Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Культивирование штамма Streptomyces lateritius 19/97 M
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации по теме "Культивирование штамма Streptomyces lateritius 19/97 M"
На правах рукописи
ГАЙДАШЕВА Ирина Игоревна
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ШТАММА БТКЕРТОМУСЕЯ 1ЛТЕК1Т1№ 19/97 М: ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ
03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехпологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1 О ;Т.Р 2011
Москва- 2011
4840282
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Громовых Татьяна Ильинична
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Алимова Фарида Кашифовна
доктор биологических наук, доцент Кураков Александр Васильевич
Ведущая организация: Института леса им. В. Н. Сукачева СО РАН
Защита состоится 22 марта в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корпЛ2, Биологический факультет, ауд. М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова
Автореферат разослан « ✓У »февраля 2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Пискункова Н.Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В настоящее время биологический метод защиты растений является наиболее важным звеном в выращивании экологически безопасной сельскохозяйственной продукции, оздоровлению лесопосадочного материала. Биометод защиты растений признан наиболее ресурсосберегающим приемом, позволяющим защищать растения от болезней, вредителей и повышать их продуктивность без затрат невосполнимых природных ресурсов и без вредных выбросов в окружающую среду. Этот метод защиты растений имеет важные отличительные свойства: полное отсутствие резистентности патогенных организмов, короткий срок ожидания отклика, способность живых организмов размножаться в природе, безопасность в применении (http://rscrt.ru/} В настоящее время уже успешно используются такие препараты как планриз, агат-25, псевдобактерин - это биофунгициды па основе бактерий рода Pseudomonas, бактофит, фитоспорин, интеграл, бисолбисан - на основе B.subtilis, триходермин - на основе микромицетов рода Trichoderma.
Все чаще в научной литературе, исследователи рекомендуют к использованию в биологическом контроле и стимулированию роста растений штаммы группы актиномицетов (Зенова 1989, Ikotun 1990, Громовых и др. 2005, Доолоткельдиева и др.,2007). Предложено достаточно большое количество штаммов актиномицетов, защищенных патентами и предлагаемых для производства биопрепаратов защиты растений, однако технология их массового производства отсутствует. Из почвы лесного питомника Красноярского края в 1997 году был выделен штамм 19/97М Streptomyces lateritius (ВКПМ Ас 1637). Данный штамм был предложен как потенциальный продуцент биопрепарата для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternaria (Громовых и др., 2005). Однако до настоящего времени не изучены условия получения биомассы и метаболитов этого продуцента. Не подобраны оптимальные питательные среды для культивирования штамма 19/97 М S.lateritius. Кроме того, не проведена апробация полученного на основе штамма препарата в полевых условиях. Все это сдерживает возможность скорейшего внедрения препаратов на основе этих микроорганизмов в качестве инструмента биоконтроля.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучение биологической активности и продуктивности штамма 19/97 М Streptomyces lateritius, разработка биотехнологии биопрепарата для биологического контроля фитопатогенов злаков и сеянцев хвойных.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- изучить биологические особенности роста и продуктивности штамма 19/97 М Streptomyces lateritius при жидкофазном и твердофазном культивировании;
- с целью повышения продуктивности оптимизировать состав питательной среды и условия для культивирования штамма;
- подобрать субстраты для твердофазного культивирования штамма на основе отходов сельского хозяйства и лесоперерабатывающей промышленности;
- изучить состав вторичных метаболитов, продуцируемых активность штамма в отношении фитопатогенов рода Fusarium;
- изучить ростстимулирующие свойства штамма 19/97 М Streptomyces lateritius в отношении хвойных и злаковых растений;
- оценить биологическую активность и жизнеспособность штамма при хранении в лабораторных условиях;
- наработать опытные партии биопрепарата и оценить его эффективность в защите растений при внесении в почву лесного питомника и агрэценоза злаков.
Научная новизна. Выявлен ростостимулирующий эффект метаболитов штамма 19/97М Streplomyces ¡ateritius в отношении хвойных и злаковых растений и установлена антагонистическая активность штамма в отношении фитопатогенных грибов хвойных и злаков из рода Fusarium. Показано, что штамм 19/97М Streplomyces laíeriíius сохраняет жизнеспособность и антибиотическую активность при длительном хранении в лабораторных условиях. Изучены физиолого-морфологические свойства, потребности в источниках углерода и азота и динамика накопления биомассы штамма 19/97М Streptomyces laíeritius при жидкофазном поверхностном культивировании на различных питательных средах; подобраны оптимальные условия для накопления биомассы. Дано биологическое обоснование применения штамма 19/97М Streptomyces ¡ateritius для получения биопрепарата.
Проведена оценка химического состава продуцируемых актиномицетом метаболитов. С использованием методов ТСХ, ВЖХ, бумажной хроматографии и электрофореза доказано, что штамм не синтезирует антибиотических соединений группы пенициллина, стрептомицина, тетрациклина и левомицитина. Показано, что активными соединениями являются окрашенные пигменты розово-красного цвета, относящиеся к группам хинонов и антрациклинов.
Впервые методом твердофазной ферментации на древесной зелени и коре пихты сибирской получен новый биопрепарат на основе продуцента 19/97 М Streptomyces 1ateritius. Установленные в результате исследований представления о возможности получения биопрепарата на основе нового штамма 19/97 М актиномицета Streptomyces laíeritius вносят существенный вклад в научные основы использования его в биологической защите злаковых и хвойных культур.
Практическая значимость работы. Подобраны состав жидкой синтетической среды и условия для получения биомассы штамма 19/97М S. laíeriíius, С целью получения биопрепарата разработаны условия для твердофазного культивирования штамма на древесной зелени пихты сибирской.
Показано, что штамм 19/97 М S.laíeritius может быть использован для защиты растений в сельском и леском хозяйстве. Наработана опытная партия биопрепарата, содержащего биомассу и культуральную жидкость штамма, и проведены опытно-производственные испытания биопрепаратов на сеянцах хвойных в лесном питомнике и культурах злаковых растений. Показано положительное влияние биопрепаратов на увеличение урожайности злаков и выход здоровых сеянцев в питомнике.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях: международных - II «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2007); VII « Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2008); всероссийских -«Рациональное природопользование» (Ярославль, 2005); «Лесной и химический комплекс. Проблемы и решения (Красноярск, 2006, 2008, 2009); IV съезде биотехнологов России (Пущино, 2006); городской научно-практической конференции «Развитие инновационной деятельности в промышленном комплексе города Красноярска», (Красноярск, 2007) семинаре проблемной лаборатории Сибирского государственного технологического университета (Красноярск, 2009), на научном
симпозиуме «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011).
Работа выполнена при финансовой поддержке грантами: Российский фонд фундаментальных исследований 06-04-08040 - офи, «Создание высокопродуктивных устойчивых к патогенам форм хвойных растений в культуре in vitro, на основе современных достижений в области половой репродукции голосеменных»; 07-0490843 (МОБ_СТ) грант па прохождение научной стажировки в Московском государственном университете прикладной биотехнологии. Грант РНП.2.2.3.1.2466 Министерства образования и науки РФ "Развитие гербарной коллекции и музея культур грибов Средней Сибири как базы для научно-образовательного процесса"; Красноярский краевой фонд науки "Индивидуальные гранты для молодых ученых" 18G178.
Объем и структура работы. Диссертация стоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает в себя 200 работ, в т.ч 70 на иностранных языках. Общий объем диссертации 174 страниц из них основного текста 156 страниц. Диссертация включает 40 рисунков, 12 таблиц, 11 приложений.
Публикации. Материалы диссертации изложены в 11 публикациях (из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК). Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителем и сотрудниками, работавшими совместно с автором в процессе выполнения исследований.
Благодарности Автор выражает благодарность за помощь при выполнении и подготовке работы своему научному руководителю, д.б.н., проф. Т.И. Громовых, д.б.н., проф. Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Г.М. Зеновой за помощь при идентификации штамма, д.б.н., проф. Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова О.В. Камзолкиной за помощь при исследовании микроморфологии штамма, д.х.н., проф. Института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН Г.С. Катруха за помощь при идентификации биологически активных соединений.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1 Обзор литературы
Глава содержит анализ и обобщение литературы по использованию актиномицетов для получения биологически активных соединений и биопрепаратов. Приводится историческая справка о применении биопрепаратов на основе актиномицетов для защиты растений. Особое внимание уделено поиску и путям отбора активных штаммов и видов как агентов биологического контроля фитопатогенных грибов и стимуляторов роста растений, приведена характеристика антибиотических и ростстимулирующих веществ актиномицетов. Показана целесообразность разработки биотехнологии с использованием различных способов культивирования.
2 Объекты и методы исследования
В ходе выполнения данной работы осуществляли лабораторные и полевые исследования. Основным объектом исследования являлся штамм 19/97М Streptomyces lateriiius (ВКПМ Ас 1637), предложенный для стимуляции роста и защиты растений
от возбудителей сосудистых микозов, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternaría.
Микроморфологические особенности штамма исследовали в живом состоянии путем выращивания культуры актиномицета в камерах Ван-Тигема. Микроморфологию штамма изучали методами световой микроскопии с использованием микроскопа марки LW Scientific (США) и сканирующей электронной микроскопии. Сканирующую электронную микроскопию проводили с помощью микроскопа «Hitachi» S-405A в лаборатории электронной микроскопии МГУ им. М.В. Ломоносова.
Изучали динамику роста актиномицета при поверхностном и глубинном культивировании (на качалке) в колбах Эрленмейера на 250 мл (100 мл среды) на модифицированных жидких синтетических средах, созданных на основе стандартной крахмало-аммиачной среды. Модификацию качественного и количественного состава среды проводили с целью подбора оптимальных субстратов - источников углерода (крахмал, пептон, глюкоза, сахароза, сорбит, маннит, глицерин, экстракт зерна, нейтрализат) и азота (пептон, дрожжевой автолизат, нитрат калия, нитрат натрия, сульфат аммония, нитрат аммония); поиск оптимальной кислотности среды -использованием фосфатных буферных систем. Оптимизацию условий культивирования проводили методом полного факторного эксперимента и метода крутого восхождения. Основные факторы для оптимизации: температура, концентрация крахмала и сульфата аммония, выходной параметр - концентрация биомассы.
Процесс твердофазного культивирования проводили на древесной зелени после спиртовой экстракции; коре лиственницы после С02-экстракции; коре пихты и некондиционном зерне пшеницы сорта Тулунская-12. Прирост продуцента на субстратах определяли по титру количества колониеобразукзщих единиц (КОЕ) методом высева на оптимизированную агаризова!шую среду.
Концентрацию биомассы актиномицета при культивировании на жидких средах определяли весовым и колориметрическим методами с использованием спектрофотометра СФ-46 (JIOMO). Измерение концентрации крахмала и сахароспиртов проводили, окрашивая крахмал рабочим раствором Люголя, используя цветную реакцию спиртов и гидрата меди соответственно. Содержание белка в биомассе продуцента проводили с использованием красителя амидо-черный 10В. Концентрацию Сахаров измеряли эбулиостатическим методом.
Исследования спектра антибиотических веществ, содержащихся в культуральной жидкости и биомассе продуцента, проводили в лаборатории по выделению и идентификации новых антибиотиков Института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН. В работе были использованы методы хроматографии (ТСХ и ВЭЖХ), электрофореза на бумаге ь различных электролитах, спектральные методы. Для обнаружения стрептомицина согласно разработанного для этой группы антибиотиков метода выделения проводили сорбцию из нативного раствора на карбоксильном катионите КБ-2(Ъ1а^) с последующей элюцией раствором соляной кислоты. Согласно схеме выделения проводили экстракцию натквных растворов культуральной жидкости (КЖ) н-бутанолом при исходном рН, кислом рН (3,8-4,5) и щелочном рН=8,6. Биомассу экстрагировали ацетоном при исходном рН, а также при кислых значениях рН. Для обнаружения в КЖ хлорамфеникола (левомицетина) проводили экстракцию этилацетатом при рН=8,65. Спиртовый концентрат из этого экстракта исследовали спектральными и электрофоретическим
методами вместе с образцом левомицетина. Проводили электрофоретическое и хроматографическое исследование спиртовых экстрактов с последующим анализом люминесцентным методом (свечение или поглощение при 260 и 340 нм в УФ-свете на ультрахемископе). Аналитическую и полупрепаративную хроматографию антибиотиков проводили методом TLC на пластинках DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 "Merck" (Germany) в системе хлороформ-бензол-метанол (30:20:7): UV-VIS-спектры выделенных антибиотиков снимали на спектрофотометре UV-1601 PC (Shimadzu, Япония). ВЭЖХ-анализ проводили на жидкостном хроматографе "Милихром-4" (Россия) на колонках из нержавеющей стали, размером 2x80 мм, заложенных сорбентом «Диасфер» А-110 С-16, 5 мкм и «Кромасил А-100» С-18, 5 мкм (ЗАО БиоХимМак СТ, Москва). Аналитический и полупрепаративный электрофорез на бумаге проводили на V-образном приборе Durruma в электролитах: (Ei) - 1 н уксусная кислота, рН=2,4, 550 V, 2 - 3 ч и (Е2) 30 %-я уксусная кислота, рН=1,7, 550 V, 2 - 3 ч.
На всех стадиях выделения антибиотиков после электрофоретического и хроматографического разделения проводили биоавтографию по методике, предложенной в литературе (Haese, Keller , 1988), методом бумажных дисков с использованием набора тест-организмов: грамположительных: В. subtilis АТСС 6633, В. mycoides 537, Micrococcus luteus NCTC 8340, Staphylococcus aureus FDA 209P, B. coagulant; грамотрицательных: Escherichia coli ATCC 25922, Comamonas terrigena ATCC 8461, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 и грибы: Aspergillus niger ИНА 00760, Candida albicans ИНА 00763, Fusarium oxysporum.
Определение химического состава метаболитов штамма проводили методом хроматомасс-спектрометрии с использованием хроматомасс-спектрометра Agelent-68-90-N на кварцевой капиллярной колонке НР-5МС с неподвижной фазой (метилсиликоновая) в диапазоне температур 70-280 °С с электронным ударом 70 эВт.
Оценку стимулирующего действия метаболитов актиномицета в культуральной жидкости проводили по показателям энергии прорастания и всхожести семян сосны обыкновенной, ели сибирской, ячменя и пшеницы с использованием метода влажных камер (ГОСТ 13056.5-76).
Полевые испытания биопрепаратов на основе актиномицета S.lateritius 19/97М проводили на посевах Picea obovata L. и Pinus sibirica в Мининском лесом питомнике, расположенном на территории Мининского опытного лесного хозяйства (56°10' с.ш., 92°42'в.д). Эффективность действия метаболитов штамма 19/97 M в агроценозе проводили, используя метод предварительного замачивания семян в культуральной жидкости пшеницы сорта Тулу некая -12, КС-15 и ячменя сортов Кедр и Красноярский 80.
Для оценки сохранения жизнеспособности штамм актиномицета 19/97М S.lateritius (в виде сухой биомассы) и препарат, полученный после твердофазного культивирования, хранили в бюксе при 20-25 °С в течение шести месяцев. Оценку жизнеспособности проводили ежемесячно по показателю КОЕ/г"1 путем посева образцов биомассы на модифицированной крахмало-аммиачной среде.
Статистическую обработку проводили с использованием программного пакета Microsoft Excel. Достоверность различий рассчитывали при доверительной вероятности Р=0,95.
3 Биологические свойства штамма 81гер1отусе$ ШегЫиъ 19/97 М
Штамм антагонистически активного актиномицета Б-ШегИш 19/97М образует ветвящийся мицелий на 4-е и 6-е сутки культивирования на жидких и плотных агаризованных средах соответственно, при этом образуются артроспоры, а на 5-е и 7-е сутки мицелий частично распадается на фрагменты (рисунок 1). Штамм образует плотные кожистые колонии, характерные для этой группы микроорганизмов. Продуцент синтезирует пигмент розово-красного цвета, но в процессе исследования может образовывать и апигментную форму. При микроскопическом анализе было показано, что пигментная и апигментная форма штамма имеет идентичную структуру мицелия. Возможность образования апигментной формы свидетельствует о том, что окрашенные вторичные метаболиты не всегда синтезируются штаммом.
а б в
Рисунок 1 - Морфология клеток (а, колоний (б) и образование пигментной и апигментной форм (в) штамма 19/97М 81гер1отусе$ ШегШия
При культивировании на плотной питательной среде (овсяный агар) в течение 7 сут при (27±2) °С штамм продуцирует 3900±200 колониеобразующих элементов с площади 100 мм2.
4 Идентификация антибиотиков в культуральной жидкости и мицелии штамма 19/97 81гери>гпусех ШегШив Тенденция применения антибиотиков в кормах, в пищевой промышленности способствует увеличению числа резистентных к антибиотикам микроорганизмов. Поэтому к проблеме использования антибиотиков следует подходить очень осторожно, учитывая возможное попадание их в пищевые продукты и отрицательное влияние на здоровье человека. Недопустимо применение антибиотиков (тетрациклина, стрептомицина, пенициллина, и др.), используемых в медицинской практике (СанПиН 2.3.2.1078-01).
Спектрофотометрические, хроматографические и электрофоретические исследования не выявили наличия в культуральной жидкости и в кислых экстрактах тетрациклина. Электрофорез и ТСХ проводили вместе с аутентичным образцом тетрациклина. УФ-спектральный анализ также не выявил характерных для тетрациклиновых антибиотиков максимумов поглощения X тах = 269 и 365 нм.
Для обнаружения в культуральной жидкости хлорамфеникола (левомицетина) проводили экстракцию этилацетатом при рН=8,65. Спиртовый концентрат из этого экстракта исследовали спектральными и электрофоретическим методами. На
основании полученных результатов сделали вывод, о том, что в культуральной жидкости штамма № 19/97-М левомицетин отсутствует. УФ-спектр спитртового концентрата также не содержит характерного для левомицетина максимума поглощения при 278 им.
Анализ электрофоретическим методом показал, что штамм № 19/97-М антибиотиков аминогликозидной группы, как и стрептомицина не образует.
Биологическая активность в основном была сосредоточена в «красных» фракциях. Даже не значительное количество окрашенного антибиотика проявляет антагонистические свойства в отношении тест-объектов. Пигментная часть накапливается в основном в мицелии продуцента, и как из нативного раствора, так и из мицелия может быть выделена экстракцией при кислых значениях pH. УФ-спектры полученных соединений убедительно свидетельствуют, что выделенные антибиотики красного цвета относятся к группам хинонов и антрациклинов. Из данных литературы (J. Bcrdy, 1980) следует, что анализируемые антибиотики близки по свойствам к антибиотикам родомицинам и цинерубинам.
5 Оценка антибиотической активности штамма 19/97М Streptomyces lateritius в отношении грибов рода Fusarium
Принципы использования антагонистически активных микроорганизмов были разработаны еще H.A. Красильниковым (1953; 1961). Исследования ряда авторов доказывают перспективность использования метаболитов актиномицетов в качестве ингибиторов роста патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания растений.
В результате проведенных исследований доказано, что штамм проявляет активность в отношении грибов рода Fusarium при культивировании на подобранной жидкой питательной среде с содержанием фосфатно-щелочного буфера и соблюдении оптимальных условий культивирования (рисунок 2).
Рисунок 2 - Зоны подавления роста грибов рода Fusarium жидкими метаболитами акти но ми пета S. lateritius 19/97М
Актиномицет антагонистически активен в отношении видов Р.пЫа1е, И.охузрогат, Р.$о1ат и в меньшей степени - в отношении вида Рлрого1гкЫо1йез, к штамму вида РлитЬистит активность экзометаболитов продуцента не проявлялась.
Активность метаболитов при глубинном и поверхностном культивировании максимальна на пятые сутки.
Таблица 1 - Зоны подавления роста фитопатогенов экстрактами, полученными после твердофазной ферментации штамма______
Водный экстракт Зоны подавления роста, мм Р. оху^рогит Зоны подавления роста, мм Р^о1ат
БАмегШш на коре пихты после С02-экстракции 12,7±1,4 11,7±0.7
З.ШегШш на коре лиственницы 10,7±1,7 9,3±1,5
¿'. 1а1егМш на древесной зелени после спиртовой экстракции 14,7±1,2 15,0±2,1
Контроль 0 0
Таким образом, кора хвойных после С02- экстракции и древесная зелень после спиртовой экстракции могут быть использованы в качестве субстрата для твердофазной ферментации, при этом сохраняется антагонистическая активность штамма 19/97М.
б Оценка жизнеспособности биомассы 31гер(отусез ШегШт при хранении
Использование микроорганизмов в биоконтроле предполагает не только получение и применение, но и сохранение их антибиотических свойств, Поэтому требуется обязательный контроль антибиотической активности и жизнеспособности биомассы штамма-антагониста.
Титр КОЕ препарата после сушки без хранения 3,65 ТО11 КОЕ/г"1 приняли за 100 %. Изучаемый штамм сохраняет свою жизнеспособность и активность в течение шести месяцев с численностью КОЕ 1,7Т0И КОЕ/г"1 , что составляет 48,04 % от исходного значения. Количество КОЕ после шести месяцев хранения удовлетворяет требованиям для биологических препаратов, содержащих бактерии [Егоров, 1989].
Штамм также хорошо сохраняет свою жизнеспособность при культивировании на отходах лесной и лесоперерабатывающей промышленное! и. Установлено, что в течение шести месяцев хранения штамм в полученном биопрепарате сохраняется с титром: на древесной зелени пихты - 1,94Т07, на коре лиственницы - 1,55Т07, на коре пихты- 1,19- Ю6КОЕт\
Независимо от способа культивирования, штамм сохраняет антагонистические и биологические свойства на необходимом уровне на протяжении всего срока хранения.
7 Динамика роста штамма 19/97М Йгер/отус« ШегШи$ при культивировании на жидких средах
На процесс роста и развития продуцентов оказывают влияние многие факторы, к ним относятся температура и рН ферментационных жидкостей, способ и продолжительность культивирования, состав питательных сред.
При глубинном культивировании адаптация штамма 19/97М Б^ерЮтусев 1а1егШт к источникам углерода и азота происходит значительно быстрее, чем при поверхностном, что подтверждается более коротким латентным периодом; лаг фаза
сокращается с 24-36 до 18-20 ч. Удельная скорость роста в период экспоненциальной фазы роста культуры при глубинном VI поверхностном культивировании составляет (0,068 ± 0,014) ч"1 и (0,057 ± 0,017) ч"1 соответственно. Количество образующейся биомассы в стационарной фазе не зависит от способа культивирования. К моменту выхода в стационарную фазу роста экономический коэффициетг максимален, на 4-е сутки при глубинном культивировании и составляет (25,77±3,74) %, а при поверхностном на 6-е сутки и составляет (22,53±1,32) %. В связи с этим культивирование штамма 19/97М З.ЫегШия целесообразно проводить в течение пяти суток в условиях глубинного культивирования и шести суток поверхностного культивирования.
В условиях поверхностного культивирования биомасса штамма формируется преимущественно в виде поверхностных колоний, на поздних стадиях роста в виде поверхностной пленки. В условиях глубинного культивирования штамм формирует сферические колонии, распределенные в толще среды.
Важной характеристикой для накопления биомассы является обеспеченность культуры источниками углерода, являющимися строительным материалом и источ1шком энергии для клетки. В результате жидкофззного поверхностного и глубинного культивирования было установлено, что штамм 19/97М 81гер1отусе$ ШегШш способен использовать различные субстраты в качестве источника углерода. Штамм успешно растет на средах, содержащих мот-, дисахариды и сахароспирты, обладает способностью утилизировать глицерин, этиловый спирт. Однако максимальное накопление биомассы (2,16±0,131) г/л было достигнуто при культивировании на среде с крахмалом, несмотря на то, что удельная скорость этого процесса была несколько ниже, чем на маните или глюкозе (таблица 2). Возможно, низкая скорость роста связана со скоростью утилизации амилозы и амилопсктина, входящих в состав крахмала.
При разработке биотехнологии препаратов защиты растений важным аспектом является подбор питательных сред с использованием растительных и животных субстратов - отходов сельского хозяйства, пищевой и лесоперерабатывающей промышленности. К тому же сведения о культивировании актиномицетов на питательных средах, содержащих зерновые экстракты и нейтрализаты, немногочисленны [Ацдрегок 1981; .НсЬегщ, 2008].
Для культивирования штамма на зерне использозали отфильтрозашшй экстракт из размолотого зерна пшеницы сорта Тулунская 12 с добавлением в среду минеральных компонентов. В качестве питательной среды из древесных растений использовали нейтрализат следующего химического состава: - гексозы (глюкоза, манноза, галактоза) - 2,4-2,6 %, пентозы (ксилоза, арабиноза) - 0,40-0,60 %, органические кислоты -0,17%, фурфурол - 0,022-0,3 %, рН - 3,9-4,1.
Исследования показали, что максимальное накопление биомассы штаммом на пшеничном экстракте, происходит на 7-е сут культивирования и соответствует (1,88±0,09) г/л. На нейтрализате прирост биомассы культуры был низкий, стационарная фаза наступила уже на 4-е сутки культивирования, при этом биомасса в культуральной жидкости составила (0,21±0,05) г/л.
На основании проведенных исследований установлено, что для накопления биомассы актиномицета следует использовать крахмалосодержащие натуральные среды.
Таблица 2 - Основные кинетические параметры процессов культивирования штамма на различных источниках углерода_ ' __
\ Удельная скорость роста, ч"1 Общая скорость роста, г/ч Экономический коэффициент, % Мпих ч-' Ks, г/л Максимальное количество биомассы, г/л
Крахмал 0,057±0,017 0,015 22,53±0,132 0,086 5,600 2,16±0,131
Сахароза 0,074±0,014 0,009 19,86±0,254 0,112 7,266 1,27±0,055
Глюкоза 0,064±0,004 0,010 20,13±0,007 0,096 6,251 1,23±0,062
Маннит 0,085±0,001 0,009 19,72±0,045 0,128 8,363 1,10±0,066
Сорбит 0,042±0,014 0,008 18,38±0,037 0,063 4,116 1,05±0,009
Глицерин 0,014±0,000 0,003 5,62±0,015 0,021 1,338 0,38±0,051
Нейтрализат 0,058±0,017 0,002 2,10±0,139 0,087 5,675 0,21 ±0,027
Зерновой экстракт 1фаза 0,043±0,004 0,011 23,48±0,231 0,065 4,226 1,88±0,09
2 фаза 0,028±0,075 0,043 2,768
Важнейшим элементом всех живых систем является азот, т. к он входит в состав аминокислот и участвует в образовании пептидных связей белка. Анализ роста культуры на средах, включающих в себя неорганические источники азота, показал, что штамм 5". ШегШиь способен усваивать как соли аммония, так и нитратов, осуществляя ассимиляционную нитратредукцию. Несмотря на то, что наилучшими источниками азота для многих актиномицетов считаются протеины, пептоны и аминокислоты (Звягинцев 1987, Зенова 1989), рост штамма на средах с пептоном и дрожжевым экстрактом обнаружен не был. Лучшим источником азотного питания для штамма был сульфат аммония. Количество биомассы на питательной среде, содержащей этот источник азота, составило (2,25±0,045) г/л, удельная скорость роста (0,052±0,002) ч"1 .
Кислотность среды является важным фактором при культивировании всех микроорганизмов. Она влияет на свойства клеточных стенок, транспорт питательных веществ, скорость роста и т.д. Для решения проблемы нейтрализации образуемых штаммом кислых продуктов метаболизма и создания постоянного рН использовали буферные системы со значениями рН=7.0: буфер Серенсена (ЫагНРО^НгРОд) и фосфатно-щелочной буфер (КНгРО^аОН). Замена карбоната кальция в составе среды на буферную систему приводит к улучшению процесса накопления биомассы продуцентом. Наибольший рост биомассы штамма был отмечен на средах с фосфагно-щелочным буфером (КгНРО^аОН).
Для подбора оптимального значения рН использовали фосфатно-щелочной буфер со значениями рН 6-8 (шаг варьирования 0,5), культивирование проводили на крахмало-аммиачной среде. Установлено, что максимальное накопление биомассы штаммом 19/97М Б.ЫегШш в период культивирования достигается при значении рН=7,2.
Согласно проведенным исследованиям в состав синтетической питательной среды для культивирования актиномицета Б.ШегШш 19/97М в качестве источника углерода целесообразно включать крахмал, а в качестве субстрата-источника азота -сульфат аммония.
При анализе кинетических характеристик роста культуры были определены условия для оптимизации процесса накопления биомассы штаммом. В качестве параметров оптимизации были выбраны: Х| - температура культивирования, °С; Хг -концентрация (ЪтОгвС^ в субстрате, г/л; Х3 - концентрация крахмала в субстрате, г/л, У - концентрация биомассы, г/л. Согласно проведенным исследованиям установлено, что оптимальной для получения максимального количества биомассы является среда с концентрацией крахмала 12,5 г/л, (ЪИ^^С^ 2,0 г/л. Температура (27±1) °С, рН - 7.2. Для поддержания оптимальной кислотности следует использовать фосфатно-щелочной буфер.
Оптимизация условий культивирования позволила увеличить выход биомассы исследуемого штамма Б^ерШтусев ШегШиз 19/97М. При поверхностном культивировании продуцента концентрация биомассы и удельная скорость роста культуры увеличились и составили (2,57±0,61) г/л и (0,069+0,02) ч'1 соответственно.
8 Твердофазное культивирование штамма $1гер!отусе$ ¡шегШю 19/97М
В Красноярском крае остается актуальным вопрос переработки отходов растительного сырья, образующихся в процессе лесозаготовок. Известны работы по использованию растительных отходов для получения биопестицидов на основе антагонистически активных штаммов грибов рода ТИскос!егма [Лунева, 2008; Рязанова 2000; Садыкова, 2003; Шкаликов 1994]. Для получения биопрепаратов на основе актиномицетов подобные исследования не проводились. Поэтому представляло интерес оценить способность штамма 19/97 М 81гер1отусез ЫегШиз к росту на твердых питательных субстратах.
Основываясь на предварительных исследованиях в качестве субстратов, использовали кору пихты после углекислотной экстракции, древесную зелень пихты после извлечения спирторастворимых веществ, кору лиственницы и некондиционное зерно сорта Тулунская-12.
В результате исследовании установлено, что самые высокие показатели накопления биомассы были отмечены на измельченном зерне -18,610" КОЕ/гПри росте на древесной зелени и коре лиственницы численность КОЕ достигает на 30-е сутки культивирования 2,19-10 и 1,59-10" КОЕ, г1 соответственно (таблица 3).
Таблица 3 - Динамика численности штамма 19/97 М З^ерЮтусеь ШегШии на растительных субстратах_
Субстрат Титр штамма 19/97 М 5. ШегШих на растительных субстратах, 10й КОЕ/ г'1, при культивировании в течение
5 сут 10 сут 15 сут 20 сут 30 сут 40 сут
Древесная зелень - 1,91 - 1,99 2,19 2,19
Кора лиственницы - 1,50 - 1,59 1,64 1,59
Кора пихты - 0,10 - 0,10 0,11 0,11
Некондиционное зерно 9,8 18,6 16,9 - - -
Примечание - прочерк означает, что численность КОЕ показывает начало фазы отмирания или не достоверность от предыдущего значения
Как показали исследования, на коре пихты продуктивность штамма была значительно ниже в сравнении с таковой на других субстратах. Это, вероятно, связано с большим содержанием в коре труднодоступных соединений, которые не утилизируются штаммом.
В массе коры лиственницы, на некондиционном зерне и древесной зелени, начиная с четвертых суток культивирования, появляется пигмент, синтезируемый продуцентом, что указывает на то, что выбранные субстраты не влияют на процессы биосинтеза вторичных метаболитов штаммом.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что для получения биопрепарата на основе штамма S.lateritins 19/97М возможно успешное использование не только синтетических сред, но и натуральных субстратов.
9 Оценка эффективности использования штамма актиномицета Streptomyces lateritius 19/97М в биологическом контроле сеянцев и злаков Установлено, что штамм 19/97М S. lateritius в процессе своей жизнедеятельности кроме антибиотиков может синтезировать и другие биологически активные вещества, обеспечивающие ростостимулирующие свойства. Известно, что эти свойства актиномицетов используют в растениеводстве для повышения урожайности и стимулирования прорастания семян [Красилышков 1958, Шкаликов 1994], в том числе, хвойных [Demain 1983]. Исследования в лабораторных условиях показали, что штамм оказывает ростостимулирующее действие на семена хвойных. Так, энергия прорастания и всхожесть семян Larix sibirica L, Picea obovata L и Pinns sylvestris L, обработанных культуралыюй жидкостью продуцента, увеличивается (таблица 4). Активность штамма сохраняется и при твердофазном культивировании на растительных субстратах. При обработке семян лиственницы водными экстрактами, полученными после культивирования штамма на древесной зелени, энергия прорастания составляла 79 %, тогда как в контроле - 37 %.
Таблица 4 - Оценка ростостимулирующего действия штамма 19/97М Streptomyces lateritius на семена хвойных_
Семена, обработанные культуральной жидкостью штамма19/97М Энергия прорастания семян, % Всхожесть, % Средняя длина побега, мм
Larix sibirica L 51,0±2,7 54,0±1,3 42,1±5,3
Контроль (стерильная вода) 19±3,3 39±2,7 29,7±7,2
Picea obovata L 38,6±2,6 83,1±4,4 14,2±5,4
Контроль (стерильная вода) 33,6±2,3 61,3±3,5 12,0±1,3
Pinus sylvestris L 56,7±3,4 79,1±3,9 18,7±2,б
Контроль (стерильная вода) 44,1±3,6 66,8±2,3 17,0±2,4
Эффективность различных форм биопрепарата на основе штамма 19/97М оценивали в лесном питомнике. Результаты испытаний обработки семян и внесения различных форм препарата на основе штамма в посевы Picea obovata L показали, что псхожесть семян и выход сеянцев значительно увеличились в сравнении с
контрольными вариантами. Наибольшее влияние оказала обработка семян метаболитами. Грунтовая всхожесть увеличивается на 32,3 %. Послевсходовый выпад сеянцев при использовании культурагсьной жидкости штамма составил 4,6 %, при этом в контрольных вариантах - 30 %, т.е выход здоровых сеянцев при обработке был более 95 % (рисунок 3). Эффективное действие оказала комбинированная обработка посевов с биопрепаратом на основе антагонистически активного штамма МГ6 T.asperellum. Выход здоровых сеянцев Picea obovata L при совместном использовании двух штаммов составил 92,7 %, что в 1,5 раза выше контрольных значений.
Таким образом, в полевых испытаниях доказано, что антагонистически активный штамм S.iateritius является перспективным для получения биологических препаратов на его основе с целью оздоровления и увеличения объемов лесопосадочного материала.
В ходе лабораторных исследований было показано, что метаболиты штамма 19/97М стимулируют всхожесть и снижают уровень инфицируемости семян пшеницы сорта КС-15 и ячменя сортов Красноярский-80 и Кедр. Водные экстракты из биомассы, полученной после культивирования продуцента на коре лиственницы и древесной зелени, оказывают на прорастание семян злаковых лучшее действие, чем после культивирования на коре пихты.
□ Выхсд сеянцзз
3* 4*
Вариант обработки
* 1 - контроль; 2 - обработка КЖ ЫегШиз, полученной на среде с мелом; 3 -обработка КЖ & ЫегШш, полученной на среде с фосфатным буфером; 4 - обработка КЖ 5. 1а1ггШиа, полученной на среде с фосфатно-щелочным буфером, 5- обработка иммобилизованной на цеолите КЖ Б.ШегШш, полученной на среде с фосфатно-щелочным буфером, 6 - внесение препарата, полученного при культивировании 5'. \ateritiМ5 на древесной зелени пихты
Рисунок 3 - Выход здоровых сеянцев при обработке почвы лесного питомника метаболитами штамма (процент от числа проросших семян).
Полевые испытания, проведенные на посевах злаков в условиях ОПХ «Минино» в период 2006-2007 гг., показали, что при обработке культуральной жидкостью штамма семян злаков урожайность в опытных посевах пшеницы увеличилась в 1,5 раза, а ячменя в 3,5 раза.
Оценка внутренней инфекции урожая семян, выращенных при использовании препарата, показала значительное снижение инфицированное™, в среднем 2,5-4 раза, чем на контрольных семенах.
Технологическая часть
На основании результатов исследований разработаны схемы получения биопрепарата в двух формах:
- в виде спорового материала получаемого методом глубинного культивирования на оптимизированной крахмало-аммиачной среде;
- в виде гранул получаемых методом твердофазной ферментации штамма на измельченных отходах сельского хозяйства, лесной и лесоперерабатывающей промышленности.
Технология получения препарата глубинным культивированием. Производительность цеха составляет 14,5 тонн в год чистого мицелиалыю-спорового материала. Производство работает в периодическом режиме, 64 цикла в год из расчета на 320 рабочих дней. Один цикл составляет пять суток.
Технология получения препарата методом глубиппого культивирования представлена на рисунке 4. С помощью дозаторов для сыпучих веществ основные компоненты среды поступают в смеситель для приготовления сред и емкости для приготовления буфера. Полученный буфер (рН 7,2) поступает в смеситель для приготовления среды. Подготовленная для культивирования среда подается на стерилизацию паром в стерилизатор, затем после охлаждения в холодильнике поступает в основной ферментер. Ферментер с мешалкой снабжен рубашкой, для поддержания постоянной температуры ферментации 27 °С. Посевной мицелиально -споровый материала, с помощью дозаторов подается в ферментационный аппарат. Засев проводят из расчета 5% от объема препарата получаемого за один цикл. После достижения стационарной фазы роста КЖ выводится из нижней части ферментера и поступает на сепараторы первой, а затем второй ступени. Суспензия концентрируется, из нижней части сепараторов выходит отработанная КЖ и поступает в бак для ее сбора. Далее суспензия подается на сушку в сушильный шкаф, имеющий систему отвода воздуха. Затем биопрепарат поступает на упаковку и хранение. Упакованный препарат хранится в сухом темном помещении при комнатной температуре. Срок хранения препарата 6 месяцев. Количество готового продукта составляет 240 кг за один цикл работы цеха. В таблице 5 приведены текущие затраты для получения готового биопрепарата.
Таблица 5 - Текущие затраты на получение мицелиально-спорового препарата
Наименование Количество Суммарная Количество Суммарная
на 230 кг стоимость, руб на 14,5 т стоимость, руб
продукта, т продукта, т
Крахмал 1,1 16780 71,6 1073930
(N1^)^04 0,2 430 И,5 27493
№С1 0,1 70 5,7 4468
КаНР04 0,7 117273 44,7 7505482
1^04-7Н20 0,1 2864 5,7 183284
ЫаОН од 2205 8,0 141129
Вода 89,5 901 5727,6 57677
Электроэнергия, кВт-ч 92,0 127 5888,0 8125
Всего 140650 9001587
Технология получения препарата твердофазной ферментацией Производительность цеха составляет 14,5 тонн в год препарата. Производство работает в периодическом режиме, 32 цикла в год из расчета на 320 рабочих дней. Один цикл составляет десять суток.
Технологическая схема получения препарата методом твердофазной ферментации показана на рисунке 5. Установка должна быть полностью герметизирована и смонтирована в особом герметичном помещении. Измельченный до 3-5 мм. растительный субстрат (древесная зелень после спиртовой экстракции) обогащается 2 %-м (ЫН4)2804-и поступает в стерилизатор, где стерилизуется паром. Затем с помощью шнека поступает в растительную камеру, субстрат охлаждается с помощью кондиционера до температуры 27 °С. Перед На подающей и вытяжной линии воздуха устанавливают фильтры для бактериальной очистки. Культивирование штамма проводят в течение 10-ти суток при постоянной температуре и аэрации стерильным воздухом. После окончания процесса полученный препарат подается с помощью ленточного конвейера в бункер узла упаковки и далее на фасовку и упаковку. Над ленточным конвейером устанавливается вытяжной зонт, воздух с которого поступает на очищение в циклоны. Затем препарат упаковывают в бумажные мешки и хранят в сухом темном помещении при комнатной температуре. Срок хранения препарата составляет 6 месяцев. Количество готового продукта составляет 460 кг за один цикл работы цеха. В таблице 6 приведены текущие затраты для получения готового биопрепарата.
Таблица 6 - Текущие затраты на получение мицелиально-спорового препарата
Наименование Количество Суммарная Количество Суммарная
на 460 кг стоимость, на 14,5 т стоимость,
продукта, т руб продукта, т руб
Древесная зелень после спиртовой экстракции 0,46 138,0 14,7 4416,0
(МН4)2Б04 0,09 193,5 2,9 6192,0
Вода 0,45 0,6 14,4 19,8
Электроэнергия, кВт-ч 92,0 126,9 2944 4062,7
Всего 459,1 14690,5
Сравнительный анализ основных экономических характеристик получения препарата глубинным жидкофазным и поверхностным твердофазным культивированием, показал перспективность получения препарата в промышленных объемах, независимо от способа культивирования. К увеличению себестоимости в первом случае ведут значительные материальные затраты на компоненты питательной среды и оборудование, при этом срок окупаемости производства достаточно короткий. Спорово-мицелиальная биомасса и гранулированный препарат имеют ряд преимуществ по отношению друг к другу. Поэтому, не смотря на разницу себестоимости, ожидается стабильный потребительский интерес в отношении обеих форм препарата.
1- Зазсяор. 2 - аххвсты Зяя ювгвте&тая В&ввв. 3 - ёиккаь ВяепкяопюЗтит сегЗа, 4 - сяаммевее. 5 - '/яемсо&пжк. б - двшвр ата&я* яаяешмв. 7 - нтяясыршя ясяокебхв. й - ¡актви&егучккий фипта. 9 - фецттяц, Ю-сгаеевяой Я— сдврш КЖ. 12 - сишлтй шквф.
Рисунок 4— Технологическая схема получения препарата глубинным культивированием
1 - стерилизатор. 2 - шнекобый транспортер, 3 - вентилятор. 4 - бактериальный фильтр, 5 - фильтр Река, 6 - кондиционер, 7 - посевной материал 3 - растительная камера. 9 - бункер узла упаковки, 10 - сборник шлапа. 11 - зонт с дытяхной трубой, 12 - ленточный конвейер.
Рисунок 5 — Технологическая схема получения препарата твердофазной ферментацией
Выводы
1. Изучены биотехнологические особенности штамма S. lateritius 19/97М при поверхностном и глубинном культивировании. Установлено, что штамм способен использовать различные субстраты в качестве источника углерода крахмал, моно-, дисахариды и сахароспирты, глицерин, этиловый спирт. Удельная скорость роста штамма составила: на средах содержащих манит - 0,085 ч"1, сахарозу - 0,074 ч"1, глюкозу - 0,064 ч'1, крахмал - 0,057 ч'1. Лучшим для роста штамма является аммонийный источник азота.
2. Для максимального получения биомассы культивирование штамма S. lateritius 19/97 целесообразно проводить при pH 7,2 и температуре 27 "С на питательной среде состава: крахмал -12,5 г/л, (NH4)2S04 - 2 г/л, NaCl - 1 г/л, К2НР04 - 1 г/л, MgS04 х 7Н20 - 1 г/л, буфер (КзНРС^аОН) - 1л. Для нейтрализации кислых продуктов метаболизма рекомендовано использовать фосфатно-щелочной буфер (K^HPiVNaOH).
3. Оптимизация среды и условий культивирования позволила увеличить выход биомассы мицелия исследуемого штамма до концентрации (2,57±0,61) г/л, удельная скорость роста культуры составила (0,069±0,02) ч"1
4. Установлено, что биологически активными соединениями продуцента 19/97М являются окрашепные пигменты розово-красного цвета, относящиеся к группам хинонов и антрациклинов. Штамм S.lateritius 19/97М не синтезирует антибиотики пенициллинового, тетрациклинового ряда, стрептомицина, хлорамфеникола, карнамицина, что дает основание использовать его в защите растений.
5. Доказана антагонистическая активность в отношении фитопатогенов рода Fusarium и ростостимулирующая активность в отношении семян хвойных и злаковых культур при культивировании на различных источниках углерода и азота сохраняющиеся при длительном хранении продуцента.
6. Установлено, что штамм хорошо культивируется на твердых субстратах, сохраняя длительный период свою жизнеспособность и биологическую активность. Наиболее перспективно использование древесной зелени пихты для получения биопрепарата на основе штамма 19/97 М S.lateritius с титром 1,91-10п КОЕ-г'1.
7. Наработаны различные формы биопрепарата на основе продуцента 19/97 М S.lateritius, содержащие биомассу и культуральную жидкость штамма. Проведенные опытно-производственные испытания показали, что использование биопрепаратов на основе продуцента увеличивает урожайность злаков в 1,2 раза и выход здоровых сеянцев в лесном питомнике в 9,5 раз.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации
1. И. И. Гайдашева, Т. И. Громовых, В. М. Ушанова, Г. А. Сизых, Ю. А. Литовка, В. С. Садыкова. Перспективы получения биопрепарата на основе активного штамма 19/97М Streptomyces lateritius для защиты сеянцев хвойных // Хвойные бореалыюй зоны. - 2007. - T.XXTV, № 4-5. - С. 482-486.
2. И. И. Гайдашева, В. С. Садыкова, П. Н. Бондарь, Н. В. Зобова, Т. И. Громовых. Перспективы использования новых биопрепаратов для защиты злаков в Средней Сибири // Вестник КрасГАУ,- 2008. - № 1 (22). - С. 74-78.
3. И. И. Гайдашева, И.Н. Третьякова, В. С. Садыкова, Н. Е. Носкова, П. Н. Бондарь, Т. И. Громовых, А. С. Иваницкая, М. В. Ижболдина, А. В. Барсукова. Ростстимулирующая активность штаммов рода Streptomyces lateritius и
Trichoderma и перспективы их использования для микроклонального размножения хвойных // Биотехнология. - 2009. - № 1. - С. 39-41.
4. *Тулунина И. И. Изучение биологических свойств нового продуцента биопрепарата защиты растений Streptomyces lateriíius 19/97М / П. П. Кормилец, И. И. Тулунина, Г. А. Сизых, Н. Р. Габидулина, И. Р. Габидулина // Экология и проблемы окружающей среды : XI всерос. науч. кон<Ь. - Красноярск, 2004. - С. 24-25.
5. Гайдашева, И. И. Оптимизация условий культивирования продуцента биопрепаратов защиты растений штамма 19/97М Streptomyces lateritius / И. И. Гайдашева, П. П. Кормилец //' Рациональное природопользование: материалы Всерос. науч. конф. аспирантов и студентов по приоритетному направлению. -Ярославль, 2005.-С. 13-18.
6. Гайдашева, И. И. Оптимизация параметров культивирования штамма 19/97М Streptomyces lateritius, продуцента биопрепарата защиты растений / И. И. Гайдашева, П. П. Кормилец, Т. В. Августинович // Лесной и химический комплексы - проблемы и решения: ст. Есерос.науч.-практ. конф. - Красноярск, 2006.-Т. З.-С. 56-58.
7. Гайдашева, И. И. Разработка биотехнологии продуцента биопрепарата «Латерин» для зашиты растений / И. И. Гайдашева, Т. И. Громовых // Развитие инновационной деятельности б промышленном комплексе города Красноярска : материалы гор. науч.-практ. конф. - Красноярск, 2007. - С. 71-74.
8. Гайдашева, И. И. Оценка продуктивности и биологической активности штамма I9/97M Streptomyces lateritius на различных источниках углерода / К. И. Гайдашева, Т. И. Громовых // Актуальные проблемы технологии живых систем : II междунар. науч.-техн. конф. молодых ученых. - Владивосток, 2007. - С. 1013.
9. Гайдашева, И. И. Влияние биопрепаратов защиты растений на продуктивность злаков в средней Сибири / П. Н. Бондарь, И. И. Гайдашева // Живые системы и биологическая безопасность населения : материалы VII Междунар. науч. конф. студ. и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2008. - С. 5-7.
10. Гайдашева, И. И. Влияние метаболитов штамма актиномицета Streptomyces lateritius 19/97М на рост и развитие злаков в лабораторных условиях / И. И. Гайдашева, Т. И. Громовых // Лесной и химический комплексы - проблемы и решения: ст. всерос.науч.-практ. конф. - Красноярск, 2009.
11. Гайдашева, И. И. Изучение химического состава и биологической активности вторичных метаболитов антагонистически активного штамма Streptomyces lateritius 19/97 М / И. И. Гайдашева, Т.И. Громовых // Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее: Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. М., 2011.- с. 29.
* - 02.07. 2005 года сменила фамилию на Гайдашева в связи с регистрацией брака.
Подписано в печать:
16.02.2011
Заказ № 4988 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гайдашева, Ирина Игоревна
Введение.
1 Обзор литературы. Актиномицеты - продуценты биологически активных соединений и биопрепаратов.
1.1 Актиномицеты - продуценты биологически активных веществ.
1.2 Актиномицеты в медицине, фармацевтике и ветеринарии.
1.3 Использование актиномицетов как продуцентов биопрепаратов для биологического контроля фитопатогенов.
1.4 Разработка условий и подбор питательных сред для культивирования актиномицетов.
2 Объекты и методы исследования.
2.1 Характеристика объекта исследования.
2.2 Изучение морфологии штамма 19/97М 81гер1отусез ЫегШш.
2.3 Изучение продуктивности штамма при глубинном и поверхностном культивировании.
2.3.1 Оценка продуктивности штамма при росте на различных. источниках углерода и азота.
2.3.2 Определение остаточной концентрации источников углерода в питательной среде после культивирования продуцента.
2.4 Подбор буферных систем для нейтрализации миколовых кислот.
2.5 Оптимизация состава среды и температуры культивирования.
2.6.Твердофазное культивирование штамма 81гер1:отусе8 ЫегШш 19/
М на растительных субстратах.
2.7 Расчет основных кинетических характеристик процесса культивирования.
2.8 Определение химического состава метаболитов штамма 19/97М 81:гер1:отусе8 Ы:егШш.
2.8.1 Идентификация антибиотиков в культуральной жидкости и мицелии штамма Streptomyces lateritius 19/97 М.
2.8.2 Спектральный анализ метаболитов.
2.9 Оценка антагонистической активности метаболитов штамма в отношении грибов рода Fusarium.
2.10 Определение биологической активности метаболитов штамма 19/97 М Streptomyces lateritius.
2.11 Оценка эффективности метаболитов штамма 19/97 М Streptomyces lateritius на рост сеянцев Pinus sibirica, Pinus obovata L. и злаковых культур в полевых испытаниях.
2.12 Определение жизнеспособности штамма 19/97 М Streptomyces lateritius при хранении в лабораторных условиях.
2.13 Статистическая обработка полученных результатов.
3 Продуктивность штамма 19/97М Streptomyces lateritius в различных биотехнологических системах.
3.1 Жидкофазное культивирование.
3.1.1 Динамика роста штамма при глубинном и поверхностном способах культивирования.
3.1.2 Продуктивность биомассы штамма 19/97М Streptomyces lateritius на различных источниках углерода и азота.
3.1.3 Рост штамма 19/97М Streptomyces lateritius при различных значениях pH.
3.1.4 Оптимизация состава компонентов питательной среды для культивирования штамма 19/97М Streptomyces lateritius.
3.2 Твердофазная ферментация.
4 Биологические свойства штамма Streptomyces lateritius 19/97М.
4.1 Изучение морфолого-культуральных признаков штамма.
4.2 Идентификация антибиотиков в культуральной жидкости и мицелии штамма 19/97 Streptomyces lateritius.
4.3 Масс-спектроскопический анализ метаболитов продуцента.
4.4 Антагонистическая активность при различных условиях культивирования.
4.5 Оценка жизнеспособности и активности биомассы продуцента при хранении.
5 Оценка эффективности использования штамма актиномицета Streptomyces lateritius 19/97М в биологическом контроле сеянцев и злаков.
5.1 Влияние метаболитов в культуральной жидкости штамма Streptomyces lateritius 19/97М на прорастание семян хвойных в лабораторных условиях.
5.2 Влияние метаболитов культуральной жидкости штамма актиномицета Streptomyces lateritius 19/97М на развитие семян хвойных в условиях лесного питомника.
5.3 Влияние метаболитов культуральной жидкости штамма актиномицета Streptomyces lateritius 19/97М на рост и развитие злаков в лабораторных условиях.
5.4 Влияние протравливания семян метаболитами штамма 19/97М Streptomyces lateritius на рост и показатели продуктивности злаков в полевых испытаниях.
6 Технологическая часть.
6.1 Технология и экономическое обоснование получения препарата глубинным культивированием.
6.2 Технология и экономическое обоснование получения препарата твердофазной ферментацией.
Выводы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Культивирование штамма Streptomyces lateritius 19/97 M"
Природа в течение миллионов лет эволюции создавала механизм, регулирующий численность патогенной микрофлоры за счет микроорганизмов-антагонистов. Поэтому было бы несправедливо не использовать этот естественный механизм для решения проблем человека. В настоящее время биологический метод защиты растений является наиболее важным звеном в выращивании экологически безопасной сельскохозяйственной продукции, оздоровлении лесопосадочного материала. Биометод защиты растений признан наиболее ресурсосберегающим приемом, позволяющим защищать растения от болезней, вредителей и повышать их продуктивность без затрат невосполнимых природных ресурсов и без нанесения ущерба окружающей среде.
Этот метод защиты растений реализуется путем использования полезных насекомых, грибных, бактериальных и вирусных препаратов и имеет важные отличительные свойства: отсутствие резистентности патогенных организмов, короткий срок ожидания отклика, способность к воспроизведению живых организмов, безопасность в применении [1, 2, 3].
В настоящее время уже успешно используются такие препараты как планриз, агат-25, псевдобактерин - это биофунгициды на основе бактерий рода Pseudomonas; бактофит, фитоспорин, интеграл, бисолбисан - на основе B.subtilis, триходермин — на основе микромицетов рода Trichoderma.
Все чаще в научной литературе исследователи рекомендуют к использованию в биологическом контроле штаммы группы актиномицетов. Так сотрудниками Сибирского государственного технологического университета Громовых Т.И., Литовка Ю.А. и Садыковой B.C. из почвы лесного питомника Красноярского края выделен штамм 19/97М Streptomyces lateritius (ВКПМ Ас 1637) [4]. Данный штамм был предложен как потенциальный продуцент биопрепарата для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов
Fusarium и Alternaría [5, 6, 7]. Однако до настоящего времени не изучены условия получения биомассы и метаболитов этого продуцента. Не подобраны оптимальные питательные среды для культивирования штамма 19/97-М Streptomyces lateritius. Кроме того, не проведена апробация полученного на основе штамма препарата в полевых условиях. Все это сдерживает возможность скорейшего внедрения данного штамма в качестве инструмента биоконтроля.
В связи с этим целыо настоящей работы было: изучение биологической активности и продуктивности штамма 19/97 М Streptomyces lateritius, разработка биотехнологии биопрепарата для биологического контроля фитопатогенов злаков и сеянцев хвойных.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- изучить биологические особенности роста и продуктивности штамма 19/97 М Streptomyces lateritius при жидкофазном и твердофазном культивировании; с целыо повышения продуктивности оптимизировать состав питательной среды и условия для культивирования штамма;
- подобрать субстраты для твердофазного культивирования штамма на основе отходов сельского хозяйства и лесоперерабатывающей промышленности;
- изучить состав вторичных метаболитов, продуцируемых активность штамма в отношении фитопатогенов рода Fusarium;
- изучить ростстимулирующие свойства штамма 19/97 М Streptomyces lateritius в отношении хвойных и злаковых растений;
- оценить биологическую активность и жизнеспособность штамма при хранении в лабораторных условиях;
- наработать опытные партии биопрепарата и оценить его эффективность в защите растений при внесении в почву лесного питомника и агроценоза злаков.
Научная новизна. С использованием методов световой и электронной микроскопии при культивировании на твердых питательных средах впервые исследован цикл развития штамма 19/97 М Streptornyces lateritius. Изучена динамика накопления биомассы штамма 19/97М Streptornyces lateritius при жидкофазном культивировании на различных питательных средах; подобран состав синтетической среды для максимального накопления биомассы изучаемого штамма.
С использованием новейших методов химического анализа доказано, что штамм не синтезирует антибиотических соединений группы пенициллина, стрептомицина, а так же тетрациклина и левомицитина. Проведена оценка химического состава продуцируемых актиномицетом метаболитов.
Показан ростостимулирующий эффект метаболитов штамма, полученных при жидкофазном культивировании на оптимизированной среде и твердофазном культивировании на подобранных субстратах, в отношении хвойных и злаковых растений.
Установлена антагонистическая активность штамма в отношении бактерий и фитопатогенных грибов рода Fusarium.
Изучена динамика жизнеспособности и антибиотической активности штамма 19/97М Streptornyces lateritius при хранении в лабораторных условиях.
Впервые методом твердофазной ферментации на древесной зелени получен новый биопрепарат на основе продуцента 19/97 М Streptornyces lateritius.
Сложившиеся в результате исследований представления о возможности получения биопрепарата на основе нового штамма 19/97 М актиномицета Streptornyces lateritius вносят существенный вклад в научные основы использования его в биологической защите злаковых и хвойных культур.
Практическая значимость работы. Оптимизирован состав жидкой синтетической среды и условия для максимального накопления биомассы штаммом 19/97М Streptomyces lateritins. Предложены растительные субстраты для твердофазной ферментации с целью получения биопрепарата на основе штамма.
Наработана опытная партия биопрепарата, содержащего биомассу штамма и культуральную жидкость штамма. Проведены опытно-производственные испытания биопрепаратов на основе штамма на сеянцах хвойных в лесном питомнике и культурах злаковых растений. Установлено положительное влияние биопрепарата на увеличение урожайности злаков и выход здоровых сеянцев в питомнике. Показано, что штамм 19/97 М Streptomyces lateritius может быть использован для стимуляции роста и защиты растений в сельском и лесном хозяйстве.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях: международных - II «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2007); VII « Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2008); всероссийских - «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2005); «Лесной и химический комплекс. «Проблемы и решения» (Красноярск, 2006, 2008, 2009); IV съезде биотехнологов России (Пущино, 2006); городской научно-практической конференции «Развитие инновационной деятельности в промышленном комплексе города Красноярска», (Красноярск, 2007 г), на научном симпозиуме «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011).
Участие в грантах: Работа выполнена при финансовой поддержке грантов: Российского фонда фундаментальных исследований 06-04-08040 -офи, «Создание высокопродуктивных устойчивых к патогенам форм хвойных растений в культуре in vitro, на основе современных достижений в области половой репродукции голосеменных»; 07-04-90843 (МОБСТ) грант на прохождение научной стажировки в Московском государственном университете прикладной биотехнологии; 09-04-98008-рсибирьа Биологический контроль биотехнологии сокультивирования хвойных в культуре in vitro с биопрепаратами рода Trichoderma и Streptomyces. Грант РНП.2.2.3.1.2466 Министерства образования и науки РФ "Развитие гербарной коллекции и музея культур грибов Средней Сибири как базы для научно-образовательного процесса"; грант Красноярского краевого фонда науки "Индивидуальные гранты для молодых ученых" 18G178.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Гайдашева, Ирина Игоревна
выводы
1. Изучены биотехнологические особенности штамма S. lateritius 19/97М при поверхностном и глубинном культивировании. Установлено, что штамм способен использовать различные субстраты в качестве источника углерода крахмал, moho-, дисахариды и сахароспирты, глицерин, этиловый спирт. Удельная скорость роста1 штамма составила: на средах содержащих манит - 0,085 ч"1, сахарозу - 0,074 ч"1, глюкозу - 0,064 ч"1, крахмал - 0,057 ч"1. Лучшим для роста штамма является, аммонийный источник азота.
2. Для максимального получения биомассы культивирование штамма S. lateritius 19/97 целесообразно проводить при pH 7,2 и температуре 27 °С на питательной среде состава: крахмал -12,5 г/л, (NH4)2S04 - 2 г/л, NaCl - 1 г/л, К2НР04 - 1 г/л, MgS04 х 7Н20 - 1 г/л, буфер (K2HP04/Na0H) - 1л. Для нейтрализации?кислых продуктов метаболизма рекомендовано использовать, фосфатно-щелочной буфер (K2HP04/Na0H).
3. Оптимизация среды и условий культивирования позволила увеличить выход биомассы мицелия исследуемого штамма до концентрации (2,57±0,61) г г/л, удельная скорость роста культуры составила (0,069+0,02) ч"1
4. Установлено, что биологически активными соединениями продуцента 19/97М являются окрашенные пигменты розово-красного цвета, относящиеся к группам хинонов и антрациклинов. Штамм S. lateritius 19/97М не синтезирует антибиотики пенициллинового, тетрациклинового ряда, стрептомицина, хлорамфеникола, карнамицина, что дает основание использовать его в защите растений.
5. Доказана антагонистическая активность в отношении фитопатогенов рода Fusarium и ростостимулирующая активность в отношении семян. хвойных и злаковых культур при культивировании на различных источниках углерода и азота сохраняющиеся при длительном хранении продуцента.
6. Установлено, что штамм хорошо культивируется на твердых субстратах, сохраняя длительный период свою жизнеспособность и биологическую активность. Наиболее перспективно использование древесной зелени пихты для получения биопрепарата на основе штамма 19/97 М 51. \ateritius, титр которого составляет 1,9Ы0И КОЕ-г1.
7. Наработаны различные формы биопрепарата на основе продуцента 19/97 М Б-ШегШия, содержащие биомассу и культуральную жидкость штамма. Проведенные опытно-производственные испытания показали, что использование биопрепаратов на основе продуцента увеличивает урожайность злаков в 1,2 раза и выход здоровых сеянцев в лесном питомнике в 9,5 раз.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гайдашева, Ирина Игоревна, Красноярск
1. Российский сельскохозяйственный центр Электронный ресурс. -Электрон, дан. Режим доступа: http://rscrt.ru.
2. Буров, В.Н. Научные основы защиты растений / В.Н. Буров и др.. М: Мир, 1984. - 220 с.
3. Райе Э. Природные средства защиты растений от вредителей / Э. Райе. — М: Мир, 1986.-250 с.
4. Громовых, Т. И. Биологический контроль болезней сеянцев хвойных в лесных питомниках Средней Сибири : монография / Т. И. Громовых, Ю. А. Литовка, О. Н. Андреева. Красноярск : СибГТУ, 2005. -264 с.7. http://ru.wikipedia.org/wiki
5. Определитель бактерий Берджи. Т 1 : пер. с англ. / под ред. Дж. Хоулта и др.. М. : Мир, 1997. - 432 е.: ил.
6. Jayasinghe D. Actinomycetes as antagonists of litter decomposer fungi / D. Jayasinghe, D. Parkinson // Applied soil ecology. 2008. - № 38. - P. 109118.
7. Звягинцев, Д. Г. Почва и микроорганизмы / Д. Г. Звягинцев. М. : Высш. шк., 1987.-С. 55-64.
8. Жадамбаагийн, Н. Актиномицеты редких родов в почвах пустынныхэкосистем Монголии / Н. Жадамбаагийн, Н. А. Манучарова, Г. М. Зенова // Почвоведение. 2003. - № 8. - С. 967-972.
9. Rezanka, Т. Identification of odorous compounds from nine fermentor-cultivated Streptomyces strains / T. Rezanka, A. Prell, K. Sigler // Folia Microbiologica. -2008. Vol. 53, № 4. - P. 315-318.
10. Промышленная биотехнология Электронный ресурс. 2009. - Режим доступа: // http://www.biotechnolog.ru/prombt.htm.
11. Пат. 2001102052, МПК С12Р1/04, C12N1/20, А61К31/00. Мумбаистатин, способ его получения и его применения в качестве фармацевтического препарата / Н. В. С. Рамакришна и др.. № 2001102052/13 ; заявл. 15.06.1999.
12. Пат. 2201964, МПК C12N1/06, С12Р13/00. Соединение WK-5344A исоединение WK-5344B, способ их получения и продуцирующий ихштамм Streptomyces sp. WK-5344 FERM BP-6668 / С. Омура, X. Томода,
13. Е. Такахаси. -№ 2001114212/13 ; заявл. 08.03.1999.
14. Широких, И. Г. Антифунгальный потенциал актиномицетов из ризосферы ячменя на дерново-подзолистых почвах / И. Г. Широких // Почвоведение. 2003. - № 4. - С. 458-464.
15. Биоактивные метаболиты из изолятов стрептомицетов описание и антимикробная активность / С. Б. Илич и др. // Микробиология. - 2007. - Т. 76, № 4. - С. 480-487.
16. Antimicribial and antiviral activities of an actinomycete (Streptomyces sp.) isolated from a brazilian tropical forest soil / Doralice Rodrigues Sacramentoet al. I I World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2004. - № 20.- P. 225-229.
17. Пат. 2198673, МПК C12N9/52, A61K35/74. Лекарственный препарат для оптимизации вязкости слизи И'стимулирования функции кишечника / М. Орман. -№ 98119950/13 ; заявл. 04.04.1997.
18. Пат. 2166959, МПК А61К38/21, А61Р37/02. Способ лечения аутоиммунных» заболеваний с использованием,интерферонов типа I / С. А. Брод. -№ 96121922/14 ; заявл. 12.04.1994.
19. Пат. 2005134413, МПК А61К36/06. Способ профилактики и терапии северных оленей при эдемагенозе и цефеномиозе / Г. С. Сивков и др.. -№2005134413/13 ; заявл. 11.07.2005.
20. Пат. 2002119048, МПК C12N1/20. Способ получения пробиотической добавки для кормовых средств / Г. В. Борисова, В. А. Грунская. № 20021198048/13 ; заявл. 15.07.2002.
21. Пат. 2210362, МПК А61К31/00, A01N25/00. Препарат для борьбы с вредными насекомыми и гельминтами / М. Н. Мирзаев и др.. № 200132764/13 ; заявл. 27.12.2000.
22. Действие авермектинов на клетки лимфолейкоза Р-388 in vitro / В. А. Мосин и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - № 6. - С. 16-20.
23. Avermectin: biochemical and molecular basis of its biosynthesis and regulation / Y. J. Yoon et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. - № 63. -P. 626-634.
24. Isolation and characterization of actinomycete antagonists of a fungal root pathogen / D. L. Crawford et al. // Applied and environmental microbiology.- 1993. Vol. 59, № 11. - P. 3899-3905.
25. James, R. L. Principies and potential for biocontrol of diseases in forest and conservation nurseries / R. L. James, R. K. Dumroese, D. L. Wenny // Proceedings western forest nursery association, 1992. Pi 122-131'.
26. Patil, I'. S. Antagonistic action of species of Trichoderma, Bacillus andi Streptomyces on Drechslera sorokiniana (Sacc) / I. S. Patil, K. Srikant, R. K. Hegde // Pesticides. 1987. - № 12. - P. 22.
27. Dumroese, R. К. Interaction among Streptomyces.griseoviridis, Fusarium root disease, and Douglas fir-seedlings / R. K. Dumroese, R. L. James, D. L.
28. Wenny//New forest.- 1998.-Vol. 15.-P. 181-191.i
29. Теркина, И. А. Антагонистическая активность актиномицетов озера Байкал / И. А. Теркина, В. В. Парфенова, Т. С. Ан // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - Т. 42, № 2. - С. 195-199.
30. Пат. 2052501, C12N1/00. Штамм Streptomyces felleus для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов / И. И. Новикова и др.. -№ 5066773/13 ; заявл. 06.10.1992.
31. Isolation and screening of Streptomyces in soil of protected forest areas from the states of Assam and Tripura, India, for antimicrobial metabolites / D. Thakur et al. // Journal de Mycologie Medícale. 2007. - № 17. - P. 242249.
32. Пат. 2002129235, МПК C12N1/20. Штамм актиномицета Streptomyces hygroscopicus subsp. ЦКМ-4561, обладающий, фунгицидными, бактерицидными и инсектицидными свойствами / Н. Н. Галкина и др.. -№2002129235/13 ; заявл. 01.11.2002.
33. Пат. 2135581, МПК C12N9/14. Штамм бактерии Streptomyces sp.ST-12-продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-CTGCAG-37 JI. И. Пучкова и др.. -№ 97116083/13 ; заявл. 26.09.1997.
34. Пат. 2005135090, МПК C02F3/00. Способ биосорбционной очистки сточных вод / О. С. Корнеева и др.. № 2005135090/13 ; заявл.1111.2005.
35. Пат. 2213080, МПК C05F11/08, C12N1/14. Способ приготовления компостной закваски / X. М. Тен и др.. № 1001131974/13 ; заявл.2611.2006.
36. Пат. 2296732, МПК C05F3/00, C12N1/20. Способ приготовления торфодробинного компоста / Тен Хак Мун, Г. Н. Ганин. № 2005113433/13 ; заявл. 03.05.2005.
37. Пат. 1669184, МПК C12N1/12. Способ получения волокнисто-пористых материалов на основе мицелиальных микроорганизмов / Л. В. Калуцкий и др.. № 4745323/13 ; заявл. 09.08.1989.
38. Пат. 2002108118 МПК C12N15/55, С07Н21/00. Способ получения гетерологичного секреторного белка / И. Кикути и др.. № 2002108118/13 ; заявл. 29.09.2000.
39. Пат. 2001105315 МПК С12Р17/10, С12Р41/00. Микробиологический способ получения оптически активных 3-гидроксипирролидиновых производных/Дж. У. Уонг. -№ 2001105315/13 ; заявл. 27.02.2001.
40. Пат. 2001103132 МПК C12N15/52, С12Р17/06. Поликетиды, их получение и материалы для использования для этой цели- / И. JI. Келленберг и др.. -№ 2001103132/13 ; заявл. 06.07.1999.
41. Егоров, Н. С. Основы учения об антибиотиках / Н: С. Егоров. М. : Изд-воМГУ, 1994.-5Í2C.
42. Cloning and expression of the a-amylase gene and Oxytetracycline production in Streptomyces rimosus / C-W. Cheng et al. // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2000. - № 16. - P. 225-230.
43. Пат. 2198928, МПК C12N1/20, МПК C12P19/62. Штамм Streptomyces nodosus 472 ВНИИСХМ Д-666-продуцент амфотерицина В / М. А. Малков и др.. -№ 2000131310/13 ; заявл. 13.12.2000.
44. A novel antibiotic produced by Streptomyces noursei Da07210 / Xiaopeng Wu et al. // Antonie van Leeuwenhoek. 2009. - Электрон, дан. - . -Режим доступа: http://springerlink.com/.
45. Пат. 2002121965, МПК С12Р1/06, МПК C12R1:465. Штамм Streptomyces cinamonensis AC-1638- продуцент монензина А / В. Н. Даниленко. № 2002121965/13 ; заявл. 19.08.2002.
46. Пат. 2151793, МПК C12N1/00, МПК С12Р1/06. Способ получения антибиотика актиноплацина, штамм Streptomyces (kitasatova) sp. 834 ВНИИСХМ Д-484-продуцент антибиотика актиноплацина / О. Г. Полатовская и др.. 97110716/13 ; заявл. 25.06.1997.
47. Пат. 2147319, МПК С12Р1/06. Штамм. Streptomyces fradiae НИЦБ 99 -продуцент тилозина / В. Н. Даниленко. № 99120284/13 ; заявл. 28.09.1999;
48. Пат,. 96118263, МПК С12Р1/06. Штамм .Streptomyces, chromopurpureus subsp. chiketamanusc ФБ0001 продуцента омомицина / Е. Б. Кругляк и др.. - № 96118263/13 ; заявл. 12,09.1996. ' ' ■
49. Пат. 1651557, МПК С12Р19/62. Штамм Streptomyces erythraens: продуцент эритромицина / Л. Д. Шищенко, Н. Т. Трофимова, В. Д. Грузина; № 4732896/13 ; заявл. 27.0К1995.
50. Пат. 1306134, МПК С12Р1/06. Штамм- Streptomyces canamyceticu, используемый для получения канамицина / Л. А. Широносова и др.. — № 3942997/14 ; заявл. 10.04.1995:
51. Пат. 93038889, МПК С12Р29/00. Штамм С-2 Streptomyces rimosus sobin, finaly and:! kane продуцент окситетрациклина / Т. В: Солнышкина и др.. -№ 93038889/13 : заявл. 27.07.1993.
52. Пат. 93011601, МПК С12Р1/06, C12N1/20. Штамм Streptomyces cattleya N11-27 продуцент тиенамицина / С. М: Навашин и др.. - № 93011601/13 ; заявл. 03.03.1993.
53. Пат. 1739635, МПК С12Р29/00. Штамм Streptomycesr aureofaciens -продуцент хлортетрациклина / Н. Д. Ломовская и др.. -№ 4807150/13 ; заявл. 21.02.1990:
54. Пат. 2013448; МПК С12Р1/06. Штамм Streptomyces bambergiensis -продуцент моенозина А / В. И: Звенигородский и др.. — № 5033511/13 ; заявл. 23:03.1992.,
55. Пат. 2007458; МПК С12Р1/06. Штамм Streptomyces virginae продуцент антибиотика вирджиниамицина / В. И. Звенигородский и др.. - № 5033511/13 ; заявл. 23.03.1992.
56. Пат. 2241755, МПК С12Р1/06. Штамм Streptomyces cinamonensis АС-1638 продуцент монензина А / В. Н. Даниленко. - № 2002121956/13 ; заявл. 19.08.2002. '
57. Пат. 2061754, МПК С12Ш/36. Штамм Зй^отусев кигевапоуп -продуцент хитиназы и М-ацетил-О-глюкозаминидазы / Н. Ю. Татаринова, О. С. Гринченко, В. П. Варламов. № 92015982/13 ; заявл. 31.12.1992.
58. Пат. 92015982, МПК С12№/36. Штамм З^ерШтусеэ кигеБапоуп 107-продуцент хитиназы и .\Г-ацети л -Р гл юкоз амин и д аз ы / Н. Ю. Татаринова, О. С. Гринченко, В. П. Варламов. - № 92015982/13 ; заявл. 31.12.1992.
59. Пат. 2248801, МПК А61КЗ1/727. Способ получения низкомолекулярных гепаринов / В. Л. Варламов и др.. № 2003111205/13 ; заявл. 04.21.2004.
60. Пат. 2005126047, МПК С12Ш/00. Новый способ получения сложного эфира углерода, сложного эфира белка, сложного эфира субъединицы или сложного эфира гидроксикислоты / Арно Де Крэии и др.. № 2005126047/13 ; заявл. 15.01.2004.
61. Пат. 2032744, МПК С12К9/04, С12Ш7/08. Штамм 81гер1ошусеэ ер. -продуцент рифамиционоксидазы и способ получения рифамиционоксидазы / В. М. Царенков и др.. № 5066229/13 ; заявл. 20.08.1992.
62. Пат. 2031947, МПК С121^9/92. Штамм БйерЬтусез оНуостегеш -продуцент глюкозоизомеразы / И. В. Улещло, А. М. Безбородов. № 5050995/13 ; заявл. 30.06.1992.
63. Пат. 1748444, МПК С12Ы9/24, С12Ш/14. Штамм 81гер1отусез ер. -продуцент а-гликозидаз / Л. А. Дзявго и др.. № 4840626/13 ; заявл. 18.06.1990.
64. Пат. 2187556, МПК С12Р17/18. Способ получения клавулановой кислоты и (или) ее солей / Антибиотикос С.А. (ЕБ). № 97114101/13 ; заявл. 20.07.1999.
65. Додзин, М. Е. Новые продуценты L-глутаматоксидазы Streptomyces litmocidini и Streptomyces cremeus / М; Е. Додзин, К. А. Виноградова, И.
66. Б. Котова // Антибиотики и химиотерапия-. 1998. - № 41 - С. 7-13.
67. Immobilization of Streptomyces olivaceoviridis E-86 xylanase on Eudragit S-100 for xylo-oligosaccharide' production / Zhilu Ai et al:. // Process Biochemistry. -2005; Vol. 40; issue 8. - P. 2707-2714*.i
68. Mahadevan, B. Properties of the chitinase of the antifungal biocontrol'agent Streptomyces lydicus WYEC108 / B. Mahadevan, Don L. Crawford // Enzyme and Microbial Technology. 1997. - Vol. 20, issue 7. - P. 489-493.
69. Novel reaction of xylose isomerase from Streptomyces, rubinosus / O. Pastinen et al. // Enzyme and Microbial Technology. 1999. - № 25. - P. 695-700.
70. Особенности образования глюкозоизомеразы актиномицетом Streptomyces viridobrunneus / JI. И. Сапунова и др. // Биотехнология. -2001.-№ 2.-С. 40-47.
71. Hung-Der Jang. Production and characterization of termostable cellulases from Streptomyces transformant T3-1 / Hung-Der Jang, Kuo-Shu Chen // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2003. - № 19. - P. 263268.
72. Microbial transformation of the bioactive sesquiterpene, cyclonerodiol, by the ascomycete Penicillium sp. and the actinomycete Streptomyces sp. / Xifeng Li et al. // Enzyme and Microbial Technology. 2007. - № 40. - P. 1188-1192.
73. Пат. 93011685, МПК C12N9/50. Штамм актиномицета Streptomyces ornatus — продуцент внеклеточного кератин-расщепляющего фермента / А. К. Бандоян и др.. -№ 93011685/13 ; заявл. 03.03.1993.
74. Пат. 2034924,, МПК C12N9/50. Штамм Streptomyces ornatus продуцент кератиназы / А: К. Бандоян и др:.; - № 93011685/13 ; заявл.03:03.1993.
75. Expression profilingiof Streptomyces peucetius: metabolic genes, using DNA microarray analysis / Joon-Ryeol Yang et al. // Biotechnology and Bioprocess Engineering; 2008; — Vol; 13, № 6; — P: 738^744.
76. Functional characterization, of orf6i and orf9 genes involved in the biosynthesis, of L-oleandrose from Streptomyces antibioticus Tu99 / Binod Babu Pageni et:al. // Biotechnology and'Bioprocess Engineering. 2008; -Vol. 13, № 6. - P. 752-757.
77. Overproduction of soluble recombinant transglutaminase from?Streptomyces; netropsis in Escherichia coli. / Yu-Jen Yu et al. // Applied Microbiologv and Biotechnology.—2008:—Vol; 81, №'3; — P: 523-532.
78. Functional characterizationi of kan; В by complementing in engineered Streptomyces fradiae;А пеоб.^^ Электронный pecypc.f/.HumtNath Jnawali [et: al.] // Biotechnology Letters. 2009:.- Электрон: дан.- - . - Режим доступа: http://springerlink.com.
79. Создание опухоль-адресованных генно-инженерных препаратов для иммунотерапии рака / Л: Б. Гулько и др.'// Биотехнология. — 2003. № 5.-С. 81-87.
80. Biosorption of Fe3+ from aqueous solution by a bacterial dead Streptomyces rimosus biomass / A. Selatnia et al. // Process Biochemistry. 2004; — Vol. 39, issue 11.-P. 1643-1651.
81. Biosorption of lead (II) from aqueous solution by a bacterial dead Streptomyces rimosus biomass / A. Selatnia et al. // Biochemical Engineering Journal. 2004. - Vol. 19; issue 2. - P. 127-135.
82. Batch zinc biosorption by a bacterial nonliving Streptomyces rimosus biomass / N. Mameri et al. // Water Research. 1999. - Vol. 33, issue 6. - P. 13471354.
83. Пат. 2312073, МПК C02F3/34, C12N1/20, C12R1/465. Способ биосорбционной очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов / О. С. Корнеева и др.. -№ 2006110825/13 ; заявл. 03.04.2006.
84. Hiiseyin Bozkurt Effects of salt, starter culture and production techniques on the quality of hot pepper paste / Hiiseyin Bozkurt, Osman Erkmen // Journal of Food Engineering. 2005. - Vol. 69, issue 4. - P. 473-479.
85. Streptomyces drozdowiczii cellulase production using agro-industrial byproducts and its potential use in the detergent and textile industries / A. L. Grigorevski de Lima et al. // Enzyme and Microbial Technology. 2005. -Vol. 37, issue 2. - P. 272-277.
86. Пат. 223631, МПК A01F25/00, A23B9/26. Способ подготовки зерна к хранению / О. А. Монастырский, В. А. Ярошенко. № 2002129924/12 ; заявл. 11.11.2002.
87. Biotechnological enchancement of coffee pulp residues by solid state fermentation with Streptomyces. Py-GC / A. L. Orozco et al. // MS analysis. — Электрон, дан. -. Режим доступа: www.elsevier.com/located/jaap.
88. Biologically active metabolites of the actinobact erium Streptomyces sp. GW 33/1593. / M. P. Sobolevskaya et al. // Russian Chemical Bulletin. ~ 2008. -Vol. 57, №3.-P. 665-668.
89. Kyoung-Ja Kim. Antitumor and antioxidant activity of protocatechualdehyde produced from Streptomyces lincolnensis. М-20 / Kyoung-Ja Kim, Mi-Ae
90. Kim, Jee-Hyung Jung // Archives of Pharmacal Research. 2008: - Vol. 31,12.-P. 1572-1577.
91. Пат. 2155052, МПК A61K35/70. Комплексный антипаразитарный препарат, необладающий иммуносупрессией / В. А. Юркив и др.. — № 2000101035/13 ; заявл. 18.01.2000.
92. Пат. 2000101995, МПК С12Р17/18, С12Р1/06. Способ выделения авермектиновых комплексов / В. А. Мосин и др.. № 2000101995/13 ; заявл. 31.01.2000.
93. Пат. 2149007, МПК А61К35/70. Антипаразитарная, антимикробная противовоспалительная мазь пролонгированного действия / В. А. Юркив и др.. -№ 99120285/13 ; заявл. 28.09.1999.
94. Пат. 98109704, МПК А61К35/70. Противопаразитарная мазь «Авермектиновая» / JI. П. Головкина, С. В. Березкина. -№ 998109704/13 ; заявл. 28.05.1998.
95. Пат. 2001120073, МПК А61К35/70, А61РЗЗ/00. Антипаразитарный препарат с иммуномодулирующими свойствами / В. А. Юркив и др.. — №2001120073/13 ; заявл. 19.07.2001.
96. Пат. 2212891, МПК А61К35/70, А61РЗЗ/00. Антипаразитарный препарат с иммуномодулирующими свойствами / В. А. Юркив и др.. — № 2001120073/13 ; заявл. 19.07.2001.
97. Савченков, С. Н. Некоторые особенности технологии получения авермектинов / С. Н. Савченков, М. Н. Мирзаев, Д. А. Девришев // Биотехнология. 1997. - № 3. - С. 35-38.
98. Пат. 2221870, МПК C12N/06, C12N/14, С12Р1/06. Мумбаистатин, способ его получения и его применения в качестве фармацевтического препарата / Н. В. С. Рамакришна и др.. № 2001102052/13 ; заявл. 15.06.1999.
99. Влияние некоторых свободных аминокислот в составе»посевной среды на соотношение компонентов А и В в авермектиновом комплексе, синтезируемом штаммом Streptomyces avermitilis / А. В. Сергеева и др. // Биотехнология. 2002. - № 5. - С. 41-48.
100. Jacobsen, В. J. Biological and cultural plant disease controls: alternatives and supplements to chemicals in IPM systems / B. J. Jacobsen, A. Backman // Plant disease. 1993. - Vol. 77, № 3. - C. 311-315.
101. Экология сельского хозяйства Электронный ресурс. Электрон, дан. -Режим доступа: www.agro-inform.ru.
102. Соколов, М. С. Экологизация защиты растений / М. С. Соколов, О. А. Монастырский, Э. А. Покушова ; под ред. В. А. Захаренко. Пущино, 1994.-462 с.
103. Dowling, D. Metabolites of Pseudomonas involved in the biocontrol plant diseases / D. Dowling, F. O'Gara // Trends biotechnology. — 1994. Vol. 12, № 4. — P. 133-141.
104. Испытание новых биопрепаратов в борьбе с фузариозом колоса / И. И. Новикова и др. // Микология и фитопатология. 1994. - Т. 28, вып. 1. -С. 70-75.
105. Тихонович, И. А. Создание высокоэффективных микробно-растительных систем / И. А. Тихонович // С.-х. биология. Сер. биология растений. -2000.-№ 1.-С. 28-33.
106. Blevins, W. Т. Comparative physiology of geosmin production by Streptomvces halsledi and Anabaena sp. / W. T. Blevins, К. K. Schrader, I. Saadoun// Water Sci Technol. 1995. - Vol. 31. - P. 127-133.
107. Chanway, C. P. Ecological growth response specificity of two Douglas fir ecotypes inoculated with coexistent beneficial rhizosphere bacteria / C. P. Chanway, F. B. Holl // Canadian jornal of botany. - 1994. - Vol. 72, № 5. -P. 582-586.
108. Harish, S. Fusarium udum is resistant to the mycolytic activities of a biocontrol strains of Bacillus subtilis AF1 / S. Harish, K. Manjula, A. R. Podile // FEMS microbiology ecology. 1998. - Vol. 25. - P. 385-390.
109. Phal, C. Expression of the suppressive effect of Bacillus subtilis on phytopathogenes in inoculated compost / C. Phal, M. Shoda // J. ferments and bioengeneering. 1990. - Vol. 70, № 6. - P. 409-414.
110. Introduction of integrated pest management in nurseries in the Czech Republic / Z. Prochazkova et al. // Diseases and insects in forest nurseries : proceedings of the third meeting of IUFRO working party, Florida, USA. — Florida, 1997.-P. 74-85.
111. Shishido, M. Effect of plant growth promoting Bacillus strains on pine and spruce seedling growth and mycorrhizal infection / M. Shishido, H. B. Massicotte // Ann. bot. (USA). 1996. - Vol. 77, № 5. - P. 433-441.
112. Ikotun, T. Inhibition of growth of some plants pathogenic fungi by some antagonistic microorganisms isolated from soil / T. Ikotun, F. Adekunle // Journal of basic microbiology. 1990. - Vol. 30, № 2. - P. 95-98.
113. Эффективность действия Trichoderma asperellum G. Samuels штамм МГ-97 на развитие фузариоза на сеянцах Larix sibirica L. / Т. И. Громовых и др. II Микология и фитопатология. — 2002. Т. 36, вып. 4. - С. 70-75.
114. Методы выделения, изучения и культивирования микроорганизмов : учеб. пособие / Т. И. Громовых и др.. Красноярск : КрасГУ, 2006. -160 с.
115. Маттис, Г. Я. Биологический метод борьбы с фузариозом сеянцев / Г. Я. Матгис, А. П. Баданов // Лесн. хоз-во. 1973 - № 3 - С. 58-60.
116. Зенова, Г. М. Актиномицеты — стимуляторы и ингибиторы роста растений / Г. М. Зенова // Микроорганизмы стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных : тез. докл. Всесоюз. конф. — Ташкент, 1989. - С. 76.
117. Introduction of integrated pest management in nurseries in the Czech Republic / Z. Prochazkova et al. // Diseases and insects in forest nurseries : proceedings of the third meeting of IUFRO working party, Florida, USA. -Florida, 1997.-P. 74-85.
118. Бирюков, В. В. Основы промышленной биотехнологии / В. В. Бирюков. -М. : КолосС, 2004.-296 с.
119. Растимешина, И. О. Стимуляция прорастания семян огурцов метаболитами актиномицетов / И. О. Растимешина, Р. Г. Перевалов, С. А. Бурцева // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке : междунар. науч.-практ. конф. -М., 2000. С. 180-181.
120. Бурцева, С. А. Перспективы применения метаболитов актиномицетов для предпосевной обработки семян / С. А. Бурцева, А. Ф. Тодераш, И. О. Растимешина // Регуляторы роста и развития растений : IV Междунар. науч.-практ. конф. -М., 1997. С. 157.
121. Гринько, Н. Н. Экологически безопасная система / Н. Н. Гринько, В. С. Тарасенко, Т. В. Стрижак // Защита и карантин растений. — 1996. № 1. — С. 42-43.
122. Чормонова, Н. Т. Поиск антагонистов среди актиномицетов рода АсИпотаёига / Н. Т. Чормонова // Тезисы VI съезда ВМО. Рига, 1990. — Т. 1.-С. 19.
123. Пат. 2070799, МПК А0Ш63/02. Препарат для борьбы с комплексом вредителей растений «Фитоверм» / Е. Б. Кругляк и др.. № 93047557/13 ; заявл. 08.10.1993.
124. Аскарова, С. Актиномицеты антагонисты фитопатогенных микроорганизмов и. их роль в устойчивости хлопчатника к вертициллезному вилту : автореф. дис. д-ра биол. наук / С. Аскарова. — Ташкент, 1970. - 45 с.
125. Аскарова, С. А. Изучение актиномицетов-антагонистов в борьбе с вилтом хлопчатника / С. А. Аскарова // Материалы Всесоюзного симпозиума по борьбе с вилтом хлопчатника. Ташкент, 1964.
126. А.с. СССР № 1042.349. Штамм Б^^отусез griseoruber 3-79 №314 продуцент антибиотика для борьбы со слизистым бактериозом капусты / К. А. Тулемисова, Е. Ф. Игина, Е. Т. Никитина ; АН КазССР. Ин-т микробиологии и вирусологии, заявл. 16.05.1983. - 8 с.
127. Пат. 226214, МПК С12Ш/20, А0Ш63/00. Штамм актиномицета 81гер1отусез сИгузотаНш Р-21 для получения биопрепаратаполифункционального действия / И. И. Новикова, И. В. Бойкова. № 2002117842/13 ;заявл. 02.07.2002.
128. Gilpin, М. L.New quinone antibiotics of the granaticin type, isolated from Streptomyces lateritius. II. Structure determination / M. L. Gilpin, S. J. Box, A. L. Elson // J. Antibiot (Tokyo). 1988. - Apr. 41(4). - P. 512-518.
129. Naphto- and anthraquinones of Streptomyces thermoviolaceusWR-141 / J. St. Pyrek, O. Achmatowicz, A. Zamojski. // Structures ands model syntheses. Tetrahedron. 1977. - Vol. 33, № 6. -P: 673-680.
130. Snipes, С. E. Biosynthesis of the antibiotic granaticin / С. E. Snipes, C. J'. Chang, H. G. Floss // J. Am. Chem. Soc. 1979. - Vol.- 101. - P. 701-706.
131. Microbial-products. II. Granaticinic acid, a new antibiotic from a thermophilic streptomycete / Hubert Maehr et al. // Chemical1 Monthly. 1979. - Vol. 110, №3.-P. 531-540.
132. Fleck, W. F. Naphthoquinone antibiotics from Streptomyces lateritius. I Fermentation, isolation and characterization of granatomycins A, C, and D. / W. F. Fleck, D. G. Strauss, H. Z. Prauser // Allg Mikrobiol. 1980. - Vol. 20 (9).-P. 543-551.
133. Production of'hybrid' antibiotics by genetic engineering / D. A. Hopwood et al. //Nature. 1985. - Vol. 314. - P. 642-649.
134. Dobson, L. F. Antagonistic effect of divalent cations Ca2+ and Mg2+ on the morphological development of Streptomyces hygroscopicus var. geldanus / L. F. Dobson, D. G. O'Shea//Applied Microbiology and Biotechnology. -2008. -Vol. 81, № l.-P. 119-126.
135. Биологические особенности нового штамма Streptomyces lateritius 19/97-М, перспективного для использования в растениеводстве / Т. И. Громовых и др. // Биотехнология. 2005. - № 5. — С. 37-40.s
136. Ростстимулирующая активность штаммов рода Streptomyces lateritius и Trichoderma и перспективы их использования для микроклонального размножения хвойных / И. Н. Третьякова и др. // Биотехнология. — 2009.-№ 1.-С. 39-41.
137. Ведерников, Н. М. Интегрированная система выращивания и защиты сеянцев хвойных и лиственных пород от болезней / Н. М. Ведерников, Н. С. Федорова // Лесн. хоз-во. 1997. - № 3. - С. 35-37.
138. Мейнел, Дж. Экспериментальная микробиология (теория и практика) / Дж. Мейнел, Э. Мейнел. -М.: Мир, 1967. 347 с.
139. Головлева, Л. А. Биохимия разложения лигнина микроорганизмами / Л. А. Головлева, О. В. Мальцева // Проблемы биоконверсии растительного сырья. -М. : Наука, 1986. С. 295.
140. Гринько, Н. Н. Биотехнологические аспекты культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai ВКМ F-2477 Д / Н. Н. Гринько // Вестн. Рос. акад. с.-х. наук. 2004. - № 1. - С. 56-60.
141. Lewis, J. A. Integrated control of Rhizoctonia fruit rot of cucumber / J. A. Lewis, С. C. Papavizas // Phytopathology. 1980. - Vol. 70. - P. 85-89:
142. Mukhopadhyay, A. N. Trichoderma harzianum a potential biocontrol agent for tobacco damping-off / A. N. Mukhopadhyay, A. Brahmbahtt, G. J. Patel // Tobacco Research. - 1986. - Vol. 12, № 1. - P. 26-35.
143. Enhancing the sporulation of Streptomyces kasugaensis by culture optimization / Won-Bok Chae et al. // Korean Journal of Chemical Engineering. 2009. - Vol. 26, № 2. - P. 438-443.
144. Vargas, Gil S. Quantitative isolation of biocontrol agents Trichoderma spp., Gliocladium spp. and actinomycetes from soil with culture media / Gil S. Vargas, S. Pastor, G. J. March // Microbiol Research. 2006. - P. 1-10.
145. Effect of liquid culture requirements on antifungal antibiotic production by Streptomyces rimosus MY02 / Jicheng Yu et al. // Bioresource Technology. 2008. - № 99. - P." 2087-2091.
146. Оптимизация биосинтеза литических ферментов термотолерантным актиномицетом Streptomyces griseinus 11-84 / H. Т. Петрова и» др. // Биотехнология. 2002. - № 1. - С. 28-35.
147. Optimized growth medium for elastase synthesis by strain Strepyomyces sp. 82 / Vania Georeva, Stoyan Vlahov // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2001. - № 17. - P. 443-445.
148. Dionigi, C. P. Effects of temperature and oxygen concentration on geosmin production by Slreplomyees tendae and, Pénicillium expansum / C. P. Dionigi, D. A. Ingram // J Agric. Food Cham. 1994. - Vol. 42. - P. 143-145.
149. Durham, D. R. Environmental factors affecting the production of geosmin, an earthy musty odorous metabolite produced by aquatic actinomycetes. Master's thesis. Auburn University, 1975.
150. Dionigi, C. P. Effects of several metals on spore, biomass, and geosmin production by Streptomvces tendae and Pénicillium expansum / C. P. Dionigi, T. S Ahten, L. H. Wartelle // J. md Microbiol. 1996. - Vol. 17. - P. 84-88.
151. Optimization of actinomycin V production by Streptomyces triostinicus using artificial neural network and genetic algorithm / Vineeta Singh et al. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2009. - Vol. 82, № 2. - P. 379385.
152. Production and optimization of thermophilic alkaline protease in solid-state fermentation by Streptomyces sp. CN902 / Hadeer Lazim et al. // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2009. - Vol. 36, № 4. - P. 531537.
153. Пат. 2111251, МПК C12N1/20, С12Р19/54. Ферментационная среда: для биосинтеза стрептомицина штаммом Streptomyces griseus / С. Е. Горин,
154. Н. А. Колесникова.-№ 95122324/13 ; заявл: 27.1211995:
155. The effect of space flight on. the: production of actinomycin D by Streptomyces plicatus / K. S. Lam и др. // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology.- 2002. № 29. - P. 299-302.
156. Семенов; С. M. Лабораторные среды для актиномицетов ■ и грибов : справочник/ С. М; Семенов: М. : Агропромиздат, 1990;-240 с.
157. Отмахова, 3. И. Оптические методы анализа : учеб. пособие / 3. И; Отмахова; Н. Ш Слезко. Томск : Изд-во гос. ун-та, 1980. - 54 с.
158. Гродзинский, A. Mi Краткий справочник по физиологии растений / А. М. Гродзинский, Д. Mi Гродзинский. — 2-е изд. Киев : Наук. Думка, 1973. -592 с.
159. Кобзарь, А. И. Прикладная математическая статистика : для инженеров'и научных работников / А. И. Кобзарь. М. : Физматлит, 2006. - 816 с.
160. Звягинцев, Д. Г. Методы почвенной микробиологии) и биохимии / Д. Г. Звягинцев. М. : МГУ, 1990. -303 с. .
161. Сэги, И. Методы почвенной микробиологии / Й. Сэги. М. : Колос, 1983:
162. West, T. P. Effect of temperature on bacterial gellan production / T. P. West // World Journal' of Microbiology and Biotechnology. 2003. - №19. - P. 649652.
163. Головлев, E. JI. Твердофазная ферментация растительного сырья / Е. JI. Головлев, JT. А. Головлева // Микробиология! и биохимия разложения растительных материалов. -М. : Наука, 1983, -С. 301-332.
164. Влияние грибов рода Trichoderma на состав одубины коры хвойныхпород / Т. В. Рязанова и др. // Вестник СибГТУ. 2000. - № 1. - С. 99i103.
165. Красильников, Н. А. Микробы, стимулирующие рост растения / Н. А. Красильников // Вестн. с.-х. наук. 1958. - № 7. - С. 52-62.
166. Шкаликов, В. А. Обработка семян биопрепаратами и микробные ценозы почвы / В. А. Шкаликов, В. А. Шильникова, М. Аль-Афанди // Защита растений. 1994. - № 12. - С. 18.
167. Ушанова, В. М. Основы научных исследований, исследование химического состава растительного сырья / В. М. Ушанова, О. И. Лебедева, А. И. Девятловская // Вестн. СибГТУ. 2004. - Ч. 3. - 360 с.
168. СанПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов
169. Berdy J., Handbook of antibiotic compounds / J. Berdy, A. Aszalos, M. Bostian, K. L. McNitt // CRC Inc. 1980. - Vol. III.
170. Матренина, P. M. Микроорганизмы ускорители грунтовой всхожести семян хвойных / Р. М. Матренина, С. В. Хижняк, А. П. Витальев //
171. Микроорганизмы как объект лесного мониторинга. Красноярск : ИлиД, 1986.-С. 108-117.
172. Платонова, Ю. В. Видовой состав грибов рода Fusarium, встречающихся на зерновых культурах Красноярского края / Ю. В. Платонова, Е. И. Сорокатая. Красноярск : КрасГАУ, 2008. - 129 с.
173. Алимова Ф.К. Биотехнология. Промышленное применение грибов рода Trichoderma: учеб. пособие / Ф.К. Алимова и др. Казань. : Казанский государственный университетет, 2007. - 230 с.
174. Промышленная микробиология : учеб. пособие / под ред. Н.С. Егорова. -М. : Высш. Шк., 1989. 688 е.: ил.
175. Тулемисова, К. А. Микробиологические методы защиты растений / К. А.
176. Тулемисова // Вестн. АН КазССР. 1990. - С. 36.i
177. Demain, A. L. New application of microbial products / A. L. Demain // Science. 1983. -Vol. 219, № 4585. - P. 709-714.
178. Оразова, M. X. Гетерогенность корня как местообитания микроорганизмов / M. X. Оразова, Л. М. Полянская, Д. Г. Звягинцев // Микробиология. 1994. - Т. 63, № 4.- С. 706-713.
179. Tanvonen, R. Preliminare experiments into the use of Streptomyces spp. Isolated from peat in the biological control peat culture / R. Tanvonen // Scient. Agr. Finland. 1982. - Vol. 54, № 5. - P. 357-369.
180. Альтергот, В. Ф. Тепловые повреждения пшеницы в условиях достаточного увлажнения / В. Ф. Альтергот, С. С. Мордкович. -Новосибирск : Наука, 1977. 120 с.
181. Чулкина, В. А. Корневые гнили хлебных злаков в Сибири / В. А. Чулкина. Новосибирск : Наука, СО, 1985.
-
Гайдашева, Ирина Игоревна
-
кандидата биологических наук
-
Красноярск, 2011
-
ВАК 03.01.06
- Внеклеточная L-глутаматоксидаза
- Разработка технологических аспектов культивирования штаммов Streptomyces fradiae - продуцентов ветеринарного антибиотика тилозина
- Образование, секреция и экстрацеллюлярная деградация кофермента А у актиномицета Streptomyces lavendulae
- Продуцент ингибитора А-глюкозидаз, стабилизация его ингибиторной активности и изучение условий биосинтеза
- Биологическое обоснование создания биопрепаратов, эффективных в отношении фузариозных заболеваний сельскохозяйственных культур
