Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культура тканей, клеток и протопластов хлопчатника как модельная система для оценки генотипов к механизмам индукции соматического эмбриогенеза

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Культура тканей, клеток и протопластов хлопчатника как модельная система для оценки генотипов к механизмам индукции соматического эмбриогенеза"

академия наук республики узбекистан

научно-производственное объединение "биолог" институт экспериментально.! биологии растений

На правах рукописи

. джаЗианкар раман к.з.

культура тканей,клеток и пр0т0пласт03 хлопчанг1^

как модельная система для оценки генотипов к механизма!.! и1{дукц1'и соматического эмбриогенеза

.03.00.15 - Генетика 03.00.12 - Физиологиг растений

автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент-1992

Работа выполнена в Институте зкспернмонтальной биологии . растений АН ?Уо и в Институто физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН России.

Научный руководитель: кандидат биологических наук ЭРГАЕЕВ А-К.Э.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук аедукарлмпв A.a. кандидат биологических наук КАДЕТОВ У.К.

Ведущая организация - НПО "Селекция и семеноводство хлопчатнк: Ташкентская область.

Защита состоится "/£" г. j час. на

заседании регионального Специализированного совета по присуждении ученой степени кандидата биологических наук Д.015.19.01 б Институте экспериментальной биологии растений АН РУз (700143, Ташкент, ул.Ф.Ходнаева, 28).

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " " 1992 г.

•Ученый секретарь _ ^

Специализиоованного совета, ?

доктор биологических наук' Уу* и ПАВЛОВСКАЯ Н.Е.

с

,СТЕМ 5

'злбн'ость проблемы. Каиз понимание, как и каким образом Р аудирую? рост и развитие растений, з значительной сте-ямм^шисит от техники, позволявшей осуществлять манипуляцию генами в соотзетствувдх системах культуры ткани растений,хо- -гя культура ткани растений возникла как область науки более чем ползека току назад, ока наила блестящее применение н модификации генома, з связи с возникновением генной инженерии. Техника манипуляции генами на основе подходящих систем ткано-зсй экеплант/нротопласт — целое растение позволяет селекцио-ispau преодолотьбприродные барьеры между видами, а такае дает )оэ«озность внедрить гены и улучшать экспрессию генов, кодиру-хдос полезлио признаки, такие как устойчивость к болезням и йксация азота. На первый взгляд каяется, что человек уае на-;ал упразлять жкзнья в пробирках. Однако, встречаются немалые 'рудноетк а культуре in vitro растений, в частности, отсут-твие общих процедур для индукции соматического эмбриогенеза

роде Gosoypiun (Trolinder and Xhixian, 1983). Преодоление пецифичности генотипов к соматическому эмбриогенезу очень ва-яо, так как только в случае успепного эмбриогенеза возможно олучение целых растений в зысокой час оте в роде Соззургит, оторые в дальнейшем моян-о трансформировать (Finer-, 1988). десь надо отстать тот факт, что а роде Goscypiun пока ии-уцирован соматический эмбриогенез только в виде G.hii-iutum серии сортов Cokar.' А что касается технологии протопластов, оторые дают дополнительные возможности модификации генома утем- электропорации и слияния протопластов, то здесь иссле-эвание э роде Goosypimn отстает значительнее, чем в культу-з ткани. Получение каллуса из изолированных протопластов G. irsutun является пока наибольшим успехом в этой области, эка нет сообщений о соматическом эмбриогенезе в диплоидных ^льтивируемых " видах хлопчатника. Такие нет сообщений о делении и культивировании протопластов диплоидных видов юпчатника. А для Индии, где в основном посевные площади гопчатш. .а заняты диплоидными видам*! (G.herbacaum-2?#; .arboreura- 21%; гибридный хлопчатник - около 35%),работа

на диплоидных ..орыах крайне актуальна.

Цель:-:, представленной работы было изучение возможности и к- '' дукции соматического эмбриогенеза 2 культуре тканей, клоток , и пр топластов ди юкдного хлопчатника.

3 связи с эта:.: в работе были поставлены следующие задачи:

1. Установление первичных культур каллуса двух диплоидных ВИДОВ хлопчатника G.herbaceum L. И G.arborsuni L. И ИХ видового гибрида JDH-2, получение клеточных линий 3-х форм путем сериального субкультизирования и поиск индукции эмбриогенеза в кпллусных культурах.

2. Получение эмбриогенных суспензий 3-х форм диплоидного хлопчатника.

■ 3. Попе:-: возможности использования культуры селектированных клеток для увеличения частот образования змбриоидов.

4. Выделение и культивирование протопластов из эмбриогенных суспензий 3-х форм диплоидного хлопчатника и поиск.индукг-дни эмбриогенеза в кзллусной к суспензионной культурах, полученных из протопластов.

.5. Проведение гистологических анализов соматических эмбри-оидов и проэмбриональных комплексов с целью выяснения происхождения эмбриоидов к изучения аспектов цитодпфференцироькп.

Научная новизна. Впервые индуцирован соматически,", эмбриогенез в двух культивируемых видах хлопчатника о.дегЬйоеш» ь., G.ai-boroua L. и их межвидового коммерческого гибрида SijH-2.' Успешно использованы'культуры селектированных клеток (сферические и овальные), ранее внедренные для Ваисиз carota (Нопи-га агл :сояая1ао,19й5) - для увеличения частот образования эмбриоидов в роде Jossypium. Таким образом, показаны пути преодоления барьера генотипоспецифичности к соматическому эмбриогенезу в роде Gossypiúa ь.Успзано выделены к культивированы протопласты из эмбриогенных суспензионных культур • диплоидных видов хлопчатника. Индуцирован соматический эмбриогенез впсрзыа.Б роде Gossypiua X. в каллусной и суспензионной культурах, полученных из культуры протопластов (DDH-2).

Проведены детальные гистологические анализы микроструктур соматических эмбриоидов, а такие прозмбрионалышх комплексов с целью выяснения пронсхокдения дмбриоидов. Выдвинута гипотеза о возможности проявления з^екта гетерозиса в индукции эмбриоидов in vitro на хлопчатнике. Это момет оказаться закономерным такие для остальных в"дов растений.

Практическая цепкость. Индуцированный соматически" эмбриогенез е культуре тканей, клеток и протопластов нзляется ецё одним пагом ка пути к установлению системы эксплант-тканей/ протопласт—целое растение, которую в дальнейшем мозно использовать в качестве системы для пол-чения трансгенных рас-текил. Полученные эмбрпоиды з культуре протопластов дают возможность трансформировать их дополнительными способами, такими как злектропорации или микроинъекции.

Апрбация работы. Результаты исследований долокены па XIой Международном симпозиуме по эмбриологии (Ленинград, 1990), на международном симпозиуме в честь золотого юбилея Индийского общества генетиков и селекционеров (Дели, 1991), на Международном симпозиуме по биотехнологии (""-гнева, 1991), на 8ой Международном симпозиуме по протопластам (Упсала, Швеция, 1991) и на пер.ом съезде физиологов растений Узбекистана (Ташкент, 1991).

Диссертация и объем диссертации. Диссертация состоит .из введения, обзора литературы, описания материалов и методики исследований, изложения результатов экспериментов с их обсуждением, выводов и библиографии. Работа изложена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами и 48 фотографиями. Список литературы включает 137 наименований, из них 36 советских и 101 зарубежных авторов.

Материалы и методы исследований. Объектом исследований служили диплоидные (2п=26) культивируемые в Индии виды хлопчатника 0 herbaoeun L. сорт SM-88, С.arboreua L. Сорт A-82-I-I и их межвидовой гибрид Рт сорта юн-2.

Для чницк&ции и пролиферации каллуса, а также для субкультивирования использовали среду по Мурасигз-Скугу (1962; с дополнениями ('Jroliador and Goodin,1933). Использовали фито-гоомг-'н Г!УК или КУ*' как источники ауксина, а такке Кинетия или Дропп как источник цитокишша в разных комбинациях при разной концентрации. Инкубировали при t = 28+2°С и 16-часо-вэи фотопериоде с интенсивностью освещения 3000 лкс.

• Для инициации суспензии использовали рыхлый каллус с 30-ти дневный ростом. Среда била идентичной среде инициация каллуса, за исключением того, что сахароза (30 г/л) использовалась вместо глюкозы. Агар отсу.отзоиад. Оба класса фитс-гормонов так:ке присутствовали в суспензионной "реде (СЗСО). Колбы Эрленмейра с суспензией инкубировали при 120 об/пин на круговой качалке. Остальные условия инкубации былк cxosk с условиям: инкубации каллуса.

Суспензионная среда без аукс-.на (ССЕА) содержала все компоненты (тао, кроме ауксина.

Для выделения протопластов использовали дэа метода. I)Одновременное использование целлюлазы 0,5^-2,153 и мацерозима 0,4,^-0,8,а. П)05работка исходного материала сначала двумя пектиназами (пектиназа 0,5'£-1,5/3 и мацорозим 0,1^-0,5,1) в течение 1ч., а затем двумя целлюлазами в течение 2 ч.(целлюлоза 0,53-1,54 и целлюлизпн 0,1:5-0,5%), Ферментные растзора содержали 0,6 М манкит. Проводился опыт по выделению протопластов -с включением соли по Мурасиге-Скугу и без в фериент-нои растворе. Выход протопластов определили по методу Ноп-shav; ot ai. (1966). Очистка и культивирование протопластов проводились по методике Sato et al (1987).

Культивирование селектированных клеток (сферические и овальные) проводилось по модифицированной нааи Методике Номуры и К ¿амайна (1985).

Гистологические анализы были проведены по ?летодике Оурстй (1979).

Эффект гетерозиса в культурах определяли по Оальконеру (1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первичные культуры каллуса. Каллусы 3х форм - и.ЬегЪасеан I.. сорт зм-ез, с.чгЬогоил ь. сорт А-32-1-1 к их мегьидоэо:1. гибрид сорт Э2Н-2 били успешно индуцированы из гипзкотплей па среде с дополнениями при всех комбинациях фктогэрмо-ноз. Максимальный рост каллусов "аблэдался при ко"бкнацпп фитогормсноз 2 мг/л НУК и 0,2 «г/л Дропп. Каллусы 3" -¡'-орм существенно отличались по морфологическим признакам. Однако не было доказательств о зависимости этих признаков от природы используемых ситогормонов. 51,1-03 имел очень рыхлый каллу яелтого - бледно-зеленого цгета. А-82-1-1 и имели плот-

ные каллуси зеленого - ярнс-зелснэго цвета. Гибридны.'! сорт . ввк-2 при низких концентрациях цитокинина во многих вариантах показал ризогенез.

Получение эмбэиогенноГ: клеточной линии при субкулъ.ивноо-вакнп. Путем сериального субкультивирования были получены клеточные линии всех используемых форм. Субкультивирование часто сопровождалось изменениями морфологических признаков, таких как консистенция и цвет. Удалое * индуцировать эмбрио-генаость з клеточной линии зм-аа поелч 3го субкультивирова-кик. Сразу не "осле 3го субкулмивировани?. в этой клеточной линии наблюдалась стабилизация роста. На желтом фоне рыхлого каллуса появились бледно-желтые или белые секторы, кот рые затем превращались в зеленке. Зеленке . юбулярные структуры можно было визуально отличить от незмбриогениой части каллуса. В клеточных линиях остальных двух форм нам не удалось индуцировать эмо'рногенность.

Инициации суспензии и индукции соматического эмбриогенеза 5 своде СССФ. Визуальные наблюдения суспензионных культур 3х форм диплоидного хлопчатника через 3 недели после инициации суспензии показали способность всех используемых генотипов образовать пролиферующие суспензии. Цвет суспензий всех форм был элановато-яелтый и они на. ¡¿¿рвый взгляд но отли-.чались друг от друга. Наблюдения в интервале 4х дней показа-

ли присутствие глобулярных свободно плаэяжкх структур з суспензиях б:,1-88. Многие из них имели суспелзоры. Диаметр эмбриоидов варьировал от 1-3 мм. Под инвертированным микро-скопо. они были коричневого цвета. Анализы их микроструктур путём гистологических методов показали чег.сий формированный эпидермис и меристематически активные ¡слетки внутри эпидермиса, богатые в цитоплазме и з крахмале. В суспензионных культурах через 3 ,;адели наблюдалось множество бипо-

лярных и некоторых чашкосбразных (или сердцевидных) эмбриоидов, что указывает на способность глобулярное эмбриоидов развиваться до этих стадий развития в этой ае среде. 3 суспензии А-82-1-1, а такзе гибрида Ым-?, из наблюдалось присутствие эмбриоидов и потому они били перенесены з среду без ауксина (ССБА).

Индукция соматического эмбрнс'епеза в соед1 ССБА. Суспензии А-82-1-1 и шн-2 были перенесены в безауксиновую среду ССБА спустя 45 дней после'их икициьцхи в суспензионной среде, содеркацей ауксин (НУК) .. цитокиник (Дропп). Спустя 2 недели после их перевода в ССБА наблюдения пробудились регулярно в интервалах 4х дней. Наблюдения показали присутствие множества глобулярных структур и после гистологических анализов были идентифнцпрозаны как эмбриоиды. Дополнительное трехнедельное время дало возможность этим эмбрисидам развиваться в биполярных и сердцевидных стадиях. Анализы показали, что количество эмбриоидов в кзндой колбе суспензии А-82-1-1 и всн-2 было бользе, чем в БИ-еа, в которой эмбриогенез индуцировался в СХО (табл.1). Эти дзе формы так:;е показали уменьшенную пролиферацию ткани суспензии по сравнению с Б^-оЗ. Возможно, что ауксин,в назем случае НУК.помогает суспензии оставаться в пролиферн-увцем состоянии и удаление ауксина из среды уменьшает пролиферацию суспензии, как ранее наблюдалось в суспензионных культурах З.Мглигил (ЗЧпег, 1938) .Наши попытки пницировать суспензии А-82-1-1 и еек-2 в среде ССБА и индуцировать эмбриогенез не увенчались успехом. Это указывает на ваянуж роль предварительной экспозиции суспензии этих геноти-

... - Таблица I.

Индукция соматического эмбриогенеза в суспензионных культурах диплоидного хлопчатника.

Материал

Среда

^отечество эмЗпиондоз" в одноЛ_колб глоО"у- "тсп-по-ляоные' ■ ляоные

сордць-! к« видные" I сУ~и:а

БМ-ав СССФ:Соли по Мурасиге -Скугу.

(С.ЬегЪасеип Ю 100 мг/л чезоинозит,10 мг/л тпа- IV мин-Ш1,1 мг/л ппрндокс;ш-н01, I и г/л никотиновая к-та, 0,5 мг/л глицин,30 г/л сахароза,2 мг/л Н7К и 0,2 иг/л Дрота. Инициации суспензии з среде СССФ. После 45 дней суспензии были пере- 14 ведены в безауксинозую среду,содержащую все компоненты СССФ кроме ауксина НУК.

Та же самая среда.Инициации суспензии в среде СССФ с последующим 21 переводом их в безауксинозую среду ССБА через 45 дней после инициации суспензии.

к Значения являются средними от ? -х позторностей.

А-82-1-1

(О.агЪогоига Ь.)

иш-2

(О.ЬегЬасеии Ь. х

Д.агЬогеид Ъ.)

xx

Су т средних значений.

24

29

16 13

пов it „уксаку (до перевода i;x з безаукеиковуз среду) для успешной индукции эмбриогенеза.

?алвнтре соуаткческкх змбсиоздов в торпедообпазной стадии.

Как видно из тзил.1, развитие. глобулярных ¡г;.'.о'риоидоз происходило в среде их инициации (СССФ длл э..'.о'риондов ум-зв к СОБА для эмбрпоидол Л-82-I-I и DDK-?.). Однако их развитие было ограничено к б::-полярным и сердцевидным стедгяа развитая. Соматические змбспоиды грех форм развивались только в среде для развития э;.;бриоидов (СРЭ) в торяедоэбразной стадии. Как видно из табл.3, такая среда с вкл ¡ехиек з неё агара для солида£зкециа (СРЭТ), была более элективной, «ем жидкая среда (СРЭ2).

Э.'.'акт глицина на оазвктие зчо'ркопдов. Результаты кеаего эксперимента о пвйсгзш: глицина в низких концентрациях на развитие эмбр;. „,;доз показаны в ^абл.З. Глобулярные всех трех генотипов положительно реагировали на включение этой аминокислоты з среду. Развит:^ большинства глобулярных эмбриоидов в твердой и яидкой безглициновой средах было прекращено в би-поляркой стадии развития.

Сравнительное изучение эффекта глчкозц и сахаооэы на индукцию соматических эмбоирядов. Имеется много сообщений о роли сахарозы з индукции дифферент:розки в культуре ткани (Jcifa and i:ortheoto,19о6; Бутекко, 1975; Катаева и Бутен-ко, 1983; ЗЬосгдкег, 4986; Сафразбекян и др., 1991). Результаты нашего эксперимента подтвердили селективное преимущество сахарозы над глюкозой в индукции соматического эмбриогенеза в суспензионных культурах хлопчатника. Но над опыт показал, что глюкоза также способна индуцировать соматический эмбриогенез в низких частотах, чем в вариантах с содержанием глюкозы. Более того, по нашему мнению, концентрация пеполь-. зуемых Сахаров играла решающую роль в частоте формирования соматических змбриоидов. Так,1если для сахарозы оптимальная концентрация эффективной индукции эмбриоидоз била 30 г/л, то

Эксперимент о выяснении роли предварительной экспозиции суспензии к ауксину для индукции соматического эмбриогенеза в безауксинозую среду (ССБА)

Таблица 2. (2мг/л ПУК)

Материал

С предварительной экспозицией суспензии к ауксину глобулярчс

ные эиб-ри оиды*

зи-поляр ные. эа-Зриоиды

^рдце-иидиые эмбри-оиды*

сумма'

заг

Без предварительной экспозиции суспензии к ауксину

с рдце^

;ше э;:б-ри оиды*

пил ii ¿7 V

ныв эч- видные боиоидн"! эмбш-оидых

сумма'

XX

А-62-1-1 ((■.Ьех-Ьасеищ Ь.)

16

12

.2

30

ьж-г

(й;ЬегЬасоигс Ь,

т.

О.агЬогеит Ь.

21

18

II

50

х— Значения являются средними от трех повторноетей. »» Сумма средних значений.

Таблица 3. -

Действие глицина на развитие змбрноидоь,полученных в суспензионных культурах диплоидного хлопчатника в твердой (СРЗТ) и жидкой (СРЭЗС) средах*

Материал

sm- аз

А-82-1-1 Ш1-2

ТВЕРДАЯ СРЗЦА :

Соли по '.?урасиге-Скугу,ЮО мг/л мезоинозит.Ю мг/л тиамин-hci, I мг/л пиоидоксин-нсцД мг/л никотиновая к-та,30 г/л сахароза, 0,1 ur/л Лропп и 8 г/л агар.

С 0,2мкг/л

цином

?ли-

Развитие

аз §

В, 1 1

к 1 1

■о о

о.

S 5

ri !»

Р. О О Pi f «

Без глицина

Развитие

_L

ХПДКАЯ СРЕДА:

Соли по '.'урасиге-Скугу.ЮО мг/л мззлннозит.Ю мг/л тканин-НС!, I мг/л пиридокспн-нс,1Д мг/л никотиновая к-та,30 t'/л сахароза, 0,1 мг/л Дропп.

G 0,2.чкг/л глицин ou

Без глицина

Развитие "¿г

I

к ■

л;

о к о и

Pi. о ЕН

Развитие

о!

а

о

20 2 6 8 4 20 8 10 2 - 20 20 I 4 7 8 20 5 12 3 - ?0 I 20 - 2 14 4 20 б 10 4 » 20 -

8 И

20 20

8 9

о «

о

Ci

о.

о

» 3 5 12 20 8 10 2 -

ь -

ь -

к Значений являются средними количествами эмбриоидов в каждой колбе от 3-.. повторноатзй.

Сравнительное изучение действия моносахарида глюкозы и дисахарида я развитие соматических эмб'риоидов диплоидного хлопчатника.

Таблица 4 захарози на индукцию

Материал и среда,

использованные для'индукции эибриоидов

Глюкоза

10 мг/л

ж

о

о, к п

>г

■о

о

*

а ш я з

О

30 мг

/л I 50 мг/л

а> я м о. к ч

>3

*э о

ч

1=4

а>

м эт о. к

Г!

0

с

1

а I то

Сахароза

10 мг/л

311-88

С,0»11егЪаоеига Ь.) Ж' среда СССФ. А-32-1 -1 ^

ВШ-2

(О.ЬегЪасоит. 1„ х

С.агЬогеит Ь»):

Г срёдаТЯИи

3 2

5 10 7 2 15 10 II I 22 9

1 03

¡а !0 • о

я а

ы и*

о. :сх

к ¡к

п ¡4

>■» ;о

\э «

о I |

ч ;к

г. VО

30 мг/л

Г

50 мг/л .

аз

■а

® I

' о 1

- II

—1 о о

1 а я ££

{ л

1 о. О,

1 к К М

} « м я-

аз ; о 01 со

о ц x сЗ

у о 1 о.

г! 3 о

о 1 'о о о

22 13 2 2 17

7 - I 8 9 4 а 21 10 12 4 26 10 5 2 17 18 12 8 38 16 13 7 35 5 8 2 15 12 8 .4 24 II 12 9 32 13 II 4 2Б 25 15 9 49 23 9 12

к Данные является- усредненными значениями количества эибриоидов в каждой колбе от 3-х повторнастай»

к* Сумма количества эмбриоидов бш»« определена как сумма средних значений глобулярных, би-г^лярных и сердцевидных эибриоидов. •

у.

■ j ■}■.■ г

л ■ /;

v-.il .

jvji •?"• ■;.

нгР( £ V W ж^пг^ч

if

°ис.1. Индукция соматического эмбриогенеза в культурах ди идного хлопчатника in vitro: А"

HUX Культур G.herbaceum eSci ^-38 " алЛ^

i^'tl " ИХ 7И2рИда- DK< -2 в)глоб\\ляпнке эмбриоиды^

зазтеезш

дипло-

>

-т.е.: йг у >;;> с ■

> ¿-л

■•■Л

i.;; --и - --Г

Рис. 2

л ••

о. с

■ 'У, й ■

■У*

Л,.; ' >

л .. i

'.• и"'

1

В г $ . \ ч./

г, У ■ /> . •

. ' . V 1

.4 {,' ) ' *

V * ■

» .1

-.У)

•• ■т-г'жгъс Рнс.З

Рис.2. Соматический эмбриогенез з культуре поотопластов соота В2Н-2;а)сусленэии,использованные з качестве исходного материала для выделения протопласт"ч; б)изолироваяные поотопласты; в):!акоо:-:олонйи, полученные из протопластов; г)эмбр:-!огенкая суспензия сорта ¿ш-2.

Рис.3. Аспекты микроструктуры и клеточной дифференцировки соматических змбоиондоз: а)пооэ!.!бриоядс суспензооом на позеэхности материнской ткани; б)суспензоо эмЗри-• . оада и окружающие его некротические клетки материнской ткани: в)дифференциацки ксилема в одном из соматических змбриоидоз.

более высокая концентрация (50 г/л) дала наилучшие результаты в вариантах с глюкозой (табл.4). Ко, в общей, в средах, содер:хачи;с сахарозу, формировалось больше эмбриондоз, чем з ■ с родах, с одерзащих глюк

Изолянля протопластоз к их культивирование. Протопласты в^ех трех форм были успей;:" . изолированы из экбрпогг'шых суспензионных культур. Они были ипично сферической формы, как и протопласты, изолированные из каллуса хлопчатника (Finer and Smith,1932). Однако диаметр их существенно варьировал в пределах 10-35мкм, Табл.5 и табл.6 показывают выход протопластов пг методу I и гч мег..ду 2 у сорта ddk-2. По методу I, наилучший выход протопластов был получен для Sü-8Q при.коу-бинации ферментов целлюлазы 1,9%+ияцерозимя 0,4% (23,1'ä),для A-82-I-I (24,8^) и при варианте 1,9% целлюлазй+0,8'3 кацеро-зима и для ddh-2 при 1,5% целлюлазы+0,6% мацерозима. Включение солей по Мурасиге-Скугу увеличило выход протопластов SLI-88, А—82-1—I и DDH-2 до максимума 27,3%, 28,S% И'29,3% соответственно. Предварительная обработка исходного мате-па-ла с пектиназами,. а зат-.u-обработка целлюлазами по методу 2 увеличила выход протопластов в 2 раза. Наилучшие результаты были получены npW обработке леток суспензии 1,0% пектиказой-и 0,3% мацерозииом в течение I часа, а. затем целлюлазами (1,0% целлюлазы и 0,5% целлюлизин). Это дало выход протопластов 47,1%, 54,8,5 и 52,7% для Sü-38, A-82-I-I и DDK-2. Включение 'солей по Мурасиге-Скугу увеличивало выход протопластов на 4-5%. Возможно, что соли по Мурасиге-Скугу эффективно умень-шатт спонтанный лизис протопластов и такнц образом увеличивают общий выход протопластов.

' Очищенные протопласты трох генотипов, которые были культивированы з среде К3 (Као et ах.,1974) регенерировали клеточную стенку 1-20Г0 для культивирования. Инкубация в темноте (14го дня культивирования) к плотность высева 5x10^ протопластов/мл среды, были необходимыми условиями для успешной регенерации клеточной 'стенай. Макроколонии, содержащие 50-100 ' клеток^ мокно было наблодвть в культурах после месячного культивирования. Эффективность в'-ева варьирозалась от 8,3% до

Таблица 5

Выход протопластов (з ^»изолированна:: из суспйнрипшткх культур гибридного хлопчатника по методу I-

Ферменты и их концентрации Без солей по Лурасиге-Скугу С солями по Мураслгб-Скугу

целлялаза О ЗЗ+мацероцим 0,43 12,3+1,5*» ' 16,3+3,2

целлюлаза 0 ?Я+:.'аце родам оля 15,214,1 19,523,0

целлюлаза 0 93+мацерсцпм оля 17,3+1,7 ' 22,3+1,8

целлалаза I ля 20,312,9 ' 24,^,2

целлюлаза I 35+у.ацероции оля 18,3+3,8 21,3+2,7

целлюлаза I 5;г+иацброцИМ оля 22,5+1,7 26,9+1,7

целлюлаза I 73+мац-зроцим оля 23,2+3,1 25,8+2,9

целлюлаза I ЭЗ+мацероцим о ля 22,2*3,I 26,1+3,1

цоллгэлазз 2 13+мацеро'дим о ля 21,3+2,6 ' 25,4+3,8

целлюлаза 0 0,63 16,1+2,5 20,3+2,3

целлщлаза 0 7>:-г;ацероцим о,63 15,3+1,2 21,9+:,7

целлюлаза 0 9?+:.:ацерсцим 0,63 18,5+2,3 21,8+3,3

целляла за I 1"'н-:гацеооцяа 0,6% 18,1*4,2 22,3+2,9

целлюлаза I 33+мацероцим 0,6% 20,1+3,2 24,1+3,5

•делл'ллаза I 53+мацсроцим 0,6 7= 25,1+2,3 29,3+4,2

целлюлаза I 7-,5+мац'Зроаим 0,6% 23,4^,2 27,8+2,1

целлклаза I 93+мацезоцим 24,5+3,7 25,3+3,5

целлюлаза 2 13+мацероцим о ля 22,1+1,2 25,4+3,8

целлклаза 0 53+мацероцим 0,83 14,0+1,3' ' 17,1+4,7

цаллвлаза 0 ?£+мзцероциг: 0,83 14,8+2,9 18,3+2,3

целлялаза 0 93+мацороцни 0,8/5 13,8ц, 7 •20,7+1,2

целлюлаза т ¡¡йтмацесоцям 0,83 19.5+3,1 23,3+2,5

целлялаза I 33+мзцесоцим о,8?; 22,4+1,5 26,6+1,2

целлпг.аза I 53+мацероцим 0,83 24,7+2,8 27,3+4,3

целлкдазэ I ?Зтмацероцим 0,83 24,9+1,3 . 28,8+3,2

целлюлаза I 93+мацеродим 0,83 23,0+3,3 25,2+4,1 '

цзллюлазз ?. 13+мацероиим 0,83 23«3+1,9 26,1+1,2

х Значения являзтол усредненными данными от 2-х позторностей

хх Среднее отклонение

Таблица 6

Выход протопластов (в %), изолированных из суспензионных культур гибридного хлопчатника вш-2 по методу-2*

Комбинации целлюлаз и иекчиназ ! Без солей по и их концентрации I Мурасиге-Скугу

С солями по Мурасиге-Скугу

пектиназа 0,5%+мацерозим 0,"% целлюлаза 0,5%+целлюлизин 0,5%

пектиназа 1,0%+мацерозиц 0,3% цзллюла 1 0,5%+целлюлиакн 0,5%

пектиназа Т,5%+мацерози" 0,1%' целлюлаза 0,5%+целлюлизин 0,5%

пектиназа 0,5%+мацерозим 0,5% целлюлаза 1,0%+целлюлизин 0,3%

пектиназа 1,5%+мацерозиы 0,1% целлюлаза 1,5%+целлюлизин 0,1%

пектиназа 1,0%+мацерозии 0,3% целлюлаза 1,0%+целлюлизт;н. 0,3%

пектиназа 0,5%+ма'церозии 0,5% целлюлаза 1,5%+целлюлизин 0,Г"5

32,2+3,3**

43,7+3,9 40,7+2,8 44,1+4,5 49,3+5,2 52,7+4,6 47,8+3,6

35,3+3,°

48,3+4,2 42,4+3,5 49,9+4,2 55,7+3,0 57,9+1,8 50,3+2,9

36 Значения являются усредненными данными от 2-х повторноетей рыь Среднее отклонение• .

I5,?f5. -Эти клеточные колонки в течение 4-5 нодслъ давали каллус, когда их выращивали по технике инверсии чайка (Sakn ut al, 1S37).- "Иази попытки культивировать протопласты использование!.: других мзтодоз, таких как культивирование з каплях, культивирование з полу-твердых и твердых средах, не дали желаемого результата. Эти микрокаллусы проднферировэлпсь быст-_ ро, когда :::■: перекосили на среду líS, содер:ха^у:э агар (8 г/л) и оба класса гитогормоноз. Элкт.г.тцкя ауксина (Н75) и уменьшение концентра:;:::; цктог'нина Дропп от 0,2 мг/л до 10 мкг/л индуцировали ;;:.:брноггнкссть з каллускых культурах, полученных от протопластов гал-2. В суспензии вш индуцированной при использовании эмбриогенного каллуса'в качество исходного материала, через месяц были получены пролк5е?ада»:цке надкг* культуры этого сорта, з которых мозно было наблюдать глобулярные, цилиндрические или би-полярные и сердцевидные эмбри-оиды.

Культура селектированных клеток. Нэпн результаты подтвердили ранее описанные в литературе данные (;; т.ига ar.ci Кстадхпе, 1985) о том, что сферические и овальные клетки являются потенциальными типами клеток для последующей дифференциации з соматические эмбрноиды. Как видно из табл.8, сферические клетки формировали больше эмбрлоидоз, чем овальные. Культура сферических клеток Е2Н-2 дазала "аибольаее количество эмбриопдов -из всех использованных в опыте культур (табл.8). Количество эмбтпендов в культурах сферических и овальных клеток в сумме превышало количество эмбриопдов, формировавшихся з культурах без селективной фильтрации клеток 'контрольные варианты) в 6-? раз. Более того, з культурах"селектированных клеток глобулярные эмбриоиды всех используемых форм развивались до тор-пздообразно.ч стадии развития. Максимальное количество глобулярных змбриоидоз наблюдалось в культурах ^ерических клеток g.hcrcaoc-^: г~. сорта sm-85 и гибрида edh-2. Однако дальнейшее развитие эмбриопдов зло значительно медленнее з культурах сферических клеток ddh-2 по сравнению с сортом s;:-es.

Таблица 8

Индукция соматических .эмбриоидов в культуре селектированных клеток диплоидного хлопчатника* ■

Материал Культуры глобулярные эмбшоидь: I о а к я о. « к г; К а о я И а. УЗ га — ■ ■ I 1 ьз 1 со со о со к к ш кве вчок Ккоо « К СХоз у* аэ ФЯОЗ о к и к (V- са 1 , ело ■ о к о о< оуэ г; о о с: о, с -; оа« 2 ^ о

С.НогЪаоеигг. Ь. Культуры сферических клеток 62 18 8 3 91

С орт Зл„-88 Культуры овальных клеток 45 12 2 I 60

Культуры без селективной фильтрации клеток (контроль) 12 8 I - 21

О.агЪогеип: Ь, культуры сферических клеток 51 13 7 2 73

сорт А-82-1-1 • Культуры овальных клеток 37 7 3 2 49

- Культур" без се-лективний филь-' трации клеток .(контроль) 14 8 2 - 24'

С.НегЪасеигп Ь. Культуры сфери- ' ческих клеток 88 10 о II 105

С.пгЪогоит Ь. Культуры овальных клеток 62 7 4 I 74

СОрТ БШ-2 Культуры без се-лектизной фильтрации :.леток (контроль) 25 5 I - 31

х Число эмбриоидов в колбе является средним значением от 3-х повторностей.

1*истологические анализы соматических змбопоидов и прозм-бриопальных комплексоз. При анализах микроструктур соматических эмбрноидоз з них были обнаружены четко сформировании;! эпидермис снаружи и меристематически активные клетки внутри эпидермиса. Эти клетки были обогащены цитоплазмой и крахмалом. Многие глобулярные структуры возникли на поверхности эмбрио-гекно;'; ткани пли про-змбрпокальпы.; комплексов, как их часто называют (TrJLeiano et ai., 198Э). 3 основном, глобулярные эмбрионды имели суспензо I, которые при гистологических анализах оказались мультпеериальнымм. Мы не смогли получить д, а-эзтольств о присутствии уннсериальных суспензоров в эмбриои-дах. Возможно, что мультисериалькые суспензоры указызают на многоклеточное происхождение эмбриондов, тогда как езобздне плавакцпе состояния эмбрноидов указывают на их происхождение из едино!: клетки. У. которые глобулярные эмбрноиды имели одну базэльну» клетку в месте соединения змбриоида с про-змО'риона-льным комплексом. Следует отметить, что базальная клетка суспензора, а иногда к целы!! суспенз'ор, бклг окружены либо кекротизировзнними или сильно вакуолизпрозаннъки клетками матерннехо'.', ткани (рис.З б). Соматические эмбрпоиды, полу-' ченпые в средах, содаряачих сахарозу, обнаружили диффереи-цировку проводящих систем (рис.З в). 3 настоящее время многое остаемся непонятным з определении точной стадии детерминации организованного развития. Связь между структурными изменениями и оогапогекноИ детерминацией также следует детально изучить 1328).

Анализы з"-'екта гетерозиса в пнгукцйк соматического эмбриогенеза з культурах in vitro с использованием с.ЬегЪасеип L. сорта sll-83, G.arboraua L. сорта A-S2-I-I И ИХ цзазидо-зого гибрида ddh-2 показали, что гетерозис от лучпего родителя и от среднего родителя составил 72,4. и 92,3% соответственно з культуре клеток, тогда как з культуре селектированных клеток эти данные равнялись 28,04%-35,77% (от среднего родителя) и 15,38%-23-33% (от лучшего родителя). Гетерозис

обычно объясняется гипотезой сзерхдоминирорания,' хотя по мнению некоторых ученых феномен гетерозиса обх>яоьнотся простым доминированием (strickberger, 1985). Имеются сообщения о способности гетерокарионо. регенерировать растения, в то время как у протопластов обоих родителей эта способность отсутствовала (ïoriyaraa et al., 1987; Tusa et al., 1990). 3 этих случая;*: гетерозис являлся результатом комплементарного действия родительских геномов.

ВЫВОДЫ

1. Первичные культуры каллусов всех используемых генотипов . диплоидного хлопчатника 'цли случены на модифицированной среде us. Отмечалось значительное разнообразие в морфологии каллусов трех форм. Серии субкультуры продут ревли змбриоген-ный каллус у sàJ-оз, тогда, как у A-82-I-I и DDH-2 эмбриогенез вплоть до 4-го пассажа ко наблюдался.

2. Были получены пролиферируюцие суспензии всех генотипов, индуцированные использованием рыхлых частей каллусов через месяц после инициации суспензии ка среде, содержащей оба класса фитогормонов (СССО).'Сорт su-os на этой среде образовал глобулярные эмбриоиды, которые с течением времени раз- . вились в би-подярные и сердцзыдные стадии.

3. Был индуцирован соматический эмбриогенез в генотипах A-32-I-I и DDH-2 с использованием механизма безауксинового культивирования после прелиминарной экспозиции суспензионных культур к ауксину. Эти два генотипа показали уменьшенную пролиферацию тк^ .¿ей суспензии на безауксиновой среде ССБА. Число змбриоидов, сформированных этими двумя генотипами, было выае • в сравнении с sii-58.

4. Ауксин играет значительную роль в сохранении тканей суспензии в пролиферируюцем состоянии. Предварительная экспозиция суспензии к ауксину была необходимой для индукции соматического эмбриогенеза до перевода их в безауксиковую среду ССБА

у 5Экомшов'А-82-1-1.и ddh-2.Концентрация Сахаров.играет ■ ,

реяавщуя роль в частоте формирования эмбриоидоз. .Однако подтвердилось селективное преимущество, сахарозы-з сравнении с клякозой. Для развития эмбряоидов орпедообразной стадии перспективными представляются твердые среды с низким содержанием глицина, нежели айдкие.

5. Подтвердилось, что сферические и овальные клетки являются потенциальными типами клеток для развития в соматические эм-брнонды в суспензионных культурах. Сферические клетки более, чем овальные способны к организованному росту и развитию. Селективная культура клеток существенно увеличивает число эмбриоидоз и облегчает их развитие в торпедообразной стадий. Из всех генотипов ddh-2 продуцировал наибольаее количество змбриоидов.

6. Наиболее перспег^ивкым является метод изоляции протопластоз, • который зключает последовательную экспозицию исходного материала к комплексам пектиназ и целлюлаз. Результаты тзк:ге показали, что включение MS солей в ферментном шстворе уменьаа-

v от спонтанный лизис протопластов. Протопласты всех'используемых генотипов сформировали микрочолонии после 3-4 недель культивирования на среде Kj. Инициальная инкубация в темноте при уменьшенной темпера уре и достаточно высокая посевная плотность (5x10^ протопластов/мл среды) язились существенными услозиями для рсп-енерэоии клеточных стенок и образования протсклонсв. Клеточные колонии в 4-5 недель сформировали каллус j. 3 дальнейшем каллусы, получении лз протопластов 3-х

. генотипов, г.ролиферировались на .среде MS.

7. Удаление ауксина из среды и уценьаеиие концентрации цито-кинина И1!дуциоозали эмбриогенез у каллуса ddk-2 и в отличив от Sl.'-88 и A-82-I-I была получена его пролиферирущся зм-бриогенная суспензия. ■

8. ^отологический анализ, помимо соматических эмбрноидов, проявил наличие проэмбриснальнкх комплексов. Эмбрлоиды характеризовались эпидермисом и ме рис тематическими активными клетками. Большинство глобулярных эыбриоидов,присоединенных материнской ткань», имели мультисариальные суспензоры, обычно

окруженные некротировакными и/илк вакуолизированннми клетками. Многие эмбриоиды A-82-I-I к DDH-2 были свободноплавающими.' Дкфферетглровки проводящих систем наблюдались в соматических эмбриоидах, получены з среде, содержащей сахарозу.

9. Результаты анализов выявили гетерозксный эффект отклика на соматический эмбриогенез в культуре клеток и в культуре селектированных клеток диплоидног" хлопчатника.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Studios of Gosoypium herbaceum L. somatic embryogeneais 111 callus culture in vi*,-o./ / .-ipdjanov Sh.A.// Abatracts,

. Xlth International Symposium on Embryology and Seed Reproduction. Leningrad, July 3-7. -19SO.- P.61^.

2. Characterisation of soxatic embryogenesis in Gossypium ar-boreum L./ Aripdjanov Sh.A., Idiyatullina D.L.// Abstracts,

■' Golden Jubilee Symposium, Indian Society of Genetics and Plant Breeding, Hew Delhi, February 1?-15, 1991. V.3.-P,917-918.

3. Способ получения змбр.огенного каллуса хлопчатника G.herba-ceum L. /Идиятуллина Д.JI., Арипдяанов Н.А., Эргаиев А-К.Э.// ДАН УзССР. 1991.-1№.-С.48-г1.

4. Studies on thiadiazurón mediatbd in vitro callus induction in asiatic cottons./Dani K.G., Aripdjanov Sh.A,., Ergashev A-K.E.//Ad.Plant Sci., 1991 .-V.4.-U1 .-P.138-1 42.

5. A method for,rapid production of embryoger.io suspension cultures of Oossypivra 1./Idiyatullina D.L., Aripdjanov Sh.A., Ergaahev-. -K.E.//Abstxacts, International Symposium on

. .Plant Biotechnology. Geneva, 19-20 April, 1991.- K4.

6. 'ihe use of cotton protoplasts in cell fusion studies./Vin- • níkova K., Dmitrieva II., Butenko R., Aripdjanov Sh., Erga-shev A -K.// Abstracts, 8th International Protoplast Symposium, .Uppsala, Sweden, June 16-20, 1991 .- II.A25.-P.144.

7. Индукция соматических эмбриоидов в ранних стадиях развития в суспензионной культуре хлопчатника/ Идиятуллина Д.Л.,

•. Таытенов Н.Е., Арипдканов Ш.А., Эргашев А-К.Э.// Тезисы

докладов Iro съезда физиологов рас зияй Узбекистана.-Ташкент.- 16-13 декабря.-.1991.- С.15. S. Выделение к культивирование протопластов из клеток кал-лусных и змбриогенкш: суспензивных культур хлопчатника./ Дмитриева H.H., Ванникова Н.В., Бутскксг Р.Г., Эрганез А-К. Э.// Тезисы докладов 1?о съезда физиологов растений Узбекистана.1-Ташкент.- 16-18 декабря 1991 г.- С.16.