Индукция соматического эмбриогенеза в культуре in vitro у гибридных семян Pinus sibirica Du Tour

Ворошилова, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Индукция соматического эмбриогенеза в культуре in vitro у гибридных семян Pinus sibirica Du Tour
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Индукция соматического эмбриогенеза в культуре in vitro у гибридных семян Pinus sibirica Du Tour"

На правах рукописи

ВОРОШИЛОВА Елена Владимировна

ИНДУКЦИЯ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO У ГИБРИДНЫХ СЕМЯН PINUS SIBIRICA DU TOUR

03.01.05. - Физиология и биохимия растений 03.02.01. - Ботаника

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

Красноярск-2013

005543143

Работа выполнена в лаборатории лесной генетики и селекции Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, на кафедре наземных и водных экосистем Института фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального университета.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Гаевский Николай Александрович

доктор биологических наук, профессор Третьякова Ираида Николаевна

Официальные оппоненты:

Круглова Наталья Николаевна

доктор биологических наук, профессор ФГБУН «Институт биологии Уфимского научного центра РАН», лаборатория экспериментальной биологии растений, заведующий

Тупицына Наталья Николаевна

доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный педагогический университет им. В.П. Астафьева», кафедра биологии и экологии, профессор

Ведущая организация:

ФГБУН «Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН»

Защита диссертации состоится «2Ь » Рй^і^і/ 2013 г. в часов на

заседании диссертационного совета ДМ212.099.15 при Сибирском федеральном университете по адресу: 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79, ауд. Р8-06.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского федерального университета

Автореферат разослан «_

2013]

Ученый секретарь диссертационного совета

Оаг!^.—

Николай Александрович Гаевский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. У Pinus sibirica, произрастающего в горах Южной Сибири, систематически встречаются уникальные особи с акселерацией генеративного процесса (Ирошников, 1974; Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990). У данных особей развитие женских шишек и семян происходит в год опыления за 2,5-Змес. (вместо 1 года), однако семена формируются с развитым эндоспермом, но без зародыша.

Для изучения репродуктивного процесса P. sibirica и сохранения его уникальных форм наиболее перспективным направлением является проведение экспериментов по контролируемому опылению и получение хозяйственно-ценных гибридов, которые можно размножать ex situ и традиционными методами биотехнологии в культуре in vitro через соматический эмбриогенез.

В основе соматического эмбриогенеза лежит явление тотипотентности -способности растительной клетки в условиях культуры in vitro реализовывать имеющуюся у нее генетическую информацию и давать начало целому организму (Бутенко, 1964). Этот эффективный метод регенерации растений является модельной системой для изучения реализации морфогенетических программ, физиологических (гормональная регуляция) и молекулярно-генетических исследований в раннем онтогенезе, а также имеет прикладное значение в современных генетико-селекционных исследованиях, направленных на массовое тиражирование улучшенных форм хвойных.

За 28 лет, с момента открытия соматического эмбриогенеза у хвойных (Hakman, 1985), были получены соматические эмбрионы и сеянцы для 28 представителей рода Pinus.

Цели и задачи исследования. Цель исследования - индукция процесса соматического эмбриогенеза в культуре in vitro у гибридных семян P. sibirica, полученных в результате контролируемого опыления, в том числе пыльцой кедров с акселерацией генеративного цикла, и испытание потомства в условиях теплицы.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- проведение контролируемого опыления и отбор клонов P. sibirica, экспланты которых обладают эмбриогенным потенциалом в культуре in vitro;

- инициация процесса соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей и мегагаметофитов;

- проведение цитологического анализа полученных каллусных культур;

- анализ гормонального баланса семян и каллусных культур;

- исследование гибридного потомства клонов P. sibirica в условиях теплицы.

Научная новизна исследования заключается в том, что впервые из эксплантов

гибридных семян P. sibirica, полученных в результате опыления пыльцой кедров с акселерацией генеративного цикла, был индуцирован эмбриогенный каллус и соматический эмбриогенез. Показана перспективность использования мегагаметофитов в качестве эксплантов для получения эмбриогенных культур. Впервые изучено содержание эндогенных фитогормонов в каллусах и семенах (зародыше и эндосперме) P. sibirica.

Теоретическая и практическая ценность полученных результатов.

Разработанная методика индукции соматического эмбриогенеза P. sibirica будет служить основой для создания биотехнологии получения регенерантов данного вида. Проведенные исследования по культивированию мегагаметофитов позволят подойти к проблеме размножения уникальных особей с однолетним циклом развития женских шишек. Полученные результаты лягут в основу создания орехоплодных плантаций Р. sibirica.

Защищаемые положения:

1. Реализация соматического эмбриогенеза у P. sibirica связана с генотипом дерева-донора, а также стадией развития экспланта, используемого для ввода в культуру in vitro.

2. Уникальные генотипы P. sibirica с акселерацией генеративного цикла могут быть размножены с помощью культуры мегагаметофитов.

Личный вклад соискателя. Представленные в диссертации экспериментальные данные, за исключением результатов по иммуноферментному анализу гормонального баланса семян P. sibirica, получены непосредственно соискателем.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VII съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011); 2th International Conference of IUFRO «Integrating vegetative propagation, biotechnologies and genetic improvement for tree production and sustainable forest management» (Брно, Чешская республика, 2012); IV Международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Пермь, 2012); Конференции молодых ученых Института леса СО РАН (Красноярск, 2013), X Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Казань, 2013).

Публикации. Основное содержание диссертации представлено в 15 печатных работах, из них 3 в реферируемых журналах.

Содержание и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы и 6 приложений. Работа изложена на 138 страницах, содержит 10 таблиц и 49 рисунков. Библиографический список включает 192 наименования, из которых 150 - иностранные источники.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям д.б.н., проф. Третьяковой Ираиде Николаевне и д.б.н., проф. Гаевскому Николаю Александровичу за оказанную помощь и руководство в процессе выполнения работы и написания диссертации; д.б.н., заведующей лабораторией лесной генетики и селекции Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН Муратовой Елене Николаевне за предоставленную возможность выполнения работ по культуре ткани; Череповскому Юрию Анатольевичу за возможность проведения работ на прививочной плантации Западно-Саянского ОЛХ; д.б.н. Кудояровой Гюзели Радомесовне за предоставление данных по иммуноферментному анализу; д.б.н., проф. Медведеву Сергею Семеновичу, к.б.н. Пожванову Григорию Александровичу и к.б.н. Шаварде Алексею Леонидовичу за организацию и проведение стажировки по освоению методов газо-жидкостной хроматографии на кафедре физиологии и биохимии растений СПбГУ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ ХВОЙНЫХ В КУЛЬТУРЕ

IN VITRO

В главе приводится обзор литературных данных по исследованию соматического эмбриогенеза у представителей семейства Pinaceae, история развития данного направления и его современное состояние, преимущества перед другими методами микроклонального размножения и перспективы дальнейшего использования. Рассматривается значимость соматического эмбриогенеза с практической и фундаментальной сторон. Особое внимание уделяется гормональному балансу и генетической регуляции в культуре ткани хвойных. Рассматриваются особенности половой репродукции P. sibirica, в том числе исследования, посвященные деревьям-акселератам с однолетним циклом развития женских шишек.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в лаборатории лесной генетики и селекции Института леса им В.Н. Сукачева СО РАН, на кафедре водных и наземных экосистем ИФБиБт СФУ и в 2010-2013 гг.

В качестве материала для исследований использовали гибридные семена Р. sibirica, полученные в результате контролируемого и свободного опыления на клоновой прививочной плантации Западно-Саянского OJIX (Ермаковский район Красноярского края). Контролируемое опыление проводили в первой декаде июня 2009-2012 гг. пыльцой кедров с акселерацией генеративного цикла 106 и 107 и плюсовых деревьев 1К и 2К из естественного древостоя Западного Саяна, а также пыльцой самих клонов (вариант самоопыления). Микростробилы собирали с клонов и деревьев-опылителей из естественного древостоя за 1-2 дня до момента их раскрытия. В это же время макростробилы клонов изолировали пакетами из крафт-бумаги. С микростробилов высыпали пыльцу и просеивали ее через марлю. В пакете, закрывающем макростробил, делали разрез, и кисточкой наносили пыльцу «отцовского» дерева. Пакет заклеивали и снимали через 7-10 дней (вторая декада июня).

Для индукции соматического эмбриогенеза использовали зиготические зародыши на стадии инициации семядолей и развитых семядолей и мегагаметофиты гибридных семян на стадиях оплодотворения, глобулярного зародыша и инициации семядолей.

При введении в культуру in vitro зиготических зародышей, мегагаметофиты стерилизовали в 3% спиртовом растворе йода в течение 10-12 мин., с последующим трехкратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. В условиях ламинар-бокса зародыши извлекали из мегагаметофитов и помещали на питательную среду по 5-6 эксплантов на колбу. При введении в культуру мегагаметофитов, семена обрабатывали водным раствором перманганата калия в течение 15мин., затем отмывали в проточной воде, и очищали от покровов. Очищенные мегагаметофиты стерилизовали гипохлоритом натрия в течение Юмин., трижды промывали в стерильной дистиллированной воде и помещали на 5мин. в 10% раствор перекиси водорода. Затем в стерильных условиях ламинар-бокса мегагаметофиты рассекали на сегменты, удаляли зародыш и помещали на питательную среду срезом вверх по 6-7 эксплантов на колбу.

Для индукции соматического эмбриогенеза использовали базовую питательную среду ЬУ (Ьцуае, 1985), с пониженной в два раза концентрацией макроэлементов (1/2ЬУ), дополненную сахарозой (ЗОг/л), глютамином (1г/л), казеином (0,5г/л), мезоинозитом (1г/л) и аскорбиновой кислотой (0,3г/л). В качестве регуляторов роста использовали 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксусную кислоту) и 6-БАП (6-бензиламинопурин) в различных концентрациях (табл.). рН среды доводили до 5,8 перед автоклавированием.

Таблица

№ среды 2,4-Д 6-БАП

1 2 1

2 2 0,5

3 3 1

4 4 1

5 0,5 0,25

6 0 0

Для пролиферации полученной каллусной массы использовали питательную среду 1/2LV с пониженным содержанием сахарозы (20г/л) и 6-БАП (0,5г/л).

Интенсивность образования каллуса оценивали по сырой массе, которую измеряли на 30 сут. культивирования (конец стадии инициации) и после каждого пассажа на пролиферационной среде по следующей формуле:

Мкаллуса = (Мк с к — Мк с )/п,

где Мых - масса колбы со средой и каллусом, Мкс. - масса колбы со средой, п - число эксплантов в колбе.

Для проведения цитологического анализа готовили давленые препараты по стандартной методике (Паушева, 1990). Для определения уровня эндогенного содержания ауксинов, цитокининов и абсцизовой кислоты использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа (Кудоярова, Веселов, 1980) и метод высокоточной газо-жидкостной хроматографии (Кислин, 2004).

Статистическая обработка данных проводилась по стандартным методикам (Лакин, 1973) при помощи программы Microsoft Excel 2003. Для оценки достоверности различий использовали однофакторный дисперсионный анализ и t-критерий Стьюдента (при Р<0,05) (Рокицкий, 1973).

ГЛАВА 3. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ ИЗ СЕМЯН P. SI BIRICA, ПОЛУЧЕННЫХ В РЕЗУЛЬТАТЕ КОНТРОЛИРУЕМОГО И СВОБОДНОГО

ОПЫЛЕНИЯ

Клоны P. sibirica отличаются неравномерным урожаем женских шишек в погодичном цикле. Годы обильного урожая (2009, 2011) сменяются неурожайными годами (2010, 2012) (Третьякова, 2012).

Анализ структуры урожая женских шишек, полученных в результате контролируемого опыления, показал, что морфометрические параметры женских шишек и их семенная продуктивность варьировали между клонами, внутри клона при разных вариантах опыления и по годам. В неурожайные годы женские шишки второго года развития, полученные от свободного опыления, отличались мелкими размерами (Cv - 10,9-17,2%) (рис. 1А, В). В урожайные годы размеры женских

шишек значительно варьировали между клонами (Су колебался от 10,9% при свободном опылении до 69,4% при самоопылении), при этом средние размеры шишек, полученные от различных вариантов опыления, варьировали незначительно (рис. 1Б, Г). Однако достоверного влияния опылителей на размеры шишек обнаружено не было (1эКСП.<2). ______________________ _____ __

400

5 350 ЗОО I 250 | 200 : 150

1юо

ЕЭЕ

3 3 а Я я 3 § й

я я н я я й

й к й к

.«.3953 К £ й <5 ¡3

§ 5 й й

к я 8 «5

$ а ^г '

з- а |«

»«а й )

Рис. 1. Длина женских шишек Р. 51Ыпса на клоновой прививочной плантации в разные годы контролируемого опыления. А-2010 г.; Б—2011 г.; В-2012 г.; Г-2013 г.

То 1+ К)

с?

» 2 к> к

О (а ¡0

-1 Я чз

Ь О

о ь ю ^ 0\ Ц 'к- к

Л а о »с

оо О а* (Г а

м 3

О О

С я

ч ы ю

* 3

81 ■е- £

к к а В н

в> -а к и И з а

х о » £

^ I

I -ч

Р О

X н

ся

о-ы ю

о к

■а

п о

0 л

а к.

(г

2 & х

» V >8

1 я ю » о

0 я

^ я

- • о

И §

1 КС

семенная продуктивность, %

277/22x107 277/22х1К 277/22х2К 277/22x277/22 277/22

281/26x1«

002x107 002х1К 002х2К 002x002

145/4x107 145/4Х2К 145/4

153/13x107 153/13Х1К 153/13х2К

семенная прод^

281/26x281/26 281/26

145/4x145/4 145/4

семенная продуктивность, %

продуктивность, %

опыления был высоким (до 62,9%), что может говорить о том, что пыльца одного опылителя оказывает различное влияние на семенную продуктивность каждого клона (рис. 2Б, Г). При этом в разные годы влияние одного и того же опылителя могло носить разный характер на семенную продуктивность как одного и того же клона (рис. 13, 14), так и в целом по плантации (рис. 2Б).

Анализ качества семян клоновых деревьев кедра сибирского показал, что число полнозернистых семян у всех клонов было высоким и варьировало от 85,8% у семян, полученных от свободного опыления (Су - 11,3%) до 95,0% у гибридных семян (Су -4,3%). Масса семян, полученных в результате контролируемого опыления, сильно варьировала внутри клона - от 341 г (клон 277/22x277/22) до 519,9 г (клон 277/22x107). Наибольшие показатели были получены при опылении клонов пыльцой кедров-акселератов 106 и 107 и пыльцой дерева 2К. При свободном опылении наблюдались наиболее низкие показатель массы семян - 311,2 г (Су - 8,4). Влияние контролируемого опыления на число полнозернистых семян и массу семян клоновых деревьев кедра сибирского было достоверным (1эксп > 2).

300 I

J н :.....I.....: [[..... 1 1

100

Рис. 3. Масса семян P. sibirica, полученных в результате контролируемого и свободного опыления 2011 и 2012 гг.

Таким образом, контролируемое опыление не оказало достоверного влияния на размеры и семенную продуктивность женских шишек клоновых деревьев кедра сибирского, однако положительно сказалось на качестве гибридных семян. Полученные семена отличались большей полнозернистотью и массой, чем семена, полученные в результате свободного опыления.

Каллусогенез из зародышей семян P. sibirica

Для индукции соматического эмбриогенеза в культуре in vitro использовали зиготические зародыши семян P. sibirica на стадиях инициации и развитых семядолей (I-II декада июля).

Результаты исследования показали, что при введении в культуру in vitro зиготических зародышей на стадии инициации семядолей, образование каллуса наблюдалось на 4-7 сут. культивирования в области зародышевого корешка. Образовавшийся каллус был прозрачного цвета (рис. 4А). При формировании эмбриогенного каллуса на 10-12 сут. культивирования каллус становился более плотным и покрывал всю поверхность гипокотиля (рис. 4Б, В).

В случае образования неэмбриогенного каллуса, прозрачная каллусная ткань в области зародышевого корешка отмирала на 10-15 сут. культивирования, и каллус формировался в области семядольного кольца, где, как правило, ослизнялся и

отмирал к концу стадии инициации (30 сут. культивирования), или происходил разрыв тканей гипокотиля, каллус активно разрастался, отличался плотной структурой и длительной жизнеспособностью (10-12 мес.).

Рис. 4. Формирование эмбриогенного каллуса P. sibirica (бар 1мм). А - 4-7 сут. культивирования; Б - 10-12 сут. культивирования; В - 30 сут. культивирования.

При введении в культуру in vitro зрелых зиготических зародышей P. sibirica (I декада августа), образования каллуса, как правило, не происходило. В большинстве случаев на 5-8 сут. культивирования наблюдалось сильное растяжение гипокотиля с разрывом тканей, начинали развиваться семядоли.

Каллусогенез из семян свободноопыленных клонов P. sibirica В 2010 г. в культуру in vitro для индукции соматического эмбриогенеза были введены зародыши семян P. sibirica на стадии инициации семядолей четырех своодноопыленных клонов - 277/22, 002, 145/4 и 153/13.

277/22 002 145/4 153/13 А ІІ5ЕУТ ВЗОСЇТ H45cyt

277/22 Gt-2 145/4 153/13 ■ І5еуі ВЗОсу* 045сут

Рис. 5. Динамика роста каллусов Р. 5ЬЫпса на среде 1/2ЬУ, содержащей различные концентрации регуляторов роста. А - среда 1; Б - среда 2; В - среда 3; Г -среда 4 (2010 г.).

Результаты исследования показали, что влияние концентраций экзогенных фитогормонов 2,4-Д и 6-БАП в питательной среде носило индивидуальных характер на каллусную культуру каждого клона (рис. 5). На ранних сроках культивирования (до 15 сут.), влияние концентраций фитогормонов являлось не значимым. К концу стадии инициации (30 сут. культивирования) концентрация 2,4-Д 4мг/л (рис. 5Г)

оказала ингибирующее действие на рост каллусных культур всех клонов. Концентрация 2,4-Д Змг/л явилась ингибирующей для клонов 277/22, 002 и 153/13 (рис. 5В). Для клона 145/4 различия в массе каллуса на средах, содержащих 2 и Змг/л 2,4-Д являлись недостоверными.

Пониженное содержание 6-БАП (0,5мг/л) (среда 2) оказало ингибирующее действие на каллусы клонов 002 и 153/13. На 30 сут. культивирования масса каллусов у данных клонов составил 0,242+0,040г и 0,468+0,090г против 0,847+0,140г и 0,751+0,208г на среде, содержащей 1мг/л 6-БАП (рис. 5А, Б).

При пересадке на пролиферационную среду (30 сут. культивирования) у всех клонов наблюдался активный прирост каллусной массы. Однако после двух пассажей (60 сут. культивирования) каллусы начинали буреть и их масса снижалась. Через 4 мес. каллусы клонов 002, 145/4 и 153/13 полностью некротизировали. Жизнеспособность в течение 12 мес. при регулярных пересадках сохраняла лишь каллусная культура клона 277/22, но затем каллус данного клона также отмирал.

В 2011, 2013 гг. для индукции соматического эмбриогенеза в культуру in vitro вводили зиготические зародыши семян клонов 275/20, 277/22, 280/25, 281/26, 002, 145/4, 153/13, 167/180, 139/149, 144/08 и 011/287, полученных в результате свободного опыления.

Частота каллусообразования у свободноопыленных клонов сильно варьировала и носила случайный характер, не зависящий от генотипа дерева и концентрации экзогенных фитогормонов в среде (рис. 6А).

У клонов 280/25, 002, 153/13, 011/287 и 144/08 формирующийся каллус характеризовался интенсивным ростом на стандартной среде 1 (рис. 6Б). Экспланты клона 281/26 наиболее интенсивно росли на среде 3 с повышенным содержанием 2,4-Д. Экспланты клонов 145/4, 167/189 и 139/149, напротив, росли более активно на среде 5 с пониженным содержанием 2,4-Д и 6-БАП. Экспланты свободноопыленных клонов 275/20 и 277/22 не обладали чувствительностью к концентрациям экзогенных фитогормонов.

^/VV ////

Ясрсдо12011 Вереда 3 2011 Ы сред-і 1 2013 ■ среда 5 2013 Псреда12011 Нсреда32011 0среда12О13 Исреді52013

Рис. 6. Каллусные культуры из зародышей семян Р. віЬігіса, полученных в результате свободного опыления. А - частота каллусообразования, Б - масса каллуса на 30 сут. культивирования.

К концу стадии инициации каллусы клонов 275/20, 280/25, 281/26, 145/4, 167/180, 139/49 и 011/287 начинали некротизировать и отмирали к концу первого пассажа на пролиферационной среде. Каллусные культуры клонов 277/22, 002, 153/13 и 144/08 сохраняли жизнеспособность до 2 мес.

Таким образом, экспланты каждого клона P. sibirica обладали индивидуальной чувствительностью к концентрациям регуляторов роста. Так для клона 145/4 повышенная концентрация 2,4-Д не явилась критической, также как и пониженная концентрация 6-БАП. Достоверные различия в росте каллусной массы в зависимости от концентрации экзогенных гормонов были получены для клонов 002 и 153/13. Каллусогенез из семян самоопыленных клонов P. sibirica (2011, 2013 гг.) При введении в культуру in vitro зародышей семян P. sibirica, полученных в результате самоопыления клонов 275/20, 277/22, 280/25, 281/26, 002 и 153/13, наблюдалась высокая частота каллусообразования (рис. 7А), однако каллусные культуры отличались низкой жизнеспособностью и некротизировали к концу стадии инициации. Масса каллуса не превышала 0,170+0,020г (клон 002). Исключение составил каллус клона 153/13, масса каллуса которого к этому сроку увеличилась до 0,378±0,038г и жизнеспособность сохранялась в течение 3 мес. (рис. 7Б).

* 100

S 9° о ао

£ 70

■g 60

0 50 jb- 40

1 30 ' 20

S ю

Н среда

Рис. 7. Каллусные культуры из зародышей семян P. sibirica, полученных в результате самоопыления. А - частота каллусообразования, Б - масса каллуса на 30 сут. культивирования.

Каллусогенез из гибридных семян клонов P. sibirica (2011, 2013 гг.)

В 2011, 2013 гг. для индукции соматического эмбриогенеза в культуру in vitro вводили зиготические зародыши гибридных семян клонов 275/20, 277/22, 280/25, 281/26, 002, 145/4 и 153/13, полученные результате контролируемого опыления.

Частота каллусообразования как у эксплантов разных клонов, так и внутри клона сильно варьировала. Данный показатель не был связан с генотипом материнского дерева, дерева-опылителя или содержанием экзогенных гормонов в питательной среде (рис. 8).

В 2011 г. каллусы, полученные из эксплантов от различных вариантов опыления клонов 275/20 и 281/26, наиболее интенсивно росли на среде 3, содержащей Змг/л 2,4-Д, Различия в массе каллуса являлись достоверными. Экспланты клонов 277/22 и 280/25 активно образовывали каллус на среде, содержащей 2мг/л 2,4-Д. Каллусы от эксплантов клона 145/4 в вариантах опыления пыльцой плюсовых деревьев 1К и 2К были не чувствительны к концентрациям 2,4-Д. Экспланты от других вариантов контролируемого опыления клона 145/4 формировали каллусные культуры, некротизировавшие в течение первых 14 сут. культивирования.

ірвммімм

г'амямм: ШЖ ■i

« ЧИР ЯЩ 1

Í HP

«і Iii * ШЩ * Vм

Sä Ulli s *

s* в s- ШШ

Si s m s ШШ *

і 8 - s mm

/ ж

V V Ф 12011 Передо 3 2011 И среда 12013 ■ среда 5 2013

/ / / / f Б

Q среда 1 2011 ■ среда 3 2011 И среда 1 2013 8 среда 5 2013

Н среда 12011г Э среда 3 2011Г □ среда 1 2013г ■ среда 5 2013г

Рис. 8. Частота каллусообразования у эксплантов гибридных семян Р. я¡Ыпса на среде 1/2ЬУ с различными концентрациями регуляторов роста.

Нсреда12011г 9 среда 3 2011г 0 среда 1 2013Г Всреда52013г

Рис. 9. Масса каллусов, полученных из зиготических зародышей Р. зЛшса на среде 1/2ЬУ с различными концентрациями фитогормонов (30 сут. культивирования).

Каллусные культуры эксплантов клонов 002 и 153/13 у всех вариантов опыления более интенсивно росли на среде, содержащей 2мг/л 2,4-Д. Наиболее активным ростом отличался каллус 153/1 Зх2К. К концу стадии инициации его масса составила 0,439+0,014гр.

В 2013 г. к концу стадии инициации наиболее интенсивный рост каллуса происходил на среде 5 у в клона 153/13, опыленного пыльцой кедра-акселерата 107 и пыльцой плюсового дерева 1К, а также клона 277/22, опыленного пыльцой дерева 1К, на стандартной среде 1.

Каллусы клонов 002 и 145/4 отличались низкой жизнеспособностью и некротизировали к концу стадии инициации. Каллусы клона 281/26 более интенсивно

росли на среде с пониженным содержанием регуляторов роста (среда 5) и некротизировали на среде 1.

Таким образом, на ранних этапах культивирования зиготических зародышей Р. sibirica, экспланты разных клонов отличались по чувствительности к концентрациям экзогенных фитогормонов. Каллусные культуры клонов 002 и 153/13 более интенсивно росли на стандартной среде (среда 1) или среде с пониженным содержанием 2,4-Д и 6-БАП (среда 5). Каллусные культуры остальных клонов более интенсивно росли на среде с повышенным содержанием 2,4-Д (среда 3) или не обладали чувствительностью к концентрациям фитогормонов.

Пролиферация эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ)(2011 г.)

При перенесении каллусов на пролиферационную среду, их рост заметно активизировался. Каллусные культуры клонов 275/20, 277/22, 280/25, 281/26 и 145/4 приобретали плотную или ослизненную структуру, желтоватого цвета, характерную для неэмбриогенного каллуса. После первого пассажа многие культуры начинали некротизировать. Каллусы клонов 002 и 153/13, в вариантах опыления 002x106, 153/13x107, 153/13х2К, приобретали рыхлую структуру, характерную для эмбриогенного каллуса и сохраняли жизнеспособность в течение 10-12 мес. Число каллусов данных клонов, вышедших на стадию пролиферации, составило 68, 74 и 67% соответственно.

Таким образом, при свободном опылении клонов P. sibirica был получен наибольший показатель массы каллусных культур, однако данные культуры отличались низкой жизнеспособностью и не формировали эмбриогенный каллус. Самоопыление клонов кедра сибирского оказало отрицательное влияние на процесс каллусогенеза. Контролируемое опыление клонов кедра сибирского положительно сказалось на состоянии формируемых каллусных культур. Наиболее высокие показатели роста каллуса и продолжительность жизнеспособности были отмечены в вариантах контролируемого опыления клонов пыльцой деревьев-акселератов 106 и 107. Следует отметить, что экспланты клонов 002 и 153/13, обладающие эмбриогенным потенциалом в культуре in vitro, проявляли большую чувствительность к концентрациям экзогенных регуляторов роста в питательной среде, чем неэмбриогенные экспланты. Однако эмбриогенные линии формировались не во всех вариантах опыления данных клонов.

Цитологический анализ культуры зиготических зародышей

Цитологический анализ культуры зиготических зародышей показал, что на 5-8сут. культивирования на среде для инициации, наблюдалось образования каллуса путем растяжения клеток гипокотиля (рис. 10А). Первоначальная длина клеток составляла 23,0±5,8мкм. На 10-12 сут. культивирования длина клеток, из которых состоял каллус, достигала 250-300мкм (рис. 10Б).

На 20 сут. культивирования образовавшийся каллус состоял из массы удлиненных клеток, длина которых достигала 700+50мкм, и оставался без изменения до конца инициации (рис. 10В). Далее происходило формирование «эмбриональных трубок» - удлиненные клетки увеличивались по ширине, вакуолизировались, в них просматривалось по 2-3 ядра (рис. ЮГ, Д). При пересадке на пролиферационную среду, в эмбриональных трубках происходило асимметричное деление. Одно из ядер смещалось к одному из концов вытянутой клетки и происходило деление с образованием эмбриональной инициали и новой

эмбриональной трубки (рис. 10Е). В течение последующих 5-7 сут. клетки эмбриональных инициалей активно делились и формировали эмбриональную глобулу, к дистальному концу которой прилегала одна эмбриональная трубка (рис. 10Ж). Размер глобул составлял 80,5-110,Омкм, эмбриональные трубки достигали в длину 450-51 Омкм. На 12-15 сут. на пролиферационной среде в каллусной массе наблюдалось образование клеточных конгломератов, состоящих из меристематических клеток, составляющих эмбриональные глобулы и трех-четырех эмбриональных трубок, примыкающих к дистальному концу глобул (рис. 103, И). Клетки трубок группировались в «пучки» и образовывали суспензор (рис. 10К, Л). Формировалась ЭСМ. Через 1 мес. культивирования на пролиферационной среде происходило выделение соматических зародышей из ЭСМ. Размеры соматических зародышей на стадии торпедо достигали 200х220мкм, длина суспензора составляла 2500±100мкм (рис. ЮМ).

Рис. 10. Развитие эмбриогенного каллуса из зиготических зародышей гибридных семян P. sibirica (бар 100 мкм, стрелками указаны ядра): А - первичное растяжение клеток экспланта (5-8 сут. культивирования); Б - вытянутые клетки на 10-12 сут. культивирования; В - длинные клетки на 20-30 сут. культивирования; Г, Д -образование эмбриональных трубок; Е - асимметричное деление в эмбриональной трубке; Ж - формирование эмбриональной трубки (ЭТ) из эмбриональной глобулы (ЭГ); 3, И - образование эмбриональной глобулы с несколькими эмбриональными трубками на дистальном конце; К, Л - глобула соматического зародыша с эмбриональными трубками; М - торпедообразные соматические зародыши.

Гормональный баланс в семенах и каллусных культурах P. sibirica Соматический эмбриогенез является динамическим процессом, управляемым изменениями экзогенных растительных регуляторов роста. Незначительные изменения концентраций фитогормонов регулируют метаболизм, морфогенез и анатомические события (Vagner et al., 2012). Компетентность эксплантов к соматическому эмбриогенезу в культуре in vitro во многом определяется их

гормональным балансом. Выявлено, что наибольшей компетентностью к данному процессу обладают экспланты с высоким содержанием ИУК и АБК и низким содержанием цитокининов (Jimenez, Bangerth, 2001; Silveira et al., 2004 и др.).

Определение содержания фитогормонов (ауксинов, цитокининов и АБК) проводилось в зиготических зародышах, мегагаметофитах и неморфогенном каллусе, полученном из зиготических зародышей P. sibirica.

Было показано, что в мегагаметофитах P. sibirica накапливалось меньше ИУК и АБК по сравнению с зиготическим зародышем (44,84 и 269,29нг/г против 83,64 и 346,50нг/г сухой массы). Общее содержание цитокининов в зародышах было почти в два раза больше, чем в мегагаметофитах (587,15 и 356,15нг/г сухой массы соответственно).

Через 3 мес. культивирования каллусов на пролиферационной среде 1/2LV, общее содержание цитокининов повышалось в 2-3 раза по сравнению с зиготическими зародышами (1033,38нг/г сухой массы), в то время как содержание ауксина в каллусе оставалось без изменения (88,34нг/г сухой массы) и к 7мес. культивирования снижалось до 10,36нг/г сухой массы. Содержание АБК в каллусе увеличивалось в два раза по сравнению с зиготическими зародышами.

Таким образом, каллус P. sibirica характеризовался низким содержанием ИУК и высоким содержанием цитокининов и АБК, что, вероятно, являлось причиной формирования неэмбриогенной культуры.

Глава 4. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ ИЗ МЕГАГАМЕТОФИТОВ Р.

SIBIRICA

В 2012-2013 гг. для индукции соматического эмбриогенеза в культуру in vitro вводили мегагаметофиты семян клонов 277/22, 281/26, 002, 145/4, 153/13, 139/149 и

Рис. 11. Каллусные культуры мегагаметофитов Р. ¿гйшса, полученные из эксплантов на различных стадиях развития зародыша (стрелками указано место образования каллуса; бар 1см). А - клон 145/4; Б - клон 153/13 (стадия оплодотворения); В - клон 277/22; Г - клон 145/4; Д - клон 281/26; Е - клон 153/13 (стадия глобулярного зародыша); Ж - клон 281/26; 3 - клон 145/4; И - клон 277/22; К - клон 153/13x107 (стадия инициации семядолей).

Экспланты вводили на стадиях оплодотворения (вторая декада июня), глобулярного зародыша (первая декада июля) и инициации семядолей (вторая-третья декада июля). Культивирование проводили на средах 1, 5 и 6 (табл.).

Результаты исследования показали, что формирование каллуса происходило на 5-8 сут. культивирования в области микропилярного конца мегагаметофита. Каллусная масса имела белый цвет, плотную или рыхлую структуру (рис. И). Через 1мес. культивирования у значительного большинства эксплантов каллус покрывал всю поверхность среза.

Частота каллусообразования у всех клонов сильно варьировала, носила случайный характер, и не была связана со стадией развития экспланта (рис. 12А) и содержанием экзогенных фитогормонов в питательной среде (рис. 12Б, В). Однако следует отметить, что при введении в культуру эксплантов, полученных в результате самоопыления (клоны 277/22x277/22; 145/4x145/4 и 281/26x281/26), частота каллусообразования была низкой (от 0% до 30%) (рис. 12Г).

Рис. 12. Частота каллусообразования у мегагаметофитов P. sibirica. А -экспланты свободннопыленных клонов на среде 1/2LV на различных стадиях развития зародыша: І- опдлодотворение; II - глобулярный зародыш; III -инициация семядолей; Б - экспланты гибридных семян на среде 1 с различными концентрациями фитогормонов (стадия глобулярного зародыша); В - экспланты свободноопыленных клонов на среде 1 (стадия глобулярного зародыша); Г - экспланты свободноопыленых и самоопыленных клонов на среде 1 (стадия глобулярного зародыша).

Наиболее активный рост каллуса наблюдался при введении в культуру in vitro эксплантов мегагаметофитов на стадии инициации семядолей (рис. 13А). К концу стадии инициации масса каллуса клона 281/26 достигал 0,600+0,005гр против 0,077±0,002гр при введении эксплантов того же клона стадии глобулярного зародыша.

При введении в культуру in vitro эксплантов мегагаметофитов на стадии инициации семядолей на среду с различными концентрациями фитогормонов, рост каллуса активно происходил как на среде 1, так и на среде 5 (рис. 13Б). Также формирование каллуса происходило на безгормональной среде 6, однако, к концу стадии инициации каллусы свободноопыленных клонов 145/4 и 167/180 на данной среде полностью некротизировали.

Каллусы, полученные из мегагаметофитов свободноопыленных клонов, введенных в культуру in vitro на стадии глобулярного зародыша, отличались слабым ростом. К концу стадии инициации их масса колебалась от 0,054±0,001гр (клон 277/22) до 0,078+0,001гр (клон 153/13) (рис. 13В). Несмотря на это, при перенесении на пролиферационную среду у эксплантов двух клонов 283/26 и 153/13 формировались эмбриогенные каллусные культуры.

У эксплантов самоопыленных клонов 281/26 и 145/4 масса каллусной культуры к концу стадии инициации была ниже, чем в вариантах свободного опыления (0,077 и 0,064гр против 0,088 и 0,083гр соответственно). У эксплантов самоопыленного клона 277/22 образования каллуса не происходило (рис. 13Г).

145/4

■ i aft aw

-¿S..........

155/13

//////-ул

ЕЗ среда 1 Е5средй5 ■ среда 6

0,09 ; 0,0В ■

0,03 0,02 ■!

277/Z2 2S1/26 283/26 145/4 153/15 аббсут ■ йктт

277/22 281/26 14S/4

(- ■ i амооиылеиие {^свободное опыление

Рис. 13. Масса каллусных культур из мегагаметофитов P. sibirica (30 сут. культивирования). А - экспланты свободннопыленных клонов на среде 1/2LV на различных стадиях развития зародыша: I- опдлодотворение; II - глобулярный зародыш; III -инициация семядолей; Б - экспланты гибридных семян на среде 1 с различными концентрациями фитогормонов (стадия глобулярного зародыша); В -экспланты свободноопыленных клонов на среде 1 (стадия глобулярного зародыша); Г - экспланты свободноопыленых и самоопыленных клонов на среде 1 (стадия глобулярного зародыша).

Цитологический анализ культуры мегагаметофитов

Цитологический анализ каллусных культур мегагаметофитов проводили на эксплантах свободноопыленных клонов, введенных в культуру in vitro на глобулярной стадии развития зародыша. Результаты исследования показали, что на 57 сут. культивирования в области микропилярного конца, а затем вдоль продольной оси среза мегагаметофита происходило растяжение клеток (рис. 14А, Б). Первоначальная длина клеток экспланта составляла 30,1±1,4мкм. К концу первого месяца культивирования на среде для инициации образовавшийся каллус состоял из вытянутых вакуолизированных клеток, длина которых в среднем составляла 495,0±24,2мкм.

Рис. 14. Развитие эмбриогенного каллуса из мегагаметофитов P. sibirica (клон 283/26, стадия глобулярного зародыша) (бар ЮОмкм): А - ткань мегагаметофита Р. sibirica при введении в культуру in vitro; Б - первичное растяжение клеток экспланта: в центре расположены клетки экспланта, окруженные вытянутыми каллусными клетками; В - образование двуядерного ценоцита; Г - миграция четырех ядер ценоцита к полюсу длинной клетки; Д - формирование четырех инициальных клеток и безъядерной клетки-трубки; Е - образование клетки суспензора; Ж - формирование двух клеток суспензора; 3 - образование глобулы соматического эмбриоида и суспензора; И, К, JI - скопление эмбриоидов P. sibirica; Н - миграция ядер в клетках суспензора на дистальный конец; М - формирование четырехядерного ценоцита в клетке суспензора; О - глобула соматического зародыша P. sibirica.

Большинство длинных клеток не завершали цитокинез, в результате чего в клетке образовывались два ядра (рис. 14В), которые делились, и формировался четырехядерный ценоцит. Эти четыре ядра мигрировали к одному из полюсов длинной клетки (рис. 14Г), где происходило формирование клеточных стенок, и образовывались четыре маленькие клетки с темноокрашенной цитоплазмой (инициали эмбриоида). К базальному концу этих клеток примыкали безъядерная длинная клетка, которая затем, вероятно, отмирала (рис. 14Д). Инициальные клетки эмбриоидов продолжали делиться, образовывая агрегаты, а затем глобулы соматических эмбриоидов.

Через 2 мес. культивирования, при перенесении каллусов на пролиферационную среду, клетки нижней части глобулы (к которой прилегала длинная деградировавшая вакуолизированная клетка) начинали удлиняться и формировали суспензор, состоящий из связки 6-7 длинных вакуолизированных клеток. Формировался

соматический эмбриоид, который включал эмбриональную глобулу и суспензор (рис. 14Е, Ж, 3).

В каллусе шло активное формирование ЭСМ (рис. 14И, К, Л). В крайних клетках суспензоров наблюдалось образование нескольких ядер, которые мигрировали к дистальному концу, образовывая четырехядерный ценоцит (рис. 14М, Н), затем из четырех клеток формировались агрегаты и, наконец, глобулы новых соматических зародышей (рис. 140). На 120 сут. культивирования размер глобул клона 283/26 составил 88,8±4,0мкм, клона 153/13 - 72,9±6,8мкм. Клетки суспензоров клона 283/26 достигали в длину - 446,4±97,3мкм, клона 153/13 - 494,7+79,7мкм.

Таким образом, полученный эмбриогенный каллус состоял из активно пролиферирующей ЭСМ, в которой шло образование эмбриоидов.

Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ ПОТОМСТВА ГИБРИДНЫХ СЕМЯН P. S1BIRICA В УСЛОВИЯХ ТЕПЛИЦЫ

В 2012 г. стратифицированные гибридные семена P. sibirica, полученные в результате контролируемого опыления 2010 г., были высажены в теплицу Погорельского ОЭП. Показатели всхожести гибридных семян сильно варьировали -от 0% (клон 153/13x153/13) до 50% (клон 002х2К) (рис. 15А). Самоопыление оказало отрицательно влияние на всхожесть семян клонов.

J9S

3? Я

S т

1 i..............

..................а

:| I | 1 1 1 | к

;| 1 1 | IX I,...................1 LI.IZI 1 * 1 1 ! I |

1 II д.и 1.........* 1.1,1

1.......I.J.

I I 1 11.1.1

1 i 1 LI..........I.JJ

* J 1 » I I ] ГЖ-ц——t LJ.......I...........j u 111 1 * 1 i ■ [J [ i lis L И J lUL I I

тттФ^шщ^ ш///////*'*///?//'

4 А V V 'V V V V 2

Рис. 15. Потомство гибридных семян Р. «Ыпса в теплице Погорельского ОЭП. А - всхожесть семян. Б - высота сеянцев в конце первого вегетационного периода.

К концу первого вегетационного периода высота сеянцев гибридных семян Р. иЫпса варьировала от 1,9см (клон 277/22х2К) до 5,6см (клон 002) (рис. 15Б). У семян, полученных при опылении клонов 277/22, 281/26 и 145/4 пыльцой кедров-акселератов 106 и 107, наблюдались наиболее высокие показатели роста внутри клона. Однако на рост гибридных сеянцев других клонов контролируемое опыление не оказало достоверно значимого влияния.

выводы

1. Контролируемое опыление не оказало достоверного влияния на размеры и семенную продуктивность женских шишек клоновых деревьев P. sibirica, но положительно сказалось на качестве гибридных семян.

2. Получены каллусные культуры из мегагаметофитов и зиготических зародышей свободноопыленных и гибридных семян. Формирование эмбриогенного каллуса и индукция соматического эмбриогенеза были отмечены у эксплатов клонов 002 и 153/13, опыленных пыльцой деревьев-акселератов 106 и 107 и плюсовым деревом 2К.

3. Механизм образования соматических зародышей в культуре мегагаметофитов и культуре зиготических зародышей отличается: в культуре половых зародышей идет удлинение клеток эксплантов и их асимметричное деление, так же, как у зародышей, образующихся естественным путем; в культуре мегагаметофитов образование соматических зародышей осуществляется через стадию ценоцита, миграцию ядер к полюсу клетки и формирование инициальных клеток и глобул соматических зародышей.

4. Экспланты P. sibirica, обладающие эмбриогенной компетентностью, в условиях культуры in vitro отличаются чувствительностью к концентрациям экзогенных фитогормонов. Высокие концентрации экзогенных фитогормонов оказывают ингибирующее действие на рост каллуса из компетентных эксплантов. Зиготические зародыши P. sibirica с высоким содержанием цитокининов и АБК формируют неэмбриогенный каллус.

5. Опыление клонов P. sibirica пыльцой деревьев из естественного древостоя оказало положительное влияние на всхожесть и рост гибридных семян в условиях ех situ.

Список работ по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Савельев, С.С. Качество пыльцы кедра сибирского (Pinus sibirica (Pinaceae)) на клоновой прививочной плантации в Западно-Саянском опытном лесном хозяйстве / С.С. Савельев, И.Н. Третьякова, Е.В. Ворошилова. Ю.А. Череповский // Хвойные бореальной зоны. 2008. Т. 25. № 3-4. С. 295-299.

2. Третьякова, И.Н. Перспективы микроклонального размножения хвойных в культуре in vitro через соматический эмбриогенез / И.Н. Третьякова, Е.В. Ворошилова. Д.Н. Шуваев, М.Э. Пак // Хвойные бореальной зоны. 2012. Т. 28. № 1-2. С. 180-186.

3. Третьякова, И.Н. Образование каллуса и индукция соматических зародышей в культуре in vitro у Pinus sibirica Du Tour / И.Н. Третьякова, Е.В. Ворошилова. Д.Н. Шуваев, A.C. Лукина // Journal of Siberian Federal University. Biology. 2013. V. 6. № 1. P. 44-60.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в других изданиях

4. Пак, М.Э. Индукция эмбриогенного каллуса кедра сибирского (Pinus sibirica Du Tour) в культуре in vitro / М.Э. Пак, Д.Н. Шуваев, Е.В. Ворошилова // Материалы XLIX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», Биология. Новосибирск. 2011. С. 248.

5. Третьякова, И.Н. Содержание эндогенных фитогормонов в семенах и эмбриогенном каллусе Larix sibirica и Pinus sibirica /

И.Н. Третьякова, Е.В. Ворошилова, Д.Н. Шуваев, М.Э. Пак // VII съезд общества физиологов растений России. Материалы докладов в двух частях. Часть П. Нижний Новгород 2011. С. 704-705.

6. Третьякова, И.Н. Соматический эмбриогенез и формирование клеточных линий у хвойных в Сибири / И.Н. Третьякова, Е.В. Ворошилова, Д.Н. Шуваев // VII съезд общества физиологов растений России. Материалы докладов в двух частях. Часть П. Нижний Новгород, 2011. С. 703-704.

7. Tretyakova, I. Micropropagation by somatic embryogenesis of coniferous species in Siberia /1. Tretyakova, E. Voroshilova. D. Shyvaev, M. Park // Materials of 3th International Boreal Forest Research Association, Krasnoyarsk, 2011. P. 69-73.

8. Третьякова, И.Н. Перспективы микроклонального размножения хвойных в культуре in vitro через соматический эмбриогенез / И.Н. Третьякова, Н.Е. Носкова, Е.В. Ворошилова, Д.Н. Шуваев // Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири. Материалы 3-го международного совещания, Красноярск 2011. С. 137.

9. Voroshilova. Е. Induction of somatic embryogenesis in culture in vitro and content of phytohormones in callus and seeds of Pinus sibirica / E. Voroshilova, D. Shyvaev, I. Tretyakova // Abstracts of 2th International Conference of IUFRO «Integrating vegetative propagation, biotechnologies and genetic improvement for tree production and sustainable forest management». 25-28 June 2012, Brno Cheswick republic. P 1-8.

10. Tretyakova, I. The Embryogenic lines and somatic embryogenesis of coniferous species in Siberia / I. Tretyakova, E. Voroshilova, A. Ivanitska, D. Shuvaev, M. Park // Abstracts of 2th International Conference of IUFRO «Integrating vegetative propagation, biotechnologies and genetic improvement for tree production and sustainable forest management». 25-28 June 2012, Brno, Cheswick republic. P. 8.

11. Tretyakova, I. The biotechnology of embryogenic cell lines obtaining and plantlets of coniferous species in Siberian in culture in vitro / I. Tretyakova, E. Voroshilova, A. Ivanitska, D. Shuvaev, M. Park // Abstracts of П International Conference «Plant Genetics, Genomics and Biotechnology». Irkutsk. 2012. P. 71.

12. Ворошилова Е.В. Индукция соматического эмбриогенеза у гибридных семян Pinus sibirica Du Tour / Е.В. Ворошилова, Д.Н. Шуваев // Материалы IV Международной Школы молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология». Пермь, 3-9 декабря 2012.

13. Tretyakova, I. The Embryogenic lines and somatic embryogenesis of coniferous species in Siberia / I. Tretyakova, E. Voroshilova. A. Ivanitska, D. Shuvaev, M. Park // Proceedings 2th International Conference of IUFRO «Integrating vegetative propagation, biotechnologies and genetic improvement for tree production and sustainable forest management». 25-28 June 2012, Brno Cheswick republic. P. 71-79.

14. Третьякова, И.Н. Эмбриогенные клеточные линии и соматический эмбриогенез in vitro у видов хвойных, произрастающих в Сибири / И.Н. Третьякова, Е.В. Ворошилова. А.С. Иваницкая, Д.Н. Шуваев, М.Э. Пак // Тезисы X Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология. Казань, 14-18 октября 2013. С. 151.

15. Ворошилова. Е.В. Соматический эмбриогенез в культуре мегагаметофитов и соматических зародышей Pinus sibirica / Е.В. Ворошилова, И.Н. Третьякова // Тезисы X Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология. Казань, 14-18 октября 2013. С. 107.

Подписано в печать 19.11.2013. Печать плоская Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,3 Тираж 100 экз. Заказ № 3816

Отпечатано полиграфическим центром Библиотечно-издательского комплекса Сибирского федерального университета 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а, тел.: +7(391) 206-26-49, 206-26-67 E-mail: print_sfu@mail.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ворошилова, Елена Владимировна, Красноярск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЛЕСА ИМ. В.Н. СУКАЧЕВА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201454126

Ворошилова Елена Владимировна

ИНДУКЦИЯ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO У ГИБРИДНЫХ СЕМЯН PINUS SIBIRICA DU TOUR

03.01.05.- Физиология и биохимия растений 03.02.01. - Ботаника

Диссертация на соискания ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Гаевский Н.А. доктор биологических наук, профессор

Третьякова И.Н.

Красноярск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение......................................................................................................................5

Глава 1. Соматический эмбриогенез хвойных в культуру in vitro.........................9

1.1. Зиготический эмбриогенез хвойных видов.......................................................9

1.2. История развития методов микроклонального размножения растений в XX-

XXI вв..........................................................................................................................12

Соматический эмбриогенез в культуре in vitro......................................................13

1.2.1. Получение соматического эмбриогенеза у представителей рода Pinus .... 15

Индукция соматического эмбриогенеза..................................................................15

Созревание соматических эмбрионов.....................................................................20

Прорастание соматических эмбрионов...................................................................23

1.2.2. Получение гаплоидных культур хвойных....................................................25

1.2.3. Генетическая регуляция соматического эмбриогенеза...............................26

1.3. Гормональная регуляция в культуре in vitro....................................................28

1.3.1. Гормональная регуляция зиготического эмбриогенеза, роль фитогормонов при прорастании семян....................................................................28

1.3.2. Фитогормоны в культуре ткани.....................................................................33

Чувствительность тканей эксплантов как фактор, регулирующий соматический

эмбриогенез................................................................................................................37

Гормональная регуляция соматического эмбриогенеза хвойных видов.............37

1.4. Половая репродукция кедра сибирского..........................................................40

1.4.1. Внутривидовая гибридизации кедра сибирского.........................................40

1.4.2. Роль фитогормонов в определении пола у растений...................................41

Определение пола у хвойных видов........................................................................43

1.4.3. Фитогормоны и морфология шишек хвойных видов..................................44

1.4.4. Особенности половой репродукции особей кедра сибирского с

однолетним циклом развития женской шишки......................................................48

Глава 2. Характеристика объектов исследования, материалы и методы............50

2.1. Общая характеристика кедра сибирского........................................................50

2.2. Объект исследования..........................................................................................53

2.3. Растительный материал и методы исследования............................................55

2.3.1. Контролируемое опыление кедра сибирского..............................................55

2.3.2. Стерилизация помещений и лабораторной посуды. Обработка растительного материала..........................................................................................58

2.3.3. Получение каллусных культур кедра сибирского.......................................58

Индукция каллусообразования и соматического эмбриогенеза...........................58

Пролиферация каллусной массы..............................................................................60

Предсозревание соматических зародышей.............................................................60

Созревание соматических зародышей.....................................................................60

2.3.4. Цитологический анализ и статистическая обработка данных....................61

2.4. Определение эндогенного содержания фитогормонов..................................62

2.4.1. Твердофазный иммуноферментный анализ..................................................62

Экстракция, очистка и концентрирование гормонов.............................................62

Проведение твердофазного иммуноферментного анализа...................................63

2.4.2.0пределение концентрации ИУК методом газожидкостной хроматографии

......................................................................................................................................64

Фиксация образцов и экстракция гормонов...........................................................64

Проведение газожидкостной хроматографии.........................................................64

ГЛАВА 3. Соматический эмриогенез из гибридных семян, полученных в результате контролируемого и свободного опыления .........................................65

3.1. Структура урожая женских шишек кедра сибирского на клоновой прививочной плантации в 2010-2013 гг..................................................................65

3.2. Качество семян кедра сибирского, полученных в результате контролируемого и свободного опыления (2011-2012 гг.)...................................71

3.3. Каллусогенез и индукция соматического эмбриогенеза из зиготических

зародышей семян кедра сибирского........................................................................72

Каллусогенез из зиготических зародышей семян свободноопыленных клонов

(2010 г.).......................................................................................................................72

Каллусогенез и индукция соматического эмбриогенеза из зародышей

гибридных семян кедра сибирского в 2011 г..........................................................75

Пролиферация эмбрионально-суспензорной массы..............................................78

Инициация соматического эмбриогенеза из зародышей гибридных семян кедра

сибирского в 2013 г...................................................................................................81

Цитологический анализ соматического эмбриогенеза из зародышей гибридных семян...........................................................................................................................83

3.4. Гормональный баланс в семенах и каллусных культурах кедра сибирского

......................................................................................................................................87

Глава 4. Соматический эмбриогенез из мегагаметофитов кедра сибирского ....90 Индукция соматического эмбриогенеза из мегагаметофитов кедра сибирского

на стадии оплодотворения........................................................................................90

Индукция соматического эмбриогенеза из мегагаметофитов кедра сибирского

на стадии глобулярного зародыша..........................................................................91

Пролиферация эмбрионально-суспензорной массы..............................................93

Предсозревание и созревание соматических зародышей......................................93

Индукция соматического эмбриогенеза из мегагаметофитов кедра сибирского

на стадии инициации семядолей..............................................................................94

Цитологический анализ каллусных культур мегагаметофитов кедра сибирского ......................................................................................................................................96

Глава 5. Изучение гибридных семян кедра сибирского в условиях теплицы... 101

Заключение...............................................................................................................104

Выводы......................................................................................................................106

Список литературы.................................................................................................107

Приложения.............................................................................................................126

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы диссертации. У кедра сибирского {Pinus sibirica Du Tour), произрастающего в горах Южной Сибири, систематически встречаются уникальные особи с акселерацией генеративного процесса (Ирошников, 1974; Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990). У данных особей развитие женских шишек и семян происходит в год опыления за 2,5-Змес. (вместо 1 года), однако семена формируются с развитым эндоспермом, но без зародыша. Внешне данный феномен проявлялся в локализации женских шишек на кончиках побегов, где обычно располагается озимь (Ирошников, 1974).

По данным физиолого-биохимических исследований женские шишки уникальных особей кедра сибирского характеризуются активным метаболизмом, высоким содержанием ауксинов и гиббереллинов, а также накапливают свободные аминокислоты и низкомолекулярные углеводы (Минина, Ларионова, 1979).

Для изучения репродуктивного процесса кедра сибирского и сохранения его уникальных форм наиболее перспективным направлением является проведение экспериментов по контролируемому опылению и получение хозяйственно-ценных гибридов, которые можно размножать ex situ и традиционными методами биотехнологии в культуре in vitro через соматический эмбриогенез.

В основе метода соматического эмбриогенеза лежит явление

тотипотентности - способности растительной клетки в условиях культуры in

vitro реализовывать имеющуюся у нее генетическую информацию и давать

начало целому организму (Бутенко, 1964). Этот эффективный метод

регенерации растений является модельной системой для изучения реализации

морфогенетических программ, физиологических (гормональная регуляция) и

молекулярно-генетических (изучение состояние генома) исследований в раннем

онтогенезе, а также имеет прикладное значение в современных генетико-

селекционных исследованиях, направленных на массовое тиражирование

улучшенных форм хвойных. С момента открытия соматического эмбриогенеза у хвойных (Hakman et al., 1985), были получены соматические эмбрионы и сеянцы для 28 представителей рода Pinus, а также успешно ведется плантационное лесовыращивание.

Первые результаты по индукции соматического эмбриогенеза из незрелых зиготических зародышей у кедра сибирского были опубликованы в 2009г (Третьякова, Ижболдина, 2009). Однако инициация каллуса происходила только у единичных эксплантов, и образование соматических зародышей в полученных каллусных культурах носило случайный характер.

Цели и задачи исследования. Цель исследования — индукция процесса соматического эмбриогенеза в культуре in vitro у гибридных семян кедра сибирского, полученных в результате контролируемого опыления, в том числе пыльцой кедров-акселератов, и испытание потомства в условиях ex situ.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- проведение контролируемого опыления и отбор клонов кедра сибирского, экспланты которых обладают эмбриогенным потенциалом в культуре in vitro;

- инициация процесса соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей и мегагаметофитов;

- цитологический анализ полученных каллусных культур;

- анализ гормонального баланса семян и каллусных культур кедра сибирского;

- исследование гибридного потомства клонов кедра сибирского в условиях теплицы.

Научная новизна исследования заключается в том, что впервые из

эксплантов гибридных семян кедра сибирского, полученных в результате

опыления пыльцой кедров-акселератов, были индуцированы эмбриогенный

каллус и процесс соматического эмбриогенеза. Показана перспективность

использования мегагаметофитов в качестве эксплантов для получения

эмбриогенных культур. Впервые изучено содержание эндогенных

фитогормонов в каллусах и семенах (зародыше и эндосперме) кедра сибирского.

Теоретическая и практическая ценность полученных результатов.

Разработанная методика индукции соматического эмбриогенеза кедра сибирского будет служить основой для создания биотехнологии получения регенерантов данного вида. Проведенные исследования по культивированию мегагаметофитов позволят подойти к проблеме размножения уникальных особей с однолетним циклом развития женских шишек. Полученные результаты лягут в основу создания орехоплодных плантаций кедра сибирского.

Защищаемые положения:

1. Реализация соматического эмбриогенеза у кедра сибирского связана с генотипом дерева-донора, а также стадией развития экспланта, используемого для ввода в культуру in vitro.

2. Уникальные генотипы кедра сибирского могут быть размножены с помощью культуры мегагаметофитов.

Содержание и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы и 6 приложений.

Работа изложена на 138 страницах, содержит 10 таблиц, 49 рисунков.

Библиографический список включает 192 наименования, из которых 150 иностранные источники.

Личный вклад соискателя. Представленные в диссертации экспериментальные данные, за исключением результатов по иммуноферментному анализу гормонального баланса семян кедра сибирского, получены непосредственно соискателем.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям д.б.н., проф. Третьяковой Ираиде Николаевне и д.б.н., проф. Гаевскому Николаю Александровичу за оказанную помощь и руководство в процессе выполнения работы и написания диссертации; д.б.н., заведующей лабораторией лесной генетики и селекции Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН Муратовой Елене Николаевне за предоставленную возможность выполнения работ по культуре ткани; Череповскому Юрию Анатольевичу за возможность проведения работ на прививочной плантации Западно-Саянского ОЛХ; д.б.н. Кудояровой Гюзели Радомесовне за предоставление данных по иммуноферментному анализу; д.б.н., проф. Медведеву Сергею Семеновичу, к.б.н. Пожванову Григорию Александровичу и к.б.н. Шаварде Алексею Леонидовичу за организацию и проведение стажировки по освоению методов газожидкостной хроматографии на кафедре физиологии и биохимии растений СПбГУ.

Глава 1. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ ХВОЙНЫХ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

1.1. Зиготический эмбриогенез хвойных видов

У хвойных растений возможны множественные пути реализации их репродуктивного потенциала: асексуальное возникновение зародыша, полиархегониальность, полиэмбриония и кливаж. Оплодотворение двух и более яйцеклеток в пределах семязачатка и последующий кливаж клеток зиготического зародыша приводит к возникновению нескольких зародышей, полученных от разных опылителей в одном мегагаметофите (иногда до 16 зародышей) (Третьякова, 1990; 2008).

Зиготический эмбриогенез хвойных после оплодотворения зиготы может быть разделен на три основные фазы: проэмбриогенез, ранний эмбриогенез и поздний эмбриогенез (Singh, 1978). Проэмбриогенез - включает все стадии до удлинения суспензора, ранний эмбриогенез - включает стадии после удлинения суспензора и до заложения меристемы корня, поздний эмбриогенез -начинается от заложения меристем корня и побега и включает все последующие события до формирования зрелого зародыша с хорошо развитыми семядолями (Singh, 1978; Третьякова, 1990).

зиготвческня эмбриогенез голосеменных (Ршасеае)

прюибрио риппйзмбриогм« поздний эмбриогенез созревши*

Рис. 1. Схема зиготического эмбриогенеза голосеменных, на примере семейства Pinaceae (по Gifford, Foster, 1989).

Проэмбриогенез. Процесс проэмбриогнеза протекает в пределах

архегония. После оплодотворения ядро яйцеклетки делится дважды,

образовавшиеся в результате деления четыре ядра опускаются в основание

проэмбрио, где располагаются в одной плоскости. Далее каждое ядро делится вертикально, и образовавшиеся в результате восемь ядер располагаются в два яруса (или два уровня), при этом клеточных стенок между ними не образуется. Эти два яруса получили названия «первичный верхний ярус» и «первичный эмбриональный ярус». Далее происходит формирование вторичного веретена деления, и между ядрами возникают клеточные перегородки, при этом верхний ярус остается открытым, а эмбриональный ярус становится полностью закрытым. Оба яруса делятся еще раз, формируя в общем четыре уровня: два эмбриональных, суспензорный и верхний ярус (von Aderkas et al., 1991). Образующийся 16-клеточный проэмбрио состоит из одинаковых клеток, отличающихся местом их расположения в системе проэмбрио. Однако способностью к растяжению обладают лишь клетки предпоследнего яруса, которые берут на себя функцию первичного суспензора и выталкивают эмбриональные инициали в ткань женского гаметофита (Третьякова, 2008).

Ранний эмбриогенез. Период раннего эмбриогенеза начинается с

удлинения клеток первичного суспензора (von Aderkas et al., 1991). У

представителей семейства Pinus рост первичных суспензоров (эмбриональных

трубок) идет с неодинаковой скоростью и уже на уровне инициалей начинается

кливаж зиготического зародыша на четыре самостоятельные единицы.

Эмбриональные инициали подвергаются многократному делению и формируют

четыре эмбриональных глобулы зародыша (Третьякова, 2008). Это явление,

характерное для всех хвойных растений, было названо полиэмбрионией (Singh,

1978). Gupta и Grob (1995) описали два типа полиэмбрионии: простая

полиэмбриония, которая происходит в результате оплодотворения нескольких

яйцеклеток в женском гаметофите, и кливажная полиэмбриония - �

Информация о работе