Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внеклеточная L-глутаматоксидаза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сухачева, Марина Владимировна

Страницы

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Общая характеристика стрептомицетов.

Глава 2. Внеклеточные ферменты микроорганизмов.

Глава 3. Использование ферментов микробного происхождения в промышленности и медицине.

Глава 4. Оксидазы L-аминокислот: их свойства и перспективы практического применения.

4.1. L-глутаматоксидаза: ее свойства и перспективы практического применения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 5. Материалы и методы исследования.

5.1. Объекты исследования.

5.2. Отбор штаммов-продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы.

5.3. Культивирование штаммов-продуцентов.

5.4. Изучение морфологических, хемотаксономических и культуральных признаков выделенных штаммов-продуцентов.

5.5. Мутагенез природного штамма-продуцента.

5.6. Изучение влияния ионов кальция на секрецию внеклеточной L-глутаматоксидазы.

5.7. Определение активности глутаматоксидазы.

5.8. Определение биомассы стрептомицета

5.9. Изучение биохимических свойств глутаматоксидазы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 6. Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов-продуцентов.

6.1. Морфолого-культуральные свойства выделенных штаммов.

6.2. Физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов.

Глава 7. Повышение биосинтетической активности природного штаммапродуцента Streptomyces sp. Z-l 1.

7.1. Оптимизация состава среды и условий культивирования природного штамма-продуцента Streptomyces sp. Z-l I.

7.2. Влияние ионов кальция на секрецию внеклеточной L-глутамат-оксидазы Streptomyces sp. Z-l 1.

7.3. Индуцированный мутагенез природного штамма-продуцента.

7.3.1. Естественная изменчивость Streptomyces sp. Z-l 1.

7.3.2. Индуцированная мутагеном изменчивость природного штамма Streptomyces sp. Z-l 1.

Глава 8. Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства мутантного штамма Streptomyces sp. Z-l 1-6.

8.1. Морфолого-культуральные свойства Streptomyces sp. Z-l 1-6.

8.2. Физиолого-биохимические свойства Streptomyces sp. Z-l 1-6.

Глава 9. Выделение и очистка внеклеточной L-глутаматоксидазы

Streptomyces sp. Z-11 —6.

Глава 10. Свойства внеклеточной L-глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6.

10.1. Стехиометрия реакции.

10.2. Определение простетической группы глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6.

10.3. Определение молекулярной массы глутаматоксидазы

Streptomyces sp. Z-l 1-6.

10.4. Субстратная специфичность внеклеточной L-глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6.

10.5. Биохимические свойства внеклеточной L-глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6.

Глава И. Перспективы практического применения внеклеточной

L-глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внеклеточная L-глутаматоксидаза"

Создание высокочувствительных тест-систем для медицинской диагностики, контроля технологических процессов и охраны окружающей среды является одним из актуальных направлений биотехнологии. В последние годы особый интерес для промышленности и медицинской практики представляют оксидазы L-аминокислот, особенно — L-глутаматоксидаза.

L-глутаматоксидаза (КФ 1.4.3.11) — фермент, который специфично катализирует реакцию окислительного дезаминирования L-глутамата в присутствии воды и кислорода с образованием а-кетоглутарата, аммиака и перекиси водорода. Образующаяся в процессе реакции перекись водорода может быть легко обнаружена с помощью хромогенной пероксидазной реакции, что делает возможным как использование фермента в качестве аналитического реагента, так и создание на его основе биосенсоров и ферментных анализаторов для определения L-глутамата, L-глутамина, креатинина и аммиака (Kusakabe et al., 1986,1989; Murachi a. Tabata, 1987,1990; Wollenberg et al., 1988,1989a, b; Passarge et al., 1989; Pfeiffer et al., 1990; Yao et al., 1990; Vahjen et al., 1991; Dremel et al., 1991; Hale et al., 1991; Chen a. Su, 1991; Suleiman et al., 1992; Botre et al., 1992, 1993; Blankenstein et al., 1993; Rui et al., 1993,1995; Ie et al., 1994; Li et al., 1994; White et al., 1994; Stalikas et al., 1994; Ryan et al., 1997; Valero a. Garcia-Carmona, 1998). Это открывает широкие возможности в аналитической химии для качественной и количественной оценки ферментативных процессов.

Известно, что для усиления вкусовых качеств продуктов питания и сохранения их при консервировании или замораживании в качестве пищевой добавки применяют глутамат. Поэтому глутаматоксидазу можно с успехом применять в пищевой промышленности для оценки качества пищевых продуктов и осуществления контроля над производством соусов и бульонных концентратов (Kusakabe a. Midorikawa, 1986; Kusakabe et al., 1989; Male et al., 1993; Moges a. Johansson, 1994).

Особенно важно применение глутаматоксидазы в фундаментальной и клинической медицине, например для ранней диагностики заболеваний сердца. Установлено, что при ишемической болезни сердца и инфаркте миокарда из поврежденных клеток миокарда или из клеток, испытывающих недостаток кислорода, в кровоток попадают аланин-трансаминаза (глутамат-пируват-трансаминаза, КФ 2.6.1.2) и аспартат-трансаминаза (глутамат-оксалоацетат-трансаминаза, КФ 2.6.1.1, Меньшиков, 1987). Определение в крови активности этих трансаминаз может дать ценную информацию о степени тяжести и о стадии повреждения сердечной мышцы (Kamei et al., 1986; Kusakabe a. Midorikawa, 1986; Schubert et al., 1987; Murachi a. Tabata, 1988; Kusakabe et al., 1989; Guntherberg et al., 1989; Cooper et al., 1991; Thomas, 1995; Moser et al., 1995, 1997). Определение в крови активности аланин-трансаминазы имеет большую диагностическую ценность при заболевании печени и позволяет осуществлять раннюю диагностику острого гепатита. Обнаружено, что это заболевание сопровождается резким повышением в крови уровня аланин-трансаминазы, при этом процесс начинается еще в продромальный период (период предвестников), когда первые клинические признаки данного заболевания только начинают выявляться (Меньшиков, 1987). Определение в крови активности аспартат-трансаминазы может служить источником важной информации при целом ряде мышечных и инфекционных заболеваний, а также при заболеваниях нервной системы. Установлено, что повышенное содержание аспартат-трансаминазы (при нормальном уровне аланин-трансаминазы) наблюдается у людей, страдающих инфекционным монокулезом, мышечной дистрофией, дермато-миозитом, инсулярной гипогликемией (Cooper et al., 1991; Villarta et al., 1991).

Известно, что основными продуцентами глутаматоксидазы являются микроорганизмы, относящиеся к группе актиномицетов, а именно — к стрептоми-цетам (Kamei et al., 1983, 1985; Kusakabe et al., 1983 a, b; Ishikawa et al., 1986; Passarge et al., 1986; Bohmer et al., 1989; Xu a. Li, 1993; Li a. Zhong, 1996; Li et al., 1996, 1997; Додзин и др., 1998; Виноградова, 1999а).

Производство этого фермента с использованием стрептомицетов в качестве продуцентов, способствовало началу широкого применения глутаматоксидазы на практике в ряде стран. Однако в России этот фермент до сих пор не производится. Поэтому поиск продуцентов L-глутаматоксидазы и разработка эффективных способов ее получения являются актуальными. Особенно перспективны в качестве продуцентов глутаматоксидазы микроорганизмы, способные к секреции этого фермента в среду, что облегчает операции по экстракции и очистке фермента, делая процесс производства экономически выгодным.

Цель настоящей работы заключалась в поиске и выделении из разных мест обитания активных продуцентов внеклеточной L-глутаматоксидазы, относящихся к группе стрептомицетов, получении и очистке фермента, а также изучении его свойств для оценки целесообразности применения этого фермента на практике.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Найти и выделить активные штаммы-продуценты внеклеточной L-глутама-токсидазы и изучить их морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства в целях идентификации.

2. Изучить условия образования глутаматоксидазы выделенными штаммами.

3. Оптимизировать состав среды и условия культивирования штамма-продуцента с целью повышения биосинтетической активности культуры.

4. Увеличить выход фермента, применив мутационно-селекционный подход.

5. Разработать схему выделения и очистки L-глутаматоксидазы.

6. Изучить свойства очищенного фермента.

7. Рассмотреть перспективы использования данного фермента на практике.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВМ — воздушный мицелий

СМ — субстратный мицелий

РП — растворимый пигмент

ДЕАЕ-целлюлоза — диэтиламиноэтил целлюлоза

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

НЭМ — н-этилмалеимид

ПХМБ — п-хлормеркурибензоат

ДДТК — диэтилдитиокарбамат Na

ДДС-Na — додецилсульфат натрия

ТХУ — трихлоруксусная кислота

МБТГ — З-метил-2-бензотиазолон-гидрохлорид

L-ДАПк — L-диаминопимелиновая кислота

ПААГ — полиакриламидный гель

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Общая характеристика стрептомицетов.

Одну из самых обширных надродовых групп актиномицетов образуют стрептомицеты (Bergey's Manual, 1989; Зенова, 1997). Это мицелиальные эубактерии, ветвящиеся гифы которых формируют, как правило, стабильный мицелий, хотя у некоторых представителей (род Intrasporangium) мицелий имеет тенденцию распадаться на различные по величине и форме фрагменты (Когп-Wendisch a. Kutzner, 1992; Зенова, 1997). Исследование олигонуклеотидного состава 16S РНК актиномицетов, и в частности стрептомицетов, показало, что они относятся к одной из ветвей филетической линии Грам-положительных бактерий, представители которой отличаются высоким содержанием (выше 55 мол.%) ГЦ-пар в молекуле ДНК (Korn-Wendisch a. Kutzner, 1992; Зенова, 1997).

Согласно Определителю бактерий Берджи (Bergey's Manual, 1989; Зенова, 1997) в группу стрептомицетов входит род Streptomyces с несколькими близкими родами — Intrasporangium, Sporichthya, Streptoverticillium, Kineosporia.

Клетки стрептомицетов Грам-положительны, хотя реакция по Граму может изменяться с возрастом культуры, и на отдельных стадиях развития клетки могут окрашиваться Грам-отрицательно, как, например, у представителей рода Sporichthya. Клеточная стенка стрептомицетов, как и всех Грам-положительных бактерий, состоит из пептидогликана, тейхоевых кислот и полисахаридов, которые с помощью ковалентных связей образуют сложную структуру с весьма упорядоченной пространственной организацией. Стрептомицеты — это гетерогенная группа, для всех таксонов которой характерны клеточные стенки

I типа, на что указывает присутствие в составе пептидогликана клеточной стенки L-ДАПк и глицина в межпептидном мостике, а также отсутствие основных диагностических Сахаров, определяемых обычно в гидролизатах целых клеток (Lechevalier et al., 1970). Толщина клеточной стенки может значительно варьировать от 100 до 250 А и более. Иногда в ней выделяют 2-3 слоя различной электронной плотности (Locci, 1989; Korn-Wendisch a. Kutzner, 1992).

Стрептомицеты — это в основном аэробные микроорганизмы, хотя встречаются и факультативные анаэробы, например Sporichthya polymorpha (Korn-Wendisch a. Kutzner, 1992; Зенова, 1997).

В большинстве своем это микроорганизмы с хемоорганотрофным типом питания. В качестве источника углерода и энергии стрептомицеты используют разнообразные органические соединения, в том числе и сложные полимеры. Среди них выделяют группы с различными требованиями к источникам питания. Большинство стрептомицетов в лабораторных условиях растут на простых по составу средах. Однако представители рода Intrasporangium предпочитают среды сложного состава, особенно — содержащие пептон и дрожжевой экстракт, и не растут на большинстве синтетических и полусинтетических сред, традиционно используемых для культивирования актиномицетов (Korn-Wendisch a. Kutzner, 1992; Зенова, 1997). У некоторых стрептомицетов обнаружена способность к олигокарбофилии, т. е. к росту на так называемом "голодном" агаре или средах с низким содержанием питательных веществ. Способность к олиготрофному росту некоторые авторы рассматривают как преимущество, которое получают стрептомицеты в конкуренции с быстрорастущими бактериями (Калакуцкий и Агре, 1977; Зенова, 1992). Некоторые представители родов Streptomyces и Streptoverticillium восстановливают нитраты до нитритов и участвуют в образовании сероводорода (Зенова, 1997). Среди стрептомицетов найдены свободноживущие хемолитоавтотрофы, способные к азотфиксации (Gadkari et al., 1992; Ribbe et al., 1997).

Среди биохимических особенностей стрептомицетов следует отметить наличие у них метаболитических путей и ферментных систем, редких для других микроорганизмов. Например, у стрептомицетов обнаружена полифосфатгексо-киназа, которая в отличие от обычной гексокиназы катализирует реакцию образования глюкозо-6-фосфата при участии полифосфатов, а не АТФ. Расщепление глюкозы протекает по пути Энтнера-Дудорова, который встречается у Грам-отрицательных бактерий и отсутствует у большинства Грам-положительных эубактерий. Некоторые особенности обнаружены во вторичном метаболизме стрептомицетов, например, шикиматный путь синтеза ароматических соединений, или включение интактных углеродных скелетов во вторичные метаболиты (Зенова, 1992).

Большинство стрептомицетов — мезофилы, у которых оптимальной температурой для роста и спорообразования является 22 - 35°С, хотя в природе встречаются психрофильные (Locci, 1989) и термофильные виды (Gadkari et al., 1992; Ribbe et al., 1997).

Оптимальные значения pH среды для роста подавляющего большинства стрептомицетов лежат в диапазоне 6,5 - 8,0 (Зенова, 1997).

Как правило, стрептомицеты - организмы со сложным жизненным циклом, включающим стадии вегетативного роста и спорообразования. Рост, развитие и старение культур сопровождается структурными изменениями постоянных клеточных компонентов, а в ряде случаев и появлением в вегетативных клетках новых структур, т.е. дифференциацией мицелия. На плотных средах сs&tZ QJ)^ п / с

Л^а^о Cf 7 ^ A

C/f c^^fzj^.гул дифференциация мицелия у стрептомицетов проявляется в разделении его на первичный (субстратный) и вторичный (воздушный). Субстратный мицелий (0,5-2,0 мкм в диаметре), как правило, более разветвлен, причем точки ветвления носят случайный характер, т. е. на любом месте поверхности мицелия может вырасти новая гифа. Воздушный мицелий обычно несколько (на 0,2-0,4 мкм) толще субстратного и обладает ярко выраженными гидрофобными свойствами (Зенова, 1992; 1997). Дифференциация мицелия у стрептомицетов проявляется и в формировании ими различных по морфологии колоний при росте на плотных питательных средах. Так, стрептомицеты, мицелий которых имеет тенденцию к фрагментированию, образуют гладкие или шероховатые, пастообразные, не врастающие в агар колонии, часто лишенные воздушного мицелия. Споровые же стрептомицеты на поверхности плотной среды образуют обычно небольшие, плотные, кожистые или маслянистые, врастающие в субстрат колонии, поверхность которых, как правило, покрыта мучнистым, бархатистым или пушистым воздушным мицелием. У некоторых стрептомицетов воздушный мицелий может быть слабо развит или полностью отсутствовать, как, например, у представителей родов Intrasporangium и Kineosporia (Зенова, 1997).

Способность стрептомицетов к клеточной дифференциации наиболее ярко проявляется в строении их репродуктивных структур - спор, хотя некоторые виды (род Intrasporangium) истинных спор не образуют. Интеркалярно или на кончиках гиф субстратного мицелия у них формируются везикулы, некоторые из которых в старых культурах содержат спороподобные клетки (Зенова, 1997). За исключением представителей рода Sporichthya, у которых споры образуются в результате разделения воздушного мицелия, споровые стрептомицеты в большинстве своем формируют специализированные и сложные репродуктивные структуры. На специальных спороносящих гифах, отходящих от стерильных гиф воздушного мицелия моноподиально или в виде пучков, у них формируются цепочки из 3 или большего числа спор. Цепочки спор могут быть прямыми, волнистыми или спиральными, причем последние имеют форму от крючков до хорошо развитых спиралей с 8 - 10 оборотами (Гаузе и др., 1983). Стенки спор стрептомицетов покрыты оболочкой, которая ответственна за конфигурацию поверхности споры и может быть гладкой, бородавчатой, покрытой шипами или волосками (Атлас спор, 1970).

В жидких средах стрептомицеты могут образовывать глубинные споры. Структурные преобразования спорулирующих гиф отличаются от таковых вегетативных клеток и сводятся к утолщению клеточных стенок (более 400 А), уплотнению внутреннего содержимого и формированию множественных септ по длине гифы. Разделение глубинных спор происходит путем растворения внутреннего слоя, соединяющего стенки двух соседних спор (Куимова, 1984).

Существует мнение, что, по сравнению с другими микроорганизмами, стрептомицеты более устойчивы к высушиванию. Обнаружено, что лабораторное хранение почвенных образцов в условиях, не способствующих вегетативному росту, приводит к значительному увеличению количества стрептомицетов по сравнению с другими бактериями. Экзоспоры некоторых стрептомицетов могут сохранять жизнеспособность в течение длительного времени при aw = 0,45 - 0,80. Однако вегетативный рост их был обнаружен только при активности воды не менее 0,95 (Зенова, 1992,1997).

Некоторые стрептомицеты устойчивы к антибактериальным антибиотикам, и это их свойство используют на практике для селективного выделения этих микроорганизмов из почвы. По сравнению с другими бактериями стрептомицеты более устойчивы к действию многих фумигантов и инсектицидов (Зенова, 1992).

Стрептомицеты широко распространены в природе. Комбинации имеющихся в наличии источников питания и факторов окружающей среды в ряде случаев создают оптимальные условия для их преимущественного развития в природных, или создаваемых человеком, экологических нишах (Зенова и Кураков, 1988). Стрептомицеты служат неотъемлемой частью микробного комплекса почвы — природного субстрата, где они представлены в наибольшем количестве и разнообразии (Калакуцкий и Зенова, 1984; Полянская и Звягинцев, 1984; Зенова, 1992). Основную часть бактерий, вырастающих при высеве из разведений почвенных суспензий на чашках с традиционно используемым казеин-глицериновым агаром, составляют, как правило, стрептомицеты, относящиеся к родам Streptomyces и Sireploverticillium (Звягинцев, 1987; Зенова и Кураков, 1988; Зенова, 1992). Стрептомицетам отводится главная роль в образовании альгобактериальных ценозов на выходах карбонатных пород (Зенова и др., 1988; Калакуцкая, 1992). Среди них встречаются виды, патогенные для растений и животных (Korn-Wendisch a. Kutzner, 1992).

Стрептомицеты характеризуются небольшой скоростью роста. Локальное развитие и значительное количественное увеличение их числа наблюдается тогда, когда создаются условия для использования сравнительно труднодоступных субстратов (Зенова и Кураков, 1988; Кожевин, 1989). Установлено, что интенсивное развитие стрептомицетов происходит в природных, или близких к ним, условиях при внесении в почву крахмала, лигнина, гумата или хитина (Калакуцкий и Зенова, 1984). Деятельность стрептомицетов в почве связывают с синтезом и разложением гумусовых веществ, азотным балансом почвы, а также с продукцией антибиотических веществ (Шлегель, 1987; Kora-Wendisch a. Kutzner, 1992).

Среди основных факторов, лимитирующих развитие стрептомицетов в природных условиях, могут быть названы кислотность среды, относительная влажность, температура, доступность питательных веществ и кислорода, а также биологические факторы, например, конкурентоспособность или симбиотические отношения (Полянская и Звягинцев, 1984; Зенова, 1992).

Таким образом, стрептомицеты, основная роль которых проявляется в разложении трудноусваиваемых соединений, представляют собой единое звено в трофической цепи любой экосистемы, выполняя главную экологическую функцию — гидролитическую. (Зенова, 1992).

Отличительной чертой стрептомицетов является их способность к образованию разнообразных биологически активных веществ. Они синтезируют значительное число антибиотиков, обладающих антибактериальными, противогрибковыми, противоопухолевыми, антипротозойными и антивирусными свойствами, при этом некоторые виды могут синтезировать два и более антибиотиков (Гаузе и др., 1983). Стрептомицеты образуют различные пигменты, которые являются продуктами вторичного метаболизма и обуславливают окраску воздушного и субстратного мицелия, а также и субстрата (Гаузе и др., 1983; Bergey's Manual, 1989; Зенова, 1997).

Среди стрептомицетов найдены и продуценты целого ряда ферментов, многие из которых имеют важное промышленное значение.

Глава 2. Внеклеточные ферменты микроорганизмов.

Круговорот органических веществ в природе осуществляется при участии микроорганизмов (Korn-Wendisch a. Kutzner, 1992; Вавилин и др., 1993). Прокариоты выработали альтернативную эукариотам стратегию ассимиляции пищевых макромолекул. Полимерный материал в среде расщепляется ферментами, выделяемыми клеткой, а низкомолекулярные продукты ассимилируются. Существует мнение, что внеклеточные ферменты в большинстве своем синтезируются микроорганизмами, населяющими почву и участвующими в деструкции органических веществ (Шлегель, 1987; Korn-Wendisch a. Kutzner, 1992; Вавилин и др., 1993). Среди прокариот основными продуцентами внеклеточных ферментов можно назвать представителей родов Bacillus, Clostridium, Cytophaga и актиномицетов, особенно — стрептомицетов.

Так как для большинства внеклеточных ферментов не были найдены внутриклеточные субстраты, было выдвинуто предположение об экзоферментах как "ферментах-мусорщиках", участвующих в расщеплении полимерных материалов в окружающей среде и обеспечивающих тем самым организм необходимыми питательными веществами (Прист, 1987). Однако оказалось, что некоторые внеклеточные ферменты (протеазы и автолизины) имеют внутриклеточные субстраты и участвуют в процессах, связанных с дифференциацией клетки и ростом клеточной стенки, что в свою очередь влияет на регуляцию синтеза этих ферментов (Безбородое, 1991; Glazer a. Nikaido, 1995).

В настоящее время нет четкой терминологии в определении "внеклеточный белок, или фермент". Обобщая существующие определения, можно сказать, что к внеклеточным белкам, в частности ферментам, следует относить все белки, которые секретированы за пределы плазматической мембраны без каких-либо нарушений в ее структуре в процессе нормального роста и развития микроорганизма (Безбородое и Астапович, 1984; Прист, 1987; Безбородое, 1991).

Исходя из современных представлений, секрецию, по-видимому, можно рассматривать как процесс, состоящий из двух стадий — транслокации белковой молекулы через плазматическую мембрану в период синтеза и последующего выделения белка через клеточную стенку в окружающую среду. Следовательно, на каждом из указанных этапов секреция может быть подвержена влиянию различных физико-химических факторов (Безбородов и Астапович, 1984; Безбородов, 1991, 1994). Например, образование фермента может зависеть от условий выращивания данного микроорганизма. Обнаружено, что появление внеклеточных ферментов в среде культивирования в значительной степени определяется ее составом (Безбородов и Астапович, 1984; Li a. Zhong, 1996).

Синтез внеклеточных ферментов обычно осуществляется одним из двух способов. Синтез и секреция могут сопровождать рост и снижаться, когда клетки достигают стационарной фазы. В альтернативном случае ферменты могут синтезироваться в экспоненциальной фазе роста с минимальной скоростью, а в стационарной фазе накапливаться в больших количествах. Эти ситуации представляют собой крайние варианты, которые иногда могут перекрываться (Прист, 1987; Безбородов, 1991; Godfrey a. West, 1996; Bains, 1998).

Различные варианты синтеза внеклеточных ферментов имеют большое значение для их промышленного производства. Так, если белок синтезируется только в стационарной фазе, то можно ожидать, что непрерывные культуры, поддерживаемые в хемостате в состоянии постоянного экспоненциального роста, будут образовывать очень мало продукта или вовсе не будут его синтезировать.

Однако для тех ферментов, которые секретируются в экспоненциальной фазе, хемостат обеспечивает идеальные условия, в которых могут быть достигнуты устойчивые уровни внеклеточного белка (Прист, 1987; Godfrey a. West, 1996; Bains, 1998).

Глава 3. Использование ферментов микробного происхождения в промышленности и медицине.

Ферменты применяли на протяжении веков при дублении колеи и изготовления сыра, в производстве солода для пивоварения и в заквасках для хлеба. В этих процессах ферменты использовали в составе животных и растительных тканей или целых микроорганизмов. Начало промышленного применения ферментов в виде частично очищенных препаратов относится к более позднему периоду и может быть датировано концом прошлого столетия, когда в 1894 году японский ученый, И.Такамине, зарегистрировал первый патент на фермент, синтезируемый Aspergillus oryzae. Такая "такадиастаза" до сих пор используется как средство, способствующее пищеварению (Кретович, 1986; Прист, 1987; Godfrey a. West, 1996).

Ферментные препараты сегодня приобретают все большее значение в качестве средств и реактивов, используемых в биотехнологии. Они применяются как в традиционных биохимических производствах, таких, как хлебопечение, сыроделие, виноделие и т. д., так и в целом ряде новых отраслей технологии, возникших в результате развития биохимии и микробиологии. Ферментные препараты широко используют в научных исследованиях и в медицине (Кретович, 1986; Егоров и др., 1987; Воробьева, 1987; Безбородое, 1994; Glazer a. Nikaido, 1995; Beppu, 1996; Godfrey a. West, 1996; Bains, 1998; Виноградова, 1999b).

Большую часть (90%) производимых сегодня ферментных препаратов составляют гидролазы. Из числа гидролаз в первую очередь следует отметить протеолитические и амилолитические ферменты — первые промышленные биокатализаторы (Безбородов, 1994). Протеолитические ферменты, действие которых заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках и пептидах, нашли широкое применение в мясной промышленности для размягчения мяса. Их с успехом используют при обезволошивании и умягчении кожевенного сырья в кожевенной промышленности, при изготовлении стиральных порошков, в кинопроизводстве при регенерации пленок, в парфюмерии, в сыроварении и хлебопечении (Воробьева, 1987; Егоров и др., 1987; Быков и др., 1987; Godfrey а. West, 1996).

Действие амилолитических ферментов (а- и (3-амилаз, глюкоамилазы) проявляется при гидролизе крахмала и гликогена. Эти ферменты находят широкое применение для получения олигосахаридов, в спиртовой промышленности для гидролиза крахмала при производстве спирта и вин, в пивоварении (для удаления остаточных декстринов из пива) и в хлебопечении (Прист, 1987; Безбородов, 1994).

В изготовлении фруктовых соков хорошие результаты дают препараты пектолитических ферментов. Они значительно повышают выход фруктовых соков (на 15%), делают соки прозрачными, снижают их вязкость и препятствуют образованию студней при концентрировании. Пектолитические ферменты широко используют в текстильной промышленности (при вымачивании льна перед его обработкой) и в виноделии — для осветления вин (Воробьева, 1987; Егоров и др., 1987; Godfrey a. West, 1996; Bains, 1998).

Целлюлолитические ферменты применяют в гидролизной промышленности для получения глюкозы из целлюлозы, в пищевой — для улучшения качества растительных масел, при приготовлении растворимого кофе и улучшения консистенции грибов и овощей, а в животноводстве — в качестве добавки в комбикорма (Кретович, 1986, Егоров и др., 1987; Быков и др., 1987; Воробьева, 1987; Godfrey a. West, 1996).

Липазы используют в пищевой промышленности для придания специфического аромата сыру, шоколаду и молочным продуктам.

Широкое применение на практике находят ферментные препараты оксидоредуктаз. Так, алкоголь: НАД-оксидоредуктазу используют для определения содержания этилового спирта в анализируемых образцах. О-дифенолоксидаза имеет большое значение при производстве черного чая, а липоксигеназу применяют в макаронной промышленности для улучшения качества и цвета готовых макаронных изделий (Кретович, 1986; Воробьева, 1987). Благодаря исключительно высокой специфичности действия глюкозооксидазы ее препараты используют для количественного определения глюкозы, особенно в клинических условиях при определении сахара в крови или моче. В пищевой промышленности глюкозо-оксидазу используют для удаления глюкозы из пищевых продуктов, предназначенных для хранения в высушенном виде, а в сочетании с каталазой — для удаления кислорода из сухого молока, кофе, майонезов, лимонных и апельсиновых соков (Кретович, 1986; Воробьева, 1987; Godfrey a. West, 1996).

Многообразно применение ферментных препаратов и в медицине (Кретович, 1986; Glazer a. Nikaido, 1995; Виноградова, 1999b). Например, протеазы используют для растворения тромбов и удаления катаракт, а также при лечении воспалительных процессов. Для лечения рака применяют препараты L-acnapa-гиназы, которая лишает раковые клетки необходимого для их развития аспарагина (Егоров и др., 1987; Быков и др., 1987). Установлено, что к торможению роста опухолевых заболеваний и увеличению продолжительности жизни приводит исключение лизина из диеты животных с прививаемыми опухолями. Введение в организм таких животных препарата лизиноксидазы открывает перспективную область применения этого фермента в терапии опухолевых заболеваний (Ярошик и Дехтярев, 1995). Препараты холестериноксидазы с успехом используют в терапевтических целях при лечении атеросклероза и определении уровня холестерина в крови (Виестуре и др., 1988; Рачинская, 1990).

Ферментные препараты применяют при лечении наследственных заболеваний, обусловленных дефицитом какого-либо фермента или белкового фактора, например, таких как, болезнь Гоше, при которой организм не способен расщеплять глюкоцереброзиды (Егоров и др., 1987; Godfrey a. West, 1996).

За последние 50 лет общая тенденция выразилась в переходе от животных и растительных источников промышленно важных ферментов к микроорганизмам. Это было обусловлено следующим: 1) микроорганизмы быстро растут и идеально подходят для интенсивного культивирования; 2) для выращивания микроорганизмов используют, как правило, дешевые компоненты среды — обычно сельскохозяйственные продукты или отходы пищевой промышленности, доступные в большом количестве; 3) имеется широкий выбор микроорганизмов-продуцентов, которые, более того, могут быть улучшены генетически; 4) микроорганизмы служат источником целого ряда уникальных ферментов, например танназы, целлюлазы, кератиназы и т. д.

Таким образом, в последнее время ферментные препараты животного и растительного происхождения постепенно вытесняются микробными аналогами. Наибольший интерес вызывают внеклеточные ферменты микроорганизмов, преимуществами которых являются: 1) простота выделения и очистки, поскольку отпадает необходимость разрушения клеток и снимается проблема удаления нуклеиновых кислот; 2) высокий выход, так как он не ограничен доступной биомассой (Воробьева, 1987; Glazer a. Nikaido, 1995; Godfrey a. West, 1996).

Сегодня наибольший интерес представляют внеклеточные ферменты микробного происхождения, обладающие высокой субстратной специфичностью. Используя такие ферменты, можно осуществлять определение того или иного вещества на фоне других веществ, имеющих даже общие структурные особенности. Например, аспартаза абсолютно специфична по отношению к фумарату в прямой реакции и к L-аспартату — в обратной реакции. Аспартаза обладает также строгой специфичностью по отношению к оптическим или геометрическим изомерам: она не взаимодействует с D-аспартатом и не присоединяет аммиак к малеату - геометрическому г/ис-изомеру фумарата (Ленинджер, 1985).

В настоящее время все большее применение в химической и пищевой промышлености, а также в медицине находят иммобилизованные и соиммобилизованные ферменты (Tabata et al., 1983; Егоров и др., 1987; Yao et al., 1990; Nakajima et al., 1991; Rui et al., 1993,1995; Li et al., 1996b; Suzukis, 1997; Лукашева и др., 1997). Это сложные каталитические системы, обладающие преимуществами перед растворимыми аналогами. Во-первых, такие ферменты могут быть отделены от продукта и использованы повторно, что снижает стоимость процесса. Во-вторых, иммобилизованные ферменты обладают повышенной стабильностью и длительно сохраняют высокую каталитическую активность. В-третьих, они пригодны для непрерывных процессов, что снижает затраты труда. И, наконец, на основе иммобилизованных ферментов можно создавать мультиферментные системы. Например, соиммобилизованные с глюкоамилазой клетки S. cerevisiae применяют в пищевой промышленности для получения пива с низким содержанием декстринов, а на основе соиммобилизации S. griseus и Сегр. acremonium создан аналитический реагент для изучения химии белков (Даценко, 1995; Godfrey a. West, 1996; Bains, 1998). Широкое применение находят имммобилизованные и соиммобилизованные ферменты в антибиотической промышленности (Glazer a. Nikaido, 1995; Godfrey a. West, 1996). Иммобилизованные ферменты имеют и некоторые недостатки, связанные с возможной частичной потерей активности в процессе иммобилизации или высокой стоимостью самого процесса. Поэтому выгодность иммобилизации того или иного фермента зависит от биохимических и инженерных соображений в каждом конкретном случае (Прист, 1987; Godfrey a. West, 1996; Bains, 1998).

Глава 4. Оксидазы L-аминокислот: их свойства и перспективы практического применения.

В последние годы особый интерес для исследовательской работы, а также для промышленности и медицинской практики представляют оксидазы L-аминокислот (КФ 1.4.3.2, Kuppa a. Aurich, 1971; Yoshino et al., 1982; Holme a. Goldberrg, 1975; Березов и др., 1987; Смирнова и Березов, 1988; 1989; Hashmi a. Anders, 1991; Niedermann a. Lerch, 1991; Rui et al., 1994; Byfield a. Abuknesha, 1994; Ярошик и Дихтярев, 1995; Backholt et al., 1995; Murthy a. Janardanasarma, 1999).

До недавнего времени основным и единственным источником получения этих ферментов был дорогостоящий змеиный яд (Chen et al., 1971; Ни et al., 1982; Oron et al., 1982; Umana, 1982; Ueda et al., 1988; Tan a. Saifuddin, 1989; Sanchez a. Magalhaes, 1991; Tan a. Swaminathan, 1992; Ponnudurai et al., 1994). Однако активный поиск надежных и дешевых источников оксидаз L-аминокислот привел к обнаружению продуцентов этих ферментов среди грибов и бактерий. Продуценты эукариотического происхождения были обнаружены среди пиреномицетов (Neurospora crassa), дейтеромицетов (Sikora a. Marzluf, 1982; Yoshino et al., 1982; Niedermann a. Lerch, 1991) и почкующихся дрожжей (Pollegioni et al., 1993), a прокариотического происхождения — среди бактерий (Chen et al., 1971; Duerre a. Chakrabarty, 1975; Koyama, 1984; Nakajima et al., 1991) и цианобактерий (Pistorius a. Yoss, 1980; Backholt et al., 1995).

Из группы оксидаз L-аминокислот наибольший интерес для промышленности и медицинской практики представляют L-лизин-а-оксидаза и L-глутамат-оксидаза.

Специфический субстрат лизиноксидазы, L-лизин, — незаменимая для человека и животных аминокислота, обладающая рядом уникальных функций, реализуемых на уровне ферментативного катализа, синтеза коллагена и гистонов.

Область применения этого фермента на практике обширна. Лизиноксидазу можно использовать для определения концентрации L-лизина при промышленном производстве аминокислот. Этот фермент также можно применять при изучении транспорта аминокислот в процессе синтеза белка (Березов и др., 1987; Хадуев и др., 1988; Лукашева и Березов, 1988; Смирнова и Березов, 1989; Лукашева и др., 1991, 1993; Потапова и др., 1992). Другой важной областью применения лизиноксидазы является использование ее для разделения D- и L-форм лизина. Используя специфичность действия фермента по отношению к L-форме, разделение рацемической смеси можно существенно упростить, так как образующаяся L-кето-а-аминокапроновая кислота может быть легко выделена из смеси с D-лизином (Kusakabe et al., 1980; Ярошик и Дихтярев, 1995). Кроме того, установлено, что исключение лизина из диеты животных с перевиваемыми опухолями приводит к торможению роста опухолей и увеличению продолжительности жизни. Этот факт, а также необратимость реакции окислительного дезаминирования L-лизина при введении в организм животных лизиноксидазы открывает новую преспективную область ее применения в терапии опухолевых заболеваний (Ярошик и Дихтярев, 1995).

4.1. L-глутаматоксидаза: ее свойства и перспективы практического применения.

L-глутаматоксидаза (L-глутамат: Ог- оксидоредуктаза [дезаминаза] КФ 1.4.3.11) — фермент, который специфично катализирует реакцию окислительного дезаминирования L-глутамата в присутствии воды и кислорода с образованием а-кетоглутарата, аммиака и перекиси водорода.

Образующаяся в процессе реакции перекись водорода может быть обнаружена с помощью хромогенной пероксидазной реакции. Это делает возможным использование фермента как в качестве аналитического реагента, так и для создания на его основе биосенсоров и ферментных анализаторов для определения L-глутамата, L-глутамина, креатинина и аммиака (Kusakabe et al., 1986,1989; Murachi a. Tabata, 1987,1990; Wollenberg et al., 1988,1989a, b; Passarge et al., 1989; Pfeiffer et al., 1990; Yao et al., 1990; Vahjen et al., 1991; Dremel et al., 1991; Hale et al., 1991; Chen a. Su, 1991; Suleiman et al., 1992; Botre et al., 1992,1993; Blankenstein et al., 1993; Rui et al., 1993,1995; Ie et al., 1994; Li et al., 1994; White et al., 1994; Stalikas et al., 1994; Ryan et al., 1997; Valero a. Garcia-Carmona, 1998), что открывает широкие возможности в аналитической химии для качественной и количественной оценки ферментативных процессов.

В пищевой промышленности для усиления вкусовых качеств продуктов питания и сохранения их при консервировании или замораживании в качестве пищевой добавки применяют глутамат. Поэтому глутаматоксидазу можно использовать для оценки качества пищевых продуктов и осуществления контроля над производством соусов и бульонных концентратов (Kusakabe a. Midorikawa, 1986; Kusakabe et al., 1989; Male et al., 1993; Moges a. Johansson, 1994).

Особенно важно применение глутаматоксидазы в фундаментальной и клинической медицине, например для ранней диагностики заболеваний сердца. Установлено, что при ишемической болезни сердца и инфаркте миокарда из поврежденных клеток миокарда или из клеток, испытывающих недостаток кислорода, в кровоток попадают аланин-трансаминаза (глутамат-пируват-трансаминазы, КФ 2.6.1.2) и аспартат-трансаминаза (глутамат-оксалоацетат-трансаминазы, КФ 2.6.1.1, Меньшиков, 1987). Определение в крови активности этих трансаминаз может дать ценную информацию о степени тяжести и о стадии повреждения сердечной мышцы (Kamei et al., 1983; Kusakabe a. Midorikawa, 1986; Schubert et al., 1987; Murachi a. Tabata, 1988; Kusakabe et al., 1989; Guntherberg et al., 1989; Cooper et al., 1991; Thomas, 1995; Moser et al., 1995,1997).

Определение в крови уровня аланин-трансаминазы имеет также большую диагностическую ценность при заболевании печени, например для ранней диагностики острого гепатита (Cooper et al., 1991; Thomas, 1995; Moser et al., 1995, 1997). Обнаружено, что это заболевание сопровождается резким повышением уровня аланин-трансаминазы в крови, при этом процесс начинается еще в продромальный период (период предвестников), когда первые клинические признаки данного заболевания только начинают выявляться (Меньшиков, 1987). Определение активности в крови аспартат-трансаминазы может служить источником важной информации при целом ряде мышечных и инфекционных заболеваний, а также при заболеваниях нервной системы. Установлено, что повышенное содержание аспартат-трансаминазы (при нормальном уровне аланин-трансаминазы) наблюдается у людей, страдающих инфекционным монокулезом, мышечной дистрофией, дерматомиозитом, инсулярной гипогликемией (Cooper et al., 1991; Villarta et al., 1991).

Глутаматоксидаза представляет интерес и для исследовательской работы. На основе глутаматоксидазы разрабатываются и создаются ферментные анализаторы и биосенсоры высокого разрешения. Установлено, что применение этого фермента в датчиках ферментных анализаторов L-глутамата, L-глутамина, креатинина и аммиака высокоэффективно и, возможно, вытеснит со временем более трудоемкий и сложный метод — хроматографирование (Yamauchy et al., 1984; Wollenberger et al., 1989a, b; Cooper et al., 1991; Yahjen et al., 1991; Botre et al., 1992,1993; Li et al., 1994,1996b; Moges a. Johansson, 1994; Stalikas et al., 1994; Moser et al., 1995,1997; Ryan et al., 1997).

Известно, что основными продуцентами глутаматоксидазы являются микроорганизмы, относящиеся к группе актиномицетов, а именно — к стрепто-мицетам (Kamei et al., 1983,1985; Kusakabe et al., 1983a, b; Ishikawa et al., 1986; Passarge et al., 1986; Bohmer et al., 1989; Xu a. Li, 1993; Li a. Zhong, 1996; Li et al., 1996a, 1997; Додзин и др., 1998; Виноградова, 1999а).

В наибольшей степени изучены свойства глутаматоксидаз Streptomyces endus (Passarge et al., 1986; Bohmer et al., 1989), Streptomyces violascens (Kamei et al., 1983,1985), Streptomyces sp. X-l 19-6 (Kusakabe et al., 1983a, b, 1986; Kusakabe a. Midorikawa, 1986) и Streptomyces sp. A 7700 и A 8063 (Ishikawa et al., 1986), Streptomyces cattleya (Fleck a. Muller, 1988). За исключением Streptomyces sp. A 7700 и Streptomyces sp. A 8063, синтезирующих внутриклеточный фермент, перечисленные выше стрептомицеты являются продуцентами внеклеточной глутаматоксидазы.

Все изученные до настоящего времени L-глутаматоксидазы катализируют реакцию окислительного дезаминирования а-аминогрупп L-глутамата в присутствии воды и кислорода с образованием а-кетоглутарата, аммиака и перекиси водорода, при этом, согласно полученным данным, в реакции участвует 1 моль кислорода и 1 моль воды на 1 моль L-глутамата, а в результате реакции образуется 1 моль а-кетоглутарата, 1 моль аммиака и 1 моль перекиси водорода, как это показано на схеме (Kamei et al., 1983):

СООН СООН

I I сн2 сн2

I I сн2 сн2

I I

CH-NH2 + 02 + Н20 -» СН2 + NH3 + Н202 I I

СООН СООН

L-глутамат а-кетоглутарат

Спектры поглощения известных глутаматоксидаз имеют близкие значения длин волн, соответствующие их максимумам поглощения. Так, глутаматоксидаза Streptomyces sp. X-l 19-6 имеет максимумы поглощения при 273 нм, 385 нм, 465 нм, плечо около 290 и 490 нм (Kusakabe et al., 1986), глутаматоксидаза S. violascens — при 280 нм, 390 нм, 470 нм, плечо около 490 нм (Kamei et al., 1983), а фермент из S. endus — при 273 нм, 355 нм и 457 нм (Bohmer et al., 1989).

У всех изученных глутаматоксидаз простетическая группа представлена ФАД (Kamei et al., 1985; Kusakabe et al., 1986; Bohmer et al.,1989). При количественном определении содержания ФАД в молекуле фермента было установлено, что для глутаматоксидаз S. endus и S. violascens на 1 моль фермента приходится 1 моль ФАД (Kamei et al.,1985; Bohmer et al., 1989), а для глутаматоксидазы Streptomyces sp. X-l 19-6 на 1 моль фермента — 2 моля ФАД (Kusakabe et al., 1983a, b, 1986).

Согласно литературным данным L-глутаматоксидазы различаются по своей молекулярной массе. Так, фермент S. violascens имеет молекулярную массу 60 ± 10 кДа (Kamei et al., 1983). Молекулярная масса глутаматоксидазы Streptomyces sp. X-l 19-6 составляет 140 + 10 кДа, при этом установлено, что фермент состоит из трех субъединиц — а, Р и у — молекулярная масса которых 44 кДа, 19 кДа и 9 кДа соответственно (Kusakabe et al., 1983b), а глутаматоксидаза S. endus имеет молекулярную массу 90 ± 10 кДа и состоит из двух субъединиц с молекулярной массой 50 кДа каждая (Bohmer et al., 1989).

Глутаматоксидазы S. endus, Sreptomyces sp. A 7700 и Streptomyces sp. A 8063 характеризуются абсолютной субстратной специфичностью. Из 20 аминокислот, включая оптический изомер глутамата (D-глутамат) вышеперечисленные ферменты проявляли активность только с L-глутаматом (Ishikawa et al., 1986; Bohmer et al., 1989). Что касается остальных глутаматоксидаз, то они проявляли групповую специфичность, т.е., помимо L-глутамата, взаимодействовали еще с несколькими субстратами. Так, глутаматоксидаза S. violascens активно окисляла L-глутамин и L-гистидин (Kamei et al., 1983,1985), а фермент, синтезируемый S. cattleya —

L-глутамин, L-аспарагин и L-гистидин (Fleck a. Muller, 1988). Глутаматоксидаза Streptomyces sp. X-119-6 проявляла активность с L-аспартатом и слабо окисляла другие аминокислоты (Kusakabe et al., 1986).

Глутаматоксидазы S. violascens, S. cattleya, Sreptomyces sp. A 7700 и Streptomyces sp. A 8063 проявляли максимальную активность при кислом значении рН — от 5,5 до 6,5 (Kamei et al., 1983,1985; Ishikawa et al., 1986; Fleck a. Muller, 1988). Оптимум рН для глутаматоксидазы Streptomyces sp. X-l 19-6 лежит в диапазоне значений рН от 7,0 до 8,5 (Kusakabe et al., 1986), а фермент, синтезируемый S. endus, обладал максимальной активностью при рН 6,5 - 8,0 (Passarge et al., 1986; Bohmer et al., 1989).

Глутаматоксидазы S. violascens, S. cattleya, Sreptomyces sp. A 7700 и Streptomyces sp. A 8063 были стабильны в буферных растворах с рН 5,5 - 6,5 (Kamei et al., 1983, 1985; Ishikawa et al., 1986; Fleck a. Muller, 1988). Ферменты, синтезируемые S. endus и Streptomyces sp. X-l 19-6, сохраняли стабильность в более широком диапазоне значений рН — от 5,0 до 8,0 и от 5,5 до 10,5 соответственно (Kusakabe et al., 1986; Bohmer et al., 1989).

Изученные глутаматоксидазы характеризуются высокой температурной стабильностью. Так, при инкубировании в течение 10 мин. глутаматоксидазы S. violascens и S. cattleya сохраняли свою первоначальную активность при 50°С, а глутаматоксидазы Streptomyces sp. А 7700 и А 8063 — при 55°С, однако при 70°С за то же время полностью денатурировали (Kamei et al., 1985; Ishikawa et al., 1986; Fleck a. Muller, 1988). Фермент S. endus отличался более высокой температурной стабильностью. В буферном растворе с рН 7,0 он сохранял первоначальную активность при 60°С в течение часа (Passarge et al., 1986; B6hmer et al., 1989). Максимальной температурной стабильностью из всех изученных глутаматоксидаз обладал фермент, полученный из Streptomyces sp. X-l 19-6. При инкубировании в течение 15 мин. в буферном растворе с рН 5,5 он сохранял первоначальную активность при 65°С и терял за то же время 50 % от исходной активности при 85°С (Kusakabe et al., 1986).

Наиболее сильное ингибирующее действие на глутаматоксидазы S. endus и S. cattleya оказывают ионы Ag и Hg" (Fleck а. МйИег, 1988; Bohmer et al., 1989). Ионы Cu2+ в концентрации 1 мМ подавляли на 50 % активность ферментов, выделенных из Streptomyces sp. А 7700, Streptomyces sp А 8063 (Ishikawa et al., 1986) и S. violascens (Kamei et al., 1985). Глутаматоксидаза Streptomyces sp. X-l 19-6 была устойчива к действию описанных выше ионов, однако в присутствии 1 мМ ПХМБ теряла 45 % от первоначальной активности (Kusakabe et al., 1986).

Сведения об основных этапах экстракции и очистки глутаматоксидаз приведены в литературе только для ферментов, синтезируемых S. violascence, Streptomyces sp. А 7700, Streptomyces sp. A 8063, Streptomyces sp. X-l 19-6 и S. endus (Kamei et al., 1983; Kusakabe et al., 1983a; Ishikawa et al., 1986; Bohmer et al., 1989). Согласно литературным данным, выделение и очистка вышеперечисленных глутаматоксидаз включала стадии высаливания или фракционирования органическими растворителями, избирательную адбсорбцию, ионобменную хроматографию, гель-фильтрацию, диализ и лиофилизацию. Максимальный выход внеклеточного фермента был достигнут при выделении и очистке глутаматоксидазы S. violascence (Kamei et al., 1983). Фермент был очищен примерно в 914 раз, а выход его составил около 28 %. Более чистый ферментный препарат был получен при выделении и очистке внеклеточной L-глутаматоксидазы S. endus (Bohmer et al., 1989). Фермент был очищен в 2500 раз, однако выход его составил 21%. Данные по очистке известных глутаматоксидаз представлены в таблице 1.

Таблица 1. Очистка известных L-глутаматоксидаз.

Продуцент Исходная активность фермента, ед/мг белка Конечная активность фермента, ед/мг белка Степень очистки, в Храз Выход фермента, % Литературный источник

Streptomyces sp. Х-119-6 0,056 43,2 770 18,5 Kusakabe et al., 1983а

Streptomyces violascence 0,066 60,3 913 27,5 Kamei et al., 1983

Streptomyces endus 0,0024 6 2500 21,0 Bohmer et al., 1989

Streptomyces sp. A 7700 0,13 ед/мл (внутриклеточный) 49,5 38,0 Ishikawa et al., 1986

Streptomyces sp. A 8063 0,59 ед/мл (внутриклеточный) 58,2 40,0 Ishikawa et al., 1986

Производство глутаматоксидазы с использованием стрептомицетов в качестве продуцентов, способствовало началу широкого применения этого фермента на практике в ряде стран. Так, для количественного определения L-глутамата, L-глутамина, креатинина, аммиака и трансаминаз разрабатывают и уже применяют ферментные электроды, содержащие иммобилизованную глутаматоксидазу (Cooper et al., 1991; Vahjen et al., 1991; Botre et al., 1992,1993; Li et al., 1994,1996b; Moges a. Johansson, 1994; Stalikas et al., 1994; Moser et al., 1995,1997; Ryan et al., 1997).

Однако в России этот фермент до сих пор не производится. Поэтому поиск продуцентов внеклеточной L-глутаматоксидазы и разработка эффективных способов ее получения являются актуальными.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 5.1. Объекты исследования

Поиск продуцентов внеклеточной L-глутаматоксидазы проводили среди актиномицетов, которые выделяли из почв агроценозов и лесных биогеоценозов разных географических зон России, ближнего и дальнего зарубежья.

Для выделения из почвы микроорганизмов, относящихся к роду Streptomyces, проводили предварительное обогащение почвенных образцов мелом. Для этого, воздушно-сухие образцы почвы (1 г) смешивали с 0,1 г СаСОз и инкубировали при 28°С в течение 7-9 дней во влажном состоянии (60% от полной влагоемкости). Обработку почвы перед проведением микробиологического посева осуществляли методом растирания (Звягинцев, 1987). Для увеличения количества выделяемых из почвы стрептомицетов перед посевом почву обрабатывали раствором фенола: 0,1 мл почвенной суспензии добавляли к 10 мл 1,4 % раствора фенола и инкубировали при 28°С в течение 10 мин. (Зенова, 1992). Использовали традиционный метод высева из разведений (10"3 -10"4) почвенных суспензий (Егоров, 1983) на крахмало-казеиновый агар (Зенова, 1992) с 0,1 % L-глутамата. Повторность — 10-ти кратная. Для ограничения роста грибов в питательную среду добавляли антибиотики: нистатин (10-50 мкг/мл) и циклогексимид (актидион, 50-100 мкг/мл). Засеянные чашки Петри инкубировали при 28°С в течение 14 дней. Все выросшие на этой среде колонии микроорганизмов проверяли на наличие глутаматоксидазной активности.

5.2. Отбор штаммов-продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы.

Для наглядного выявления штаммов-продуцентов внеклеточной L-глутаматоксидазы нами была предложена модификация состава минимального верхнего агара F (Миллер, 1986) добавлением в него (на 100 мл): 250 ед. пероксидазы из хрена, 0,1 ммоль 4-аминоантипирина, 1,75 ммоль фенола и 1 ммоль L-глутамата в 0,1 М К-фосфатном буфере, рН 7,0. Выросшие на пластинке агара в чашках Петри колонии стерильно заливали модифицированным минимальным верхним агаром F и инкубировали сутки при 28°С. Глутаматоксидазную активность выделенных штаммов определяли визуально по наличию вокруг колонии характерного красного окрашивания, образующегося в результате хромогенной пероксидазной реакции. Для поддержания штаммов-продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы использовали овсяный агар (Гаузе и др., 1983) с 0,1% глутамата.

5.3. Культивирование штаммов-продуцентов.

Для выращивания выделенных штаммов изначально использовали среду следующего состава (%): крахмал - 2, дрожжевой экстракт - 0,1, KNO3 - 0,1, СаСОз - 0,5, КС1 - 0,05 , MgCl2 - 0,05, К2НР04 - 0,05, солевой раствор А - 0,1 мл, рН среды 7,0-7,2. Солевой раствор А содержал (%): FeS04- 0,1, МпСЬ- 0,1, Z11SO4- 0,1.

При оптимизации состава среды и условий культивирования штаммов-продуцентов применяли метод математического планирования эксперимента в сочетании с традиционным эмпирическим подходом. Оптимизацию состава среды проводили в три этапа: 1) качественный отбор необходимых для данной культуры источников азота, углерода, витаминов и микроэлементов; 2) количественная оценка влияния отобранных компонентов на синтез внеклеточной глутаматоксидазы и построение адекватной математической модели изучаемого процесса; 3) определение собственно оптимального состава среды методом крутого восхождения (Максимов и Федоров, 1969; Максимов, 1980).

В дальнейшем для выращивания культур стали применять оптимизированную среду, содержащую (%): глюкозу - 3, кукурузный экстракт - 0,9, (NH4)2S04 - 0,6, СаСОз - 2, КС1 и MgCl2 - по 0,1, солевой раствор А - 0,1 мл, рН среды 7,0-7,2. Выращивание культур проводили в условиях глубинного культивирования при 28°С в 750-мл качалочных колбах на орбитальной качалке (190 об/мин). По окончании выращивания мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через плотную ткань, после чего в фильтрате проводили измерение глутаматоксидазной активности (см. главу 5.7).

Способность исследуемых штаммов использовать различные источники углерода проверяли на среде Готтлиба и Придгема (ISP 9) следующего состава (%): (NH4)2S04 - 0,26, КН2Р04 - 0,24, К2НРО4 - 0,56, MgS04-7 Н20 - 0,1, агар - 2, солевой раствор А - 0,1 мл, рН среды 7,0. Солевой раствор А содержал (%): FeS04-0,1, МпС12- 0,1, Z11SO4 - 0,1. В качестве источника углерода использовали глюкозу, фруктозу, арабинозу, сахарозу, ксилозу, маннит, рамнозу, раффинозу, целлюлозу, галактозу, инозит, мальтозу, глицерин и крахмал в концентрации 1%. Выращивание проводили при 28°С в течение 21 дня. Результаты оценивали на 7,14 и 21-е сутки роста при сравнении с отрицательным контролем (среда без источника углерода) и положительным контролем (среда с D-глюкозой). Повторность в опытах — трехкратная.

Способность выделенных штаммов использовать различные источники азота проверяли на среде, содержащей (%): глюкозу - 1, MgS(V7 Н2О - 0,05, NaCl -0,05, FeS04-7 Н20 - 0,001, К2НР04 - 0,1, агар - 1,5, рН среды 7,0. В качестве источника азота использовали следующие соединения в концентрации 0,1%: L-аргинин, L-цистеин, L-гистидин, L-гидроксипролин, L-метионин, L-фенилаланин, L-серин, L-треонин, L- валин, В,Ь-амино-п-масляную кислоту, L-аспарагин, L-аланин, L-глутамин, ЬДЭ-глутамат, L-пролин, нитрат калия, нитрат натрия, сульфат аммония и нитрат аммония. Результаты оценивали на 14-е сутки при сравнении с отрицательным контролем (среда без источника азота) и положительными контролями (среда с L-аспарагином или L-пролином). Повторность в опытах — трехкратная.

5.4. Изучение морфологических, хемотаксономических и культуральных признаков выделенных штаммов-продуцентов.

Сравнительное изучение морфолого-культуральных признаков исследуемых штаммов проводили по традиционной схеме (Гаузе и др., 1983; Зенова, 1992). В качестве диагностических сред использовали: минеральный агар 1, органический агар 2, глюкозо-нитратный агар, СР-1, овсяный агар, глицерин-нитратный агар, глюкозо-аспарагиновый агар, пептонно-дрожжевой агар с железом (модификация среды ISP 6), глицерин-аспарагиновый агар, ISP 5 и крахмало-аммиачный агар, ISP 4 (Гаузе и др., 1983). Повторность в опытах — трехкратная.

Кислотоустойчивость выделенных штаммов определяли по методу Циль-Нильсена (Егоров, 1983).

Морфологию мицелия и спор стрептомицетов изучали в фазово-контрастиом микроскопе "Laboval 4" с вмонтированной видеокамерой.

Для изучения морфологического строения репродуктивных структур культуры стрептомицетов выращивали на средах, наиболее благоприятных для спорообразования (на овсяном или картофельно-морковном агаре). Для детального микроскопического исследования спорулирующих структур и расположения спор у изучаемых штаммов использовали стерильные покровные стекла, помещенные в чашку Петри под углом 30-45° к поверхности агаризованной среды с растущей культурой. Тип цепочек спор определяли у зрелых культур на 14-е сутки. Покровные стекла с прикрепившимся к ним мицелием переносили на предметное стекло с каплей воды и рассматривали в фазово-контрастном микроскопе "Laboval 4" с вмонтированной видеокамерой.

Поверхность оболочки спор изучали с помощью электронного микроскопа JEM-1000 (Япония) при увеличении 10 ООО х - 30 ООО х. Для приготовления образца слегка прикасались сеткой с нанесенной на нее коллодиевой пленкой к поверхности спороносящего воздушного мицелия.

Присутствие в клеточной стенке изучаемых штаммов L-ДАПк определяли по методу Робинсона (Robinson, 1968). Биомассу отделяли от культуральной жидкости центрифугированием (8 ООО g 15 мин.), промывали дистиллированной водой, затем — этиловым спиртом, после чего высушивали в термостате при 37°С в течение суток. Затем проводили кислотный гидролиз, для чего 10 мг сухой биомассы заливали 1 мл 6 н НС1 и выдерживали в термостате 18 часов при 110°С в запаянной ампуле. Отмытый дистиллированной водой до светлого цвета, гидролизат выпаривали на водяной бане, перерастворяли в 0,3 мл дистиллированной воды и в количестве 10 мкл наносили на бумажную хроматограмму (Filtrak FN-13, ГДР).

Нисходящую хроматограмму разгоняли в растворе: метанол - вода - НС1 конц. - ' пиридин (80:17,5:2,5:10), а затем проявляли в 0,5 % растворе нингидрина в ледяной уксусной кислоте в ацетоне. Для более четкого проявления желто-зеленых пятен L-ДАПк хроматограмму прогревали при 100°С в течение двух минут.

При определении состава моносахаров 10 мг сухой биомассы заливали 1 мл 2 н НС1 и выдерживали в термостате 3 ч. при 105°С в запаянной ампуле. Для нисходящей хроматографии на бумаге Filtrak FN-13 (ГДР) с целью разделения моносахаров использовали систему: бутан-1-ол-пиридин-бензол -вода (5:3:1:3). Обнаружение моносахаров проводили с помощью анилинфталата (Naumova et al., 1989).

Потребление глюкозы измеряли с помощью глюкозооксидазы, входящей в набор "Фотоглюкоза" (ООО "Импакт", Россия).

5.5. Мутагенез природного штамма-продуцента.

Естественную и индуцированную мутагеном изменчивость изучали по общепринятым методам (Герхардт и др., 1984; Миллер, 1986).

В качестве мутагена применяли азотистую кислоту в концентрации, при которой степень выживания составляла 0,01-0,1%. Для построения кривых выживаемости споры стрептомицета обрабатывали одной и той же дозой мутагена, но при разной длительности воздействия. Обработанную азотистой кислотой культуру подращивали в течение ночи на среде с глюкозой и кукурузным экстрактом (см. главу 5.3), после чего высевали на овсяный агар с глутаматом. В качестве контроля использовали необработанную мутагеном культуру. Для выявления активных клонов применяли модифицированный нами минимальный верхний агар F (см. главу 5.2).

5.6. Изучение влияния ионов кальция на секрецию внеклеточной

L-глутаматоксидазы

При изучении влияния ионов кальция на секрецию внеклеточной глутаматоксидазы посевной материал выращивали в течение ночи при 28°С. Полученным инокулятом (5% по объему) засевали среду, разлитую по 100 мл в 750-мл качалочные колбы. Непосредственно перед посевом в каждую колбу стерильно добавляли СаСЬ до конечной концентрации 0,1-0,5%. В качестве контроля использовали среду без хлорида кальция. Культивирование проводили при 28°С на орбитальной качалке (190 об/мин). Через каждые четыре часа отбирали пробы для измерения ферментативной активности и биомассы.

5.7. Определение активности глутаматоксидазы

Определение глутаматоксидазной активности проводили на основе хромо-генной пероксидазной реакции. Реакционная смесь содержала (в 1 мл): 2,5 ед. пероксидазы из хрена, 1,0 мкмоль 4-аминоантипирина, 17,5 мкмоля фенола, 10 мкмолей L-глутамата в 0,1 М К-фосфатном буфере, рН 7,0. Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение двух минут и реакцию инициировали, добавляя исследуемый образец (фильтрат или раствор фермента). Активность фермента измеряли по изменению оптической плотности раствора при длине волны 500 нм. россхЗСЗДЯ s f f'vTliiiHH^ •

41 ' ''-Ы^ШШХ^ i

Измерение проводили на спектрофотометре Хитачи 200-20 (Япония). Активность глутаматоксидазы рассчитывали по формуле:

A-Vo6 Аго =-, где

Ем • Т • УЕ

Аго - глутаматоксидазная активность исследуемых образцов (ед/мл); А - изменение величины оптической плотности раствора в кювете за одну минуту (Т) при 37°С; Vo6 - общий объем раствора в кювете (мл); Ve - объем вносимого образца (мл); бм -коэффициент молярной экстинкции (мМ"1 • см"1) образующегося в процессе реакции хромогенного соединения хинонимина, численно равный 6. За единицу активности фермента (ед.) принимали такое его количество, которое катализирует образование одного мкмоль перекиси водорода за минуту при 37°С.

Содержание белка в ферментных препаратах определяли по методу Бредфорда (Bradford, 1976). Для построения калибровочной кривой использовали доведенный до постоянного веса бычий сывороточный альбумин (Sigma, США).

5.8. Определение биомассы стрептомицета

Биомассу стрептомицета определяли по весу сухого мицелия, отмытого от солей вначале 1 н НС1, а затем — дистиллированной водой. Фильтры с промытым мицелием доводили до постоянного веса при 80°С и хранили в эксикаторе с силикагелем до взвешивания. Вес сухого мицелия рассчитывали по разнице веса фильтра с мицелием и сухого фильтра. Конечный результат пересчитывали на вес сухого мицелия в мг/мл среды.

5.9. Изучение биохимических свойств внеклеточной глутаматоксидазы.

Нами был разработан метод выделения и очистки внеклеточной глутаматоксидазы (см. главу 9). Дальнейшая работа была проведена с очищенным по предложенному методу ферментом.

Диапазон рабочей температуры глутаматоксидазы. Реакционную смесь, содержащую в качестве субстрата L-глутамат (10 мкмоль/мл), инкубировали при температурах от 20 до 90°С в течение 20 мин. Глутаматоксидазную активность измеряли описанным выше методом (см. главу 5.7), используя в качестве инициатора реакции исследуемый фермент.

Оптимум рН глутаматоксидазы. Определение активности фермента при различных значениях рН проводили, используя в качестве субстрата L-глутамат в 0,2 М ацетатном буфере (рН 3,5-6,0); 0,2 М К-фосфатном буфере (рН 6,0-8,5) и 0,2 М глицин-NaOH буфере (рН 8,5-11,5). рН стабильность глутаматоксидазы. Исследуемый фермент инкубировали в буферных растворах с рН от 3,5 до 11,5 в 0,2 М ацетатном буфере (рН 3,5-6,0); 0,2 М К-фосфатном буфере (рН 6,0-8,5) и 0,2 М глицин-NaOH буфере (рН 8,5-11,5) при 37°С в течение часа. По окончании инкубирования проводили измерение активности изучаемой глутаматоксидазы (см. главу 5.7).

Температурная стабильность и влияние рН на термостабильность глутаматоксидазы. Исследуемый фермент инкубировали в буферных растворах с рН 4,5,6,5 и 9,5 при фиксированной температуре от 30 до 90° С в течение часа. Через каждые 15 мин. отбирали пробы и измеряли глутаматоксидазную активность описанным выше методом (см. главу 5.7).

Влияние ионов металлов, ингибиторов и хелатирующих агентов на активность глутаматоксидазы. В реакционную смесь, содержащую изучаемый фермент, добавляли различные химические вещества в концентрации 1 мМ и после инкубирования в течение пяти минут, реакцию начинали добавлением в качестве субстрата глутамата (10 мкмоль/мл). В качестве контроля использовали реакционную смесь без добавления химических веществ. Активность фермента в контроле принимали за 100%.

Субстратная специфичность глутаматоксидазы. Реакционную смесь, содержащую в качестве субстрата различные аминокислоты, а именно: L-аспартат, L-глутамин, L-аспа-рагин, L-аланин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин, L-серин, L-треонин, L-фенил-аланин, L-тирозин, L-пролин, L-орнитин, L-гистидин, L-аргинин, L-цистеин, L-лизин, L-глицин и L, D-глутамат в концентрации 10 мкмоль/мл, инкубировали при 37°С в течение двух минут, после чего реакцию инициировали добавлением исследуемого фермента. Активность фермента по отношению к L-глутамату принимали за 100 %.

Спектр поглощения глутаматоксидазы снимали на спектрофотометре "Ultrospek 11 "(LKB-Biochrom, Швеция) в диапазоне длин волн от 260 нм до 700 нм с последующей компьютерной обработкой полученных данных.

Сродство изучаемого фермента (Км) к L-глутамату, при рН 7,4 рассчитывали в двойных обратных координатах (уравнение Лайнувера-Берка, Кочетов, 1971).

Молекулярную массу исследуемого фермента определяли гель-фильтрацией, используя в качестве носителя сефадексы G-100 и G-150 (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.), которыми заполняли колонку (2,5 х 100 см) и уравновешивали 50 мМ К-фосфатным буфером, рН 7,0. Элюирование проводили тем же буфером со скоростью 18 мл/ч. Свободный объем определяли с помощью синего декстрана (2000 кДа). Для построения калибровочной кривой использовали смесь белков с известной молекулярной массой (алкогольдегидрогеназа из пекарских дрожжей -150 кДа, БСА - 67 кДа, овальбумин - 43 кДа, ингибитор трипсина - 20 кДа). Молекулярную массу субъединиц глутаматоксидазы рассчитывали по данным градиентного электрофореза в 4-12 % ПААГе в присутствии 0,1 % ДДС-Na после обработки фермента 0,1 М меркаптэтанолом. Чистоту ферментного препарата определяли по градиентному электрофорезу в 4-12 % ПААГе в нативных условиях (Bolland et all., 1991). В качестве калибровочных белков использовали LMW маркеры ("Pharmacia", Швеция).

При определении простетической группы раствор фермента выдерживали на кипящей водяной бане в течение пяти минут, денатурированный белок удаляли центрифугированием, а супернатант анализировали методом тонкослойной хроматографии (Silica gel G, Merck, Германия), используя систему растворителей: третичный амиловый спирт - муравьиная кислота - вода (3:1:1). Для количественного определения ФАД к 0,6 мл раствора фермента, содержащего 1,4 мг белка (7 нмолей), добавляли 0,1 мл 25% ТХУ. После центрифугирования супернатант нейтрализовали 1 М К2НРО4 и измеряли поглощение раствора при 450 нм на спектрофотометре Хитачи 200-20 (Япония). Количество ФАД на молекулу фермента рассчитывали, учитывая его молярный коэффициент адбсорбции е = 11,3 мМ-1 • см-1.

Стехиометрию реакции окисления L-глутамата определяли следующим образом. Реакционная смесь содержала 1,32 мкмоля L-глутамата, 120 мкмолей К-фосфатного буфера, рН 7,0 и 1 ед. фермента. Конечный объем — 6,2 мл. Для анализа брали аликвотные кличества (по 0,5 мл) реакционной смеси, предварительно инкубированной при 37°С в течение пяти минут. а-Кетокислоту определяли по методу Сода с МБТГ (Soda, 1968): 0,5 мл реакционной смеси смешивали с 1 мл 1 М ацетатного буфера (рН 5,0) и 0,4 мл свежеприготовленного 0,1 % раствора МБТГ. После инкубирования смеси при 50°С в течение 30 мин. и последующего охлаждения до комнатной температуры измеряли поглощение раствора при 325 нм. Для построения калибровочной кривой использовали а-кетоглутарат (Sigma, США). Количественно L-глутамат определяли на анализаторе аминокислот "Hitachi-835" (Япония). Определение аммиака проводили с помощью реактива Несслера, а перекиси водорода — на основе хромогенной пероксидазной реакции с 4-амино-антипирином и фенолом (см. главу 5.7).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 6. Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов-продуцентов.

6.1. Морфолого-культуральные свойства выделенных штаммов.

Из почв агроценозов и лесных биогеоценозов разных географических зон России, ближнего и дальнего зарубежья было выделено 1284 штамма актино-мицетов. Из них скринингом получена коллекция культур, включающая 7 штаммов-продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы, что составило 0,5% от числа выделенных и проверенных культур. Такая же относительно невысокая встречаемость продуцентов глутаматоксидазы в природных источниках отмечалась и в одной из первых работ, посвященных описанию этого фермента (два выявленных продуцента среди 500 проверенных культур стрептомицетов, Kamei et all., 1983). Следует отметить, что все штаммы-продуценты внеклеточной глутаматоксидазы были выделены из почв агроценозов (рисовое поле в Японии и пахотные земли в Московской и Липецкой областях).

В целях идентификации было проведено сравнительное изучение морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств двух наиболее активных продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы: штамма Z-l 1 (исходная активность фермента — 0,01 ед/мл среды) и штамма Z-83 (исходная активность фермента—0,005 ед/мл среды).

Установлено, что выделенные штаммы Грам-положительны, не кислотоустойчивы. В составе пептидогликана клеточной стенки была обнаружена L-ДАПк.

При изучении моносахаридного состава клеточных стенок установлено отсутствие в них основных диагностических Сахаров (ксилозы, арабинозы, рамнозы, галактозы, маннозы). Присутствие L-ДАПк и отсутствие основных диагностических Сахаров в клеточной стенке выделенных штаммов (клеточная стенка 1 типа, Lechevalier et al., 1971) дало основание отнести их к группе стрептомицетов.

Вегетативные гифы обоих штаммов образуют хорошо развитый разветвленный мицелий, не распадающийся на фрагменты. Гифы воздушного мицелия — 0,8-1,1 (штамм Z-l 1) и 0,5-0,7 мкм (штамм Z-83) в диаметре — в зрелом состоянии несут цепочки спор. У штамма Z-l 1 цепочки спор спиральные, в виде хорошо развитых, правильных, растянутых спиралей от трех до семи оборотов (рис. 1). Споры — 0,6-0,7 х 0,9-1,1 мкм — циллиндрические с гладкой поверхностью, неподвижны (рис. 2). У штамма Z-83 вдоль стерильных гиф воздушного мицелия расположены прямые цепочки спор (рис. 3). Споры циллиндрические — 0,4-0,5 х 0,6-0,7 мкм — с гладкой поверхностью, неподвижны (рис. 4). Склероцио-, спорангио-, пикнидио- и синнемаподобные структуры не обнаружены. По морфологии мицелия и строению репродуктивных структур выделенные актиномицеты были отнесены к роду Streptomyces.

На поверхности плотной среды в чашках Петри Streptomyces sp. Z-l 1 и Streptomyces sp. Z-83 образуют плотные, врастающие в агар, концентрические колонии со светлым фестончатым краем, d~2-3 мм (штамм Z-83) и d ~3-5 мм (штамм Z-l 1). Поверхность колонии покрыта серым бархатистым воздушным мицелием, который обладает ярко выраженными гидрофобными свойствами.

Рисунок 1. Фотографии цепочек спор Streptomyces sp. Z-l 1. Фазовый контраст, 300 х. (а) 10-ти дневная культура, (б) 14-ти дневная культура.

Рисунок 2. Электронные микрофотографии цепочек спор

Streptomyces sp.Z-11(15 ООО х).

Рисунок 3. Фотографии цепочек спор Streptomyces sp. Z-83. Фазовый контраст, 300 х. (а) 10-ти дневная культура, (б) 14-ти дневная культура.

Рисунок 10. Фотографии цепочек спор Streptomyces sp. Z-l 1-6. Фазовый контраст, 400 х. (а) 10-ти дневная культура, (б) 14-ти дневная культура.

Проведено сравнительное изучение морфолого-культуральных свойств выделенных штаммов-продуцентов на разных диагностических средах. Результаты исследования представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2. Морфолого-культуральные свойства Streptomyces sp. Z-83 на разных диагностических средах.

Показатель Воздушный Субстратный мицелий Растворимый

Среда мицелий пигмент

Минеральный агар 1 Серый Красновато-бурый Бледно-бурый

Глицерин-нитратный агар Светло-серый Сначала желтый, потом темно-бурый Темно-красновато-бурый

Органический агар 2 Серый Темно-красновато-бурый Темно-красновато-бурый

Овсяный агар Хорошо развит, серый Темно-бурый Буровато-желтый

Пептонно-дрожжевой агар с железом, ISP 6 Хорошо развит, серый Бурый Образует меланоидные пигменты

Глюкозо-аспарагиновый Слабо развит, Бледно-желто- Нет агар светло-серый кремовый

Глюкозо-нитратный агар, СР-1 Хорошо развит, светло-серый Сначала желтый, потом темно-красновато-бурый Нет

Глицерин-аспарагиновый Скудный, Желтовато-кремовый Нет агар, ISP 5 светло-серый

Крахмал о-аммиачный Скудный, Буровато-желтый Нет агар, ISP 4 Светло-серый

Таблица 3. Морфолого-культуральные свойства Streptomyces sp. Z-l 1 на разных диагностических средах.

Показатель Среда Воздушный мицелий Субстратный мицелий Растворимый пигмент

Минеральный агар 1 Хорошо развит, серый Серовато-бурый Нет

Глицерин-нитратный агар Скудный, светло-серый Серовато-буровато-желтый Слегка желтоватый

Органический агар 2 Белый Бурый Бурый

Овсяный агар Хорошо развит, серый Серовато-бурый Нет

Пептонно-дрожжевой агар с железом, ISP 6 Хорошо развит, светло-серый Бурый Образует меланоидные пигменты

Глюкозо-аспарагиновый агар Слабо развит, светло-серый слабо желтовато-кремовый Нет

Глюкозо-нитратный агар, СР-1 Хорошо развит, светло-серый Желто-бурый Нет

Глицерин-аспарагиновый агар,ISP 5 Скудный, светло-серый Серовато-желтый Нет

Крахмало-аммиачный агар, ISP4 Хорошо развит, светло-серый Желтовато-буровато-серый Нет

Установлено, что по своим морфолого-культуральным свойствам штамм Z-l 1 наиболее близок к A. canofumeus, Krassilnikov 1970 (табл. 4), а штамм Z-83 — к S. eurythermus, Corbaz et al. 1955 (табл. 5, Гаузе и др., 1983).

Таблица 4. Сравнение морфолого-культуральных свойств штамма-продуцента Streptomyces sp. Z-11 и A. canofumeus,Krassilnikov 1970 (Гаузе и др., 1983).

Среда Streptomyces sp. Z-11 A. canofumeus,Krassilnikov 1970 (Гаузе и др., 1983)

Минеральный агар 1 ВМ хорошо развит, ВМ серый до темно-серого, серый, СМ серовато- СМ серый до сероватобурый, РП нет бурого, РП нет

Глицерин-нитратный ВМ скудный, светло- ВМ отсутствует или агар серый, СМ серовато- светло-серый, СМ желтый, буровато-желтый, РП буровато-желтый, РП нет слегка желтоватый или слегка желтоватый

Органический агар 2 ВМ белый, СМ ВМ белый до светлобурый, РП бурый серого, СМ и РП бурые

Овсяный агар ВМ хорошо развит, ВМ серый до темно-серого, серый, СМ серовато- СМ серый до сероватобурый, РП нет бурого, РП нет

Меланоидные пигменты Образует Образует

Цепочки спор Спиральные, споры гладкие Спиральные, споры гладкие

Таблица 5. Сравнение морфолого-культуральных свойств штамма-продуцента Streptomyces sp. Z-83 и S. eurythermus, Corbaz et al. 1955 (Гаузе и др., 1983).

Среда Streptomyces sp. Z-83 S. eurythermus, Corbaz et al. 1955 (Гаузе и др., 1983)

Минеральный агар 1 ВМ серый, СМ красновато-бурый, РП бледно-бурый ВМ серый, СМ желто-бурый до красновато-бурого, РП бледно-серый до буроватого

Глицерин-нитратный ВМ светло-серый, СМ ВМ белый до серого, СМ агар сначала желтый, потом желтый до темнотемно-бурый, РП темно- красновато-бурого, РП красновато-бурый темно-красновато-бурый

Органический агар 2 ВМ серый, СМ темно- ВМ серый, СМ темнокрасновато-бурый, РП красновато-бурый, РП темно-красновато-бурый темно-красновато-бурый

Овсяный агар ВМ хорошо развит, серый, ВМ серый, СМ желтый до

СМ темно-бурый, РП темно-бурого, РП буровато-желтый буровато-желтый

Меланоидные пигменты Образует Образует

Цепочки спор Прямые, споры гладкие Прямые или волнистые, редко спиральные, споры гладкие

Таблица 6. Сравнение морфолого-культуральных свойств выделенных штаммов — Streptomyces sp. Z-l 1 и Streptomyces sp. Z-83 — и известных продуцентов глутамат-оксидазы (на минеральном агаре 1).

Показатель Штамм-продуцент Цепочки спор Воздушный мицелий Субстратный мицелий Растворимый пигмент Мела- ноидные пигменты

1 2 3 4 5 6

S. violascens (Kamei et al., 1983) Спиральные От белого с фиолетовым оттенком до светло- красновато- фиолетового Бесцветный, до серо-коричневого Нет Образует

S. endus (Bohmer et al.,1989) Спиральные Серый до коричневато- серого От бесцветного до желтого Нет Не образует

S. cattleya (Fleck a. Miiller, 1989) Спиральные Беловатый Бесцветный Нет Не образует

Streptomyces sp. X-119-6 (Kusakabe et al., 1986) Спиральные Белый до серого Беловато-желтый Нет Не образует

Streptomyces sp. A-7700 (Ishikawa et al., 1986) Спиральные, есть петли, крючки Голубовато-серый Светло-коричневый Нет Образует

Streptomyces sp. A-8063 (Ishikawa et al., 1986) Спиральные, есть петли, крючки Серебристо-серый до бежевого Шоколадно-коричневый Нет Образует

Таблица 6. Продолжение.

1 2 3 4 5 6

Streptomyces cremeus 510 (Додзин и др., 1998) Несовершенные спирали, крючки Бледно-желтый Бесцветный, желтый Нет Не образует

Streptomyces litmocidini 447 (Додзин и др., 1998) Прямые, редкие крючки Средне- серый, бархатистый Бесцветный Нет Образует

Streptomyces sp. Z-ll Спиральные Серый Серовато-бурый Нет Образует

Streptomyces sp. Z-83 Прямые Серый Красновато-бурый Нет Образует

Как видно из представленных результатов, выделенные штаммы — Streptomyces sp. Z-l 1 и Streptomyces sp. Z-83 — по морфолого-культуральным свойствам отличаются от ранее описанных в литературе продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы и, таким образом, являются новыми продуцентами этого фермента (табл. 6).

6.2. Физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов.

Установлено, что оптимальной температурой для роста как Streptomyces sp. Z-l 1, так и Streptomyces sp. Z-83 является 26-28°C, а температурный диапазон, в котором их рост возможен, находится между 18 и 37°С. Оптимальный рН — 7,0-7,4, хотя рост обеих культур наблюдали при рН от 5,5 до 8,5.

Streptomyces sp. Z-l 1 и Streptomyces sp. Z-83 — это аэробные стрептомицеты с хемоорганотрофным типом питания. Хороший рост обеих культур был обнаружен на средах, содержащих в качестве источника углерода и энергии глюкозу, арабинозу, сахарозу, ксилозу, маннит, фруктозу, галактозу, мальтозу, крахмал и глицерин. Рамноза не поддерживала рост штамма Z-83, а раффиноза и инозит — обеих культур.

Ни один из штаммов не использовал в качестве источника углерода и энергии органические спирты. Слабый рост наблюдали на среде с пируватом и цитратом. Формиат, лактат, ацетат, малат, сукцинат, оксалоацетат и фумарат не поддерживали рост обеих культур.

Лучшим источником азота для биосинтетических целей изучаемых культур оказался аммоний. На среде, содержащей в качестве основного источника азота нитраты (натрия или калия) или мочевину, скорость роста обоих штаммов была существенно ниже, чем на среде с сульфатом аммония. Нитрат аммония не поддерживал рост как штамма Z-l 1, так и штамма Z-83. Streptomyces sp. Z-l 1 и Streptomyces sp. Z-83 хорошо росли на среде с пролином, треонином, серином, гистидином, глутаматом, глутамином и валином, используя эти аминокислоты в качестве основного источника азота На средах с цистеином, фенилаланином и аспарагином рост культур не обнаружен. Метионин слабо поддерживал рост штамма Z-83, но хорошо использовался штаммом Z-l 1. Ни одна из изучаемых культур не росла на среде без экзогенного источника азота и углерода.

Была изучена устойчивость выделенных штаммов к антибиотикам. Обнаружено, что хлорамфеникол, эритромицин, канамицин, стрептомицин, линкомицин, тетрациклин в концентрации 100 мкг/мл полностью подавляют рост обеих культур. Присутствие пенициллина и нистатина в среде несколько замедляло рост обоих штаммов, но не подавляло его. В присутствии ингибиторов слабый рост как Streptomyces sp. Z-83, так и Streptomyces sp. Z-l 1 был обнаружен на средах с 0,1% фенола и 0,01% азида натрия. Более высокие концентрации азида натрия (0,02%) полностью подавляли рост обоих штаммов.

Кристаллический фиолетовый (0,0001%) не оказывал влияния на рост как Streptomyces sp. Z-83, так и Streptomyces sp. Z-l 1.

Глава 7. Повышение биосинтетической активности природного штамма-продуцента

Streptomyces sp. Z-l 1.

9.1. Оптимизация состава среды и условий культивирования Streptomyces sp. Z-l 1.

Известно, что одним из эффективных методов повышения биосинтетической активности культуры является оптимизация состава среды. В связи с этим была проведена работа по оптимизации состава среды и условий культивирования природного штамма-продуцента. Из двух ранее изученных штаммов был выбран наиболее продуктивный— Streptomyces sp. Z-l 1, синтезирующий внеклеточную глутаматоксидазу с активностью — 0,01 ед/мл среды.

Оптимизацию состава среды и условий культивирования Streptomyces sp. Z-l 1 проводили с применением метода математического планирования эксперимента в сочетании с традиционным эмпирическим подходом в три этапа.

На первом этапе был проведен качественный отбор основных компонентов (источников азота, углерода, витаминов и микроэлементов) и факторов температуры, рН и аэрации) среды, оказывающих заметный положительный эффект на биосинтетическую активность культуры.

Было установлено, что среди различных компонентов питательной среды источники углеродного питания оказывают наибольшее влияние на синтез и секрецию глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1. Штамм активно синтезировал фермент при выращивании его на средах, содержащих крахмал, сахарозу, глюкозу и фруктозу, при этом максимальная активность глутаматоксидазы была обнаружена на среде с глюкозой. Слабую ферментативную активность, как и рост культуры, наблюдали при наличии в среде глицерина (табл. 7).

Таблица 7. Глутаматоксидазная активность Streptomyces sp. Z-l 1 при росте на средах разными источниками углерода.

Источник углерода (1%) Крахмал Глицерин Сахароза Мальтоза Глюкоза

Активность фермента (ед/мл среды) 0,01 0,005 0,02 0,02 0,04

Согласно литературным данным, известные продуценты глутаматоксидазы образовывали фермент при выращивании их на средах, содержащих нитраты или различные органические соединения азота. Исследуемый штамм активно синтезировал глутаматоксидазу при культивировании его на среде с аммонием. На средах, содержащих глутамат, гидролизат казеина, соевую муку или нитраты (натрия или калия) активность глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1 была значительно ниже, чем на среде с аммонием (Табл. 8).

Таблица 8. Глутаматоксидазная активность Streptomyces sp. Z-l 1 при росте на средах с разными источниками азота. В качестве источника углерода использовали глюкозу.

Источник азота (0,1%) Глутамат Соевая мука NaN03 или KN03 (NH4)2S04 Гидролизат казеина

Активность фермента (ед/мл среды) 0,02 0,03 0,01 0,05 0,01

При добавлении в среду с сульфатом аммония в качестве дополнительного источника азота глутамата в концентрации 0,01-0,1% наблюдали увеличение биомассы Streptomyces sp. Z-l 1 и повышение общей ферментативной активности. Однако удельная активность при этом не возрастала. При повышении концентрации глутамата от 0,1 до 0,7% активность фермента (общая и удельная) заметно снижалась, при этом рост культуры не подавлялся, и при концентрации глутамата 0,8% полностью исчезала (табл. 9).

Таблица 9. Глутаматоксидазная активность Streptomyces sp. Z-l 1 на среде с сульфатом аммония (0,1%) и разными концентрациями L-глутамата.

Концентрация L-глутамата, % 0 0,01 0,05 од 0,2 0,4 0,8

Общая активность фермента, ед/мл среды 0,050 0,052 0,055 0,070 0,050 0,011 0,0

Биомасса, мг/мл среды 25,0 26,0 27,5 35,0 35,7 36,0 36,0

Удельная активность фермента, ед/мг биомассы 0,002 0,002 0,002 0,002 0,0014 0,0003 0,0

Было сделано предположение, что регуляция синтеза глутаматоксидазы у Streptomyces sp. Z-l 1 происходит по принципу репрессии/дерепрессии. При низких концентрациях глутамата в среде он, вероятно, метаболизируется, что и приводит к изменению скорости роста культуры, т.е. к увеличению биомассы и повышению общей ферментативной активности. Однако, слишком высокие концентрации глутамата подавляют синтез глутаматоксидазы. При добавлении в среду с сульфатом аммония в качестве дополнительного источника азота других аминокислот — пролина, серина, глутамина, гистидина и валина в концентрации 0,01-0,1% — наблюдали увеличение биомассы Streptomyces sp. Z-l 1, однако активность глутаматоксидазы (общая) при этом не возрастала.

Добавление в среду кукурузного экстракта приводило к заметному увеличению глутаматоксидазной активности Streptomyces sp. Z-l 1. На среде с кукурузным экстрактом активность культуры была в два раза выше, чем на среде с дрожжевым.

Streptomyces sp. Z-l 1 синтезировал глутаматоксидазу при температуре от 22 до 32°С. В наибольшем количестве фермент (в расчете на мл среды) образовывался при температуре 28°С и исходном значении рН 7,0-7,4. Эти условия были оптимальны и для роста культуры.

При выращивании Streptomyces sp. Z-l 1 в 750-мл качал очных колбах на качалке со скоростью 190 об/мин, установлено, что изменение объема среды от 50 до 250 мл оказывает существенное влияние на синтез глутаматоксидазы. В наибольшем количестве фермент (в расчете на мл среды) был обнаружен при выращивании Streptomyces sp. Z-l 1 в колбах со 100 мл среды. Увеличение или уменьшение объема среды в два раза приводило к снижению синтеза глутаматоксидазы.

Заметное снижение биосинтетической активности культуры было обнаружено в присутствии фосфатов (натрия или калия). Дефицит фосфата или его отсутствие, наоборот, стимулировало накопление фермента.

Присутствие в среде СаСОз оказывало заметный положительный эффект на биосинтетическую активность культуры. Так, повышение его концентрации от 0,5 до 10 г/л приводило к возрастанию глутаматоксидазной активности.

Таким образом, были подобраны основные факторы и компоненты среды, оказывающие заметный положительный эффект на биосинтетическую активность культуры.

На втором этапе оптимизации состава среды и условий культивирования Streptomyces sp. Z-l 1 была проведена количественная оценка влияния отобранных компонентов (глюкозы, кукурузного экстракта, (NH4)2S04 и СаСОз) на бисинтетическую активность культуры. Для построения адекватной математической модели изучаемого процесса требовалось связать выходной параметр системы (активность внеклеточной глутаматоксидазы) с входными параметрами — концентрациями ранее отобранных компонентов (факторов) среды. Были проверены все возможные комбинации исследуемых факторов, каждый из которых рассматривался на двух количественных уровнях — верхнем "+" и нижнем "-". План полного факторного эксперимента (ПФЭ 244) и его результаты представлены в таблице 10. Чтобы выяснить с какой степенью достоверности полученные значения коэффициентов регрессии отличаются от нуля, т. е. являются статистически значимыми, был проведен анализ полученных результатов графическим методом — построением Уг-нормального графика, на котором все незначимые коэффициенты регрессии должны оказаться на одной прямой, проходящей через начало координат. Для построения Уг-нормального графика по оси абцисс были отложены суммы Си, расположенные в ранжированный ряд в порядке возрастания их абсолютных величин, а по оси ординат — доверительные вероятности (рис. 5). Из графика следует, что достоверно отличными от нуля, т. е. статистически значимыми, являются эффекты xi, х2, хз и Х4. Таким образом, зависимость глутаматоксидазной активности штамма Streptomyces sp. Z-11 (Y) от концентрации в среде варьируемых компонентов (факторов) можно представить в виде многофакторного уравнения регрессии: Y = 31 + 4,6xi + 4,8х2 + Зх3+ 2хд

Из уравнения следует, что увеличение относительно среднего уровня содержания в среде культивирования факторов xi (глюкозы), х2 (сульфата аммония), хз (кукурузного экстракта) и Х4 (СаСОз) должно дать значимый положительный эффект.

Таблица 10. Влияние компонентов среды на активность внеклеточной глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1. План ПФЭ 24

Фактор Глюкоза (NH4)2S04 Кукурузный СаСОз экстракт

Обозначение X! Х2 Х3 Х4 переменных

Ед. измерения г/л г/л г/л г/л

Нижний 5 1 2 5 уровень "-

Верхний 15 3 6 15 уровень "+"

Ед. варьиро- 5 1 2 5 вания, X;

Матрица Результаты 4-й шаг Коэф- Обозна- Ранжиропланирования опытов расчета по фициент чение ванный

ПФЭ 2 (активность алгоритму регрессии строк в ряд IcJ фермента Иейтса (Си) Ь; матрице мкмоль/мл среды)

Опыт

1 — — — — 12 491 30,7 1

2 + — — - 26 74 4,6 XI 3

3 - + — - 26 77 4,8 Х2 5

4 + + — - 37 -17 -1Д XI х2 5

5 — — + - 20 48 3,0 Хз 7

6 + — + - 34 -3 -0,2 X] Хз 7

7 - + + - 34 -17 -1Д Х2Хз 7

8 + + + - 40 7 0,4 XI Х2 Хз 13

9 — — — + 19 32 2,0 Х4 13

10 + — — + 30 -18 -1Д Xl Х4 17

11 - + — + 32 -13 -0,8 Х2Х4 17

12 + + — + 39 -5 -0,4 Xi Х2 Х4 18

13 — — + + 30 -5 -0,4 Хз Х4 32

14 + — + + 36 -13 -0,8 Xi Х3 Х4 48

15 — + + + 36 -7 -0,4 Х2Х3Х4 74

16 + + + + 40 7 0,4 Xi Х2 Хз Хд 77

На исходной среде 10 р' 1

0,8 0,6 Н 0,4 0,2 0

ОХ:

ЭСч

I-1-1-1-1-1-1-1-1

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Ранжированный ряд |Си|

Рисунок 5. 1/2-нормальный график для оценки значимости коэффициентов регрессии.

Следовательно, движение в найденном направлении градиента (крутое восхождение) должно привести к получению оптимальной по составу среды. Так как полученная модель адекватно описывает процесс в исследуемой области, то направление градиента было определено непосредственно величинами коэффициентов регрессии при линейных членах. Расчет величины шага варьирования для движения по градиенту (Xi ) представлен в таблице 11.

Приняв за исходный уровень центр полного факторного эксперимента, была расчитана серия опытов, в которой изменяли концентрацию факторов xi, хг, хз и Х4 на величину X*. Остальные факторы фиксировали на исходном уровне. Результаты эксперимента представлены в таблице 12.

Таблица 11. Крутое восхождение по результатам ПФЭ-24. Расчет X*.

Xi х2 Х3 Х4 глюкоза) (сульфат (кукурузный (СаСОз) аммония) экстракт)

Исходный уровень (центр 10 2 4 10

ПФЭ-24)

Ед. варьирования, X, 5 1 2 5

Коэффициент регрессии, Ь; 4,6 4,8 3 2 kh 23 4,8 6 10

Коэффициент 5,2 1 1,25 2,1 пропорнациональности, к; яГ 5,2 1 1,25 2Д

Таблица 12. Результаты опытов по методу крутого восхождения.

X! х2 Х3 Х4 Глутаматоксидазная глюкоза) (сульфат (кукурузный (СаСОз) активность Streptomyces sp. аммония) экстракт) Z-l 1 (ед/мл среды)

Г/л Г/л Г/л Г/л Эксперимен- Значения, тально полу- полученные по ченные линейной значения модели

1 10,0 2 4,0 10,0 0,02

2 15,2 3 5,25 12,1 0,046 0,045

3 20,4 4 6,5 14,2 0,06 0,059

4 25,6 5 7,75 16,3 0,08 0,074

5 30,8 6 9,0 18,4 0,10 0,090

6 36,0 7 10,25 20,5 0,09 0,120

В итоге, оптимизация состава среды и условий культивирования природного штамма-продуцента внеклеточной глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1 позволила повысить биосинтетическую активность культуры и получить 10-ти кратное увеличение выхода внеклеточного фермента по сравнению с исходным уровнем (от 0,01 до 0,1 ед/мл среды).

Было обнаружено, что образование глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1 идет параллельно росту культуры и достигает максимума уже через 44 ч от начала культивирования (рис. 6). Это является большим преимуществом данного штамма по сравнению с другими известными продуцентами глутаматоксидазы, при выращивании которых максимальное накопление фермент наблюдали только через 72-144 часа от начала культивирования.

0,1 1

0,08

0,06

0,04

0,02 а

4 и

Рн К

5 и 2 й о о а Я о к ю

0 Ф Oia v |-1-1-1-1

0 10 20 30 40 50 60

-1-1-1-1-1

0 10 20 30 40 50 60 время культивирования, ч время культивирования, ч

Рисунок 6. Зависимость роста и активности глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-11 от времени культивирования на среде с глюкозой, (а) активность фермента, (б) рост культуры.

Следует отметить, что после достижения максимума глутаматоксидазная активность заметно падала (рис. 6). Было сделано предположение, что, возможно, секретируемый фермент, присутствующий в среде культивирования в концентрации выше определенной пороговой величины, сам подавляет свой синтез. Установлено, что внесение избытка ферментного препарата глутаматоксидазы (0,1 ед/мл среды) в растущую культуру Streptomyces sp. Z-l 1 после 20 часов культивирования вело к прекращению прироста активности фермента в среде (рис. 7)

0 10 20 30 40 50 60 время культивирования, ч

Рисунок 7. Биосинтез глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1. (1) с добавлением и (2) без добавления ферментного препарата (0,1 ед/мл среды).

Специфичность влияния фермента на биосинтез подтверждалась тем, что только активный фермент обладал регуляторным действием. Внесение в среду неактивного фермента не подавляло процесс возрастания активности глутаматоксидазы.

Переход культуры в стационарную фазу роста, как показали опыты при выращивании Streptomyces sp. Z-l 1 на среде с глюкозой, связан с исчерпанием углеродного субстрата. Фермент появлялся в среде культивирования только после 50% потребления глюкозы, при этом максимальная активность глутаматоксидазы была обнаружена при исчерпании углеродного субстрата почти на 97% (рис 8). а)

0 10 20 30 40 50 60 время культивирования, ч л « о О-о ч я ci о £

S о К ю

-1-1-1-1-1

10 20 30 40 50 60 время культивирования, ч 0 3 аз п

5 о И 8 рЗ сЗ н кв ч

D Он о .S и ев

0,1

0.08

0,06

0,04

0,02

1 г

0 10 20 30 40 50 60 время культивирования, ч

Рисунок 8. Динамика потребления глюкозы, накопление биомассы и активность глутаматоксидазы при выращивании Streptomyces sp. Z-l 1. (а) содержание глюкозы в среде, (б) рост культуры, (с) активность фермента.

7.2. Влияние ионов кальция на секрецию внеклеточной L-глутаматоксидазы

Streptomyces sp. Z-ll.

В литературе встречаются сведения о положительном влиянии ионов кальция на синтез и секрецию экзоферментов (Безбородов и Астапович, 1984; Li a. Zhong, 1996). В связи с этим было изучено влияние ионов кальция на биосинтетическую активность Streptomyces sp. Z-ll. Установлено, что, с одной стороны, добавление к среде культивирования хлорида кальция несколько подавляет рост микроорганизма, при этом степень подавления зависит от концентрации СаСЬ (рис. 9а). Так, на средах без кальция или с низким содержанием последнего (0,10,2%) изучаемый штамм рос значительно быстрее. Биомасса достигала максимума уже через 44 часа от начала культивирования, тогда как на средах с более высокими концентрациями кальция (0,3-0,5%) — только через 48 ч от начала выращивания (рис. 9а).

С другой стороны, добавление к среде культивирования хлорида кальция стимулировало биосинтез глутаматоксидазы и значительно сокращало время максимального накопления фермента, что является большим преимуществом при его промышленном синтезе (рис. 96). Глутаматоксидазная активность Streptomyces sp. Z-l 1 на средах с 0,3-0,5% СаСЬ достигала максимума уже через 28 часов от начала культивирования, тогда как на средах без кальция или с его низким содержанием (0,1-0,2%) — только через 48 часов от начала выращивания (рис. 96). Максимальная активность глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-ll была обнаружена при добавлении в среду 0,3% хлорида кальция. а)

CaCEz

0%

•0,1%

0,2%

-0,3%

0,4%

-0,5%

10 20 30 40 50 60 время культивирования, ч б)

0,14 0,12 -I

0,1

0,08 -0,06 0,04 0,02

0 *

-в—

С a CSz о% —•—0,1%

-А-0,2% ■0,3% •0,4% •0.5%

10 20 30 40 50

60 время культивирования, ч

Рисунок 9. Влияние ионов кальция на рост и активность глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1. (а) рост культуры, (б) активность фермента

На основании проведенных исследований был разработан лабораторный регламент культивирования Streptomyces sp. Z-l 1 с целью получения внеклеточной глутаматоксидазы из данного стрептомицета.

7.3. Индуцированный мутагенез природного штамма-продуцента.

7.3.1. Естественная изменчивость Streptomyces sp. Z-ll.

При работе с природным штаммом-продуцентом, Streptomyces sp. Z-ll, была обнаружена его спонтанная изменчивость как по морфологии колоний, так и по способности образовывать внеклеточную L-глутаматоксидазу. Моноспоровый рассев изучаемого стрептомицета на картофельном агаре показал, что культура по своим морфологическим признакам неоднородна и представлена пятью типами колоний. 1 тип — плотные, врастающие в агар, концентрические колонии со светлым фестончатым краем, d ~ 3-5 мм. Поверхность колонии покрыта хорошо развитым, серым, бархатистым воздушным мицелием. II тип — круглые колонии с фестончатым краем, d ~ 2-3 мм, с хорошо развитым воздушным мицелием серого цвета. III тип — крупные круглые колонии 5-7 мм в диаметре, слегка выпуклые в центре, с фестончатым краем. Воздушный мицелий хорошо развит, белого цвета. IV тип — колонии 2-3 мм имеют воздушный мицелий только в центре. Центр колонии серого цвета, а края беловатые, ровные или слегка фестончатые. V тип — мелкие, 12 мм в диаметре, опушенные колонии белого цвета. В основном, в данной популяции стрептомицета преобладали колонии 1 и II типов. Варианты, полученные из этих колоний, синтезировали глутаматоксидазу с активностью 0,14 и 0,10 ед/мл среды соответственно, в то время как варианты, полученные из колоний других морфологических типов, были значительно менее активны (табл. 13). Активность же исходной (контрольной) популяции стрептомицета составляла 0,08 ед/мл среды.

Таблица 13. Глутаматоксидазная активность вариантов Streptomyces sp. Z-l 1, полученных при моноспоровом рассеве на картофельном агаре, из колоний разных морфологических типов.

Морфологический тип колонии Количество колоний при моноспоровом рассеве, % Активность фермента, ед/мл среды

1тип 54 0,14

II тип 30 0,10

III тип 12 0,06

IV тип 3 0,04

V тип 1 0,01

Контроль(исходная популяция) 0,08

Варианты, полученные при моноспоровом рассеве Streptomyces sp. Z-ll, были трижды пересеяны на картофельный агар с интервалом в 14 суток. После этого для каждого из вариантов был проведен популяционный анализ. В качестве контроля использовали исходный штамм стрептомицета, который после трех пересевов также был подвергнут популяционному анализу. Результаты эксперимента представлены в таблице 14.

Таблица 14. Изменчивость и глутаматоксидазная активность полученных при моноспоровом рассеве вариантов Streptomyces sp. Z-l 1 после трех пересевов их на картофельном агаре.

Морфологический тип колоний Количество колоний разных морфологических типов, % Активность фермента, ед/мл среды

I II III IV V

I 70 29 0,6 0,3 ОД 0,2

II 30 69 0,5 0,5 0 0,14

III 28 50 16 1,6 4,9 0,07

IV 6 0 0 0 93 0,00

V 12 88 0 0 0 0,09

Контроль 1 (исходный штамм без пересевов) 76 19 2 2 1 0,10

Контроль 2 (исходный штамм после пересевов) 45 22 13 16 4 0,05

Как видно из приведенных результатов, большинство полученных при рассеве пяти вариантов колоний были представлены I и II морфологическими типами, т. е. морфология колоний этих типов сохранилась. Глутаматоксидазная активность вариантов, полученных из таких колоний, по сравнению с вариантами того же типа до пересевов несколько повысилась — от 0,1 до 0,14 ед/мл среды (II тип) и от 0,14 до 0,2 ед/мл среды (I тип). Морфология колоний других вариантов (III, IV и V типов) существенно изменилась. По-видимому, они не являлись стабильными морфологическими вариантами. Так, при пересеве варианта Ш-го морфологического типа в основном преобладали колонии I и II типов, колонии же III типа составляли всего 16 %, в то время как V вариант был представлен колониями только I и II типа (табл. 14). Кроме того, трехкратный пересев исходного штамма привел к изменению количественного соотношения морфологических типов колоний в сторону уменьшения содержания наиболее активного I типа. Это, вероятно, и приводило к снижению глутаматоксидазной активности популяции в целом при ее многократных пересевах на плотные среды. Поэтому, в дальнейшем, пересев с одной агаризованной среды на другую осуществляли после предварительного выращивания Streptomyces sp. Z-l 1 в жидкой среде.

Так как варианты I типа показали наибольшую активность (0,2 ед/мл), то их подвергли повторному популяционному анализу с последующим отбором линий этого же типа. Однако следует отметить, что отбор активных вариантов на фоне естественной изменчивости культуры Streptomyces sp. Z-l 1 не дал положительных результатов, так как все выделенные клоны теряли повышенную активность уже во второй или третьей генерации.

7.3.2. Индуцированная мутагеном изменчивость природного штамма

Streptomyces sp. Z-l 1.

Известно, что классическим способом увеличения выхода фермента является мутационно-селекционный подход, который заключается в тотальной проверке обработанных мутагеном культур и отборе среди них штаммов с высоким выходом продукта.

С целью повышения биосинтетической активности культуры природный штамм Streptomyces sp. Z-l 1 подвергли мутагенной обработке азотистой кислотой с последующим многоступенчатым отбором наиболее активных клонов. Наиболее продуктивные варианты отбирали с помощью модифицированного нами состава минимального верхнего агара F (см. раздел 5.2).

Было обнаружено, что L-глутамат в концентрации 0,2% и выше ингибирует рост неактивных и замедляет процесс спорообразования у низкопродуктивных клонов. Только высокопродуктивные клоны были способны к росту и спорообразованию при высоких концентрациях глутамата в среде. Это может быть связано, с одной стороны, с необходимостью синтезировать высокоактивный фермент для окисления большого количества глутамата, а с другой стороны — с возникающими в процессе мутагенеза генетическими изменениями, вероятно, приводящими к снятию катаболитной репрессии, вызываемой высокими концентрациями глутамата. Поэтому после каждого мутационного цикла наиболее активные вырианты пересевали на агаризованную среду, содержащую глутамат. Вариант с хорошо развитым воздушным мицелием использовали для дальнейшей мутагенной обработки.

Из 1386 проверенных клонов, полученных после первой обработки азотистой кислотой спор и мицелия природного штамма Streptomyces sp. Z-11, только 14 проявляли глутаматоксидазную активность. Три наиболее продуктивные из тестируемых вариантов подвергли новому мутагенному воздействию. На первом этапе мутагенеза в результате трех последующих мутационных циклов были отобраны пять наиболее активных варианта. Оказалось, что после трех пересевов на агаризованную среду с 0,2% глутамата способность большинства полученных клонов к стабильному образованию высокоактивного фермента снизилась, за исключением одного Streptomyces sp. Z-l 1-6' (0,6 ед/мл среды), который и был взят в качестве материнского для последующей обработки азотистой кислотой (табл. 15а).

Таблица 15а. Глутаматоксидазиая активность наиболее продуктивных вариантов, отобранных на первом этапе мутагенеза природного штамма Streptomyces sp. Z-ll, после трех пересевов на среду с 0,2% глутамата. пересева Глутаматоксидазиая активность полученных вариантов после каждого пересева на среду, содержащую 0,2% глутамата (ед/мл среды)

Z-11-1' Z-11-6' Z-11-9' Z-11-7' Z-11-24'

1 0,193 0,602 0,146 0,156 0,291

2 0,191 0,610 0,120 0,158 0,270

3 0,104 0,601 0,110 0,132 0,220

Таблица 156. Глутаматоксидазиая активность наиболее продуктивных вариантов, отобранных на втором этапе мутагенеза, после трех пересевов их на среду с глутаматом.

Материнский штамм Streptomyces sp. Z-11-6', полученный на 1 этапе мутагенеза № мутационного цикла

1 2 3 4

Глутамат- Z-11-5 Z-11-12 Z-11-7 Z-11-6 оксидазиая 0,60 0,64 0,76 0,91 1,65 активность ед/мл среды)

На втором этапе мутагенеза наиболее активные варианты, отобранные после каждого мутационного цикла, трижды пересевали на агаризованную среду, содержащую L-глутамат, концентрацию которого увеличивали от 0,2 до 0,5% при переходе от первого к четвертому мутационному циклу. Вариант с хорошо развитым воздушным мицелием подвергали дальнейшей обработке мутагеном (табл. 156). Как видно из представленных результатов, наиболее продуктивным оказался полученный после проведения четвертого мутационного цикла вариант Z-11-6, глутаматоксидазная активность которого — 1,65 ед/мл среды (табл. 156). Стабильность полученного штамма также оказалась высока. При многократных пересевах Streptomyces sp. Z-l 1-6 сохранял свои свойства и не снижал способности к синтезу высокоактивного фермента. Было обнаружено, что при культивировании Streptomyces sp. Z-l 1-6 на средах, содержащих дрожжевой или кукурузный экстракты, он образует меланоидные пигменты в значительно меньшем количестве, чем природный, что облегчает выделение и очистку фермента.

Таким образом, оптимизация состава среды и последующий мутагенез природного штамма-продуцента Streptomyces sp. Z-l 1 позволили увеличить выход фермента в 160 раз по сравнению с исходным уровнем (табл. 16).

Таблица 16. Увеличение глутаматоксидазной активности природного штамма-продуцента Streptomyces sp. Z-l 1 в результате оптимизации состава среды и последующего мутагенеза.

Исходный штамм Streptomyces sp. Z-ll на неоптимизиро-ванной среде Исходный штамм Streptomyces sp. Z-l 1 на оптимизированной среде Материнский штамм Streptomyces sp. Z-l 1-6', полученный на 1 этапе мутагенеза Штамм Streptomyces sp. Z-l 1-6, полученный на 2 этапе мутагенеза

Глутаматоксидазная активность (ед/мл среды) 0,01 0,1 0,60 1,65

Глава 8. Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства мутантного штамма Streptomyces sp. Z-l 1-6.

8.1. Морфолого-культуральные свойства Streptomyces sp. Z-l 1-6.

Вегетативные гифы Streptomyces sp. Z-l 1-6 образуют хорошо развитый разветвленный мицелий, не распадающийся на фрагменты. Гифы воздушного мицелия — 0,8-1,1 мкм в диаметре — в зрелом состоянии несут цепочки спор в виде хорошо развитых правильных спиралей от трех до семи оборотов (рис. 10) Споры — 0,6-0,7 х 0,9-1,1 мкм — циллиндрические с гладкой поверхностью, неподвижны (рис. 11).

На поверхности плотной среды в чашках Петри Streptomyces sp. Z-l 1-6 образует плотные, врастающие в агар, концентрические колонии с фестончатым краем, d ~2-3 мм. Поверхность колонии покрыта серым бархатистым воздушным мицелием, который обладает ярко выраженными гидрофобными свойствами.

Проведено сравнительное изучение морфолого-культуральных свойств мутантного штамма на разных диагностических средах. Результаты исследования представлены в таблице 17.

Рисунок 10. Фотографии цепочек спор Streptomyces sp. Z-l 1-6. Фазовый контраст, 400 х. (а) 10-ти дневная культура, (б) 14-ти дневная культура.

Рисунок 11. Электронная микрофотография цепочки спор

Streptomyces. sp. Z-l 1-6 (15000 х).

Таблица 17. Морфолого-культуральные свойства Streptomyces sp. Z-l 1-6 на разных диагностических средах.

Показатель Среда ^^^^ Воздушный мицелий Субстратный мицелий Растворимый пигмент

Минеральный агар 1 Хорошо развит, серый Сначала слабо желтовато-серый, позднее становится серым Нет

Глицерин-нитратный агар Отсутствует От желтого до серовато-желтого Слегка желтоватый

Органический агар 2 Скудный, белый Бурый Бурый

Овсяный агар Хорошо развит, серый Сначала слабо серовато-желтый, позднее — серый Нет

Пептонно-дрожжевой агар с железом, ISP 6 Хорошо развит, светло-серый Бурый Образует меланоидные пигменты

Глюкозо-аспарагиновый агар Слабо развит, светло-серый Слабо желто-кремовый Нет

Глюкозо-нитратный агар Хорошо развит, светло-серый Желто-бурый Нет

Глицерин-аспарагиновый агар, ISP 5 Скудный, светло-серый Серовато-желтый Нет

Крахмало-аммиачный агар ISP, 4 Хорошо развит, светло-серый Желтовато-буро-серый Нет

Из представленных результатов видно, что по своим морфолого-культуральным свойствам штамм Streptomyces sp. Z-l 1-6 близок к природному, Streptomyces sp. Z-11 (табл. 18).

Таблица 18. Сравнение морфолого-культуральных свойств мутантного штамма Streptomyces sp. Z-l 1-6 и природного штамма Streptomyces sp. Z-l 1 на разных диагностичских средах.

Среда Мутантный штамм Streptomyces sp. Z-l 1-6 Природный штамм Streptomyces sp. Z-11

1 2 3

Минеральный агар 1 ВМ хорошо развит, серый, СМ сначала слабо желтовато-серый, позднее становится серым, РП нет ВМ хорошо развит, серый, СМ серовато-бурый, РП нет

Глицерин-нитратный агар ВМ отсутствует, СМ от желтого до серовато-желтого, РП слегка желтоватый ВМ скудный, светлосерый, СМ серовато-буровато-желтый, РП слегка желтоватый

Органический агар 2 ВМ скудный, белый, СМ бурый, РП бурый ВМ белый, СМ бурый, РП бурый

Овсяный агар ВМ хорошо развит, серый, СМ сначала слабо серовато-желтый, позднее становится серым, РП нет ВМ хорошо развит, серый, СМ серовато-бурый, РП нет

Таблица 18. Продолжение.

1 2 3

Глюкозо-аспараги- ВМ слабо развит, светло- ВМ слабо развит, светлоновый агар серый, СМ слабо желто- серый, СМ слабо желтокремовый, РП нет кремовый, РП нет

Пептонно-дрожжевой агар с железом, ISP 6 ВМ хорошо развит, светлосерый, СМ бурый, образует меланоидные пигменты ВМ хорошо развит, светлосерый, СМ бурый, образует меланоидные пигменты

Глюкозо-нитратный ВМ Хорошо развит, ВМ Хорошо развит, агар светло-серый, СМ желто- светло-серый, СМ желтобурый, РП нет бурый, РП нет

Глицерин-аспарагиновый агар ISP, 5 ВМ скудный, светлосерый, СМ серовато-желтый, РП нет ВМ скудный, светлосерый, СМ серовато-желтый, РП нет

Крахмал о-аммиачный агар, ISP 4 ВМ Хорошо развит, светло-серый, СМ желтовато-буро-серый, РП нет ВМ Хорошо развит, светло-серый, СМ желтовато-буро-серый, РП нет

8.2. Физиолого-биохимические свойства Streptomyces sp. Z-l 1-6.

Рост Streptomyces sp. Z-l 1-6 был обнаружен при рН от 5,0 до 8,0 с оптимумом — 7,0-7,2 и в интервале температур — от 20 до 32°С с оптимальной температурой для роста — 28°С.

Хороший рост Streptomyces sp. Z-l 1-6 наблюдали на среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии глюкозу, арабинозу, сахарозу, ксилозу, маннит, фруктозу, галактозу, мальтозу, рамнозу, крахмал и глицерин. Изучаемый штамм относительно хорошо потреблял раффинозу, не использовал инозит. Органические спирты в качестве источника углерода данный штамм не использовал. Слабый рост Streptomyces sp. Z-l 1-6 наблюдали на среде с пируватом и цитратом. Формиат, лактат, ацетат, малат, сукцинат, оксалоацетат, фумарат не поддерживали рост культуры.

Установлено, что лучшим источником азота для биосинтетических целей Streptomyces sp. Z-l 1-6 является аммоний. Нитрат аммония не поддерживал рост культуры. На среде, содержащей в качестве источника азота нитраты (калия или натрия) или мочевину, скорость роста Streptomyces sp. Z-l 1-6 была значительно ниже, чем на среде с сульфатом аммония. Из аминокислот в качестве единственного источника азота штамм хорошо использовал пролин, треонин, серин, гистидин, глутамин, валин и глутамат. В отличие от природного штамма Streptomyces sp. Z-l 1-6 был способен к росту на среде с 0,5% глутамата. Цистеин, фенилаланин и аспарагин не поддерживали рост культуры. Слабое развитие Streptomyces sp. Z-l 1-6 наблюдали на среде с метионином. На среде без экзогенного источника азота и углерода рост культуры не обнаружен.

Хлорамфеникол, эритромицин, канамицин, стрептомицин, линкомицин, тетрациклин, пенициллин и нистатин в концентрации 100 мкг/мл полностью подавляли развитие мутантного штамма.

В присутствии ингибиторов слабый рост Streptomyces sp. Z-l 1-6 был обнаружен на среде с 0,1% фенола, 0,0001% кристаллического фиолетового и 0,01% азида натрия. Более высокая концентрация азида натрия (0,02%) полностью подавляла рост культуры.

От известных продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-11-6 отличается способностью к стабильному образованию высокоактивного фермента при выращивании его в течение суток на дешевой полусинтетической среде с глюкозой и кукурузным экстрактом. Известные же штаммы-продуценты синтезируют фермент при выращивании их в течение 7-10 суток на средах сложного состава, содержащих пептон, дрожжевой экстракт и крахмал.

Как и в случае с природным штаммом, добавление к среде культивирования Streptomyces sp. Z-l 1-6 хлорида кальция, с одной стороны, несколько подавляло рост микроорганизма, при этом степень подавления зависела от концентрации СаС12, а с другой стороны — стимулировало биосинтез глутаматоксидазы и значительно сокращало (до 28 ч) время максимального накопления фермента.

Таким образом, по своим физиолого-биохимическим свойствам мутантный штамм, Streptomyces sp. Z-l 1-6, близок к природному. Основными его отличиями являются: способность расти при высоких концентрациях глутамата в среде, чувствительность к пенициллину и нистатину, образование в небольшом количестве пигментов меланоидного типа и высокая биосинтетическая активность. Штамм Streptomyces sp. Z-l 1-6 был депонирован в коллекции культур кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова (КМ МГУ) под номером 434.

Были рассмотрены возможные варианты длительного хранения штамма-продуцента. Установлено, что данный штамм можно сохранять в жизнеспособном состоянии длительное время в лиофилизированном виде, на скошенном агаре под вазелиновым маслом или без него при 4°С. Во всех случаях у выросших культур после хранения сохранялась прежняя способность к синтезу внеклеточной L-глутаматоксидазы (табл. 19).

Таблица 19. Изменение активности глутаматоксидазы при разных условиях хранения штамма Streptomyces sp. Z-l 1-6

Способ хранения В пробирке на агаризованной среде при 4°С В пробирке на агаризованной среде под вазелиновым маслом при 4°С Лиофильные клетки при 4°С

Время хранения, мес. 6 12 6 12 6 12

Продуктивность штамма, % от исходной 98 94 96 94 80 76

Глава 9. Выделение и очистка внеклеточной L-глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6.

Был разработан метод выделения и очистки внеклеточной глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6. Мицелий выросшей культуры отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через плотную ткань. Фильтрат концентрировали в 10 раз на разделительном аппарате АР - 0,1 ("Биотест", г. Кириши, РФ). Для осаждения белковой смеси фильтрата использовали сульфат аммония (50% от насыщения). Осадок, собранный центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин., перерастворяли в 25 мМ К-фосфатном буфере с 60 мМ NaCl (рН 7,0). Полученный раствор фермента диализовали в 2,5 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,0) в течение 20 ч. Диализат пропускали через колонку (2,0 х 25 см) с ДЕАЕ-целлюлозой, уравновешенную 25 мМ К-фосфатным буфером (рН 7,0). Элюирование проводили 0,5 М К-фосфатным буфером (рН 6,0). Отобранные активные фракции фракции концентрировали ультрафильтрацией через Amicon Р—10 мембрану и пропускали через колонку (1,5 х 100 см) с Сефадексом G-150, уравновешенную 50 мМ К-фосфатным буфером (рН 7,0). Элюирование проводили тем же буфером со скоростью 20 мл/ч. Очищенный таким образом в 974 раза фермент имел удельную активность 45,5 ед/мг белка, а выход его составил примерно 35%. Отобранные фракции (70-100 мл) высушивали в вакууме. После сушки удельная активность фермента была около 35 ед/мг белка. Основные стадии очистки фермента приведены в таблице 20.

Таблица 20. Основные стадии очистки внеклеточной L-глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6.

Стадия очистки Суммарный белок, мг Суммарная активность, ед Удельная активность, ед/мг белка Степень очистки

Фильтрат (культуральная жидкость, 1 л) 25000 1400 0,056

Высаливание 1000 1100 U 15,7

ДЕАЕ-целлюлоза 1 90 1000 ПД 159

ДЕАЕ-целлюлоза 2 31 975 31,5 450

Сефадекс G-150 11 500 45,5 974

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Сухачева, Марина Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Из почв агроценозов разных географических зон России, ближнего и дальнего зарубежья было выделено 7 штаммов-продуцентов внеклеточной L-глутаматоксидазы. Изучены морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства наиболее продуктивных штаммов.

2. Оптимизация состава среды и последующий мутагенез природного штамма-продуцента позволили увеличить выход внеклеточной L-глутаматоксидазы в 160 раз по сравнению с исходным уровнем.

3. Получен генетически устойчивый мутантный штамм Streptomyces sp. Z-l 1-6, синтезирующий внеклеточную глутаматоксидазу с активностью 1,6 ед/мл среды при выращивании его в течение суток на дешевой полусинтетической среде с глюкозой и кукурузным экстрактом.

4. Предложен оригинальный метод выделения и очистки внеклеточной L-глутаматоксидазы. Изучены свойства очищенного фермента.

5. Разработан лабораторный регламент культивирования Streptomyces sp. Z-l 1-6 в целях получения ферментного препарата из данного микроорганизма, а на основе глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6 разработан метод определения трансаминаз в сыворотке крови и создан диагностический набор (ООО "Импакт"), позволяющий определять активность трансаминаз при клинико-диагностических и биохимических исследованиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенные исследования по поиску и идентификации природного штамма-продуцента внеклеточной L-глутаматоксидазы дополнили данные об источниках получения этого фермента. Из почв агроценозов и биогеоценозов разных географических зон России, ближнего и дальнего зарубежья было выделено 1284 штаммов актиномицетов. Из них получена коллекция культур, включающая 7 штаммов-продуцентов внеклеточной глутаматоксидазы. В целях идентификации было проведено сравнительное изучение морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств наиболее активных продуцентов этого фермента.

Оптимизация состава среды и условий культивирования природного штамма-продуцента позволила повысить биосинтетическую активность культуры и получить 10-ти кратное увеличение выхода внеклеточного фермента по сравнению с исходным уровнем. Было обнаружено, что добавление в среду культивирования хлорида кальция оказывает положительное влияние на секрецию внеклеточной глутаматоксидазы, значительно сокращая время максимального накопления фермента.

Мутагенез азотистой кислотой и последующий многоступенчатый отбор наиболее продуктивных вариантов привел к получению мутантного штамма, Streptomyces sp. Z-l 1-6, обладающего способностью к стабильному образованию внеклеточной глутаматоксидазы с активностью 1,6 ед/мл среды. По своим морфолого-культуральным и физиолого-биохимическим свойствам данный штамм близок к природному. Основными его отличиями являются: способность к росту при высоких концентрациях глутамата в среде, чувствительность к нистатину и пенициллину, образование в небольшом количестве пигментов меланоидного типа и синтез высокоактивного фермента. В отличие от других продуцентов глутаматоксидазы, синтезирующих фермент при выращивании их в течение 7-10 суток на средах сложного состава с пептоном, дрожжевым экстрактом и крахмалом, Streptomyces sp. Z-l 1-6 способен к образованию высокоактивного фермента при выращивании его в течение суток на дешевой полусинтетической среде с глюкозой и кукурузным экстрактом. Штамм депонирован в коллекции культур кафедры микробиологии МГУ им. М. В. Ломоносова (КМ МГУ) под номером 434.

На основании проведенных исследований разработан лабораторный регламент культивирования Streptomyces sp. Z-l 1-6 в целях получения ферментного препарата из данного микроорганизма.

Предложенный метод выделения и очистки внеклеточной глутаматоксидазы позволил получить очищенный в 974 раза ферментный препарат с удельной активностью 45,5 ед/мг белка и выходом примерно 35%. По своим свойствам глутаматоксидаза Streptomyces sp. Z-l 1-6 не уступает зарубежным аналогам и характеризуется высокой температурной стабильностью, устойчивостью к ионам меди, ПХМБ и хелатирующим агентам, высокой субстратной специфичностью, возможностью работы в широком диапазоне значений рН, а также стабильностью при длительном хранении.

На основе глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6 разработан метод определения трансаминаз в сыворотке крови, который не требует сложного оборудования. Для его реализации может быть использовано фотометрическое оборудование, обеспечивающее измерение оптической плотности раствора при длине волны 490 - 540 нм в диапазоне 0-1,0 единиц оптической плотности.

На основе глутаматоксидазы Streptomyces sp. Z-l 1-6 создан диагностический набор (ООО "Импакт"), позволяющий определять активность трансаминаз в биологических жидкостях при клинико-диагностических и биохимических исследованиях. Предлагаемый набор характеризуется высокой специфичностью, так как присутствие других аминокислот не оказывает влияние на проведение определения и его результаты, точностью и простотой в применении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сухачева, Марина Владимировна, Москва

1. Атлас спор избранных родов и видов Actinomycetaceae. Варшава: Польское мед. изд-во, 1970.

2. Безбородое А. М., Астапович Н. И. Секреция ферментов у микроорганизмов. -М.: Наука, 1984.-70 с.

3. Безбородое А. М. Биотехнология продуктов микробного синтеза. М.: Агропромиздат, 1991. - 238 с.

4. Безбородое А. М. Ферментативные реакции в биотехнологии. М.: Наука, 1994. -64 с.

5. Березов Т. Т., Лукашева Е. В., Смирнова Е. П. К вопросу об определении активности оксидаз L-аминокислот // Вопросы мед. химии. 1987. - № 1.1. С.127-132.

6. Быков В. А., Манаков М. Н., Панфилов В. И, Свитцов А. А., Тарасова Н.Б. Производство белковых веществ. М.: Высшая школа, 1987. - 143 с.

7. Вавилин В. А., Васильев В. Б., Рытов С. В. Моделирование деструкции органического вещества сообществом микроорганизмов. М.: Наука, 1993. - 202 с.

8. Виноградова К. А. L-глутаматоксидаза Streptomyces. Свойства фермента, его получение и методы определения его активности // Антибиотики и химиотерапия. 1999а. - Т. 44. - № 8. - С. 23-29.

9. Виноградова К. А. L-глутаматоксидаза Streptomyces: использование в клинической и фундаментальной медицине // Антибиотики и химиотерапия. -1999b. Т. 44. - № 9. - С. 37^9.

10. Воробьева Л. И. Техническая микробиология. М.: МГУ, 1987. - 168 с.

11. Гаузе Г. Ф., Преображенская Т. П., Свешникова М. А., Терехова JL П., Максимова Т. С. Определитель актиномицетов. М.: Наука, 1983. - 246 с.

12. Герхардт Ф. (ред.). Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1984. - С. 8-166.

13. Даценко 3. М. Лабораторная технология биопрепаратов // Укр. биохим. журн. -1995. Т. 67. - № 3. - С. 40-43.

14. Додзин М. Е., Виноградова К. А., Котова И. Б. Новые продуценты L-глутаматоксидазы Streptomyces litmocidini и Streptomyces cremeus II Антибиотики и химиотерапия. - 1998. - Т. 43. - № 4. - С. 7-13.

15. Егоров Н. С. (ред.) Практическое руководство по микробиологии. М.: МГУ, 1976.-224 с.

16. Егоров Н. С., Олескин А. В., Самуилов В. Д. Биотехнология. Проблемы и перспективы. М.: Высшая школа, 1987. - 159 с.

17. Зенова Г. М., Кураков А. В. Методы определения структуры комплексов актиномицетов и грибов. М.: МГУ, 1988. - 54 с.

18. Зенова Г. М., Эфрон А. Н., Лихачева А. А., Калакуцкий Л. В. Особенности бактериального компонента альгобактериальных ценозов на выходах карбонатных пород // Вестн. Моск. ун-та. 1988. - Сер. 17. Почвоведение. -№ 1. - С. 44-48

19. Зенова Г. М. Почвенные актиномицеты. М.: МГУ, 1992. - 77 с.

20. Зенова Г. М. Стрептомицеты и близкие им роды (перевод) // В кн.: Определитель бактерий Берджи. 9-е изд. / под ред. Заварзина Г. А. М.: Мир, 1997.-Т. 2,- С. 613-710.

21. Звягинцев Д. Г. Почва и микроорганизмы. М., 1987. - 256 с.

22. Калакуцкий Л. В., Агре Н. С. Развитие актиномицетов. М., 1977. - 203 с.

23. Калакуцкий JI. В., Зенова Г. М. Экология актиномицетов // Усп. микробиол. -1984.-№ 19.-С. 203-221.

24. Калакуцкая А. Н. Взаимодействие актиномицетов и водорослей в альго-бактериальных ценозах на выходах карбонатных пород // Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1992. - 23 с.

25. Кожевин П. А. Микробные популяции в природе. М.: МГУ, 1989. - 153 с.

26. Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Изд-во Высшая школа, 1971.-С. 3-69.

27. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. М.: Наука, 1986. - 352 с.

28. Куимова Т. Ф. Влияние условий культивирования и фаз роста на морфологию и ультраструктуру различных микроорганизмов при ферментациях // В кн.: Итоги науки и техники. Микробиология. М.: ВИНИТИ, 1984. - Т. 13. - С. 3-47.

29. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. - Т. 1. - С. 226-269.

30. Лукашева Е. В., Березов Т. Т. Каталитические свойства L-лизин-а-оксидазы из Trichoderma sp. // Прик. биохимия и микробиол. 1988. - Т. 24. - Вып. 4. - С. 459-465.

31. Лукашева Е. В., Веса В. С., Березов Т. Т. Сравнительное физико-химическое изучение L-лизин-а-оксидазы при поверхностном и глубинном способе культивирования Trichoderma sp. И Вопросы мед. химии. 1993. - Т. 39. - №1.1. С. 45—47.

32. Лукашева Е. В., Рубцова М. А., Ковба Г. Г., Березов Т. Т., Егоров А. К. Совместная иммобилизация L-лизин-а-оксидазы и пероксидазы на поровых мембранных носителях // Вопросы мед. химии. 1997. - Т. 43. - № 6.1. С. 566-575.

33. Максимов В. Н., Федоров В. Д. Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов. М.: МГУ, 1969. - 128 с.

34. Максимов В. Н. Многофакторный эксперимент в биологии. М.: МГУ, 1980.-278 с.

35. Меньшикова В. В. (ред.). Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Мир, 1987.-С. 181-190.

36. Полянская Л. М., Звягинцев Д. Г. Популяционная экология актиномицетных популяций в почвах и ее роль в управлении комплексом почвенных микроорганизмов // Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1984. - № 5. - С. 746-755.

37. Потапова О. Л., Смирнова И. П., Веса В. С., Быкова О. Каталитические свойства L-лизин-а-оксидазы // Вопросы мед. химии. 1992. - Т. 38. - № 1. - С. 9-13.

38. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. М.: Мир, 1987. - 118 с.

39. Смирнова И. П., Березов Т. Т. Орто-дианизидиновый микрометод определения активности L-фенилаланин-а-оксидазы // Вопросы мед. химии. 1988. - Т. 34. № 2.-С. 129-131.

40. Смирнова И. П., Березов Т. Т. Исследование субстратной специфичности оксидаз L-аминокислот некоторых штаммов рода Trichoderma И Микробиология. 1989. - Т. 58. - Вып. 1. - С. 49-53.

41. Хадуев С. X., Лукашева Е. В., Смирнова И. П. Некоторые физико-химические свойства L-лизин-а-оксидазы Trichoderma sp. II Вопросы мед. химии. 1988.4.-С. 97-100.

42. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. - 566 с.

43. Ярошик JL В., Дихтярев С. И. Оксидазы L-аминокислот и перспективы их практического применения // Укр. биохим. журн. 1995. - Т. 67. -№ 2.1. С. 18-24.

44. Bains W. Biotechnology from A to Z. 2nd ed. N. Y.: Oxford University Press, 1998. - 420 p.

45. Beppu T. Genes, enzymes and secondary metabolites in industrial microorganisms. The 1995 Thorn Award Lecture // J. Ind. Microbiol. 1996. - V. 16. - № 6.1. P. 360-363.

46. Bergey's Manual of systematic bacteriology / Williams S. T. et al. (Eds.). Baltimore, Hongkong, London, Sydney, 1989. - V. 4.

47. Bohmer A., Muller A., Passarge M., Liebs P., Honeck H., Muller H.-G. A novel L-glutamate oxidase from Streptomyces endus. Purification and properties // Eur. J. Biochem. 1989. - V. 182. - № 2. - P. 327-332.

48. BollandD., Ededstein S. Protein methods. N. Y.: Wiley Liss. Inc., 1991. -P. 230.

49. Botre F., Botre C., Gall M., Lorenti G., Mazzei F., Porcelli F. Determination of glutamic acid decarboxylase activity and inhibition by an H202-sensing glutamic acid oxidase biosensor // Anal. Biochem. 1992. - V. 201. - № 2. - P. 297-320.

50. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. -1976.-V. 72.-P. 248-258.

51. Byfield M., Abuknesha R. Biochemical aspects of biosensors // Biosen. Bioelectron. -1994. V. 9. - № 4-5. - P. 373-400.

52. Chen S., Walgate J., Duerre J. Oxidative deamination of sulfur amino acids by bacterial and snake venom L-amino acid oxidase // Arch. Biochem. Biophys. 1971. -V. 146.-P. 54-63.

53. Chen C., Su Y. Amperometric L-glutamate sensor using a novel L-glutamate oxidase from Streptomycesplatensis NTU 304 // Anal. Chim. Acta. 1991. - V. 243.1. P. 9-15

54. Cooper J., McNeil C., Spoors J. Amperometric enzyme electrode for the determination of aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase in serum // Anal. Chim. Acta. 1991. - V. 245. - P. 57-62.

55. Duerre J., Chakrabarty S. L-amino acid oxidase of Proteus rettgeri II J. Bacteriol. -1975.-V. 121.-P. 656-663.

56. Fleck W., Muller H.-G. Verfahren zur Herstellung einer mikrobiellen (H2O2-bildenden) L-Glutaminsaure-Oxidase // DD Patent 261932 A3. 1988.

57. Gadkari D., Morsdorf G., Meyer O. Chemolithoautotrophic assimilation of dinitrogen by Streptomyces thermoautotrophicus UBT1: identification of an unusual N2-fixing system // J. Bacteriol. 1992. - V. 147. - № 21. - P. 6840-6843.

58. Glazer A., Nikaido N. Microbial biotechnology: fundamentalsof applied microbiology / Freeman W. (ed.). -N. Y„ 1995.

59. Godfrey Т., West S. (ed.). Industrial enzymology. 2nd ed. N. Y.: Stockton Press, 1996. - 609 p.

60. Guntherberg H., Lehmann A., Dittrich F. Analytisches Element zur Bestimmung von Transaminasen in waprigen Fliissigkeiten // DD Patent 263540 Al. 1989.

61. Hale P., Lee H.-S., Okamoto Y., Skotheim T. Glutamate biosensors based on electrical communication between L-glutamate oxidase and a flexible redox polymer // Anal. Lett. 1991. - V.24. - № 3. - P. 345-356.

62. Hashmi M., Anders M. Enzymatic reaction of beta-N-methylaminoalanine with L-amino acid oxidase // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - V. 1074. - № 1. -P. 36-39.

63. Holme D., Goldberg D. Coupled optical rate determinations of amino acid oxidase activity // Biochim. Biophys. Acta. 1975. -V. 377. - № 1. - P. 61-70.

64. Hu R., Wang J., Lei K. Isolation and properties of L-amino acid oxidase from Ophiophagus hannah venom // Sci. Sin. В. 1982. - V. 25. - № 9. - P. 941-952.

65. Ie В., Li Q., Li I., Yu J. The glutamate biosensor and its application to flow injection analysis system // Chin. J. Biotechnol. 1994. - V. 10. - № 2. - P. 83-89.

66. Ishikawa H., Misaki H., Muto N., Toyo I. L-glutamic acid oxidase (H2O2-generating), its production and analytical method therefor // US Patent 4605615. -1986.

67. Kamei Т., Asano K., Suzuki H., Matsuzaki M., Nakamura S. L-glutamate oxidase from Streptomyces violascens. Production, isolation and some properties // Chem. Pharm. Bull. 1983,-V. 31.-№4.-P. 1307-1314.

68. Kamei Т., Asano K., Nakamura S. L-glutamate oxidase from Streptomyces violascens and its utilization // J. Pharmacobio-Dyn. 1985. - Y. 8. - № 2. - P. 40-43.

69. Kamei Т., Asano K., Nakamura S. Determination of serum glutamate oxaloacetate transaminase and glutamate pyruvate transaminase by using L-glutamate oxidase // Chem. Pharm. Bull (Tokyo). 1986. - V. 34. - № 1. - P. 409-412.

70. Korn-Wendisch F., Kutzner H. The familly Streptomycetaceae II In: The prokaryotes. 2 ed. / Balows A. et al. (Eds.). Berlin, Heidelberg, New York, 1992. - V. 1. - P. 921-995.

71. Koyama H. Oxidation and oxygenation of L-amino acids catalyzed by a L-phenyl-alanine oxidase (deaminating and decarboxylating) from Pseudomonassp. P-501 // J. Biochem. (Tokyo). 1984. - V. 96. - № 2. - P. 421-427.

72. Kusakabe H., Kodama K., Kuninaka A. A new antitumor enzyme L-lysine-oxidase from Trichoderma viride. Purification and enzymological properties // J. Biol. Chem. 1980. -V. 255. -№ 3. - P. 976-981.

73. Kusakabe H., Midorikawa Y., Kuninaka A., Yoshino H. Occurrence of a new enzyme, L-glutamate oxidase in a wheat bran culture extract of Streptomyces sp.

74. X-119-6 // Agric. Biol. Chem. 1983a. - V. 47. -№ 1. - P. 179-182.

75. Kusakabe H., Midorikawa Y., Fujishima Т., Kuninaka A., Yoshino H. Purification and properties of a new enzyme, L-glutamate oxidase, from Streptomyces sp.

76. X-l 19-6 grown on wheat brain // Agric. Biol. Chem. 1983b. - V. 47. - № 6. -P. 1323-1328.

77. Kusakabe H., Yamauchi H., Midorikawa Y., Yamasa S. Use of novel L-glutamate acid oxidase // US Patent 4614714. 1986.

78. Kusakabe H., Midorikawa Y. L-glutamic acid oxidase and its production // US Patent 4623626. -1986.

79. Kusakabe H., Midorikawa Y., Yamauchi H. L-glutamic acid oxidase, and its use // Eur. Patent 0097949. 1989.

80. Lechevalier H., Lechevalier M., Gerber N. Chemical composition as a criterion in the classification of actinomycetes // Adv. Appl. Microbiol. 1971. - V. 14. - P. 47-72.

81. Li Q., Ie В., Zhang S., Yu J. Determination of L-glutamate using flow injection analysis with immobilized l-glutamate oxidase reactor // Chin. J. Biotechnol. 1994. -V. 10.-№ 4.-P. 291-297.

82. Li Q., Wang L., Li Y. Color development with rational screening method for improved L-glutamate oxidase-producing strains // Enzyme Microb. Technol. -1996a.-Y. 18.-P. 7-9.

83. Li Q., Ie В., Zhang S., Yu J. Immobilization of L-glutamate oxidase and peroxidase for glutamate determination in flow injection analysis system // Appl. Biochem. And Biotechnol. A. 1996b. - V. 59. - № 1. - P. 53-61.

84. Li Q., Zhong J.-J. Enhancement of L-glutamate oxidase production in liquid fermentation of Streptomyces sp. by calcium addition // Biotechnol. Techniques. -1996. V. 10. - № 6. - P. 453^456.

85. Li Q., Xu J.-J., Zhong J.-J. Production of L-glutamate oxidase and in situ monitoring of oxygen uptake in solid state fermentation of Streptomyces sp. N1 // Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. - V. 62. - P. 243-250.

86. Locci R. Streptomyces and related genera // In: Bergey's Manual of systematic bacteriology / Williams S. (Ed.). Baltimore, Hongkong, London, Sydney, 1989. -V. 4.-P. 2451-2492.

87. Luppa D., Aurich H. Kinetic studies on the reaction mechanism of L-amino acid oxidase from Neurospora crassa II Acta Biol. Med. Ger. 1971. - V. 27 - № 5. -P. 839-850.

88. Male K., Luong J., Gibbs В., Konishi Y. An improved FIA biosensor for the determination of aspartame in dietary food products // Appl. Biochem. Biotechnol. -1993.-V. 38. -№ 3. P. 189-201.

89. Moges G., Johansson G. Flow injection assay for the neurotoxin beta-ODAP using an immobilized glutamate oxidase reactor with prereactors to eliminate glutamate interferences // Anal. Chem. 1994. - V. 66. - № 21. - P. 3834-3839.

90. Moser I., Jobst G., Svasek P., Varahram M., Urban G. Miniaturized Thin Film Glutamate and Glutamine Biosensors // Biosensors and Bioelectronics. 1995. -V. 10.-P. 527-532.

91. Moser I., Jobst G., Svasek P., Varahram M., Urban G. Rapid liver enzyme assay with miniaturized liquid handling system comprising thin film biosensor array // Sensors and Actuators. 1997. - V. 44. - P. 377-380.

92. Murachi Т., Tabata M. Use of a bioreactor consisting of sequentially aligned L-gluta-mate dehydrogenase and L-glutamate oxidase for the determination of ammonia by chemiluminescence // Biotech. Appl. Biochem. 1987. - V. 9. - P. 303-309.

93. Murachi Т., Tabata M. Method for determination of ammonia // Eur. Patent 0135092 Bl.- 1990.

94. Murthy S. N., Janardanasarma M. K. Identification of L-amino acid / L-lysine-alpha-amino oxidase in mouse brain // Mol. Cell Biochem. 1999. - V. 197. - P. 13-23.

95. Naumova I. В., Potekhina N. V., Duigimbaye C., Shashkov A. S., Terekhova I. P., Preobrazhenskaya T. P. Cell wall polymeres of Actinomadura carminata

96. A 4281 11 Arch. Microbiol. 1986. - V. 176. - № 2. - P. 256-262.

97. Nakajima H., Koyama H., Suzuki H. Immobilization of Pseudomonas L-Phe oxidase on a nylon membrane for possible use as an amino acid sensor // Agric. Biol. Chem. -1991. -V. 55. -№ 12. -P. 3117-3118.

98. Niedermann D., Lerch K. Regulation of biosynthesis of L-amino acid oxidase by Neurospora crassa И FEMS Microbiol. Lett. 1991. - V. 63. - P. 309-313.

99. Oron U., Roth D., Bdolah A. Processing of snake venom L-amino acid oxidase during intracellular transport // Exp. Cell Res. 1982. - V. 140. - № 2. - P. 383-388.

100. Passarge M., Bohme A., Renneberg R., Muller H. Verfahren zur Herstellung einer mikrobiellen L-Glutaminsaure-Oxidase // DD Patent 240910 Al. 1986.

101. Passarge M., Liebs P., Sedler H., Ganzel K. Verfahren zur Herstellung einer extrazellularen, H202-bildenden L-Glutamatoxidase // DD Patent 272101 Al. 1989.

102. Pfeiffer D., Scheller F., Wollenberger U., Makower A., Thomma U. Verfahren zur tmpfindlichen Bestimmung von Proteaseaktivitaten sowie Proteinkonzentrationean mittels Biosensoren // DD Patent 284249 A5. 1990.

103. Pistorius E., Voss H. Some properties of a basic L-amino acid oxidase from Anacystis nidulans II Biochim. Biophys. Acta. 1980. - V. 611. - № 2. - P. 227-240.

104. Pollegoni L., Buto S., Tischer W., Ghisla S., Pilone M. Characterization ofD-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis II Biochem. Mol. Biol. Int. 1993. - V. 31. -№4.-P. 709-717.

105. Ponnudurai G., Chung M., Tan N. Purification and properties of the L-amino acid oxidase from Malayan pit viper (Calloselasma rhodostoma) venom // Arch. Biochem. Biophys. 1994. -V. 313. -№2. - P. 373-378.

106. Robinson K. The use of cell wall analysis and gel electrophoresis for the identification of coryneform bacteria // Identification methods for microbiologists. Soc. Appl. Bacter. Techn. 1968. - Ser. 2. - V. 13. - P. 85-87.

107. Rowlands R. Industrial strain improvement: Mutagenesis and random screening procedures // Enzyme Microb. Technol. 1984. - V. 6. - P. 3-10.

108. Rui C., Kato Y., Sonomoto K., Ogawa H. Aflow injection biosensor system for the amperometric determination of creatinine simultaneous compensation of endogenous interferents // Anal. Biochem. 1993. - V. 210. - № 1. - P. 163-171.

109. Rui C., Kato Y., Sonomoto K. Amperometric flow injection analysis of creatinine based on immobilized creatinine deiminase, leucine dehydrogenase and L-amino acid oxidase // Biosens. Bioelectron. - 1994. - V. 9. - № 6. - P. 429-437.

110. Rui C., Kato Y., Sonomoto K., Ogawa H. A multifunctional flow injection biosensor for the determination of ammonia, creatinine and urea // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1995. -V. 31.-№750.-P. 30-38.

111. Ryan M., Lowry J., O'Neill R. Biosensor for neurotransmitter L-glutamic acid designed for efficient use of L-glutamate oxidase and effective rejection of interference // Analyst. 1997. - V. 122. - № 11. - P. 1419-1424.

112. Sanchez E., Magalhaes A. Purification and partial characterization of an L-amino acid oxidase from bushmaster snake (Surucucu Pico de Jaca) Lachesis muta muta venom // Braz. J. Med. Biol. Res. 1981. - V. 24. - № 3. - P. 249-260.

113. Schubert F., Kirstein D., Scheller F. Enzymelecktrode und Verfahren zur Bestimmung von L-glutamat und Transaminasenaktivitat //DD Patent 248605 Al. 1987.

114. Sikora L., Marzluf G. A. Regulation of L-amino acid oxidase and of D-amino acid oxidase in Neurospora crassa II Mol. Gen. Genet. 1982. - V. 186. - № 1.1. P. 33-39.

115. Soda K. Microdetermination of D-amino acids and D-amino acid oxidase activity with 3-Methyl-2-benzothiazolone hydrazone hydrochloride // Anal. Biochem. -1968.-V. 25.-P. 228-235.

116. Suleiman A., Villarta R., Guilbaulf G. Analytical applications of glutamate oxidase based amperometric electrodes // Electrochem. 1992. V. 8. № 4. P. 189-192.

117. Suzuki S. The beginning on recearch and methodology on biosensor // Tanpakushitsu Kakusan Koso. 1997. - V. 42. - № 1. - P. 73-76.

118. Tabata M., Murachi Т., Kusakabe H. A new enzymatic and highly sensitive analysis of serum urea-N using immobilized enzymes and chemiluminescence // Abstracts, 3rd. Congress of the Federation of Asian and Oceanian biochemists. Bangkok. 1983. -P. 115.

119. Tan N., Saifuddin M. Isolation and characterization of an unusual form of L-amino acid oxidase from King cobra (Ophiophagus hannah) venom // Biochem. Int. 1989. -V. 19,-№4.-P. 937-944.

120. Tan N., Swaminathan S. Purification and properties of the L-amino acid oxidase from monocellate cobra (Naja naja Kaouthia) venom // Int. J. Biochem. 1992. - V. 24. -№6.-P. 967-973.

121. Thomas L. Labor und Diagnose Die Medizinische // Verlagsgesellschaft, Marburg, 4th edn. 1995. - P. 120-136.

122. Ueda M., Chahg C., Ohno M. Purification and characterization of L-amino acid oxidase from the venom of Trimeresurus mucrosquamatus (Taiwan habu snake) II Toxicon. 1988. - V. 26. -№ 8. - P. 695-697.

123. Umana V. Comparative study of the isoenzymes of L-amino acid oxidase from venom of Bothrops asper II Rev. Biol. Trop. 1982. - V. 30. - № 1. - P. 79-84.

124. Vahjen W., Bradley J., Bilitewski U., Schmid R. Mediated enzyme for the determination of L-glutamate // Anal. Lett. 1991. - V. 24. - P. 1445-1452.

125. Valero E., Garcia-Carmona F. A continuous spectrophotomentric method based on enzymatic cycling for determinating L-glutamate // Anal. Biochem. - 1998. - V. 259. - № 2. - P. 265-271.

126. Villarta R., Palleschi G., Lubrano G., Suleiman A., Guilbault G. Amperometric aspartate electrode // Anal. Chim. Acta. 1991. - V. 245. - P. 63-69.

127. White S., Turner A., Bilitewski U., Schmid R., Bradley S. Lactate, glutamate and glutamine biosensors based on rhodinised carbon electrodes // Anal. Chim. Acta -1994. -V. 295. -№ 3. P. 243-251.

128. Wollenberger U., Scheller F., Renneberg R., Bohmer A., Passarge M., Muller H. Biosensor zur Bestimmung von Glutamate und Substanzen, die in Glutamat umgewandelt werden // DD Patent 257272. 1988.

129. Wollenberger U., Eckardt S., Chojnacki A., Scheller F. Biosensor zur amperometrischen Bestimmung von Ammoniak, Harnstoff und Creatinin // DD Patent 266808. 1989a.

130. Wollenberger U., Scheller F., Bohmer A., Passarge M., Muller H. A specific enzyme electrode for L-glutamat development and application // Biosensors. 1989b. - V. 4. №6.-P. 381-391.

131. Xu S., Li Y. Screening of L-glutamate oxidase forming strains and conditions for enzymes production // Wei. Sheng. Wu. Hsueh. Pao. 1993. - V. 33. - № 4.1. P. 309-312.

132. Yamauchi H., Kusakabe H., Midorikawa Y., Fujishima Т., Kuninaka A. Enzyme electrode for specific determination of L-glutamate // 3rd. Eur. Congr. Biotechnol. -1984. Miinchen. - V. 1. - P. 705-710.

133. Yao Т., Kobayashi N., Wasa T. Flow-injection analysis for L-glutamate using immobilizied L-glutamate oxidase comparison of an enzyme reactor and enzyme electrode // Anal. Chim. Acta. 1990. - V. 231. - № 1. - P. 121-124

134. Yoshino E., Ishikawa H., Inoue F., Takada M., Misaki H. Process for producing L-amino acid oxidase // US Patent 4357425. 1982.