Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы: физиологические и биотехнологические аспекты
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации по теме "Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы: физиологические и биотехнологические аспекты"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ нм. К.А.ТИМИРЯЗЕВА
3 Г 6 0 М На правах рукотки
КАРАБАЕВ Мурагбек '
КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ КЛЕТКИ ПШЕНИЦЫ И КУКУРУЗЫ: ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
Специальности:
03.00.12 — физиология растений 03.00.23 — биотехнология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва. — (804
Работа выполнена в Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина Национальной Академии наук Республики Казахстан.
Официальные оппоненты — доктор биологических наук
С. А. ГОСТИМСКИЙ
— доктор биологических наук В. В. КУЗНЕЦОВ
— доктор биологических наук В. В. МАЗИН
Ведущее учреждение — Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева.
Защита состоится « »_1994 г. в час
на заседании специал:;зкр:ванного совета Д.002.45.01 при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН (127276, Москва, Ботаническая ул., 35).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.
Автореферат разослан « » 1994 г.
Ученый секретарь специализированного совета
Н. В. ЗАГОСКИНА
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Развитие идей и катодов физиологии растений и клеточной биологии, с одной стороны, молекулярной биологии и генетики - с другой, привело к появлению новых методов и методологий - клеточной и генной инженерии. Этим была заложена основа для становления современной высотой биотехнологии, которая сегодня стремительно выдвигается на передний край научно-технического прогресса.
Подавляющее большинство биотехнологий для растений основано на использовании культур тканей, клеток и протопластов. Ценность данной экспериментальной системы определяется ее большими потенциальными возможностями в решении практических и фундаментальных проблем биологии и создании новых эффективных биотехнологий. И тем не менее эти возможности в селекции валнейдих сельскохозяйственных культур и, прежде всего, зерновых злаков, остаются все еще нереализованными. Это связано с нерешенностью целого ряда проблем, в частности, со слабой разработанностью методов регенерации растений в культуре клеток и протопластов, клеточной и тканевой селекции, с отсутствием эффективных способов генетической трансформации клеток и получения фертильных траясгенных растений, ограниченностью знаний о клеточных и молекулярных процессах жизнедеятельности культуры in vitro, механизмах регуляции ее морфогенеза. Попытки реиения такого рода проблем применительно к важнейшим представителям злаковых растений -пгекице и кукурузе, и составили основу данной работы. Особое отношение к этим растениям определяется не только их ролью в питании человека и животных, но и трудностьо задач - это наиболее сложные для культивирования in vitro и использования методов клеточной и генной инженерии растительные объекты.
Цель и задачи. Цель настоящего исследования - изучение физиологических особенностей культивируемых клеток зерновых злаков на примере пшеницы и кукурузы и создание новых биотехнологий для селекции. Дая этого необходимо было решить следующие задачи: 3. Определоть Факторы..влияющие на интенсивность каллусообразоваяия и регенерации растений пшеницы и кукурузы в культуре in vitro.
2. Изучить генетическую нестабильность клеток в культуре, приводящую к вариабельности клеточных популяций и сомаклолальной изменчивости растений,
3. Получить суспензионные культуры клеток пиенады и кукурузк, обогащенные детерминированными к эмбриогенезу и регенерации расте-
ний клетками.
4. Кайти условия получения делящихся протопластов и регенерации из них растений.
5. Показать возможность новых подходов к решению физиологических проблем с помощью культивируемых клеток (фотосинтез, морфогенез, стрессы).
6. Создать биотехнологии ¡fe основе клеточкой и генной инленерии для селекции и использовать их на практике.
Научная_новизна__и _практическая ценность. Продемонстрированы
возможности культивируемых клеток и методов на их основе для эффективного решения важнейших фундаментальных и прикладных научных проблем, таких, как фотосинтез, модекужрние механизмы морфогенеза, клеточная селекция на устойчивость к стрессам, в том числе а условиях косшч$ских полетов. Впервые с помогаю методов культуры клеток индуцированы изменения соотношения карбоксидаэной и оксигеназкой активностей ключевого фермента фотосютеза РДФ-карбоксилазы. Выделен фактор пептидной природы, стимулирующий морфогенез в культуре клеток. Впервые на культуре in vitro пшеницы и кукуруз;.- изучена реактивность процессов роста и развития клеток и структур на воздействие факторов косшческого полета в связи с его длительностью. Разработана система генетической трансформации злаков, основанная на слиянии генов и прямом переносе ДНК в змбриогенные протопласты; показана ее эффективность для массового получения фертильных трансгенных растений кукуруаы и функциональной оценки различных промо-торных конструкций.
Для пшеницы и кукурузи разработаны биотехнологии а} получения растений-сомаклонов с применением суспензионного культивирования клеток и делящихся протопластоэ; б) клеточной селекции пшеницы на устойчивость к септориозу; в) генетической трансформации клеток и получения фертильных трансгенных растений кукурузы.
Апробация работа. Основные положения работы были долояены и представлены на различных международных, всесоюзных, республиканских конференциях, симпозиумах, совещаниях, семинарах, в том числе на Всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пуки-но, 1984, 1986); ¡V (Ашхабад, 1986) я V (Ташкент, 1991) конференциях биохимиков Средней Азии и Казахстана; Всесоюзном симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1987); на I (Новосибирск, 1988) и И (Алмать, 1993) Международных конференциях "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология"; Всесоюзной
конференции по биотехнологии злаковых культур (Алматы, 1SS8); Международном симпозиум«- "Клеточные и геянне биотехнологии дел зерновых элакоэ" (Алматы, 19S9), Республиканских конференциях "Актуальные проблемы Оизико-химической биологии и биотехнологии" (Алматы, 1939), "Проблемы теоретической и прикладной генетики а Казахстане" (Алматы, 1980); Всесоюзной Hayn- >й школе "Клеточные технологии в селекционном процессе" (Москва, 1989); 20 съезде Федерации Европейских Биохимических Обцеств (Будапешт, Венгрия, 1990); VII Международном конгрессе по культуре тканей и клеток растений (Амстердам, Нидерланды, 1990): Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (Целиноград, 1991); Международном симпозиуме по иьэ-лироэакным протопластам (Упсала, Швеция, 1991); IV технологическом конгрессе Венгрии (Сегед, 1591); 3 Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пуядако, 1991); Международной конференции по геному растений (Сан-Диего, США, 1994); научных семинарах Центральной лаборатории генетической инженерии (Костинброд, Болгария) , Института пшеницы и хлопка (Чкрпан, Болгария), Института пшеницы и подсолнечника (Толбухин, Болгария), Института зерновых культур (Сегед, Венгрия), Института сельскохозяйственных культур (Квед-линбург, Германия).
B&xjíSl-l'lL. Основные положения диссертации изложены в 96 печатных работах, включая 6 авторских свидетельств на изобретения.
Диссертация изложена на 380 страницах машинописного текста, содержит 59 та5лиц и 36 рисунков. Состоит из введения, 9 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 736 наименований, из них 624 на иностранных языках.
ФАКТОРУ, ВШЩЯЕ ИЛ ИНТЕНСИВНОСТЬ ЯШУСООЕРАЗОВАШЧ И РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕШ &рвые этапы работы, как и любые исследования подобного рода, были связаны с изучением факторов, влиявших на регенерациэняую способность культивируемых клеток ляэницы и кукурузы, роли эпигенетических особенностей зкспланта, генотипа и условий среды в проявлении этой способности.
Еае в самых первых экспериментах было обнаружено, что в.*да пк-Н1.щ Т. aestivum, Т. durum, Т. tirofeevj м эгилопе Ае. cyli'virica aav; етно различаются между собой по каллуеообразукгей к регенерздоодаой активностям. Oí обяего числа каядусоз из незрелых зародышей у Т, aestivui» юрфогепньага оказались 70Z, у Т. durum - 30, 7. lírcfwvi ~
60, Ae>. cylindrlca - 50%. Стеблевой морфогенез удалось индуцировать у 65% каллусов мягкой пшеницы. 20Z каллусов твердой пгоницы, 40% камусов Т. tlirafeevi и XX каллусов Ае. cylindrica По степени снижния регенерационной способности каллусннх ткачей исследованные виды можно было расположить в следуший ряд: Т. aestivum (ABD) - Т. timofeevi (AG) - Ае. cylindrlca CCD) - Т. durum (AB). (В скобках указаны геномные формулы). Эти и другие шившиеся на то время факты (а речь идет об исследовачиях 10-летней давности) определенно указывал:* на то, что способность к культуре in vit.ro имеет выраженную видоспецифичность и, по всей вероятности, генетически обусловлена Дополнительные свидетельства о влиянии генотипа на процессы роста и развитая в культуре in vitro были получены нам:«, и в другом исследовании, где объектами являлись И лилий и 13 гибридов кукурузы.
Все это побудило нзс провести генетический анализ признаков каллусогенега и регенерации. У различных сортов мягкой и твердой пшениц и их гибридов были определены частота образования каллусов, интенсивность их роста, частота индукции морфогенкых каллусов и регенерации растений. Результаты одного из таких опытов представлен;; в таблице 1.
Анализ проведенных исследований позволил вывести следующее:
- индукция образования каллуса на эксплантах определяется не особенностями генотипа, а условиями культивирования;
- генетическую обусловленность имеет признак Скорость роста каллуса": гибриды по этому признаку превосходили в большинстве случаев сорте (явление, подобное гетерозису) или соответствовали «у^гу^му кз родителей;
- каллусообраэование и регенерация растений не является сопряженными процессами; вероятней всего, они контролируются различными генетическими механизмами; ' "
- определяющее вкачение в проявлении регенерационной активности гибридов имеет материнские сорта, что молет указывать на ваетую роль генов цитоплазмы в морфогенезе in vitro.
В таблице 2 суммированы данные наследования признаков морфеге-пеза in vitro пшеницы (по степени доминирования, hp). Регенерацион-:-;ая способность у 64,3% гибридов Т. aestivu.-n наследовалась по типу сэерхдомишрования (hp>l), около 30% показали промежуточное наследование (-i<hp<l). У твердой псенкцы признак регенерации, в основном, наследовался по типу промежуточного доминирования (42,5%) ч сьерхдоминкрования (28.62).
Таблица 1.
Кадлусогенез и регене: ция растений у сортов пшеницы и их гибрвдоэ
1 ! Частота каг- Средний Кол-во | Кол-во
NN 1 Наименование | луеообразо- размер мэрфоге.ч-1 каллусов,
п/п ! сортов и 1 зания на первич- ных кал- | р^гекери-
1 гибридов | экслданга". ного лусов, | розавсих
1 I I 1 1 1 7. каллуса, мм 7. ! ! 1 растения, %
1 1 £ 1 1 1 3 4 Г- | 1 6
Сорта гвердой озимой пшеницы Т. дигип
1. 0109775 93 5,2 «5 33
2. 0109776 95 5,1 48 *
3. -578155 '96 5,2 61 42
4, 491711 97 5,8 64 44
5. 476805 95 6,1 52 ¿9
6. 485617 99 6,6 66 52
425621 95 Я о 50 43 .
8. "'5006 97 5,3 51 *
9. ч/5ЭЗС 98 6,1 68 *
10. ' 4750?5 (56 6,3 39 *
11. Вахт 94 5.1 50 32 ,
■< о 4РСЗЗЗ 93 6,0 63 51-'
15. Л3305 91 5,5 40 ос
Гхбряхы Т гердой озимой пиемия Т. (¡игипп
14. 0105775 х Бахт 97 5,5 57 30
15. 0109775 х 430333 97 6,4 ■ 70 52
16. 0109776 х Бчхт 95 5,9 57 *
17. 0105776 х 480339 93 5,6 71
18. 478156 х Вахт 55 7,1 47 33 .
19. 478156 х 460339 39 5,1 69 49
20. 491711 х Бахт 100 7,1 51 33
21. 491711 х 480339 94 • 6,9 59 Б0
22. 476805 х Вахт 96 7,3 49 42
23. 476805 х 430333 91 6,6 72 53
24. 485317 у. Вх/Т 69 6,9 59 ^
¿5. 485517 х 420339 95 7,3 63 47
86. 4£5о21 х Бает 99 5.5 ДО - 51
27. 485521 X 450339 94 7,0 70 55
г 1 г 1 | 1 3 1 4 1 5- | 1 1 6
Сорта шгкой озимой лIXниш Т. аезЦуит
26. Алма-Атинская полу-
карлжовая 69 4.7 80 60
29. Алма-Атинская высо-
корослая 95 • 4.9 71 50
30. Ккная 12 97 5,1 7° 52
31. Дкетысу 98 5,0 76 *
32. Алыаяы 56 4,7 71 49
33. Беэостаэ 1 93 5,1 69 51
34. Бе реке «5 5,2 69 *
35. Прогресс 100 5.6 89 70
35. Карлыгаи 100 5.3 85 61
Гибриды такой озимой пае ниш Т. 1 уит
37. Алма-Атинская лолукар-
ликозея х Карлыгаш 100 5,3 87 63
35. Алма-Атинская полукар-
ликовая х Прогресс 98 6.1 90 70
39. Южная 12 х Карлыгаш 98 5.3 85 57
40. Шкая 12 х Прогресс 100 5,5 91 73
41. Алма-Атинская высоко-
рослая х Карлыгаи 100 5,7 76 59
42. Алма-Атлкская высоко-
рослая х Прогресс 100 6,2 77 71
43. Дкетысу х Карлыгаш 96 5,2 во л
■44. Яметыеу х Прогресс 100' 5,6 88 72
45. Береке х Карлыгаш 58 5,3 84 58
45. Береке х Прогресс 100 6.2 75 •л
47. Безостая 1 у. Кзрлыгаш 100 5,3 87 62
48. Безостая 1 х Прогресс 93 5,7 31 74
49. Алмаьы х Карлыгаш 97 5,4 77 62
50. Алмалы х Прогресс 100 6.1 90 72
ж - анализ яе провожался
Таблица 2.
Тип доминирования по,- .загелей регенерационной способности пшеницы
Доминирование | 7. морфогенних | | каллусов | 7. каллусов, ровавших регенери-растения
( — | мягкая ! твердая | мягкая твердая
-1 < hp < 1 50,0 14,3 28,6 42,9
hp - 1 7,1 - 7.1 -
hp- -1 - - - 14,3
hp > 1 42,9 57,1 64,3 28,6
hp <-1 - 28.6 - 14,2
Таблица 3.
Генетический контроль признака регенерации in vitro пшеницы
Тип взаимодействия
Генотип ------------------------------------------------------------Донор
внутрилокускый межлокусный
Озимая.мягкая
Озимая твердая
Яровая твердая
сверхдоминирование
неполное доминирование
неполное доминирование
комплементарный эпистаз
комплементарный эпистаз
сильный комплементарный эпистаз
Толкш, Богарная 66, Береке, Йетыеу. Л-3305, К-476805. К-0109776. Харьковская 46, Накат,
Актюбинска* 76.
Совместно с КаэККИ земледелия была проведена большая серия экспериментов с применением диаллельных скрешдваний (по трем наборам 24 сортов твердой и шгкой пшениц), а ¡соторой были коучгна ком национная способность и системы генетического контролл и "'(ыгькл генерацки (табл.3). Показана, что в генетическом контрола ¡¡«•гчнори-ционной способности пшеницы лежит комплементарный эпистаз, кг.тс,¡>ь>!, Как известно, определяется действием рецессивных генов. 0г.р«?л
комбинационная ценность сортов пшеницы по изучаемому признаку для использования в селекцюнно-биотехнологическ::х работах. Зги исследования - еще одно свидетельство генетической природы мсрфогенети-ческих реакций в культуре in vitro.
Завериая обзор результатов генетического ачализа процессов морфогенеза in vitro, хотелось бы особо подчеркнуть, что генотип реализуется э конкретных условиях внешней среды и, подбирая условия культивирования, мохно выявить его потенциальные способности. Генетическая детерминированность ни в коей мере не означает запрета на регенерацию растений у тех или иных генотипов; для серьезного исследователя это означает необходимость поиска для данной культуры условий, индуцирующих экспрессию генов и механизмов морфогенеза.
Регулируются роль среды в реализации тотипотентности культивируемой клетки легла в основу разрабатываемого нами "градиентного" подхода к проблеме дифференцировкн in vitro. Началом для развития этого подхода послужили следуювде два выявленных нами {акта
Первый - регенерация растений к? считающихся очень слабыми в морфэгекетическом отношении листовых тгакей шзенипм. Дело ь том, что применяемые в суйгс-твуиадих способах регенерации растений воздействия на ткань, обусловленные резкими изменениями фитогоршналь-ного баланса и других факторов, являются довольно жесткими и, как правило, приводят к некрозу и снижению регенерационной способности тканей листа. Оказалось, что если ступенчато изменять условия воздействия (в данном случае - повышать, или снижать-концечтрацию гормонов, интенсивность света), то модно избежать некроза каллуеных тканей пенвд; и, более того, индуцировать в них морфогенез, таким способом нам в числе первых в мире удалось получить регенераты из листовых каллусов пагенкцы (авторское свидетельство СССР N1701744).
Второй факт. Б обцепринятых способах для поддержания и роста культуры клеток проводят пересадки на среды одного и того же состава, и только при регенерации резко меняют ©итогормоиальнкй баланс и другие условия культуры. При длительном культивировании, как правило, регенерационная активность клеток снижается вплоть до полной ее потери. Сказалось, что если при каждом субкультиаировачии менять концовтрацив фитогор.моков, то при такой циклической схеме культивк-рг.вак:« удается значительно дольше сохранить морфогенетическую ак-ти«юо?ь каллусов кукурузы и, белее того, повысить прирост биомассы кк-тс-к ( чв-.'орское свидетельство СССР 1701197). Периодически ctmxn концентраций ауксинов в среде, мы, по сути, постоянно провоцируем в
культуре процессы диФФеренцировки клеток, а повывая содержание гормонов - вновь индуцируем их дедифференциащш; тем самым культура клеток предотвращается от "привыкания". Результаты такого опыта представлены з таблице 4.
Таблица 4.
Влияние циклических схем культивирования на морфоге-неткческкй потенциал кадл/соз кукурузы (линия ЗсЬ)
| 7. каллусов с побегами
Схема культивирования I------------------"-------------------
| 3-е субкультив. 10-е субкультив.
1. Контроль - обычная
схема 64,4 114,5 80,3 + 8,9
2. Опыт - циклическая
схема 66,7 +12,9 49,9 ¿10,1
х- Обычная спет: оубкультивироватв каллусов на среды а постоянной концентраций горюнов (пиклорзм + цикамба * 2.4-Д - О, Я мг/л). Циклическая схема: изменение суммарной концентрации тех хе горюнов в среде при каждом пассировании с 0,9 /р 0,3 иг/л и наоборот.
/
Таким образом, применяя определенные воздействия, удается более тонко регулировать морфогенетические процессы в культивируемых клетках и тканях. По существу, эти приемы основаны на создания ол~" ределенного градиента факторов между средой и культивируемой тканью, а также внутри самой ткани. Другими словами, для инду»сции морфогенеза in vitro необходимо вызвать неоднородность в неорганизованно растущих клеточных популяциях и тканях. Согласно этому "градиентному" подходу любые воздействия, приводящее к увеличянш неоднородкостей в культуре клеток, а том числе пространственного распределений гормонов, будут способствовать дифференциации клеток и формированию участков морфогенеза в каллусе. А факторы, способствуюшяе равномерному распределению клаток в среда и уменьшению концентрационных и прочих градиентов (как, например, непссомость), оказывают противоположное действие. Как показано нами, . ¡.¿лови-лх космического полета частота образования морфогент« каллусов и регенерации растений снижается. Ма отдаем себе отчет, что прр^льгч?-мая гипотеза не может охватить всей сложности и якогсгрангк.тзи
проблема морфогенеза in vitro. Ь!ы пытались очертить лишь один из возможных подходов, являющийся в своей основе физиологическим, показать на этом примере валкую роль внешней среды в процессах диффе-реяцировки клеток.
*
Большинство исследований культивируемых клеток зерновых злаков и технологических приемов на их основе до настоящего времени было ориентировано на использование каллусов и твердых питательных сред. Превде всего, это связано со сравнительной легкостью к доступностью получения и выращивания каллусной ткани. Однако на современном этапе развития биология культивируемых клеток и биотехнология зерновых злаков нуждаются в более эффективных моделях и экспериментальных системах, которые позволили бы осуществить селекцию на клеточном ур-овне. генетические модификацию и реконструирование растений.
СОЗМНЯЕ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ, ОЮГАЕВНЖт СПОСОБНЫМИ К ЭМБРИОГЕНЕЗУ К1ЕТКАШ Одной № перспективных клеточных систем являхя'ся суспензионные клеточные культуры, которые уже хорошо зарекомендовали себя в биотехнологиях для многих растений. Разработка технологий суспензионного вырадашаяил клеток сельскохозяйственных растений, превде всего, преследует цель получения быстрорастущих эмбркогенных клеточных культур с высокой регенерационной активностью. Однако для зернозкх злаков глубинное культивирование клеток, сохранят;« эмбриогенный потенциал, оказалось сложной задачей, таковой она остается и до сих пер: успешных работ по получению морфогеияых клеточных суспензий яшгкицы и кукурузы на сегодняшний день не так ух и много. Следует подчеркнуть, что выделение интенсивно растущей, высокоактивной в регенерационном отношении суспензионной клеточной линии воспринимается кас несомненный успех, лоскальку с ее получением открывается юзможость различных манипуляций с данным генотипом. Прежде всего, решается проблема клонирования - получения колоний и далее целого растения из индивидуальных клеток и протопластов, а вместе с ней и создания эффективных технологий клеточной селекция, генетической трансформации и соматической гибридизации.
¡¿ы начали проводить исследования суспензионной культуры меток лаекицы с 1986 года. Эта работа включала несколько этапов, отралзш-¡Ц.5Х каши попытки получения клеточной культура, отвечающей всем требованиям "1зтинной" суспензии. Здесь ограничимся лисш обзором ее
заключительных стадий, в которых нам это удалось осуществить. В основу разработанного на1^;: подхода легли два методических приема (принципа). Первый - отбор вводимой в жидкую среду каллусной культуры. Только клетки, способные к перестройке метаболизма и размножению с высоким коэффициентом в данных конкретных условиях суспензионного культив! рования, . образуют "хорошие" линии. Для формирования регенерирую«;:"-/! растения суспензии клетки должны быть морфогене-тически активны. Например, для пол/чения клеточной суспензии пзеии-цы сорта "Казахстанская 4" (Т. аеэЬ^ит I.) отбирали ярко-желтый глобулярные каллусы с гладкой матовой поверхность» и рыхлой структурой. Для непосредственного переноса в жидкую среду мз таких каллусов вычленяли морфогенные участки из клеток меристемсадного типа. Тем самым уже на начальном этапе глубинного культивирования создается значительное количественное преимущество для клеток, из которых должна формироваться суспензионная культура. Второй принцип -подбор условий суспензионного культивирования, предпочтительных для деления выбранного типа клеток. Частое субкультивирование суспензии на такой среде приводит в конечном счете к обогаденкю суспензии активно делящимися морфологически однородными клетками.
Формирование- суспензионной культуры пшеницы нами условно подразделено на три стадии. Первая стадия связана с началом культивирования каллуса в жидкой среде. Она может длиться 2-5 недель, на это время приходится адаптация поверхностно выращенных тканей к ус-■ ловиям глубинного культивирования. Рост внесенных каллусных агрегатов происходит, главным образом, эа счет Деления клеток приповерхностных слоев. Именно поэтому в целях ускорения получения суспензионной культуры целесообразно вводить в жидкую среду н& целые каллусы, а только вычлененные из них участки из клеток меристе-моидного типа. На этой стадии в зависимости от интенсивности роста каллусов среда обновлялась через 15-20 суток.
Вторая стадия становления суспензионной клеточной культуры является наиболее продолжительной (З-б месяцев). 3 этот период формируется гетерогенная суспензия клеток. Ее лишь условно можно назвать суспензионной культурой, так как в ней одновременно представлены клетки самых различных в морфологическом (возможно, и генетическом) отновении типов; рост культуры происходит За счет размнок-п;..: клеток каллусов и их отделения в среду, деления агрегированные, одиночных клеток (в том числе меристемоидных) и т.п. По мере субкультивирования клеточная популяция обогащается меристемоидм-лда метка-
ми. Камусы и крупные агрегаты удалялись при просеивании суспензии через сито. На этой стадии мы начинали проводить селекции клеток мсристеиоидного типа. Casará простой способ заключается в отстаивании суспензии в высоких пробирках и отборе среднего слоя, преимущественно состоящего из мериетемоидных клеток, для дальнейшего культивирования. Период субкульг/вирования клеток на второй стадии сокращали до 7-10 суток.
Третья стадия - окончательное формировали? истинной суспензионной культуры. Такая культура имеет ярко-желтый цвет, высокодиспер-гирована, морфологически выравнен, состоит из клеток круглой и овальной форм с маловакуолизировелной цитоплазмой и четко выраженными ядром, и датоплазматическиш тяжами. Типичная картина таких суспензионных культур клеток пшеницы представлена на рисунке 1, А.
Если получена активкорастущая з.убриогекная суспензия, то регенерацию можно осуществлять на сравнительно проста средах. В частности, клетки суспензионной культуры сорта "Казахстанская 4" регенерировали растения на среде ЫС с 1 мг/л ИУК и 1 мг/л зеатина. •Частота регенерации в условиях нашит опытов составила 5-1 ОХ.
Таким оорезом, нам удалось найти подход к получению эмбркогек-яой клеточной суспензии пшеницы. Этот подход оказался приемлемым для широкого ряда генотипов лгсенвды, и он в принципе применим и к другим зерновьв; злакам (в частности, для кукурузы). Указанная воз-могшость следует из того, что разработанный нами прием (как, впрочем, и стратегия всей настоящей работы) основан, превде всего, на общ;« свойствах культивируемых клеток злаковых растений, изучении их игакедеятельности.
Еще лет 8-30 назад считалось очень трудным или почти невозможным регенерировать растения из протопластов пшеницы, осуществлять генетическую трансформации протопластов э&рновых злаков и получать траксгенные растения. Сейчас это реальность, и реш&кщу» роль для ее доетижяия в нашей работе сыгреи: метод получения змбркогеккых, активно продиферирулщих клеточных суспензий. Именно из плеток суспензионных культур кш удалось получить делящкся протопласты и регенерировать растения.
¡¡ЗОЛИРОВАНННЕ ПРОТОПЛАСТЫ: ЛсЖНИЕ И РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЯ
На рисунке 1 представлен весь цикл регенерации растений из изолированных протопластов пшеницы. Протопласты в условиях наших опытов делились с высокой эффективностью - до 50% от общего числа
Рис. 1. Регенерация растении из суспензионных клеток н изолированных из ниу протопластов пмениии Trjt>aJm аодгСд' , л А - клетки суспензии; В - протопласты; О - начзлъш& эталы дс.~:'лнл протопластов; 0 - лелетае; Е - агрегаты т делящихся клеток; Г, и -¡¡орынрзвание ыякрокоюний и протокаллусов; И - [егеиеряомя ръстепчи
культивируемых клеток. Они формировали микрокодонии. протокаллусы и далее регенерировали побеги. В оптимальных условиях среды до 25% протокаллусов на среда регенерации могли давать начало растениям.
Успешному решению проблемы предшествовали свы:::- пяти лет упорной работы. Предпринимались безуспешные попытки индуцировать деление протопластов из клеток листа и других органов растения. Много времени было уделено каллусным протопластам. И хотя опыты с последними также дали негативный результат, но в них были сделаны ваадые наблюдения. Ео-лервых, по сравнению с протопластами из натявных растений каллусные значительно дольне сохраняли жизнеспособность. Во-вторых, протопласты из активно растудах каллусов во многих случаях синтезировали клеточные стенки и начинали проявлять начальные признаки митоза, логично было полагать, что в случае гсиеницы ва*ен источник протопластов и целесообразно выделять их из клеток, уме адаптированных к условиям m v)tro и обладающих очень высокой мито-тической активностью. А таким требованиям соответствуют клетки суспензионных культур. Поэтому в дальнейшем мы сосредоточили основное внимание на получении клеточных суспензий и изучении изолированных из них протопластов. Для того, чтобы получить такую суспензионную культуру клеток, выделить протопласты, индуцировать их деление и регенерировать растения важно было подобрать соответствующие условия среды. Такой подход, который опирается не на поиск определенных "активно регенерирующих" уникальных генотипов, а на клеточную селекцию тотипотентных клеток, имеет принципиальное значение, поскольку позволяет реиать "протоллзстную" проблему для любого генотипа пшеницы, и не только пшеницы. Этот подход приме...■■м и для кукурузы. Полный цикл регенерации растений из протопластов суспензионной культуры клеток кукурузы представлен на рисунке Z.
Завершая обзор этих исследований, " хотелось бы подчеркнуть, что "протопластная" проблема - зерновых злаков, особенно в части регенерации растений, все еще остается одной из сложнейших и до конца не решенных задач клеточной биологии к биотехнологии растений. До сих пор не- удается разработать более или менее универсальные приемы получения делящихся протопластов и регенерации из них растений. Серьезные работы, в которых достигнута эффективная регенерация растений из протопластов пшеницы, появились лиса в последние 4-5 лет (Harris et al. 1S88; Hayashi, Shinerroto. 1S33; Vasil et a). , 1990; Vang et al. ,1990) и их все еце немного, что свидетельствует о сложности проблемы. Ео всех работах, где удалось добиться регенерации расте-
Ряс. г. Регет? раиия ристехт) из суспензионных клеток и гэо-ллр?Рвнннх из них протопластов кукурузы туи £.. А - ртгепный кылус; В - суспензионная культура клеток из эмб-рюгениого кшяуся-, С - прс<топлпоты да сустнзтиних клгток: О -нзчпяь^ие этапы л?л*ння л/'огои.пстон: Е,Р - фрнщпвешие Ь'$тр9Кож>~ ннй и прошсммусор; 0.1), I - эг.гм ¡^генерации расг<?шЛ-лрого/ш.Ч'>л
- 16 - -• ьий из изолированных протопластов пшеницы и кукурузы, источником их выделения бшш эмбриогеяные клеточные суспензии. • Это указывает на важную роль в регенерации растений из протопластов фнетора детерминированности клеток к морфогенезу, т. е. их генетического статуса (генотипа). Однако роль генотипа клеток - -источника протопластов, нельзя рассматривать в отрыве от условий внешней среды. Позволил« себе еще раз подчеркнуть, что, как для получения (селекции) змбрио-геиной клеточной суспензии, так и для регенерации растений из клеток и протопластов, определяющее значение имеет подбор условий.
zíi'j^^wspj?^^0пвп7и&7;ьт}!.щрувт fjistof. лиеямцу и_ку.чу?узь/
При изучении, самых различных сторон метаболизма растений, внутриклеточных процессов и механизмов их регуляции, мэми* сочки взаимодействий и в генетических исследованиях культура in vi его мо;кет служить адекватной модель» и удобней экспериментальной системой. Преимущества этой модели и системы заключа-ттск, прежде всего, в относительной простоте, возможности контролирования условий вырзадга-нил и быстром получении необходимой массы клеток и растений.
Ф-ггоеинтеэ, фтодытиж ипррлукги£ность_ растений Одной из важнейших проблем современности является Фотосинтез. Интерес к фотосинтезу определяется, в первую очередь, рекаля.ей его ролью в энергетическом и пластическом обменах растения, а также участием в формировании хозяйственно-ценных -призн-чков. Поэтому исследования фотосинтеза и его генетических изменений являхт'-ч составной часть» программ улучшения сельскохозяйственных куль'.^р.
Фотосинтез является весьма чувствительным индикатором реакции растений на действия различных факторов и условий. Как известно, стадия неорганизованного роста культуры in vitro сопряжена с довольно лесткими воздействиями на клетки и значительными их генетике с изменениями. В этой связи было интересно, с одной стороны, изучить реактивность растения на условия in vitro по одному из ьаж~ ье>шх показателей ее жк не деятельности, а с другой стороны - оценить вогнюяиость генетического изменения фотоскясетЕческого аппарата содомя культуры ¡«¡еток. Изучение растений-регенеравуов ввашюн лр.!.' • i.! •Hi'iVüpcfcaJSJ, что в куль туре in vitro индуцируется иэменч;:-?i ".'г- t:o par-личным показателям фотосинтетичесяой де-ятельности, х л- го: viоххмодскш активность хгороплостов (Ш), цлкдич.-ское (и нециклическое (ЩМО «стофосфорялировзние, активность рису-
лозодифосфат-карбоксилазы-оксигеназы (РЛ'"'Н0), интенсивности фотосинтеза и фотодыханкя/ У -5 в последующих поколениях растений многие изменения элиминируются, часть из них шлет сохраняться и стабильно наследоваться.
Особо интересны линии регекерантсв ппеницы, у которых изменения фотосинтеза и отдельных реакций были сопряжены с изменениями продуктивности и его йлементов. Они представляют собой уникальную экс-периментальну» систему для выяснения связи фотосинтетической деятельности с продуктивностью и урояаем растений, а также генетической обусловленности этой связи. Из-за'ограниченности объема автореферата остановимся лишь на одном моменте этой работы.
Таблица 5.
Кзрбоксилазная и оксигеназная активности РДЖО, соотношение величин истинного фотосинтеза и выделения углекислоты на свету у сомаклонов и исходного сорта "Заря" Т. аезиушп
Карбоксилаз- Оксигеказкая
Обраэцы ная активность активность РДФК/РЛ40 Ф- ИСТ. /ЙЫД. С02
Рд'КО (РДЖ), РД1К0 (РДФО)
нМ ■> /млн. нМ Ог /мин.
мг белка мг белка
йорма Mlб 625+32 102+8,2 6,13 9. 68
Форма N28 630 + 41 72 £ 4,3 8,7о 10.71
Исходный сорт 424 2 22 G5 + 3, S 6,52 9. 23
В таблице G представлены данные определения карбоксилазной и оксигеназной активностей РДКСО у сомаклональных линий N16, Н£0 и исходного сорта "Заря" Т. aestivum. Зги линии были выделены в результате 5-летних селекционно-генетических исследований синие D00 реге:.ерантов пшеницы. Карбокеилаза и. оксигеназа рибулозол:фссф№» осуществляют ключевые реакции фотосинтеза и фотодыхания и -:г :,~.>?ля-ют относительные скорости этих процессов. Выделенные фор?.« растений превосходили исходный сорт как по карбоксилаэкой, так и оксугеиаэ-ной активностям РД-ЖО, а. также по интенсивности фотосинтеза и фото-
дыхания. Однако гораздо белыглй интерес вызывает факт изменения у линии N28 соотношения двух' актаькосте-й FДФ.ЧО а пользу увеличения доли карбоксилазной активности. &«ча>.»>;«> лам и?вес?.*<о, до сих пор изменить сооткои-ение двух активностей клы?*сго фермента никакими методами не удавалось. Это очень вяхно-* сбс7сят«\»с?:0, ибо свидетельствует о зозуоллости ууввьа?«;« доли солряхенжа с фотосинтезом окислительных процессов, и око ;:wv«t прямое отнесение к проблеме понижения фотодмхания растен.:.'!. в процессе которого расходуется до Б0~ продуктов фотосинтеза. Такям образом, £ культиг.круо!«их метках могут Сыть вызваны изменения такого Фундаментального процесса, как фотосинтез, и этот факт имеет праициг.к&ы>йоз значение для генетического реконструирования фотосинтеза на основе клеточных технологий и его дальнейшего познания.
и биох'м;{ческа? механизмы :,юрфо?лч:ега Другой областью применения культивируемых клеток является проблема морфогенеза, особенно, его молекулярные механизмы. К несомненным достоинствам культуру клеток ь такого рода исследованиях откосится возможность индукции молЧзгенетическлх реакций и контроля за ¡¡им». Необходимо ответить, что изучение различных внут-рикдотечнвх процессов, солр.а;екныл с ре дифференциацией клеток, представляет ке только фундач^нталмый. но и практический интерес с точки зрения поиска маркеров дифференциревки, выделения белков и генов морфогенеза, т.е. разработки способов управления регенорацдай в культуре in vitro. А последнее ягдя??ея одной т вах\ы:< ч по;та нереае-шых проблем биолог.,;; и биотехнологии.
Генетическая обусловленность процессов шрфогекоза, о которой говорилось гкег, на молекулярном и биохимическом уровнях должна вы-родглт-'ьгя в изменениях синтеза кндармайу.оннах ?НК, белков, активности ферментов и др., т. е. комплексе скоординированных во времени и остранотве реакций, обусловленных дифференциальной активностью геяоз. действительно, проведенные иачи исследования свидетельствует? о суйзеягенныу иэмеи&яиях на уровне индивидуальных белков и РЖ, еопря>:;-нны>: с процессами роста и развиткя в культуре in vitro.
Переход з;;родьак>й пвеницы в iiajuycHoe состояние и кгоричи&я д^-К-ропонацил солрсвсадаигсй заметными изменениями £ составе ци-TO''.\*,..iv:.vin4eci-:;fx белков. Усиливается синтез яизкмше-кулярккх поли-пгаило». появляется ¿опий белок 87 кД. При яи^ренгшацип клеток к^луси резко усиал-ается синтез подлпеитидоБ 22 и 27 кД.
Кукуруза В ыорфогеннкх каллусах резко усиливается синтез полипептидов 70, 50, 35, 27 к и появляется совершенно новый белок 43 кД. Примечательно, что и в случае- кукурузы характерным для морфогенеза in vitro является полипептид 27 кД.
Еще большие различия в составах цитоплазматических белков пшеницы между исходными зксплантами, неморфогешшм и морфогенным каллусами обнаруживаются при двумерном электрофорезе (рис.3). двумерной злектрофореграмме препаратов белков, как и на одномерной, выявляются полипептиды, различающиеся по молекулярным массам и зарядовым характеристикам в зависимости от источника их выделения.'
Существенным этапом посттрансляционной модификации белков в эу~ кариотических клетках, одним из моеньнс факторов регуляции активности белков является их ФосСорили[ювание. Редифференциация клеток, по-видимому, связана и с этим процессом. Так, если в исходных экс-ллантах (зародышах) фосфорилируется полипептид 70 кД, то в культивируемых клетках его фосфорялированив резко сни.чсается и появляется Фос<;орилироганные полипеш-идн 85 , 50 , 37 кД. Появление нолипептида 85 кД в культуре меток и его активное фосфорилирование могут свидетельствовать об отношении этих явлений к внутриклеточным процесса;.; m vitro у ;ешщк. .Для кукурузы, по-видимому, ваяяое значение в процессах п-'-рехода каллусных клеток в дифференцированное состояние имеет фх-ф.'|рилирование белка 70 кД.
При изучении спектра ниакошлекулярннх цитоплазматических PhK в экстрактах из культивируемы* клеток пшеницы выявлен ряд дискретных РНК размером от 120 до £50 нуклеотидоь, часть из которых отсутствует ь экстрактах из эародывей пшеницы. Следует отметить, что спектр этих махнх РНК хорошо воспроизводим.
Таким образом, морфогенез в культуре ;n vitro затрагивает синтез белков и регуляцию 1,х активности. Конечно, образование пептидов а белков в индуикроешпгой ткани еде не является критерием их участии з морфогенезе и запуске морфогенетичесгах реакций, Однако появление некоторич из них юг.ст быть напрямую связано с морфогенезом. В кулынвптуетх клетках кукурузы иаы удалось обнаружить и выделить п>ч;тид (условно обозначенный как фактор "3"), синтез которого, го-Р-рг-ых, резко усиливается при переходе каллуса в эмЗркогеня>э состо-m», во-вторых, при экзогенном внесении в кул> уру ¡л vit.ro он стимулирует морфогенез и регенерацию растений (табл. О).
» go -
г л
94674330- + . -— — - . H/^'W" •.. ¡41 *attrf -irST. " ~ 1 ^t^biïgrL
20- ж"4 »
14-
946730- 3 • -о* * » 4 ^_______ -¡с**®»«*' ' - - tÄsT *
2Q- * «•
14- <» «Ж*? е- 'T * * "«A. -
Рис. 3. Лвуаерный злзкгрзфорзз даголлазмагитескюг бежав из ю-югаоаса вгродыа&Я ( 1), прорзаташа зарок-щеп (В), к$-уорфогетюго (3) я морфогениого (4) гялпусои пюенпш
Таблица 6.
Влияние фактора "3" образование морфогекного каллуса и регенерацию растений кукурузы сорта Шиндельмайзер МС
Содержание I фактора в | среде, мкМ/л | I 1 X морфогенных каллусов | 1 1 1 | 7. каллусов с побегами 1 1
0,0 50.0 25,0
7,5 50,0 -
35.0 85,0 36,0
30,0 - 45.0
37,5 76,0 -
45,0 - 42.0
знак "-" означает, что опыт не проъодшся
Культивируемые^ клетки_8^иэучении космоса ■ Условия космического полета представляет своеобразную новую среду обитания, составляющими которой являются невесомость, совместное влияние невесомости и ионизирующих излучений, отсутствие привычной суточной ритиики, повышенный радиационный фон, а такие вибрация и ускорение. Действие основных факторов, космического поле--та на биологические системы во время полетов непрерывно и практически неизменно, земные органиэш не сталкивались с ними в онтогенезе и филогенезе, их воздействие не вызывает немедленной гибели или острой патологии. Благодаря этим особенностям изучение жизнедеятельности клеток и организмов в условиях космоса Предсиавлярт интерес для науки и практики.
Анализ космических экспериментов, проведенных, е основном, советскими и американскими исследователями, показ?;аае?, Что ясности в вопросе влияния космических факторов и, прежде всего, невесомости, на газнедеятельность растений нет. 3 экспериментах с высзкми растениями в космосе очень часто встречаются несовпадающие и даже противоречивые результаты. Оказывается, что. до Сих пор нет способов выращивания в космосе интактнкх растений, й опыты прс с'лтся на устройствах, не соответствуктах потребностям растений.
Кэ полученных к нзстояшрьу времени данных космических исследований биологических систем мы смогли более или менее определенно
вывести следуюиэе: а) невесомость не влияет на жизнедеятельность одноклеточных организмов; б) элементарные биологические процессы у живых организмов, включая высшие растения и животных, гравитационно независимы; в) влияние невесомости на живые организмы начинает проявляться на уровне многоклеточных организмов; г) невесомость влияет на все процессы у растений, зависящие от силы тяжести: геотропическую ориентацию, нутации, эпинасти»; изменяется в невесомости конечная форма растений, хотя их принципиальное строение остается стабильным; д) космические излучения оказывают мутагенный эффект.
Из продемонстрированных в предыдущих разделах настоящей работы всзмо.шостей культуры клеток растений кгк экспериментальной системы, с одной стороны, и проблем космических исследований с другой, логично определяется следующая область применения культивируемых клеток - космическая биология. Преимущества культуры in vitro высших растений как объекта космических опытов заключаются, лреэде всего, в том, что она может предоставить исследователю в "чистом виде" все стадии развития биологических систем: свободно культивируемне соматические и подовые клетки, многоклеточные агрегаты, дпф-ф^ренцировка клеток, эмбриогенез, формирование органов целых растений. Sue одни« достоинством является сравнительная простота культивирования объектов, регуляции и контроля за процессами их роста и развития в условиях косжчэского полета.
Каши работы по космической биологии культивируемых клеток nse-ницы и кукурузы (эксперимент "Максат") были начаты в полете первого казахстанского космонавта Т. 0. Аубакирова на орбитальной станции "Мир" в составе совегско- австрийской экспедиции ("Союз ..-.!-13 -Млр", октябрь. ISSlr). В дальнейшем исследования были продолжены в российско-германской ("Сакв ТЫ—14 - Мир", март, 19S2r.российско-французской ("Союз ТМ-15 - Мир", "ипнь, 1992г.) экспедициях на орбитальную станцию "Мир", В яастоягее время работы этого направления ведутся в рамках Государственной программы "Казахстан-Космос".
Прежде всего, проведенные эксперименты показали, что в условиях космического полета могут протекать все основные процессы лизнедея-тельностк культивируемых клеток пкеаицы и кукурузы: образований члоточяых стенок у изолированных протопластов и угл деление, рост суопекзконной культуры клеток, дифференциация клеток каллусов, ре-■ reiiepvtu.« растений.
1-Хе ь полета Т. О. Аубакирова было показано, что 9-и суточное ПГ^йлан. 5 культур клетск в космосе,. в целом, негативно влияет на
их рост и развитие. При 57osi ежившие в космосе клетки в наземных условиях оказывались б*. • устойчивыми к действию неблагоприятных факторов, в частности, к токсину септориоза. Последующие эксперименты, в которых время экспонирования бкоматериала в космосе было приблизительно одинаковый подтвердили эти наблюдения и позволили вывести-, что 9-32 суточное воздействие факторов космоса
- сии:тает рост каллусных И суспен?! тнннх клеточных культур;
- ингибирует дифференциацию клеток, морфогенетические и регенераци-онные процессы в культуре in vitro;
- оказывает селективное действие на клеточную популяцию в сторону ' позыаения ее общей (неспецифической) устойчивости к неблагоприятным (акторам за счет обогащения более жизнеспособными клетками.
В следующей серии экспериментов длительность пребывания объектов в полете была увеличена до 30 суток. Постполетные анализы биоматериала показали, что в этом случае клеточные культуры не только не снизили своего роста, а в ряде вариантов и превысили наземный контроль. Частота образования морфогениых каллусов и регенерации растений, как и в случае краткосрочных полетов,' уменьшалась.
Сравнительной анализ проведенных космических экспериментов, различных по г.. дол/стельности, и выявленных при этом отличий в реактивности культивируемых клеток на условия космоса позволил нам вывести еле дух.:.,Резкая смена внеиних условий, часть из которых носит экстремальный характер (перегрузки, перепад температур, ради-.-ация), а часть относится к совершенно новым условиям обитания (невесомость), приводит к остановке деления и гибели клеток с небольшими пределами нормы толерантности. Этот период адаптации, судя по полученным результатам, находится в пределах 10-и суток и в возвращенном биоматериале мы находим все признаки угнетения жизнедеятельности культивируемых клеток; тормокение роста культур, гибель клеток, некрозы в каллусных тканях и т.п. Если ж культуры клеток дальше продолжают существовать в космосе, то в лопуляцик повышается доля клеток с широкими пределами норма толерантности (амплитудой реактивности) и они получают преимущественное развитие ь изменившихся условиях. Более того, такие клеткй могут есе интенсивней размножаться в космосе, поскольку в условиях невесомости псрсстаст действовать ограничения, обусловленные градиентами kok'J' .,-чций продуктов мине деятельности и питательных веществ, ьезнмка ¡ссимл при седиментации. Йз-ва равномерного распределения клеток в популяция/ невесомость является более благоприятной для роста культуры, Б eas-
те этого становится понятным разноречивость и даже противоположность литературных данных, касашихоя влияния космоса на ростовые процессы лкзых организмов: если продолжительность пребывания биологического объекта в космосе совпадает с периодом его адаптации к изменившимся условиям, то мы наблюдаем негативный эф^кт; при длительных полетах, когда биологическая система уте успела стабилизироваться , мы видим нормальный рост объектов или даже его стимуляцию. Поэтому при проведении космических экспериментов надо четко определять их длительность и делать соответствуйте конкретным условиям опытов выводы.
fr-рейдем теперь к обсуждению влияния космоса на процессы развития в культуре клеток. В литературе пока е® нет определенности в Boiifoce о влиянии усдорий космического полета, прежде всего, невесомости, ка эмбриогенез и постнатальное развитие растений. Если даже принять точку зрения, что невесомость не влияет на элементарные биологические процессы v жизнедеятельность единичной клетки, то на уровне многоклеточных образований и, те-м более, морфогенных э;.<б-рионзльных структур роль силы тяжести додала появляться. К:- всех проведенных космических «¡ы?ах ш наблюдали снижение морфокнети-ческой и рягенерашюнной активностей культивируемых клеток. Торможение процессов дифферендаровед клеток в культуре in vitro происходило как в краткосрочных, так и длительных космических полетах, что исключает его возможную обусловленность адаптационными явлениями.
В отнесении влияния невесомости ка эмбриогенез в его классическом понимании - развитие оплодотворенной яйцеклетки, есть д?.е точки зрения. Поскольку в крупных зародышевых клетках нормальное развитие в значительной степени определяется процесса;« гразитадиохкой конвекции, они должны быть чувствительны к гравитационным изменениям. ' Согласно другой точке зрения развитие"растений является автономным процессом, а все эмбриональные передвижения клеток и групп клеток представляют собой автотропизма Что же касается соматического эмбриогенеза и органогенеза, а именно таким путем происходит регенерация m vitro у зерновых злаков, то наш исследования однозначно по-козшамт ингибируюшяй эффект юостчэокого полета на эти процессы. Механизм этого явления еее предстоит изучить. Б условиях невесо.'.:ос-7:--, части (клетки) неорганизованно растущей системы, кзкоьой является гоюгекннй каллус, по законам термодинамики стремятся занять не-эивлсимыс (равномерные) друг от друга положения. То ж? самое происходит и с концентрационными градиентами веществ, например, фитогор-
- EG -
моноз, участвующих в процессах дкф^ренцировки клеток. Логично полагать, что для возниино!»- '■'■л порядка з системе и уменьнення ее энтропии, в конкретном случае - перехода каллусов в морфогенкое (эмб-риоге.чное) состояние, в условиях невесомости требуется затратить больпе энергии. Может быть з этом одна из причин негативного влияния космоса на дифференциацию клеток и морфогенез?
Проведенные исследования продемонстрировали,большие потенциальные возможности космоса в решении а-щейшх фундаментальных проблем биологии культивируемых клеток. В свою очередь культивируемые клетки являются чрезвычайно удобными модельными об1>екташ для исследования биологических систем в космосе, на очереди стоит серьезный вопрос об их использовании для мониторинга среды обитания з космосе, особенно в длительных межпланетных полетах.
ехдшн.уюгтзскщ аспекты иу.зьтимрушх клеток пшешщы и кукурузы
Б последние годы исследования культивируемых клеток получили новый мощный импульс благодаря тому, что на их основе стало возможным развитие современной биотехнологии растений' и, прежде всего, ее важнейших направлений - клеточной и генетической инженерии.
JSnarexmjpгни нп однове_генеттеской гетерогенности культуры клеток
Ооьздшиольная ¿зариабелькоста. Уже на уровне регенерации растений методы культуры клеток вышли из рамок лабораторных разработок г> практическую селекцию. Одной из таких биотехнологий является использование сомаклональкой вариабельности, в основе которой лежат генетические изменения культивируемых клеток и регенерированных иэ них растений. Причины и механизмы сомаклональной вариабельности широко обсуждаются и до сих лор привлекают пристальное внимание исследователей. Но ясно одно, что эти изменения могут затрагивать самые различные стороны та не деятельности клетки и растения, э том числе и хозяйственно ценные признаки. И именно с данным обстоятельством связано практическое использование этого явления.
Совместно с КаэНЖГ земледелия за период 1985-1982 гг. было поручено и передано для селекционно-генетических исследований а различных экологических зонах Казахстана свыше 4000 растений-рэгс-нс-рантои пшеницы и кукурузы. Вообще надо отметить, что Казахстан с его разнообразными природно-климатическими условиями представляет собой уникальный "полигон" для испытания различие« биотехнологий для селекции, в том числе и на основе сомщшзнальной изменчивости
(табл. 7}. В процессе селекционной работы с этими сомаклонами выде- ■
лено около 200 линий, которые рекомендованы и уле используются:
- в качестве родительских форм как источники отдельных хозяйственно-ценных признаков;
- для непосредственного включения в практический селекционный процесс и доработки до новых сортов различных агрозкотилов;
- для создания изогенных линий по лимитируидим хозяйственно-ценным признакам.
Таблица 7.
Количество созданных сомаклэнальных линий ($орм) на основе селекции растений-рере^ерэдтсш пшеницы Т. aasUvum С 19S6-iS91rr.}
Сомаклональные- линии
Экологические пункты —г-----------------------------
озимзя пшеница | яровая пшеница
КазНЙИЗ . 21 40
Караой 13 12
Краснозодопадская ГСС 39
Актюбанская ГОСХОС - 16
Карагандинская ГОСХОС - 11
Семипалатинская ГОСХОС - 9 Восточно-Казахстанская СХОС .11
Кустакайский НККСХ - • 17
Талды-Курганский ОП 8 4
Сомаклональная вариабельность на сегодняшний день представляет больиой интерес для исследования механизмов генетической изменчивости клеток и растений, генетической обусловленности отдельных процессов, их регуляции и т. п., поскольку сомаклоны является вариациями одного и того же генотипа (отдельно взятого растения) и з этом отношении могут быть сравнимы с моногеннкми линиями. Сейчас ухе ясно, что, хотя сомагаюкальная вариабельность и позволяет су-ЕТ-ственно повысить генетическую изменчивость растений и, тем самым, возможность отбора, она кэ представляет собой кардинального ререккй проблем практической селекции я, тем более, направленного конструирования растений. Кэ переоценивая, но и не уу&дйя возможностей со-мимонааыгого варьирования, следует относиться к нему как к одному из метод''8 в арсенала селекционера.
Клеточная селв/сция на устойчивость к септоряозу. Дальнейшим усовершенствование« еыаеопне&чкой технологии является веточная селекция, при которой отбор генетически измененных клеток происходит в присутствии селективного фавора с послэдуюцей регенерацией на них растений. Этот подход может бьггь использован для повышения устойчивости растений к болезням. Для получения устойчивых клеток и растений в качестве селективного агента успешно используется пато-токеины, культурс-льные фильтраты и непосредственно патогены.
После того, как удалось получить суспензионные клеточные культуры пжницы и, по существу, реиить проблему «.тонирования, нами сстместно с Казахским научно-исследовательским институтом сельского хозяйства были начаты работы по клеточной селекции на устойчивость к септориоау. Септориоз является одним из широко распространенных, инфекционных заболеваний пшеницы и других зерновых культур, вызываемым грибами рода Septoria. В 50 странах мира септориальные грибы вызывай? апиФитотии, приводящие к потере около 20% урожая пшеницы.
В насей работе но клеточной селекции были использованы два наиболее активных фстотоксина гриба Septoria nodorum - <1?-2 и ФТ-5, являюются низкомолекулярными веществами класса фенольных соединений. СТ-5 принадлежит к группе иэокумаринов. Солее конкретной ин~-фо^маили о токсине СТ-2 пока нет. В биологических тестах эти ве-щгс-ла вызывает задержу роста проростков. Селекцию на устойчивость к токсинам проводили в суспензионных клеточных культурах различных генотипов, пшеница Triticum aestivum
Прежде всего было показано, что действующе на культивируемые клетки концентрации токсина на порядок ниже, чем в случае целых растений. Например, токсин 4Т-5 при концентрациях около 5 кг/л практически водность» ингибировал рост культуры пшеницы генотипа 11 S3 и вызывал гибель клеток.
Так?® была исследована чувствительность суспензионных клеточных культур различных генотипов пшелицы к патотоксину. Оказалось, что различные генетические линии проявляют неодинаковую устойчивость К одним и тем ж? дозам токсина Так, летальная для генотипа "1132" концентрация токсина 5 мг/л на 80% икгибирозала рост суспензионной культуры клеток пшеницы сорта "Казахстанская-*!" и лишь на треть - у генотипа "14007". При этом у последнего оставались аязнеепособтат 45,б? клеток суспензии. Следует отметить, что устойчивость к токе, ну в условиях in vitro прямо коррелировала с резистентностью генотипа на уровне целых растений. Это значит, что полученные в реауль-
тате клеточной селекции устойчивые клетки с высокой вероятностью могут сохранить этот признак в регенерированных из них растениях.
Таким образом, культивируемые клетки пшеницы отвечают двум принципиальным требованиям к проведению селекции на устойчивость. Бо-первых, клетки in vitro чувствительны к низким концентрациям токсина, т. е. в них сохранены механизмы реактивности организма на воздействие фактора. Во-вторых, различные генотипы проявляют неодинаковую' чувствительность к токсину, т.е. ■ в условиях in vitro сохранена генетическая обусловленность устойчивости.
Таблица 8.
Влияние различных концентраций токсина септориоза ФТ-2 на рост исходной суспензионной культуры клеток Т. aestivun (генотип KSV) и выделенной из нее устойчивой к патотоксину линии'
Рост культуры, X от контроля
гллцентрация 1
токсина в I-------------------------------------------------
среде, мг/л (исходная культура K3V |устойчивая культура KS7-R
_____i_:_I__._
0,0 (контроль) Б40 10,0 16,0
100,0
35,0 i11,3 0,0 0,0
100,0
90,5 ¿18,9 82,9117,2 50.2+10,1
¡Шальные плотности ксюкной культуры - 22,4 ш/ш, устойчивой культуры - 19, £; приросты биомассы в контрольных вариантах опытов аа период субкулътнвирпваьшя (7 суток) составили. соответственно, 26,4 мг и 15,6 иг на í ш суспензии. Ка основе специально подобранной схемы были начаты эксперименты по клеточной селекции и в течение года удалось выделить первую ус-тойч^вум к токсину септоршза клеточную линию пиенииы.
В таблице в представлена сравнительная характеристика устойчивой к токсину септориоза линии (обозначенной нами КЗУ-И), выделенной из суспензионной культуры КЗУ в результате ступенчатой клеточной селекции. Как видно из нее, концентрация токсина 5 мг/л, подав-.лчтсая рост исходной суспензии на 70Х, практически не оказывает л-й-.-твид на устойчивую лини». Летальная для клеток исходной еуспен-лора токсина 10 мг/л приводит лишь к незначительному снижению ¡•.-»-■та устойчивой культуры. Лишь при очень высоких концентрациях
токсина, равных 15 мг/л и выше, рост клеточкой суспензия скитается ' наполовину. Доказательством генетической природы изменений у полученных клеточных линий является наследуемость признака устойчивости в последугацих клеточных поколениях в присутствии токсина, а тага® сохранение признака в отсутствии селективного давления.
Проведенные исследования свидетельствуют о реальности повклзния устойчивости растений к инфекционным заболеваниям на основе щеточной селекции с использованием патотоксинов. Среди болезней, связанных с продукцией фитотоксинов патогенами, наряду с септориозом есть и другие не менее опасные (фитофтороз, фузариоз, гельмиятоснороз и др.), что делает проблему особенно актуальной. Кроме того, получение генетически маркированных линий клеток и растений важно и для проведения работ по клеточной инженерии (соматическая гибридизация,, манипуляции с органеллами и т.п.). Устойчивые клеточные линии, в которых происходит активная экспрессия генов, контролирующих резистентность, могут оказаться ценным источником выделения этих генов. И работы а этом направлении нами начаты.
Клеточная селекция, несмотря на кажущуюся простоту, является сложной методической и теоретической проблемой. Для проведения тю-телыгой селекиии и получения генетически стабильных клеточных линий. требуется длительное время (иногда до года и более). К этому кудао прибавить еще и время получения исходной суспензионной кле-течной культуры. По мере пребывания клеток в состоянии in vitro снижается их тотяпогентность, а без регенерации растений теряется ■ сам смысл работы. Поэтому эффгктивлые методы клеточной селекции н биотехнологии на их основе дол>ш совмещать эти противоположности.
Одж из ьозмокяых подходов к ускорению клеточной селекции и раопиреиию спектра генетических изменений культивируема« клеток мо-кт быть связан с космическими факторами. Как уж отмечалось визе, клетки пшеницы после их пребывания в космосе повышали свою устойчивость к токсину септориоэа. Дальнейшим продолжением этих исследований стала серия специальных экспериментов, в которых культуры' клеток пзг-ницы з течение месяца подвергались действию токсина ■септориоза непосредственно в космосе. Как видно из таблицы S, кон-центрагия токсина, которая на Земде в 4'раза подавляла рост культуры, практически не оказывала действия з условиях ¡сосмоса Пороговые действующие концентрация токсина на >лзнзсиособность клеток в космосе значительно повышается. Чтобы добиться такой же устойчивости клеточной культуры на Земле требуется до года времени.
Таблица 91
Роет культуры клеток пиеницы (Т. аезиуит, линия КЗУ) в присутствии токсина септоршэа на Земле и в 30-суточном космическом полете
Концентрация токсина в среде, мг/л Прирост биомассы, % от исходного веса
на Земле в космосе
0,0 441,0 + 39,4 319,4 ; 46,7
5,0 105,8 + 20,4 285,5 + 39,9
10,0 60,2 + 19,3 210,9 + 33,2
15,0 61,7 + 14,7 165,7 +24,8
Полученные нами данные о большей устойчивости к патстокс>:чу культур клеток, побывавших в космосе, а также значительном ускорении процесса выделения устойчивой линии при непосредственном контакте клет-ок с токсином в космосе находятся в соответствии с наией концепцией реактивности культуры клеток на необычные условия космоса. В первом случае произошло обогащение клеточных культур более кизнеспособными клетками с шрокими адаптивными свойствами, и эта устойчивость носит общий характер. При длительном космическом полете культур в присутствии еще одного селективного фактора - токсина, преимущество в популяциях получают клетки с об^ай (к экстремальным факторам космоса) и специфической (к данному веществу) резистентностью. Если учесть при этом наложение сомаклональной вариабельности, мутагенность постоянно действующей на клетки космической радиации и то, что невесомость, в целом, благоприятна для роста одноклеточных и мелкоагрегированных культур, то ускорение клеточной селекции ь космосе не является чем-то неожиданным.
Космическая клеточная селекция, о реальности которой свидетельствует результаты проведенных исследований, - это практическая сторона использования уникальных факторов космоса для биотехнологии. Регенерированные в космосе растения, которые несут л себе генетические изменения, обусловленные сомаклональной вариабельностью и «>!ШЧ!Иной зктирностьр космических излучений, могут оказаться цен-ким материалом для создания хозяйственно ценных форм растений. Все •>т."> ?ает нам основание определить новое направление космических
Мы рассмотрели некоторые области применения культивируемых клеток в решении Фундаментальных и прикладных проблем биологии и биотехнологии. Общность этих подходов заключается в том, что они основаны на внутренних потенциальных свойствах культуры in vitro как экспериментальной системы, выявлении и, главнее, реализации этих возможностей. Здесь не происходит внесения в клетки экзогенной'генетической информации, и все события являются результатом вариации одного и того конкретного генотипа.
А теперь мы переходим к области использования культуры in vitro, которая связана с генетическим реконструированием клетки и растения, - генетической инженерии, имеющей революционизирующее значение для познания и преобразования живой природы. Только с развитием генетической инженерии появилась возможность преодоления эволюционных барьеров и перемещения генов между организмами, которые до этого никогда не вступали в генетический контакт. В этем заключается самое главное преимущество этого метода и методологии.
Генетическое реконструирование зерновых злаков на основе культивируемых клеток и протопластов. Генетическая трансфрмшщя кукурузы .
Разработка биотехнологии генетического реконструирования зерновых злаков была связана с решением трех задач: 1) получение делящихся протопластов пшеницу и кукурузы, регенерация из них растений; 2! перенос чужеродной ДНК в клетки (протопласты); 3) интеграция, введенной в клетку ДНК в геном хозяина и ее экспрессия. Если первые две проблемы были более или менее разработаны в нашей лаборатории ' (нам удалось даже создать усовершенствованный прибор для злектрос-лляния и злектропорацик клеток - авторское свидетельство СССР N1701197), то попытки генетической трансформации этих элзкоз долгое время были безуспескьми. Анализируя эти неудачные эксперименты, ми выявили, что общим для них является то, что чужероднье бактериальные гены переносились в клетки со своими регуляторнымя сигналами (участками), которые могли ке узнаваться PJ5K-полим^разой растечи4 и другими ферментными системами. Кроме того, значительные структурные различия между растительной к переносимой ДНК могли снижать вероятность встройки или обмена гомологичными последовательностям!" мегяу этими SHS, Поэтому было решено основное змимаян» уделить кокс?;. • -рованим "химерных" генов и изучению их экспрессия з клетках i: растения/. Эти эксперименты дали положительный результат. Здесь мы
представим наш работы по генетической трансформации кукурузы генными конструкциями, содержащими химерный промотор с удвоенным 35S эихансерным элементом вируса мозаики цветной капусты и фрагментом промотора гена альфа- амилазы пшеницы.
Для стабильной генетической трансформации кукурузы были использованы, в основном, плазмиды рМЗР1 и pNA2G (рис.4). содержащие двойной энхансерный элемент ЗБЗ-лромотора вируса мозаики цветной капусты ¿CaMV}, укороченный-промотор ген альфа-амилазы пшеницы, ген бета-глюкуронидаэы (GUS), 35Б-промотор CaMV, терминирующую пос-ледовательн гь 355-промотора CaMV. В качестве селективных маркеров вектбры содержали ген несмицин-фосфотрансфераэы (NPTÜ) и ген фос-финотрнцин-ацетилтрансфераэы (PAT).
рКМ794
рИ2
pMQPl
H
Hill M
Щ-
GUS
-С
в
2.1 kb
H
H
GUS
—с
pi 42
1 5 I PAflêb-
У-
pNA2G —С
p142
"|б! NPTH ' i
Hybridization probes
_GUS_ 1.9 kb
piPiO П^.эг Ria
-L
E
E
3
P
Рис. 4. Схематические карги векторных конструкций, исполь- ■ аованных для стабиль ной трансформации кукурузы. 1 - эшапоерная последовательность Сот -248 до -46) 352 СаМ/; «> - домен А (от -90 so +В) из 355 лроютора Caff/ (Ве-пГеу, 1989);
3 - терминирующая последовательность гена.нопалин-синтетазы, ЯбОпн;
4 - укороченный (oí* -ЗВ9 до дадэяа АТ6) промотор гена альфа-амияааы
джницы (р ZOT. i4t HUttl у, Baulcoube, 1989) ;
5 - S5S промотор CaMV;
¡1 - гермтирухшзя последовательность 355 CaJif/.
СеЯзы рестрикции: И-Hind III-, B-Bam HI; E-Eco RJ; S-Sacl; P-Pst I.
Несколько слов об испольгованных генах. GUS-ген кодирует фер-w?üt бета-глйкуронидазу, катализирующую расщепление широкого ряда глса?рснидсв. Для детекции фермента в клетках и тканях используют
две реакции: i). Расщепление ферментом субстрата 4-nethyl un'fc^llíferyl-D-glucuronide (MU) с образованием флуоресцирующего продукта По интенсивности флуоресценции судят об активности Фермента. 2). Расцепление 5-Ьгою-4-оЫого-3-1лс1о1у1- glucuronic^ (Х-сию) с образованием индоксильного производного, при окислительной димериэации которого образуется нерастворимый синий краситель. Эта реакция очень удобна для гистохимической локализации фермента. Нами было показано, что из прижизненно окрашенных клеток и колоний можно регенерировать растения, и это позволило отбирать GUS-па.-..-тквные трансформакты уse на уровне агрегатов и микроколоний,
Гек иеомицкн-фос(|отрансф?раэы II (лео, NPT1I). Кодируемый геном фермент ¡«активирует антибиотики неомицинового семейства, такие', как канамлцин (К.-л) и гекетицин (G418!, фосфорилируя их молекулы.
Ген Соофинотрицин-ацетилтрансферазы (bar, PAT). йодирует синтез' <1осфинотрицин-ацдтидгрлнс0еразн (РАГ), кнактизирующей гербицид L-({ссфшотрицин (L-PPT) путем его ацетилированкл. Ген РА'Г был любез- ' но предоставлен компанией Hoechst А. £3. (Frankfurt. Germany).
Трансформацию'протопластов, ныделенных иэ клеток эмбриогенной суспензионной культуры (линия НЕ/89). плаэмидными ДНК проводили пу-. тем их обработки полиэтилекгликол^м (ПЭГ). Об эффективности paspa-, бетонного метода трансформации можно судить по следующим цифровом д-.лним. Из 1 млн обработанных протопластов удается получить минимум 10-20 устойчивых к канамицину или фосфинотрицину и ШЗ-позктивных протокаллусов. При обработке 11 млн протопластов было получено 140 трансгенншх растений. 11 млн протопластоз можно выделить из 4 г клеток суспензии. 80-00% канамицин- или фосфиготрицинустойчявых трансформактоз проявляли одновременно и гджуронидазную активность.
Основные стадии получения трансгенных растений кукурузы и результаты их анализа представлена на рис. 5. Идентификацию и отбор трайС'|ормантов проводили по т. устойчивости к каяамицину иди фосфи-нотридаку и приязненному окрашиванию клеток на наличие GUS-активности. Налич/'? чужеродных генов в геномной ДИК трансгашых растенйй определяли как ЩР-анализами (подимеразная цепная реакция), так и блотт-гибрвдиэацией по Саугерну. Как видно из рис. 5, в геномной Д5Й канвмкцин- или фосфинотри1;и.чустойчивьк'растений присутствуют специфические последовательности GUS. Трансгеняда растения были нор-• мальнкми и, за некоторыми исключениями, не имели морфологическ . дефектов или отклонений в развитии. Еосле перекрестного опыления они давали полноценные зародыши. . ■
1 23 А 66 123456789
Pia. 5. Различные стадии получения трансгешрй кукурузы и их анализ Я Отбор предполагаемых трансформантов в присутствии 100 ыг/л калг-шщина: 1 - шкрз/юлонии из обработанная плазыидной ßBI-i протопластов; 2 - контроль, необработанные протопласту, 3 нел-елп куль-мтирования нз селективной среде. R Sjvjws транегеннов растения кукурузы, ярояЕляда.-е устойчивость л
х&нем'.цииу или фосфинотрицяну я активность GUS. С. ПНР- ашшфяяакюг посладоштель наста гена GUS ю гвножюб ВШ различных трянс&рч-ялтоз (юрэхкх i,3,4 и 5) и понтрохьг.их j&c-
тений, регенерированнух из необработанны;. л рог олллего» (доромз £}. Граксфр^ттм были регенериропзны из протопластов, обработанных плаз малой рА'/AT из сред? с кшаи.нучюм.
D. Результата ГДР-тплк&н&ция GUS-после догзтеяыюотн у трчнс&рми-POKtHHHX плззмихой рЮ1 (юрохм 1-5) И ЦОЯТрУЛЬИШ (дорохнъ б) растений кукуруза. Селекцию проходили из'с ¡.ем? с L-PPT.
E. Саузерн-блот продуктов ПНР ( покгэанных на pst\5,D) при их гибридизации с BJS-зондом, полуденным из илаошгды piû! 794 ргстрикта-звии Brün H! и Sac I.
F. Растение, сгенерированное из вИЗ-полиУиГ.'ельной микромом mm протоллясгои после ее приязненного окрктчяянш X-glvc.
в. Сзусерн-б.тот-пизлиз ¡астений-трм'с^орнантоп, регенерированных из бЬ'З-погохгтемъгых миксоколоний прзтопд&езов после иг прнлиэпен-. ног о с-красигания с шюч&ю Я-,р)ис: Î - Вот H!-Fco Ri-фрагмент из рУЛ^Зы; 2 - Зал HI-Eco RI-nepe/лр геномной ДНК из транс-Сор-иаьта 7<~х.», получаного ¿¿едениен в протопласты pKtff04; S -Si-AV-Его RI-переmр геномной да аз траисфоршта 7G1, полученного л осле сСрайотки протопластов векторов р!42; 4 - нерестрици-[оьанчзя геномная ДНЕ тряпсфрманта TG6; 5 - не рестрнциротннзя гъиомнзя ДИК трйнс^оршнта ТС1; S - ¿енотах ДЕК из контрольной линии кукурузы НЗ/8Э. Сопли яля гибридизации гак нч рис. 5, Е. Я. Клот-аибрид;!ваш:я по Саузсрну геномной ЛЕК из ШЗ-зкопрессируо-Ui.< пророс-тюз, ьыделиьшихся после перекрестного опыления пер-smma р,ЧА£в-трънс<;ориа.'.то2: 1-4 - ДНЕ из ШЗ-позитивных сегр;-гантов после лерепаришния Eco Й1; 5 - контрольная да кчеток лилии ¡13/0$ после рестрикции Eco RI; 6-9 - нерестриипрованна-л геномная ДНК из тех да проростков, что я на дорояжх 1-4. В ка-чесгде зондз испольаошг ген tlPTII.
Перенесенные гены наследовались, о чем свидетедьствоваяа нали-сегрегации ЭКЗ-пологатеданкч и ШЗ-отрпцательных растений л госледуети поколениях. Волео того, Сауаерк-ша.п53 показал гяк;«> наличие в них гена неомициьфосчотрансфэраэ13 КРГП (рис. S.H).
Цры^вени» трех различных методов отбора тралс^рмзнтоп значительно повышало надежность и з'чкктивьость рзарлботанней sev,f сио-т-м;!. При атом использование GUS-гена позволяло, во-nspst«, a ¡шопе,«:/ окроааьать трансгенные кикроколониа. отбпрагь их •; ре г;-" рнроьать растели.т; во-вторых, проводить :со.яичес?вен<нгй анализ различных промоторных конструкций на их способность контролировать
экспрессию гена; в-третьих, гиетохимически локализовать активность гена и, тем самым, оценить тканеспецифичность конструируемых промоторов. В нашей работе химерный промотор был составлен из тканеспе-цифического промотора однодольных, выделенного из гена альфа-амилазы пшеницы, и энхансерных элементов вир/оного 353 промотора.
Сравнительный анализ уровня экспресип Glo-гена (по удельной активности глюкуронидазы в нМ MU/мг белка/час) в различных тканях к органах'кукурузы показал, что по силе иг: имого химерного промотора суш,ествует повышающийся градиент экспрессии в направлении "каллус-корень гебель-лист". Активность промотора также зависила от возраста листьев, их распололкния и была различной в базальной, средней и верхней участках листа (меньше в базальной и больше в верхней). Более старые листья, в целом, проявляли большую активность GU3, особенно в концевой части. Такие закономерности были выявлены в трансгенных растениях, трансформированных как плазмидой pNA2G. так и рМЗР1.
Ткаяеспецифическая экспрессия репортерного гена в трансформантах кукурузы была такде исследована гистохимически путем окрашивания поперечных срезов листьев, стеблей и корней .(рис. 6). Молодь» листья окрашивались почти по всей длине среза. Интенсивное окрашивание наблюдалось в зоне обкладки сосудистых пучков листа Также значительной была активность GU3 в клетках эпидермиса и мезофилла Отмечено интенсивное окрашивание сосудистых пучков стеблей молодых растений'кукурузы (рис. 6,F). Напротив, клетки паренхимы проявляли слабую активность фермента В корнях кукурузы (рис.6,6,Н) промотор предпочтительно функционировал в корневом чехлике и сосудистых пучках. Инкубирование поперечных срезов корня с X-gluc приводило к голубому окрашиванию сосудистого цилиндра и кортекса Слой перицнкла сосудистого цилиндра также содержал клетки с активно работающим промотором. Элементы центральной метаксилемы и слоя эпидермиса, по наит данным, не обладали активностью GUS.
Контрольные растения и трансгенные регенеранты были проанализированы на чувствительность к гербициду фосфинотрицину. С этой целью они .в течение 2-х недель выдерживались на среде с 0,5 мМ L-PPT. Контрольные растения при этом обесцвечивались и погибали, а трансгенные продолжали расти и нормально развивались (рис.6,0)!
о
Шщ
. ДГ .
' 4 /,»< ■ ä ) Нч' ,, i| t
- к';.:
г.,—.« --"-V«-.
к'-
-учЛУ, V» "ч^кчта^гг п. Ч "«у JJ
t'
i- . -/Г""
и. . . - V4» f . • .
t .
is
E TF
УЛ 1
¿<f : а** щ* «л .j». ■'.
Щ -'Чу:.
vi: j ¿-<-7 .' д. ч > .
г/Л
w. • ' ■
P:'q. G. Гистохимическая локализация активности GUS з каллусах и различных органах кукурузы, несуща ген GUS с хишртм просторе ■
A. Получению ю протопластов многоклеточные колонии после яряхиз* ценного вИЗ-окрашивания с использованием, субстрата Х-glue.
B. Растущая каллуоная TKaira из GUS-noswxnawfi иинроколопии.
C. Повторный тест на GUS-активность побегов, трансформированных плнылдой р!42 к регенерированных га визуально отобранных ШЗ-синтезнрукоих мяирокаллусов: Г - трвнсфор-лзнт TGI; Z - контроль НЕ/89 поеме 1 ?-часовой инкубации с X^gluc.
D.- Ошика устойчивости регенератов к фоефинотрицину з присутствии 0,5 мМ L-PP7: i - транс формант PS-47; 2 - контрольное растение линии НЕ/69.
E. -Поперечный с;*?з молодого листа ристен кукурузы, трансформированного вектором р!гЮР1.
F. Яолореч я срез молодого стебля того ле трансформанта.
G. Поперечны}! срез корня того же тране(орманта.
И. Распределение атюности GUS в корнях растен:п кукурузы, трансформированного вектором pNADG. Таким образом, экспериментальная система генетической трансформации, основанная на слиянии генов и прямом переносе ДНК в эмбрио-гашые протопласты, моглет бить эффективной для массового получения фертильных трансгенных растений кукурузы, а также для функциональной оценки различных лромоторных конструкций в однодольных растениях. Предлагаемая система трансформации, прежде всего, основала на получении и использовании эмбриогенной клеточной суспензии, способной давать растения с полноценным потомством, и в этом смысле разработанная нами биотехнология может бьггь приемлема и для других зерновых злаков.
* npHve4awidL Когда настоящая диссертация была уда написана, нам удалось получить стабильные генетические трансформанты пшеницы на меточном уровне. Б этой работе были использованы те ие методы и подколы, что и для генетической трансформации кукурузы.
здам
В наае время, когда значительной части населения Земли не хватает продовольствия, а из-за экстенсивного типа продукционного процесса оауЕ^ется дефицит земельных ресурсов, необходимы прикшншаль но новые подходы к изучению растений и нетрадиционные технологии пова_»?нил их продуктивности. Становление ряда из них оказалось воз-¡лиъм благодаря фундаментальным знаниям и практическим разработкам в области биологии культивируемых клеток. Попытки их применения у Осрновнх знаков пока еше сталкиваются с трудностями. методического и Филологического характера Но события и достижения последних лет,
включая и результаты настоящей работы, свидетельствуют о преодолимое™ имеющихся затруднений и возможности создания эффективных генных и клеточных биотехнологий для этих важнейших сельскохозяйственных культур.
Значительное внимание в настоящей работе уделено регенерации растений в культуре клеток и протопластов пшеницы л кукурузы, а также разработке клеточных систем, позволяющих осуществлять генетические модификацию и реконструирование клеток к растений. Однако затрагиваемые при этом вопросы представляют не только частный интерес с точки зрения разработки и дальнейшего усовершенствования методов культуры in vitro для пшеницы и кукурузы (что само по себе, конечно, ва.кно), но являются вместе с тем составной частью более оирокой проблемы - создания методических и методологических основ клеточной и генной инженерии зерновых злаков, остающихся наиболее трудными объектами биотехнологии растений.
К важнейшим позитивным результатам настоящей работы можно отнести получение эмбриогенной клеточной суспензии и регенерацию растений в культуре протопластов. Именно они предопределили возможность постановки исследований по клеточной селекции и генетической трансформации и, по существу, являются материальной основой для разработки биотехнологий для зерновых злаков.
В настоящей работе практически не затрагивался' вопрос о клеточных механизмах и путях морфогенеза в культуре in vitro. Эта сложная. не менее увлекательная и привлекахисая в настоящее время пристальное внимание исследователей проблема представляет самостоятельный интерес. Несомненно, что это направление в биологии культивируемых клеток является одним из решающих для дальнейшего развития биотехнологии, для перехода от эмпирики к системе при разработке методов регенерации растений in vitro.
Дальнейший прогресс в биолог.:;; и биотехнологии зависит не только от развития методов клеточной и генной инженерии, но и более глубокого познания процессов жизнедеятельности клетки и растения. Важное место в ?тих исследованиях необходимо отвести Фотосинтезу -единственному я?" л су на напей планете, за счет которого в громадном масштабе первично образуется бога:': - энергией гещества, и в силу этого он имеет исключительное значение для обеспечения жизни на Земле. Одной из главных целей биологии и биотехнологии растений должно стать наиболее полное использование возможностей фотосинтеза на основе его познания и целенаправленного реконструирования.
Мы являемся современниками космической эры, выхода земных форм жизни за пределы Земли. Открываются новые области исследования, в которых биологические теории не в 'состоянии сделать обоснованные прогнозы. Может быть, именно культивируемые клетки высших организмов, как более пластичные, адаптируемые формы жизни и в то же время несущие информацию о самых сложных формах уникальной биологической эволюции на Земле, внесут значительный вклад в изучение и освоение космоса.'
В настоящей работе продемонстрировала принципиальная возможность при1. .ения методов современной биоинженерии для .генетического изменения и реконструирования клеток и растений зерновых злаков. Успешная генетическая трансформация кукурузы яв."пется, в конечном счете, логическим результатом 20-летней нашей работы с клетками сначала эукариотных водорослей, а затем пшеницы и кукурузы. И хотя впереди еще более сложные проблемы биотехнологии, но понятное чувство удовлетворения вызывает тот факт, что настоящая работа завершена генетическим конструированием растения, достижением одной из целей, к которой мы долго и Упорно шли многие годы. Для воплощения этих подходов в новых сортах и гибридах потребуется дальнейшая кропотливая и настойчивая работа по получению змбриогенных клеточных культур у различных перспективных генотипов, регенерации растений из их меток и протопластов, поиску и выделению хозяйственно ценных генов, переносу их в клетки и получению трансгенных растений, клеточной селекции и т. п. Когда станут реальными генетические манипуляции с любым генотипом, когда эти методы из рамок лабораторных разработок выйдут в практическую селекцию, то лишь тогда можно будет говорить о новых эффективных биотехнологиях для зерновых злаков.
Для сельского хозяйства Казахстана с его многочисленными резко котрастьыми экологическими зонами (рискованного земледелия) био-■гехнологические подходы будут играть все более важную роль в селек-циончом процессе. При создании благоприятной инфраструктуры сельского хозяйства биотехнология окажется мощным подспоръем в селекп-ги уотг'й^иьых к неблагоприятным факторам среды высокопродуктивных растений. Прогрессивные наукоемкие биотехнологии основаны, прежде всего, на »снеточной и генной иноверии. Именно они позволят конструировать новые биологические системы с заданными свойствами и дейс-ТгШелыго переАти к главной Цели познания экивой природы - унравле-
гчиэнедеятельноетъю организмов.
шшж.
1. Разработаны эффективные способы регенерации растений из каллусов листа, зрелых и незрелых зародьлгей пшеницы (Г. aosUvum,- Т. durum, Т. timofeevj), эгилопса (Ае. су] indrtca) и незрелых зародышей кукурузы. Показаны генетическая обусловленность процессов роста и развития в культуре клеток и решавшая роль условий среды в реали-эации потенции клетки (генотипа, зкспланта) к морфогенезу in vitro,
2. На осноей изучения каллусообразумцей и регенеркционной активностей различных сортов и их гибридов проведен генетический анализ этих признаков у твердой и мягкой пкенкц. Строго подтверждена генетическая обусловленность регенерационвой способности, выяснены основные типы доминирования данного признака, показаны сложность характера наследования и вогмоянзя зависимость от цитоплазматячес-ких и материною« эффектов. Каллусообраэование и регенерация, вероятно, контролируются различными генетическими механизмами.
3. Разработан способ получения эмбриогенной активна пролифери-рухщей суспензионной культуры клеток ппеницы, основанный на двух методических приемах: селекция клеток на уровне вырагдипанил исходного источника (зкспланта, каллуса) и селекция на уровне их глубинного культивирования. Клетки и клеточные агрегаты такой суспензии, после переноса их на твердые питательные среды формируют каллусы и регенерируют растения. Данный подход к получению суспензионной культуры применим к любому генотипу, поскольку он ориентировал на селекцию определенного типа.клеток в клеточной популяции и подбор условий для их преимущественного деления и развития.
4. Определены требования к получению деляд,теся протопластов псйницц, кукурузы и регенерации из них растений. Они заключаются в подборе соответствующих источников выделения протопластов (активно растущие суспензии из ¡-слеток меристемоидного типа с высоким морфо-генным потенциалом) и условий культивирования протопластов, прото-каллусоз и регенерации растений. Разработанный способ позволяет с высокой частотой (до 25Z от общего числа регенерируемых протокаллу-сов) получать раетения-протоклоны.
fi. Каллусогенеэ и регенерация, ¡-сак генетически обусловленные процессы, на молекулярном и биохимическом уровнях выражаются в изменениях синтеза белков и РНК, вызываемых дифференциальной активность» генов. Переход культивируемых клеток пшеницы и кукуруз" j дифференцированное состояние сопряжн с резким уе^енчем синтеза ряда цктоплазматических белков и появлением новых полипептидов. Не-
которые из них имеют прямое отновение к морфогенезу. Из эмбриоген-ных каллусов кукурузы удалось выделить фактор пептидной природы, который при экзогенном добавлении в культуру . клеток усиливает их регенерационную активность.
б. Клетка, у которой нет необратимых структурно-функциональных изменений или повреждений генетического аппарата, потенциально способна к морфогенезу. Определяющая роль среды в отборе генетически способных к морфогенезу in vitro клеток ! , примере получения эмб-риогенных клеточных суспензий) и прояил-.-нии.этой способности (на примерах pt операции растений из листа, позитивного эффекта циклической схемы культивирования и негативного влияния невесомости на морфогенез в культуре клеток) • позволила обосногать "градиентный" Подход к проблеме регенерации. Согласно ему индуцировать процессы дифференциации в культуре in vitro и повысить регенерационную активность возможно созданием неоднородностей (градиентов) в неорганизованно растущих клетках и тканях.
V. В культивируемых клетках может быть индуцирован широкий спектр изменений такого фундаментального процесса, как фотосинтез. Выявлены форма пшеницы с относительно низкими активностями фотодыхания и оксигенаэы РДЖО; формы, у которых повышение продуктивности в значительной мере достигается интенсивным путем. Генетические изменения культивируемых клеток и растений из них, как вариации одного и того же конкретного генотипа, - удобная модель для изучения механизма и генетической обусловленности фотосинтеза, а также его взаимосвязи с другими процессами, в том числе продукционными.
8. Генетическая гетерогенность культуры in vitro и изменчивость ее клеток могут быть использованы в биотехнологиях для селекции. Возможно применение культивируемых клеток для повышения устойчивости пв-?ниш к септориоэу. Разработанный прием селекции in vitro основан на трех определенных нами свойствах культуры клеток пшеницы -ее чувствительности к низким концентрациям патотоксина, сохранении культурой in vitro генетически детерминированного признака устойчивости к токсину септориоэа, выделении б суспензионной культуре устойчивых клеток и их клонировании.
Б результате селекционно-генетических испытаний в различных апологических зонах Казахстана растений, регенерированных' в культуре in vitro, совместно с КазНИИ земледелия выделено 207 линий пше-используемых в настояо^е время в практической селекции.
3. Культивируемые клетки - удобный модельный объект космических исследований живых организмов. В свою очередь космос - новая экспериментальная среда и перспективный инструмент для решения проблем ' биологии культивируемых клеток растений и биотехнологии. Реактивность культуры клеток на необычные условия космического полета носит стрессовый характер. Период адаптации сопройождается угнетением жизнедеятельности клеток и гибелью их значительной части. 3 популя- ' цкях возрастает доля жизнеспособных клеток с широкими пределами нормы толерантности. Выживите и адаптировавшиеся клетки в дальнейшем могут очень интенсивно размножаться, поскольку в невесомости клетки в популяции стремятся распределиться равномерно и снижаются градиенты концентраций продуктов жизнедеятельности и элементов питательной среды. Эти особенности факторов космического полета с учетом мутагенного эффекта космической радиации могут быть использованы для. эффективной клеточной селекции на устойчивость к неблагоприятным условиям, в частности, патотоксинам, и дают основание определить новое перспективное направление космических исследований - космическую биотехнологию.
10. Разработана воспроизводимая и эффективная система гекети- • ческой трансформации кукурузы, основанная на прямом введении ДЖ в эмбриогенные протопласты и регенерации фертильных трансгенных растении. Отбор трансформантов основан на устойчивости к канамицину или фосфинстрицину и прижизненном окрашивании клеток на наличие в них бета-глхкуронидаэной (GUS) активности. Система позволяет проводить функциональный анализ слияния генов; с- ее помощью удалось, в частности, определить активный химерный промотор, состоящей из удвоенной энхансерной области 35S промотора CaШ и укороченного промотора альфа-амилазы пвеницы, способный обеспечивать выралсенкую т.'санеспецифическую экспрессия гена бета-глюкуронидззы у кукурузы. Подход может быть применим и к другим зерновым злакам, лостшсу он опирается на общие методические и методологические принципы.
11. Перспективные биотехнологии для зерновых-злаков должы ориентироваться не на поиск уникальных, "регенерирущж" генотипов или универсальных условий культивирования, а на поиск общих принципов, учитывахдах неразрывное диалектическое единство генотипа и среды, • что мы и попытались показать в этой работе.
Список основт!Х_работ, опубликованных по материаламдиссертации^
1. Петров В. Е. , Лосева Н Л.. Карабаев М. К. Энергетика ассимилирующей клетки и фотосинтез. - XII Междун. Ботан. конгресс. Тезисы докл, А, Наука, 1975, с.433.
2. Петров В. Е. , Сейфуллина Е X , Сорвин С. В. , Карабаев М. К. Энергетика ассиыилирухздих клеток и Фотосинтез. - Ботан. «урн., 1975, т. 60, N1, е. 16-25.
3. 'Карабаев М. К. , Глаголева Т. А., Г -некий О. В. Влияние кислорода
на Фотосинтез. - Ботан. журн., т. 62, N6, с.802-810.
4. &. йаев М. К. , Глаголева Т. А., Заленский О. В. Об участии циклического фотофосфсрилирования в цикле Кальвина - Фиэиол. раст., 1877, т. 24, Мб, с. 677-684.
6. Глаголева Т. А. . Чулановская Ы. В. , Карабаев Я К. , Заленский 0. В. Влияние АТФ на фотосинтез и фотосинтетический метаболизм углерода. - 4изиол. раст., 1981, т.28, N3, с.478-487.
6. Карабаев М. К , Глаголева Т. А. Участие АТФ циклического фотофос-форилирования в цикле Кальвина. - Известия АН КазССР, сер. биол. , 1982, ¡¡3, с. 22-27.
7. Карабаев Ы. К., Глаголева Т. А., джардемалиев К. К. Влияние кислорода на фотосинтетический метаболизм углерода. - Известия АН КазССР, сер. биол., 1382, К5, с. 4-9.
8. Карабаев М. К., Джардемалиев Ж. К., Шарипов К А. Изучение фотосинтеза. в связи с эффектом Варбурга и активностью систем первичной ассимиляции углекислоты. - Изьестия АН КазССР, сер. биол. , 1983, N2, с. 4-9.
9. Карабаев М. К. , йзрипов К. А. , Интыкбаева Б. Б. , Ушарова Г. Е , Джардемалиев Ж. К Изучение ассимиляции С02 листьями пшеницы в связи с работой фотохимических систем и действием кислорода на фотосинтез. - Известия АН КазССР, сер. биол.. 1984, N1, с. 11-17.
Ю. Рахманова Е. Я. , Карабаев К К , Шарипов К. А., Интыкбаева В. Б., Уварова Г. П. Исследование карбоангидразной активности листьев пшеницы в связи с онтогенетическими изменениями фотосинтеза и аффекта Варбурга. - Известия АН КазССР, сер. биол., 1984, N2, с. 7-12.
И. Карабаев М.К. , Кершанская О.И. , Иалева Е К., Шйчекина Р. М. , Интыкбаева ЕЕ., Ушарова Г. П., Джардемалиев & К., Беденко а П. Изучение фотосинтеза в связи с онтогенетическими изменениями фотофосфсрилирования и фотохимической активности изолированных
' - 45 -
хлорспластов. - Известия АН КаэССР, сер. биол. , 1984, N6,- с. 3-9.
12. Карабаев М.К., Мамутов а У.. Мусалдинов Т. Б., Романова А. К. Фотосинтез и щелочеобразующая способность клеток водорослей. -Вестник АН КазССР, 1984. N.12, с. 40-45.
13. Джардемалиев Ж. К. , Карабаев М. К., Дарканбаева Г. Т., Ушарова Г. П., Интыкбаева Б. К Изучение гликолатоксиДаэы листьев пшеницы в связи с онтогенетическими изменениями С02 -газообмена и ак- ' тивностью ферментов первичной ассимиляции утлерода. - Известия АН КазССР, сер. биол. , 1984, N4, с. 19-25.
14. Паршина Г. Н. , Карабаев .4. К. , Алыбаева Р. А., Полимбетова Ф. А. Влияние низких температур на фотосинтетический аппарат озимой пвеницы. - Известия АН КазССР, сер. биол., 1985, N3, с. 12-16.
15. Алыбаева P.A.. Карабаев М. К., Волимбетова Ф. А. Влияние условий перезимовки на активность ферментов карбоксилирования и интенсивность фотосинтеза озимой пшеница. - Вестник АН КазССР, 1986, N11. с. 47-51
16. Сайб Л. Р., Карабаев М. К. Выделение, очистка к оценка жизнеспособности протопластов кукурузы. - Цитология, 1987, т.29, N9, с. 1103-1104.
17. джардемалиев Ж. К. , Карабаев М. К. Получение каллусов из эксплантатов разных органов пшеницы. - Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений. Алма-Ата, Наука, 1988, с. 2 20-125.
18. Карабаев НИ, Дгардемалиеь Ж. К Получение растений-регенеран-тов из каллусов, индуцированных из разных органов пшенииы. -Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений. Алма-Ата, Наука, 19S8, с. 125-130.
19. Сайб . JL Р. , Карабаев .4 К, Методы математического планирования эксперимента в работах по культуре тканей растений на примере
' каллусообразования ткачей кукурузы. - Методы молекулярной био-• лргии, биохимии и биотехнологии растений. ' Алма-Ата, Наука, 13S8, с. 133-137.
20. Дглрдемалиев Л К., Никифорова iL Д. , Бутенко Р. Г., Карабаев К К , Айтхо.тан И. А. Исследование роста клеточных популяций различи'.« видов пшеницы и эгилопса в суспензионной культуре. - • Вестник АН КазСО?, 1983, N8, с. 66-70.
21. Сайб Л Р., Карабаев М. К. Способ получения растений-регенератов кукурузы из культуры тканей. - Авторское свидетельство СССР N144G1G5 от 22. 08. 88.
22. Карабзев М. К. , Джардемалиев Ж. К., Бегалиев М. К. , Курбаков О. И., Айтхожин И А. Культура in vitro пягеницы. - Биология культивируемых клеток и биотехнология.'Тезисы докладов Международной конференции. Новосибирск, 1988, с. 151-152.
23. Karabaev UK.. Begaliev UK., Djardemaliev D. К. Cell and protoplast cultures of wheat. - 20th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies. Abstracts. Budapest, Hungary,
'1990, p. 328.
24. Карабаев M. К , Сидоренко 0. И. , Майчекина P. М. , Кошанова К. Ш. , Уи1 -рова Г. П. Первичные процессы фотосинтеза у сомаклональных вариантов озимой пшеницы. - Известия АН КазССР, сер. биол., 1990, N5, с. 27-30.
26. Karabaev UK., Djardemaliev J.К., Muknametkaliev U Т. Division of protoplasts isolated from cell suspension culture of Triti-cum aestivum. - Plant Tissue and Ceil Culture. Abstracts Vllth International Congress. Amsterdam, 19S0, p. 20.
26. Begaliev UK. , Karabaev M. K. Regeneration of wheat plants from leaf base callus culture. - Plant Tissue and Cell Culture. Abstracts VI Ith' International Congress. Amsterdam, 1990, p. 291.
27. Pol imbetova N. S., Darkanbaeva 6. T., Karabaev UK. The wheat embryo proteins analysis during callus formation and morphogenesis in vitro. - Plant Tissue and Cell Culture. Abstracts VIIth International Congress. Amsterdam, 1990, p. 305.
28. Salb L.R , Karabaev UK. Some factors affecting plant morphogenesis in maize in vitro culture. - Plant Tissue and Cell Culture. Abstracts Vllth International Congress. Amsterdam, 1990, p. 307.
?9. Сайб 11 P. , Карабаев М. К. , Айтхожин M. А. Влияние некоторых факторов на формирование морфогенных каллусов кукурузы и табака. -Биологические науки, И,, 1991, N4, с. 100-103.
SO. Omirulleh S., Karabaev U К., Stefanov I. , Abraham U , Feher A., Могосг S., Golovkin U , Dudits D." Improved maize transformation system based on morphogenies protoplasts. - Physiol, plantaruin, 1&91. v. 82, N1, p. A31.
•A1. КадеРаев M. К , Джардемалиев Ж. К , Еегалиев М. К. , Курбакоь 0. И., Сопабаева Б. А. , Шевченко Е.Л Культура ппеницы in vitro.' - Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. Москва, Наука, 1Р91. с. 252-250.
Оайб Л. Р. , Савин 3. Н. , Карабаев U. К., Сейфуллин Я. Л , Киусов
К Л-О. Влияние генотипа на формирование морфсгенного каллуса и регенерацию растений кукурузы з культуре in vitro. - Известия АН КезССР, сер. Сиох . 1991, N6. C.33-3G.
33. Сайб JL Р., Карабах в М. К. Способ получения каллуса кукурузы. -Авторское свидетельство СССР N1701197 от 01.09.91.
34. Бедекко В. II , Карабаев М.Я., Дкэрдемалиев Ж. К. Соотношение интенсивности фотосинтеза и активности ферментативных систем пер- ' вичной ассимиляции углекислоты пшеницу и згилопса в различных условиях вегетации. - Сельскохозяйственная биология, 1991, N1, с. Э6-1С4.
35. Карабаев Ы. К., Дчардемалиев й. К., Дарканбаева Г. ?., Бутенко Р. Г. Генетические особенности каллусообразовзния и регенерации растений в культуре клеток паеяяцы и згилопса. - Сельскохозяйственная биология, 1991, N3, с. 69-75.
36. Сайб Д. Р. , Карабаев М. К. Ситогормональная регуляция регенерации растений: качественная модель. - Известия АН КазССР, сер. би-сл. , 1991, N3, с. 15-22.
37. O.Turulleb S., АЬгалап; М , Stefanov I., Morocz 3. , Karabaev Ы. , D'jdits D. РЕВ-nediated genetic trarjsfonnation of inaizs. - 1У ■ Magyar fiovenyelettani Kongresszus. Szeged, 1991, p.41-47.
33. Карабаев \L К., Диардемалиев Я. К., Ларканбаева Г. Т., Юегебаев О. Е Биотехнологические подходы в подборе родительских пар при скрекдваяии пшеницы. - Биотехнология. Алма-Ата, 1991, с. 15-17.
39. Карабаев М. К. , В?гебаез 0. И., Дяардемалиез Я. К., Лесова Н.?., гениев Б. К. Способ получения сомаклональных вариантов ярово.'? твердой пзеяицы. - Биотехнология. Алма-Ата, 1981, с. 19-21.
40. Карабаев К К., Диардэмалиев Я. К., Беденко В. П., Лгдяйкнна F, А., Сидоренко О. Уи Биотехно логические подходы повышения фотоскято-тической продуктивности растений. - Биотехнология. Алма-Ата,
'1991, с. 21-23.
41. Карабаев М. К , Дгардемадиев Е..К. Способ регенерация растений из листовых тканей пае ниш. - Биотехнология: Алма-Ата, 1991, с. 25-26.
42. Карабаев М. К., Еегалкев М, К , Диардемалиев Ж. К Способ регеке-рации растений пиеницм в культуре тканей. - Авторское свидетельство ССС? HI 701744 ОТ 01.09.91.
43. Karabaev М К. , Dzhardemaliev Z. К., Mukharotkaliev М. Т. , But<?nke R.G. Division of protoplasts isolated from cell suspension culture of hexaploid vheat Triticum aestlvun L. - Известия Ail
- 48 -
РК. сер. биол. , 1932, N5, с. 3-11.
44. Джзрдемалкев й. К. , Карабаев К К. , Мухаметкалиев ML Т., Вутеяко ?. Г. Деление протопластов, ' выделенных из .клеток суспензионной культуры гексаллоидясй ппекицы Triticum aestivum (L). - йюиол. раот., 1SS2, T.d9, Kl, с. 135-142.
45. Карабаев К К., Забелин В. А. Способ отбора жизнеспособных клеток или протопластов растений. - Авторское свидетельство СССР
' ¡¿173885Б от 03.G2.92.
46. Карабаев bi К , Айтхоиша Н. А., ¿х^пров С. 3. Биотехнология расте-н:- i В космических экспериментах казахстанского космонавта. -Наука Казахстана - освоению космоса. Алма-Ата, 1S92, с. 51-64.
47. Аяташва З.Г., Ю В. К., Карабаев М. К., ГЬалиев К Д. Способ культивирования леталой пыльцы табака Nicotiana tabacum L. - Авторское свидетельство СССР N1745954 от 16.03.92.
43. Ведеикэ ЕЕ, Карабаев М. К. , Ледайкина Е А. , Алкбаева Р. к. функциональная активность фотосинтетического аппарата озимой пыеницы (Triticuni ae^tsvum) в связи о сомаклональной изменчивость» растений. -'Доклады АН РК, 1992, N3, с. 74-79,
49. Сайб Л. Р., Карабаев М. К., Шуеов IL1-0. Способ стимуляции регенерации растезий в культуре тканей кукурузы. - Авторское свидетельство СССР »4947818/13 от 30.01. 62.
50. Karabaev IL К., - Djaiderail lev J. К., Butenko R. 6. Cell and gene engineering of cereals in Kazaklistan: its state and prospects.
- Biology of plant cell cultures and biotechnology. Abstracts . II-International conference. Almaty, 1993, p. 95.
51. Karabaev M.K. , Bedenko V.P. , Ledyaikina N. A. , Alibayeva R. A. Specific features of photo.synthe&is and its certain inactions caused by soraclonal variations in winter wheat Triticum aestivum. - Biology of plant cell cultures and biotechnology. Abstracts !I International conference. Alisaty, 1993, p. 94.
52. Карабаев M. R , Беден ко В. .П., Додяйкина Е А., Вутенкэ Р. Г. Особенности фотосинтеза и его отдельных реакций, обусловленные cv-маклональкой изменчивость» озимой паениыу (Triticum aestivum).
- ССизиология растений, 1993, г. 40, КЗ, с. 332-396.
5а O^irulleh S., . Abraham М. , Gclovkin I. , Stefanov I. , Karabaev H, Mustaroy L., -Morocz S. , Dudits D. Activity of a chimeric proKotv-r wich .the doubled CaMV 35S -enhancer element in protoplest-d&rived cells and transgenic plants in maize. Plant Molecular Biology, 1393, v. 21, p. 415-428.
С чувством глубокой благодарности вспоминав своих безвременно уведших из жизни первых учителей профессора Петрова Владимира Ефремовича (г. Казань, Казанский Университет), профессора Заленского Олега Вячеславовича (г. Санкт-Петербург, Ботанический институт), академика Айтходаша Мурата Абеновича (г. Алматы, Институт молеку- ' лярной биологии и биохимии). Лолгих лет жьт .тела» и всегда помню Глаголеву Татьяну Андреевну (г.Санкт-Петербург, Ботанический институт) - одну из первых научных руководителей. •
Вьф&каю глубскув благодарность члену-корреспонденту РАН. академику РАСХН, профессору Бутеяко Раисе Георгиевне - одному из главных инициаторов этой работы, знакомство с газторой в начале 80-х го-доз стало поворотным моментом в направлении моей научной деятельности. Все эти годы становления биотехнологии растений в Казахстане она постоянно оказывала нам большое внимание к. поддержку, а как Главный Координатор научного направления в ССС? - существенную материальную и финансовую помог» в проведения исследований.
Б памяти сердца года учебы на кафедре биохимии Университета, г.Казани у академика Тарчеаского Игоря Анатольевича и преподавателей кафедры, аспирантские годы в прославленной лаборатории фотосинтеза Ботанического института км. В. Д. Комарова РАН.
ibn научная жгзнь в г. Алматы вое эти годы была связана с Институтом молекулярной биологии и .биохимии им. M А. Айтхожю, ь котором .вместе с «рузьпм.и я учениками .посчастливилось организовывать первую в .Казахстане лабораторию неточной инженер-«,?. Особо хочу отметить участие а данной работе моего друга и соратника кандидата биологических наук Дгардемалиеза Зрение а Кадаровича; моих учеников доктора философии Омкрулы Сесикз,'Сайба Льва Рихардовича; коллеги и сотрудницы лаборатории кандидата биологических наук По-л'^мбетовой Кайли Рейтжановны; ушедшего из ккэни 'в расцвете лет талантливого инжяера, друга и сотрудника Забелина Владимира Александровича.
у
-
Карабаев, Муратбек
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1994
-
ВАК 03.00.12
- Оптимизация технологии получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы в каллусной культуре in vitro
- Биотехнологические аспекты регенерации растений в культуре клеток и протопластов пшеницы
- Моделирование стресса обезвоживания в культуре изолированных тканей пшеницы и его биологические последствия
- Биотехнологические аспекты создания исходного материала для селекции зерновых колосовых культур
- Использование культуры тканей in vitro в селекции гороха
