразитической бактерии Mlcavlbrlo adrolrandus.

С целью поиска других продуцентов бактериолитических ферментов был исследован новый род паразитических бактерий Mlcavlbrlo, который морфологически близок с паразитическими бактериями рода Bdellovibrio. Известно, что бделловибрионы обладают комплексом литических ферментов, с помощью которых осуществляется проникновение в клетки хозяина и их лизис. Показано, что в состав лити-ческого комплекса входят пептидазы и глюкозидазы (Fackel1, Robinson, 1373; Thanashow, Rittenberg, 1978).

Отличительной чертой бактерий рода Mlcavlbrlo является обли-гатно паразитический внеклеточный рост и развитие на клетках хозяина. У микавибрионов практически полностью отсутствуют ключевые ферменты гликолиза и пентозофосфатного цикла (Afinogenova et al., 1986). Это позволяет предположить, что в значительной степени пищевые и энергетические потребности бактерия-паразит удовлетворяет за счет клеток бактерии-хозяина. Жизненный цикл развития Mlcavlbrlo включает лизис клеток хозяина, который совпадает по времени с окончанием латентного периода роста паразита. Мы полагали, что лизис клеток хозяина происходит под действием бактериолитических ферментов Mlcavlbrlo и, учитывая внеклеточный рост и развитие паразита, ферменты зкскретируится в ростовую среду. Однако анализ культуральной жидкости показал отсутствие в ростовой среде бактериолитических ферментов. Еыделение бактериолитических ферментов проводили из внутриклеточного содержимого паразита.

Культуру M.admlrandus выращивали с использованием Pseudomonas maltophilia в качестве хозяина. После отделения клеток хозяина паразитическую бактерию разрушали и из внутриклеточного содержимого выделяли бактериолитический фермент. С использованием методов ионнообменной и гель-хроматографии был выделен гомогенный фермент, который обладал как протеолитической, так и бактериоли-тической активностями. Ингибиторный анализ показал, что фермент относится к классу сериновых протеиназ. Молекулярная масса фер-

мента 39 кЦа, pI-4,3, Km для казеина 4,0 мг/мл, рН оптимум 7,0, оптимум температуры 55°С. Фермент не гедродизовал живые клетки Е. coll. Гидролизу подвергались только автоклавированные клетки, что указывало на то, что внешняя мембрана Е.соН являлась барьером для проникновения фермента к пепгидогликановому слою клеточных стенок. Однако степень гидролиза (рис. 2) автоклавкрованных клеток не при-вышала 50% за 5 часов, что было на несколько порядков ниже, чем скорость гидролиза клеток S.aureus литической протеиназой, синтезируемой культурой P.lytlca.

Полученные результаты позволили выявить ряд важных особенностей участия литических ферментов во взаимодействии бактерии-паразита и клеток хозяина. По-видимому, бактериолитический фермент, синтезируемый клетками M.admirantus, непосредственно транспортируется в клетки хозяина через участки прикрепления паразита к клеткам хозяина без выхода его в ростовую среду. Проникновение литического фермента к пептидогликану предполагает наличие специального механизма, приводящего к образованию во внешней мембране клеток хозяина участков, способных пропускать внутрь клеток белковые молекулы молекулярной массой около 40 кДа.

Таким образом, показано, что паразитическая бактерия M.admi-rândus синтезирует протеиназу, отнесённую к классу сериновых про-теиназ, которая гидролизует как белки, так и пептидогликан Е.соН.

I.Q.

Рис.2. Гидролиз автоклавирован-ных клеток Е.соН бактериолити-ческим ферментом M.admlrandus.

5.0

Врем

(5, 20)

- 24 -Цитируемая литература

1. Aflnogenova А.V., Markelova N.Y., LamblnaV.A., Zbl. Bakt., II Abt.,'1986, 141, N6, p. 471-475.

2. Fackell H.B:, Robinson J., Can. J. Microbiol., 1973, 19, N5, p. 659-666.

3. Thomashow M.F., Rittenberg S.C., J. Bacterlol., 1978, 135, N3, p, 998-1007.

Глава 4. Бактериолитические ферменты бактерии Pseudomonas sp.

4.1 Выделение бактериодитического комплекса дизоамидазы. Для выделения комплекса ферментов к фильтрату культуральной жидкости после отделения клеток добавляли равный объём ацетона, осадок отделяли, к фильтрату добавляли 1,5 объёма ацетона. После выдерживания на холоду осадок, содержащий основную часть ферментов, собирали, растворяли в дистиллированной воде и проводили дробное осаждение сульфатом аммония (60 и BOZ насыщения). Основная часть активности переходила в осадок, полученный при BOX насыщении сульфатом аммония. После диализа при электропроводности 5-7 ms материал высушивали лиофилизацией. Полученный таким образом препарат был назван лизоамидазой.

Лизоамидаза синтезируется как свободными, так и иммобилизованными в полиакриламидный гель (ПААГ) клетками. Важной особенностью культуры является расщепление на активные и неактивные формы. После десятого пересева наблюдаются клетки, не способные синтезировать бактериолитические ферменты лизоамидазного комплекса. Как правило, после десятого пересева проводили отбор активных форм клеток с последующим их использованием для получения лиао-амидааы. Иммобилизация клеток продуцента в ПААГ приводила к значительному снижению скорости расщепления культуры. Появление неактивных форм клеток было обнаружено только на 60 цикл культивирования. Хранение иммобилизованных клеток в течение 2 лет полностью сохраняло биосинтетическую активность клеток, расщепде-

ние культуры на активные и неактивные формы не наблюдали. Полученные данные говорят о возможности использования иммобилизованных в ПААГ клеток продуцента для их хранения и применения при подготовке посевного материала.

Лизоамидаза проявляла логическую активность в отношении клеток стафилококков, стрептококков, коринебактерий. Устойчивыми к действии лиаоамидааы были три исследованных штамма Streptococcus pneumoniae и все исследованные штаммы грамотрицателъных микроорганизмов (Абрамочкин и др., 1989). Найдено, что штаммы стафилококков, устойчивые к 10-12 антибиотикам тетрациклинового и пени-циллинового рядов, являлись чувствительными к лизоамидазе. Чувствительность S. pneumoniae к действию лизоамидазы определялась их устойчивостью к пенициллину. Штаммы, обладающие устойчивостью к пенициллину (МЯК > 1,6 мкг/мл), гидролизовались лизоамвдазой. Это связано с изменениями в структуре пептидогликана при развитии устойчивости к антибиотику (раздел 4.4).

4.2. Механизм гидролиза клеточных стенок 5. aureus лизаамидаз-ным комплексом. Определение субстратной специфичности имеет важное значение при характеристике бактериолитических комплексов. С этой целью исследован механизм гидролиза клеточных стенок S.aureus ли-зоамидазой. Выделенные клеточные стенки содержали следующие аминокислоты и аминосахара: глюкозамин, мурамовую кислоту, лизин, глю-таминовую кислоту, глицин, аланин и серин в молярном соотношении 2,4: 0,8: 1,0: 1,0: 4,7: 1,9: 0,4 (табл. 4) Аминокислотный анализ после динитрофенилирования показал, что все аминокислоты включены в связи. Это свидетельствовало о нативности полученных клеточных стенок. Клеточные стенки содержали 2,4 моль глюкозамина на моль глютаминовой кислоты, при содержании мурамовой кислоты 0,8 моль. Отношение глюкозамина и мурамовой кислоты к глютаминовой кислоте в пептидогликане клеточных стенок S.aureus равно 1,0 (Tipper et al., 1965). По-видимому, 1,4 моль глюкозамина в выделенном препарате клеточных стенок определялись из тейхоевых кислот. Ранее было показано, что тейхоевые кислоты S.aureus, связанные с пепти-догликаном через мурамовую кислоту (Наумова, 1978, Rogers, 1983), содержат в своём составе глюкозамин ( Акатов, 1988). Обработка клеточных стенок с целью удаления тейхоевых кислот нами не прово-

дилась, поскольку известно, что удаление тейхоевых кислот приводит к изменению специфичности бактериолитических ферментов (Herbold, Glaser, 1975; Holtje, Гошазг, 1975).

Таблица 4. Состав клеточных стенок S.aureus до и после гидролиза лизоамидазой

Компонент Исходные клеточные стенки После 4 часов гидролиза

ДНФ* ДНФ

A Б A Б A 1 Б A Б

Миг 320 0,8 309 0,9 344 1,0. 310 0,9

GlcN 906 2,4 450 2,4 938 2,6 926 2,6

Gl и 386 1,0 351 1,0 357 1,0 356 1,0

Gly 1828 4,7 1658 4,7 1712 4,8 1244 3,5

Ala 735 1,9 704 2,0 734 2,1 588 1,7

Lys 378 1,0 357 1,0 385 1,0 373 1,0

Ser 147 0,4 117 0,3 134 0,4 134 0,4

* - динитрофенилирование А - нмоль/мг клеточных стенок Б - моль/моль Glu

Под действием лизоамидазы происходила деградация пептидогли-кана клеточных стенок до коротких фрагментов. Гидролиз сопровождался увеличением количества свободных аминогрупп аминокислот. В течение четырёх часов гидролиза их содержание возрастало с 0,18 до 0,50 ммоль/мг цветочных стенок, при этом количество редуцирующих групп Сахаров не изменялось. Обнаружено, что 0,4 моль аланина и 1,3 моль глицина, отнесённые на моль глютаминовой кислоты, становились доступными действию динитрофенола после гидролиза клеточных стенок лизоамидазой (табл. 4). Определение природы амино-

кислот (рис. 3), которые в продуктах гидролиза находились на N- и С- концах пептидов, показало, что количество N- и С-терминального аланина достигало . 0,5 и 0,3 моль/моль Glu, N- и С-терминального глицина 1,3 и 1,2 моль /моль Glu. Эти данные свидетельствовали о том, что гидролизу подвергались связи между аланином и мурамовой кислотой, двумя глицинами, аланином и глицином.

Рис. 3 Рис.4

Рис. 3. Изменение содержания N- и С-концевых аминокислот

в процессе гидролиза пептидогликана клеточных стенок S.aureus лизоамидазой

Рис. 4. Гидролиз 3,4-динитрофенил-гетра-М-ацетил-0-хитотетра-озида лизоцимом (1) и лизоамидазой (2)

Наличие в препарате лизоамидазы мурамидазы, фермента, гидро-лизующего связь между мурамовой кислотой и глюкозамином, определяли с использованием хромогенного субстрата - 3,4-динитрофе-нил-тетра-Н-ацетил-О-хиготетраозида (Ballardie, Capon, 1972). Как видно из рис.4, лизоамидаза гидролизовала хромогенный субстрат с начальной скоростью в 15 раз ниже, чем лизоцим, однако, глубина гидролиза субстрата за 80 час исследованными ферментами была при-

мерно одинаковой.

Для более точного определения связей, которые гидролизова-лись в пептидогликаае клеточных стенок S.aureus лизоамидазой, продукты гидролиза были подвергнуты разделению гель-хроматографией на сефадексе G-25, ионнообменной хроматографией на QAE-сефа-дексе А-50. Хроматографией на сефадексе G-25 (рис. 5а) продукты

Рис. 5а

Рис.56

W*фракции (УшЮ*я)

Рис.5в

Рис.5 Разделение продуктов гидролиза клеточных стенок S.aureus на сефадексе G-25 (а) и фракций 1 (б) и 2 (в) на QAE-сефадексе А-50: 1 - аминогруппы; 2 - гексозамин

гидролиза бьиш разделены на две фракции, одна из которых была

обогащена гексозамином, другая - аминокислотами. В данных условиях из-за близости молекулярных масс разделение пиков не было полным. Фракция 1 на ОАЕ-сефадексе была разделена на три фракции. Фракция 1-1 содержала аминокислоты, фракции 1-Е и 1-3 - гексоза-мин (рис. 56). Фракция 2 в тех же условиях была разделена на фракцию 2-1, содержащую аминокислоты, и фракцию 2-2, содержащую гек-созамин (рис. 5в).

Анализ гомогенности полученных фракций показал, что при рН 5,0 все фракции имели низкую подвижность и двигались к катоду как гомогенный материал (рис. б). При рН 1,2 все исследованные фракции были гомогенны, кроме фракции 1-1, которая разделялась на три пятна, и фракции 2-1, которая разделялась на четыре пятна. Три пятна из четырёх фракции 2-1 имели такую же подвижность, как пятка, обнаруженные при анализе фракции 1-1. Это дало нам основание предположить, что пятна фракции 1-1 идентичны пятнам б, в, г фракции 2-1. В дальнейшем материал фракции 1-1 не анализировали. Электрофорезом на бумаге ЗММ фракции 2-1а, 2-16, 2-1в и 2-1г были накоплены в количествах, достаточных для проведения аминокислотного анализа.

• 1 • о

7-7 1 •

2-7 | •

2-2 1 •

1-1 1 •

t-1 1 •

$ 1 Сиз Я La «Г 9 Blu в

1 S t .

2-Я a i *

2-21 •

7-2 1 «

7-J | • Q

Рис. 6. Анализ гомогенности полученных фракций электрофорезом на бумаге: а - рН 5,0; б - рН 1,2. Условия 25 V/см, 150 мин

Таким образом, из гидролизата клеточных стенок S.aureus были получены семь гомогенных фракций.(таблицы 5,6). Фракции 1-2, 1-3 и 2-2 содержали как углеводную, так и пептидную части пептидогди-кана, фракции 2-1а, б, в, г - только пептидную часть.

Таблица 5. Состав фракций, выделенных из гидролизата клеточных стенок S.aureus

Фракция Обработка Компонент, нмоль/мл

Миг GlcN GlU Gly Ala Lys Ser

1-2 1200 2798 128 406 257 120 13

А " 1359 2843 156 .366 321 140 18

Б 0 0 0 93 0 0 0

В 1054 2860 135 365 209 140 13

1-3 —-, 654 1542 23 78 50 20 0

А . • 650 1500 25 68 51 22 0

Б 0 '' 0 0 24 0 0 0

В 650 1500 25 88 •43 22 0

2-2 --- 2010 2000 217 657 420 210 68

А 1833 1740 228 533 350 220 48

Б 0 ' 0 0 264 0 0 0

В 1786 1820 201 549 306 180 72

2-1а — 0 ' 0 30 105 ' 54 24 9

2-16 — 0 0 31 56 58 28 5

2-1в — 0 0 17 82 25 18 7

£-1г --- 0 0 10 64 14 5 ■ 0

А - динитрофеншшрование Б - гидразинолиз Б - обработка боргидридом

Фракция 1-2 содержала мурамовую кислоту, глкжозамин, глютами-новую кислоту, глицин, аланин, лизин и серии в молярном соотношении 9,0: 21,0: 1,0: 3,2: 2,0: 1,0: 0,1. Как и исходные клеточные стенки, эта фракция содержала в два раза больше глгокозамина, чем мурамовой кислоты. 0,6 Моль глицина определялись как N-концевая и 0,7 глицина - С-концевая аминокислоты.

Фракция 1-3 содержала те же компоненты, что и фракция 1-2, за исключением серина, который во фракции 1-3 не был обнаружен. Соотношение компонентов во фракции 1-3 было следующее: 28,0: 67,0: 1,0: 3,4: 2,2: 0,9: 0,0. 0,7 Моль глицина были N-концевыми, 1,0 моль глицина - С-концевым.

Фракции 2-2 и 2-1 имели близкий аминокислотный состав. Фракции 1-2, 1-3 и 2-2 имеи одинаковую первичную структуру пептидной субъединицы: Ala-Glu-Lys-Ala. Это хорошо согласуется с ранее полученными данными по структуре пептидогликана S.aureus (Ghuysen et al., 1968). Исследованные фракции содержали 3 моль глицина на моль Glu. Анализ содержания С- и N-концевого глицина показал, что один остаток глицина соединён с аланином, находящимся в четвёртом положении пептидной субтединицы, второй - с лизином. Положение третьего глицинового остатка точно не определено. Исходя из первичной структуры межпепгидного мостика пептидогликана S.aureus (Ghuysen et al., 1968), он может быть присоединён к глицину, находящиеся на С- или N- гащах пептидов.

В отличие от описанных выше фракций, фракции 2-1а, б, в, г не содержали фрагментов гликановой части пептидогликана. По соотношению аминокислот они б^ли близки и отличались только содержанием глицина.. В данных фракциях N-концевыми аминокислотами определялись аланин и глицин, С-концевой аминокислотой - глицин. Количество глицина, положение которого в предполагаемых структурах не определено, выражено ¡сак (Gly)n. Для фракций 2-1 п-2, 2-16 п-0, 2-1в п-3, 2-1г п-4.

Состав гликановой части пептидогликана в исследованных фракциях отличался: фракции 1-2 и 2-2 содержали 9, фракция 1-3 - 28 дисахаридных остатков GIcN-Muï. Это свидетельствовало о том, что мурамидаза лизоамидазы гидролюует гликановые цепи с образованием крупных фрагментов, в отличи» от лизоцима, который гидролизует пептидогликан M.luteus с образованием, в основном, дисахарида

- 32 -

Таблица б. Первичная структура пептидов, выделенных из гидролизата пептидогликана S.aureus

Фракция Предполагаемая Компонент Наблвдаемое Вычисленное первичная структура значение значение* _i_i_i_i_i

ТХК Миг 9,0** 9,0

GlcN-Mur- (GlcN-Mur)e GlcN а,О 9,0

1-2 Ala aicN(TXiC) 12,0

Glu Glu .1,0 1,0

Gly-Lys Gly 3,2 3,0

Ala-Gly-(Gly) N-KOH4.Gly 0,6 1,0

С-кЬнц-Gly 0,7 1,0

Ala 2,0 2,0

Lys 0,9 1,0

TXK Mur 28,0 28,0

GlcN-Mur-(GlcN-Mur)27 GlcN 67,0 28,0

1-3 Ala GlcN (TXK) 39,0

Glu Glu 1,0 1,0

Gly-Lys Gly 3,4 3,0

Ala-Gly-(Gly) N-конц. Gly 0,7 1,0

С-конц.Шу 1,0 1,0

Ala ¡ 2,2 2,0

bits 0,9 1,0

GlcN-Mur-(GlcN-Mur)6 Mor ; 9,0 9,0

Ala GlcN / 9,0 9,0

2-2 Glu Glu i 1,0 1,0

G1 y-Lys Gly 3,0 3,0

Ala-Gly-(Gly) N-конд. Gly 0,7 1,0

C-KOiU. Gly 1,2 1,0

Ala Í 1,9 2,0

Lys.í 1,0 1,0

Serj 0,3 0,0

(продолжение таблицы )

2-la

Al а

Glu I

Sly-Lys 2-16 Ala-(Gly)n

2-lB

2-lr

Glu 1,0 1,0

Gly 3,6 4,0

Ala 1,9 2,0

Lys 0,8 1,0

Ser 0,3 0,3

Glu 1,0 1,0

Gly 1,8 2,0

Ala 1,9 2,0

Lys 0,9 1,0

Ser 0,2 0,2

Glu 1,0 1,0

Gly 4,8 5,0

Ala 1.5 2,0

Lys 1,1 1,0

Ser 0,4 0,4

Glu 1,0 1,0

Gly 6,4 6,0

Ala 1,5 2,0

Lys 0,5 1,0

Ser 0,0 0,0

* - значения вычислены, исходя из предложенных первичных структур пептидов

** - значения выражены в моль/моль Glu. ТХК - тейхоевая кислота

В1сИ-Миг. Причина такой избирательности гидролиза связей углеводной части пепгидогликана Б.аигешз, выявленная впервые, не ясна. Мы полагаем, что она определяется не только структурой гликановой части пептидогликана, но и структурой других компонентов клеточных стенок, в случае стафилококков - тейхоевыми кислотами. Важная роль тейхоевых кислот для активности некоторых бактериолитических

ферментов показана ранее (Mosser, Tcrnasz, 1970, Lindsay, Glaser, 1976). Обнаружение фракций клеточных стенок, содержащих различное количество гдюкозамина, превышающее содержание мураиовой кислоты, указывало на неравномерность распределения тейхоевых кислот в гликановой молекуле. Так, во фракциях 1-2 и 1-3 отношение глюко-замина тейхоевых кислот к мурамовой кислоте было 1,3-1,4, в то время, как во фракции 2-2 глюкозамина тейхоевых кислот не выявлено. Возможно, что тейхоевые кислоты определяют точки связывания мурамидазы лизоамидазного комплекса с полимером клеточной стенки стафилококков. Ранее была показано, что тейхоевые кислоты определяют локализацию автолитической' амидазы в клеточных стенках B.subtills (Herbold, Glaser, 1975а,b).

з • з

J i з • • з

-(GlcN-Mur)2Q-G1cN- i I

2"* I - (GlcN-Mur) g-GlcN-

Ala •

Glu Ala

i i Lys Glu

I I •

Ala-Gly-Gly-Bly-Gly-Gly-Lys

t t t t Ala

•1111.

Рис. 7. Схема гидролиза пептидогликана 3.aureus лизоамидазой. Стрелками показаны связи, гидролизуемые: глицил-глицин эндопептидазой - 1-, ацетилмурамил-аланш амидазой - 2; мурамидазой - 3. .

Обнаружение в продуктах гидролиза фрагментов, не связанных с гликановой частью пептидогликана, с различным содержанием глицина, позволило сделать заключение о том, что в состав лизоамида-зы входят ферменты, обладающие глицил-глицин зндопептидазной и ацетилмурамил-аланин амидазной активностями (рис.7). Мы полагаем, что основная бактериодитическая активность лизоамидазы связана с глицил -глицин эндопептидазой. Близкие по специфичности ферменты были обнаружены в стафилолитических комплексах - лизостафине

(Ghuysen et al., 1965) и L-ll (Kato, Strominger, 1968). Гли-цил-глицин эндопептидазной активностью обладали литические ферменты, выделенные из Streptomyces grlseus S 35 (фермент F-l) (Yoshlmoto, Tsuru, 1972), Aeromonas hydrophlla (Coles et al., 1969), Mlxobacter ALI (Jackson, Wolfe, 1968)

Ацетилмурамил-аланин амидаза лизоамидазы так же принимает участие в фрагментации пептидогликана клеточных стенок S.aureus. Однако остаётся открытым вопрос о способности фермента лизиро-вать нативный пептидсгликан и клетки стафилококков. Иными словами, является ли ацетилмурамил-аланин амидаза лизоамидазного комплекса литическим ферментом? Полученные данные не дают нам оснований для такого вывода. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что большинство описанных внеклеточных амидаз, входящих в состав бактериолитических комплексов, относятся к ферментам, гидролизую-щим растворимые фрагменты пептидогликана, получаемые после фрагментации клеточных стенок другими бактериолитическими ферментами (Kawata et al., 1984; Takebe et al., 1970; Iversen, Grov, 1973; Singer et al., 1972). Вместе с тем, автолитические ацетилмурамил-аланин амидазы, выделенные из клеток, обладали способностью гидро-лизовать как гомологичные, так и гетерологичные клеточные стенки (Holt]e, Tornasz, 1976; Forsberg, Rogers, 1972; Herbold, Glaser, 1075a,b). Исследование специфичности гидролиза лизоамидазой клеточных стенок М.luteus (раздел 4.3) показал, что амидаза гидроли-зовала клеточные стенки без предварительного гидролиза пептидной части пептидогликана и, по-видимому, в отношении данных клеточных стенок фермент являлся литическим. С другой стороны, в отношении клеточных стенок S.pneumoniae (раздел 4.4) амидазная активность лизоамидазы проявлялась только после гидролиза связей в межпептидном мостике пептидогликана аланил-аланин зндопептидазой, что дало нам основание говорить об отсутствии литической активности фермента на клеточных стенках стрептококков.

Ответ на поставленный вопрос, является ли амидаза лизоамидазы литическим ферментом в отношении клеточных стенок стафилококков, может быть получен после выделения данного фермента и исследования специфичности его действия на клетки и клеточные стенки стафилококков.

4.3. Механизм гидролиза клеточных стенок Micrococcus lute-us лизоамидазным комплексом. Выбор штамма для проведения данного исследования был связан с тем, что структура пептидогликана М.luteus отличается от структуры пептидогликана S.aureus. Предполагалось, что гидролиа пептидогликана клеточных стенок М.luteus может осуществляться другими ферментами лизоамидазы, не выявляемыми при гидролизе пептидогликана 3.aureus. В состав перекреет-носвязывающих мостиков пептидогликана М.luteus входит пептид, имеющий первичную структуру tAla-Lys-Glu(Gly)-Ala]n, где n-0; 1 или 4 (Ghuysen et al., 1968). Кроме того, гликановая часть пептидогликана также отличается у этих бактерий. Гликановые цепи М.luteus являются субстратом для лизоцима, в то время как у S. aureus они лиаоцимом не гидролизуются.

Таблица 7. Состав клеточных стенок М.luteus до и после гидролиза лизоамидазой

Компо- До гидролиза После гидролиза

1 ЦНФ 1 гидрази-нолиз 1 ДНФ гидрази-нолиз

А 1 Б А Б 1 1 АБА 1 Б 1 А Б А Б

Миг 625 1.1 683 1,1 0,0 0,0 595 1, ,0 615 1, ,1 0,0 0, ,0

GlcN 565 1,0 598 1,0 0,0 0,0 593 1, ,0 618 1, ,1 0,0 0, ,0

Glu 588 1,0 618 1,0 0,0 0,0 583 1. .0 585 1; ,0 0,0 0, ,0

Gly 615 1,1 600 1,0 773 1,3 575 1 .0 593 1, ,0 720 1, ,2

Ala 1193 2,0 1289 2Д 260 0,4 1315 2 ,2 978 1 .7 180 Q, ,3

Lys 518 0,9 55 1,1 0,0 0,0 575 1 ,0 93 0 ,2 0,0 0, ,0

А - нмоль/мг клеточных стенок Б - моль/моль Glu

Полученные клеточные стенки М.luteus были исследованы на со-

держание в них аминокислот и аминосахаров (табл. 7). Они содержали мурамовую кислоту, глюкозамин, гдюташшовую кислоту, глицин, аланин и лизин в молярном соотношении 1,1: 1,0: 1,1: 2,0: 0,9. 0,7 Моль лизина имели свободные аминогруппы, что хорошо согласуется с ранее полученными данными (Ghyusen et al., 1968), где это значение было между 0,6 и 0,8 моль. 0,3 Моль глицина и 0,4 моль аланина определялись как С-концевые аминокислоты. Аланин не имел свободных аминогрупп, что свидетельствовало о том, что в процессе выделения клеточные стенки не претерпели каких-либо изменений под действием автолитических ферментов.

После 4 часов гидролиза клеточных стенок лизоамидазой содержание аминокислот и аминосахаров не изменялось. При этом было обнаружено, что 0,5 моль аланина стали доступны действию динитрофе-нола, в то время,, как содержание С-концевых аминокислот не изменялось. Появление в гидролизатах свободных аминогрупп аланина без увеличения свободных карбоксильных групп какой-либо аминокислоты свидетельствовало о том, что происходил гидролиз связей между мурамовой кислотой и аланином.

С использованием того же подхода, как и при исследовании механизма гидролиза клеточных стенок S. aureus, были получены две гомогенные фракции, состав которых, и их предполагаемая первичная структура представлена в таблицах 8 и 9.

Фракция 1а содержала пептидную часть пептидогликана и состояла ив глютаминовой кислоты, глицина, аланина, лизина в соотношении 1,0: 1,0: 2,0: 1,0. Определение С- и N-концевых аминокислот показало, что 0,7 моль глицина и ОД моль аланина имели свободные карбоксильные группы, а 0,5 моль аланина и 0,7 моль лизина имели свободные аминогруппы. Полученные нами данные по аминокислотному составу и содержанию С- и N-концевых аминокислот хорошо согласуются со значениями, вычисленными по предполагаемой первичной структуре пептида, а также с данными по структуре пептидной части пептидогликана М.luteus, полученными другими авторами (Ghuysen et al., 1968). Таким образом, фракция 1а содержала димеркый пептид с двумя свободными N-терминальными аланиновыми остатками.

- 38 -

Таблица 8. Состав фракций, полученных из гидролизата клеточных стенок МЛШеиз

Фракция Обработка Компонент, мкмоль/мл

Миг GlcN Glu Gly Ala Lys

1а О О 5,11 5,22 10,31 5,08

А. 0 О 4,55 5,19 6,92 1,48

Б 0 0 0 3,39 0,60 0

4 3,48 2,49 0,53 0,56 1.39 0,51

А 3,49 2,56 0,55 0,60 1,00 0,18

Б 0 0 0 0,26 0,24 0

В 4,22 0,57 0,5? 0,66 1,18 0,73

А - динитрофенилирование Б - гидразинолиз В - обработка боргидридом

Фракция 4 содержала аналогичную последовательность аминокислот, как и фракция 1а, однако, к аланину, находящемуся в первом положении пептидной субъединицы, был присоединён фрагмент глика-новой цепи, состоящий из 15 дисахаридных остатков.

Итак, лизоамидаза гидролизовала клеточные стенки М. luteus по связям, образованным аланином и мурамовой кислотой, и связям между мурамовой кислотой и ацетилглюкоаамином (рис. 8). При этом, мурамидааа, как и в случае пептидогликана S.aureus, гидролиаовала гликановые цепи с образованием крупных фрагментов, и её специфичность не связана, по-видимому, с различиями в строении гликановой части пептидогликана этих бактерий.

Ацетилмурамил-аланин амидаза гидролизовала клеточные стенки M.luteus без предварительного гидролиза пептидной части пептидогликана. Более того, анализ динамики появления редуцирующих групп

Таблица 9. Предполагаемая первичная структура фракций, полученных из гидролизата клеточных стенок М. ]1Леиз.

Предполагаемая первичная Компонент Наблюдаемое Вычисленное

структура значение t значение t

Фракция 1а Миг 0,0" 0,0

GlcN 0,0 0,0

Glu 1,0 1,0

Ala | Gly 1,0 1,0

Glu-Gly Ala Ala 2,0 2,0

Lp Gly Glu-Gly Ala- (Ala-Lys-Glu-Ala)4-Lys Lys 1,0 1,0

С-конц-Gly 0,7 1,0

Ala N-конц. Ala 0,5 0,3

С-конц. Ala 0,1 0,2

N-KQHq.Lys 0,7 0,8

Фракция 4

Миг 6,5 5,0

GlcN 4,7 5,0

(GlcN-Mur)is Glu 1,0 1,0

Ala (GlcH-Mur)i5 Gly 1,1 1,0

Glu-Gly Ala Ala 2,1 2,0

Lys Gly Glu-Gly Lys 1,0 1,0

Ala- (Ala-Lys-Glu-Ala)4-Lys С-конц.Gly 0,4 1,0

Ala N-конц. Ala 0,0 0,0

С-конц. Ala 0,03 0,2

N-конц.Lys 0,7 0,8

* - Содержание компонентов приведено в моль/моль Glu.

Сахаров и аминогрупп аланина показал, что гидролиз связей Миг-А1а опережал гидролиз гликановых цепей. Эти данные указывали на то, что амидаза лизоамидазного комплекса гидролизовала нативные клеточные стенки и может быть отнесена к литическим ферментам, в отли-

чие от других амидаз, входящих в состав комплексов, которые гид-ролизовапи толь ко растворимые фрагменты пепгадогликана (Ка>уа1а еЬ а1. , 1984; О-шузеп et а1., 1969; Не13епооЛ еЪ а1., 1975), и не являлись литическими ферментами.

I 4 2 2

-(GlcN-Mur)i5-GlcN- | |

1-*| - (GlcN-Mur)15-GlcN-

Ala Н

Glu-Gly Ala

Lys Gly Glu-Gly

Ala- (Ala-Lys-Glu-Ala)4-Lys Ala

Рис. 8. Схема гидролиза пептидогликана клеточных стенок М.1^еиз лизоамидазой. Стрелками показаны связи, гидролизуе-мые: ацетилмурамил-аланил амидазой - 1; мурамидазой - 2

4.4. Механизм гидролиза клеточных стенок Streptococcus pneumoniae лизоамидазяш комплексом. В таблице 10 приведена характеристика штаммов S.pneumoniae, использованных в данном исследовании. Лизоамидаза гидролизогала только устойчивые к пенициллину (МИК >1,6 мкг/мл) штаммы, а также клеточные стенки, выделенные из них. Чувствительные к пенициллину штаммы обладали устойчивостью к действию лизоамидазы. Исключением являлся штамм R6st, чувствительный к пенициллину, но устойчивый к стрептомицину.

На рис. 9 представлены данные гидролиза устойчивых к пенициллину штаммов D2Q и Реп 4 (МИК 12 и 4 мкг/мл, соответственно) и чувствительного штамма R 6 (МИК 0,001 мкг/мл). За ВО мин оптическая плотность суспензии клеток, устойчивых к пенициллину, снижалась на 97%, чувствительных клеток - только на 30%. Более значительная разница в чувствительности к лизоамвдазе была выявлена на клеточных стенках. Гидролизу подвергались только клеточные стенки, выделенные из штаммов, устойчивых к пенициллину (табл. 10).

Таблица 10. Характеристика штаммов S.pneumoniae, использованных в данном исследовании.

Клинические итаммы

Штамм Серотип Выделение Пенициллин ШК Гидролиз клеточ-Год Страна (мкг/мл) них стенок лизоамидазой (%)

D39S о 1916 США 0.01 10

Вг 19 1985 США 0.01 Ю

SP96 10A 1938 США 0.03 10

SA23 б 1985 Южная Африка 0,01 10

С07 19А 1977 Южная Африка 4,0 50

140 19А 1977 Южная Африка 4,0 70

D20 19А 1977 Южная Африка 12,0 95

Лабораторные штаммы

Штамм Пенициллин ШК Гидролиз клеточных сте-

(мкг/мл) нок лизоамидазой (%)

R36A 0,001 <10

R6 0,001 <10

R6st 0,001 70

Pen 1.6 1,6 60

Pen 4 4,0 90

Pen 6 6,0 50

№Ж - минимальная ингибирующая концентрация

Анализ изменения содержания редуцирующих групп Сахаров и свободных аминогрупп аминокислот (рис. 10) при гидролизе клеточных стенок устойчивого к пенициллину штамма Реп 6 лизоамидазой пока-

зал, что количество редуцирующих групп не изменялось, количество же свободных аминогрупп возрастало до 1000 нмоль/мл. Это свидетельствовало о том, что лизоамидаза гидролизовала пептидную часть пептидогликана клеточных стенок 5.pneumoniae.

Из продуктов гидролиза клеточных стенок устойчивых к пенициллину штаммов S.pneumoniae были выделены пептиды, и их состав был исследован методом ЕЖХ на колонке с обращенной фазой С18. В контрольных экспериментах гидролиз связи между мурамовой кислотой и аланином осуществляли амидазой S.pneumoniae.

Структура пептидов пептидогликана клеточных стенок устойчивых и чувствительных к пенициллину штаммов S.pneumoniae была определена ранее (Garsia-Bustos et al., 1987; Garsla-Bustos, et al., 1988) Срис. 11). Основными димерами пеницидлинчувствительных штаммов, которые поддерживают структуру пептидогликана, являются пептиды 4, 5 и 6. Пептид 4 составляет до 30 % всех пептидов пептидогликана чувствительных к пенициллину штаммов. Развитие устойчивости к пенициллину сопровождается изменениями в структуре пептидогликана, которые связаны с тем, что основными димерными пептидами становятся пептиды 7, IV, V и VI (рис. 11, штамм Реп 6). Эти

Рис, 9. Гвдролиз лизоамидазой устойчивых (020 и Реп 4) и чувствительного (1?б) к пенициллину штаммов.

Бремя (мин)

Рис. 10. Гидролиз лизоамидазой клеточных стенок штамма Реп 6:

- аминогруппы; -о- редуцирующие группы; -•- ОЮээо-

Ala I

¡Cln

¡Gln I

Ala t

Ala

¡Gln

Ais

»L «J.

¡Gln

Ala

¡Gln

Ala —Ser—Ly« 1

Ala

¡Gln ti.

iGln li.

Ala

¡Gln

Ala— Ser— Lys

Ala

¡Cln

Ala—Set—Lys

O 20 40 00 80 100

Ala '

¡Ola

Al»—Ala—Ly»

Aja'

Ш Ala

iCln

Ala—Ala — l]r»

Ala

Ala Ala

iGln 4

Ala t

1 ¡Gln ¡Gb

Л t Ala—Ala— Lye

Ala

¡Gln

Ala

¡Gln ¡Gln

Lyi J'-'1

aL-

.Gln

Рис. 11. Анализ продуктов гидролиза пелтидогликана клеточных стенок штаммов Реп 6 и R 6st, полученных с помощью лизоамидазы. Приведенные структуры пептидов были определены Гарсия-Еастусом и Томасом (García-Bustos, Tomasz, 1990)

J>ír

пептиды являются разветвлёнными пептидами, в которых к е-аминогруппе лиэинового остатка присоединён пептид, имеющий состав Ala-Ala или Ala-Ser.

Под действием лиаоамидазы димерные разветвлённые пептиды штамма Реп 6 гидролизовались, и в продуктах гидролиза были обнаружены мономерные пептиды а, Ь, с, е, f (рис. 11). На рис. 12 приведена структура пептидов, которая была установлена аминокислотным анализом и масс-спектрометрией. Пептид а являлся тетрапеп-тидом, в котором к е-аминогруппе лизинового остатка присоединён аланин. Пептиды Ь, с и е имели первичную структуру, аналогичную пептидам 3, I и II. Пик d являлся смесью нескольких пептидов, один из которых был обнаружен в препарате лизоамидазы. В пептиде f к е-аминогруппе лизинового остатка тетрапептида присоединён ди-пептид Ala-Ala. На рис. 13 представлена предполагаемая схема образования пептида f при гидролизе лизоамидазой разветвлённых пептидов V и VI. Гидролиз данных пептидов происходил по связям, образованным аланином, находящимся в четвёртом положении пептидной субъединицы, и аланином межпептидного мостика с образованием пептида f и пептидов 3 и I.

А^а

01п , I

Lys Ala

A(la Gin

A la-Ser-Lys

Ala Gin

Ala-Ala-Lys

Aja Gin

Ala-Ser-Lys Ala Ala

A^a Gln

Ala-Ala-Lys A*la

Рис. 12. Предполагаемая структура пептидов, выделенных из продуктов гидролиза клеточных стенок штамма Реп 6 лизоамидазой.

Были выявлены важные особенности в специфичности ферментов лизоамидазы. Клеточные стенки штаммов R6st и КВ по набору пепти-

дов достаточно близки, за исключением разветвлённого пептида 7, количество которого значительно увеличено в штамме гез^ Наличие этого пептида является достаточным для гидролиза клеточных стенок штамма Rбst лизоамидазой. При этом происходил гидролиз не только данного пептида, но и неразветвлённых пептидов 5 и 6. Более того, обнаружение свободных от гликана пептидов в продуктах гидролиза клеточных стенок свидетельствовало о том, что связь между мурамо-вой кислотой и адалином также подвергалась гидролизу. Однако гидролиз этой связи происходил только в штаммах, несущих в структуре пептидогликана разветвлённые пептиды. Возможно, что ацетилмурамил -аланин амидааа, гидролизующая связь между мурамовой кислотой и аланином, не является литическим ферментом и не гидролизует на-тивный пептидогликан. Гидролиз связей в пептидной части пептидогликана аланил-аланин пептидазой приводит к тому, что продукты гидролиза становятся растворимыми. И именно растворимый пептидог-ликан с гвдролизованнш межпептидным мостиком является субстратом для амадазы.

Ala Ala

Gin Ala Gin Ala

II II

Ala-Ala-Lys Gin -- Ala-Ala-Lys Gin

i I fi

Ala-Ala-Ser-Lys Ala Ala-Ser-Lys

VI f

A(la Ala

Gin Ala Gin

' ,1

Ар

Ala-Ala-Lys Gin -- Ala-Ala-Lys Gin

Ala-Ala-Ala-Lys Ala Ala-Ala-Lys

Рис. 13. Схема гидролиза разветвлённых пептидов пептидогликана S.pneumoniae лизоамидазой.

В литературе описаны ацетилмурамил-аланин амидазы, которые гидролизуют только растворимые фрагменты пептидогликана. Так,

амидаза бактериолитического комплекса, выделенного из S. aureus, в состав которого также входят эндопептидаза и ацетилглюкозомини-даза, не гидролизовала нативный пептидогликан 3.aureus, S.epidermidis и М.lysodeiktlcus. Активность фермента проявлялась только на растворимом пептидогликане, получаемом после его гидролиза глюкозошкидазой или эндопептидазой (Huff et а2., 1970; Tipper, 1969). Амидазы, входящие в состав бактериолитических комплексов S.epidermidis (Suglnaka et al., 1968), Myxobacter AL-1 (Tipper et al., 196V), Streptomyces albus G и Streptomyces globis-porus 18Z9 (Kawata et al., 1984) также были активны только на растворимых фрагментов пептидогликана. По-видимому, ацетилмурамил -аланин амидаза лизоамидазы, по крайней мере, в отношении клеточных стенок S.pneumoniae, не является литическим ферментом, что объясняет отсутствие гидролиза связей между мурамовой кислотой и апанином в пептидогликане штамма R6.

Важная особенность в специфичности пептидазы была выяснена при попытках гидролизовать пептиды, не связанные с гдикановой частью пептидогликана. Выделенные пептиды 7, IV, V и VI подвергали гидролизу лизоамидазой в тех же условиях, как и нативный пептидогликан. Было обнаружено, что лизоамидаза не гидролизовала свободные пептиды. Это свидетельствует о том, что гидролиз данных пептидов происходит до их отделения от гликановых цепей пептидогликана. Эти данные также указывают на то , амидазная активность лизоамидаэы проявляется на растворимых фрагментах пептидогликана, образующихся при гидролизе нативного пептидогликана ала-нил-аланин пептидазой лизоамидазного комплекса.

Таким образом, развитие устойчивости штаммов S.pneumoniae к пенициллину сопровождается изменениями в структуре пептидной части пептидогликана. Эти изменения приводят к тому, что основными димерами, поддерживающими структуру пептидогликана, становятся разветвлённые пептиды. Данные пептиды с закрытой е-аминогруппой лизинового остатка являются субстратом для аланил-аланин зндопеп-тадазы, что в целом приводит к гидролизу лизоамидазой штаммов, устойчивых к пенициллину.

Итак, в лизоамидазе нами выявлены следующие ферменты, способные гидролизовать клеточные стенки устойчивых к пенициллину штаммов S.pneumoniae: (рис. 14) аланил-аланин эндопептидаза и ацетил-

мурамил-аланин амидаза. При этом ацетидмурамид-аланин амидаза, по-видимому, гидролизует растворимые фрагменты, образующиеся после гидролиза аданил-аданин зндопептидазой пептидной части пепти-догликана устойчивых к пенициллину штаммов 3.pneumoniae. (27, 37, 42, 46, 48, 50, 56, 5В, 59, 63)

-GlcN-Mur-

2-*j -Mur-GlcN- Рис. 14. Схема гидролиза пеп-

А1а тидогликана S. pneumoniae ли-

Gln Ala зоамидазой. 1 - эндопептида-

Ala-Ser-Lys Gin за; 2 - ацетилмурамил-аланин

i i Ala-Ala- Ser-Lys амидзза

Цитируемая литература

1. Абрамочкин Г.В.Плотникова З.С., Бобик М.А. и др., в сб. Бак-териолитичеекий препарат лизоамидаза. Физиологические, биохимические и клинические аспекты. 1989, Пущино, с. 20-32.

2. Акатов А.К., Журн. микробиол. зпидемиол. иммунол., 1988, N12, с.3-9.

3. Наумова И.В., Биохимия, 1978, 43, N2, с.195-207.

4. Ballardle F.W., Capon В., J. Chem. Soc. Commun., 1972, N14, p. 828-829.

5. Coles N.W., Gllbo C.M., Broad A.Y., J. Blochem., 1969, 111, N1, p.7-15.

6. Forsberg C.W., Rogers H. L., J. Bacterid., 1974, 118, N2, p. 358-368.

7. Garcla-Bustos J.F., Tottiasz A., J. Bacterid., 1987, 169, N2, p. 447-453.

8. Garcia-Bustos J.F., Chait B.T., Tomass A.. J. Bacterlol. 170, 1988, N5, p. 2143-2147.

9. Ghuysen J.M., Tipper D.J., Strominger J. L.-, Method. Enzymol. 1966, 8, p.685-699.

10. Ghuysen J.M., Brlcas E., Lâche M. et al., Biochemistry, 1968,

7, N4, p. 1450-1460.

11. Ghuysen J.M., Dlerlcks L., Coyette J. et al., Biochemistry, 1969, 8, N'l, p. £13-222.

12. Heljenoort J., Parquet C., Flouret B. et al., Eur. J. Blochem. 1975, 58, M2, p. 611-619.

13. Herbold D.R., Glaser L., J. Biol. Chem., 1975, 250, N5, p. 1676-1682.

14. Herbold D.R., Glaser L., J. Biol. Chem., 1975, 250, N18, p. 7231-7238.

15. Holtje J.V., Tomasz A., J. Biol. Chem. 1975, 250, N6, p. 60726076.

16. Holtje J.V., Tornas^ A., J. Biol. Chem., 1976, 251, N5, p.4199-4207. 1

17. Iversen 0. J., Grov A., Eur. J. Blochem., 1973, 33, N2, p. 293-300.

18. Jackson R.L., Wolfe R.S., J. Biol. Chem., 1968, 243, N2, p. 879-888.

19. Kato K., StromInger J.L., Biochemistry, 1968, 7, N8, p. 27542761.

20."Kawata S., Takeraura T., Takese Y. et al-, Agrlc. Biol. Chem., 1984, 48, N2, p. 261-269.

21. Lindsay B., Glaser L., J. Bacterlol., 1976, 127, N2, p. 803811.

22. Mosser J.L., Tomasz A., J. Biol. Chem., 1970, 245, N2, p. 287-298.

23. Rogers H.J., In Bacterlol Cell Stracture, Van Nostrand Eelnold Co. Ltd. (Cole, Knowles, Sclesslnger), 1983, p.6-27.

24. Singer H.J., Wise E.M., Park J.T., J. Bacterlol., 1972, 112, N2, p. 932-939.

25. Takebe G., Singer H.G., Wise E.M. et al., J. Bacterlol., 1970, 102, N1, p. 14-19.

26. Tipper D.L:, Ghuysen J.M., Strominger J.L., Biochemistry, 1965, 4, N3, p.468-473.

27. Yoshlmoto T., TsuraD., J. Blchem. 1972, 72, N2, p. 379-390.

4.5. Выделение и свойства компонентов дизоамидазного комплекса. Для выделения ферментов, входящих в состав лизоамидазы, препарат подвергали фракционированию с помощью ионнообменной и гель-хроматографии. Схема выделения ферментов представлена на рис. 15. В результате проведенной работы получены следующие ферменты: металлопротеиназа, литичеекая протеиназа Л2, нейтраль-

Лизоамидаза

ДЭАЭ-сефадекс —> Сефадекс в-75 —> Металлопротеиназа*

I Протеиназа, фрак-

КМ-сефадекс —> Сефадекс Э-50 —> Ацетилмурамидаза ция

Литичеекая пептидаза Л1

СП-сефадекс —> Сефадекс (3-75 —> Литичеекая протеиназа Л2*

Нейтральная фосфатаза*

* - ферменты, полученные в электрофоретически гомогенном состоянии

Рис.15. Схема выделения ферментов из лизоамидазы.

ная фосфатаза. Выделена также литичеекая фракция Л1, в состав которой входило несколько белков.

В таблице И представлены некоторые физико-химические характеристики выделенных ферментов.

Металлопротеиназа. Фермент имел молекулярную массу 28 кДа, оптимум рН 8,0, константу Миаалиса на казеине 3,2 мг/мл, р1 5,0, температурный оптимум 60°С. Активность фермента ингибировалась ЭДТА и восстанавливалась при добавлении двухвалентных катионов кальция, цинка и магния. Аминокислотный состав металлопротеиназы (табл. 12) наиболее близок к аминокислотному составу нейтральной металлопротеиназы, выделенной из В.зиЫШз (Кеау et а1., 1971).

- 50 -

Таблица 11. Некоторые свойства ферментов, выделенных иа лизоамидазы

Фермент Мм.кДа РНопт Км Ингибитор Р1

Металло- казеин,

протеиназа 28 8,0 3,2мг/мл ЭДТА 5,0 60

Фосфатааа 20 6,5 пШФ, Р1 8,0 62

34,7 мкМ

Литическая

протеиназа 15 9,5е -- ЭДТА, 5,2 55

Л2 ¡ШСФ

8,06 -- ЭДТА 65

6,7В 26 мкМ ДИФ, пХЫБ, 40

<ШСФ

а - протеолигичеекая активность; б - бактериологическая активность в - протеодитическая активность на субстрате АЬг-А1а-А1а-РПе-рМА

Ыеталлопротеиназа гидролизовала В-цепь окисленного инсулина по следующим связям: Рвв^Уа!^ Н135-Ьеиа; Шз-ю-Ьецц; б1и1з~А1а14; А1а14-Ьеи15; Туг1б"ЬеЩ7; Б1у23-РЬе24; РЪе24"РЬе25. Фермент также расщеплял трипептид АЬг-А1а-А1а-РЬе-рИа по связи, образованной аминокислотами аланшюм и фенилаланином. Сопоставление констант инги-бирования фермента пептидами, образованными двумя, тремя и четырьмя аланинами показало, что тетрааланин наилучшим образом взаимодействует С активным центром металлопротеиназы. Константа ингибирования металлопротеиназы триаланином меньше (Ку1=0,98 мМ), .чем тетрапепти-дом (Ку1=1,82 мМ), но в первом случае ингибирование не носило конкурентного характера (рис. 16)

Ингибиторный анализ металлопротеиназы пептидами различной длины, образованными аланином, указывал.на наличие в активном . центре изучаемого фермента гидрофобной площадки, настроенной на узнавание коротких гидрофобных участков у расщепляемых пептидных субстратов.

Таблица 12. Аминокислотный состав нейтральных металлопротеиназ

Амино- Металло- Металло- Термолизин Металло-

кислота протеиназа протеинаэа (Tltanl et протеиназа

лизоамидазы В.brevls al., 1972) S.subtllls

(Паберит и (Keay et

ДР., 1984) al .,1971)

Lys 13 12 11 17

His 4 со 8 5

Arg 5 17 10 8

Asp 37 47 44 48

Thr 25 35 25 29

Ser 25 24 26 31

Glu 16 20 21 27

Pro 13 8 8 9

Gly 37 38 36 30

Ala £8 33 28 28

1/2 Cys 4 0 0 0

Val 24 23 22 19

Met 4 — 2 4

lie 5 8 18 13

Leu 11 23 16 21

Tyr 13 17 28 £2

Phe 15 11 10 11

Trp — — 3 —

Всего 279 329 316 322

Нейтральная фосфатава. Фермент имел молекулярную массу 20 кЯа, оптимум рН 6,5, Кт по нитрофенилфосфату 3,47 мМ, р1 8,0, температурный оптимум 60-63°С. Определение субстратной специфичности показало, что фермент расщепляет все типы фосфомонозфирных связей в молекулах общей формулы ИЗ-РОзН и по этому свойству относится к неспецифичным фосфомоногидролазам (Табл. 13).

усл. ед.

Рис. 16. Влияние аланиновых пептидов на начальные скорости расщепления субстрата Abz-Ala-Ala-Phe-pNa протеинааой. Условия: 0,01 М MES-буфер, рН 6,5, 40° С. О - контроль; 1 -Ala-Ala-Ala-Ala-Ala; 2 - Ala-Ala-Ala-Ala; 3 - Ala-Ala-Ala; 4 -Ala-Ala.

Таблица 13. Относительная скорость гидролиза фосфатсодер-жащих соединений нейтральной фосфатазой

Соединение Активность, 7,

п-НФФ 100

5'-АМФ 97

3'-АШ> 97

Рибозо-5'-монофосфат 65

Глицеро-1,6-дифосфат 76

Глицеро-1-монофосфат ' 70

Аденозинфосфат 67

Бис-п-НФФ О

СрА О

РНК О

Ортофосфат проявлял свойства сильного конкурентного ингибитора нейтральной фосфатазы (Кц^-4,36 ыкМ). Исследование зависимое-

тл от рН константы Иихаздиса и константы ингибирования фермента ортофосфатом показало присутствие в активном центре нейтральной фосфатазы карбоксильного с рК 4,3 (предположительно глутаминово-го) и имидазольного с рК 7,15 аминокислотных остатков (рис. 17).

4 а

4 6В рН

Рис. 17. Зависимость изменения константы ингибирования нейтральной фосфатазы ортофосфатом (кривая 1) и константы Ыихаэлиса ( кривая 2) от рН.

Литическая протеиназа Л2. Выделенная протеиназа гидролизовала казеин, целые клетки и клеточные стенки S. aureus. Гидролиз клеточных стенок S.aureus сопровождался освобождением аминогрупп без увеличения содержания в гидролизатах редуцирующих групп Сахаров, что свидетельствовало о гидролизе пептидной части пептидогликана. Молекулярная масса фермента 15 кДа, р! 5,2. Оптимальные условия гидролиза казеина: рН 9,5, температура 55°С, в то время, как бак-териолитическая активность была максимальной при рН 8,0, температуре 85°С. Кроме казеина и клеточных стенок фермент расщеплял синтетический трипептид Abz-Ala-Ala-Phe-pNA по связи, образованной фенилаланином и пара-нитроанилдаом. Оптимальные условия расщепления этого трипептида: рН 6,7, температура 40оС, Km 26 мкМ, Определение действия ингибиторов на активность литической протеина-зы Л2 показало, что протеолитическая активность более чувствительна к действию ингибитора сериновых протеиназ - диизо-пропилфторфосфату (ингибирование 96%) и фенилметилсульфонилфториду (59%), чем Оактериолитическая активность. По-видимому, протеиназа

- 54 -

Л2 относится к классу сериновых литических протеиназ.

Рядом авторов (Боровикова и др., 1975-, Логинова и др., 1976; Степанов и др., 1980; Brawn et al., 1970; Ensign, Wolfe, 1965) были выделены и изучены протеиназы, обладающие литическим действием на бактерии. Протеиназа, вццеленная из Myxobacter AL, гид-ролизовала клетки стафилококков, артробактеров и микрококков. Протеиназа из Termoactlnomyces vulgaris лизировала клетки E.coli, М.lysodelktlcus и дрожжей. Фермент, выделенный из Myxobacter sp , лизировал клетки стафилококков путем гидролиза глицил-глициновых связей в межпептидном мостике пептидогликана и, кроме того, обладал амидааной активностью. Мы полагаем, что глицил-глиция эндо-пептидазная и амидазная активности лизоамидазы могут принадлежать литичеекой протеиназе MS.

Дитическая фракция Л1. Фракция Л1 состояла из 4 белков, которые элюировались с КМ-сефадекса и сефадекса G-75 одним симметричным пиком. Фракция Л1 обладала протеолитической и бактериолитиче-кой активностями. Установлено, что эти активности принадлежали разным белкам. Молекулярные массы белков фракции Л1 лежали в области 10-15 КЦа, изоэлектрические точки также были близки и находились в области от 8 до 9. Рециркуляционной хроматографией на сефадексе G-75 фракцию Л1 удалось разделить на две фракции - Л1а и Л1б. Фракция Jila обладала протеолитической и бактериолитичес-кой, а Л1б - бактериолитической активностями. Определение субстратной специфичности действия литических ферментов фракции Л1 на клеточные стенки S.aureus показало, что фракция Л1а содержала му-рамидазу, а Л1б - лигическую пептидазу. (6, 8-11, 16, 24, 26, 27, 34-36, 39, 41, 44, 45, 47, 49, 52-55, 60, 64).

4.6. Реконструкция лизоамидазного комплекса. После получения отдельных компонентов лизоамидазы в высокоочищенном состоянии, представлялось важным провести реконструкцию бактериолитической активности и определить вклад каждого выделенного компонента в суммарную активность лизоамидазы. Как видно из таблицы 14, объединение литической протеиназы Л2 и литшеской фракции Л1 в соотношении, в котором ферменты находились в препарате лизоамвдазы, приводило к полному восстановлению бактериолитической активности. Это

свидетельствовало о том, что в процессе очистки не было потеряно каких -либо факторов или ферментов, необходимых для проявления бактериолитической активности. Добавление к каждому из бактерио-литических ферментов иди к реконструированному препарату нейтральной фосфатазы, метаялопротеиназы или полисахарида, выделенного из лизоамидазы, практически не изменяло их бактериолитическую активность.

Таблица 14. Реконструкция бактериолитической активности лизоамидазы

Вариант реконструкции • Еактериолитичеекая

активность, %

Контроль (лизоамидааа) 100

Фракция Л1 57

Литичеекая протеиназа Л2 40

Л1+Л2 92

Л1+Л2+- металлопротеиназа 94

Л1+Л2+ металлопротеиназа + фосфатаза 98

Л1+Л2+ металлопротеиназа + фосфатаза + полисахарид 98

Полученные данные важны для понимания природы действующего начала бактериолитической активности лизоамидазы. Данный препарат представляет собой сложную смесь белков и полисахарида. Однако комбинация только некоторых из входящих в него ферментов, а именно, литической протеиназы Л2 и литической фракции Л1, необходима и достаточна для реконструкции бактериолитической активности лизоамидазы. Выявленное в исходном препарате соотношение ферментов могло быть не оптимальным для лизиса клеток стафилококков. В связи с этим исследовали зависимость активности реконструированного препарата от соотношения в нем литической протеиназы Л2 и литической фракции Л1. Увеличив содержание литической фракции Л1 в четыре раза, удалось повысить активность реконструированного

препарата в 1,5 раза, по сравнению с активностью лизоамидазы (табл.15).

Таблица 15. Зависимость бактериологической, активности реконструированного препарата от соотношения литической протеи-нааы Л2 и литической фракции Л1

Соотношение Л2 и Л1, Активность препарата, Z

(мкг/мл)

Контроль (лизоамидаза) 100

Л2 г Л1

0,7 : 0,3 95

0,7 : 0,6 127

0,7 : 0,9 137

0,7 : 1,2 164

1,4 : 0,3 106

2,1 : 0,3 116

2,8 : 0,3 116

Полисахарид, входящий в состав лизоамидазы, не оказывал влияния на активность реконструированного литического препарата, однако, термостабильность фракции Л1 и литической протеиназы Л2 в присутствии полисахарида лиаоамидазы повышалась на 30 и 80%, соответственно. Липаполисахарид E.coll и гепарин не влияли на термостабильность литической протеиназы Л2 и приводили к снижению температуры инактивации фракции Л1 на 10% . На рис. 18 представлены данные по влиянию полисахарида, выделенного из препарата лиаоамидазы, на стабильность раствора реконструированного литического препарата при 4°С, При выдерживании реконструированного бактерио-литического препарата при 4°С в течение 9 суток его бактериоли-тическая активность снижалась на 60%. Добавление к реконструированному препарату полисахарида приводило к увеличению стабильности препарата практически до стабильности дизоамидазы.

Таким образом, в состав лизоамидазы входят, по крайней мере, четыре бактеряолитических фермента. Основная бактериолитическая активность лизоамидазы связана с ферментами, гидролизующими гли-цил-глициновые связи в перекрестносвязывающем мостике пептидогли-

Время (сут)

Рис. 18. Влияние полисахарида на бактериолитичеекую активность реконструированного препарата. -л- реконструированный препарат; -о- реконструированный препарат+ полисахарид; контроль (лизоамидаза)

кана S.aureus и аланил-аланиновые связи в пептидогликане S.pneumoniae. Препарат также обладает амидазной и мурамидазпой активностями. Суммарная бактериолитическая активность лизоамидазы зависит от соотношения лигической протеиназы Л2 и литической фракции Л1. Изменяя соотношение этих ферментов, могшо получить реконструированный препарат с более высокой бактериологической активностью, чем активность лизоамидазы. Полисахарид, выделенный из лизоамидазы, не оказывает влияния на активность бакгериолитических ферментов лизоамидазы, но повышает стабильность ферментов. (30, 35, 44, 47).

* * *

Из трёх исследованных культур: P.lytlca, М.admlrandus и Pseudomonas sp. нами был выбран штамм Pseudomonas sp. в качестве продуцента бактериолитических ферментов. С использованием данного продуцента была разработана технология получения бактериолитичес-кого комплекса лизоамидазы, и на его основе создан лекарственный препарат (глава 5.4).

Лизоамидаза лизировала стафилококки, в том числе устойчивые

ко многим антибиотикам, и клетки S.pneumoniae, устойчивые к пенициллину. По субстратной специфичности лизоамидаза наиболее близка к двум бакгериолитическим препаратам - лизосгафияу (Iverson, Grov, 1973) и мутанолизину (Yokogawa et al., 1974). Вместе с тем, она обладает рядом преимуществ по сравнению с вышеперечисленными препаратами и прежде всего в том, что лизоададааа лизирует клетки стафилококков и стрептококков, в то время, как лизостафин имеет узкую субстратную специфичность и гидролизует только клетки S.aureus, а мутанолизин - клетки стрептококков.

Кроме того, лизис клеток S.aureus лизостафином происходит под действием глицил-глицин эндопептидазы и замена одного глицинового остатка на серин в перекрёстносвязывающем мостике пепти-догликана приводит к устойчивости штаммов стафилококков к лизос-тафину (Kloos, Schleifer, 1975; Robinson et al., 1979). Содержание в лизоамидазе трёх бактериолитических ферментов, лизиругощих стафилококки, сникает вероятность возникновения устойчивых к препарату клеток.

Цитируемая литература

1. Боровикова В.П., Аксеновская В.Е., Лаврёнова Г.И. и др., Биохимия, 1980, 45, N8, С. 1524-1533.

2. Логинова Л.Г., Яковлева М.Б., Головина И.Г. и др., Микробиология, 1976, 45, N2, с. 291-297.

3. Паберит Н.Ю., Панк М.С., Лийдерс М.С. и др., Биохимия, 1984,49, N1, с. 275-284.

4 Степанов В.М., Руденская Г.Н., Нестерова Н.Г. и др., Биохимия, 1980, 45, N10, с. 1871-1880.

5. Braun V., Siegle In U., Eur. J. Blochem., 1970, 13, N3, p. 336346.

6. Ensing J.C., Wolfe R.S., J. Bacterlol., 1965, 90, N2, p.395-402.

7. Iversen O.J., Grov A., Eur. J. Blochem., 1973, N2, p. 293-300. 8 Keay L., Feder I., Sarreff L.ii., Blochem. Biophys. Acta, 1971,

229, N4, p. 829-835. 9. Kloos W. E., Schleifer K.H., J. Clin. Microbiol., 1985, 1, p. 82-88'.

- оа -

10. Robinson J.M., Hardman J.K., Sloan G.L., J. Bacterlol.,1979, 137, N5, p. 1158-1164.

11. Titanl K., Hermodson M.A., Erlcson L.H. et al., Nature, 1972, 238, N1, p. 35-37.

12. Yokogawa K., Kawata S., Nlshlmura S. et al., Antimlcrob. Agerits Chemoter. 1974, 6, N2, p. 156-165.

Глава 5. Использование бактериолитических ферментов в научных исследованиях и в медицине.

5.1. Исследование первичной структуры пептидогликана Eubacterlum nodatum и Eubacterlum alactolytlcum. Общим подходом при исследовании первичной структуры пептидогликана бактерий является выделение фрагментов клеточных стенок после их гидролиза с помощью бактериолитических ферментов известной специфичности или химических методов. При этом задача заключается в получении гомогенных фракций, которые должны иметь достаточно простой состав пептидов, первичную структуру которых можно установить с помощью доступных биохимических и физико-химических методов. Использование бактериолитических ферментов при определении структуры пептидогликана, на наа взгляд, имеет значительные преимущества перед химическими методами, поскольку позволяет определять первичную структуру как пептидогликана в целом, так и отдельных пептидов, входящих в его состав.

На момент начала райоты была определена первичная структура пептидогликана только для одного штамма рода Eubacterlum. Было показано, что пепгидогликан E.llmosum состоит из пептидных субъединиц'Ser-Glu-Orn-Ala, которые соединены между собой лизином или орнитином (Gulnand et al., 1969).

Для исследования первичной структуры пептидогликана Е. nodatum и Е.alactolytlcum был выбран комплекс бактериолитических ферментов, синтезируемый Streptomyces albus G. Этот комплекс включает в себя несколько литических ферментов: две ацетилмурамидазы (Ghuysen et al., 1962), ацетилмурамил-аланин амидазу (Ghuysen et al., 1969) и набор эндопептидаз (Ghuysen et al., 1965).

Как видно из таблицы 16, выделенные клеточные стенки E.nodatum содержали мурамовую кислоту, глюкозамин, глютаминовую кислоту, аланин, орнигин и глицин в молярном отношении 0,9: 0,8: 1,0: 2,8: 1,8: 0,5. Содержание других аминокислот было 0,1-0,2, фосфора - 0,5 моль/моль Glu. Определение конфигурации аминокислот показало, что количество глютаминовой кислоты не изменялось при обработке препарата клеточных стенок декарбоксилазой L-глютаминовой кислоты, около 38% аланина исчезало после обработке препарата оксидазой D-аминокислот и весь орнитин исчезал при обработки

Таблица 16. Состав клеточных стенок E.nodatum до и после обра-бодки ТХУ.

Компонент 5Z ТХУ

нмоль/мг* моль/моль Glu нмоль/мг* моль/моль Glu

Миг 337 0,9 353 1,2

GlcN 287 0,8 249 0,8

L-Ala 612 1,7 533 1,7

D-Ala 388 1,1 333 1Д

D-Glu 358 1,0 306 1,0

L-Orn 631 1,8 516 1,7

Gly 173 0,5 110 0,4

Asp 60 0,2 54 0,2

Lys 77 0,2 79 0,2

Thr 46 0,1 0 0,0

Суз 26 0,1 34 0,1

Leu 54 0,1 12 0,0

Туг 21 ОД 20 0,1

Phe 28 од 11 0,0

Аминогруппы 4286 12,0 4286 14,0

Гексозамин 598 1,7 713 2,3

Фосфор 16S 0,5 110 0,4

■* значения приведены в нмоль/мг клеточных стенок

L-орнитин карбамилтрансферазой. Эти результаты свидетельствовали о том, что глютаминовая кислота имела D-конфигурацию, орнитин -L-конфигурацию, отношение D- к L-аланину было примерно 1:2.

Определение чувствительности выделенных клеточных стенок к литическим ферментам показало, что они не гидролизоЕалиеь литическим комплексом S.albus G и литическим ферментом М-1. Обработка клеточных стенок 5% ТХУ при 85°С в течение 10 мин приводила к тому, что клеточные стенки становились чувствительными к литическим ферментам. При этом изменялось содержание фосфора с 0,5 до 0,4 моль/моль Glu. По-видимому, обработка ТХУ приводила к удалению части тейхоевых кислот, которые ингибировали активность использованных нами литических ферментов.

Гидролиз обработанных ПУ клеточных стенок комплексом литических ферментов 5.albus G (рис. 19) сопровождался освобождением аминогрупп аминокислот и редуцирующих групп Сахаров. В течение инкубации наблюдалось уменьшение оптической плотности на 787. и увеличение количества редуцирующих групп и аминогрупп до 225 и 5D0 нмоль, соответственно (0,74 и 1,63 моль/моль Glu). Анализ содержания N-концевых аминокислот в гидролизате показал, что 0,8

Рис. 19. Гидролиз клеточных стенок E.nodatum препаратом литических ферментов S.albus G. Условные обозначения: -а- 0D550, -•- аминогруппы, -о- редуцирующие группы.

моль орнитина и 0,3 моль аланина имели свободные аминогруппы. Подученные результаты свидетельствовали о том, что гидролиз клеточных стенок E.nodatum происходил под действием пептидазы и/или ами-дазы и глюкозидаэы литического препарата S.albus G.

Продукты гидролиза клеточных стенок были фракционированы гель- и ионнообменной хроматографией.- Как видно из рис. 20, хроматографией на колонке с сефадексом G-25 (60-2,5 см) гидролизат был разделен на четыре фракции. Первая фракция содержала гексозамин, аминогруппы и редуцирующие группы, вторая - гексозамин и редуцирующие группы, две другие - только аминогруппы. Анализ фракции 4 показал, что она состояла из пептида, в состав которого входили следующие аминокислоты: треонин, аспарагш, еерин, глютаминовая кислота, глицин, аланин, цистеин, лейцин, тирозин и фенилаланин.

10000 8000

< 6000 I

4000 20(10 О

Рис. 20. Гель-фильтрация гидролизата клеточных стенок Е.по-йаЬшп на сефадексе Б-"5. Условные обозначения:

редуцирующие группы, -о- аминогруппы, -А- гексозамин

Ноиер фракция (5 вд/еробитжа)

Фракции 1, 2 и 3 были собраны и нанесены на колонку с 0АЕ-се-фадексом А-25. Градиентом ИаС1 фракция 1 была разделена на шесть фракций (рис. 21а). Фракция 1-3 содержала редуцирующие группы,

- 63 -

другие фракции содержали аминогруппы.

С использованием того же подхода фракция 2 была разделена на три фракции: 2-1, 1-2 и 2-3 (рис. 216). Четыре фракции были получены при разделении фракции 3 (рис. 21в). Аминокислотный анализ фракции 3-1 показал, что она состояла из пептида того же состава, как и фракция 4. Природа этих пептидов неизвестна. В дальнейшей работе фракции 4 и 1-3 не анализировались.

Всмер фрвхцп (10 щ/пДОХрка)

Рис. 21а

10 20 50 40 50

Всывр Фрейда (10 и/прскзяряа)

Рис.216

1а го за ю Нмер йвиш НО м/пр<0жрка>

Рис.21в

Рис. 21. Разделение фракций 1 (а), 2 (б) и 3 (в) на (ЗАЕ-се-фадексе. Условные обозначения: редуцирующие группы, -о- аминогруппы.

Гомогенность полученных фракций определяли электрофорезом на бумаге при двух значениях рН - 5,0 и 1,2 (рис. 22). При рН 5,0 все фракции, за исключением 1-1, двигались к катоду как гомогенный матариал. Фракция 1-1 была разделена на два пятна. При рН 1,2 фракции 1-1 и 2-3 разделялись на два и три пятна, соответственно, остальные фракции были гомогенными. В дальнейшей работе фракции 1 -1 и 2-3 не анализировались.

Ч' А1а С1и

3- 2 • О

г-1 •

г- г •

1- 3 «

г- * 9

1- 1 « «

1- 2 •

1- 3 •

1- * •

6 т

• ф т

Ьу. С1и

1». А1. И» "

• • • ь

э-г *

2-1 Ф

2-г

2-Э • •

2-4

1-1 • •

1-2 «

1-3 •

1 - 4 •

1-в

Рис. 22. Определение гомогенности полученных фракций электрофорезом на бумаге: а - рН 5,0 ; б - рН 1,2.

В таблицах 17 и 18 приведён состав и предполагаемая первичная структура полученных фракций. Фракция 1-2 состояла из мурамо-вой кислоты, глицина, аланина и орнитина в молярном отношении 1,1: 1,0: 0,9: 1,9: 1,4. Одна аминогруппа орнитина была свободна, один аланиновый остаток определялся как С-концевая аминокислота. Эти данные позволили сделать заключение о том, что в состав фракции 1-2 входит мурамилпептид, имеющий структуру пептидной субъединицы, к которой присоединена мурамовая кислота.

Таблица. 17. Состав фракций, полученных из гидролизата клеточных стенок Е.псх1аЬит

Фракция Обработка Компонент (нмоль/мл)

Mur GlcN Glu Gly Ala Orn

1-2 --- 88 0 77 68 147 109

А 68 0 52 23 112 11

В 0 0 0 4 45 0

1-4 75 264 26 31 55 37

А 75 92 26 37 54 33

Б 42 53 24 30 49 35

1-6 — 81 5В 118 50 292 195

А 57 43 113 47 254 57

Б 0 0 0 14 22 0

2-3 — 0 0 93 30 160 50

А 0 0 143 57 90 10

Б 0 0 2 4 0 0

3-2 — ВО 0 237 97 691 494

А 69 0 236 107 362 173

Б 0 0 0 54 130 97

А - дшитрофенилирование Б - гидразинолиз

Фракция 1-4 содержала мурамову» кислоту, глотаминовую кислоту, глицин, аланин и орнитин в молярном отношении 0,3: 1,0: 0,2: 3,2: 1,9. Из трёх аланиновых остатков два определялись как N-концевые, один - как С-концевой. Весь глицин определялся как С-концевой, 0,6 моль орнитиновых остатков имели свободные аминогруппы. Фракция 1-4 представляла большой интерес с точки зрения определения последовательности аминокислот в межпептидном мостике. Деградация пептида фракции 1-4 методом Здмана показала (тайл.

19, рис. 23), что в первом цикле деградации освобождался аланин в количестве два моля /моль Glu. Во втором и третьем циклах освобождались глютаминовая кислота и глицин, соответственно. В последующем цикле никаких аминокислот не было обнаружено. Полученные результаты позволили определить, что весь глицин соединён с глю-таминовой кислотой, дипепгид Ai а-От входит в состав межлептидно-го мостика. Более того, прекращение деградации на третьем цикле, когда следующими аминокислотами, имеющими свободные аминогруппы, являлся орнитин, свидетельствовало о том, что связи Ala-Qrn и Glu -Orn образованы 5-аминогрулпой орнитина.

Таблица 18. Деградация пептида фракции 1-4 методом Здмаяа

Цикл деградации N-концевая кислота*

Glu ^ Ala Gly Orn

О 0,0 1,9 0,0 0,6

1 0,0 2,0 0,0 0,0

2 1,0 0,0 0,0 0,0

3 0,0 0,0 1,0 0.0

* моль/моль Glu

1 (NH2) Ajla

2 Elu—Gly (СООН) 3 1 (ЯИ2) Ala—Orn—Orn

Al a (COOH)

Рис. 83. Схема деградации пептида фракции 1-4. Цифрами обозначены циклы деградации.

В состав фракции 1-6 входили мурамовая кислота, глюкозамин, глютаминовая кислота, глицин, аланин и орнитин в соотношении 0,4: 0,4: 1,0: 0,4: 2,5: 1,7. Один остаток аланина и 1,3 остатков орнитина пределились как N-концевые, аланин и глицин - как С-концевые аминокислоты. Эти данные позволили предположить, что пептид фракции 1-6 является димером пептидных субъединиц, соединённых межпептидным мостиком Ala-Ala-Orn.

Аминокислотный состав и преполагаемая первичная структура пептида фракции 2-3 достаточно близки фракции 1-2. В состав фракции 2-3 входит пептидная субъдиница пептидогликана Ala-Glu(Gly)-Orn-Ala.

Фракция 3-2 содержала следующие аминокислотные остатки: му-рамовую кислоту - 0,3, глютаминовую кислоту - 1,0, глицин - 0,4, аланин - 2,9, орнитин - 0,7. N-концевыми аминокислотами являлись аланин -1,4 и орнитин - 0,7 моль/моль Glu. Кроме того, глицин и аланин определялись как С-концевые аминокислоты. Предполагаемая структура пептида представлена в таблице 19, Исходя из предполагаемой структуры межпептидного мостика Ala-Ala-Orn, С-концевой аланин фракции 3-2 являлся частью межпептидного мостика. Другая часть межпептидного мостика Ala-Orri входила в состав фракции 1-4. При этом было найдено, что содержании фракций 3-2 и 1-4 составляло 23% и 27Z от гидролизованного пептидогликана клеточных стенок, соответственно, т.е. соотношение было близко к 1, что также подтверждало правильность сделанного предположения о структуре межпептидного мостика.

Таким образом, проведенный анализ структуры пептидогликана E.r.odatum показал, что аминогруппа орнитина одной пептидной субъединицы L-Ala-D-Glu(Gly)-L-Orn-D-Ala соединена межпептидным мостиком L-Orn-L-Ala-L-Ala с D-аланином другой пептидной субъединицы (рис. 24). Связь между L-аланином и L-орнитином в межпептидном мостике образована 5-аминогруппой орнитина. Весь глицин, обнаруженный в составе пептидогликана, соединён с глютаминовой кислотой в соотношении 0,5:1.

Таблица 19. Первичная структура некоторых пептидов, выделенных из гидролизата пептидогликана клеточных стенок Е. поспит

Предполагаемая первичная Компонент Наблюдаемое Вычисленное структура значение ' значение i_i_i_i_

Фракция 1-2 Mur 1,1 1,0*

Glu 1,0 1,0'

Mur Gly 0,9 1,0

Ala Ala 1,9 2,0

Glu-Gly N-конц. Ala 0,0 0,0

Orn С-конц.А1а 0,6 1,0

Ala Orn 1,4 1,0

N-конц.Orn 1,2 1,0

Фракция 1-4 Mur 0,3 0,0

Glu 1,0 1,0

Ala Gly 0,2 0,2

Glu-(Gly) Ala 3,2 3,0

Ala-Orn-Orn N-конц.Ala 1,9 2,0

Ala С-конц.Ala 0,6 1,0

Orn 1,9 2,0

N-конц.Orn 0,6 1,0

Фракция 1-6 Mur 0,4 0,0

Glu 1,0 1,0

Ala Gly 0,4 0,5

Glu Ala Ala 2,5 3,0

I i

Orn Glu-(Gly) N-конц.Ala 1,1 1,0

Ala-Ala-Ala-Orn-Orn С-конц.Ala 0,2 0,5

Ala Orn 1,7 1,7

N-конц.Orn 1,3 1,0

Фракция 3-2

Ala

Glu-(Gly) Orn-Orn Ala-Ala

(продолжение таблицы)

Миг 0,3 0,0

Glu 1,0 1,0

Gly 0,4 0,5

С-конц. Gly 0,2 0,5

Ala 2,9 3,0

N-конц.Ala 1,4 1,0

С-конц. Ala 0,6 1,0

Orn 2,1 2,0

N-конц. Orn 0,7 1,0

* - значения выражены в моль/моль Glu

-GlcN-Mur-

L-Ala -Mur-GlcN-

D-Glu-(Gly) L-Ala

i i L-Orn D-Glu

i I

D-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Orn-L-Orn

D-Ala

Рис. 24. Первичная структура пептидогликана клеточных стенок Е.nodatum

Аналогичный подход был использован нами при исследовании первичной структуры пептидогликана клеточных стенок E.alactolytl-cum. Полученные клеточные стенки содержали (табл. 20) примерно 1 моль L-аланина, D-аланина, D-глютаминовой кислоты, мезо-диамино-пимелиновой кислоты и 0,24 моль глицина. Кроме того, препарат клеточных стенок содержал 0,03 моль лейцина и аспарагиновой кислоты, 0,04, 0,06 и 2,64 моль/моль Glu лизина, фосфора и гексоз, соответственно. Анализ содержания N-терминальных аминокислот в клеточных стенках показал, что пептидогликан E.alactolytlcum имел около 89Х межпептидных мостиков.

Таблица. 20. Состав клеточных стенок E.alactolyticum до и после дтитрофенюмроваиия

Компонент Сходные клеточные стенки Обработка ДНФ

нмоль/мг* моль/моль Glu нмоль/мг моль/моль Glu

Миг 400 0,86 324 0,84

GlcN 351 0,75 269 0,70

Ala 1036 о оо (С , 809 1,85

L-Ala 523 1,12 ___* —

D-Ala 513 1,10 — —

D-Glu 466 ■ 1,00 384 1,00

m-Aspm 299 0,64 218 0,57

Gly 112 0,24 99 0,30

Asp 14 0,03 12 0,03

Leu 13 0,03 25 0,07

Lys 19 0,04 346 0,01

Гексозы 1229 2,64 —' —

Фосфор 30 0,06 — - —

* - содержание не определяли

Из продуктов гидролиза клеточных стенок, полученных после их гидролиза литическим комплексом S.albus G, были выделены четыре гомогенные фракции. Как видно из таблиц 21 и 22, все исследованные фракции содержали аланин, глютаминовую кислоту, глицин и диамино-пимелиновую кислоту. Кроме того, фракции 1-4 и 2- 2 содержали му-рамовую кислоту, а фракция 2-1 - два дисахаридных остатка GlcN-Mur. Данные аминокислотного анализа и определение N- и С-тер-минальных аминокислот позволили сделать заключение о первичной структуре выделенных пептидов пептидогликана E.alactolyticum.

Таблица 21. Состав фракций, полученных иа гидролизата клеточных стенок Е.а1асЪо1уисш

фракция Обработка Компонент нмоль/мл

Миг 61 cN Ши Б1у А1а Агря

1-3 --- 66 0 496 84 834 506

А 105 0 484 116 417 310

Б 0 0 0 11 42 13

1-4 — - 41 0 272 20 504 253

А 94 0 282 97 266 193

Б 0 0 0 13 53 10

2-1 — - 1231 1822 982 269 1823 730

А 1342 1431 894 537 1039 156

Б 0 0 0 17 395 30

В 388 1269 934 407 1742 655

2-2 — 177 0 490 162 792 429

А. 143 0 407 158 286 186

Б 0 0 0 36 84 40

А - динитрофенилирование Б - гидразинолиа В - обработка боргидридом

фракция 1-3 содержала глютаминовую кислоту, аланин, мезо-ди-аминопимелиновую кислоту, глицин и мурамовую кислоту в молярном отношение 1,0: 1,7: 1,0: 0,2: 0,1. Половина аланина определялась как И-концевая аминокислота, одна аминогруппа ш-диаминопимелино-вой кислоты была свободной, весь глицин определялся как С-конце-вой. Полученные данные позволили предположить, что в состав фракции 1-3 входит пептид, в котором две пептидные субъединйцы, имеющие первичную структуру А1а-В1и-т~Агрт-А1а, соединены между собой связью между аланином, находящимся в четвёртом положении

одной пептидной субъединицц и т-диаминопимелиповой кислотой другой субъединицы. Около 20% глютаминовой кислоты соединены с глицином.

Таблица 22. Первичная структура пептидов, выделенных из гидро-лизата пептидогликана клеточных стенок Е.а1ас1:о1уисит

Предполагаемая структура Компонент Наблюдаемое Вычисленное

значение значение

Фракция 1- 3 Миг ОД 0,0

01и 1,0 1,0

А1а | □1у 0,2 0,2

В1и А1а | С-конц. Й1у 0,02 0,2

-Агрт В1и--б1у А1а 1,7 2,0

А1а-т Агрт Ы-конц. А1а 0,8 1,0

А1а С-конц. А1а 0,1 0,5

т-Агрт 1,0 1,0

Ы-конц.Агрт 0,6 0,5

С-конц.Агрт 0,01 0,0

Фракция 1-4 Миг А1а

В1и А}а Агрт 81и А1а

Г | I

А1а-Агрт В1и А1а

I | I

А1а-Агрт Б1и

А1а-Агрт

А1а

Миг 0,2 0,25

Ии 1,0 1,0

Б1у 0.1 0,0

С-конц. Иу 0,01 0,0

А1а 1,9 2,0

М-конц. А1а 0,8 0,75

С-конц. А1а 0,2 0,25

т-Агрт 0,9 1,0

Ы-конц.Агрт 0,22 0,25

С-конц.Агрт 0,04 0,0

(продолжение таблицы)

Фракция 2-1 Mur 1,3 2,0

GlcN 1,9 2,0

GlcN-Mur-GlcN-Mur Glu 1,0 1,0

Ala ) Gly 0,3 0,3

Glu Ala C-KOHU.Gly 0,02 0,3

и-Агрга Glu--Gly Ala 1,9 2,0

Ala-т-Агрм N-конц. Ala 0,6 0,5

Ala С-кокц.А1а 0,4 0,5

т-Агри 0,7 1,0

N-конц. A'2pm 0,5 0,5

С-конц.Агрм 0,03 0,0

Фракция 2-2 Mur 0,4 0,3

Glu 1,0 1,0

Mur i Gly 0,3 0,3

Ala С-кокц-Gly 0,1 0,3

Glu Ala Ala 1,5 2,0

т-Агрт Glu Ala N-конц. Ala 0,9 1,0

Ala-m-A^pm Glu-Gly С-конц.Ala 0,2 0,3

Ala— —т-Агрш т-Агрт 0,9 1,0

Aia N-конц. Агрт 0,4 0,3

С- конц. AgpWi 0,01 0,0

Фракция 1-4 имела близкий аминокислотный состав к фракции 1-3, аа исключением содержания мурамовой кислоты (0,2 моль/моль Glu) и N-концевой диаминопимелиновой кислоты - 0,6 и 0,22 моль/моль Glu во фракциях 1-3 и 1-4, соответственно. По-видимому, в состав фракции 1-4 входит тетралептид, в котором к одному Н-концевому аланиновому остатку присоединена ыурамовая кислота.

Фракция 2-1 являлась дипептидом, в котором к N-концевому аланиновому остатку присоединён тетрасахарид GlcN-Mur-GlcN-Mur. Обнаружено, что один остаток мурамовой кислоты в мурамилпептиде фракции 2-1 имел редуцирующий конец.

Фракция 2-2 имела примерно такой же аминокислотный состав,

как фракция 1-3. Анализ содержания С- и К-концевых аминокислот озволил предположить, что в состав данной фракции входит трипеп-тид, в котором мурамовая кислота присоединена к И-концевому ала-нину.

Экспериментально полученные данные по содержанию в выделенных пептидах аминокислот, аминосахаров, Ы- и С-концевых аминокислот хорошо коррелируют со значениями, вычисленными из предложенных первичных структур пептидов (таблица 22).

■На рис. 25 представлена первичная структура пептидогликана Е.а1ас1о1уИсии. Пептидные субъединицы имели последовательность аминокислот Ь-А1а-П-в1и(61у)-т-А2Рт-0-А1а. Диаминопимелиновая кислота, находящаяся в третьем положении одной пептидной субъединицы, соединена с алашшом, находящимся в четвёртом положении другой пептидной субъединицы . При этом следует отметить, что пептидоглигеан Е.а1ас1о1у(;1сит характеризуется высокой степенью полимерности. Не обнаружено фракций, в состав которых входила бы мономерная пептидная субъединица. Все аминогруппы диаминопимели-новой кислоты включены в связи.

-В1сЫ-Миг-

Ь-А1а -Миг-ЕИсИ-

0-61и Ь-А1а ш-Арт 0-61и- (В1у)

Б- А1 а-т- Агрт

0-А1а

Рис. 25. Первичная структура пептидогликана клеточных стенок Е.а1ас1о1уИсит

Полученные данные позволили сделать заключение о том, что два исследованых наш штамма рода ЕиЬас1ег1иш имеют различные типы пептидогликана, согласно классификации, предложенной Шляйфером и Кандлером. Авторами на основе собственных и литературных данных была разработана классификация пептидогликанов бактерий и обосно-

вана возможность её применения в хемосиетематике (Schleifer, Kandier, 1972; Schleifer, Seidl, 1985). В основу классификации была положена первичная структура пептидных субъединиц и межпептидных мостиков пептидогликана клеточных стенок бактерий. На рис. 26 приведена первичная структура пептидной субъединицы и показаны возможные аминокислотные замены. Все описанные пептидогликаны были разделены на группы А и В. К группе А отнесены пептидогликаны,

Гликан

1 L-Ala (Gly, L-Ser)

2 D-Glu (Gly, D-Ala)

3 и-Адап (L-Lys, L-Orn, LL-AaPm, L-Dab, L-HyLys,)

| (L-Dab, L-Hsr, L-Ala, L-Glu)

4 D-Ala

Рис. 26. Первичная структура пептидной субъединицы.

В скобках приведены возможные аминокислотные замены (Schleifer, Kandier, 1972)

в которых пептидные субъединицы содержат в первом положении L-аланин, во втором - D-глютаминовую кислоту, в третьем - диами-нокислоту и четвёртом - D-аланин. Связь между двумя пептидными субъединицами образована между диаминокислотой и D-аланином. К группе Б отнесены пептидогликаны, в пептидных субъединицах которых первое положение занимают глицин или L-серин. Две субъединицы соединены между собой связью между глютаминовой кислотой и D-ала-нином. Рассмотрим более подробно классификацию пептидогликанов, отнесённых к группе А.

Подгруппа AI: пептидные субъединицы соединены напрямую: AI«: L-Lys в положении 3; Alß: L-Orn в положении 3; Air: т-Агрш в положении 3.

Подгруппа А2: межпептидный мостик образован пептидной субъединицей.

Подгруппа A3: межпептидный мостик содержит Gly или монокарбоксильные аминокислоты: A3o(: L-Lys в положении 3; A3ß: L-Orn в положении 3; АЗг: L,L-A2pm в положении 3.

Подгруппа A4: межпептидный мостик содержит дикарбоксильные аминокислоты: A4«: L-Lys в положении 3; А4В: L-Orn в положении 3; А4г: т-Агрт в положении 3.

Пептидогликан исследованных штаммов - E.nodatum и E.alacto-lytlcum - может быть отнесён к группе А, поскольку пептидные субъединицы имеют последовательность аминокислот Ala-Glu-Daa-Ala, где диаминокислота (Daa) представлена орнитином, в случае E.nodatum, и п-диаминопимелиновой кислотой, в случае E.alactolyticum. Межпептидный мостик пептидогликана E.nodatum имел Последовательность аминокислот L-Ala-L-Ala-L-Orn.

Орнитин был обнаружен ранее в третьем положении пептидной субъединицы в пептидогликане группы А ряда бактерий (Ghuysen et al., 1968; Kandier, 1970; Schielfer, Kandier, 1970; Jürgens et al., 1987), но не в составе мостика. Обнаруженный нами пептидогликан, в котором орнитин входит в состав не только пептидной субъединицы, но и межпептидного мостика, не описан ранее. Мы предложили отнести данный тип пептидогликана к А5г типу.

В пептидогликане E.alactolyticum пептидные субъединицы непосредственно соединены между собой, что дало нам основание отнести данный пептидогликан к А1т типу.

Таким обравом, в настоящее время определена первичная структура пептидогликана трёх представителей рода Eubacterlum. Показано, что пептидогликан Е.llmosum относится к Б2 типу (Guinand et al., 1969; Schleifer, Seldl, 1985), E.nodatum - А5т типу, E.alactolyticum - Ali типу. Однако на основании имеющихся данных представляется затруднительным сделать заключение о том, какой тип пептидогликана является типичным для данного рода. Тем не менее, полученные данные указывают на гетерогенность рода Eubacterlum и, по-видимому, могут быть использованы при определении точного систематического положения, по крайней мере, трёх исследованных видов.

(29, 31-33, 57).

Цитируемая литература

1. Ghuysen J.M., Leyh-Boullle M., Dlerickx L., Blochlm. Blophys. Acta, 1962, 63, N2, p. 286-296

2. Ghuysen J.M., Tipper D.Т., Birge C.H. et al., Biochemistry, 1965, 4, N10, p. 2245-2254.

3. Ghuysen J.M., Bacterlol. Rev., 1968, 32, «4, p. 425-464.

4. Ghuysen J.M., Dlerickx L., Coyette J. et al., Biochemistry, 1969, 8.N1, p. 213-222.

5. Gulnand M., Ghuysen J.M., Schleifer K.H. et al., Biochemistry, 1969, 8, N1, p. 200-207.

6. Jürgens U., Meissner J., Fischer U. et al., Arch. Mlcroblol., 1987, 148, N1, p.72-76.

7. Kandier 0., Int. J. Sys. Bacterlol., 1970, 20, N2, p. 491-507.

8. Schielfer K.H., Kandier 0., J. B3cterlol., 1970, 103, N1, p. 387-392.

9. Schleifer K.H., Kandier 0., Bacterlol. Rev., 1972, 36, N4, p. 407-477.

10. Schleifer K.H., Seidl P.H., in Chemical methods In bacterial systematlcs, 1985, Academlc Press, NY, (Goodfellow, Mlnnikln), p. 201-219.

5.2. Получение протопластов • Staphylococcus aureus с помощью лизоамидазного комплекса. Протопласты широко используются при исследовании различных процессов, протекающих в микробной клетке, генноинженерных манипуляциях, изучении структурно-функциональной . организации бактерий (Fodor et al., 1979; Фомичёв и др., 1982; Яковенко, Троицкий, 1985; Wlrth, 1986). Наиболее широко при получении протопластов из грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов используется лизоцим. Однако использование лизоцима для получения протопластов и сферопластов из грамположительных кокков -стафилококков и стрептококков - неэффективно. Это связано с особенностью строения клеточных стенок этих микроорганизмов -(Акатов, Зуев, 1983). Для получения протопластов из клеток грамподожитель-

ных кокков используют бактериолитические ферменты (Ward, Perkins, 1968; Hlrachl at al., 1971; Mansito at al., 1987). Ввдедение протопластов из клеток стафилококков наиболее часто проводят с использованием лизостафина (Schuhardt, Kleslus, 1968) и фермента L-11, продуцируемого Flavobacterlum sp. (Hlrachl at al., 1971). В данной работе исследована возможность получения протопластов с использованием бактериолитическога препарата лизоамидазы. Наличие в препарате лизоамидазы высокой протеолитической активности могло препятствовать получению функционально нативных протопластов. Кроме того, представлялось крайне важным исследовать с помощью методов электронной микроскопии процесс гидролиза клеточной стенки бактерий в условйях, стабилизирующих полученные протопласты.

' Первым этапом при исследовании возможности получения протопластов из клеток стафилококков было изучение влияния возраста культуры на ее чувствительность к лиаоамидазе- Известно, что гидролиз клеток бактериодитическими ферментами зависит от фазы роста, в котором находятся клетки ( Акатов, Зуев, 1983). Как видно из рис. 27, чувствительность клеток S.aureus к лизоамидазе была максимальна в середине логарифмической фазы роста. Клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста, лизировались со скоростью в 5'раз более высокой, чем клетки в стационарной фазе. Эти данные

Рис. 27. Чувствительность клеток S.aureus к лизоамидазе в зависимости от возраста культуры: 1 - кривая роста; 2 - лизис клеток (АХ)

хорошо согласуются с ранее полученными результатами, свидетельствующими, что клетки стрептококков, находящиеся в стационарной фазе роста.(Calandra, Cole, 1980), и клетки стафилококков, находящиеся в стационарной и лаг-фазе ( Hlrachl at al., 1971; Mansito

at al.( 1987), менее чувствительны к бактериолитическим ферментам, чем клетки в логарифмической стадии. Видимо, устойчивость клеток, находящихся в стационарной и лаг-фазе роста, к дитическим ферментам связана с наличием полностью сформированной клеточной стенки.

Использование 1М сахарозы в качестве осмотического стабилизатора позволило получить выход протопластов около 80% в течение часа. Аналогичные результаты получены при использовании лизоста-фина. Следует отметить, что начальная скорость образования протопластов при использовании лизостафина была выше, чем при использовании лигоамидавы, однако, количество образовавшихся протопластов к 60 минуте было практически одинаковым.

Электронномикроскопические исследования процесса образования протопластов показали, что после 5 минут инкубации клеток с лизо-амидазой в присутствии сахарозы наблюдается локальные зоны гидролиза клеточной стенки. Число и размер участков клеточной стенки, гидролизованных лизоамидазой, возрастало с увеличением времени инкубации, Вследствие перфорации клеточной стенки образовывались осмотически чувствительные сферопласты, что сопровождалось падением оптической плотности суспензии клеток. Продолжение инкубации в изотонических условиях приводило к повышению чувствительности сферопластов к осмотическому шоку и образованию протопластов. Последние выходили через лизированные участки стенки, и на конечной стадии они были полностью лишены клеточной стенки (рис 28).

О жизнеспособности полученных протопластов свидетельствовала их реверсия в бактериальные формы и дыхательная активность. Поглощение кислорода протопластами составляло 70-90% от уровня дыхательной активности интактных клеток (рис. 29). Следует, однако, отметить, что относительная скорость окисления экзогенных субстратов протопластами была выше, чем клетками (Табл. 23). Чувствительность дыхания протопластов и клеток к цианиду была примерно на одном уровне. Обработка протопластов протеиназой К или прона-зой приводила к потере чувствительности эндогенного дыхания к цианиду (Artzatbanov, Petrov, 1990). Это свидетельствовало о натив-ности дыхательной цепи протопластов S.aureus, полученных с помоп?>ю лизоамидазы.

Рис. 28. Образование протопластов из S. aureus под действием лизоамидазы. Длина масштабной метки 0,2 мкм; а - ультраструктура клеток S. aureus 209 Р, растущих на ЫПБ; b - с образование сферопластов; d - Г образование протопластов.

Рис. 29. Поглощение кислорода клетками и протопластами 3.aureus 209Р. Б 2 мл 1М сахарозы вносили (показано стрелками): 1 - 0,4 мг клеток стафилококка; 2 - протопластов, полученных из 0,4 мг клеток; 3 - KCN до конечной концентрации 1 ыМ.

Таблица 23. Скорость окисления субстратов протопластами и клетками Staphylococcus aureus.

Субстрат* Клетки Протопласты

нмоль Ой % нмоль Og

мин- мг мин- мг

Эндогенное 45,8 100 35,0 100

дыхание

Глюкоза 59,7 130 65,1 186

Сукцинат 53,6 117 47,6 136

«-Глицерофосфат 89,8 196 101,1 286

Этанол 82,4 180 101,5 290

* - Концентрация - 20 мМ, этанол - IX

Таким образом, лизоамидаза может быть использована для полу1 чения протопластов из клеток S.aureus. При этом полученные протопласты сохраняли нативность ферментов дыхательной цепи и были спо-

собны окислять экзогенные субстраты со скоростью не меньшей, чем целые клетки. (25, 38, 40, 43, 51, 61).

Цитируемая литература

1. Акатов А.К., Зуев B.C. Стафилококки. М., 1983, 256с.

2. Фомичёв Ю.К., Максимова Н.П., Желдакова Р.А., Генетика, 1982, 18, N12, с.1927-1937.

3. Яковенко К.Н., Троицкий Н.А. Протопласты микроорганизмов. Минск, 1985, 160с.

4. Artsatbanov V.Y. , Petrov V.V., Arch. Microbiol., 1990, 153, N2, p. 580-584.

5. Calandra G.B., ColeR.M., Infect. Immun., 1980, 63, N2, p. 1033-1037.

6. Fodor K., Rostas K., Alfoldl L., In Advances in protoplasts research, Budapest, 1979, p. 19-28.

7. Hirachl Y., Kotanl S., Suginaca H. et al., Blken J., 1971, 14, N1, p. 11-28.

8. Manslto T.B., Falcon M.A., Moreno J. et al., Mlcroblos, 1987, 49, N1, p. 55-64.

9. Schuhardt V.T., Kleslus P.H., J. Bacteriol., 1968, 96, N3, p. 734-737.

10. Ward J.В., Perkins H., Blochem J., 1968, 106, N2, p. 391-400.

11. Wlrth R., An F.Y., Clewell D.B., J. Bacteriol., 1986,165, N3, p. 831-836.

5.3. Исследование структуры пептидогликана DD-карбоксипепти-дазкых мутантов Streptococcus pneumoniae. DD-карбоксипептидаза является ферментом, обнаруженным у всех исследованных бактериях. Данный фермент катализирует отщепление D-Ala от пептидной субъединицы пептидогликана L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala. Однако имеющиеся s литературе данные не дают ясную картину относительно роли этого фермента в биосинтезе клеточной стенки. Анализ мутантов E.coll с делецией в DD-карбоксипептидазах (пенициллинсвязывающие белки (ПСБ) 5 и 6) не выявил каких-либо фенотипических изменений клеток (Broom-Smith, 1985; Sprat, 1980). Мутанты же S.aureus, ли-

шенные ПСБ 4, который обладая DD-карбоксипептидазной активностью, имели некоторые фенотипические изменения и характеризовались снижением скорости роста (Curtis at al., 1980; Wyke at al., 1981).

Получение мутантов S.pneumoniae, лишенных DD-карбоксипепти-дазы - ПСБ-3, поаволшю определить функцию этого фермента In vivo. Мутанты были получены путём введения пдазмиды в область гена ПСБ-3 (Schuster at al., 1990). Исследована первичная структура пептидной части пептидогликана двух мутантов CS1 и CS2, имеющих различную ориентацию плазмиды. Отделение пептидной части пептидогликана от гликановых цепей проводили гидролизом клеточных стенок исследуемых штаммов ацетидмурамил-аланин амидазой 5.pneumoniae. Литический фермент выделяли из рекомбинаятного штамма Е.соП, несущего ген пневмококковой амидазы (Garola at al., 1385). Как видно из рис. 30, мутанты имели идентичный набор пептидов, который отличался от родительского штамма R6. Основными мономерами родительского штамма являлись пептиды 1 и 3, мутантов - пептид 2, количество которого увеличивалось в 3,6 раза. Основными димерами штамма R6 являлись пептиды 4 (33%), 5 (19Х) и 6 (13 %.), у мутантов - 5 (18%), 7 (9%) и В (14Л).

Установлена первичная структура пептида В, не обнаруженного ранее ни у одного из исследованных штаммов S.pneumoniae. Пептид состоял из Ala, Gin, Lys и Ser в молярном отношении 3,1:1,0:1,0: 0,5, соответственно, молекулярная масса - 1044,3. Алании обнаружен в первом цикле деградации методом Эдмана. Никаких аминокислот не выявлено в последующих циклах деградации. Этот пептид являлся димером линейного пептида Ala-Gln-Lys-Ala и пептида Ala-Gln-Lys -Ala-Ala, соединённых между собой межпептидным мостиком Ala-Ser. Необычность первичной структуры данного пептида заключалась в том, что вторая пептидная субъединица представлена не тетрапепти-цом (или трипептидом), а пенталептидом. Увеличение содержания гептида 2 и появление пептида В в пептидогликане мутантов являюсь следствием отсутствия DD-карбоксипептидазы. В нормальных метках пептид 2 не накапливается, а путём последовательного расцепления DD и DL-карбоксипептидазами превращается в трипептид, юторый, как было показано ранее (Laltlnen, Tomasz, 1990), явля-¡тся акцептором в клеточной стенке, определяющим локализацию пе->егородки в делящейся клетке.

iUJj

jjlltl/^

.^^iJUljiit^1

20 40 60

Время (мин)

Родительский штамм R.6

100

ДД-карбоксипептвдазный мутант

»Cln \}у*

»Gin

Л) а—Scr—Ly»

iGb

4. i

Основной димер ¡Gin iGln I I

Ly« Ly. ! /

Ly»

iCln jj.

¡(¡In

Lys

iCln d

Ly s

I AI Aln-*'

Als AJa

iGln wL

г—Ly» >

iGjo

Ala—Scr—Lys

Рис. 30. Анализ пептидной части пептидогликана 5. pneumc nie R6 и карбоксипептидазных мутантов CS1 и CS2.

Биосинтез пептидов 5 и 7 в мутантах может происходить, по-видимому, в отсутствие DD-карбоксшептидазы. Мы полагаем, что наличие DL-карбоксилептидазы, транспептидазы и эндопептидазы является достаточным для образования этих пептидов. Их биосинтез, по-видимому, происходит через образование тримера путем транслептидазной реакции между пептидом В (в случае образования пептида 5) и пептидом 2 (рис.31). Далее последовательным гидролизом этого тримера эндопептидазой и DL-карбоксипептидазой образуется пептид 5. Аналогичная схема может быть предложена для образования пептида 7, В этом случае сначала из двух пептидов II под действием транспептидазы образуется димер, к которому присоединяется пептид 2 с образованием тримера. Далее последовательным действием эндопептидазы и DL-карбоксипептидазы образуется пептид 7.

Ряд фенотипических изменений был обнаружен в мутантах. iiy-тантные штаммы росли с более низкой скоростью. У мутантов была нарушена локализация перегородки в делящихся клетках, что может быть следствием уменьшения количества акцептора (тримера) - продукта гидролиза пентапептида DD- и DL-карбоксипептидааами.

Таким образом, впервые показано, что мутация в DO-карбокси-пептидазе S.pneumoniae приводит к изменению структуры пептидной части пептидогликана, а именно, к увеличению доли пептидов, в которых одна из пептидных субъединиц представлена пенталептидом, и уменьшению количества гршептида. (62).

Цитируемая литература

1 Broome-Smlth J.К., J. Gen. Microbiol., 1985, 131, N9, p. 21152118.

2. Garcia E., Garcia J.L., Ronda P. et al., Mol. Genet., 1985, 201, N1, p. 225-230.

3. Curtis N.A., Hayes M.V., Wyke A.W. et al., FEMS Microbiol Lett., 1980, 9, N1, p. 263-266.

4. Laltlnen H., Tomasz A., J. Bacterol., 1990,172, N10, p.5961-5967.

5. Schuster C., Dobrlnskl В., Hakenbeck R., J. Bacteriol., 1990, 172, N11, p. 6499-6505.

6. Spratt B.G., J. Bacteriol., 1980, 144, N3, p. 1190-1192.

У Л-V С

> рл® I®

I I триЛ t u>Him 1

X © ©-

Рис. 31. Предполагаемая схема образования пептидов пептидо-гликана клеточных стенок S. pneumoniae (а) и DD-карбокеипеп-тидазного мутанта S.pneumoniae (б). Символом (•) обозначена аминокислота в пептидной субъединице: три, тетра и ленгапеп-тид, имеющее последовательность аминокислот Ala-Gln-Lys, Ala -Gln-Lys-Ala, Ala-Gln-Lys-Ala-Ala, представлены соотвественно тремя, четырьмя и пятью символами. Символом d-oобозначен ди-пептид Ser-Ala ТРаза - транспептидаза, DD или DL.KJlasa -карбоксипептидаза.

7. Wyks A.W., Ward J.B., Hayes M.V. et al., Eur. J. Blechern., 1981, 119, N1, p. 389-393.

5.4. Разработка лекарственного препарата на основе бактериоли-тического комплекса лизоамидазы. Выделение комплекса бактериолити-ческих и протеолитических ферментов - лизоамидазы из культуральной жидкости Pseudomonas sp. и изучение свойств ферментов, входящих в комплекс, создало необходимые предпосылки для разработки лекарственного препарата для лечения заболеваний, вызываемых патогенными, в том числе устойчивыми к антибиотикам, стрептококками и стафилококками.

Исследованиями коллектива сотрудников Ш РАН под руководством чл. корр. РАН И. С. Кулаева совместно с рядом других, в том числе медицинских, учреждений России, при непосредственном участии автора данной работы, была установлена возможность эффективного использования бактериолитического ферментного препарата лизоамидазы в ряде областей медицины.

Отработаны методы стерилизации и хранения лизоамидазы. Стерилизацию препарата проводили r-облучением в дозе 0,7-1 Ырад. Данные по хранению лизоамидазы при комнатной температуре показали, что по истечении трёх лет показатели качества лизоамидазы не изменялись. Лизоамидааа обладала бактерицидным действием на клетки стафилококков в концентрации 400-1000 мкг/мл при концентрации клеток 107/мл.

Проведены медико-биологические й клинические испытания лизоамидазы. Во всех случаях применения лизоамидазы наблюдали сокращение сроков заживления ран, ожогов, других поврещений кожи. Кроме того, лизоамидаза являлась эффективным лекарственным препаратом при лечении ряда стоматологических заболеваний, в том числе стоматитах и заболеваниях парадонта. Фармакологический комитет СССР разрешил медицинское применение лизоамидазы: приказ МЗ СССР 622 от 21.11.1989, регистрационное удостоверение 891622/1. (19, 35).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа проведена в рамках проекта по разработке научных основ получения и практического использования бактериолити-ческих ферментов.

В первой части работы нами исследованы бактериолитические ферменты Pseudomonas lytica, Mlcavlbrlo admlrandus и Pseudomonas sp.

Обнаружено, что культура P.lytica синтезировала и секретиро-вала в среду литическую протеиназу. Фермент гидролизовал пепти-догликан клеточных стенок Staphylococcus aureus по связям в пен-таглициновом мостике. Аналогичным механизмом гидролиза пептидог-ликана стафилококков обладали лизостафин (Iversen, Grov, 1973) и фермент LU (Kato et al., 1968). Паразитическая бактерия M.admlrandus синтезировала литическую протеиназу, которая гидро-лизовала убитые клетки E.coll. Несмотря на внеклеточный рост на клетках хозяина, бактерия-паразит не секретировала бактериолитические ферменты в ростовую среду и, следовательно, можно предположить, наличие у паразита ферментативной системы, осуществляющей нарушение целостности внешней мемраны. Через поврежденные участки внешней.мембраны хозяина бактериолитические ферменты транспортируются непосредственно из клеток-паразита в клетки хозяина, минуя ростовую среду. Это обеспечивает эффективность гидролиза клеток грамотрицательных бактерий, у которых внешняя мембрана является барьером для проникновения в клетку белков и в том числе бактерио литических ферментов.

Из фильтрата культуральной жидкости Pseudomonas sp. выделен комплекс бактериолитических и протеолитических ферментов и полисахарида, названный лизоамидазой. Показано, что в состав лизоами-дазы входят глицил-глицин зндопептидаза, ацетилмурамил-аланин амидаза и ацетилмурамидаза. Все три фермента принимают участие в гидролизе пептидогликана S.aureus. Только два фермента лизоамида-зы - ацетилмурамил-аланин амидаза и ацетилмурамидаза - гидролизо-вали пептидогликан Micrococcus luteus.

При исследовании механизма гидролиза меток Streptococcus pneumoniae лизоамидазой впервые выявлена зависимость между чувствительностью клеток к бактериолитическим ферментам и их устойчивостью к пенициллину. Лизоамидаза гидролизовала только устойчивые к пенициллину клетки. Это связано с тем, что пептидогликан устойчивых к пенициллину штаммов S.pneumoniae содержит димерные разветвлённые пептиды, которые гидролизуются лизоамидазой. Гидролиз димерных разветвлённых пептидов происходит по связям, образованным аланином, находящимся в четвёртом положении пептидной субъединицы, и аланином межпептидного мостика.

Таким образом, лизоамидаза гидролизовала клетки стафилококков независимо от их устойчивости к антибиотикам, гидролиз же штаммоз S.pneumoniae определялся их устойчивостью к пенициллину. Основными ферментами лизоамидазы, гидролизующими клетки стафилококков и стрептококков являются, соответственно, глицил-глицин и аланил-аланин эндопептидазы. Ацетилмурамил-аланин амидаза гидролизовала только растворимые фрагменты клеточных стенок S.pneumoniae, получаемые в результате действия на клеточные стенки аланил -аланин эндопептидазы. Следовательно, по крайней мере, в отношение клеточных стенок S.pneumoniae амидаза не являлась литическим ферментом.

Из лизоамидазы выделены в злектрофоретически гомогенном состоянии металлопротеиназа, нейтральная фосфатаза и литическая про-теиназа Л2, а также полисахарид и литическая фракция Л1, состая-шдя из мурамидааы и пептидазы.

Для оценки вклада каждого выделенного компонента лизоамидазы в её суммарную бактериолитическую активность проведена реконструкция препарата. Показано, что только активности литической протеиназы Л2 и литической фракции Л1 определяли суммарную активность лизоамидазы. При этом было выяснено, что полисахарид, входящий в состав лизоамидазы, обладал способностью стабилизировать активности бактериолитических ферментов.

Выделение нового бактериолитического комплекса - лизоамидазы - расширяет список бактериолитических ферментов, которые широко используются в научных исследованиях при изучении структуры •щеточных стенок, получении протопластов и выделении ДНК. Использование бактериолитических ферментов при изучении структуры пеп-

тидогликана имеет значительные преимущества перед химическими методами и позволяет определять структуру как пептидогликана в целом, так и отдельных пептидов, входящих в его состав.

В данной работе бактериолитический комплекс Streptomyces albus G использован при определении первичной структуры пептидной части пептидогликана двух видов бактерий, относящихся к роду Eubacterlum и ацетилмурамил-аланин амидаза - при исследовании первичной структуры пептидной части пептидогликана DD-карбокси-пептидазных мутантов S.pneumoniae. Было показано, что пептидогли-кан Eubacterlum nodatum имеет состав пептидной субъединицы Ala-Glu(Gly)-Qrn-Ala. Орнитин одной пептидной субъединицы соединён через мостик Orn-Ala-Ala с аланином другой пептидной субъединицы. В пептидогликане Eubacterlum alactolytlcum пептидные субъединицы, имеющие состав Ala-Glu(Gly)-mA2Pm-Ala, непосредственно соединены между собой. Полученные данные теют важное значение и, наряду с другими таксономическими признаками, могут быть использованы в систематике.

С использованием ацетилмурамил-аланин амидазы выявлены тонкие детали в структуре пептидогликана DD-карбоксипептидазных мутантов S.pmeumonlae. DD-карбоксипептидаза является важным ферментом, принимающим участие в биосинтезе клеточной стенки бактерий. Епервые показано, что мутация, приводящая к нарушению DD-карбок-сипептидазы, вызывает изменения в структуре пептидогликана. В пеп тидогликане мутантных штаммов обнаружен пептид, в котором одна из субъединиц представлена пентапептидом. Количество пентапептида увеличено в мутанте в четыре раза. Эти данные имеют принципиальное значение и объясняют нарушения локализации перегородки у мутантов, что может быть следствием уменьшения количества акцепторг Стримера) - продукта гидролиза пентапептида DD- и DL-карбоксипеп-тидазами.

Исследование возможности практического применения лизоами-дазы показало, что она, наряду с другими бактериолитическими фер ментами, может быть использована для получения функционально ак тивных протопластов S.aureus, в которых полностью сохраняютс ферменты дыхательной цепи. При зтом выяснено, что процесс образо вания протопластов происходит в две стадии. Сначала образуйте осмотически чувствительные сферопласты, несущие фрагменты клеточ

ной стенки. Затем через гидролизованные участки клеточной стенки протопласты выходят в среду. Образование протопластов не сопровождается тотальным гидролизом клеточных стенок; для их образования достаточным является гидролиз локального участка клеточной стенки.

Другой областью применения лизоамидааы является медицина. Гидролиз лизсамидазой патогенных стафилококков и стрептококков, в том числе устойчивых к антибиотикам, давало нам основание надеяться на возможность использования лизоамидазы при лечении заболеваний, вызываемых патогенными грамположительными кокками. В создании лекарственного препарата на основе лизоамидазы участвовали институты РАН и РАМН. Результатом этой совместной работы явилась разработка лекарственного препарата на основе лизоамидазы для лечения ран, ожогов и других повреждений кожи, а также ряда стоматологических заболеваний. Разработаны четыре регламента на производство лизоамидазы. Промышленный выпуск лизоамидазы в 19891990 гг. осуществлялся на экспериментальном заводе Института органического синтеза АН ЛатвССР из субстанции, нарабатываемой на опытно-технологической установке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН. В настоящее время лизоамидааа производится на заводе ферментных препаратов, г. Вышний Волочёк.

Таким образом, несмотря на большое количество патентной и научной литературы по бактериолитическим ферментам, включая способы их получения и возможные области применения, единственным используемым в медицинской практике лекарственным препаратом, .в состав которого входят бактериолитические ферменты, лизирующие стафилококки и стрептококки, является лизоамидаза.

ВЫВОДЫ

1. Изучены бактериолитические ферменты Pseudomonas lytlca, Pseudomonas sp., Mlcavlbrio admlrandus. Показано, что литическая протеиназа Pseudomonas lytlca гидролизуег в пептидогликане клеточных стенок Staphylococcus aureus связи в пентаглициновом мое-

тике. В состав лизоамидазного комплекса Pseudorrionas sp. входят глицил-глицин эндопептидаза, ацетилмурамил-аланин амидаза и му-рамидаза. Все три фермента прининимают участие в гидролизе пепти-догликана Staphylococcus aureus. Пептидогликан клеточных стенок Micrococcus luteus гидролизуется толь;и ацетидмурамил-амидазой и мурамвдазой. Бактериолитическая система паразитической бактерии Mlcavibrio admlrandus представлена литической протеиназой.

2. Чувствительность клеточных стенок Streptococcus pneumoniae к лизоамидазе определяется наличием в структуре пептидогли-кана разветвлённых димерных пептидов, в которых s-аминогруппа ли-зинового остатка замещена пептидом Ala-Ala или Ala-Ser. Появление таких пептидов, как правило, связано с развитием устойчивости штаммов к пенициллину. В разветвлённых пептидах гидролизу подвергаются связи, образованные аланином в четвёртом положении пептидной субъединицы и аланином межпептидного мостика.

3. Из бактериолитического комплекса лизоамидазы выделены логическая фракция Л1, содержащая протеиназу, мурамидазу и литическую пептидазу, и полисахарид. В гомогенном состоянии выделены металлопротеиназа, литическая протеиназа Л2 и нейтральная фосфа-таза. Изучены физико-химические свойства выделенных ферментов и их вклад в суммарную бактериолититическую активность лизоамидазы. Показано, что активности литической протеиназы Л2 и литической фракции Л1 определяют бактериолитическую активность лизоамидазы. Полисахарид оказывает стабилизирующее влияние как на отдельные бактериолитические ферменты, так и на бактериолитическую активность реконструированного комплекса.

4. С использованием комплекса бактериолитичееких ферментов Streptomyces albus G изучена первичная структура пептидной части пептидогликана клеточных стенок двух штаммов, относящихся к роду Eubacterlum. Показано, что пептидогликан Eubacterlum nodatum относится к А5г типу и имеет состав пептидной субъединицы Ala-Glu (Gly)-Orn-Ala. Орнитин одной пептидной субъединицы соединён посредством мостика 0гп-А1а-А1а с аланином другой пептидной субъединицы. Пептидогликан Eubacterlum alactolytlcum относится к Air типу. Две пептидные субъединицы, имеющие состав Ala-Glu(Gly)-mA2pm-Ala, непосредственно соединены между собой.

5. С помощью бактериолитического фермента - ацетилмура-

мил-аланин амидазы исследована первичная структура пептидов DD-карбоксипептидазных мутантов Streptococcus pneumoniae, несущих дефект в пенициллинсвязывающем белке 3. Отсутствие Ш-карбокси-пептидазы приводит к изменению первичной структуры пептидов пеп-тидогликана. Увеличивается количество пентапепгида, появляется димерный пептид, в котором одна из пептидных субъединиц образована пентапептидом. Кроме того, у мутантных штаммов уменьшается количество трипептида, что приводит к нарушению локализации перегородки в дедяшуися клетках.

6. Проведенные исследования и последующие медико-биологические и клинические испытания позволили разработать на основе лизоамидазы эффективный лекарственный препарат. С 1989 года ' лекарственный препарат лизоамидаза выпускается в промышленном масштабе и применяется в медицине для лечения ран, ожогов и других повреждений кожи, а так же твёрдых и мягких тканей ротовой полости.

Основные публикации по теме диссертации.

1. Кулаев И.О., Северин А.И., Абрамочкин Г.В. Еактериолитичеекие ферменты микробного происхождения в биологии и медицине. Тезисы докл. Есес. совещания по медицинской энзимологии, Алма-Ата, 1983, с.142.

2. Кулаев И.С., Северин А.И., Абрамочкин Г.В. Еактериолитичеекие ферменты в биологии и медицине. Вестник АШ СССР, 1984, N8, с.64-69.

3. Бобык М.А., Кулаев И.С., Ламбина В.А., Плотникова З.С., Северин А.И., Таусон Е.Л., Чуркина Л.Г. Штамм Pseudomonas lytlca ЕКМ-В-1454Д - продуцент литического фермента. Авт. свид. СССР N 1075740. Ш N24, 1985.

4. Северин А.И., Таусон Е.Л., Кулаев И.С. Исследование биосинтеза бактериолитических ферментов культурой Pseudomonas lytlca. Тезисы докл. Всес. конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Кобулети, 1986, с.34.

5. Маркелова Н.Ю., Афиногенова A.B., Северин А.И. Выделение и

некоторые свойства внутриклеточной протеиназы из экзопарази-тичеких бактерий Micavibrio admlrandus. Тезисы докл. Там же, с. 43.

6. Степная O.A., Северин А.И., Кулаев И.О. Выделении и характеристика бактериолитических ферментов из препарата лизоамида-вы. Тезисы докл. Там же, с.45.

7. Таусон Е.Л., Северин А.И., Кулаев И.С. Выделение бактериолитических ферментов из культуры Pseudomonas lytica. Тезисы докл. Там же, с.45.

8. Кулаев И.С., Северин А.И., Абрамочкин Г.В. Бактериолитические ферменты: перспективы их использования в медицине. Тезисы докл. Всес. биохимический съезд, Киев, 1986, с.80-81.

9. Северин А.И., Степная O.A., Крупянко В.И., Кулаев И.О. Очистка и некоторые свойства нейтральной фосфатазы ферментного препарата лизоамидааы, выделенного из бактерии семейства Pseudomonadaceae. Биохимия, 1986, т.51, в.4, с.684-690.

10. Северин А.И., Степная O.A., Кулаев И.С. Счистка и свойства металлопротеиназы ферментного препарата лизоамидааы, выделенного из бактерии семейства Pseudomonadaceae. Биохимия, 1986, т.51, В.5, с.869-875.

11. Степная O.A., Северин А.И., Кулаев И.С. Некоторые физико-химические свойства литической протеиназы Л2 ферментного препарата, выделенного из бактерии семейства Pseudomonadaceae. Биохимия, 1986, т.51, В.6, с. 909-915.

12. Таусон Е. Л., Северин А.И. , ЧуркинаЛ.Г., Еобык Ы.А., Ламби-наЕ.А., Кулаев И.С. Обнаружение бактериолитической активности в ^льтуре Pseudomonas lytica. Прикладная биохимия и микробио логия, 1986, т.22, в.З, с.302-309.

13. Severin A.I., Tauson E.L., Kulaev I.S. A study of biosynthesis of bacteriolytic enzymes by a Pseudomonas lytica culture. Abstr. Int.sympozlum on extracellular enzymes of microorganisms, Bechyne, 1986, p. 363.

14. Кулаев И.С., Северин А.И., Таусон Е.Л. Обнаружение и характеристика протеиназы культуры Pseudomonas lytica, лизирующей патогенные микроорганизмы. Тез. докл. Всес. симпозиума по медицинской энаимологии, 1986, Махачкала, с.40.

15. Таусон Е. Л., Северин А. И., БобыкЫ. А., Ламбина В. А., Кулаев

И.С. Лизис микроорганизмов литическим комплексом, продуцируемым Pseudomonas lytlca. Прикладная биохимия и микробиология, 1986, Г.22, В.4, С.526-530.

16. Степная O.A., Северин А.И., Кулаев U.C. Вактериолитические ферменты препарата лигоамидазы, выделенного из бактерии семейства Pseudomonadaceae. Биохимия, 1986, т.51, в.7, с.1117-1123.

17. Таусон Е.Л., Степная O.A., Северин А.И., Кулаев И.С. Регуляция биосинтеза литического фермента и протеиназ у культуры Pseudomonas lytlca. Прикладная биохимия и микробиология, 1986, Т.22, В.5, с.690-697.

18. Таусон Е.Л., Северин А.И., Кулаев U.C. Некоторые физико-химические свойства литического препарата, продуцируемого культурой Pseudomonas lytlca. Прикладная биохимия и микробиология, 1986, т.22, В.6, С.750- 757.

19. Кулаев U.C., Северин А.И., Абрамочкин Г.В., Степная O.A., Карелин A.A., Блатун Л.А., Сергель О.С., Гончарова З.Г., Самы-гин Т.Д. Еактериолитические ферменты микроорганизмов в лечении гнойных ран. Тезисы докл. Всес. конференции "Раны и раневая инфекция". Москва, 1986, с.194.

20. Северин А.И., Маркелова Н.Ю., Афиногенова А.В., Кулаев U.C. Выделение и некоторые физико-химические свойства литической протеиназы паразитической бактерии Mlcavlbrlo admlrandus. Биохимия, 1987, т.52, в.10, с.1594-1599.

21. Кулаев И.С., Северин А.И., Таусон Е.Л., Степная O.A. Обнаружение и характеристика литической протеиназы культуры Pseudomonas lytlca, лизирущей патогенные микроорганизмы. Вестник АНН СССР, 1987, N7, с.67-75.

22. Северин А.И., Таусон Е.Л., Степная O.A., Кулаев И.С. Исследование специфичности гидролиза клеточных стенок S. aureus 209Р литическим препаратом Pseudomonas lytlca. Прикладная биохимия и микробиология, 1988, т.24, в.2 с.187-192.

23. Таусон Е.Л., Северин А.И., Шобухова Т.С., Лебедева М.В., Андреева З.М., Кулаев И.С. Литическая активность в отношении грамположительных микроорганизмов ферментного препарата, выделенного из культуры Pseudomonas lytlca. Антибиотики и химиотерапия, 1988, т.33, N4, С.271-275.

24. Северин А.И., Степная O.A., Абрамочкин Г.Б., Кулаев И.С. Характеристика лизоамидазы - нового бактериолитического комплекса, перспективного терапевтического средства для лечения ран и атогов. Тезисы докл. Всес. конференции "Биосинтез ферментов микроорганизма),ж". Ташкент, 1938, с.17.

25. Петров В.В., Ратнер E.H., Северин А.И., Фихте Е.И., Кулаев И. С. Получение протопластов Staphylococcus aureus под действием лизоамидазы. Тезисы докл. Там же, с.237-238.

26. Abranochklr. G. V., Petrov V.V., Ratner E.N. , Severin A. I., Fikhte B.A., Kulaev I.S. Affect of the bacteriolytic preparation of lysoanidase on the Staphylococcus aureus 209P cells. Abst. Int. congress of biochemistry. Praque, 1988, MO, p.254.

27. Kulaev I.S., Severin A.I., Stepnaya O.A., Abramochkln G.V., BogdanovM. V. Characteristics of lysoanldase - new bacteriolytic complex, perspective therapeutic remedy for threatlng wounds and burns. Abst. Ibid., TU, p.59.

28. Kulaev I.S., Severin A.I., Tauson E.L. Biosynthesis of bacteriolytic enzymes by culture Pseudomonas lytlca. Abst. Int. symposium on overproduction of microbial products. Ceske Budejovice, 1988, p.196.

29. Severin A.I., Kokeguchl S., Kato K. Chemical structure of Eubacterlum alac.tolyt.lcum and E. nodatum cell wall peptidoglycan. Abst. Leipzig Simposium on biotechnology "Cell envelope - mediator and sign of cellular productivities". Leipzig, 1988, p.402.

30. Кулаев И.С., Северин A.M., Степная O.A., Круглая O.B. Ответственные за бактериолитическую активность компоненты препарата лизоамидазы, выделенного из бактерии семейства Pseudomonadaceae. Биохимия, 1989, т.54. в.2, с.201-305.

31. Severin A.I., Kokeguchl S., Kato К. Chemical composition of Eubacterlum nodatum cell wall peptidoglycan. Arch. Microbiol., 1989, v.151, N4, p.353-358.

32. Severin A.I., Kokeguchl S., Kato K. Chemical composition of Eubacterlum alactolytlcum cell wall peptidoglycan. Arch. Microbiol., 1989, v.151, N4, p.348-352.

33. Северин А. И. Химическая структура пептидогликана клеточных

стенок Eubacterlum alactolyticum и Eubacterlum nodatura. Тезисы докл. Всес. конференции "Регуляция микробного метаболизма". Пущино, 1389, с.6.

34. Крупянко В.И., Кудрявцева А.И., Валиахметов А.Я., Северин А.И., Абрамочккн Г.В., Зякун A.M., Лысогорская E.H., Филиппо-Еа И.Ю., Кулаев И.С., Степанов В.М. Субстратна! специфичность нейтральной металлопротеинаэы 4*?рыентного препарата лиаоали-дазы, выделенного из фильтрата культурсошной жидкости бактерии семейства Pseudornonadaceae. Биохимия, 1989. т.54, в.7. с. 1140-1150.

35. Kulaev I,S., Severin A.I., Stepnaya O.A., Abraniochkln G.V. Lysoanidase - new polyensymatlc staphylolytlc therapeutic remedy. Abstr. Int. symposium "Molecular organization of biological structurej". Moscow, 1939, v.l, p.122.

35. Severin A.I., Krupyanko V.I., Kudryvtseva A.I., Vallakhme-tov A.Y., Koslovsky A.G. , Kulaev I.S. Study on the substrate specificity and kinetic properties of metalloproteinase Isolated from the Pseudomonadaceae bacterial family. Proceedings Int. conference of biologically active natural products. Varna, 1989, v.l, p.133-133.

37. Arlnbasarova A.Y., Severin A.I., Plotnlcova Z.S., Abramoch-kln G.V., Koshcheyenko K.A., Kulaev I.S., Skryabln G.K. Immobilisation of the lysoamldase produser in carragenan, Ca-alglnate and polyacrllatiide gels. Ibid., v.4, p. 133-138.

38. Petrov V.V., Artzatbanov V.V.,. RatnerE.N., Severin A.I., Kulaev I.S. Structural and functional characterisation of Staphylococus aureus protoplasts Isolated using1 lysoanldase. Ibid. , v. 4, p.433-437.

39. Крупянко В.И., Северин А.И., Степная O.A., Козловский А.Г., Кулаев И.С. Исследование ингибирования нейтральной фосфатазы из Pseudomonadaeeae производными ее субстратов. Биохимия, 1989, т. 54, НЮ, С. 1658-1665.

Ю. Петров В.В., Артцагбанов В.Ю., Северин А.И., Кулаев И.С. Окисление первичных спиртов клетками 5.aureus и протопластами. полученными с помощью лизоамидазы. Доклады АН CCCF, 1989, т.308, N4, с.1003-1007.

: 1. Богданов М.В., Плотникова З.С., Северин А.И., Кулаев И.С. Вы-

■деление и сравнительное изучение полисахарида логического комплекса - лизоамидазы, экзоклеточного полисахарида и липо-полисахарида бактерии продуцента. Сб. научных трудов "Еакте-риолитический препарат лизоамидаза. Физиологические, биохимические и клинические аспекты". Пущино, 19S9, с.32-42.

42. Аринбаеарова А.Ю., Северин А.Г., Плотникова 3.С., Абрамоч-кин Г.В., Гулевская С.А., Кощеенко К.А., Кулаев И.С., Скрябин Г.К. Биосинтез лизоамидазы иммобилизованными клетками (структурно-функциональные аспекты). Там же, с.47-68.

43. Петроь В.В., Ратнер E.H., Северин А.И., Фихте Б.А., Кулаев И. ( Использование лизоамидазы для получения протопластов Staphylococcus aureus. Там же, с.68-80.

44. Северин А.И., Степная O.A., Крупянко В.И., Валиахметов А.Я., Кудрявцева А.И., Ильченко В.Я., Плотникова З.С., Зякун A.M., Козловский А.Г., Кулаев И.С. Выделение и характеристика ферментов, входящих в состав лизоамидазы. Там же, с.80-99.

45. Прокопович A.B., Зосина Е.В., Селезнева A.A., Казанина Г.А., Северин А.И., Абрамочкин Г.В., Кулаев И.С., Лопатнев С.В., Еасильева Л.Л, Галвиня В.Я., Волкова Т.И. Кинетика инактивации лизоамидазы при воздействии температуры и pH среды. Там же, с.103-109.

46. Абрамочкин Г.В., Ратнер E.H., Петров В.В., Северин А.И., Су-зина Н.Е., Фихте Б.А., Кулаев И.С. Действие бактериолитичес-кого препарата лизоамидазы на клетки Staphylococcus aureus 209Р. Прикладная биохимия и микробиология, 1990, т.26, в.1, с.93-100.

47. Kulaev ¡.S., Severin A.I., Stepnaya О.A. Lysoamldase: a novel antibacterial drug. Abstr. Int. conference on antimicrobial activity of non-antibiotics. Copenhagen, 1990, p.33.

48. Severin A.1., Kulaev I.S. Substrate specificity of the lysoamldase bacteriolytic enzymes. Abstr. Ibid., p.34.

49. Крупянко В.И., Северин А.И., Кудрявцева А.И., Валиахметов А.Я Козловский А.Г., Кулаев И.С. Некоторые физико-химические и кинетические свойства металлопротеиназы бактериолитического препарата лизоамидазы. Биохимия, 1990, т.55, в.7, с.1279-1288

50. Северин А.И., Валиахметов А.Я., Ильченко В.Я., Плотникова 3.С Кулаев И.С. Гидролиз пептидогликана клеточных стенок Micro

coccus luteus BKM-1314 лизоамидазой. Биохимия, 1990, т.55, в.7, с.1319-1327.

51. Петров В.В., Рагнер Е.Н., Северин А.И., Фихте Б.И., Кулаев И. С. Получение протопластов Staphylococcus aureus под действием лизоамидазы. Прикладная биохимия и микробиология, 1990, т.26,

в.3, с.413-421.

52. Severln A. I., Kudrlavtseva A. I., Krupyanko V.I., Kozlovsky A. G., Kulaev I.S. Amino acid composition and some kinetic properties of metalloprotelnase from the bacteriolytic preparation lysoamldase. Abstr. European congress on blotecnology. Copenhagen, 1990, p.272.

53. Stepnaya 0. A., Kudrlavtseva A.I., Severln A.I., Krupyanko V.I., Kozlovsky A.Q., Kulaev l.S. Some properties of bacteriolytic proteinase L2 of the polyenzyme bacteriolytic preparation lysoamldase obtained from the Pseudomonadaceae culture liquid. Ibid., p.272.

54. Kulaev I.S., Krupyanko V.I., Severln A.I., Stepnaya 0.A., Kozlovsky A.G. Neutral phosphatase from a bacterium of the family Pseudomonadaceae:isolation and properties. Ibid., p. 273.

55. Kudryavtseva A.Y., Krupyanko V.I., Severln A.I., Valiakhme-tov A.Y., Kozlovsky A.G., Kulaev I.S. Neutral metalloprotelnase of the lysoamldase enzyme preparation Isolated from the Pseudomonadaceae culture liqlud filtrate. Ibid., p.273.

56. Северин А.И., Валиахметов А.Я., Механизм гидролиза пептидогликана Micrococcus luteus ВКМ В-1314 лизоамидазой. Сб. научных трудов "Актуальные проблемы биохимии эукариот и прокариот", Пущино, 1990, с.33-45.

57. Северин А.И., Като К. Структура пептидогликана клеточных стенок Eubacterlum nodatum и Eubacterlum alactolytlcum. Там же, с.15-33.

58. Северин А.И., Ильченко В.Я., Кулаев И.С. Гидролиз пептидогликана клечных стенок Staphylococcus aureus лизоамидазой. Биохимия, 1990, т.55, в.11, с.2078-2099.

59. Аринбасарова А.Ю., Северин А.И., Плотникова 3.С., Абрамоч-кин Г.В., Кощеенко К.А., Кулаев И.С., Скрябин Г.К. Биосинтез лизоамидазы иммобилизованными клетками. Биотехнология, 1990,

N6, с.24-28.

60. Северин А.И., Степная O.A., Кулаев И.О. Металлопротеиназа. Авт. СВИД. СССР N 1594214. БИ N35, 1990.

61. Petrov V.V., Artzatbanov V.Y., Ratner E.N., Severin A.I., Kulaev I.S. Isolation, structural and functional characterization of Staphllococcus aureus protoplasts obtained using lysoamldase. Arch. Microbiol., 1991, v.155, p.549-553.

62. Severin A. I., Schuster C., Hakenbeck R., Tomasz A. Altered mureln composition In DD-carboxypeptidase mutant of Streptococcus pneumoniae. J.Bacterlol., 1992, v.174, N15,

c.5152-5156.

63. Severin A.I. Susceptibility of pneumococcal cell walls to the lytic complex - lysoamldase depends on resistance to penicillin. Abstr. ASM general * meeting, New Orleans, 1992, p. 564.

64. Степная O.A., Северин А.И., Кудрявцева А.И., Крупянко В.И., Козловский А.Г., Кулаев И.С. Ферменты бактериолитического комплекса лизоамидаза. Некоторые свойства бактериолитической протеиназы Л2. Прикладная биохимия и микробиология, 1992, т.28, N5, С.666-673.

20.09.93 г. Зак.5781Р. Тир.150 экз. Уч.-язд.л. 5.0 Отпечатано на ротапринте в 0Н1И ПНЦ РАН

Информация о работе

Северин, Анатолий Иванович
доктора биологических наук
Пущино, 1993
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Бактериолитические ферменты микроорганизмов: теоретические и прикладные аспекты ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Бактериолитические ферменты микроорганизмов: теоретические и прикладные аспекты"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бактериолитические ферменты микроорганизмов: теоретические и прикладные аспекты
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия