Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Коррекция нейропептидами судорожных состояний взрослого и развивающегося мозга

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Коррекция нейропептидами судорожных состояний взрослого и развивающегося мозга"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.Ломоносова Биологический факультет

§ «

I

со

о>

На правах рукописи

УДК: 612.853 + 615.357 + 612.(047) + 591.571.1:577.112.6

АББАСОВА КЕНУЛ РАСИМ-кызы

(Азербайджан)

КОРРЕКЦИЯ НЕЙРОПЕПТИДАМИ СУДОРОЖНЫХ СОСТОЯНИЙ ВЗРОСЛОГО И РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ МОЗГА (РОЛЬ ТИРОЛИБЕРИНА И ГАЛАНИНА В РЕГУЛЯЦИИ СУДОРОЖНОЙ

АКТИВНОСТИ)

03.00.13. - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Московского Государственного университета им.М.В.Ломоносова

Заведующий кафедрой

Академик РАМН Игорь Петрович Ашмарин

Научные руководители: докт. биол. наук, проф. С.А.Чепурнов канд. биол. наук, доц. Н.Е.Чепурнова

Часть исследований выполнена на кафедре патофизиологии Карлова Университета в Праге (Чехия) при консультации

докт. биол. наук, проф. Павла Мареша

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук профессор Н.А.Тушмалова

- доктор биологических наук доцент В.Ю.Щебланов

Ведущее учреждение: Научно-Исследовательский Институт Нормальной Физиологии имени П.К.Анохина РАМН

Зашита состоится: 16 июня 1997 года в 14.00 час на заседании Специализированного Совета Д.0553.05.35. в Московском Государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва Воробьевы Горы МГУ Биологический факультет, в аудитории ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан: ^ мая 1997 г.

Ученый секретарь Совета ^ / ¿ £ Д-У

кандидат биологических наук I/ Ч.Умарова

Изучение эпилепсии всегда способствовало расширению и углублению представлений о нейрофизиологических механизмах деятельности мозга (W.Penfield, H.Jasper, 1954; Gastaut, 1959; С.Н.Давиденков,1960; Т.С.Степанова и др., 1968; Ю.Н.Савченко, 1982; Н.П.Бехтерева, 1986; А.И.Болдырев, 1984; В.А.Карлов, 1990; G.Kostopoulos et al., 1990; Е.И.Гусев, Г.С.Бурд, 1994; P.Wolf, 1995; П.А.Темин, М.Ю.Никанорова, 1997; К.Ю.Мухин, 1997). Эпилепсия является заболеванием многофакторным с различными наследственными и приобретенными компонентами, в ее развитие может встраиваться патологическая информация или патологическая эпилептиформная активность, генетически запрограммированная у данного фенотипа (E.Andermann, F.Andermann, 1985). Почти две трети больных, страдающих эпилепсией в Мире - дети и подростки. Это означает, что исследование эпилепгогенеза развивающегося мозга приобретает все большее значение (А.Г.Земская, 1971; С.Л.Яцук и др., 1992; C.Lombroso, 1992; Ph.Schwartzkroin, S.Moshe, J.Noebels, J.W.Swann, 1995). Исключительно важны последствия фебрильных судорог (G.Mathieson, 1975; H.Holthausen, 1994). Продолжительные фебрильные судороги в детстве и нейротоксичность возбуждающих аминокислот остаются факторами риска возникновения мезиального склероза гиппокампа, что является одной из причин височной эпилепсии и нарушений в интеллектуальной сфере ребенка.

Особое место в изучении эпилепсии отводится созданию экспериментальных моделей на животных (Л.В.Крушинский, 1960; В.М.Окуджава, 1969; Г.Н.Крыжановский, В.К.Луценко, М.Ю.Караганов, 1991; Н.Н.Хлебникова, 1991), они все больше соответствуют запросам клинической эпилептологии (J.Engel, 1996; K.Gale, 1995). Экспериментальные модели диктуются многообразием форм эпилепсии и эпилептических синдромов, наличием форм, не поддающихся лечению средствами, разработанными на базе данных о нейрохимическом внеклеточном или внутриклеточном контроле активности нейронов. Уточнение медиаторной регуляции активности нейронов, включая систему сосуществующих с медиаторами регуляторных нейропептидов, остается физиологической основой дальнейшего изучения эпилепсии (К.С.Раевский, В.М. Георгиев, 1986; Taylor, 1993; С.А.Дамбинова, 1995; Т.А.Воронина, 1995; B.Meldrum, 1995; D.Chadwick, 1995; К.С.Раевский В.Г.Башкатова и др., 1997). Разработаны способы формирования эпилептического припадка у животных: травматизация головного мозга, сенсорные (болевые, звуковые) раздражения,

электрическая стимуляция, в том числе "киндлинг", гипертермия, химическая индукция эпилептогенеза, включая фармакологический киндлинг, разработанный в школе акад. Г. Н. Крыжано веко го (Г.Н.Крыжановский, ААШандра и др., 1989; В.С.Вастьянов, 1995). Фармакология новых противосудорожных стредств (H.Reynolds, 1995; J.Majkowski, 1995) опирается в основном на успешные исследования ГАМК-ергической и глутаматергической систем, прямой регуляции ионных каналов. Однако, каждый пятый больной страдает рефрактерной формой эпилепсии, не поддающейся лечению. Изучение и внедрение новых противосудорожных препаратов нейропептидной природы остается актуальной задачей теоретической и практической медицины.

Тиролиберин (ТРГ) - один из наиболее перспективных нейропептидов для широкого применения в клинике. Впервые (1987) на кафедре физиологии человека и животных МГУ были получены сведения о его антигипоксическом и противосудорожном действии, других каскадных эффектах (И.П.Ашмарин, Н.Е.Чепурнова, С.АЛепурнов, 1992; И.П.Ашмарин, В.Ю.Иониди и др., 1993; И.Г.Власова, С.А.Чепурнова и др., 1996). Позднее ТРГ применили японские невропатологи для тяжелых случаев эпилепсии детства, синдрома Леннокса (A.Matsumoto et al., 1990; JCInanaga et al., 1989) и лечения спинальной мышечной атрофии (Y.Takewuch et al., 1994).

Функции нового нейропептида - галанина (ГАЛ) в межнейрональных отношениях остаются не раскрытыми (Crawely J.N. et al., 1991, 1996). Важно выяснить, обладает ли ГАЛ полифункциональностью, несущей по И.П.Ашмарину, сложный физиологический континуум регуляций (И.П. Ашмарин, М.Ф.Обухова, 1986). Центральное действие галанина включает сложный спектр регуляций - нейроэндокринные, когнитивные (обучение и память), сохранение клеток в старческом возрасте, при паркинсонизме. Его роль при пикротоксиновом киндлинге впервые показана А.А.Шандра и А.М.Мазарати (1994). Анализ структурных гомологов ГАЛ не позволяет отнести его ни к одному из известных классов физиологически активных пептидов. J.Crawely, G.Wenk (1989) показали угнетающее влияние ГАЯ на высвобождение и/или эффекты ацетилхолина. T.Hokfelt et al.(1992) высказали предположение об усугубляющем действии ГАЛ на развитие болезни Альц-геймера. Обоснована новая концепция J.Crawley (1995), что ГАЛ имеет определенную внутриклеточную функцию в холинергических корковых нейро-

нах, позволяет сохраняться холинергическим клеткам. Актуальность исследования ГАЛ определяется недостаточностью представлений о его роли в нервной системе и механизмах эпилептогенеза.

Цель н задачи исследования Исходя из вышеизложенного целями работы были:

- разработка новой модели - гипертермически вызываемых судорог развивающегося мозга в раннем постнатальном онтогенезе по типу фебрильных судорог у детей;

- разработка модели краткосрочной эпилептизации с дробным введением под-пороговой дозы хеиоконвульсанта, путем накопления дозы для судорожного ответа мозга взрослого животного;

- изучение протективного и блокирующего судорожную активность действия регуляторных нейропептидов - тиролиберина и галанина на животных в условиях новых экспериментальных моделей.

Ставились задачи:

исследовать гипертермически вызванные судороги в разные периоды постнатального созревания мозга у крыс;

исследовать дозо-зависимые влияния тиролиберина на судорожную активность по поведенческим тестам и электрической активности коры и лимбических структур при интраназальной аппликации ТРГ на интактных животных и в сочетании с блокированием бензодиазепинового сайта;

исследовать роль НМДА рецепторов в генезе гипертермических судорог у животных;

исследовать возможность купирования судорожных приступов, вызываемых хемоконвульсантом (пентилентетразол-ПТЗ) и гипертермией, с помощью системного и внутрюкелудочкового введения галанина, нового нейропептида, тормозящего секрецию ацетилхолина и возбуждающих аминокислот.

Научная новизна исследования Впервые выявлены противосудорожные свойства нейропептида галанина в условиях гипертермически вызванных судорог при его системном, интра-назальном и внутрижелудочковом введении. Доказано, что интраназальное введение ТРГ в ультрамалых концентрациях (от 10"12 М до 10'8 М) вызывает увеличение латентностей, снижение тяжести моторного судорожного припадка или полное его блокирование. При этом тормозится эпилептиформная

активность в гиппокампе, миндалине и неокортексе. Значительное увеличение дозы ТРГ вызывает противоположный эффект: он облегчает судорожную активность. Сделано заключение об участии НМДА рецепторов в генезе фебрильных судорог в ранний постнатальный период развития мозга.

Теоретическое и практическое значение

Обосновано новое клиническое применение ТРГ в ультрамалых дозах в качестве пептидной противосудорожной терапии (по сравнению с ранее, необоснованно завышенными, лечебными дозами ТРГ в неврологии и психиатрии). Результаты подтверждают принципиально новую концепцию акад. И.П.Ашмарина об эндогенных регуляторах пептидной природы в организме, действующих в ультрамалых дозах. Полученные результаты внедрены в практику Лаборатории пароксизмальных состояний Института Профилактической Психиатрии и Судебной Медицины им. Сербского (Зав. лаб. проф., докт. мед. наук Л.М.Асанова).

Показано центральное действие ГАЛ и экспериментально доказано его участие в тормозных механизмах эпилептогенеза (в частности, при гипертермических фебрильных судорогах у детей). Даны обоснования применения ГАЛ в неврологической практике и при других расстройствах, для разработки комплексного лечения.

Полученные в работе данные позволяют сделать вывод о возможности фармакологического купирования фебрильных судорог нейропептидами с целью предотвращения последующих осложнений по типу височной эпилепсии.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на:

Конференциях Психофармакологических обществ Чехии и Словакии в Есениках в 1992-93гг.; Международных симпозиумах "Локальный эпилептический очаг" - "Focus on Epilepsy- I" (1991), "Focus on Epilepsy-III" (1995) в Канаде, Вистлер; 2-ом Международном Конгрессе по ультрамалым дозам, Бордо, Франция, 1993; Европейской конференции по невропатологическим наукам в Германии, Берлин, 1993; Всероссийской междисциплинарной конференции "Поведение животных", Борок, 1994; X Конференции Польской Противоэпилептической Лиги, Варшава, 1994; II Конгрессе Польши по Эпилепсии, Варшава, 1995; 4-ом (Страсбург, 1994) и 7-ом (Марбург, 1997) Годичных Симпозиумах Европейского Нейропептидного Клуба; Между-

народном Симпозиуме "Физиологические и биохимические основы деятельности мозга", посвященном Н.П.Бехтеревой, Санкт-Петербург, 1994; 2-ом Съезде Физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 1995; II Европейской Конгрессе по Эпилепсии в Нидерландах (Гаага, 1996); на XX (Oslo, 1993), XXI (Sydney, 1995), XXII (Dublin, 1997) Международных Конгрессах по Эпилепсии Международной Противоэпилептической Лиги (ILAE). По теме диссертации опубликовано 18 работ.

Объем и структура диссертации Работа состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 3-х частей (глав) с изложением полученных экспериментальных данных, обсуждение результатов, выводы. Общий объем составляет 190 страниц, включая 43 рисунка. Список литературы состоит из 173 источников, в том числе 78 на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на взрослых крысах-самцах линии Wistar, Sprague Dowely и беспородных крысах, а также на крысятах в возрасте от 5 до 17 дней. Всего использовано 303 взрослых животных и 86 крысят. Все опыты проводились с соблюдением требований, предъявляемых к работе с экспериментальными животными в России (Приказ Министерства Здравоохранения СССР №755 от 12.08.1977 г.), и в соответствии с требованием Международной Комиссии по Биоэтике МСФН (XXXII Congress IUPS,1993). Были разработаны и модифицированы следующие методики.,

1. Модифицированная модель судорожной активности, вызываемой хемокон-вульсаптами. Модель основана на дробном введении пороговых доз ПТЗ, что-позволяет более дифференцированно оценить чувствительность к эпилепто-гену экспериментальных животных, и имеет ряд преимуществ перед общепринятой моделью одноразового введения эпилептогена. Дробное введение ПТЗ позволяет замедлить процесс развития судорожной активности или управлять им. Метод исключает передозировку эпилептогена при повторных введениях в последующие экспериментальные дни с целью контроля и быстрого исследования противосудорожных свойств препаратов. Исследования проводили в три этапа.

В первый день вводили только ПТЗ (i.p.) в дозе 25 мг/кг каждые 15 мин, но не более трех раз. При достижении максимальной судорожной моторной активности дальнейшие введения ПТЗ прекращали.

Во второй экспериментальный день животные опытной группы получали исследуемое вещество (противосудорожный препарат) всегда до введения ПТЗ. В случае применения ТРГ его апплицировали в нос - в первый раз за 10 мин до ПТЗ, а два остальных раза одновременно с введением ПТЗ. В опытах с ГАЛ аппликацию проводили однократно: за 10 мин до первого введения ПТЗ. Препараты вводили интраназально в объеме 10 мкл в каждую ноздрю. Животные контрольной группы всегда получали физиологический раствор в том же объеме.

В третий опытный день (контрольный) вводили только ПТЗ. Показателями эффективности противосудорожного действия служили:

1) индивидуальная изменчивость моторного судорожного приступа животного;

2) изменение времени латентных периодов реакций в среднем по группе крыс;

3) число крыс с различной тяжестью припадков, выражаемое в процентах различных стадий судорожной активности в группе контрольных и опытных крыс, до и на фоне действия антиэпилептогена; 4) число животных, у которых на фоне исследуемого вещества полностью или частично блокировалась судорожная активность. Мы придерживались классификации ПТЗ-вызываемых судорог по K.Gale (1990); P.Maresh, M.Pohl, H.Kubova (1983). Моторную судорожную активность измеряли по модифицированной пятибальной шкале П.Мареша (P.Maresh, М.РоЫе, H.Kubova, 1983; P.Maresh, H.Kubova, 1985):

0 - отсутствие реакции;

0,5 - абнормальное поведение, длительные периоды замирания, учащения дыхания, напряжения мышц пальцев и хвоста;

1 - изолированные миоклонические вздрагивания (myoclonic jerks);

2 - атипичные минимальные судороги (minimal seizures)',

3 - минимальные судороги, клонического типа, ограничивающиеся вздрагиванием головы и мышц передних конечностей;

4 - большие судороги без тонической фазы (major seizures). Судороги мышц всего тела, подъем на задние конечности в "позе кенгуру";

5 - полные большие генерализованные тонико-клонические судороги с потерей выпрямительных рефлексов (generalized tonic-clonic seizures), падение животного на бок

По результатам измерений строили индивидуальные графики (Рис.1) и вычисляли средние величины латентостей.

г «■

3

+

31-

I 15 30 46

Вреает. шпг

...............! 1Ш1ТШП

1 16 30 46 : Время, млн

3 ь-

4-

-

3-

г>_

и • .

1-

0.3-

0-

2.,день..............................

1 15 30 45

Рис.1. Динамика развития судорожной реакции, вызванной ПТЗ (¡.р.) у двух крыс до (А, 1 день) и после (В, 2 лень) введения МК-801. По оси ординат - стадии судорог по 5-ти бальной шкале. Крысы получали ПТЗ в дозе 25 мг/кг два раза с интервалом 15 мин, МК-801 (¡.р.) в дозе 0.09 мг/животное за 30 мин до ПТЗ.

2. Модель фебрильных судорог при гипертермии.

Модель фебрильных судорог была применена на крысятах в модификации МсСаи§Нагап е1 а1., (1984). Оценка поведения была принята по шкале, предложенной С.А.Чепурновым и Н.Е.Чепурновой для крысят разного возраста, основанной на собственных наблюдениях (Б-Отеритоу ег а1., 1993) и предложениях МсСа^Ьагап (1984), Р.Маге$Ь, Б.Тпуап (1984),К.Са1е (1990) для действия хемоконвульсантов. Каждые 10 с отмечали поведение по шкале:

0 - нормальное поведение, нормальная поза;

1 - гребковоподобные движения лапок и ригидность хвоста;

2 - одиночный спазм типа опистотонуса;

3 - спорадические миоклонические вздрагивания;

4 - потеря равновесия, экстензия передних лапок, клонус задних конечностей (попытка встать в "позу кенгуру", характерную для 4-й стадии взрослых крыс);

5 - падение на бок, потеря позы, потеря «сознания»._

Дополнительно учитывали внезапное замирание, стереотипические движения головы, продолжительность (в минутах) атаксии, ротаций или стереотипий, поведение избегания (наблюдается у крысят с 13-го дня). Весь период наблюдений крысята находились в одной клетке с матерью за исключением экспериментальных дней, когда они переносились в экспериментальную камеру для согревания. Перегревание крысят проводили в мягком режиме светом (лампой накаливания 200 Вт) с расстояния, обеспечивающего температуру внутри камеры +38°С. Гипертермию прекращали с появлением клонико-тонических судорог с потерей позы, но максимальный срок обогревания был не более 15 мин. Измеряли латентные периоды появления судорожных стадий по выше приведенной шкале. В данной серии опытов ГАЛ вводили за 15 мин до гипертермии в дозе 1мкг/крысенка (20 мкл, i.p.).

Вещества. ТРГ вводили интраназально по А.А.Каменскому (Л.В. Антонова, A.A.Каменский, 1982) в концентрациях - от Ю-12 М до Ю-4 М. Использовали химически чистый ТРГ и препарат «Рифотироин», синтезированный П.Е.Романовским (НИИ Орг.Синтеза, Латвия, Рига). Меченый [3Н] ТРГ был получен с использованием термически активированных атомов трития (А.В.Гедрович и др., 1984) в Молекулярно-Генетическом отделении Биотехнологического филиала БИО-ВТИ при ТМГА. Активность маточного раствора была 2.2 • 105 имп/мин. Опыты проводили в Лаборатории изотопов Биологического факультета под руководством доц. Г.В.Коссовой.

Галанин (МЯ га|амп = 3164.5), синтезированный в НИИ ОЧБП (Санкт-Петербург) д.х.н. М.П.Смирновой в отделе проф. О.А.Каурова, вводили различными способами, дозы указаны в Таблице:

Способ введения Конц. раствора (нмоль/мкл) Доза (нмоль) Доза (мкг)

Интраназальное I.N. 3.16 6.32 63.2 126.4 10 20

Внутрижелудочковое I. С. V. 0.16 0.64 2

Внутрибрюшинное (крысята) I. P. 0.016 0.32 1

Внутрижелудочковое по J.Crawley (1993) 1. С. V. 0.32 1.6 5

Использовали ПТЗ ("Sigma"), МК-801 (Dizocilpine maleate, "Sigma"); транквилизатор группы бензодиазепинов хлордиазепоксид - Clozepidum (Poldinger,Wider, 1990; М.Д.Машковский, 1993). Препараты вальпроевой кислоты применяли перорально в лекарственной формах: "Депакин", "Орфирил" (DIS1TIN, Germany) и "Конвулекс" - Gerot Pharmaceutica, Wien).

Электрофизнологачеекие исследования проводили с помощью электроэнцефалографа ЭЭГ-4 (Львов) и 4-х канальной усилительной системы с компьютерным анализом ЭЭГ - "CONAN" (А.П.Кулаичев, 1996). Суммарную ЭЭГ регистрировали в норме и при развитии эпилептических судорог. Для регистрации вживляли биполярные электроды из сплетенных нихромовых проволочек диаметром 75 мкм и расстоянием между кончиками 0.5 мм под нембуталовым наркозом (40 мг/кг массы тела). Вживление электродов (в лобный отдел коры, гиппокамп и миндалину) и вживление канюли для введения пептидов проводили по общепринятым стереотаксическим координатам атласа мозга крысы Е.Фифковой и Дж. Маршалла (Я.Буреш и др., 1962). Электрическую активность регистрировали в условиях свободного поведения не ранее, чем через двое суток после операции. Система CONAN позволяет визуально исследовать запись, вычислять амплитудно-частотные характеристики, вычислять спектр текущей эпохи по методу быстрого преобразования Фурье, картировать по диапазонам частот и эпохам, проводить усреднение и статистическое сравнение карт, проводить экспресс диагностику (А.П.Кулаичев, 1997). По окончании опытов проводили морфологический контроль локализации кончиков электродов в структурах мозга крысы по общепринятой методике. Серийные срезы делали на замораживающем микротоме.

Статистический анализ полученных результатов во всех сериях проводили по критериям точного метода Фишера, Вилкоксона-Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Иптраназалышй путь введения веществ для коррекции и торможения судорожной активности.

Интраназалыюе введение пептидов - биологически обоснованный путь изучения их центрального действия. Для доказательства того, что значительная часть введенного пептида оказывается в слизистой и поступает далее в мозг,

мы использовали метод интраназального введения меченых аминокислот (изолейцин 14С) и ТРГ (по 3Н и 1253 ). При внутрибрюшинном введении аминокислота включалась и накапливалась в слизистой желудка и печени (превышение Ие14С активности над фоном составляло в желудке в 6-8 раз, в печени более чем в 10 раз), для сравнения - в слизистой носа только в 2-5 раз. При интраназальном введении, напротив, максимальную радиоактивность регистрировали в слизистой носа, где превышение над фоном составляло в 30 и 15 раз через 1 и 4 часа соответственно.

При интраназальном введении ТРГ через 15 мин радиоактивность слизистой носа превышала фон в 100-[70 раз, причем она практически не отмечалась в крови, обонятельной луковице и мозжечке. Через час произошло накопление метки в крови, луковице и мозжечке, но превышение радиоактивности было незначительным - не более чем в 2 раза от фона. В то же время активность в слизистой носа резко упала (только в 10 раз больше фона). Следовательно, уже 15-ти минутный интервал после закапывания можно считать достаточным для тестирования действия веществ при интраназальном введении. [3Н] ТРГ радиоактивность отмечалась только в слизистой носа -превышение над фоном в 20 раз наблюдалось у всех опытных крыс. Через час превышение над фоном составляло не более 2-х раз. При этом накопление в обонятельной луковице и периферической крови было соизмеримо. Это указывает на прохождение ТРГ через слизистую в кровь и в обонятельные области мозга уже к 15 минуте.

Рис.2. Распределение меченого ТРГ после интраназального введения у крыс. Светлые столбики - через 15, темные - через 60 мин после введения.

Используя другую метку ТРГ (125.1), оценивали его распределение через 15 и 60 мин после введения. Через 15 мин максимальная радиоактивность определялась только в слизистой и в крови (рис.2). Через час - в обонятельной луковице. В абсолютных величинах содержание ТРГ в обонятельной луковице составляет лишь 15% от накопленного в слизистой носа. В остальных структурах мозга (суммарно по навеске ткани больших полушарий) за 1 час накапливается не более 3% ТРГ. Это соизмеримо с количеством ТРГ, проходящего через ГЭБ (1% по Е.М.СогпГогё ег а!., (1985).

ТОРМОЖЕНИЕ СУДОРОЖНОЙ АКТИВНОСТИ ТИРОЛИБЕРИНОМ В УЛЬТРАМАЛЫХ ДОЗАХ ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ Протективпое действие ТРГ в ультрамалых концентрациях (10~8М-10~12М). Исследовали противосудорожный эффект ТРГ, вводимого интраназально в понижающихся концентрациях: 10"8 М, Ю-10 М и 10"12 М, до или одновременно с введением эпилептогена. Первое введение ТРГ было за 10 мин до ПТЗ (25 мг/кг 3 раза через каждые 15 мин). При используемых концентрациях ТРГ проявлял индивидуальное, в различной степени выраженное, но достоверное противосудорожное действие на ПТЗ-вызванные судороги. Достоверно уменьшается число крыс, получавших ТРГ, с тонической и клонико-тонической стадиями припадка (Рис.3).

Рис.3. Влияние ТРГ (10~8М - 10_12М, интраназальное введение) на судорожную активность, вызываемую ПТЗ. Распределение реакций по стадиям судорог. * - р<0.01 для 4-ой, тонической стадии припадка. Сверху -опыт, внизу - контроль.

Влияние ТРГ на выраженность судорожного припадка и эпилептиформнуто активность в неокортексе и гиппокампе крыс.

Результаты поведенческих опытов подтверждены электрофизиологически. Введение ТРГ в ультрамалых дозах может оказывать модулирующее действие на развитие и протекание ЭГ судорожной активности, предшествующей моторному припадку. Это подтверждается полным блокированием разрядов пик-волновой активности, укорочением их продолжительности. Вопрос о соотношении эпи-активности и моторных припадков, остается трудным для объяснения. Он находится в центре внимания со времени классических исследований эпилепсии (W.Penfieid, H.Jasper ,1954; Н.Gastaut, M.Fisher-Williams, 1959). В соответствии с традицией клиники эпилепсии мы использовали непрерывные записи, и только для решения спорных вопросов проводили спектральный анализ ЭГ гиппокампа, коры или миндалины. При этом исходили из опыта изучения влияний ТРГ на ЭЭГ человека при интраназальном введении ТРГ (А.Я.Каплан, С.А. Чепурнов и др., 1994; И.Г.Власова, Н.Е.Чепурнова, 1996). Определяли частоту возникновения одиночных пиков или комплексов лик-волна; длительность разрядов последействия (РПД); интервалы между РПД; частоту пик-волновой активности. Измерения проводили от 1 до 3-х часов, через каждые 3 мин. При введении ПТЗ с интервалом в два дня подтвердились данные о его следовом действии, несмотря на введение в подпороговой дозе. В гиппокампе пик-волны возникали более часто, чем в неокортексе, что указывает на различия в процессах "киндлинга". РПД возникают на второй день эксперимента одновременно в обеих исследуемых структурах - через 10 мин после введения ПТЗ - и достигают максимальной продолжительности 2,5 сек на 25 минуте. Ответ имеет генерализованный характер. Следовательно, и в случае нейро-пептидной коррекции судорог пептид может предотвратить генерализацию. Разряды в ЭГ сопровождались специфическими поведенческими реакциями (1 и 2-я стадии судорожного ответа).

Блокирование судорожной активности введением ТРГ исследовали спустя две недели, на фоне сниженного судорожного порога. Это приближало опыт к клинике, к тем случаям, когда противосудорожное средство "работает" в мозге, длительное время имевшем предисторию "судорожной готовности". Введение ТРГ в отмеченных выше ультрамалых дозах оказывало

модулирующее действие на развитие и протекание ЭГ судорожной активности, предшествующей моторному припадку. Введение ТРГ не прекращало генерализованной эпилептизации, но предотвращало резкое усиление разрядов при введении дополнительной дозы эпилептогена. При генерализованной судорожной активности в коре, миндалине и гиппокампе, ТРГ вызывал сходные эффекты торможения активности. ПТЗ-модель не отражает полностью клинической картины, поскольку в этом случае не регистрируются разряды в интериктальный период. Однако следовые изменения типа киндлинга наблюдаются, и судорожный порог снижается. Введение ТРГ интраназально, как показано выше, способствует повышению судорожного порога, либо его поддержанию - направленно действуя против киндлинга. Можно сделать вывод, что ТРГ в ультрамалых дозах имеет особенности противосудорожного действия: при его интраназальном введении. ТРГ не приводит к разрушению паттернов пик-волна, а только вызывает их урежение или полное блокирование.

Полученные результаты имеют практическое значение, так как нейропептиды, модулируя судорожный порог и меняя структуру (тяжесть) припадка,могли бы определять дальнейшее течение болезни. Для клиники эпилепсии важны такие синдромы, на основании которых можно судить об опасности усугубления до эпилептического статуса или о возможности купирования (до полной блокады) судорожной реакции. В особых случаях, когда регистрируются только ЭЭГ манифестные признаки, без развития моторных припадков, их изменение используют для диагностики и решения вопроса о медикации. Блокирование эпилептиформных разрядов в покое с помощью нейропептидов может быть новой перспективой в фармакотерапии судорожных состояний.

Облегчающее влияние на судорожный ответ увеличенной концентрации интраназально вводимого ТРГ. Различие эффектов, выявленное в интервале доз ТРГ всего на два порядка, указывало на необходимость дальнейшего исследовния дозо-зависимых отношений противосудорожных влияний ТРГ. Ранее отмечалась возможность при системном введении ТРГ в большой дозе вызывать бочкообразные ротации (Cohn M.L. et al., 1975), известно и стимулирующее действие ТРГ на моторную активность и индукцию стереотипий (В.Е.Клуша, 1984). Описанные выше

эффекты ТРГ в ультрамалых дозах, сопоставление их с уже известными влияниями на моторную активность крыс, поставили задачу: определить диапазон концентраций ТРГ, в пределах которого может происходит смена его противосудорожного эффекта на облетающий. Такая возможность "парадоксального эффекта" характерна для многих пептидов по мере уменьшения концентрации на три-четыре порядка (И.П.Ашмарин, 1993; Е.Б.Бурлакова, 1993).

Было выполнено две серии экспериментов (п=22) по предыдущей схеме введения ПТЗ. При введении ТРГ в концентрации 10~6М степень выраженности судорожной активности у опытного и контрольного животных не менялись, наступала тоническая стадия. Характер судорожного ответа повторялся на протяжении всех трех дней экспериментов. Различия не носили закономерного характера для групп в целом. ТРГ в концентрации 10"6 М не оказывал влияния на развитие ПТЗ-вызванных судорог. Введение ТРГ в концентрации Ю'4М вызывало увеличение числа крыс в опытной группе с более тяжелыми стадиями судорог.

Итак, выявлено противосудорожное действие ТРГ при его инграназальном способе введения в ультрамалых концентрациях Ю-8 М, 10"10 М и 10->2 м Показано дозо-зависимое действие ТРГ и его следовой эффект. При введении в дозе 1СИМ ТРГ наблюдается противоположный эффект -облегчение судорожной реакции. Результаты подтверждены электрофизиологически. При сравнении эффектов ТРГ и бензодиазепинов (хлордиазепоксид - 2мг/кг) показано, что последние, в основном, эффективны в отношении снижения латентности и тяжести приступов клонико-тонической фазы. Но ТРГ обладает более выраженным генерализованным действием на все стадии припадков. Сочетанное действие ТРГ и хлордиазепоксида ослабляет эффекты.

ГИПЕРТЕРМИЧЕСКИЕ СУДОРОГИ В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ КАК МОДЕЛЬ ФЕБРИЛЬНЫХ КОНВУЛЬСИЙ Характеристика судорожной активности у крысят в результате гипертермии. Новая международная классификация форм эпилепсии и эпилептических синдромов относит фебрильные судороги к разделу (4.I.): специальных синдромов, встречающихся всегда в виде генерализованных судорог при острых лихорадочных (febrile) заболеваниях. Модель фебрильных

судорог на крысятах была предложена McCaugharan J.A., Sechechter N. (1982). Было показано (Чепурнов, Чепурнова,1994), что у крысят, перенесших гипертермию, сопровождающуюся судорожной активностью, наблюдалось длительное последействие: во взрослом состоянии у них повышается число особей со сниженным судорожным порогом, что объясняется - нарушением процесса формирования рецепторов к ГАМ К и глутамату в первые две недели развития (G.Avanzini,1995). Есть основания сравнивать периоды развития мозга в отношении судорожного порога у крысенка в 5 и 15 дней соответственно с мозгом ребенка в 1 и 3-4 месяца (S.L.Moshe, J.L.Noebels, J.W. Swann, 1995). С возрастом у крысят не только появлялась типичная поза, в том числе переворачивание, вставание, но к концу второй недели формировались стойкие избегательные рефлексы. Соответственно увеличивалось время таких компонентов поведения, как ротации, стереотипии, атаксии, избегания. Последнее появлялось после 10-13 дней развития. Противосудорожный эффект достоверно выявлялся при сопоставлении латентных периодов наступления определенных стадий моторного ответа при гипертермии в возрасте 5, 7 и 9-11 дней.. Латентный период резко возрастает к 15-17 дням постнатального развития крысят (рис 4). Этим, в частности, и ограничивается период перегревания в 15 минут.

Роль НМДА-рецепторов в формировании гипертермически-вызванных судорог. Сведение о влиянии МК-801 (неконкурентного антагониста НМДА-рецепторов) на гипертермические судороги в литературе не имеется, хотя практически сразу после синтеза этого препарата было проведено изучение его прогивосудорожных свойств на модели киндлинга и максимального электрошока (Troupin A.S., et al., 1986; McNamara J.O., et al., 1988; Taylor, 1993). МК-801 относится к числу блокаторов, которые связываются непосредственно с сайтом, ответственным за открытие ионного канала. В опытах крысятах (п =12) в возрасте 5 дней было изучено влияние на гипертермически-вызываемме судороги МК-801 (i.p. введение в дозе 0.09 мг/крысенка, по Iversen L.L.,1994). Полная блокада гипертермического судорожного ответа наблюдалась в 100% случаев, у всех крысят опытной группы, получавших МК-801. Одновременно наблюдали сильную атаксию, потерю тонуса и значительный нейролептический эффект. В контрольной группе крыс (п=12) развивались судороги различных стадий. С помощью МК-

801 в малых дозах показано также участие НМДА-рецепторов в регуляции процессов обучения и памяти (Bannerman D.M., et al., 1995), но результаты многих авторов противоречивы (Iversen L.L., 1994). Однако введение больших доз МК-801 (>0.05 мг/кг) вызывало нарушение моторной активности, что делало невозможным точно анализировать признаки моторного припадка. Торможение судорожной активности нейропептидом галанипом при его системном и интраназальном введении.

Влияние галанина на развивающийся мозг: коррекция гипертермически-вызванных судорог в раннем онтогенезе. Были проведены опыты на беспородных крысятах двух пометов (п=18). Вдень гипертермии в возрасте 5, 7, 9, 11 и 13 дней крысят переносли в камеру для согревания. ГАЛ при системном, внутрибрюшинном введении (1 мкг/хивотное) крысятам в возрасте от 5 до 13 дней эффективен в определенный период на 7 - 11-й дни развития (Рис.4).

*

Рис.4. Влияние нейропептида галанина-29 (1 мг/животное, ¡.р.) на латентные периоды наступления тонической и клонико-тонической стадий судорог, вызываемых гипертермией в возрасте 5, 7, 10 дней. * -р< 0.01.

Отсутствие эффекта на 5 день может быть связано с тем, что в процессе онтогенеза галаниновые рецепторы у млекопитающих впервые появляются на 1-5 день после рождения, с последующим увеличением плотности рецепторов до 25 дня (1.Сга\ге1у, 1996).

Противосудорожные эффекты галанина у взрослых крыс. У взрослых крыс, в условиях разработанной нами схемы опыта с ПТЗ, выявлено противосудорожное действие ГАЛ в виде задержки клонико-тонической фазы и значительного укорочения 4-ой стадии. Показателями протективного действия ГАЛ были латентные периоды. Крыс, получавших интраназально

ГАЛ d лозах 10 и 20 мкг/хипотное, сравнивали по всем стациям судорожного ответа с контрольными (рис. 5). ГАЛ в 2-3 раза увеличивал латентный период наступления первых вздрагиваний (minimal seizures) и клонико-тонической стадии (major, generalized seizures) судорожного ответа.

Рис.5. Влияние галанина (20 мкг/животное, интраназально за 15 минут до ПТЗ) на тонические (4) и клонико-тонические (5) стадии судорог. Светлые столбики- контроль с введением физ. р-ра. **- р<0.005.

Изменения достоверны только для периода появления клонико-тонической стадии. Первые признаки ответной на ПТЗ судорожной реакции -слабые вздрагивания головы - наступали у крыс опытной, и контрольной групп практически в одно время, но под влиянием ГАЛ значительно затягивалось развитие стадии, характеризующейся (по Maresh P., Velishek L.,1986) частыми вздрагиваниями мышц головы (wet head shake) и туловища и клонико-тоническими ритмическими судорогами; или они полностью блокировались.

В специальной серии опытов поведенческие тесты сопровождали регистрацией ЭГ активности коры, гиппокампа и миндалины (п=1б). Использовали крыс в возрасте 3-х месяцев. При увеличении дозы интраназально вводимого ГАЛ (20 мкг/животное) были подтверждены все выводы, сделанные ранее. Спектральный анализ основных ритмов ЭГ у крыс в "интериктальный период" и при формировании судорожной активности был выполнен в одни и те же строго определенные временные отрезки после

□ Контроль ■ Галанин

введения ПТЗ. Сравнивали ЭГ характеристики коры и миндалины в период ПТЗ вызванной эпилетической активности на фоне действия ГАЛ, введенного в желудочки мозга через хронически вживленную канюлю (рис.6). Само введение галанина не вызывало за исследованный период изменений ЭГ. но на фоне ГАЛ не вызывало изменения ЭГ, но на его фоне частота пик-волновой активности резко уменьшалась, снижалось количество разрядов пик-

Рис.6. Торможение галанином (L мкг/4мкл, i.c.v.), вызванной ПТЗ эпилептиформной активности миндалины (верхний спектр) и фронтальной коры (нижний спектр).

Введение только селективного антагониста ГАЛ - галантида (МК. 15), и на его фоне - ГАЛ, не вызывало достоверных изменений в спектре ЭГ, за исключением периодов десинхронизации, связанньгх с самой процедурой введения в условиях свободного поведения животного. Галантид - М15 [galanin(l-13)-SP(5-ll)] является антагонистом галанина по нескольким физиологическим функциям: выделению ацетилхолина в гиппокампе, увеличению степени активности нейронов в голубом пятне, спинальным рефлексам, по влиянию на сердечную деятельность, выделению инсулина в поджелудочной железе. Введение ПТЗ после блокирования галаниновых рецепторов селективным антагонистом не снимает полностью, но ослабляет

тормозным эффект ГАЛ: приеходит изменение спектра в сторону более низких частот, а разряды появляются с характерной частотой 4/с - б/с - 9/с. На фоне антагониста эффект ГАЛ ослаблен.

Итак, ГАЛ может выполнять функции эндогенного регулятора судорожной активности мозга. Одинаковы ли гаданин-ергические механизмы, включающиеся при блокировании генерализации эпилептиформной активности в мозгу человека? Насколько ГАЛ предохраняет нейроны от гипоксических состояний, вызванных судорожной активностью? Эти вопросы необходимо выяснять дополнительно. Специфичность галанинового эффекта ранее была показана А.А.Шандра и сотр. (1994) для селективного антагониста М35 [gaIanin(l-l)2-bradikinin(2-9)-amide]. Его i.c.v. введение приводило к проэпилептическому действию, но блокировало противосудорожный эффект ГАЛ при фармакологическом киндлинге (A.A.Shandra et al., 1993). Задачей дальнейших фундаментальных и клинических исследований ГАЛ должно быть выявление условий экспрессии гена ГАЛ в нервной клетке (Holmes P.V.,1995) у людей, страдающих эпилепсией и другими нервными заболеваниями. Важно знать, что в какой момент развития судорог или в интериктальный период возникает экспрессия гена (у человека ген прегаланина локализован в районе 35-kb в 11 хромосоме, позиция Ilql3.3-ql3.5) и "защитное синаптическое выделение" ГАЛ, поскольку холинергические механизмы эпилептогенеза являются только частью этого процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ .

Выбор экспериментальной модели эпилепсии имеет большое значение и определяется особенностями клиники эпилепсии (Engel J.Jr, 1995; K.Gale., 1995). Полученные данные касаются двух типов моделей: 1)хемоконвульсивной - когда судорожный припадок вызывается нарушениями в системе ГАМК-ергической передачи после введения хемоконвульсаната - пентилентетразола и 2) метаболической - когда внешние факторы* (гипертермия) приводят к эндогенно развивающимся припадкам. В последнем случае они определяются незрелостью систем торможения развивающегося мозга (у крысят до 15 дней).

При введении ПТЗ мы также изменили парадигму опыта с целью "растянуть во времени" процесс эпилептизации, иметь возможность быстро оценить судоржный порог в большой группе животных и индивидуально охарактеризовать структуру припадка. В клинике она является решающей для

выбора прогивосудорожного препарата (Р.\Уо1£,1994). С использованием обеих моделей противосудорожное действие выявлено нами для двух регуляторных нейропептидов - тиролиберина и галанина, отличающихся не только по строению, спектру физиологических регуляций, но и по путями воздействия на процесс эпилептизации мозга.

Существенными факторами, определяющими противосудорожный эффект, были - дозы и пути введения. Для галанина- это системный, интраназальный и внугрижелудочковый; .для тиролиберина - интраназальный. Нами впервые показано, что при двух условиях - действии в ультрамалых концентрациях (от 10'8М до 10"|2М) и локалюованности воздействия через слизистую носа (эндоназально) ТРГ полностью купирует развитие или снижает тяжесть судорожного припадка.

Известно, что ТРГ является эндогенным антидепрессантом, его считают эндогенным панакгивином. В многочисленных, выполненных под руководством академика И.П.Ашмарина работах Т.В.Лелековой, Л.Т.Санжиевой, И.В.Гурской, А.Н.Инюшкиным, Н.А.Соколовой, В.Б.Кошелевым, Н.Е.Чепурновой, С.А.Чепурновым, В.Ю.Иониди Е.В.Ефимовой, Е.Пасхали, А.А.Мартьяновым, Э.Я.Турбовской, было систематически доказано, что ТРГ оказывает: I) стимулирующее действие на дыхательную систему - рефлексы и нейроны дыхательного центра; 2) стимулирующее действие в ультрамалых дозах на сократительную сопособность лимфатических сосудов; 3) вызывает стереотипии при введении в желудочки мозга и усиливает моторную активность; 4) повышает устойчивость к гипобарической гипоксии, 5) в комплексе с другими пептидами (+5ешах+РМЕРа), проявлет защитный эффект при остром геморрагическом шоке и гипоксическом шоке, 6) нормализует мозговое кровообращение и повышает р02 кислорода в крови новорожденных недоношенных детей, оказывает положительное действие в реанимации новорожденных (Ашмарин и др., 1993), 7) оказывает положительное действие при дозированной физической нагрузке у человека, улучшает память и процессы обучения. Есть все основания добавить к этому списку физиологических регуляций - протек/пивное действие ТРГ в отношении развития судорожного ответа, то-есть его противосудорожное действие. Доказательства этому представлены в данной работе. Дополнительным

подтверждением высказанных положений являются изменения ТРГ в структурах мозга, выявляемые после серии судорожных припадков, опубликованные М.КиЬек А. БаИт (1984). Убедительно доказано, что при судорогах повышается содержание ТРГ более чем в два раза в гиппокампе, миндалине, энторинальной коре, причем, в последние годы показано, что содержание предшественника ТРГ (ТЯН-СТу) может увеличиваться в 30 раз (А.БаШп е1 а1., 1995). Локализованное экзогенное введение ТРГ, обеспечивающее его поступление в обонятельную луковицу и структуры лимбической системы, позволяет предположить включение защитных механизмов, аналогичных эндогенным.

Галанин также представляет интерес как эндогенный регулятор холинергической передачи, он выделяется из окончаний холинергических клеток и тормозит секрецию ацетилхолина (1.Сга\уе1у, 1987-1996; Б.О^еп а1., 1992; Т.Ваг1Га1 ег а1., 1992; Т.НоМеИ Л а1., 1987). ГАЛ, следовательно, имеет отношение к холинергической компоненте эпилептогенеза. Одним из возражений его применения в качестве противосудорожного агента может быть его тормозное действие на моторные системы мозга и связь с болезнью Альцгеймера. Возможно ГАЛ оказывает не противосудорожное действие, как таковое, а создает "невозможность" реализации возбуждений в моторных системах мозга. Однако это не так. В последних работах лаборатории У.Веп-Ап на изолированных срезах гиппокампа (Х1т -Б ег а!., 1993) доказано, что ГАЛ снижает секрецию возбуждающих аминокислот глутамата и аспарата, то-есть проявляет прямое противосудорожное действие. Это важно для объяснения наших данных при блокаде гипертермически - вызванных судорог у крысят, у которых блокада секреции глутамата (при незрелости ГАМК-рецепторной системы и ее деполяризующем эффекте) является решающим условием тороможения эпилептической активности нейронов гиппокампа и других структур мозга. Дополнительно это подтверждается нашими данными о полном торможении гипертермических судорог блокадой НМДА-рецепторов с помощью МК-801. Данные о действии галанина на мозг здорового человека, на десинхронизирующие механизмы сна имеют прямое отношение к его участию в эпилептогенезе, поскольку у испытуемых наблюдали значительное повышение мощности дельта-активности (Н. Мигск ы а1.,1996).

выводы

1. Разработана экспериментальная модель эпилепсии на крысах с дробным введением хемоконвульсанта в подпороговых дозах (на примере пентилентетразола), позволяющая "управлять" развитием судорожного моторного припадка, срочно определять индивидуальную чувствительность животных и в кратчайший срок оценивать противосудорожные свойства нейропептидов.

2. Показано, что интраназальное введение тиролиберина в ультрамалых дозах приводит к полному торможению судорожного ответа на введение пентилентетразола, или к снижению тяжести судорожного припадка, увеличению латентных периодов тонической и клонико-тонической стадий судорог. Электрофизиологически это проявляется в уменьшении частоты и продолжительности разрядов последействия.

3. Выявлена дозозависимая характеристика влияний тиролиберина при его интраназальном введении: эффект торможения моторного припадка наблюдается в диапазоне концентраций от 1СИ2 М до 1(Н М. При больших концентрациях - Ю-6 М эффект не наблюдается, а при дальнейшем увеличении концентрации ТРГ до 1(И М выявлен противоположный эффект -облегчение судорожного припадка.

4. Введение меченого тиролиберина показало, что уже через 15 мин после интраназального введения (время проявления тормозного эффекта на ПТЗ вызванные судороги) наблюдается его накопление в ткани обонятельной луковицы. Это позволяет предполагать, что при интраназальном введении эффект ТРГ может быть связан с его поступлением в обонятельную луковицу и другие структуры конечного мозга.

5. На крысятах в возрасте от 5 до 15 дней исследованы особенности развития гипертермических судорог развивающегося мозга, котороые являются моделью фебрильных судорог у детей. Показана роль НМДА-рецепторов в инициации и развитии гипертермических судорог с помощью системного введения неконкурентного антагониста МК-801

6. Впервые показано противосудорожное действие нейропептида галанина на модели гипертермически вызываемых судорог. При системном внутрибрюшинном введении галанин эффективен в определенный возрастной период с 7-го по 11-ый дни развития. Галанин в 2-3 раза увеличивает латентный период наступления первых вздрагиваний (minimal seizures) и клонико-тонической стадии (major generalized seizures) припадка.

7. Галанин в условиях хемоконвульсантной модели (внутрибрюшинное введение пентилентетразола) оказывает противосудорожное действие у взрослых крыс как при интраназальном (20 мкг), так и при внутри-желудочковом (2 мкг) введении.

8. Галанин в тех же дозах тормозит эпилептиформную ЭГ активность: развитие генерализованных разрядов пик-волновой активности. Эффект галанина ослабляется предварительным внутрижелудочковыми введением антагониста галаниновых рецепторов - галантида (МК15).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

[1] Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., Obukhova M.F., Abbasova K.R., P. Ch. Kumar, Ashmarin I.P. Immunization against the antidepressant inkazan inhibits corasol and cobalt-induced seizures in amygdala // Focus on Epilepsy - I. Cellular mechanisms and pharmacological approaches. Intern. Symp., Ste-Adele, Canada. August. 10-12, 1991. Abstr. P. 15.

[2] Chepurnova N.E., Kabanova N.P., P.Ch. Kumar., Abbasova K.R;, Chepurnov S.A., Ashmarin I.P. Normalization of peripheral vegetative reflexes by neurokinin and kassinin during motor seizures and the prevention of seizures by neuropeptides / The 20th Intern. Epilepsy Congress. 1993. Norway // Epilepsia. 1993. V. 34. Suppl. 2. P. 51.

[3] Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., Abbasova K.R., Turbovskaya E.Ja., Ashmarin LP. Thyrotropin releasing hormone (TRH) in ultra low doses increases the convulsion threshold in the rats / The 2nd Intern. Congress on Ultra Low Doses. 1-2d Octobre, 1993. Bordeaux, France, 1993. // Livre des resumes. P.34.

[4] Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., Abbasova K.R., Jin Kiu Park. Cognitive functions and carbamazepine in experimental epilepsy // Meeting of The European Federation of Neurol. Societies, December 8-11, 1993. Berlin, 1993. P. E-23.

[5] Чепурнов C.A., Чепурнова H.E., Бузинова E.B., Аббасова К.Р., Сато М., Альбрехт Д., Парк: Джин-Кью. Когнитивные функции при экспериментальной эпилепсии нормализующее действие карбамазепина и нейропептидов // Симп. с международным участием: "Физиолого-биохимические основы жизнедеятельности мозга". 22-24, июня 1994 г. Санкт-Петербург. 1994.

[6] Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., Chepurnov A.S., Abbasova K.R., et al. Restorative influence of carbamazepine on "the cognitive map" and working memory in rats during epilepsy syndrome testing.// X Konferencja Naukowa na Temat Padaczki. Warszawa, 18-21, May, 1994. P. 6-7.

[7] Chepurnova N.E., Kossova G.V., Abbasova K.R., P.Ch.Kumar, Chepurnov S.A., I.P.Ashmarin Thyrotropin releasing hormone in ultra-low doses decreases severity of seizures of rats / "Neuropeptides 94". European Neuropeptides Club. The 4th Annual Meeting, April, 1994 Strassbourg // Neuropeptides. 1994. V. 26. Suppl. 1. P. 52.

[8] Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., Buzinova E.V., Abbasova K.R., Sato M., Albrecht D., Park Jin-Kyu. Cognitive function in experimental epilepsy (The improvment by carbamazepine and neuropeptides) // The physiological and biochemical basis of brain activity. / Symp. dedicated to 70th anniversary of acad.N.P. Bechtereva. June 22-24, 1994. Saint-Petersburg. P. 74.

[9] Chepurnova N.E., Chepurnov S.A. Abbasova K.R. Febrile hyperthermia-induced seizures: long-tem impacts for developmetn of the cognitive functions in expreriment. // II Congress Epileptologii. Polska Liga Przeciwpadaczkowa. Warsawa 17-20, 1995. P. 32-33.

[10] Abbasova K..R., Sato M., Moghimy A., et al., Restorative influence of carbamazepine intranasal administration on the "cognitive map" and memory in rats during experimental epilepsy/The 21st Intern. Epilepsy Congress. Sydney, Australia, 3-8 September 1995.// Epilepsia 1995. V. 36. Suppl. 3. P. S44.

[11] Chepurnova N.E., Asanova L.M., Abbasova K.R., Inyushkin A.N., Chepurnov S.A., Ashmarin I. P. Physiological bases оГ applications of neuropeptides (thyroliberin) in epileptology // The Intern. Congress "Epilepsy-A Developing World". Chine, Bejin. 22-28 April. 1996.

[12] Chepurnova N.E., Chepurnov S.A., Klueva U.A. Abbasova K.R. Hyperthermia-induced febrile convulsions increase the susceptibility to epleptogenesis / The 2nd European Congress on Epilepsy // Epilepsia. 1996. V.37. Suppl. 4. P. 94.

[13] Chepurnova N.E., Abbasova K.R., Kabanova N.P., Chepurnov S.A., Ashmarin I. P. Effects of tachykinins on the electrodermal conductivity / The 6th Annual Meeting of European Neuropeptides Club. Pesc, Hungary. June, 16-19, 1996 // J. Neurobiology, 1996.

[14] Чепурнов С.А.,Чепурнова H.E., Аббасова K.P. Нейропептид галанин в эпилептогенезе развивающегося мозга // Успехи физиол. наук. 1997 Том.28. вып. 2. С. 3-37.

[15] Чепурнова Н.Е., Клюева Ю.А., Аббасова K.P., Котликова О.Н., Чепурнов С.А. Долговременные влияния фебрильных судорог в раннем отнтогенезе на процессы обучения и памяти // Журнал высш. нервн. деят. 1997. Т. 47. №3. С. 601-604.

[16] Chepurnova N.E, Abbasova K.R, Klueva U.A, Kotlikova O.N., et al., Impairment of cognitive function and learning in rats after hyperthermia-induced febrile convulsions in neonatal period. // The 22d World Congress on Epilepsy / Ireland, Dublin June 28- 4 July. 1997 // Epilepsia. 1997. V.37. Suppl.3. P.

[17] Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., Abbasova K.R., Berdiev R.K.. et al., Peptide galanin and seizure state in developing brain // XXXIII Intern. Congr. of Physiological Sciences. 1997. Saint-Petersburg. June, 30-July, 5. 1997. P.

[18] Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., Abbasova K.R. et al. Galanin controls the seizures in the developing brain // Neuropeptides-97. The 7th Annual Meeting of European Neuropeptides Club. May. 21-25 Marburg. 1997 P.

Выражаю сердечную благодарность академику И.П.Ашмарину за предоставленную возможность завершить исследования в МГУ.

Благодарю моих руководителей Н.Е.Чепурнову и С.А.Чепурнова, и директора института физиологии ЧАН, проф. Павла Мареша за консультации и возможность работать в его лаборатории в Праге.

Особую благодарность выражаю своему брату Аббасову Фуаду Расим оглы.

БЛАГОДАРНОСТИ