Роль тиролиберина в регуляции генерализованной и фокальной экспериментальной эпилепсии

Гончаров, Олег Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль тиролиберина в регуляции генерализованной и фокальной экспериментальной эпилепсии
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль тиролиберина в регуляции генерализованной и фокальной экспериментальной эпилепсии"

На правах рукописи

Гончаров Олег Борисович

РОЛЬ ТИРОЛИБЕРИНА В РЕГУЛЯЦИИ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОЙ И ФОКАЛЬНОЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЭПИЛЕПСИИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Специальность 03.00.13 - физиология

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных

Биологического факультета Московского Государственного университета им М.В.Ломоносова (заведующий кафедрой академик РАМН И.П.Ашмарин)

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Чепурнов Сергей Александрович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор

Щебланов Виктор Ювенальевич

Ведущая организация

к андидат биологических наук доцент

Лихачев Юрий Валентинович НИИ ВНД и Нейрофизиологии РАН

Защита состоится 26 декабря 2005 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.93, при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы д. 1, корпус 12. МГУ. Биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 26 ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Б. А.Умарова

I 2ff

JLS3M

Актуальность проблемы. Нейрофизиологические и психофизиологические особенности деятельности мозга детей и взрослых при эпилепсии широко исследуются с применением междисциплинарных научных методов и, в том числе, на животных. Фундаментальное значение исследований в этой области важно для понимания меахнизмов нарушения высших психических функций: внимания, памяти, мышления и интеллектуальной деятельности, эмоционально-личностной сферы у больных эпилепсией. Убедительно показана связь этих нарушений с клиническими проявлениями различных патологий мозга, нейродегенеративными процессами, вместе с тем, изучены еще недостаточно нейрохимические механизмы эпилептогенеза, роль нейропептидов в эпилептогенезе и в предотвращении генерализации судорог.

Нейропептид тиролиберин [L-pyroglutamil-L-histidil-L-prolinamide] (ТРГ) широко распространен в ЦНС и участвует в регуляции высшей нервной деятельности в восходящем ряду млекопитающих (Т.Н.Соллергинская,1990). Его внеэндокринные, центральные эффекты заключаются в активирующем действии, усилении эмоциональных реакций, ТРГ считают эндогенным антидепрессантом - панактивином. В работах, выполненных на кафедре физиологии человека и животных МГУ под руководством академика И.П.Ашмарина (С.А.Чепурновым, Н.Е.Чепурновой, Р.К.Аббасовой, Т.В.Лелековой, А.А.Гусевой, А.А.Мартьяновым, Н.П.Кабановой, П.Чандра Силапагари, а также в сотрудничестве с проф. А.Н.Инюшкиным (Самарский ГУ) и проф. И.Г.Власовой (РУДН) был всесторонне изучен спектр физиологических функций ТРГ. ТРГ оказывает стимулирующее действие на дыхательные рефлексы и нейроны дыхательного центра; стимулирует в ультрамалых дозах сократительную способность лимфатических сосудов. ТРГ повышает устойчивость к гипобарической гипоксии. ТРГ нормализует мозговое кровообращение и повышает парциальное давление кислорода в крови новорожденных недоношенных детей, его i.v. введение оказывает положительное действие в реанимации новорожденных. Эффекты ТРГ реализуются в нервной системе через специфические рецепторы (Laakkonen, Guarnen, Osman 1996; Huang, Osman, Gershengorn, 2005), а так же определяются согласно концепции И.П.Ашмарина его ролью в «физиологическом континууме регуляторных пептидов». И.П.Ашмариным, Л.М.Асановой и др. (1995) было впервые показано, что противосудорожный эффект наблюдается в клинике детской эпилепсии и определяется дозой ТРГ и способом его введения. Именно применение ТРГ в ультрамалых дозах при локальном

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ 3 БИБЛИОТЕКА С.Пе 09

; ЛПОТЕКА I

интраназальном введении оказывает противосудорожное действие. Физико-химический и нейрохимический механизм этого явления изучен Е.Б.Бурлаковой, Н.В.Пальминой и др. (2003, 2005), показавших, что модификация структуры биологических мембран является одним из механизмов его противосудорожного действия (Пальмина, Жерновков, 2005).

В нашей работе проведено исследование влияния ТРГ и его метаболита на судорожную активность у крыс при аппликацию на слизистую носа в ультрамалых дозах и концентрациях. Поскольку проникновение ТРГ из крови в мозг ограничивается отсутствием транспортных систем в ГЭБ и наличием энзимов расщсплсния ТРГ в плазме (Zlokovich, Segal st al.,1985), концентрация ТРГ в ликворе стабильна Это определяется также отсутствием или неактивностью в ней ферментов деградации, процессами секреции ТРГ в ликвор ТРГ-ергическими нейронами, прилежащими к желудочкам мозга. Прямое поступление ТРГ через слизистую в ликвор обеспечивает его более быстрое и эффективное действие на мозг. Эффективность такого введения доказана с помошью изотопного метода (Аббасова, 1997). Противосудорожное действие ТРГ было открыто с применением экспериментльных судорог, вызываемых пентилентетразолом, тогда как ряд клинических форм имеют другую природу эпилептогенеза. Модель возникновения зеркальных эпилептических очагов остается актуальной для изучения фокальной эпилепсии. В частности, очаг, создаваемый кобальтом (по методу Mutani et asi 1973), является адекватной моделью для развития кортикальных и подкорковых зеркальных очагов, как это впервые было показано Э.С.Толмасской, Л.Н.Неробковой и В.Ю.Щеблановым (1980).

Целью исследования является выяснение роли тиролиберина в рефляции генерализованной, вызываемой хемоконвульсантами, и фокальной, вызываемой кобальтом, судорожной активности головного мозга.

Для выполнения этой цели решались следующие задачи:

• используя хемоконвульсант пентилентетразол (ПТЗ) в модельных опытах на крысах, изучить дозо-зависимые противосудорожные эффекты ТРГ при его интраназальном введении в ультрамалых дозах;

• сравнить эффекты ТРГ с действием дипептида гистидин-пролина, который является естественным метаболитом ТРГ, а также с

действием синтетического аналога ТРГ - Р11-546, не обладающего эндокринным действием;

• исследовать модель фокальной эпилепсии, создаваемой введением порошка металлического кобальта в соматосенсорную кору кролика;

• на модели первичного и зеркального фокальных эпилептических очагов в коре исследовать действие ТРГ при (а) интраназальном введении в ультрамалых дозах и (б) при внутривенном введении в дозах, превышающих физиологические;

• на модели пентилентетразоловых судорог исследовать изменение чувствительности и судорожной активности у гомозиготных крыс линии (по локусу В2.Та§1 - А типа).

Научная новизна исследования. Впервые показано, что для проявления противосудорожного эффекта ТРГ необходимо взаимодействие с рецептором полной молекулы этого трипептида, так как его метаболиты противосудорожным действием не обладают. Впервые показано, что эффекты интраназального введения ТРГ у кролика с фокальной эпилепсией имеют дозозависимый характер: противосудорожным эффектом обладает ТРГ в дозах и 10'12 М.

Показано, что при внутривенном введении (по протоколу, рекомендованному в детской клинической эпилептологии) ТРГ оказывает сильное проэпилептическое действие, как на первичный, так и на вторичный очаг на модели кобальтовой эпилепсии.

Теоретическое и практическое значение. Подтверждено в опытах на крысах и кроликах, что интраназальное введение ТРГ является адекватным методом противосудорожной терапии. Показано, что внутривенное введение может повышать риск эпилептического статуса у больных с фокальной эпилепсией с последующей гибелью клеток гиппокампа, тогда как при генерализованных формах эпилепсии интраназальное введение ТРГ оказывает противосудорожное действие.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на конференции аспирантов и молодых ученых МГУ «Ломоносов-2000» (Москва), на 3-м Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» 2002 (Москва), научной конференции «Опыт интеграции научных исследований НИИ-ВУЗ-клиники 2002 (Москва), Всероссийской конференции с международным участием «Нейроэндокринология - 2003» (Санкт-Петербург), 15-ом Съезде Европейского Нейропептидного Клуба 2005 (Рига, Латвия), 26-ом

Конгрессе по Эпилепсии, Международной Лиги против Эпилепсии, 2005 (Париж Франция).

Публикации По теме диссертационной работы опубликовано 11 научных работ (статей - 3, тезисов - 8).

Объем и структура диссертации. Диссертация включает 130 страниц текста компьютерного набора. Текст состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования и полученных результатов, обсуждения и выводов.Список использованной литературы содержит источников.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 96-04-50331 и

№ 00-04-48809

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводили с соблюдением требований, предъявляемых к работе с экспериментальными животными в России (приказ Минздрава №755 от 12.08.1977 г.), и в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, с Директивами 86/609/ЕЕС, рекомендациями рабочей группы FELASE [1986. 86/609/ЕЕС. ISSN 03780 6978].

Эксперименты с пентилентетразоловой моделью судорог (на крысах). На взрослых крысах-самцах (п=160) линии Wistar и беспородных крысах применяли модель судорожной активности, которая разработана на основании методики фармакологического киндлинга. Регистрацию динамических изменений моторной судорожной активности проводили после дробного введения пороговых доз пентилентетразола (ПТЗ), что позволяло более дифференцированно оценить чувствительность к эпилептогену. Методика имеет преимущества перед моделью одноразового введения эпилептогена (75 мг/кг), так как дробное введение ПТЗ позволяет замедлить процесс развития судорожной активности или остановить развитие процесса, если судорога достигает максимальной длительной клонико-тонической фазы уже при пороговой дозе 25 мг/кг и угрожает жизни животного. Метод исключает передозировку эпилептогена при повторных введениях в последующие экспериментальные дни с целью контроля развития киндлинга. Метод позволяет в пределах одного дня выявить индивидуальную чувствительность и судорожные пороги у каждого животного экспериментальной группы. Разработка метода была начата К.Р.Аббасовой (1997).

По протоколу опьггы проводили с интервалом не менее двух суюк. В первый день дробно вводили только ПТЗ - внутрибрюшинно в

Графическое выражение развития судорожного припадка в новой модели дробного введения ПТЗ (указано стрелками) По оси ординат - баллы , по оси абсцисс-время в мин Черные столбики — суммарная накапливаемая доза введенного ПТЗ (однократное введение - 25 мг/кг)

дозе 25 мг/кг каждые 15 мин, но не более трех раз. При достижении судорожной моторной активности, оцениваемой как 4-я стадия по шкале акад. Павла Мареша (ЧАН), дальнейшее введение ПТЗ прекращали. Крыс распределяли по выраженности судорожного порога: формировали однородные группы животных с учетом профиля эпилептического припадка (контрольную и опытную) с максимальным ответом до 15 мин (одно введение ПТЗ) и 30 мин (2 введения ПТЗ). На второй экспериментальный день животные опытной группы получали ПТЗ + ТРГ. ТРГ вводили интраназально в объеме не более 5 мкл в каждую ноздрю. Первую аппликацию ТРГ проводили за 10 мин до введения 25 мг ПТЗ, а в последующем - одновременно с введением ПТЗ.

Животные контрольной группы всегда получали физиологический раствор в том же объеме. Третий опытный день был контрольным -вводили только ПТЗ крысам обеих групп. Протокол опыта мог быть изменен в зависимости от задачи исследования. Для наблюдения судорог крысу помещали в камеру с прозрачными пластиковыми стенками. Моторную судорожную активность измеряли по шкале П.Мареша и Г.Кубовой, представаленной в таблице. Для каждого животного строили график изменений тяжести припадка во времени (рис.1)._

0 отсутствие реакции

0,5 абнормальное поведение: длительные периоды замирания, учащение дыхания, напряжения мышц пальцев и хвоста

1 изолированные миоклонические вздрагивания (myoclonic jerks)-,

2 атипичные минимальные судороги (minimal seizures')-,

3 судороги ююнического типа, ограничивающиеся вздрагиванием

головы и мышц туловища, «встряхивание мокрой собаки»,

4 большие судороги без тонической фазы (major seizures), судороги мышц всего тела, подъем на задние конечности - "поза кенгуру";

5 полные большие, генерализованные тонико-клонические судороги с потерей выпрямительных рефлексов (generalized tonic-clonic seizures), падением животного на бок.

4 7 10131619 22 252*31 4043

4 7 101316192225М31Э437404Э

Jll---

4 7 1013161922 232S 3134374043

I 4 7 I0I1|6192225M31J*J7«43

Ha puc.l представлено количественное выражение судорожного припадка, вызываемого ПТЗ. Момент внутрибркпишного введения указан стрелками. По оси ординат — тяжесть приступа в баллах, по оси абсцисс - время в минутах. Слева - пример крысы с низким судорожным порогом -припадок наступает при дозе 25 мг/кг. Интервалы между опытами /-// - 2 сут., II-III - 18 сут., 1II-IV- 4 сут. Справа - пример крысы с высоким судорожным порогом ( ответ на суммарную дозу 50 и 75 мг/кг). Интервалы между опытачи с применением ПТЗ 1-11 —8 сут., II-III —17 сут.

Показателями эффективности противосудорожного действия служили: (1) факты полной или частичной блокады судорожной активности, (2) индивидуальная изменчивость моторного судорожного приступа животного; (3) изменение длительности латентных периодов наступления реакции, в среднем в группе животных; (4) изменение числа крыс с различной тяжестью припадков, выражаемое в процентах различных стадий судорожной активности у крыс контрольной и опытной групп, до и на фоне действия антиэпилептогена; (5)число животных, у которых на фоне исследуемого вещества полностью блокировался судорожный моторный припадок.

Введение веществ. Крысам ТРГ вводили интраназально в концентрациях от 10 "12М до Ю^М в объеме 10 мкл. Использовали ТРГ в химически чистом виде и в виде препарата «Рифотироин», синтезированного ТТ.Е.Романовским в НИИ Органического Синтеза (Рига). Дипептид cHis-Pro (NEOSYSTEM) также вводили интраназально. Внутрибрюшинно вводили: пентилентетразол (разовая доза 25мг/кг) "Sigma"; для сравнения применяли общепринятое противосудорожное средство - вальпроевую кислоту перорально в лекарственной форме Депакин, Орфирил (DISITIN, Germany).

Кроликам ТРГ вводили интраназально в дозе 10'9 М и 10"|2М, в обе ноздри, а внутривенно (в вену уха) в дозах 25, 50,100 мкг/кг. Аналоги вводили только крысам: cHis-Pro-NH2 - метаболит ТРГ (см. схему) PR-546 ( DHO-His_Pro-NH2 ) имеет в составе дигидрооротовую кислоту, которая замещает глютамат. Молекулярный вес синтетического пептида 45.4 Интраназальное введение осуществляли одному и тому же животному по убывающей концентрации: Iff9 М, 10"10 М, 10"12 М.

Электрофизиологические исследования судорожной активности Электрофизиологические исследования проводили с помощью 4-х канальной усилительной системы с компьютерным анализом ЭЭГ -"CONAN" А.П.Кулаичева. Система является интегрированным аппаратно - программным комплексом, она позволяет визуально исследовать запись, вычислять амплитудно-частотные характеристики (вычисление спектра текущей эпохи по методу быстрого преобразования Фурье). Регистрацию суммарной электрической активности мозга проводили биполярно с помощью нихромовых электродов (диаметром 75 мкм, расстояние между кончиками 0.5 мм), которые вводили в лобный отдел коры, гиппокамп и миндалину по общепринятой методике, стереотаксическим координатам атласа мозга крысы Е.Фифковой и Дж.Маршалла. Электрическую активность в условиях свободного поведения регистрировали не ранее, чем через двое суток после операции. По окончании опытов проводили морфологический контроль.

Координаты, используемые для введения погружных электродов

ссоавт., 1962)

Инертный электрод вживляли в кости черепа.

по атласу К .Фифковой и Д..Маршалл (Я.Буреш

Структура АР L H

Cortex frontalis +2 2 1-1.5

+2 3.5 1-1.5

Cortex parietal. -6 4 1.5-2

-3 3 1.5-2

Модель формирования эпилептического очага в коре, вызываемого металлическим кобальтом

Кобальтовая модель была разработана на кафедре С.А.Чепурновым, Н.Е.Чепурновой (1980) и Маджид Басир Шейхом (1978) для изучения зеркальных очагов в миндалевидном комплексе мозга кролика. Мы использовали эти методические приемы для формирования первичного очага в зоне фронтальной коры мозга кролика и зеркального очага в симметричном участке противоположного полушария. Металлический порошок атомарного кобальта помещали в стеклянную канюлю диаметром менее 1 мм , которую вживляли в кору на глубину 2 мм.

Использовали координаты атласа С.М.Блинкова, Бразовской Ф.А. и Пуцимлло М.В. (1973). Канюля находилась на уровне -6 мм от брегмы, регистрирующий монополярный никелиновый электрод диаметром 70 мкм располагали впереди канюли. В противоположное полушарие погружали симметрично другой электрод. Операции и забор материала для последующего электронно-микроскопического анализа проводили совместно с доктором А.А.Суворовым.

Взяты образцы белого вещества мозга кроликов из первичного, зеркального очагов и мозолистого тела, электронно-микроскопические исследования которых будут проводиться под руководством д.б.н. О.Н.Гайковой (кафедра неврологии Военно-Медицинской Академии, Санкт-Петербург).

Таблица 1

I Кролик Вес в гр. | Операция по вживлению 1 Наркоз Норматон мл. Время в мин

[ Ьгеу-уаег 3200 | 28.05.05 1 55

| Яес1 уеаг 3200 1 28.05 05 | 1.6+0 9 60

{ Яес11а|| J 2900 ! 20.06.05 | 1 65

! 154X702 3100 | 20.06.05 1 0.9 60

| И0\56 3200 ! 20.06.05 9 1+0.8 50

| 108X56 2700 20.0605 \ 1+0.4 65

На рис.2 Слева. Мозг кролика, вид сверух (по П.В.Терентьеву. и др, 1952 с изменениями). Вскрыта кора для обозначения мозолистого тела; показано положение первичного очага и регистрирующих ЭГ электродов во фронтальных отделах коры. Справа . фронтальный срез

левого полушария, показно положение погружного электрода на уровне

—6 от брегмы

Статистическая обработка результатов. Данные представлены в форме среднее±ст.ошибка. Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием пакета статистических программ STATISTICA (StatSoft Inc, USA). Использовали точный метод Фишера, U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, парный критерий Вилкоксона, а также метод анализа вариаций (ANOVA). Уровень достоверности р<0.05 принимался за значимый.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Часть 1 Тиролиберин в регуляции генерализованной судорожной активности у крыс на примере хемоконвульсивной модели

Противосудорожные эффекты тиролиберина в ультрамалых дозах при его интраназальном введении Сравнивали развитие ПТЗ-вызванных моторных судорог у крыс контрольной группы, получавших физиологический р-р, и опытной группы, получавших 1(Г10М ТРГ (три раза с интервалом 15 минут). У крыс контрольной группы (п=22) в ответ на введение ПТЗ в 100% случаев развивались приступы в 4-5 баллов на 1, 4 и 7-ой дни введения. Крысы опытной группы (п=22) в первый день получали только ПТЗ и у 80% животных возникали максимальные припадки. На 4-ый день введение ПТЗ сочетали с аппликацией ТРГ, в этом случае припадок провоцировался только у 21,6% крыс. На 7-ой день (введение ПТЗ без ТТГ) эффект повышения судорожного порога сохранился у 33% крыс, у

остальных возникли моторные припадки 4-5 баллов. Снижение тяжести припадка привело одновременно к снижению летальности у крыс опытной группы.

В другой серии опытов детально сравнивали тяжесть припадков, определяя число (%) стадий в 3, 4 и 5 баллов. В контрольной группе крыс (п=13) треть животных ответили на введение ПТЗ максимальными по тяжести припадками. При введении ТРГ крысам опытной группы (п=13) полностью купировались припадки 5 баллов и снизилось число приступов 4 балла (с 85 до 77 %). На 7-ой день при введении только ПТЗ не подтвердилось наличие положительного следа ТРГ.

В специальной серии опытов трехкратную аппликацию ТРГ проводили в уменьшающейся концентрации (10"8М - Ю'10М - 10"12М ) с тем, чтобы сохранить поддерживающие концентрации нсйропептида в слизистой, полагая, что торможение припадка начинается с рефлексогенных зон слизистой носа. В каждом опыте концентрация вводимого ТРГ уменьшалась, хотя доза ПТЗ повышалась: первое введение 25г/кг, второе давало суммарную дозу 50 мг/кг и третье - 75 мг/кг На 4-ый день, когда ПТЗ сочетали с аппликацией ТРГ, наблюдали достоверное снижение (р<0,001) числа припадков в 4 балла как по сравнению с контрольными крысами, так и по сравнению с припадками у тех же крыс за два дня до этого опыта, при введении крысам только ПТЗ. Понятно, что снижение числа крыс, отвечающих судорогами в 4 балла (р<0.01) по сравнению и с контролем, и с ответами тех же крыс без ТРГ, означает увеличение числа крыс с меньшей тяжестью припадка в 3 балла (в таблице не указано). Следовательно, вместо клонико-тонических судорог те же дозы ПТЗ вызывали только минимальные судороги клонического типа.

В настоящее время в нашей группе под руководством С.А.Чепурнова проводится поиск других противосудорожных средств. Мы участвовали в разработке возможности применения гинзенозидов в качестве противосудорожных средств. Эти данные были доложены и опубликованы в Южной Корее.

Электрофизиологические доказательства противосудорожного действия ТРГ.

Исследованы ЭГ-корреляты ПТЗ-вызванных судорог, в том числе ранние пик-волновые разряды. При первом введении ПТЗ (25 мг/кг ) через 4 мин возникают пик-волновые разряды только в гиппокампе. Второе введение ПТЗ, как правило, вызывает у всех крыс полноценные синхронные пик-волновые разряды в коре и гиппокампе с

продолжительностью в среднем 1,5 с. Частота волн в разряде по нашим данным была 5-6/с (максимально наблюдаемая - 9/с). В ходе опыта интервал между разрядами увеличивался с 1,5 до 20 с в течение часа, при этом уменьшалась их продолжительность, но частота волн в разряде оставалась стабильной. Эти ЭГ- изменения соответствовали припадкам в 1 - 2 балла. На следующий день повторное введение ПТЗ вызывало аналогичную картину: разряды затухали через 50 мин -1ч. После чего возникали не чаще 1 в мин. При этом в гиппокампе продолжали регистрироваться одиночные пик-волны. ТРГ при интраназальной аппликации прежде всего тормозит процессы генерализации разрядов.

Сочетание системного введения ПТЗ и интраназальной аппликации ТРГ (10"8М и Ю"10М ) задерживало развитие пик-волновых разрядов на протяжении 30 мин. Влияние ТРГ заключалось в уменьшении частоты и продолжительности пик-волновых разрядов, что должно отражаться на дальнейшем развитии моторных припадков. Через 90 мин в ЭГ еще регистрировали разряды не чаще 1 в 1,5 мин и одиночные пик-волны. Эти результаты служат электрофизиологическим подтверждением влияния ТРГ в виде увеличения латентности моторных судорожных ответов 3, 4 и 5 баллов. Аппликация ТРГ редко полностью прекращала процессы генерализованной эпилептизации, но могла блокировать резкое усиление пик-волновой активности, обычно вызываемое добавлением ПТЗ. Повторные совместные введения ТРГ и ПТЗ через два дня показали усиление тормозного действия ТРГ. При сравнении одинаковых временных отрезков электрограммы коры и гиппокампа показано,что отставленная пик-волновая активность с частотой 5-7/с могла наблюдаться спустя 80 мин после введения ПТЗ + аппликации ТРГ. ТРГ вызывал либо повышение судорожных порогов, либо сохранял пороги на прежнем уровне, несмотря на увеличение дозы ПТЗ.

Все сказанное означает, что отсутствие эпилептиформных разрядов в ЭЭГ в покое, или блокирование их с помощью противосудорожных препаратов симптоматично и может быть использовано в клинике для оценки протективного влияния ТРГ как на тонический, так и на клонико-тонический компоненты припадка. Молекулярные нарушения в препатальный и ранний постнатальный периоды развития отражаются на формировании корково-таламических связей в постнатальном онтогенезе, на что указывает, по данным школы С.Ауапиш [21], постепенное формирование эпилептиформных паттернов по мере созревания мозга. В связи с данным обсуждением можно сделать вывод, что противосудорожное действие ТРГ

характеризуется некоторыми особенностями. При интраназальной аппликации ТРГ не вызывает разрушения паттернов пик-волна, а только их урежение или полное блокирование.

Облегчение судрожных припадков при увеличении дозы ТРГ.

Возможность парадоксального эффекта характерна для многих пептидов по мере уменьшения их концентрации на три-четыре порядка (И.П.Ашмарин, Е.П.Каразеева, Т.В.Лелеков, 1999). Каков мог быть диапазон эффективных концентраций ТРГ, в пределах которого может происходить смена его эффектов, например, противосудорожного на облегчающий? При аппликации ТРГ в больших концентрациях наблюдали либо отсутствие эффекта (при КГЧГ), либо облегчение действия ПТЗ (при КГ*М и 10~3М). Облегчающее действие заключалось в снижении порога в 50% случаев. Основные эксперименты с изучением проэпилептического эффекта ТРГ при больших дозах и концентрациях были впервые проведены в наших опытах на кроликах (Часть 2).

Сравнение эффектов ТРГ и его метаболита - дипептида cHis-ProNHi

Внеклеточная инактивация ТРГ осуществляется специфическими энзимами, принадлежащими семейству цинк - зависимых металлопептидаз (В.Е.Клуша,1984). Известно, что в крови и тканях одним из путей метаболизма ТРГ является распад на глютамат (pGlu) и дипептид His-Pro. Выяснено, что именно ароматическое кольцо является местом связывания в положении Туг282 ТРГ-рецептора с His. Малые размеры молекулы ТРГ позволяют ей связываться с трансмембранным доменом ТМ6. Доказано также и другое взаимодействие в ТМ7 между Arg306 и терминальным карбоксиамидом ТРГ (Perlman et al.,1996], PyroGlu связывается с ТРГ-рецептором в положении ТугЮб и Arg306. Лиганд-рецепторный комплекс включает также связывание ТРГ с 11е109, Ilel 16 в НХЗ и ТугЗЮ и Ser313 в НХ7 ( Laakkonen et al., 1996). Возможно ли, чтобы дипептид His-Pro, возникающий после расщепления ТРГ, самостоятельно «продолжал» его противосудорожное действие. На рис.3 даны фрагменты опытов, где представлен характер развития судорожных припадков у крыс. Аппликации His-Pro в концентрациях 10'9М и 10"5М не вызвает торможения ПТЗ-вызванного судорожного ответа (рис.3 А, Б). Напротив, последующая аппликация тем же крысам ТРГ в дозе Ю"|0М вызывает противосудорожный эффект, увеличивая латентные периоды наступления припадков в 4 и 5 баллов (рис. 3- В, крысы № 4, 5, 7, 8). В разных группах крыс латснтности увеличивались в среднем с 7.4 ±1.4 с до 10±6.6 с (п=4) и с 2.4±0.8 с до 13.3+5.2 с (п=5). Наблюдается также снижение тяжести припадка: на

фоне ТРГ регистрируются судроги только в 4 балла (рис. 3- крысы № 3, 5, 7, 8). Следовательно, наличие гистидина в дипептиде не обязательно приводит к тем же противосудорожным эффектам, которые наблюдаются при введении целой молекулы ТРГ.

Рис 3 Ответы пяти крыс при интраназальной апппикаии дипептида (А,Б) и тиролиберина (В). Стрелками указаны введения ПТЗ (разовая доза 25 мг/кг) После введения ТРГ увеличивается латеный период наступления припадка

Наши результаты подтверждают ранее проведенные исследования влияния данного дипептида на развитие температурного гомеостаза у крысят (Sato, Kato, Miyamori et al., 1986). Было показано, что введение дипептида непосредственно в мозг (tectum) в аналогичных ультрамалых дозах Ю'"М и 10-9М крысятам в возрасте 3-х недель снижает термогенез, а введение ТРГ в тех же дозах - повышает. Авторы не видят противоречий в полученных результатах, полагая, что протовоположные регуляторные эффекты молекул ТРГ и его метаболита His-Pro встраиваются в единый терморегуляционный механизм гипоталамуса. Действительно T.Hori, M.Yamasaki, N.Asami et al. (1988) показали микроионофоретическим методом, что возникают разные эффекты при подведение к термочувствительным клеткам гипоталамуса ТРГ и His-

Pro. ТРГ снижал активность тепловых клеток и повышал активность холодовых нейронов преоптической области гипопталамуса, действуя на все клетки. His-Pro вызывал повышение активности только трети исследованных нейронов, причем «не делая различий» для холодовых и тепловых рецепторных нейронов. Полагаем, что эти эффекты следует объяснять различным распределением рецепторов к ТРГ в гипоталамусе и различной афинностью. Сходными нам представляются данные, полученные на нейронах респираторного центра у крыс. Подведение ТРГ вызывало различные реакции нейронов инспираторных и экспираторных (А.Н.Инюшкин, 1998).

Противосудорожные эффекты синтетического аналога тиролиберина PR-546

Другим аналогом ТРГ, противосудоржные свойства которого мы исследовали с помощью ГГГЗ-модели, был препарат PR-546. Опыты проводились на трех группах животных, показатели тяжести судорого расчитывали отдельно для группы самок (п=12) и самцов (n=12). PR-546 был более эффективен при интраназальной аппликации самкам. На рис 4 представлены изменения средних значений наступления клонико-тонических судорог (4-5 баллов) под влиянием PR-546. Результаты достоверны, несмотря на большой разброс (20,42±1,9 мин) как по сравнению с контрольной группой крыс (18,2±0,5 мин), так и по сравнению с результатами, полученными до введения пептида (17,6±0,7 мин).

25 20 -15 -10 5 1 0

КОНТРОЛЬНАЯ ГРУППА

ОПЫТНАЯ ГРУППА

I I

р<0,1 Поотно шению к контролю

На рис 4 представлены изменения латентных периодов под влиянием PR-546 1(Г М, (2 - опытная группа) В контрольной группе вводили физиологический растовр(2-контрольная группа) Интервал между опытами 1 и 2 - 3 сут

Большой разброс в изменении латентных периодов связан с изменением общего характера формирования судорожного ответа. РЯ-546 может отодвигать время наступления припадка (рис. 5,опыты №5, №6). В случае, если припадок наступает быстрее чем в контроле, РЯ-

645 способствует быстрому затуханию судорог (рис. 5,оптыт № 11). Вместе с гем, нельзя сделав вывод, что препарат в полной мере обладает противосудоржными свойствами. Здесь повторяется та же закономерности, которая выявлена нами при изучении дипептида. His-Рго. Наличие оротовой кислоты снимает связывание с рецепторами клеток-тиреотрофов, но частично сохраняется связывание с некоторыми рецепторами к ТРГ, расположенными в структурах головного мозга. Это могут быть подтипы рецепторов TRH-RI (Straub et al.,1990) или TRH-2 (Сао et al., 1998). Первый ограниченно экспрессируется в ЦНС, а второй широко распространен во всех отделах головного мозга крысы (Heuer, Schafer et al., 2000). У TRH-R2 только 51% идентичности в аминокислотной последовательности с TRH-R1. Только недавно А.М.Балашовым, Т.Н.Алябьевой и Л.Ф.Панченко (2002 ) было показано, что аналог более эффективно влияет на аффинность опиатных рецепторов (dihydroorotyl-histidyl-prolinamide > TRH > methionyl-asparagyl-phenylalaninamide)

№5

ILA

9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 _i__

33 37 41 45

№6

. ИМДЦИЦИЦ

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45

4 *__

1 5 9 13.17 21 25 29 33 37 41 45

J--

№11

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 i_i___

Пороговые ответы на системное введение ПТЗ у крыс линии WAG/Rij и линии гомозиготных крыс генетически модифицированной линии WAG/Rij

Одной из признанных генетических моделей эпилепсии типа абсанс является инбредная линия крыс WAG/Rij, селектированная на основе крыс линии Вистар (G.VanLuijtelaar & T.Coenen, 1986). Генетически детерминированные абсансы - спайк-волновые разряды (spike-wave discharges - SWD) у этих крыс регистрируются в таламусе и коре, начиная с 3-х месячного возраста, и сопровождаются характерными поведенческими маркерами. Чувствительность к петнилентетразолу (ПТЗ) у крыс линии WAG/Rij с генетически обусловленными абсансами была ранее исследована Ю.А.Клюевой (2000). Она проводила многократные введения ПТЗ беременным самкам крыс (в дозе 40 мг/кг) и исследовала чувствительность потомства к эпилептогенам (Klueva et asl., 2000). Вопрос о пониженной чувствительности крыс с абсансами к ПТЗ был исследован нами на двух линиях абсансных крыс: классических WAG/Rij из Наймегена и гомозиготных WAG/Rij по локусу D2.Tagl - A type ( на З1). Линии была создана в Башкирском университете проф. Л.Б.Калимуллиной и любезно предоставлена для анализа чувствительности к хемоконвульсантам, поскольку такие исследования не проводились. Была выбрана пороговая доза ПТЗ, которая соответствует дозе при первом введении ПТЗ по принятой на кафедре методике оценки ПТЗ-вызванного припадка (Abbasova et al.,2003) для определения вызванных SWD у крыс линии WAG/Rij. На рис. 6 приведены результаты системного введения ПТЗ в дозе 20 мг/кг. Исследование проводили на 6 гомозиготных крысах с электродами, вживленными во фронтальную кору одного полушария. На протяжении двух недель ежедневно регистрировали фоновую активность и эффеты введения ПТЗ. Выявлена большая гетерогенность появления вызванных разрядов по времени. Спонтанные SWD составляли 41±2% с частотой 4 в с и 25±1,5% с частотой 8-12 в с. Эти данные согласуются с работами А.Ф.Бикбаева (2003). Киндлинг практически не развивался. Вызванные ответы не менялись по частотным характеристикам на протяжении двух недель регистрации (типичные ответы представлены на рис.6). Наши данные согласуются с полученными в БашГУ (Kallimullina 2004) и данными о роли дофаминовых рецепторов в генезе абсансной эпилепсии (Kuznetcova ,1996: Bazuayn et al., 2004 ).

При сравнении эффектов ПТЗ у беспородных белых крыс после введения ПТЗ в дозе 20мг/кг, было показано, что появляются пик-волновые разряды с амплитудой 250-600мкВ и частотой 4-6/с. Продолжительность разрядов - 5-8 с, со временем она уменьшается до 1-1,5 с. При введении ПТЗ крысам классической линии WAG/Rij с генетически обусловленными абсансами, кроме усиления присущих этим крысам разрядов с частотой 7-9/с, появляются новые - с частотой 4-5/с, идентичные ПТЗ- индуцированным пик-волновым разрядам у беспородных крыс. Ранее ПТЗ - вызванные разряды с частотой 7-8/с были описаны у крыс линии Вистар ( Vergens М., Marescaux Ch, et al., 1990). Такие ПТЗ-вызванные разряды с частотой 4-6/с были зарегистрированы для развивающегося мозга крыс ( Schickerova R., Mares Р. 1989.).

№2

tí, >4 wietm.1 №3

.Рис.6Примеры ПТЗ-выэванных разрядов у гомозиготных крыс линии 1ГАвЩ-

Ли Б повторение опыта через 7 сут., доза ПТЗ-20мг/кг, крысы N° 2,3 В - другой опыт, эффекты ПТЗ- доза 20 мк/кг сверху вниз 4 корысы, одновременная запись спустя 15 мин после введения ПТЗ- 20 мг/кг

Итак, выявлена пониженная чувствительность крыс линии АУАО/Щ} к хемоконвульсантам, причем, как показано в опытах А.Правдухиной, наблюдается их утойчивость при воздействии лития и пилокарпина для индукции эпилептического статуса. Эти факторы необходимо учитывать при тестировании новых противоэпилептических перпаратов на животных с генетически обусловленными абсансами.

Часть 2 TPГ в регуляции фокальной эпилепсии на примере очагов, сформированных хроническим введением металлического кобальта в неокортекс кролика **

(**Соруководителем данной части работы является доцент канд. биол. наук Н.Е.Чепурнова, МГУ)

Тормозящее влияние ТРГ в ультрамалых дозах при интраназальном введении и стимулирующее влияние больших доз ТРГ, вводимого

вунтривенно

На шести хронических животных прослежено время формирования первичного и вторичного (зеркального) очагов. Показано, что при локализации кобальта (первичного очага) рострально в области фронтальной коры, появление разрядов пик-волновой активности не сопровождается моторными судорогами. Уже к третьим суткам формируется зеркальный очаг. Судорожная — пароксизмальная электрическая активность коры становится генерализованной, спайк-волновые разряды, острые волны регистрировались одновременно в обоих полушариях. На этой модели было проведено исследование эффективности интраназального введения ТРГ в ультрамалых концентрациях на активность первичного и вторичного очагов и генерализацию эпилептической активности. В активности отмечались спайк-волны, острые волны, ритмическая активность нарастающей амплитуды. Измерения амплитуды и частотные характеристики проводились с помощью новой программы, разработанной А.В.Аристовым (каф. биофизики Физического фак-та МГУ) для поиска предикторов в электрической активности при абсансной эпилепсии.

На протяжении недели, а для одного животного на протяжении трех недель, проводили регистрацию ЭГ активности фронтальной коры в обоих полушариях. Опыты на всех животных проводили по единой программе: 1) первые день - запись базовой активности, 2) введение ТРГ интраназлыю в дозах 10*9 М и 10"12 М; 3) базовая запись после ТРГ, 4)в другие дни проводили инъкецию ТРГ внутривенно (в вену уха) в дозах 25, 50 и ЮОмкг, что позволяло получить некоторые дозо-зависимые эффекты.

Основной характер изменения активности представлен в автореферате на электроэнцефалограммах. Обработано более 31 записей продолжительностью регистрации от 3 мин до 2-х часов. Поученные результаты позволяют сделать вывод о том, что в случае

интраназальной аипликации ТРГ, его эффект заключается в торможении (на проятженяи до часа) эпилептической активности, спонтанно возникающей под влиянием повреждающего действия кобальта в правом полушарии - Не отмечалось, что торможение более продолжительно в зеркальном очаге, но по интенсивности оно более выражено. В случае внутривенного введения ТРГ возникало генерализованное усиление эпилептической активности, провокация разрядов спайк-волновой активности. Судорожная активность , синхронизовалась в обоих очагах, и сохранялась более 30-40 мин.

Несмотря на то, что при прохождении гематоэнцефалического барьера действующая доза пептидов соотносится как 1 к 100, описываемые эффекты внтуривенного ввведения следует считать центральными. Действите экзогенно вводимогоТРГ складывается при ■этом с эффектом повышенного уровня ТРГ в крови и СМЖ в результате развития фокальной формы эпилепсии. При этом продолжительность эффекта определяется онтосительно медленным выведением ТРГ и его незначительной деградацией в спинномозговой жидкости (B.Zlocovic, Segal Ш Begiey еу al., 1985

ишь

о г

yvvwtyAWy^^

На рис. 7 Слева — регистрация активности фронатльного отдела неокортекса кролика около первичного очага, справа - во вторичном зеркальном очаге) Запись 1, 2 - до введения ТРГ дозе 10-12 М, и через 13 мин (3) т 27 мин (4) после введения

Рис.8.Торможение эпилептической активности в первичном (R) и вторичном (L) очагах коры кролика под влиянием ТРГ вводимого интраназалъно в дозе Ш9 М Время регистрации -1-до, 2-6 мин после аппликации, 3-13 мин после аппликации ТРГ

—т-ш ш w ij fj ш ^

W^VhT^'vW

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведены исследования противосудорожного действия нейропептида тиролиберина при локальных аппликациях на слизистую носа. Введение ТРГ в улмрамалых дозах и концентрациях от 10"12до 10"8 моль/л достоверно тормозило судорожные припадки, вызываемые пентилентетразолом. ПТЗ-тест позволяет объективно оценить торможение судорог. В опытах на крысах ТРГ при интраназальном введении вызывает увеличение латентностей отдельных фаз судорог, снижение тяжести моторных судорожных припадков или полностью их блокирует. При этом в ЭЭГ наблюдается торможение пароксизмальной -пик-волновой активности в неокортексе, гиппокампе, миндалине. Значительное увеличение дозы ТРГ (Ш^'М) вызывает противоположный эффект: облегчение судорожной активности. Метаболит ТРГ - дипептид сШэ-Рго (Ю"10 моль/л, 10'8 моль/л), несмотря на возможность его связывания с рецептором ТРГ, не вызывает противосудорожных эффектов.

Механизм противосудорожных эффектов ТРГ при интраназальной локальной аппликации нуждается в изучении. Аппликация ТРГ в

Рис.9. Усиление эпилептической активности при внутривенном введении кролику ТРГ в дозе 50 мкг. Регистрация через 15 мин (1) и 21 мин (2) после введения.Я-правое полушарие, первичный очаг, Ь- левое полушарие, зеркальный очаг

ультрамалых дозах на слизистую носа может по И.П.Ашмарину индуцировать физиологическую реакцию малыми концентрациями сигнальных молекул посредством нейронов «первого порядка» с последующей передачей уже нервных сигналов на «собирательные нейроны высших порядков». В наших опытах к нейронам первого порядка можно отнести обонятельные клетки и нейроны прилежащих структур (древней коры на пути распространения сингнальных молекул ТРГ в лимфотоке). При этом следует подчеркнуть, что усиление лимфотока под влиняием ТРГ, открытое Т.В.Лелековой, будет способствовать его распространению. К нейронам высшего порядка следует отнести нейроны лимбической системы (пириформная кора, миндалина, вентральный гиппокамп), вовлеченные в совозбуждение лимбических нервных кругов. Именно в этом случае происходит секреция ТРГ как защитная реакция мозга на развитие судорожного процесса Дальнейшие события развиваются по "неврологическому сценарию" вовлечения либо про - эпилептической либо антиэпилептической систем мозга. Исследования последних лет подтверждают, что ключевой для про-эпилептической системы является секреция кортиколиберина и опиатных пептидов, а для противосудорожной системы - секреция ТРГ. При эпилепсии содержание ТРГ повышается более чем в два раза в структурах мозга (гиппокампе, миндалине, энторинальной коре), а содержание предшественника ТРГ (TRH-Gly) может увеличиваться в 30 раз (Satin, Pekary, Lloyd, 1995). Включение аналогичных защитных механизмов начинается с включения ранних c-fos генов (Rozen et al., 1993). При киядлинге миндалины экспрессию ТРГ предшественников наблюдали в зубчатой извилине гиппокампа, пириформной коре. Однако эта собственная защита мозга «срывается» через две недели полного развития кипдлинга, так как продлжается повышенная секреция энксфалина (A.Satin et al., 1995). Эндогенная секреция ТРГ снижает предрасположенность и генерализацию судорожных процессов в мозгу. Ряд фактов говорит за его эффективность: 1) в ядрах мозга имеется высокая плотность рецепторов к ТРГ; 2) доказано синаптическое выделение ТРГ непосредственно в ликвор, в частности нейронами PVN гипоталамуса; 3) in vitro на срезах гиппокампа мозга крыс ТРГ может также модулировать ответ NMDA рецепторов; 4) антигипоксические свойства ТРГ обнаружены И.Г.Власовой при системном введении ТРГ [Власова и др., 1994]. При уровне концентраций в крови и ликворе 200250 10"12 моль/л приращение концентраций при экзогенном введении ТРГ в 10"12 моль/л равно 0.002 - 0.0002. (И.П.Ашмарин и др.,1999).

Расчеты подтверждают и обнаруженную нами эффективность эндоназального применения ТРГ в концентрации 10"12 моль/л. Но и при меньших дозах Н.П.Пальминой и Н.Г.Богдановой выявлены мембранные эффекты ТРГ на клетках печени при действии ТРГ в концентрациях до 10"18 моль/л (изменяется вязкость липидного бислоя на поверхности мембраны эндоплазматического ретикулума печени мыши) (Жерновков и др.,2002, Пальмина и др.,2005). Наблюдаемые изменения в структуре приповерхностных областей липидов, индуцируемые ТРГ, по-видимому, являются существенными для проявления его физиологической активности.

ВЫВОДЫ

1. Подтверждено на модели генерализованной судорожной активности, вызванной хемоконвульсантами (пентилентетразол), противосудорожное действие ТРГ в ультрамалых дозах (от 10" М до Ю-12 М) при его интраназальной аппликации на слизистую носа крысе.

2. Доказана необходимость целостности молекулы трипептида ТРГ, поскольку введете его метаболита дипептида сН1з-РгоМН2 в тех же ультрамалых дозах и концентрациях, не вызывает аналогичных противосудорожных эффектов.

3. Выявлено, что синтетический аналог ТРГ (РЯ-546) в дозах 10"®М, 10"1вМ, 10'12М обладает слабо выраженным противосудорожным эффектом, который зависит от чувствительности животного к ПТЗ, т.е. от величины судорожного исходного порога.

4. Выявлена устойчивость к пентилентетразолу у крыс генетически модифицированной линии ХУАО/Яц (гомозиготных по локусу Б2

- А типа в рецепторах к дофамину).

5. Показано развитие фокальной эпилепсии при одностороннем введении кобальта во фронтальный отдел неокортекса мозга кролика с формированием на третьи сутки зеркального эпилептического очага в коре противоположного полушария. На данной модели выявлено противосудорожное действие ТРГ при интраназальном введении кролику в дозах 10-9М и 10-12М. Преимущественнно действие

оказывается на зеркальный очаг и процессы межполушарной генерализации эпилептической активности.

6. Внутривенное введение ТРГ в больших дозах (25 мкг/кг) кроликам с сформированной фокальной эпилепсией усиливает судорожную активность в неокортексе.

С1ГИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гончаров ОБ, Ретинская ОМ. и др,, Противосудоржная защита мозга нейропептидами и поликарбоновыми кислотами .М «Ломоносов - 2000» тезисы, МГУ . 2000 с.

2. Chepumov S.A., Jin Kyu-Park, van Luijtelaar E.L.J.M, Chepurnova N.E., Goncharov O.B., Sergeev V.I., Tolamacheva E.A Antiepileptical properties of ginsenozides from Korean Red Ginseng and ginseng cell cultures (dan25) // In: The Plant Resources Society of Korea. The 7th Intern. Symp. "Preceding of Intematioonal Symposium for the Development of Medical Plants." Cultural Center Inje-Kun. Korea. October, 27-29,2000. P. 116-122.

3. Chepurnov S.A., Park Лп-Kyu, van Luijtelaar E.L.J.M, Chepurnova N.E., Strogov S.E. Mikhaylova O.M., Artukhova M.V., Berdiev R.K., Goncharov O.B., Sergeev V.I., Tolamacheva E.A. Antiepileptical properties of ginsenozides from Korean Red Ginseng and ginseng cell cultures (dan25) // Abstracts of The 7th Intern. Symp. for the Development of Medical Plants. The Plant Resources Society of Korea. Inje-Si. October 27-29, 2000. P. 18.

4. Чепурнов С,А,,Чепурнова H.E., Аббасова K.P, Гончаров ОБ Нейропептид тиролиберин - эндогенная противосудорожная защита мозга // Успехи физиологических наук. 2002. Т. 33. № 1. С. 29-39.

5. Chepurnov S.A , Jin-Kyu Park, Chepurnova N Е, Abbasova К R, Berdiev RK, Goncharov O.B., Tolmacheva E.A., Pereversev M.O., Strogov S.E. Ginseng in the mechanisms of brain ecxcitability regulation - The way for progress. // Advances in Ginseng Research (Ed. Nam-In Baek). 2002. P. 84-95.

6. Аишарин ИП, Чепурнова H.E., Чепурнов C.A., Инюшкин А.Н., Гончаров О Б. Нейропептид тиролиберин - эндогенная защита мозга в ультра малых дозах и концентрациях // 3-й Международный симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз». Москва. 3-5 декабря, 2002. М. 2002. С. 7.

7. Ашмарин И.П., Асанова Л.М., Чепурнова НЕ, Аббасова К.Р., Коссова Г.В., Гончаров О.Б., Чепурнов С.А. Интраназальная аппликация тиролиберина как способ регулирования судорожной активности мозга // Научная конференция "Опыт интеграции научных исследований НИИ-ВУЗ-клиника". 21-22 ноября 2002г. НИИ НФ РАМН, Москва.

8. Ашмарин ИП, Асанова JI.M., Аббасова К.Р, Чепурнова Н.Е, Коссова ГВ, Чепурнов С А., Инюшкин А.Н., Гончаров ОБ Нейропептид тиролиберин - противосудорожная защита мозга в сверх малых дозах //Радиоционная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43. С. 324-327.

9. Ашмарин И.П., Чепурнова Н.Е., Аббасова К.Р., Лелекова Т.В., Гончаров О.Б, Чепурнов С.А. Полифункциональность тиролиберина: физиология-неврология-психиатрия // Всероссийская конференция с международным участием "Нейроэндокринология 2003". Санкт-Петербург. 23-25 сентября 2003. С. 10-13.

10. Redkozubova О.А., Goncharov О.В., Abbasova K.R., Chepurnova N. E., Chepurnov S.A. Thyroliberin intranasal application in rats with Lithium-pilocarpine epileptical status // European Neuropeptide Club 15-th Annual Meeting Riga, Latvia May 19-21 2005, P. 78.

11. Chepurnova N.E., De Curtis M., Uva L., Chepurnov S.A., Redkozubova OM, Goncharov O.B Status epilepticus in rat and Guinea pig (lithium-pilocarpine and PTZ models //26 Intern..Epilepsy Congress. Paris. 28 August - 1 September 2005. (abs. PI 186) // Epilepsia. Vol. 46. Suppl. 6. P. 364.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность за направление моего научного пути и поддержку исследований зав кафедры академику И.П.Ашмарину, зав кафедрой физиологии ВНД проф. В.В.Шульговскому, проф. Н.А.Тушмаловой.

Благодарю к.б.н. К.Р. Аббасову за помощь в работе и Александра Суворова за сотрудничество.

THE ROLE OF THYROLIBERIN IN REGULATION OF GENERALISED AND FOCAL EXPERIMENTAL EPILEPSY Oleg B. Goncharov

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 24.11.2005 г.

í 2 5 0 43

РНБ Русский фонд

2006-4 28994

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гончаров, Олег Борисович

Введение

Обзор литературы

Этиология и формы заболевания

Медиаторные системы, вовлеченные в патогенез эпилепсии

Экспериментальная эпилепсия

Генетические модели эпилепсии у животных

Основные направления в лечении эпилепсии

Роль нейропептидов в развитии и торможении судорожной активности

Тиролиберин - эндогенный антиконвульсант

О физиологических регуляциях в ультра малых дозах

Материалы и методы исследования

Эксперименты на крысах с пентилентетразоловой моделью судорог

Электрофизиологические исследования судорожной активности 70 Модель формирования эпилептического очага, вызываемого металлическим кобальтом

Полученные результаты и их обсуждение

Часть I

Тиролиберин в регуляции генерализованной судорожной активности у крыс 75 Противосудорожные эффекты тиролиберина в ультрамалых дозах при его интраназальном

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль тиролиберина в регуляции генерализованной и фокальной экспериментальной эпилепсии"

Электрофизиологические доказательства противосудорожного действия ТРГ 76

Облегчение судорожных припадков при увеличении дозы ТРГ 77

Противосудорожные эффекты дипептида His-ProNH2 метаболита ТРГ 78

Противосудорожные эффекты синтетического аналога тиролиберина PR-546 81

Пороговые ответы на системное введение ПТЗ у крыс линии Wag/Rij 83

Часть II 87

Тиролиберин в регуляции фокальной эпилепсии у кроликов 87

Модель формирования первичного и зеркального эпилептических очагов 87

Обработка ЭЭГ 90

Тормозное влияние ТРГ в ультрамалых дозах при интраназальном введении 98

Стимулирующее влияние ТРГ, вводимого внутривенно в больших дозах 104

Заключение 109

Выводы 115

Благодарности 117

Список использованной литературы

118

ВВЕДЕНИЕ

Нейрофизиологические и психофизиологические особенности деятельности мозга детей и взрослых при эпилепсии широко исследуются с применением междисциплинарных научных методов и, в том числе, на животных. Фундаментальное значение исследований в этой области важно для понимания механизмов нарушения высших психических функций: внимания, памяти, мышления и интеллектуальной деятельности, эмоционально-личностной сферы у больных эпилепсией. Убедительно показана связь этих нарушений с клиническими проявлениями различных патологий мозга, нейродегенеративными процессами; вместе с тем, еще недостаточно изучены нейрохимические механизмы эпилептогенеза, роль нейропептидов в эпилептогенезе и в предотвращении генерализации судорог.

Нейропептид тиролиберин [L-pyroglutamil-L-histidil-L-prolinamide] (ТРГ) широко распространен в ЦНС и участвует в регуляции высшей нервной деятельности в восходящем ряду млекопитающих (Т.Н.Соллертинская,1990). Его внеэндокринные, центральные эффекты заключаются в активирующем действии, усилении, эмоциональных реакций, ТРГ считают эндогенным антидепрессантом - панактивином. В работах, выполненных на кафедре физиологии человека и животных МГУ под руководством академика И.П.Ашмарина (С.А.Чепурновым, Н.Е.Чепурновой, Р.К.Аббасовой, Т.В.Лелековой, А.А.Гусевой, А.А.Мартьяновым, Н.П.Кабановой, П.Чандра Силапагари), а также в сотрудничестве с проф. А.Н.Инюшкиным (Самарский ГУ) и проф. И.Г.Власовой (РУДН), был всесторонне изучен спектр физиологических функций ТРГ. ТРГ оказывает стимулирующее действие на дыхательные 'рефлексы и нейроны дыхательного центра; стимулирует в ультрамалых дозах сократительную способность лимфатических сосудов. ТРГ повышает устойчивость к гипобарической гипоксии. ТРГ нормализует мозговое кровообращение и повышает парциальное давление кислорода в крови новорожденных недоношенных детей, его i.v. введение оказывает положительное действие в реанимации новорожденных. Эффекты ТРГ реализуются в нервной системе через специфические рецепторы (Laakkonen, Guarneri, Osman 1996; Huang, Osman, Gershengorn, 2005), а также определяются согласно концепции И.П.Ашмарина его ролью в «физиологическом континууме регуляторных пептидов». И.П.Ашмариным, Л.М.Асановой и др. (1995) было впервые показано, что противосудорожнЬш эффект наблюдается в клинике детской эпилепсии и определяется дозой ТРГ и способом его введения. Именно применение ТРГ в ультрамалых дозах при локальном интраназальном введении оказывает противосудорожное действие. Физико-химический и нейрохимический механизмы этого явления изучены Е.Б.Бурлаковой, ЬГВ.Пальминой и др. (2003, 2005), показавших, что модификация структуры биологических мембран является одним из механизмов его противосудорожного действия (Пальмина, Жерновков, 2005).

В нашей работе проведено исследование влияния ТРГ и его метаболита на t судорожную активность у крыс при аппликации на слизистую носа в ультрамалых дозах и концентрациях. Поскольку проникновение ТРГ из крови в мозг ограничивается отсутствием транспортных систем в ГЭБ и наличием энзимов расщепления ТРГ в плазме (Zlokovich, Segal et al., 1985), концентрация ТРГ в ликворе стабильна. Это определяется I также отсутствием или неактивностыб в ней ферментов деградации, процессами секреции ТРГ в ликвор ТРГ-ергическими нейронами, прилежащими к желудочкам мозга. Прямое поступление ТРГ через слизистую в ликвор обеспечивает его более быстрое и эффективное действие на мозг. Эффективность такого введения доказана с помощью изотопного метода (Аббасова, 1997). Противосудорожное действие ТРГ было открыто с применением экспериментальных судорог, вызываемых пентилентетразолом, тогда как ряд клинических форм имеют другую природу эпилептогенеза.

Модель возникновения зеркальных эпилептических очагов остается актуальной для изучения фокальной эпилепсии. В частности, очаг, создаваемый кобальтом (по методу

Mutani et al., 1973), является адекватной моделью для изучения кортикальных и подкорковых зеркальных очагов у человека, как это впервые было показано Э.С.Толмасской, • Л.Н.Неробковой и В.Ю.Щеблановым (1980). В новой форме моделирования кобальтового очага в коре разработано проф. Т.А.Ворониной в НИИ Фармакологии РАМН (Воронина и сотр, 1990, Неробкова, Воронина и др., 1986) и включено в обязательный список тестов проверки противосудорожных препаратов. На кафедре физиологии человека и животных в МГУ Чепурновым С.А. Чепурновой Н.Е. (1980) и их аспирантом Маджид Басиром Шейхом зеркальные очаги были впервые изучены в ядрах миндалевидного комплекса (см. схему эксперимента на рисунке). Существенным открытием было формирование зеркальных очагов дифференцированно -независимо в разных ядрах миндалины, причем ведущими были ядра кортико-медиального отдела. Это становится понятным после описания морфологами (Л.Б.Калимуллиной -у I крысы, Ю.А.Мухиной - у кошки) кортикального ядра как структуры коркового типа (цит. по Чепурнов, Чепурнова, 1980; Акмаев, Калимуллина, 1982). Что же моделируется экспериментаторами при очаговой эпилепсии?

Известный американский нейрохирург Т. Бэбб, опираясь на опыт развития I эпилептической терминологии определяет фокус как "наличие макроструктурных нарушений ткани мозга" [Babb T.L. в книге: G.Pawlik, H.Stefan - Eds., "Focus Localization" 1996, 439 p.] Возможно, что понятие припадок ("epileptical fits") возникло из понятия локального ответа пораженного мозга ("focus"). Именно Хугелин Джексон писал отчетливо, что "фокальные поражения мозга" ведут к проявлению "фокальных припадков", еще более отчетливо это сформулировано Пенфильдом (Penfield, Erikson, 1941), который предложил нейрохирургическое лечение фокальной эпилепсии удалением видимого пораженного участка коры - как источника пароксизмальной активности (в том числе опухолей мозга).

Исследование кобальтового очага (зачернение в правой миндалине). Вверху -Представлена схема объемного изображения нервных связей миндалевидного комплекса мозга кролика обеих полушарий. Внизу - формирование зеркального кобальтового очага в переднем амигдалоидном поле. (Из: Чепурнов, Чепурнова, 1980)

Hips -v-^-'L

Рис. 36. Формирование зеркального эпилептического очага в кон-тралатеральной миндалине при расположении первичного кобальтового очага в AAA. Внизу — активность со спонтанными эпилептическими разрядами: 7 — 5й день после введения кобальта до пересечения связей; 2 — 18-й день после введения кобальта и 13-й день после пересечения СА, ST, VAF (показано на рис. 34). Калибровка: 100 мкВ, 1 с. Вверху — серия фронтальных срезов мозга кролика с локализацией первичного кобальтового очага в миндалине, смещенного в AAA.

Щресечепы СА, ST, VAF.

К генерализованной эпилепсии «относят те случаи, при которых клинические и электрофизиологические методы не позволяют выявить какой либо локальный источник эпилептических разрядов» (Зенков, 1996, с 143). Фокальные эпилептические приступы без потери сознания характеризуются ограниченной областью эпилептиформных разрядов на ЭЭГ, соответствующих клиническим проявлениям припадка (Зенков, 1996 с. 141). Вместе с тем, отмечается «нестрогость» и относительность разграничения эпилептических приступов, несмотря на исключительную важность их определения для диагностики. Однако, известно также, что «при одних и тех же локализациях патологического фокуса возможно проявление различных эпилептических феноменов, а одинаковые эпилептические проявления могут наблюдаться при разных локализациях фокуса.

Эксперимент на животных ~ стереотаксически точное повреждение группы нейронов и создание локального поражения в коре или подкорковых структур создает возможности более строго исследовать закономерности в формировнии эпилептической активности, а именно: в повреждаемом (первичном) очаге, и процесс генерализации активности в другие структуры, то есть - формирование зеркального очага.

Обзор литературы показал, что' разработка экспериментальных моделей представляется актуальной, как с точки зрения выяснения клеточных и молекулярных механизмов формирования и торможения эпилептической активности, так и с точки зрения проверки эффективности новых лекарственных противосудорожных средств, разрабатываемых фармокологами и нейрохимиками. В настоящее время основные лекарственные средства создаются благодаря современному пониманию механизмов действия медиаторов центральной нервной системы, тогда как применение естественных регуляторов нейропептидной природы и их синтетических аналогов может стать основой разработки лекарств нового поколения.

Цель исследования: выяснение роли тиролиберина в регуляции генерализованной, вызываемой хемоконвульсантами, и фокальной, вызываемой кобальтом, судорожной активности коры головного мозга. ■

Для выполнения этой цели решались следующие задачи:

• сравнить эффекты ТРГ с действием дипептида гистидин-пролина, который является естесственным метаболитом ТРГ, а также с действием синтетического аналога ТРГ -PR-546, не обладающего эндокринным действием;

• исследовать модель фокальной эпилепсии, создаваемой введением порошка металлического кобальта в соматосеНсорную кору кролика;

• на модели пентилентетразоловых судорог исследовать изменение чувствительности и судорожной активности у гомозиготных крыс линии WAG/Rij ( по локусу D2.Tagl - А типа).

- ■ — обладают. Впервые показано, что эффекты интраназального введения ТРГ у кролика с фокальной эпилепсией имеют дозозависимый характер: противосудорожным эффектом

11 1 "У обладает ТРГ в дозах 10" М и 10" М. Показано, что при внутривенном введении (по протоколу, рекомендованному в детской клинической эпилептологии) ТРГ оказывает сильное проэпилептическое действие как на первичный, так и на вторичный очаги на модели кобальтовой эпилепсии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции аспирантов и молодых ученых МГУ «Ломоносов-2000» (Москва), на 3-м Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» 2002 (Москва), научной конференции «Опыт интеграции научных исследований НИИ-ВУЗ-клиники 2002 (Москва), Всероссийской конференции с международным участием «Нейроэндокринология - 2003» (Санкт-Петербург), 15-ом Съезде Европейского Нейропептидного Клуба 2005 (Рига, Латвия), 26-ом Конгрессе по Эпилепсии, Международной Лиги против Эпилепсии, 2005 (Париж Франция).

Публикации По теме диссертационной работы опубликовано 11 научных работ статей - 3, тезисов - 8).

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 96-04-50331 и № 00-04i

48809.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Этиология и формы эпилепсии

Эпилептический приступ — это расстройство мозга, вызванное чрезмерной электрической активностью нервных клеток. Существует более тридцати видов эпилептических припадков и еще больше видов эпилепсии, так как возможны различные комбинации припадков. Человек, страдающий эпилепсией обычно подвержен одному виду эпилепсии и имеет от одного до трех видов припадков.

Слово эпилепсия имеет греческое происхождение и означает «быть схваченным» В древности заболевание также называлось «morbus sacer», то есть «священная болезнь», что придавало ему особенное положение, которое в некоторой степени остается за ним и сегодня. Эпилепсию можно описать следующим образом: человек внезапно вскрикивает, теряет сознание, вся его мускулатура напрягается и он падает, после этого мышцы рук и t ног сокращаются, затем в результате истощения человек впадает в некоторое подобие сна. Позже он может пожаловаться на необыкновенную усталость, головную боль, головокружение и боль в мышцах. Иногда происходит непроизвольное мочеиспускание.

Такое описание довольно точно отражает часто встречающуюся форму эпилептического t припадка (так называемый grand mal - генерализованные тонико-клонические судороги).

Эпилептический приступ может иметь различные проявления. Он может происходить и без крика и потери сознания, без мышечного напряжения, без прикусывания языка, без падения, без синюшности. Приступ может быть настолько «безобидным», что ни сам больной, ни человек, который его в это время видит (если он не эксперт) не узнают в этом эпилептический приступ. Единственным признаком эпилептического припадка в этом случае может быть кратковременная (5-10 с.) потеря внимания или быстрое подергивание руки.

Отражающее действительность и более общее для всех видов эпилептических припадков определение может звучать следующим образом: эпилептический приступ - это довольно быстрое внезапное изменение сознания, мышления, поведения, памяти, чувств и ощущений, или напряжение. мускулатуры, вызванное временным нарушением функционального состояния нервных клеток мозга в форме повышающейся и возвращающейся к норме электрической активности. Кратко можно определить эпилептический приступ т.о.: это проявление временного функционального нарушения состояния нервных клеток, при котором эффекты зависят от того, какую функцию эти клетки в норме выполняют. Каждая нервная клетка или группа нервных клеток может стать «эпилептической», что приведет^ к нарушению или прекращению нормальной функции мозга.

Выражение «эпилептический приступ» является общим названием, под которым могут пониматься различные нарушения. Не каждый приступ «эпилептического i характера» является эпилепсией. Например, почти каждый человек при определенных обстоятельствах (таких как развитие воспаления мозга, серьезное ранение в голову, недостаточное снабжение мозга кислородом, или передозировка некоторых медикаментов) может пережить судорожный приступ. И даже если такое состояние будет длительным или I если будут возникать повторные припадки, мы не можем однозначно сказать, что у этих людей есть эпилепсия.

Судорожные припадки признаются эпилепсией только в том случае, если произошло по меньшей мере два судорожных припадка, у которых не было явной непосредственной t причины, то есть они произошли спонтанно. При этом не исключаются другие изменения в мозге, которые могут быть причиной припадков (родовые травмы или перенесенные ранее ранения).

Итак эпилепсия - полиэтиологическое заболевание, обусловленное поражением головного мозга, характеризующееся повторными судорожными и/или другими припадками и нередко влияющее на психоэмоциональное состояние человека.

Эпилепсия является одним из наиболее распространенных проявлений патологии нервной системы. По имеющимся данным 2-4% всего населения страдают этим недугом, причем более чем у 50% больных первый приступ возникает до 20-летнего возраста. Возраст больного во время первого припадка часто связан с этиологией заболевания (Гусев, Бурд, 1994; Отчет ВОЗ о здоровье мира, 2004).

До настоящего времени остается невыясненным вопрос о генетической обусловленности эпилепсии, эти вопросы будут рассмотрены нами ниже.

В течение долгого времени было принято разделение эпилепсии на генуинную (идеопатическую) и симптоматическую. Предполагалось, что в первом случае, отсутствует явное органическое поражение головного мозга. Однако по мере исследования этого заболевания и развития новых современных методов диагностики число форм заболевания с невыясненной этиологией снижалось. Поэтому в настоящее время такое разделение практически не употребляется. Следует отметить, что значение наследственного фактора неоднозначно для проявления эпилепсии в разные возрастные периоды. Однако роль и характер органических поражений мозга также неодинаковы для различных возрастно-зависимых форм.

К основным причинам поражения мозга по Карлову (1990), ведущим к развитию эпилепсии, относят: в пренатальный период: 1. инфекции, чаще вирусные (цитомегаловирус, краснуха); 2. паразитарные заболевания (токсоплазмоз); 3. токсемия и другие формы аномально протекающей беременности; 4. неизвестные факторы, вызывающие мозговые мальформации или деструкции мозга; 5. нарушения питания; в перинатальный период: 1. физическая травма; 2. интрародовая аноксия; 3. постнатальная аноксия; 4. неонатальные метаболические нарушения; 5. неонатальные инфекции. в постнатальный период: 1. инфекции; 2. травмы; 3. метаболические расстройства (дегидратация и др.); 4. токсические факторы; 5. тяжелые и пролонгированные судороги различного происхождения; 6. нарушения мозгового кровообращения; 7. опухоли мозга (Карлов В. А., 1990).

Учитывая обширную группу факторов риска возникновения эпилепсии, выдающийся отечественный невролог С.Н.Давиденков в 1947 г. сформулировал унитарную концепцию эпилепсии, согласно которой происхождение заболевания объясняется взаимодействием генетических и средовых факторов. Риск заболевания эпилепсией для родственников больных эпилепсией превышает общепопуляционный в 2-8 раз. Генетические исследования эпилепсии привели к выводу о том, что при большинстве форм эпилепсии речь идет о повышенном наследовании ( цит. по: Чепурнов, Чепурнова, 1997).

По возможности определить очаг пароксизмальной активности эпилептические припадки разделяются на генерализованные и фокальные. В первом случае во время приступа невозможно выделить локализованный очаг судорожной активности. Во втором случае электрофизиологические проявления припадка ограничиваются локальными участками мозга, а клинические связаны с нарушениями функций (сокращения отдельных мышц или групп мышц, вегетативные расстройства, некоторые психические нарушения). Генерализованные припадки могут протекать в форме судорожно-генерализованных (большой приступ - grand mal) и абсансов (малых припадков - petit mal). Первые характеризуются кратковременными (десятки секунд) сокращениями мышц всего тела, сопровождаются потерей сознания, длящейся до получаса. При частых повторениях таких приступов развивается эпистатус. Малые "припадки сопровождаются кратковременными потерями сознания до нескольких секунд, клоническими подергиваниями мышц или снижением их тонуса, сосудистыми и вегетативными нарушениями (урежение дыхания, брадикардия, расширение зрачков). Эти пароксизмы могут возникать более 100 раз в сутки.

По другой классификации, основанной как на внешних признаках, так и на электроэнцефалографических феноменах, также различают конвульсивные (большие -grand mal) и неконвульсивные (малые - petite mal) припадки.

Для малых припадков типа абсанс характерна специфическая электрическая «пик-волновая» активность с частотой комплексов 3 в секунду. Однако такого рода активность можно зарегистрировать у пациентов и между приступами в интериктальный период. Большой тонико-клонический приступ обычно начинается десинхронизацией ЭЭГ, высокой частотой колебаний до 20-40 в секунду при низкой амплитуде пиков, частота постепенно снижается до 10 в секунду, а амплитуда возрастает. В дальнейшем происходит урежение ритма, переходящего в дельта- или тета-диапазон. После приступа в течение некоторого времени наблюдается снижение амплитуды колебаний на ЭЭГ. В интериктальный период у больных могут наблюдаться разряды различных типов: острые пики, медленные волны, возникающие ритмически или спорадически (Binnie, Stefan, 1999, Зенков 1996,2003).

Медиаторные системы.мозга, вовлеченные в патогенез эпилепсии t

Причины патологии при эпилепсии кррются в нарушении деятельности тормозных и возбуждающих механизмов мозга. На нейрохимическом уровне в первую очередь следует учитывать соотношение между тормозными и возбуждающими медиаторами. Считается, что избыточность возбуждающих нейромедиаторов, таких как аспартат и глутамат, является пусковым механизмом в развитии судорожного grand mal припадка. В литературе принято выделять два подтипа глутаматных рецепторов: NMDA- и не-ЫМБА-рецепторы. NMDA-рецепторы локализованы главным образом в кортикальных структурах, базальных ганглиях и сенсорно-ассоциативных системах, наивысшая их плотность обнаружена в гиппокампе. Рецептор NMDA помимо участков взаимодействия с нейромедиатором имеет участки связывания: 1. глицина; 2. фенциклидина и его родственных соединений; 3. потенциал зависимый К<^+2-связывающий участок; 4. тормозный участок связывания двухвалентных катионов; 5. участки связывания барбитуратов. Именно барбитураты, которые тормозят функции рецепторов и оказывают противосудорожное действие, активно применяются в клинической медицине для лечения эпилепсии. К не-ЫМОА-рецепторам относят рецепторы АМРА и каиновой кислоты, сходные по своим физико-химическим свойствам и относящиеся к так называемым «медленным рецепторам» метаботропного типа. Глутамат, при его внутрицеребральном введении в определенные зоны мозга может вызывать приступы судорог. Однако каиновая и квискваловая кислоты (мощные агонисты глутаматных рецепторов) оказались особо мощными индукторами судорог, способными специфически разрушать нейроны, несущие глутаматные рецепторы (Ашмарин И.П. и др., 1996.). Дополнительным фактом в поддержку гипотезы о нарушениях функций глутаматергической системы при эпилепсии служит обнаружение в плазме крови пациентов значительно повышенного уровня антител к белкам глутаматного рецептора, что используется в диагностике скрытых форм заболевания. Подобное явление отражает снижение функций гематоэнцефалического барьера при развитии эпилепсии, сопровождающееся выходом в периферический кровоток определенных количеств белков-рецепторов и их фрагментов, и, далее, образования антител к ним. Возможно, что сам патогенез эпилепсии подобен патогенезу аутоиммунных заболеваний, при которых аутоантитела к белкам мозга служат основным повреждающим фактором.

Глутаминовая система занимает в обменных процессах мозга ключевую позицию. Она тесно связана с функцией тканевого дыхания, так как в цикле Кребса глутаминовая кислота образуется из а-кетоглутаровой при воздействии глутаминтрансаминазы. В свою очередь глутаминовая кислота способна к ряду превращений, в том числе в ГАМК, которая играет в коре мозга роль универсального тормозного медиатора и, в свою очередь, возвращается в цикл Кребса в виде сукцинированного полуальдегида янтарной кислоты. Глутаминовый обмен тесно связан с обменом АТФ (глутамат и АТФ принимают участие в синтезе глутамина). Глутаминовая система вырабатывает важные для мозговой ткани медиаторы: ГАМК (глутаминовая кислота - прекурс ГАМК) и глутамат, который образуется при трансаминировании ГАМК.

Глутамат играет роль возбуждающего медиатора. Глутаминовая кислота принимает участие в транспорте ионов калия: способствует их удержанию во внутриклеточных пространствах, а следовательно," содействует поляризации. Таким образом, видно, что нарушения в глутаминовой системе ведут к многообразным расстройствам. Есть прямые доказательства возможной роли глутамата в механизме запуска эпилептических припадков.

Отмечено увеличение содержания этого вещества в целом мозге в преконвульсивной фазе приступа. С другой стороны, низкое содержание глутамата в эпилептическом очаге может быть объяснено теорией "утечки": происходит увеличение скорости перехода глутамата в экстрацеллюлярное пространство, а затем быстрая его метаболизация. Согласно этой концепции низкое содержание ГАМК в очаге есть следствие уменьшения концентрации глутамата. Возбуждение вызывается глутаматом, высвобождение которого не нарушено и превалирует над ГАМК торможением, если образование ГАМК снижено.

Глутаминовая система оказывает влияние на обмен ацетилхолина (АХ). Для своего накопления в неактивной форме АХ нуждается в присутствии глутаминовой кислоты, ионов К+ и Mg2+. Роль АХ в патогенезе эпилепсии обсуждается довольно давно. АХ вызывает деполяризацию пирамидных клеток. Холинергические нейроны имеются в подкорковых структурах, мозговом стволе. Значительная часть корковых интернейронов и ретикуло-кортикальных нейронов являются холинергическими. Применение ингибиторов холинэстеразы часто сопровождается возникновением судорожных эпилептических припадков. Имеются данные о прямом влиянии ингибиторов холинэстеразы на эпилептическую активность (Meldrum, 1982). У больных эпилепсией установлено значительное повышение уровня сывороточной холинэстеразы (Н.Г.Сергиенко и др., 1979). В многочисленных экспериментальных исследованиях в мозговой ткани животных после судорог, вызванных различными факторами (инъекциями амидопирина, электрошока, аудиогенная стимуляция), установлено значительное повышение активности холинэстеразы. Высказывается предположение, что основную роль в механизме повышения эпилептической возбудимости играет нарушение соотношения между катехоламинами и ацетихолином (Поздеев, 1991). Это согласуется с данными о создании каиновой модели экспериментальной височной эпилепсии, при которой в гиппокампе возникают патоморфологические изменения, сходные с таковыми у человека. Каиновая кислота вызывает значительное увеличение содержания АХ и уменьшение содержания норадреналина. Одновременно понижается активность глутаматкарбоксилазы и уменьшается обратный захват глутаминовой кислоты, что сопровождается возрастанием активности нейромедиатора возбуждения глутамата и ослаблением ГАМК-ергической передачи с возникновением эпилептических судорог.

С глутаминовой системой связан обмен гистамина и гистидина. Гистидин -предшественник глутамата, важный элемент глутаминовой системы. Он превращается в гистамин. Гистамин же обладает нейротрансмиттерной функцией. Обнаружено увеличение содержания гистамина в крови больных эпилепсией и в цереброспинальной жидкости, особенно при височной эпилепсии. Также привлекает внимание возможное участие глицина в эпилептогенезе. Он, как й ГАМК, ингибирует активность нейронов на всех уровнях ЦНС, особенно в спинном мозге и мозговом стволе. Существует предположение, что глицин, как и таурин, тормозит пароксизмальное возбуждение. Помимо ингибиторного воздействия, глицин может оказывать влияние на нейрональную активность путем тесной связи с обменом глутамина, поскольку он ингибирует глутаминсинтетазу. Снижение уровня глутамина во время эпилептического пароксизма объясняется именно этим.

Вызывает также интерес состояние серотонинергической системы при эпилепсии.

Повышение ее активности может вызывать противосудорожный эффект (Поздеев, 1981).

Стимуляция ядер шва блокирует, а его разрушение облегчает киндлинг (Wada, 1982).

Положительное влияние L-ДОФА при эпилепсии связано с воздействием на серотонинергическую систему. Если при экспериментальной эпилепсии обнаружено угнетение серотонинергической передачи, то в исследованиях на человеке получены неоднозначные данные. t

Большинство авторов отмечают снижение серотонинового обмена при эпилепсии. В ряде исследований обращается внимание на участие в патофизиологических механизмах цАМФ и цГМФ, - их содержание, в спинномозговой жидкости у больных увеличено.

Учитывая, что циклические нуклеотиды не проникают через гематоэнцефалический t барьер, можно предположить, что повышается активность ферментов мозга, образующих цАМФ и цГМФ. Отмечено и локальное увеличение содержания цАМФ в эпилептическом очаге. Уровень цГМФ в мозге повышается во время эпилептических разрядов и коррелирует со степенью пароксизмальной активности, а уровень цГМФ в мозге находится в обратной зависимости от степени эпилептической активности, и содержание его в мозге повышается, главным образом, после эпилептического припадка. Предполагается, что цГМФ вовлекается в развитие и поддержание припадков, а цАМФ - в их подавление (Ferrendelli, 1983). Есть работы, где изменение содержания цАМФ и цГМФ рассматривается в связи с нарушением синаптической передачи.

Нарушение моноаминергической передачи ведет к увеличению чувствительности соответствующих рецепторов к моноаминам. В механизме этого явления важна роль цАМФ (Dely, 1974). С другой стороны, цГМФ приписывается существенное значение в регуляции системы глутамат-ГАМК, при этом воздействие осуществляется через ацетилхолиновые М-рецепторы.

При прямом действии медиаторов, их агоиистов или антагонистов или торможении ферментов обмена медиаторов при систематическом их введении, трудно представить, какое огромное число нервных клеток и нервных цепей подвергается воздействию. Но первоначально эпилептическая активность появляется только в определенных областях мозга (звеньях нервных цепей, например в миндалине, или гиппокампе), которые структурно и нейрохимически предрасположены к судорожной активности и имеют низкий судорожный порог. При этом до или незвисимо от эпилептических разрядов, по мнению K.Gale (1995), происходит большое число иных событий: например, после введения каиновой кислоты — выделение глутамата из нервных окончаний, экспрессия c-fos гена, индукция нейротрофического фактора, повышение утилизации глюкозы, стимуляция термогенеза, активация симпатической нервной системы. Какие их них прямо ведут к эпилептогенезу, а какие являются следствием распространения и генерализации судорожной активностится, должно быть предметом специального исследования.

Основная система, с которой связано блокирование судорожного состояниями

ГАМК-ергическая. Тормозные функции ГАМК-ергической системы носят универсальный, менее специфический характер, чем функции возбуждающих нейромедиаторных систем. Доля ГАМК-ергических терминалей в мозге является наибольшей. Снижение судорожной готовности и облегчение судорожных приступов наблюдается при центральном введении I

ГАМК, а также при периферическом введении его аналогов, способных проходить через гематоэнцефалический барьер. Таков же эффект соединений (ставших лекарственными противосудорожными средствами), тормозящих распад, стимулирующих синтез и обратный захват ГАМК: вальпроата натрия, прогабида. На рецепторах ГАМК обнаружен барбитурат-связывающий участок. В отличие от аналогичного участка на глутаматных рецепторах барбитураты усиливают эффект основного нейромедиатора (И.П.Ашмарин и др., 1996).

Несмотря на то, что ГАМК имеет структурное сходство с глутаматом и является его производным, эта кислота обладает противоположным нейрофизиологическим действием. Различают 2 типа ГАМК рецепторов: бикукулин-чувствительные (ГАМКа) и баклофен-чувствительные (ГАМКб). Обнаружено, что ГАМКа рецепторы являются быстродействующими, они сопряжены с ионными каналами для СГ и чувствительны к антагонисту пикротоксину. Подобно рецепторам глутамата ГАМКа - рецепторные I комплексы содержат специфические участки связывания не только самой ГАМК, но и других физиологически активных соединений, например, бензодиазепинов (БДЗ). БДЗ занимают особое место среди лекарственных веществ в связи с их широким лечебным спектром действия: противосудорожного, снотворного, нейротропного, анксиолитического и др. Установлено, что участок связывания бензодиазепинов взаимодействует также с эндогенными пептидными регуляторами - эндозепинами, которые обладают физиологическими эффектами, противоположными БДЗ, - вызывают возбуждение, тревожность и проконфликтное поведение животных. Они подавляют открытие канала для С1", индуцируемое ГАМК, т.е. являются эндогенными функциональными антагонистами (Дамбинова С.А., Каменская М.А., 1996 - в книге «Нейрохимия», И.П.Ашмарин и др.,). ГАМКб - рецепторы (преимущественно пресинаптические, повышающие проницаемость для К+) оказались вовлечены в особый тип припадков — абсансы, сопровождающиеся гиперсинхронизацией разрядов таламокортикальных нейронов. Участие ГАМКб рецепторов в формировании длительных синхронных ТПСП таламических нейронов было доказано сравнительно недавно. Дополнительным подтверждением послужило то, что антагонист ГАМКб рецептора CGP 35348 смягчает, вызванные с помощью ПТЗ, полиспайки. На рецепторах ГАМК, как и на глутаматных, обнаружен участок, связывающий барбитураты, но не ослабляющий, а усиливающий эффект основного медиатора. Таким образом, барбитураты могут проявлять противосудорожный эффект двумя путями: подавляя стимулирующее действие глутаматергической и усиливая тормозное действие ГАМК-ергической систем.

Следует обратить внимание на то, что избыточность возбуждающих медиаторов и недостаточность тормозных - прежде всего характерны для конвульсивной эпилепсии, характеризующейся «большими» припадками. Причиной неконвульсивной эпилепсии типа абсанс, напротив, считают избыточность ГАМК-ергической передачи (Marescaux et al., 1984; Snead, 1992; Coenen et al., 1995). Разнонаправленность механизмов возникновения больших и малых припадков подтверждается фармакологически: препараты, успешно подавляющие судороги (барбитураты, карбамазепин, тиагабин) усиливают абсансы. И наоборот, противоабсансные препараты. способны провоцировать судороги. Однако существует ряд противоречий. Абсансы, как и конвульсии успешно купируются бензодиазепинами (феназепам, диазепам, лоразепам), взаимодействующими со специфическим сайтом ГАМК-А рецепторного комплекса. Аналогично, агонисты NMDA I глутаматных рецепторов способны вызывать и моторные и абсансные приступы (Coenen et al., 1992). На сегодняшний день эти факты не удается логично объяснить.

Особую актуальность в последнее время приобрели исследования, направленные на выяснение роли оксида азота (N0), вторичного посредника в нейронах, усиление синтеза которого рассматривается как неблагоприятное и вредное для мозга условие. Известно, что именно глутаматергическая иннервация активирует работу NO-синтазы - фермента, продуцирующего N0, что приводит к развитию так называемого нейротоксического эффекта глутамата и его аналогов. В работах академика К.С.Раевского с соавт. (1996) было I показано, что содержание N0 и вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) драматически возрастает в коре мозга взрослых крыс при судорожных состояниях, вызываемых пентилентетразолом, тиосемикарбазидом, максимальным электрошоком, а также при детских фебрильных судорогах (Bashkatova et al., 1996; Stringer, Erden, 1995). Другие авторы (Przegalinski et al., 1994) рассматривают NO как эндогенный антиконвульсант, • высказывая предположение, что при интенсивной стимуляции глутаматергических синапсов через NMDA рецепторы увеличивается синтез N0 в постсинаптической зоне, хотя возможно, что пароксизмальная активность мозга сама по себе ведет к увеличению уровня N0 в мозговой ткани. N0 способен активировать гуанилатциклазу, повышая уровень цГМФ в терминалях и глии. Повышенный уровень цГМФ влияет на ионные каналы, фосфодиэстеразу, активирует цГМФ-зависимую протеинкиназу. Все эти процессы ведут к снижению уровня внутриклеточного Са2+, уменьшая возбудимость нейронов, тем самым, облегчая завершение судорожного разряда (Przegalinski et al.', 1994). Обзор данных" А.Х.Уразаева и A.JI. Зефирова (1999) позволяет сделать вьюод, что такие разнонаправленные эффекты могут быть объяснены действием N0 на какую-то одну молекулу или один' фермент, чьи модуляционные состояния и определяют изменение нейросекреции медиаторов, участвующих в формировании судорог. I

Таким образом, на нейрохимическом уровне эпилепсия - это прежде всего дисбаланс возбуждающих и тормозных механизмов. Однако, ошибочно сводить заболевание только к изменениям глутаматергической системы или ее баланса с ГАМК-ергической системой. К настоящему времени известны данные о способности met-энкефалина и р-эндорфина '"* 'л. вызывать судороги при их аппликации в некоторые участки мозга - вне зон, где они проявляют аналгетическое действие, типичное для опиоидов. Особого внимания заслуживают появляющиеся данные о роли пептидергических систем при эпилепсии.

Еще одной причиной эпилепсии можно назвать изменение энергетических процессов в нейронах, причем в тех из них, которые входят в патологические эпилептогенные структуры. Отмечены изменения метаболической структуры нейронов и их митохондрий: повышение проницаемости мембран для К+ и Na+, коррелирующее с повышением чувствительности белков мембран к протеиназам, снижение синтеза АТФ и др. Аномальные локальные изменения концентраций К+ и Na+, а также NH/, выделяющегося при эпилептическом приступе в результате усиления реакций дезаминирования, могут вызывать или облегчать деполяризацию постсинаптических зон, снижать порог возбудимости и провоцировать судорожный приступ (Ашмарин, 1997).

Всеохватывающее поражение медиаторных систем лишний раз подчеркивает сложность и комплексность патологических изменений мозга при эпилепсии. Можно с уверенностью сказать, что поиски новых аспектов взаимодействия различных систем мозга в норме и при патологии представляют огромный интерес для исследователей. I

Обнаружение вовлечения все новых медиаторных систем в патогенез эпилепсии раскрывает оригинальные пути изучения механизмов заболевания и способов его лечения.

Экспериментальная эпилепсия

Изучение эпилепсии способствует расширению и углублению представлений о нейрофизиологических механизмах деятельности мозга. Особое место в изучении эпилепсии отводится созданию экспериментальных моделей на животных, что дает возможность более глубокого и всестороннего исследования сущности эпилептического феномена, чем это возможно в условиях клиники. Пользуются самыми разнообразными

•' -.v. способами формирования эпилептического припадка у животных: травматизация спинного мозга и различных областей головного мозга, болевые и звуковые раздражения, электрическая стимуляция различных мозговых структур, гипертермия, химическая индукция и т.д. Экспериментатор старается вызвать либо один феномен судорожной реакции с целью раскрыть его нейрохимические механизмы, либо создать модель болезни - целый комплекс состояний и признаков данного фенотипа, к тому же передающихся по наследству.

Парадокс успеха экспериментальной эпилепсии состоит в том, что исследователь создает очаг с заданными свойствами и поэтому успешно его контролирует. Напротив, врач часто встречается с неопознанными по природе явлениями, среди которых пятая часть относится к неконтролируемым приступам - рефрактерной эпилепсии (Eds.-S.Iohannessen, L.Gram, M.Sillanpaa, T.Tomson, 1995).

Новые экспериментальные модели продиктованы прежде всего многообразием форм эпилепсии (нейрофизиологический субстрат идиопатической эпилепсии отличен от такового симптоматической эпилепсии и лимбической эпилепсии) и наличием определенных форм, не поддающихся лечению известными лекарственными средствами, разработанными на базе данных о нейрохимическом внеклеточном и внутриклеточном контроле активности эпилептического нейрона.

Понимание основных причин и механизмов возникновения эпилепсии тем не менее не может пока объяснить всех тонкостей и особенностей разных типов заболевания.

Приблизительно у 25 % пациентов наблюдаются устойчивые (рефрактерные) к терапии, хронические формы, неподдающиеся лечению даже с помощью новейших антиэпилептических средств. Таким образом, очевидна потребность в новых лекарственных препаратах и современных стратегиях лечения. Использование экспериментальных моделей на животных позволяет изучать механизмы устойчивости к различным препаратам, искать новые подходы в лечении. Новые модели устойчивые к классическим противосудорожным средствам должны удовлетворять ряду строгих критериев: 1. Тип экспериментальных судорог должен совпадать или быть схожим с клинической картиной аналогичного вида припадков у людей. Наиболее устойчивыми к препаратам считаются комплексные парциальные припадки и синдромы миоклонического астатического и инфантильного спазма, поэтому разработка модели этого вида припадков остается наиболее актуальной. 2. Моделированные судороги должны сопровождаться пароксизмальной активностью на ЭЭГ, что позволяет оценить действие препарата не только на внешние проявления припадков, но и на ЭЭГ манифестацию приступа. 3. Классические противосудорожные средства должны быть неэффективны или мало эффективны в отношении данной судорожной модели. 4. Модель должна позволять проводить длительные хронические наблюдения, т.е. животные должны выживать после судорожных приступов.

Выявление особенностей нейрохимической карты больного мозга, локализация очагов, определение метаболических и нейрохимических особенностей эпилептического нейрона остаются физиологической основой дальнейшего изучения эпилепсии. Но, новые модели должны соответствовать запросам клинической эпилептологии (Engel, 1996; Gale, 1995). Исследуя краткосрочные и долгосрочные изменения в тканях головного мозга, особенности регионального метаболизма и мозгового кровотока, особенности экспрессии генов, процессы аксонального спроутинга и .клеточного апоптоза, экспериментатор может составить представления о том, какие взаимосвязанные мозговые структуры или нервные сети ответственны за генез эпилептической активности (Avanzini, de Curtis, 1997; Desthexe, 1999). Клиническое значение экспериментальных моделей было рассмотрено в работах Дж.Энгеля (Engel, 1992, 1995). Следует учитывать, что имеется много форм парциальной, локальной и неокортикальной эпилепсии, и все они имеют различные механизмы возникновения и развития. При всей необходимости изучения природы этих явлений на человеке, модельные эксперименты на лабораторных животных очень важны. Конечно, параллельные исследования на больных с применением современных неинвазивных методик - томографии (обмена веществ, локализации медиаторов и рецепторов) должны проводиться, но исключительно в диагностических или лечебных целях.

Острые эксперименты позволяют изучить многообразие форм припадков, вызываемых у животных. При использовании таких моделей воспроизводится не эпилепсия, как болезнь, а эпилептический приступ,' электрофизиологическое или моторное проявление судорожной активности. Это достигается применением электрошока или введением проконвульсантов. Хронические модели имеют своей целью изучение последовательности эпилептогенеза, его долговременых последствий.

Естественно наблюдение спонтанных приступов. Оба типа моделей позволяют оценить степень и объем повреждения мозговых структур; например, мезиальный склероз гиппокампа. Так, для моделирования парциальной эпилепсии можно создать нарушения в мозге различными путями, но следует понимать, почему мозг становится в результате того или иного воздействия "эпилептическим". Только в этом случае, модель позволит решать фундаментальные вопросы эпилепсии. С другой стороны, только создание условий в мозгу животного, соответствующих условиям протекания эпилепсии у человека, делает обоснованным проведение испытаний новых противоэпилептических средств. Следует отдавать себе отчет: возможно ли моделирование «эпилептогенеза человека»? J.Engel (1995) приводит ряд спорных примеров,"из которых и возникает такое сомнение. Так, при введении локально в мозг животного ГАМК-антагонистов или ГАМК-агонистов или возбуждающих аминокислот можно вызвать судорожную активность. Но означает ли это, что у человека судорожная активность возникает всякий раз, как результат именно этих изменений? Рассмотрим этот подход подробнее. В экспериментальной эпилептологии он просматривается и в логике разработки новых лекарственных противосудорожных средств (Т.А.Воронина, 1994). Эксперименты проводят с воздействием веществ: 1) снижающих уровень ГАМК или блокирующих работу ГАМК-рецепторов; 2) имитирующих действие глутамата при взаимодействии с НМДА-рецепторами, каинатными и/или АМПА-рецепторами; 3) имитирующих действие ацетилхолина на мускариновые рецепторы.

Наиболее распространенной моделью создания генерализованных судорожных состояний являются химически индуцированные припадки. В качестве конвульсантов используют: стрихнин, тиосемикарбазид,- коразол, бикукулин, бемегрид, пикротоксин, прокаин, кокаин. По механизму действия судорожные агенты подразделяют на усиливающие процессы возбуждения, блокирующие тормозные механизмы, нарушающие энергетический метаболизм и тормозящие транспорт ионов.

В качестве модели эпилептического припадка чаще всего используют ПТЗ-тест. Пентилентетразол - ПТЗ (коразол) относится к аналептическим препаратам. Это синтетический препарат, представляющий собой спаренные тетразольное и пентаметиленовое кольца. Он стимулирует жизненные центры продолговатого мозга, особенно дыхательный, и в больших дозах оказывает мощное возбуждающее действие на кору мозга и подкорковые структуры. Впервые его проэпилептические свойства были отмечены в 1935-1936 гг. Он использовался в психиатрической практике при лечении шизофрении. В отличие от использовавшихся ранее препаратов для шоковой терапии, при действии коразола, либо во время инъекции, либо несколько секунд спустя, наступают судорожные приступы. '

Судорожное действие ПТЗ объясняется его влиянием на двигательные зоны головного мозга; помимо клонического, в коразоловых судорогах наблюдается и тетанический компонент, связанный с действием препарата на спинной мозг. При введении I

ПТЗ в перфузат, омывающий изолированные нервные клетки, наблюдаются типичные судорожные разряды нейронов. Развитие судорожной активности сопровождается ростом новых дендритов, повышением внутриклеточной концентрации кальция.

После первых инъекций ПТЗ (30-35мг/кг) у животных появляются периоды замираний, сопровождающиеся полной локомоторной неподвижностью, слабым тремором головы, нижней челюсти, жеванием, вздрагиванием мышц головы, шеи, ушей (А.А.Шандра и др., 1983). Продолжительность указанных явлений увеличивается по мере продолжения инъекций ПТЗ от 5-10 мин до нескольких часов. В коре головного мозга и подкорковых структурах в этот период регастрируются вспышки отрицательных медленных волн и пикволновых комплексов частотой от 3-5 до 8-12 кол/с. Эти электрографические проявления сходны с изменениями, которые наблюдаются после системного введения пенициллина.

В дальнейшем у крыс и мышей судорожные реакции последовательно проходят стадии клонических судорог передних и задних конечностей, всего туловища. В период появления клонических судорог передних конечностей в ЭЭГ наблюдаются генерализованные судорожные разряды частотой 3 кол/с, продолжительностью от 8 до 25 с. Увеличение частоты эпиразрядов на ЭЭГ до 6-10 кол/с сопровождается подъемом на задние лапы, потерей равновесия, падением на бок и развитием тонической экстензии задних конечностей. Появление таких генерализованных клонико-тонических судорог сопровождается непроизвольным мочеиспусканием, дефекацией, гиперсаливацией и другими вегетативными расстройствами, наблюдаемыми во время больших судорожных припадков. После окончания приступа' развивается пост-приступная депрессия, сопровождающаяся резким угнетением ЭЭГ (Крыжановский и др., 1988). Возникшая предрасположенность к судорожным припадкам в ответ на введение подпороговой дозы ПТЗ сохраняется в течении 1-6 месяцев после последней его инъекции (Graig, Colasanti, 1989). . '

Развитие эффектов ПТЗ сопровождается нарушением функции ГАМК-ергической системы, причем ПТЗ по механизму действия отличается от пикротоксина и бикукулина, которые также являются антагонистами ГАМК. ПТЗ способен взаимодействовать с двумя подклассами бензодиазепиновых рецепторов. Высказано предположение, что первый тип бензодиазепиновых рецепторов участвует в противосудорожном и анксиолитическом действии бензодиазепинов, тогда как второй тип рецепторов обеспечивает седативное действие и атаксию. Можно предположить, что судорожное действие ПТЗ связано с его конкурентным взаимодействием с бензодиазепиновыми рецепторами первого типа.

Системное введение ПТЗ или каких-либо других судорожных агентов приводит, как правило, к генерализованным судорожным припадкам. Тем не менее, и в этом случае было " *М9 показано формирование в мозге так называемой патологической детерминанты, с которой связано дальнейшее развитие всей эпилептической системы, вызывающей синдром генерализованной эпилептической активности. Практически во всех случаях детерминантной структурой оказывался гиппокамп, а разрушение хвостатого ядра приводит к усилению эпилептической активности при действии ПТЗ. Известно, что гиппокамп играет роль патологической детерминанты, с которой связано формирование эписистемы, а хвостатое ядро оказывает ингибирующее влияние на судорожной процесс.

Нарушения могут охватывать определенные нервные сети. При систематическом введении хемоконвульсантов возникают прямые изменения в нервной системе, которые необязательно ведут к эпилепсии, и вторичные изменения физиологических функций, которые могут быть следствием развития судорожной активности, ее распространения на другие структуры мозга. Эту трудность можно преодолеть, если вводить конвульсант строго локально, подводить его микроионофоретически к небольшой группе клеток (например, в гиппокампе). В этом случае в эксперименте можно исследовать как область, куда введено вещество, так и отдаленные от него участки мозга.

Классический пример - применение тетано-токсина в эксперименте. После его введения в кору головного мозга животного судорожный ответ возникает уже через 3 мин., эффект продолжается до нескольких недель или месяцев, что позволяет рассматривать эту модель как долгосрочную модель фокальной эпилепсии. Механизм действия токсина -блокада высвобождения ГАМК (тормозного медиатора), что подтверждается в опытах in vivo и на срезах гиппокампа in vitro. Введенный в гиппокамп тетано-токсин моделирует комплексные парциальные судороги по типу височной эпилепсии и поведенческие эффекты напоминают таковые в клинике, несмотря на то, что в данной модели ограничены потери клеток в гиппокампе: они наблюдаются только у 10-30% крыс. Лечение карбамазепином снимает как судороги, так и поведенческие последствия (Jefferys, Borck, Mellanby,1995).

Генетические модели эпилепсии у животных

Животные с хроническими, спонтанно повторяющимися припадками представляют идеальные модели эпилепсии у людей. Генетические модели на животных можно разделить на модели, в которых судороги вызываются внешними стимулами, и на модели с судорогами спонтанной природы. Первая категория включает различные линии животных с врожденной чувствительностью к судорогам. Среди них аудиогенные мыши и крысы, реагирующие генерализованными конвульсиями на звуковую стимуляцию определенной частоты и силы (Крушинский, 1960; Browning, 1986), фотосенситивные бабуины (Papio papio), у которых перемежающиеся вспышки света провоцируют спайк-волновые разряды, миоклонус и даже тонико-клонические судороги. Одной из исследованных линий крыс с врожденными аудиогенными припадками является линия GEPRs (genetically epilepsy-prone rats), у которых припадки возникают в ответ на звуковую стимуляцию. Выделено две подлинии: GEPRs-З с, у которых в ответ на стимуляцию возникают клонические судороги и GEPRs-9 с, у которых развиваются тонические судороги конечностей (экстензия) (Browning, 1986). Одной из возможных причин судорожной активности у этих животных считается врожденный дефицит норадреналина, который рассматривается как модулятор судорог и выступает в роли эндогенного антиконвульсанта в различных моделях судорог (Eells et al., 1997.) Ранее предполагали, что причина недостаточности норадреналина кроется в сниженной активности клеток locus coereleus, содержащих норадреналин, однако это не подтвердилось. В работе Eells et al., (1997) доказано одинаковое увеличение c-fos реактивности клеток locus coereleus (что отражает их активность) и при аудиогенной стимуляции и при фенотипически схожих моделях судорог, например, при максимальном электрошоке или ПТЗ-вызванных судорогах у крыс данной линии. Норадренергическую недостаточность объясняют снижением числа норадренергических терминалей и содержания в них норадреналина для разных участков мозга этих крыс.

Следует упомянуть монгольских песчанок, у которых судороги возникают при практически любых изменениях внешней среды, хендлинге или сильных колебаниях воздуха (Frey et al., 1983). Еще одна линия мышей El характеризуется чувствительностью к повторяющимся подбрасываниям (Imaizuma, Nakao, 1964).

Все вышеперечисленные модели являются в большей мере моделями «рефлекторной эпилепсии», чем моделями спонтанно возникающих судорог (Loescher, 1992). Однако среди пациентов с эпилепсией всего 5% страдают фокальными или генерализованными приступами, возникающими в ответ на сенсорную стимуляцию (Schmidt, 1986). Модели, в которых пароксизмальная активность не зависит от определенных внешних стимулов или воздействий, считаются моделями со спонтанно возникающими судорогами, обусловленными генетически. Большинство таких моделей представлено инбредными линиями грызунов со спонтанной активностью типа абсанс. Чуть более 10 лет назад были описаны мутантные мыши (С57BL/1 OBg) (Maxon et al., 1983.) и крысы (SER) (Serikawa, Yamada, 1986), у которых абсансы перемежаются генерализованными тонико-клоническими судорогами. Крысы линии SER получены от скрещивания крыс линии Sprague-Dawley (несущих мутацию zitter) с крысами линии Вистар (несущими мутацию tremor). У гомозиготных гибридов первого поколения по обеим мутациям, zitter и tremor, в возрасте 8 недель спонтанно появлялась «крутящаяся походка», формировались мозговые полости, возникали абсансы, а затем и тонические конвульсии. В дальнейшем, эти гибриды давали потомство с конвульсивным и неконвульсивным типом судорог. Особенный I интерес представляет различный фармакологический профиль конвульсий и абсансов. Абсансы купировались триметадионом и этосуксимидом, а конвульсии фенитоином, оба типа судорог одновременно облегчались фенобарбиталом и вальпроатом. Во время приступов на ЭЭГ возникали характерные низкоамплитудные быстрые спайки с частотой пик-волн 5-7 Гц. Интересно, что спайки "регистрировались и в коре и в гиппокампе (Sasa et al., 1988).

Сравнительно недавно была выведена линия крыс с генетически обусловленными спонтанными конвульсиями, похожими на лимбические судороги у людей (IGER). Генерализованные конвульсии у таких крыс развиваются у почти всех самцов в возрасте 45 месяцев без каких-либо внешних стимулов. Припадки начинаются с подергиваний морды и миоклонуса головы, постепенно превращаясь в генерализованные тонические судороги. Микронарушения развития, такие как ненормальная группировка нейронов, неправильное их расположение, недоразвитие пирамидных нейронов в гиппокампальной формации было обнаружено у молодых крыс без генерализованных тонико-клонических конвульсий. Спроутинг мшистых волокон в зубчатой извилине наблюдали в гиппокампе взрослых IGER крыс после повторных тонико-клонических припадков. Электроэнцефалографические исследования во время тонико-клонической фазы припадка демонстрируют, что спайки внезапно возникают в гиппокампе и затем распространяются на кору (Amano et al., 1996).

Особый интерес представляют собаки со спонтанно возникающими припадками. Не только клинические проявления и ЭЭГ паттерны, но и частота и длительность приступов, а также типы судорог совпадают с таковыми у людей. Генерализованные тонико клонические припадки у собак являются не первично, а вторично генерализованными фокальными судорогами, причем в 20-40% случаев они не поддаются лечению классическими препаратами (Loescher, Ebert, 1995).

В 1984 году Noebels описал 14 одиночных генных мутации у мышей, которые приводили к инициации спонтанных неконвульсивных паттернов эпилепсии. Мыши с мутацией в 8-й хромосоме были идентифицированы по моторным нарушениям, напоминающим «шатающуюся походку» (мутация tottering). Поведение животных характеризовалось атаксией, за которой следовали моторные судороги, а затем, t генерализованные кортикальные спайк-волновые разряды, внешне сопровождавшиеся замираниями. Снова обращает на себя внимание различный фармакологический профиль двух типов припадков: спайк-волновые разряды могут быть блокированы этосуксимидом, л33 диазепамом и фенобарбиталом, но не фенитоином, в то время как моторные судороги снимались лишь диазепамом, но не этосуксимидом. Исследование мозга «шатающихся» мышей выявило гипериннервацию регионов, содержащих норадреналин в качестве нейромедиатора. У новорожденных мышей с ненарушенным развитием норадренергических терминалей судорог не наблюдалось, что показывает вовлеченность норадренергической иннервации в патогенез этого типа эпилепсии (Noebels, 2005).

Другая линия мышей с наследственной рецессивной мутацией одного гена в 15-й хромосоме характеризовалась синхронизованными вспышками в неокортексе, таламусе и гиппокампе (мутация названа star gazer). Эти спайк-волновые разряды появлялись на 16-18-й постнатальные дни и сохранялись всю жизнь. Продолжительность разряда варьирует от 1 до 10 с, частота спайков в разряде 6-7 Гц. Было обнаружено, что паттерны синхронизации сопровождаются повышенной экспрессией нейропептида Y (NPY) в мшистых волокнах гиппокампа. При этом не выявлено повреждений гранулярных клеток или их постсинаптических целей (Noebels et al., 1990). У здоровых мышей пептид в гиппокампе не обнаружен. Более детальные исследования иммуноцитохимическим методом показали, что увеличенное содержание NPY наблюдается в гиппокампе только через 2 недели после появления первых гиперсинхронизованных спайк-волновых разрядов, однако все структуры, участвующие в синтезе NPY, окончательно созревают уже к 21-му постнатальному дню. Среди возможных механизмов гиперэкспрессии рассматривают инициаторное действие некоторых факторов роста: фактора роста нервов (NGF) и мозгового нейротрофического фактора (BDNF). Повышенный уровень мРНК этих двух белков в гранулярных клетках мутантных мышей доказывает их способность активировать ген ответственный за синтез NPY (Qiao, Noebels, 1993; Chafetz et al., 1995).

Мыши с рецессивной мутацией во 2-й хромосоме и характерными спайк-волновыми разрядами в корковой ЭЭГ получили название lethargic (летаргические мыши). Было показано, что у этих животных повышенное количество ГАМК Б подтипа рецепторов, причем оказалось, что связывание с рецептором прямо пропорционально числу припадков. Считается, что именно ГАМКб рецепторы ответственны за долговременную гиперполяризацию и депрессию выброса нейромедиаторов. Предположение о том, что ГАМК Б рецепторы участвуют в генерации низкопороговых выбросов Са2+, чем инициацируют синхронные таламо-кортикальные вспышки разрядов, укрепились с открытием антагонистов ГАМКб рецепторов. Антагонисты этих рецепторов подавляли спайк-волновую активность, а агонисты, напротив, потенциировали разряды (Hosford, 1992).

Параллельно было описано несколько линий мышей, таких как DBA/2 и С57В1/6, в ЭЭГ которых наблюдались короткие вспышки высокоамплитудных веретен, продолжительностью около 1.5 с, при частоте пиков 6.7-7.1 Гц. Эти пароксизмы мимикрируют с известными спайк-волновыми разрядами. Исследования показали роль ростральной части ствола мозга, включая locus coeruleus, который, очевидно, подавляет спайк-волновую активность, усиливая пробуждающий эффект на высшие структуры мозга (Ryan, 1984; Eells et al., 1997).

Еще 20 лет назад некоторые лаборатории столкнулись с неожиданной проблемой: было замечено что около 15-20 % неспецифически скрещенных крыс демонстрируют спайк-волновые разряды с частотой от 7 до '10 Гц, сопровождающиеся замираниями и подергиваниями вибрисс. Эти разряды были описаны для взрослых самцов Charles River CD крыс, для Sprague-Dawley в возрасте от 6 месяцев. Семба и Комисарук обнаружили, что 50% самок Long-Evans в возрасте от 8 до 11 месяцев также демонстрируют спайк-волновые разряды (Semba, Komisaruk, 1984.). Подобные явления зафиксированы и для крыс линии Вистар, широко использующихся для разведения. Было показано, что в возрасте 22 месяцев до 90% крыс этой линии имеют абсансо-подобные разряды. Вернее и Морешо, основываясь на Страсбургской популяции крыс линии Вистар, вывели новую линию животных со спонтанной генерализованной эпилепсией (GAERS). Неконвульсивные припадки у этих животных возникали, начиная с 40 дня, наблюдались на протяжении всей жизни, увеличиваясь в числе и продолжительности (Vergnes, Marescaux et al., 1982).

Hosford (1995), обобщая данные по моделям первичной генерализованной эпилепсии, заключил, что причиной спайк-волновой активности являются синхронизованные вспышки разрядов таламокортикальных нейронов. Молекулярные механизмы этого явления разнообразны и специфичны для различных линий селектированных животных. В случае генетической линии GAERS — это изменение биофизических особенностей Т-типа кальциевых каналов и изменения в организации субъединиц самой Гамма-аминомасляной кислоты и ГАМКд подтипа рецепторов. У летаргических мышей (lh/lh mouse) - это увеличенное содержание ГАМКд "~tr ГАМКб рецепторов. Несомненно участие нейрональных популяций inferior и superior colliculi в регуляции припадков у генетической модели аудиогенных судорог (GEPR крысы) при одновременном нарушении функции

ГАМК-ергической системы и норадренергических рецепторов. (Hosford, 1995).

Нельзя не отметить различий'"в-возникновении и проявлении генетически обусловленной абсансной эпилепсии у животных и человека. Во всех выше описанных моделях на животных наблюдается увеличение с возрастом числа особей, демонстрирующих спайк-волновую активность и увеличение числа разрядов у одной конкретной особи. Кроме того, частота пик-волновых комплексов в разрядах колеблется от 7 до 11 Гц. У человека, наоборот, абсансы чаще возникают в детском возрасте от 2 лет и сопровождаются помимо внешних проявлений спайк-волновой активностью с частотой 3 в секунду. С половым созреванием абсансы могут бесследно исчезать, однако у большинства они трансформируются в другие формы'Ъудорожной активности, например в ювенильную миоклоническую эпилепсию. Но они могут возникать и de novo в зрелом возрасте как синдром отмены психотропных препаратов — бензодиазепинов. Перед клиницистами стоит масса вопросов: почему пик-волновая активность наблюдается у здоровых детей во время дремоты, почему она исчезает. Не ясно'также, у какого ребенка абсансы прекратятся, а у какого разовьются в генерализованную судорожную форму эпилепсии. Какова роль наследственных факторов, и какие возрастные особенности развития мозга определяют возникновение и исчезновение абсансной активности? (Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е., 1998).

Еще одна экспериментальная модель генерализованных атипических припадков ч абсансного типа предложена G.VanLuijtelaar & T.Coenen в 1986 году. WAG/Rij - полностью инбредная линия (более 100 поколений близкородственных скрещиваний), полученная от крыс линии Вистар (Wistar Albino Glaxo, U.K.) в TNO Rijswijk (The Netherlands). Крысы страдают генетически врожденной абсансной формой эпилепсии.

В ЭЭГ выявляются пик-волновые разряды двух типов (spike-wave discharge - SWD), источником которых являются пейсмекерные нейроны ретикулярного ядра таламуса. SWD наблюдаются в определенный период постнатального развития: первые приступы — с 3-х месячного возраста, а в дальнейшем их длительность и частота возрастают. Разряды первого типа у взрослых крыс имеют продолжительность - до 10-15 с, они возникают в среднем с частотой 3 в мин. Частота пик-волн в разрядах колеблется в пределах 7-11 Гц с амплитудой 200-500 мкВ. Разряды второго типа встречаются у 50 % животных, они короче, часто менее 1 с, и частота спайков в них не превышает 8 Гц (Luijtelaar, Coenen, 1986). Спайк-волновая активность билатерально симметрична и неравномерно распространена по всей коре. Как показало детальное картирование, спайки лучше выражены во фронтальной коре, в области центра жевания и управления вибрисс, в то время, как волны — в 17 зоне затылочной коры (Кузнецова с соавт., 1998, 2005). Однако в гиппокампе SWD не наблюдаются. Половое и родительское поведение, а также способность к обучению в радиальном лабиринте у крыс линии WAG/Rij не отличаются от таковых у беспородных и крыс линии Вистар (van Luijtelaar, Coenen, 1986). Важным для данной модели является то, что число и длительность судорог у каждой особи не отличаются из дня в день (Coenen, Van Luijtelaar, 1987). Уровень бодрствования, REM сна и медленно-волнового сна являются определяющими в проявлении абсансной активности. В 33% случаев спайк-волновым разрядам предшествовало состояние пассивного бодрствования и в 48% легкий медленно-волновой сон. Во время активного бодрствования и REM сна разряды появляются крайне редко. Также и у детей абсансы чаще возникают в периоды дремоты и легкого сна и практически никогда во время активного бодрствования и игр. Сходство спайк-волновых разрядов с сонными веретенами позволяет предположить родство этих феноменов. В определенные периоды сна у крыс линии WAG/Rij можно зарегистрировать так называемое «промежуточное состояние», характеризуещееся нерегулярными спайками. Оно возникает при переходе от медленно-волнового сна к REM сну. Было установлено, что депривация REM сна приводит к снижению числа спайк-волновых разрядов. Эти данные также находят подтверждение в клинике, т.к. известно, что депривация парадоксального сна увеличивает уровень общего возбуждения у людей, и напротив, общая депривация сна ведет к росту сонливости и является провокатором эпилепсии. Анализ циркадианных ритмов показал, что максимальная пароксизмальная активность наблюдается между 4-м и 5-м часами темнового периода и минимальная с началом светлового периода, когда на ЭЭГ крыс наблюдается наибольшее число медленных волн, соответствующих глубокому сну. Данные полученные на людях,' также совпадают: максимум спайк-волновых разрядов приходится на утренние часы, т.е. на период пробуждения.

Одним из важнейших критериев адекватности модели служит ее фармакологический профиль. Как говорилось выше, абсансы у людей купируются принципиально отличными f от противосудорожных препаратами. Преимущество данной модели состоит в том, что классические средства этосуксимид и триметадион - препараты первого выбора при эпилепсии типа абсанс - существенно снижают число спайк-волновых разрядов у этих крыс, в то время как антиконвульсивные препараты типа дифенилгидантоина и карбамазепина, наоборот, увеличивает (Coenen et al., 1992). Авторы модели совместно с коллегами из Берлина исследовали влияние новых бензодиазепин подобных соединений

Р-карболинов на абсансы у крыс линии WAG/Rij. Соединения этого класса обладают более специфическим действием, чем бензодиазепины, и не имеют ряда побочных эффектов, свойственных бензодиазепинам. Парциальный агонист бензодиазенпиновых рецепторов ZK 91296 дозозависимо подавлял число спайк-волновых разрядов, не вызывая седативного и снотворного эффекта и не влиял на фоновую активность в ЭЭГ. Другой новый препарат из группы p-карболинов - абекарнил (ZK 112119) - с сильным антианксиолитическим действием также подавлял число спайк-волновых комплексов, не вызывая моторных нарушений и не оказывая снотворного эффекта (Coenen, van Luijtelaar, 1989). Были проведены подробные исследования действия веществ, оказывающих влияние через глутаматергическую и ГАМК-ергическую системы. Антагонист NMDA глутаматных рецепторов, МК-801, дозозависимо снижал число спайк-волновых разрядов, однако, из-за того, что этот препарат имеет побочные эффекты, вызывая атаксию и «нетипичное» поведение, его не используют во врачебной практике (Peeters et al., 1989). Закономерно антагонист ГАМК рецепторов, бикукуллин, снижал число спайк-волновых разрядов, а агонист ГАМК - рецепторов, мусцимол, усиливал их проявление. На конвульсивные формы эпилепсии эти вещества оказывают диаметрально противоположное действие, т.е. ГАМК-агонисты подавляют моторные судороги, а ГАМК-антагонисты потенцируют их. Разнонаправленные эффекты ГАМК-миметиков на конвульсивную и неконвульсивную формы эпилепсии, позволяют предположить, что тормозная система по-разному вовлечена i в эти два типа эпилепсии. Способность ГАМК агонистов увеличивать а ГАМК антагонистов уменьшать число абсансов может объясняться гиперактивностью этой системы при неконвульсивной форме заболевания. С другой стороны, и агонисты, и антагонисты глутаматных рецепторов облегчают обе конвульсивную и неконвульсивную формы.

Обращает на себя внимание, что бензодиазепины, обычно действующие как агонисты ГАМК А рецепторной системы, в случае абсансной эпилепсии, оказывают противоположное действие, т.е. вызывают снижение числа разрядов. Этот факт указывает на сложность и неодназначность трактовки имеющихся данных о механизмах генерации абсансов. Можно предположить, что гиперфункция ГАМК-ергической системы при абсансной эпилепсии может наблюдаться лишь в отдельных областях мозга или в определенные моменты развития.

Было доказано участие опиоидной системы и дофаминергической системы в неконвульсивной эпилепсии у крыс линии WAG/Rij. Обнаружено повышенное содержание проэнкефалина в стриатуме и среднем мозге у крыс WAG/Rij в сравнении с линией животных без абсансов (Кузнецова с соавт., 1999).

Существует несколько теорий, объясняющих возникновение абсансов. Пенфильд, предложил «центрэнцефалическую теорию», по которой спайк-волновые комплексы возникают в верхней части ствола мозга и поднимаются к промежуточному мозгу, откуда распространяются на кору (Пенфильд и Джаспер 1958). Противоположную точку зрения высказал Глур, предположив, что разряды возникают синхронно в коре и таламусе (Gloor, 1982). Принимая во внимание многочисленные электрофизиологические данные, в настоящее время не вызывает сомнений таламо-кортикальное происхождение осцилляций (Avoli et al., 1983). Таламо-кортикальные осцилляции представляют собой чередование синхронных вспышек ВПСП и ТПСП. Суммарные ВПСП обусловливают спайки в разряде, а суммарные ТПСП — медленные волны." Биохимически фаза ингибирования происходит за счет активации ГАМК А рецепторов с последующей гиперполяризацией. Торможение сменяется возбуждением, опосредованным глутаматом. Активация Т-типа Са+2 токов с помощью ГАМК Б рецепторов рассматривается как основной момент взаимодействия возбуждающих и тормозных механизмов. ГАМК-ергические нейроны ретикулярного ядра таламуса участвуют в синхронизации спонтанных разрядов пейсмекерных, глутаматергических таламо-кортикальных нейронов (Binnie, Stefan, 1999). Vergnes et al. (1992) показала, что высокая амплитуда спайк-волновых разрядов появляется в латеральном таламическом ядре-до, или одновременно, с кортикальными разрядами. В медиальном таламусе, цингулятном кортексе и гиппокампе разрядов не обнаруживается.

Разряды с меньшей амплитудой можно зарегистрировать в стриатуме, покрышке среднего мозга и в черной субстанции. Инъекция антагониста ГАМК-рецепторов мусцимола в область черной субстанции дозозависимо снижает спайк-волновые разряды как в коре, так t и в таламусе, подчеркивая роль substantia nigra в процессах прерывания генерализации. Исследования роли corpus callosum в межполушарной синхронизации спайк-волновых разрядов показало, что этот путь важен, но не является единственным при билатеральной синхронизации. Таким образом, именно таламус считается источником спайк-волновых разрядов (Vergnes, Marescaux, 1992).

Генерализованные судорожные состояния чаще всего моделируют с помощью различных хемоконвульсантов. В качестве конвульсантов, вызывающих судороги различного генеза используют: стрихнин, тиосемикарбазид, коразол, бикукулин, бемегрид, пикротоксин, прокаин, кокаин. Они вызывают генерализованные клонические судороги с тонической фазой или без нее. По механизму действия судорожные агенты подразделяют на усиливающие процессы возбуждения, блокирующие тормозные механизмы, нарушающие энергетический • метаболизм и тормозящие транспорт ионов. Целенаправленное использование судорожных агентов с известным механизмом действия позволяет оценить роль этих механизмов в реализации действия противосудорожных средств. Общим недостатком использования здоровых животных при исследовании механизмов системного применения судорожных агентов является стремительно развивающееся диффузное возбуждение, вызывающее первично-генерализованные судороги у животных. В качестве хемоконвульсанта широко применяется конвульсант коразолового ряда — пентилентетразол (метразол=ПТЗ). В низких дозах ПТЗ индуцирует абсансо-подобные судороги (Snead, 1992). В умеренных дозах ПТЗ ведет к развитию t клонических судорог, а высокие его дозы индуцируют тонико-клонические судороги, генерализованные судороги (эпистатус) и даже смерть животного (Depaulis et al., 1989). Около двадцати лет тому назад была раскрыта последовательность активации мозговых структур в процессе ПТЗ-индуцированных судорог. Абсансы, клонические и тонико-клонические судороги, возникающие в зависимости от дозы конвульсаната, имеют различные нейрональные субстраты. Абсансо-подобные приступы возникают в структурах таламуса и поддерживаются" на таламо-кортикальном уровне, практически не распространяясь на другие структуры мозга (Browning, 1985, Vergnes and Marescaux, 1992). Клонические судороги, вызванные умеренными дозами конвульсанта и сопровождающиеся клонусом всех конечностей животного, возникают в коре мозга и переднем мозге. При дальнейшем развитии припадка клонические судороги переходят в тонические. За внешние проявления тонических судорог ответственны структуры ствола мозга, в особенности ретикулярная формация и ядра среднего мозга, включая вестибулярное ядро и перивентрикулярное серое вещество. В опытах с разрушением структур, потенциально вовлеченных в ПТЗ-индуцированные судороги, не получено данных об участии substantia nigra (Miller et al., 1989; Miller, Ferrendelli, 1990; Andre et al., 1998).

Действует ПТЗ через пикротоксиновый сайт ГАМК А рецепторного комплекса, подавляя работу рецепторов и вызывая закрытие каналов для йонов СГ, что приводит к снижению гиперполяризации нейронов повышению их возбудимости1 (Нейрохимия, 1996).

Основные направления в лечении эпилепсии

До недавнего времени единственным противосудорожным воздействием была коррекция недостатка ГАМК в головном мозге. Сравнительно недавно было выбрано еще одно направление терапевтического воздействия при эпилепсии — снижение избыточной электрохимической активности нейронов, являющейся одним из основных патофизиологических механизмов эпилептических припадков, но при этом не угнетающее нормальную функцию нейронов. В настоящее время для лечения эпилепсии применяются препараты 12-ти основных классов (Карлов, 1990), среди которых: 1. производные гидантоина (дифенин); 2. производные барбитуровой кислоты (фенобарбитал); 3. производные оксазомендиона (триметин); 4. бензодиазепины (клоназепам, диазепам, нитразепам); 5. сукцинимида (этосуксимид, фенсуксимид, пуфемид); 6. иминостильбена (карбамазепин); 7. сульфонамида (сультиам); 9. кортикотропин и глюкокортикоиды; 10. агонисты ГАМК (баклофен, тиагабин, габапентин); 11. антагонисты возбуждающих аминокислот (ламотриджин); 12. разные противосудорожные препараты (хлоракон, метиндион, хлоралгидрат, мидокалм).

Кроме того, в качестве вспомогательных средств используют L-DOFA, холинолитики, психостимуляторы (кофеин, сиднокарб), антиоксиданты (а-токоферол), нейролептики, транквилизаторы и ноотропы (Ашмарин, 1997).

Обобщая литературные данные, можно сформулировать, какие проблемы привлекают внимание исследователей и активно изучаются, а какие, по тем или иным причинам, остаются недостаточно освещенными. В настоящее время, к сожалению, многие исследователи ограничиваются изучением одного какого-либо типа или модели эпилепсии, не учитывая, что разные формы эпилепсии, имея различные морфологические субстраты и различные медиаторные системы, могут трансформироваться друг в друга. То есть, остро стоит проблема взаимодействия конвульсивной и неконвульсивной форм заболевания. Совершенствование технических средств позволяет использовать новые методы изучения просудорожных и противосудорожных-систем организма. Непрерывно обнаруживаются новые звенья в сложной цепи эпилептизации мозга, а это означает открытие новых путей и подходов в лечении заболевания.

Роль нейропептидов в развитии и торможении судорожной активности

Как уже отмечалось выше, имеющиеся фармакологические средства против эпилепсии созданы на основании результатов нейрохимических исследований процессов возбуждения и торможения нервной клетки. Случаи резистентности можно рассматривать как нарушение сразу двух механизмов: внеклеточного и внутриклеточного контролей за возбудимостью клетки, которые еще не поддаются объяснению.

С другой стороны, возможной причиной этого могут быть нарушения в обмене и секреции эндогенных регуляторов пептидной природы (И.П.Ашмарин и др., 1996), которые сосуществуют с классическими медиаторами и секретируются в ткани и ликворе как "защитные противоэпилептические средства" самого мозга (П.Ч.К.Чилапагари, 1993; S.Chepumov, N.Chepurnova, S.Yatzuk, O.Gaykova, 1994). При этом допущении становится понятным, что успешная коррекция и нормализация процессов в ЦНС вероятнее всего будет достигаться применением регуляторных пептидов.

В течении ряда лет в. МГУ проводится работа по поиску и внедрению нейропептидов, способных предотвращать развитие судорожной активности. Это нейропептиды: аналоги меланостатина',' аналоги фрагмента молекулы АКТГ (семакс), дипептид алаптид, тиролиберин и нейрокинин, субстанция П, кассинин. В наших собственных исследованиях именно интраназальное введение в сверхмалых дозах тиролиберина, повышающее судорожный порог, стало предметом дальнейшего подробного исследования. •■

Применение в лечебных целях спинномозговой жидкости больных эпилепсией (НИИ нейрохирургии им.А.Л.Поленова, Санкт-Петербург) основано на экспериментальных данных о появлении в спинномозговой жидкости животных, перенесших длительные судорожные припадки, "защитных противосудорожных веществ" пептидной природы и на соответствующем поиске пептидной фракции, ответственной за такое противосудорожное свойство ликвора (G.Kryzanovsky et al., 1989). Есть основания предполагать, что она включает опиоидные пептиды. Однако известно, что последние в больших концентрациях могут провоцировать судорожный ответ, а в малых выступать в качестве защиты. Известно также, что эпилептический приступ вызывает экспрессию генов раннего ответа и генов предшественников (Sperk et al., 1993) проэнкефалина и протахикининов в нейронах коры и других отделах мозга, поэтому особенно важна роль концентрации вводимого пептида с целью предотвращения развития эпилептической активности.

Ликвор мозга действительно содержит непрерывно обновляющийся "код" нейрохимической регуляции активности мозга. Реальные концентрации, содержащихся в ликворе веществ (как, впрочем, при экспериментальном экзогенном введении пептидов и при ликворотерапии в клинике) так малы, что, по-видимому, физиологическим механизмом их действия следует считать запуск антиэпилептической системы мозга (Г.Н.Крыжановский, А.А.Шандра и др., 1992). Именно при полифункциональном действии пептидов в организме, за счет их связывавния с различными, а не только с опиатными рецепторами, возможно их комбинированное применение при лечении эпилепсии с другими противосудорожными лекарственными препаратами (карбамазепином, вольпроатом и другими).

Все выше сказанное позволяет заключить, что применение эндогенных нейропептидов и изучение механизма их противоэпилептического действия остается актуальной проблемой физиологии головного мозга.

Исследования в области противосудорожных свойств веществ приняли новое I направление. Особое внимание стало '-уделяться веществам пептидной природы (И.П.Ашмарин, 1988). Существуют экспериментальные данные, показывающие, что при эпилепсии происходит увеличение в миндалине содержания мет-энкефалина и холецистокинина и уменьшение содержания динорфина в гиппокампе. В черной субстанции содержание мет-энкефалина увеличивается, а изменений в содержании динорфина обнаружено не было (Tadarola, Shin et al., 1986). Это говорит о специфическом нарушении метаболизма нейропептидов в лимбической и экстрапирамидной системах, которые происходят в процессе формирования киндлинга и в результате вызываемых им t судорог. Вышесказанное получило экспериментальное доказательство на модели фармакологического киндлинга: многократное системное введение ПТЗ вызывало увеличение выделения мет-энкефалина в стриатуме в период клонико-тонических судорог. Перфузия срезов стриатума крыс раствором ГАМК вызывала резкое снижение выделения I мет-энкефалина. Это позволяет говорить о том, что опиоидные пептиды могут выделяться во время эпилептического припадка и оказывать влияние на постиктальное поведение, причем эффекты могут регулироваться ГАМК-ергической системой (Zubieta, Vindrola et. al., 1985).

На кафедре физиологии МГУ были проведены исследования по конкуренции меланостатина и морфина (Н.Е.Чепурнова и др., 1984). Налоксон снимал тормозные эффекты аналогов меланостатина (Gly-Pro; Ala-Pro) на нейроны гиппокампа (А.А.Подобина, 1984; С.А.Чепурнов, 1985). Результаты этих работ позволяют предположить противосудорожное действие аналогов меланостатина через опиатные рецепторы. Есть подтверждения, что внутрижелудочковое введение циклического аналога меланостатина «алаптида» вызывает блокирование залповой эпилептической активности при сформированном электрическом киндлинге (S.Chepurnov, 1991; N.Chepurnova et al., 1991). Залповая активность на ЭЭГ купируется одновременно с поведенческими компонентами судорожного состояния (Ф.Б. Нозмо Мукииби, 1986). Показаны противосудорожные свойства пептида АКТГ4.ю-Про-Гли-Про ("Семакса") (Н.Е.Чепурнова и др., 1989 Сато Масака, 1992). При его системном введении было выявлена кратковременная блокада судорожной активности у крыс с выработанным феноменом киндлинга, и крыс линии Крушинского-Молодкиной, генетически предрасположенных к аудиогенной эпилепсии (В.Крейчи, Е.Касафирек и др., 1987).

Тиролиберин - эндогенный антиконвульсант

Накоплено уже немало экспериментальных данных, доказывающих высокую нейробиологическую эффективность экзогенно вводимого тиролиберина, оказывающего противосудорожное действие (Kouichi, Osono, Minako et al., 1989), изменяющего ряд висцеральных функций, оказывающего психостимуляторное и антидепрессантное действие (И.П.Ашмарин, А.П.Кулаичев, С.А.Чепурнов, 1989; И.П.Ашмарин и др., 1992). В то же время, имеются данные о том, что иммунизация ковалентными коньюгатами антигенов-носителей с низкомолекулярными биорегуляторами, например, тиролиберин-белковыми коньюгатами (С.А.Чепурнов и.др., 1990; Н.Е.Чепурнова, Н.П.Кабанова и др, 1995; Е.В.Ефимова, 1993), изменяет физиологический статус организма, и, в первую очередь, деятельность мозга.

Нейропептид тиролиберин [L-pyroglutamil-L-histidil-L-prolinamide] (ТРГ), открытый t

A.Schally в 1974 году, широко распространен в ЦНС и участвует в регуляции высшей нервной деятельности в восходящем ряду млекопитающих. Его внеэндокринные, центральные эффекты заключаются в активирующем действии, усилении эмоциональных реакций, ТРГ считают эндогенным антидепрессантом, а среди нейропептидов называют панактивином. Тиролиберин pGlu-His-Pro-NEk синтезируются наряду с другими рилизинг-факторами в области мелкоклеточных ядер медиобазалыюго гипоталамуса (Burgus et al., 1969, Bassiris, Utiger, 1974).

Первоначально полагали, что высокостереоспецифические сайты связывания ТРГ на t клеточных мембранах в головном мозге, т.е. его рецепторные белки, ограничены локализацией только в гипофизе (Grant et al., 1972), в головном (Burt, Snyder, 1975) и спинном мозге (Prasad, Edwards, 1984), а также в сетчатке глаза (Burt, 1979). Помимо этого Fukusumi и соавторы (1995) обнаружили, что ТРГ-рецептор присутствует в подчелюстной железе, тимусе, легких, сердце, желудке, поджелудочной железе, селезенке, надпочечниках, почках, печени, кишечнике, плаценте, матке, простате и семенниках.

Установлено, что ТРГ-рецепторы распределены гетерогенно в ЦНС крыс (Ogawa et al., 1981). В области перегородки, как обнаружено, регистрируется наиболее высокая плотность ТРГ-рецепторов. Показано также, что перегородка является наиболее чувствительным регионом головного мозга к микроинъекциям ТРГ для провокации аналептического эффекта (Kalivas, Horita, 1980), при этом интегративность септо-гиппокампальной'системы является важным проявлением данного эффекта (Kalivas et al., 1981). Simasko и Horita (1984) установили, что повреждение нейронов каиновой кислотой введенной непосредственно в перегородку, вызывает снижение связывания ТРГ на 35%. Поскольку каиновая кислота, главным образом разрушает клеточные тела (McGeer et al., 1978), можно говорить о преимущественной локализации ТРГ-Рецепторов именно на этих телах. Burt и Snyder (1975) были первыми, продемонстрировавшими процесс связывания ТРГ с мембранами мозга крыс и установившими присутствие как высоко-, так и низкоактивных сайтов связывания. В дальнейшем было обнаружено, что существует четкое соответствие между ТРГ-Рецепторами в ЦНС (кора больших полушарий) и в передней доле гипофиза (Burt, Snyder, 1975; Burt, Taylor, 1980; Baneiji, Prasad, 1982). Четкая корреляция между наличием ТРГ в различных регионах мозга и присутствием в этих же регионах сайтов связывания ТРГ дополнительно подтверждает положение о том, что ТРГ оказывает важное влияние на ЦНС. Zabavnik и соавторы (1993) показали, что виртуально в каждой области, где есть экспрессия мРНК ТРГР присутствует прогормон ТРГ или иммунореактивный ТРГ (Lechan, Jackson, 1982). Sergeson с соавторами (1987) также продемонстрировали наличие мРНК прогормона ТРГ в тех регионах, в которых, как установили Zabavnik с соавторами (1993), содержится мРНК ТРГР. Эти регионы включают в себя миндалину, диагональный пучок Брока, ядро концевой полоски и дорсальное моторное ядро блуждающего нерва. Присутствие ТРГ-Рецепторов в тех же регионах, в которых осуществляется синтез прекурзора ТРГ, свидетельствует о локальном воздействии ТРГ. В исследованиях на ооцитах африканской лягушки Xenopus laevis вводили мРНК из гипофизарных клеток, кодирующую ТРГР, после этого наблюдалась активация экспрессируемых ТРГР в этих ооцитах (Oron et al., 1988; Staub et al., 1989; Shapira et al., 1990).

Существует несколько важных вопросов, касающихся механизмов действия любых нейромедиаторов в ЦНС животных и человека. Например, может ли нейромедиатор проявлять возбуждающее и ингибирующее действия одновременно? Может ли он модулировать эффекты других нейромедиаторов и помимо этого обладать прямым действием? Если субстрат действует как модулятор, изменяет ли он чувствительность нейрона ко всем нейромедиаторам или только к одному? Если вещество оказывает многостороннее влияние, выделены ли рецепторы в специфические типы клеток, которые опосредуют эти эффекты (Батуев с соавт, 1990)?

Поскольку ТРГ является одновременно нейрогормоном, нейромедиатором и нейромодулятором, то несомненно, что все эти вопросы касаются механизмов его действия, а также его взаимодействия с классическими нейромедиаторными системами.

Введение ТРГ стимулирует выделение дофамина из тубероинфундибулярных нейронов, которое опосредуется через ТРГ-Рецепторы (Ikegami et al., 1992).

ТРГ повышает обмен норадреналина (НА) (Horst, Spirt, 1974; Oka et al., 1989) и высвобождает НА из фронтальнрй коры у крыс, анестезированных уретаном (Itoh et al., 1995), а также уровень З-метокси-4-гидроксифенилэтилгликоля в головном мозге (Oka et al., 1989). Напротив Itoh и соавторы (1996) установили, что введение ТРГ (10 и 30 мг/кг, в/б) дозо-зависимо повышает концентрацию 4-гидрокси-З-метоксифенилгликоля без изменения уровня норадреналина в головном мозге мышей.

В спинном мозге ТРГ-иммунореактивные волокна супраспинального происхождения наблюдаются в вентральном роге, где также часто содержится серотонин (СА) (Johansson et al., 1981). Это совпадает с гипотезой о том, что ТРГ/СА иннервация в этих спинальных регионах возникает из В1-В2 клеток (Chiba, Masuko, 1989). Наоборот, ТРГ, обнаруженный в дорзальном роге, по-видимому, не является нейропептидом супраспинального происхождения. Кроме того, на этом уровне не обнаружено никакого совместного существования ТРГ и СА (Harkness, Brownfield, 1986). ТРГ/СА нейроны в ВЗ иннервируются преимущественно другими структурами ЦНС чем дорзальный рог спинального мозга, где находится главная область действия ТРГ и СА. Предполагаемой областью действия ТРГ/СА может быть моторное ядро блуждающего нерва, нерва солитарного тракта, ядра подъязычного нерва, где также была обнаружена иннервация ТРГ и СА (Steinbush, 1984).

Установлено, что ТРГ (5 мг/кг, подкожно) избирательно активирует холинергические нейроны в коре и гипокампе, вызывая существенное • и длительное повышение выделение эндогенного ацетилхолина, чего не наблюдается в полосатом теле. Непосредственное введение ТРГ в перегородку повышает обмен АХ в гиппокампе у крыс, анестезированных с помощью фенобарбитала (Brunello, Cheney, 1981), а внутрижелудочковая инъекция ТРГ повышает обмен АХ в париетальной коре свободно перемещающихся крыс, но не в других областях мозга (Malthe-Sorennsen et al., 1978).

В литературе имеются данные о том, что ТРГ может оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее влияние на глутаматергическую систему, однако сведения об этом весьма противоречивы (Kasparov et al., 1994; Stocca, Nistri, 1995; Koenig et al.', 1996).

Поскольку ТРГ ингибирует выделение глутамата и препятствует обусловленному л I глутаматом поглощению Са в культуре кортикальных клеток, повышенная секреция ТРГ может принимать участие в механизмах его антиконвульсивных и нейропротективных эффектов (Koenig et al., 1996; Boroni et al., 1997). Снижение значения Вшах ТРГР в гиппокампе и стриатуме имеет сходство с эффектом одиночной дозы пентилентетразола (Jaworska-Feil et al, 1998). Понижающая регуляция ТРГ-Рецепторов, связанная с судорогами, выявлена и в исследованиях других авторов (Kubek et al., 1993). Такая регуляция ТРГ-Рецепторов может быть адаптивным ответом постсинаптической мембраны на вышеупомянутое избыточное высвобождение ТРГ в течение судорожного периода. Однако длительное повышение связывающей способности рецепторов ТРГ в стриатуме у возбужденных крыс, наблюдавшееся Kajita и соавторами (1988), может свидетельствовать о том, что регуляция ТРГ-Рецепторов зависит от модели судорожных состояний и не коррелирует с изменениями уровня ТРГ. Рецепторные механизмы изменений активности секреции ТГР, обусловленные судорогами, предотвращаются введением ингибитора ацетилхолинэстеразы, которое вызывает значительное повышение уровня ТРГ в мозге (Knoblach, Kubek, 1997). Как известно, основным механизмом действия пилокарпина, каината или раздражения миндалины является активация глутаматергических нейронов (Turski et al., 1989; Rice, DeLorenzo, 1998). В свою очередь активация глутаматергических рецепторов приводит к экспрессии многих транскрипционных факторов, включая и фактор для ТГР (Rosen et al., 1993).

Jaworska-Feil и соавторы (1999) также установили, что однократное введение ПТЗ (70 мг/кг в/б) повышает уровень мРНК препроТРГ в зубчатой извилине гиппокампа и в пириформной коре через 3 часа, причем максимальная степень роста мРНК отмечается через 24 часа. На седьмой день после введения уровень мРНК препроТРГ возвращается к исходному значению. Инъекция ПТЗ также понижала плотность (Вшах) ТРГ-Рецепторов в полосатом теле через 3 и 24 часа, тогда как в миндалине и пириформной коре повышение этого параметра наблюдалось только через семь дней и 24 часа соответственно. Величина Kd понижалась в полосатом теле и повышалась в миндалине только через три часа. Однократная инъекция ПТЗ, а также многократные инъекции ПТЗ, сильно влияют на биосинтез ТРГ и его рецепторов в дискретных регионах головного мозга (Jaworska et al.,

1999). Временной интервал и величина повышения содержания в тканях лимбических структур головного мозга мРНК препроТРГ и ТРГ имеет сходство с изменениями, обнаруживаемыми после электроконвульсивного шока, электрического раздражения миндалины (Kubek, Sattin, 1984; Kubek et al., 1985, 1993; Knoblach, Kubek, 1997). Кроме того, только у крыс с полностью развившимися клонико-тоническими судорогами наблюдались достоверные изменения в биосинтезе ТРГ и его рецепторов, свидетельствуя о том, что стимуляция биосинтеза ТРГ зависит от появления судорожной реакции. У крыс с низкой степенью проявления судорог после повторного введения ПТЗ изменения в уровне ТРГ отмечались только в стриатуме и перегородке.

Электроконвульсивные судороги модулируют уровень ТРГ в гипоталамусе, цингуляте и латеральном мозжечке крыс (Pekary et al., 2000).

Было обнаружено, что ТРГ (2 и 5 мг/кг) и его стабильный аналог RGH-2202 (2.5 и 5 мг/кг) поднимают порог при судорогах, вызываемых каинатом и снижают смертность. Гистологические исследования показали, что каинат вызывает потерю нейронов СА1 и САЗ гиппокампа. ТРГ (10,20 и 50 мг/кг) и RGH-2202 (2.5, 7.5 и 10 мг/кг) заметно снижают эффекты возбуждения, вызванные каинатом. Далее было показано, что ТРГ (1-100 микроМ) и RGH-2202 (100 микроМ) значительно смягчают высвобождение лактодегидрогеназы, вызываемое каинатом (150 микроМ) в культуре первичных кортикальных клеток эмбрионов крыс. Кроме того, было показано что ТРГ и RGH-2202 смягчают судороги, вызываемые каинатом и ингибируют нейротоксичность, обусловленную каинатомлп vivo и in' vitro: Результаты подтверждают данные о том, что ТРГ и его аналоги обладают потенциалом в лечении судорог и некоторых других нейродегенеративных заболеваний (Jaworska-Feil et al., 2001).

ТРГ успешно используется для лечения детей с нейрологическими нарушениями, в том числе при эпилепсии. ТРГ и его аналоги эффективны также при Уест синдроме, синдроме Леннокса-Гасто и ранней младенческой эпилептической энцефалопатии, которые были рефрактерны для антиконвульсантов и АКТГ. ТРГ безопасен при лечении детей и эффективен в некоторых случаях лечения Уест синдрома, синдрома Леннокса-Гасто. ТРГ рассматривается в качестве нового метода лечения Уест синдрома, синдрома Леннокса-Гасто перед АКТГ терапией, особенно подходящего для пациентов с инфекцией, иммунодефицитом или сильным органическим повреждением мозга. Механизм антиэпитептического действия ТРГ может отличаться от такового других антиэпилептических лекарств. Возможно, ТРГ действует через кинуреновый механизм, учитывая то, что кинуреновая кислота является антагонистом N-метил-аспартат рецептора (Takeuchi et al., 2001).

Пациент с младенческими . спазмами находился на АКТГ терапии, которая полностью блокировала спазмы, но была прекращена по причине развития вентрикулярной гипертрофии. После этого судороги возобновились Также был поставлен диагноз синдром Уильямса. ТРГ терапия уменьшила припадки и улучшила результаты ЭЭГ. Кроме того, было улучшено его психомоторное развитие (Morimoto et al., 2003).

При пилокарпиновых судорогах наблюдается длительная временная зависимость экспрессии препроТРГ в некоторых кортикальных и гиппокапмальных регионах (Tetich et al., 2005).

Избыточное выделение возбуждающих аминокислот связано с путями образования судорог и нейродегенерации. Тиролиберйн эффективен при лечении подобных расстройств, хотя I механизмы такого влияния недостаточно изучены. На гиппокампальных срезах in vitro показано, что ТРГ может ингибировать судороги, вызванные высвобождением глутамата/аспартата. ТРГ не влиял на исходное высвобождение глутамата/аспартата, но все три дозы (Р < 0.05) ингибировали пик 50 мМ [К(+)] высвобождения глутамата/аспартата, и t глутамат был ниже контроля через 15 минут после стимуляции. Можно предположить, что экзогенный и/или эндогенный ТРГ может модулировать избыток высвобождения глутамата в специфических областях ЦНС (Y Nie et al, 2005).

ТРГ проявляет серьезную роль в модуляции судорог. Тиролиберин и некоторые из его аналогов проявляют антиэпилептические свойства на различных моделях судорог, включая киндлинг и электроконвульсивный шок. Клинически применение ТРГ эффективно при таких рефрактерных формах эпилепсии как младенческие спазмы, синдром Леннокса-Гасто, миоклонические судороги, и другие (Kubek et al, 2002).

Как уже отмечалось во введении, в МГУ был всесторонне изучен спектр физиологических функций ТРГ. Он оказывает стимулирующее действие на дыхательные рефлексы и нейроны дыхательного центра; стимулирует в ультрамалых дозах сократительную способность лимфатических сосудов. ТРГ повышает устойчивость к гипобарической гипоксии. ТРГ нормализует мозговое кровообращение и повышает парциальное давление кислорода в крови новорожденных недоношенных детей, его i.v. введение оказывает положительное действие в реанимации новорожденных [Иониди, 1992]. Он облегчает процессы обучения и памяти в условиях электрошока и нарушений корковых связей (травмы) лимбической системы. Нами впервые показано, что ТРГ оказывает защитное действие при выполнении сверхмаксимальных физических нагрузок у человека. На основании известных в свое время данных В.Е Клуша (1994) подчеркивала, что ТРГ провоцирует эпилептическую активность мозга. Однако уже в экспериментах, начатых нами уже в 1987 г., было впервые показано, что эффект определяется дозой ТРГ и I способом его введения. Применение- его в. ультрамалых дозах при локальном эндоназальном введении оказывает противосудорожное действие. Определены диапазоны доз и концентраций, при которых ТРГ выступает как антиэпилептоген (от 10"8 М до 10"12

М). Позднее японские невропатологи разработали протокол лечения при системном t введении ТРГ при тяжелых случаях эпилепсии детства, синдрома Леннокса. Однако и при системном введении ТРГ его центральные эффекты объясняются действием .в ультрамалых дозах, поскольку его проницаемость через ГЭБ очень низка и нет специальных транспортных механизмов ТРГ. Клиренс проТРГ 8.4 +/- 1.2 мкл/мин"1. Проникновение ТРГ из крови в мозг ограничивается двумя факторами: отсутствием транспортных систем в ГЭБ и наличием энзимов расщепления ТРГ в плазме. Концентрация ТРГ в ликворе стабильна, это определяется также отсутствием или неактивностью в ней ферментов деградации, процессами секреции ТРГ в ликвор ТРГ-эргическими нейронами, прилежащими к желудочкам мозга. Прямое поступление ТРГ через слизистую в ликвор обеспечивает его более быстрое и эффективное действие на мозг.

Несмотря на многообразные поведенческие эффекты ТРГ, его клиническое использования ограничено коротким периодом полужизни. В результате многочисленных исследований было выяснено, что в основном остатки пироглутаминовой кислоты и пролинамида ответственны за полную биологическую активность ТРГ. Насыщение пирролидонового кольца пролином или другими гетероциклами приводит к появлению у аналогов ТРГ высоких центральных эффектов и неизменяемой гормональной активности (Szirtes et al., 1984). В противоположность этому, присутствие специфических основных свойств у имидазола в цепочке гистидина считается необходимым фактором для полной ТТГ-высвобождающей активности ТРГ.

3-Me-His]-TPr является наиболее похожим на тиролиберин соединением, стимулирующим выделение ТТГ из гипофиза. Однако, хотя [3-Me-His]-TPr обладает t высокой аффинностью для центральных ТРГ-Рецепторов, экспериментально установлено, что он менее активен в головном мозге, чем ТРГ (Ward et al, 1987).

Цикло-ТРГ (His-Pro) оказался в различных поведенческих тестах более активным аналогом по сравнению с натуральным трипептидом (Griffiths, Webster, 1981; Ogawa et al,

1984). Цикло-ТРГ ингибирует поглощение дофамина в синаптосомах полосатого тела (Battani, Peterkofsky, 1980).

ТА-0910 - аналог ТРГ, который проявляет стимулирующее действие на ЦНС, но обладает низкой способностью активировать секрецию ТТГ (Yamamura et al., 1990; t

Kinoshita et al, 1995, 1997; Moriyasu et al:, 1996). В то же время, MK-801 (0,1 мг/кг, в/б), являющейся антагонистом НМДА, подавлял эффекты ТА-0910 у крыс, получавших 3-ацетилпиридин. Полагают, что в эффект аналога ТРГ вовлекается глутаматергическая система. Однако не существует однозначных доказательств прямого связывания ТРГ или его аналогов с НМДА-рецепторами. ТА-0910 специфически связывается с меченным лигандом - [3Н]-метилТРГ, но не с лигандами для НМДА, адреналиновых, ацетилхолиновых, дофаминовых, серотониновых и ГАМК-рецепторов (Kinoshita et al., 1998). По-видимому активация НМДА является результатом опосредованной стимуляции ТРГ-Рецепторов в ЦНС. В то же время, аналоги ТРГ, являющиеся агонистами для ТРГ-Рецепторов, могут локально повышать глутаматергическую нейропередачу. Полагают, что использование ТА-0910 может быть полезным при лечении нарушений функции церебральной моторной системы (Kinoshita et al., 1998).

NS-3 является аналогом ТРГ, который метаболически стабилен и быстро проникает в головной мозг (Flohe et al., 1983; Itoh et al., 1995). В отличие от ТРГ,' NS-3 сильнее стимулирует высвобождение дофамина из полосатого тела, вызывая локомоторную гиперактивность у крыс (Higuchi et al., 1991) и мышей (Heal et al., 1987).

NS-3 очень выражено увеличивает обмен норадреналина в мозге мышей (Hennies, Flohe., 1982). Itoh и соавторы (1995,' 1996) выявили, что NS-3 повышает внеклеточную концентрацию НА во фронтальной коре у крыс in vivo.

RGH-2202 - аналог ТРГ, который обладает повышенной и пролонгированной фармакологической активностью по сравнению с ТРГ, однако этот аналог не оказывает никакого влияния на высвобождение ТТГ (Kisfaliidy et al., 1983; Szirtas et al., 1984). Было установлено, что RGH-2202 более активен в ингибировании каталепсии, вызванной галоперидолом, по сравнению с природным ТРГ (Szirtas et al., 1984; Drago et al., 1991).

Внеклеточная инактивация ТРГ осуществляется специфическими энзимами, принадлежащими семейству цинк- зависимых металлопептидаз. Известно, что в крови и тканях одним из путей метаболизма ТРГ является распад на глютамат (pGlu) и дипептид

His-Pro. Выяснено, что именно ароматическое кольцо является местом связывания в положении Туг282 ТРГ-рецептора с His. Малые размеры молекулы ТРГ позволяют ей связываться с трансмембранным доменом ТМ6. Доказано также и другое взаимодействие в ТМ7 между Arg306 и терминальным карбоксиамидом ТРГ. PyroGlu связывается с ТРГ-рецептором в положении ТугЮб и Arg306. Лиганд-рецепторный комплекс включает также связывание ТРГ с Не 109, Ие116 в НХЗ и ТугЗЮ и Ser313 в НХ7 . Возможно ли, чтобы дипептид His-Pro, возникающий после расщепления ТРГ, самостоятельно «продолжал» его

I , противосудорожное действие.

Изучение и внедрение новых противосудорожных препаратов нейропептидной природы остается актуальной задачей. Приходится констатировать, что несмотря на большие успехи физиологии и биохимии регуляторных нейропептидов, в неврологии отсутствуют противоэпилептические' лекарства нового поколения нейропептидной природы. Фармакология новых противосудорожных средств опирается в основном на данные по изучению ГАМК-ергической и глутамат-ергической систем , прямой регуляции ионных каналов. Однако каждый пятый больной сегодня страдает рефрактерной формой

I ' эпилепсии, которая не поддается лечению. •

1996), не только объясняет патологические механизмы эпилептизации, но и развитие механизмов потери эффективности противосудорожных средств. Доказательства этих механизмов в отношении ТРГ были - представлены J.Rosen (1992) при киндлинге миндалины (экспрессию ТРГ предшественников наблюдали в зубчатой извилине гиппокампа, пириформной коре).

Нейроэндокринная функция тиролиберина заключается в стимуляции секреции тиреотропного гормона, пролактина (JJackson, 1982; Nemeroff, Loosen et.al., 1979). Наличие ТРГ показано, помимо гипоталамуса, в коре, в базальных ганглиях, мозжечке, а также в периферических тканях - желудочно-кишечном тракте, поджелудочной железе, репродуктивной системе (Jackson, Reichlin, 1979).

Говоря о влиянии ТРГ на ЦНС, необходимо отметить его эффекты на температуру тела, сон, аппетит, барбиталовый наркоз (Gullemin, 1977). Но основное его действие -антидепрессивное (Benkert, Martschike, Goldon, 1981; A.J.Prange, Wilson, 1972). Показано, что нейрохимические механизмы, в большей мере связаны с активацией им "* ч дофаминергической системы (Engler, Chad, Jackson, 1982; Odawa et. al., 1984). Антикаталептическое действие пептида проявляется в его антагонизме с блокатором дофаминовых рецепторов - галоперидолом, а также с действующими угнетающе на ЦНС веществами: этанолом, барбитуратами, - хлоралгидратом. Антагонизм ТРГ с наркотическими веществами снимается ГАМК-ергическими веществами. Это показывает возможную роль ГАМК-ергической системы в проявлении аналептических эффектов ТРГ. Он также вызывает увеличение содержания циклических нуклеотидов в некоторых структурах мозга.

И внутрижелудочковое, и периферическое введение ТРГ вызывает повышение температуры тела, увеличивает подвижность животных, вызывает болеутоляющий эффект, который не снимается налоксоном. Наряду с эндогенными опиатами, холецистокинином, f

ГАМК и другими факторами ТРГ образует, систему, регулирующую аппетит. Нахождение его наряду с соматостатином в островках Лангерганса поджелудочной железы, очевидно, обусловлено участием этих пептидов в регуляции уровня глюкозы в крови (Leung, Guansing, Aslouni et. al., 1975).

Внутрижелудочковое введение ТРГ увеличивает скорость оборота АХ в париетальной коре головного мозга крыс и уменьшает концентрацию АХ (Malthe-Sorenssen, Wood et.al., 1978). Введение пептида с последующей регистрацией уровня биогенных аминов выявило его роль, как нейромодулятора (Sobue, Hashizume et. al.,1983). Показано при этом повышение уровня всех биогенных аминов и их метаболитов во всем мозге (Клуша,1984). Действие ТРГ как стимулятора синтеза и как фактора, способствующего выбросу моноаминов, показано с использованием блокаторов биосинтеза моноаминов. Одинаковый характер влияния ТРГ на моноаминергическую систему при центральном и периферическом путях введения свидетельствует о способности пептида преодолевать ГЭБ.

Установлено наличие специфических рецепторов к ТРГ (Ogawa, Yamawarai et al., 1982). Методом сатурационного анализа с помощью меченого тритием ТРГ показано существование в мембранной фракции клеток мозга крыс специфически связывающих мест к тиролиберину (Ogawa, Mizuno, Mori et al., 1984). Показано, что наибольшая плотность рецепторов в пределах ЦНС приходится на гиппокамп, миндалину, фронтальную кору. Сравнительно мало их в спинном мозге (Hokfeldt et al., 1975; Ogawa et al., 1983).

В крови тиролиберин быстро инактивируется. Период полураспада ТРГ составляет 5,3 минуты.

Исследованиями И.П.Ашмарина с сотр. (1992) в клинике недоношенных детей показано протективное действие ТРГ и его стимулирующее действие на дыхание и i мозговое кровообращение. Противогипоксическое действие в клинике и доказательство стимулирующего действия ТРГ на нейроны дыхательного центра (Инюшкин,1997) были основанием для исследования и последующей рекомендации ТРГ для лечения эпилепсии. Метод внутривенного введения ТРГ был использован для лечения эпилепсии в Японии.

Рекомендации ТРГ в клинику эпилепсии были сделаны только после детального исследования его антигипоксического действия (Ашмарин и др., 1990).

По совокупности физиологических свойств были основания считать тиролиберин способным оказывать противосудорожное действие. Однако, как все нейропептиды он обладает полифункциональностью, каскадным эффектом, вызывающим выброс в кровь и другие биологические жидкости других нейропептидов и гормонов (Ашмарин, 1992), поэтому было необходимо подробнее рассмотреть его физиологическую роль в организме. Впервые эффекты ТРГ в ультра-малых дозах экспериментально были продемонстрированы в опытах с сократительной активностью лимфатических сосудов крыс и быка (.Лелекова, 1989, 1990, 1995), причем также впервые было показано действие ТРГ через адренорецепторы (Ashmarin, Lelkova et al., 1995).

В многочисленных исследованиях, выполненных в школе академика Г.Н.Крыжановского (1980, 1988) показано, что эпилепсия связана с феноменами гипоксии (Торшин В.И., 1995), а антигипоксические эффекты способствуют противоэпилептическим. Этот же механизм протекции является частью противоэпилептического действия тиролиберина при его системном введении (Ашмарин и др., 1990; Чепурнов, Чепурнова, 1985; Чепурнов, Чепурнова, Ашмарин, 1995).

Достоверно выявлено, что ТРГ при внутривенном введении провоцирует судорожные приступы у людей, больных эпилепсией или с органическими поражениями мозга. Механизмы этого возбуждения связывают с чрезмерным внутри- и внеклеточным притоком кальция, что изменяет внутриклеточный обмен и запускает ряд дополнительных каскадов. В опытах с влиянием ТРГ на модели эпилептического статуса, вызываемого дибутирил-сАМФ (db-cAMP) и этилендиаминтетраацетиловой кислотой (ЭДТА), вводимых в миндалину, ТРГ (введенный внутривенно или в мозг через 30 мин после db-сАМР/ ЭДТА в дозе 3 мг/кг) не изменял характера судорожной активности в ЭЭГ, вызванной db-cAMP!

ЭДТА, но увеличение дозы ТРГ до 25 мг/кг и 50 мг/кг приводит к значительному увеличению амплитуды ЭЭГ и поведенчески выраженным приступам. Помимо этого при введении ТРГ в дозе 50 мг/кг вслед за увеличением эпилептической активности в ЭЭГ наблюдали подавление судорожных разрядов. Эти данные К.Осоное (Osonoe, 1991) подтверждают, что ТРГ в больших дозах оказывает возбуждающее действие.

ТРГ и его стабильные аналоги ингибируют киндлинг, ПТЗ-индуцированные и глутамат-индуцированные судороги у крыс. Как и пилокрапин ТРГ может действовать на холинорецепторы, но судороги, вызываемые пилокарпином изменяют секрецию ТРГ.

ТРГ может оказывать торможение через взаимодействие с некоторыми медиаторными системами, например, с глутаматергической. Это показано в экспериментах на крысах, где ТРГ подавлял глутамат-индуцированные судороги, а также NMDA-индуцированное возбуждение у крыс в различных областях гиппокампа. Кроме того, ТРГ оказывает положительное влияние на выход дофамина, что также может оказывать тормозный эффект. И, наконец, нейропротективные и тормозные эффекты тиролиберина связывают с его влиянием на активацию протеинкиназы С.

О физиологических регуляциях в ультра малых дозах В последние годы наблюдается возрастающий интерес к феномену высокой чувствительности организма к самым разнообразным воздействиям внешней среды, сила которых мала. За такими воздействиями официально утвердилось название «факторы малой интенсивности» (Подколзин, Донцов, 1995, 1998), объединяющее их по признаку малой силы влияния на организм, что делает их практически безопасными и поэтому весьма привлекательными для использования в лечебных целях.

К сожалению, механизмы действия факторов малой интенсивности практически не изучены, поэтому, несмотря на многочисленные экспериментальные данные, у многих исследователей и практикующих врачей достоверность полученных результатов вызывает сомнения (Подколзин, Гуревич, 2002). Межклеточная и внутриклеточная химическая сигнализация является одним из основных механизмов регуляции активности всех биологических объектов (Гомазков, 1995., Ашмарин и др., 1997, 1999).

Малые дозы — это такие дозы, которые обеспечивают концентрацию биологически активного вещества в месте действия на несколько порядков ниже константы диссоциации с эффектором (Подколзин, Гуревич,2002). Если концентрация биологически активного вещества на несколько порядков ниже, чем равновесная константа диссоциации, то будет наблюдаться связывание единичных молекул биологически активных веществ с их эффектором. Это приведет к большой вариабельности наблюдаемых результатов и невозможности применения закона действующих масс для описания такого взаимодействия в силу вероятностного характера ассоциации.

После взаимодействия лиганда с рецептором, как правило, возникает целый каскад химических реакций, результирующий в клеточном ответе. Такой механизм обеспечивает проведение и усиление внутриклеточного сигнала. Показано, что существующие в клетке ферментативные системы усиления . сигнала теоретически позволяют достигать астрономических величин усиления: Ю12-Ю40.

Инактивация клеточного ответа на рецепторный сигнал обеспечивает его высокую специфичность и позволяет адаптировать клетку к изменяющимся внешним воздействиям.

После удаления эффектора ферментативная система проведения и усиления сигнала полностью восстанавливает свои свойства (Варфоломеев, Гуревич, 1999).

Существенным свойством рецепторных систем является их суперчувствительность. Это свойство проявляется в виде существенных изменений клеточного ответа на незначительные изменения концентрации добавленного лиганда.

Другое, не менее важное свойство рецепторных систем, заключается в наличии «резерва» рецепторов, то есть максимальный клеточный ответ может наблюдаться при незначительном числе связанных с лигандом рецепторов. «Резерв» рецепторов самым тесным образом связан с каскадным механизмом проведения и усиления сигнала.

Клеточный ответ может зависеть не только от связывания лиганда с определенными типами рецепторов, но и от сопряжения этих рецепторов с различными внутриклеточными мессенджерами, микроокружения рецепторов (ионная сила раствора, вязкость биомембран и т.д.), исходного состояния клетки.

Представим, что в ответ на малое воздействие в синаптическую щель выделилось небольшое количество медиатора. Сразу же после этого начался процесс диффузии медиатора к постсинаптической мембране. Однако синаптическая щель и постсинаптическая мембрана содержат ферменты, расщепляющие медиатор, а пресинаптическая мембрана - системы его обратного захвата. Таким образом, вследствие ферментативной деградации и обратного захвата может получиться так, что ни одна молекула медиатора не достигнет рецепторов на постсинаптической мембране, следовательно, эффекторный сигнал не будет передан. С другой стороны, у разных индивидуумов состояние ферментативных систем значительно варьирует, определяясь генетическими особенностями белков ферментов, наличием ингибиторов и т.д. (Варфоломеев, Гуревич, 1999). Поэтому у индивидуумов с «хорошо работающими» ферментативными системами вероятность получить ответ на воздействие малыми дозами биологически активных веществ ниже, чем у индивидуумов с «плохо работающими». То есть диффузия (отсутствие мгновенного переноса молекул биологически активных веществ от места выработки к месту действия) может явиться дополнительным фактором, влияющим на вариабельность результатов, наблюдаемых при действии малых доз.

Однако даже в тех случаях, когда процессы диффузии не оказывают влияния на вариабельность эффектов, она может наблюдаться. Это связано с отсутствием «реальной» концентрации молекул в диапазоне 10"19-10"14М и с тем, что только единичные молекулы биологически активных веществ связываются с их мишенями, то есть для описания поведения такой системы закон действующих масс не применим.

В этих условиях в 0,1-10 мл раствора содержатся единичные молекулы, поэтому трудно представить, что все они распределены равномерно, то есть что имеется «реальная» (статистическая) концентрация молекул биологически активного вещества. С одной стороны, это приводит к большим трудностям получения столь разбавленных растворов методом разведения, что заставляет многих исследователей сомневаться в достоверности полученных результатов из-за наличия чисто методических сложностей в получении сильно разбавленных растворов. С другой стороны, при действии малых доз биологически активных веществ большую роль в формировании биологического ответа начинают принимать процессы диффузии. Это связано с тем, что не все молекулы биологически активных веществ могут одновременно достигнуть клеточных эффекторов, некоторые эффекторы оказываются как бы «закрытыми», что создает определенный «резерв» этих эффекторов. Эти процессы достаточно подробно рассмотрены в работах Е.Б.Бурлаковой и др. (1990) и Wheatley (1998).

Вариабельность клеточных ответов на однотипные воздействия является принципиально важным феноменом, присущим действию биологически активных веществ в малых дозах. Это создает существенные проблемы при индивидуальном подборе доз с тем, чтобы достигнуть желаемого результата, не вызвав при этом побочных эффектов. Кроме того, вариабельность получаемых в эксперименте данных при действии биологически активных веществ в малых дозах делает подобные эксперименты плоховоспроизводимыми. В отличие от сложившейся традиции сравнения средних данных, при изучении эффектов малых доз биологически активных веществ следует сравнивать дисперсии и законы распределения параметров (Подколзин, Гуревич, 2002). •

Действие биологически активных веществ в малых дозах имеет прямое отношение к сигнальной трансдукции, механизмам синаптической пластичности, кратковременной и долговременной памяти (Подколзин, Гуревич, 2002).

Флуктуации числа лиганд-рецепторных комплексов неизбежно приведут к флуктуациям величины (интенсивности) клеточного ответа, благодаря этому на одни и те же воздействия может быть получен разный (вариабельный) ответ. При увеличении числа рецепторов и/или их аффинности будет наблюдаться уменьшение амплитуды флуктуаций, то есть образование более устойчивых (стабильных) синаптических связей, или развитию «памяти» на уровне клеточного контакта.

При анализе большого числа литературных данных можно выделить следующие виды зависимостей доза-эффект:

1. мономодальные, характеризующиеся наличием одного максимума (монофазные, для которых наблюдается стимуляция эффекта малыми дозами биологически активных веществ и выход клеточного ответа на прато при действии больших доз; бифазные, при которых "малые дозы стимулируют, а большие угнетают клеточный ответ).

2. бимодальные, для которых характерно наличие двух максимумов на зависимости доза-эффект (трехфазные - стимуляция ответа малыми дозами, угнетение средними, стимуляция и выход на плато при действии .больших доз биологически активных веществ; четырехфазные, представляющие собой «суперпозицию» двух бифазных зависимостей доза-эффект, то есть при увеличении дозы от малой к большой в начале наблюдается стимуляция клеточного ответе, потом угнетение, затем снова стимуляция, и наконец - второе угнетение).

3. полимодальные, имеющие более двух максимумов (Подколзин, Гуревич, 2002).

Традиционно в фармакологии считается, что если некоторая доза не имеет биологического эффекта, то и меньшие дозы также не будут иметь никакого биологического эффекта. Между тем, открытие би- и полимодальных зависимостей опровергает это мнение: меньшие концентрации биологически активного вещества могут иметь сравнимый эффект с большими концентрациями. Поэтому необходимо изучать эффекты биологически активных веществ во всем диапазоне концентрации, а не только в диапазоне концентраций, в котором «на первый взгляд» имеется биологический эффект.

На сегодняшний день актуальной является проблема минимальной физиологической дозы вводимого препарата и поиска новых путей их введения в организм (Бурлакова и др., 1990; Ашмарин, 1988). Это можно объяснить возросшим интересом к фармакологическим аспектам исследования регуляторных пептидов, к действию их синтетических аналогов и их лекарственных форм. Показано, что в ряду малых, сверхмалых и сравнительно высоких доз тиролиберина могут наблюдаться различные физиологические эффекты (Ashmarin et al., 1991). Содержание ТРГ в мозге значительно повышается после интраназального введения и дольше остается на высоком уровне по сравнению с внутривенным и внутрибрюшинным введением. Это позволяет использовать меньшие концентрации пептида для достижения соответствующего эффекта.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты на крысах с пентилентетразоловой моделью судорог. На взрослых самцах крыс линии Wistar и беспородных крысах (п=160) применяли модель судорожной активности, которая разработана на основании методики фармакологического киндлинга. Регистрацию динамических изменений моторной судорожной активности проводили после дробного введения пороговых доз пентилентетразола (ПТЗ), что позволяло более дифференцированно оценить чувствительность к эпилептогену. Методика имеет преимущества перед моделью одноразового введения эпилептогена (75 мг/кг), так как дробное введение ПТЗ позволяет замедлить процесс развития судорожной активности или остановить развитие процесса, если судорога достигает максимальной длительной клонико-тонической фазы уже при пороговой дозе 25 мг/кг и угрожает жизни животного. Метод исключает передозировку эпилептогена при повторных введениях в последующие экспериментальные дни с целью контроля развития киндлинга. Метод позволяет в пределах одного дня выявить индивидуальную чувствительность и судорожные пороги у каждого животного экспериментальной группы. Разработка метода была начата К.Р.Аббасовой (1997).

По протоколу опыты проводили с интервалом не менее двух суток. В первый день дробно вводили только ПТЗ - внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг каждые 15 мин, но не более трех раз. При достижении судорожной моторной активности, оцениваемой как 4-я стадия по шкале акад. Павла Мареша (ЧАН), дальнейшее введение ПТЗ прекращали. Крыс

67 распределяли по выраженности судорожного порога: формировали однородные группы животных с учетом профиля эпилептического припадка (контрольную и опытную) с максимальным ответом до 15 мин (одно введение ПТЗ) и 30 мин (2 введения ПТЗ). На второй экспериментальный день животные опытной группы получали ПТЗ + ТРГ. ТРГ вводили интраназально в объеме не более 5 мкл в каждую ноздрю. Первую аппликацию ТРГ проводили за 10 мин до введения 25 мг ПТЗ, а в последующем - одновременно с введением ПТЗ.

Животные контрольной группы всегда получали физиологический раствор в том же объеме. Третий опытный день был контрольным - вводили только ПТЗ крысам обеих групп. Протокол опыта мог быть изменен в зависимости от задачи исследования. Для наблюдения судорог крысу помещали в камеру с прозрачными пластиковыми стенками. Моторную судорожную активность измеряли по шкале П.Мареша и Г.Кубовой, представаленной в таблице. Для каждого животного строили график изменений тяжести припадка во времени (рис.1).

5 . 4 з 2

1 15 30 45 60 PTZ1 PTZ2 PTZ3

Рис. 1. Графическое выражение метода дробного введения ПТЗ в пороговых дозах по 25 мг/кг (PTZ1, PTZ2, PTZ3) По оси абсцисс - время в минутах. По оси ординат - развитие судорожного припадка в баллах. Черные столбики указывают суммарную дозу ПТЗ (доза однократного введения 25 мг/ кг).

Таблица 1.

Шкала оценки тяжести моторных судорог у крыс (в баллах).

0 Отсутствие реакции

0,5 Абнормальное поведение: длительные периоды замирания, учащение дыхания, напряжения мышц пальцев и хвоста

1 Изолированные миоклонические вздрагивания (myoclonic jerks)

2 Атипичные минимальные судороги (minimal seizures)

3 Судороги клонического типа, ограничивающиеся вздрагиванием головы и мышц туловища, «встряхивание мокрой собаки»

4 Большие судороги без тонической фазы (major seizures), судороги мышц всего тела, подъем на задние конечности - "поза кенгуру"

5 Полные большие, генерализованные тонико-клонические судороги с потерей выпрямительных рефлексов {generalized tonic-clonic seizures), с падением животного на бок

IЛ Ч Ч I Г I I I I I I I I I I I

1 4 7 101316192225283134374043 > 111111 11II1111 III

1 4 7 101316192225283134374043

1, I ■ m I . | ■ 11 I I и | | 11

4 7 101316192225283134374043 и, «.»»»■ ■ . иМШИШ

1 4 7 1013116192225283134374043

Рис. 2. Графическое выражение тяжести судорожного припадка, вызываемого ПТЗ. Момент внутрибрюшинного введения ПТЗ отмечен стрелками. По оси ординат - тяжесть приступа в баллах, по оси абсцисс — время в минутах. Слева - пример судорогу крысы с низким судорожным порогом: припадок наступает при дозе 25 мг/кг. Интервачы между опытами /-//- 2 сут., II-I1I- 18 сут., III-IV- 4 сут. Справа - пример судорог у крысы с высоким судорожным порогом (ответ на большую -суммарную дозу ПТЗ 50мг/кг и 75 мг/кг): Интервалы между опытами с применением ПТЗ I-II-8 сут., II-III-17 сут.

Пооказателями эффективности противосудорожного действия служили:

1) факты полной или частичной блокады судорожной активности,

2) индивидуальная изменчивость моторного судорожного приступа животного;

3) изменение продолжительности латентных периодов наступления реакции, в среднем в группе животных;

4) изменение числа крыс с различной тяжестью припадков, выражаемое в процентах различных стадий судорожной активности у крыс контрольной и опытной групп, (до и на фоне действия антиэпилептогена),

5) число животных, у которых на фоне исследуемого вещества полностью блокировался судорожный моторный припадок.

Введение веществ. Тиролиберин крысам вводили интраназально в концентрациях от 10 "12М до Ю^М в объеме 10 мкл в ноздрю. Использовали ТРГ в химически чистом виде и в виде препарата «Рифотироин», синтезированного П.Е.Романовским в НИИ Органического Синтеза (Рига). Дипептид cHis-Pro (NEOSYSTEM) также вводили интраназально. Внутрибрюшинно вводили: пентилентетразол (разовая доза 25мг/кг) "Sigma"; для сравнения применяли общепринятое противосудорожное средство - вальпроевую кислоту перорально в лекарственной форме Депакин (DESITIN, Germany).

Кроликам ТРГ вводили интраназально в дозе 10"9 М и 10"12М, в обе ноздри, а внутривенно (в вену уха) в дозах 25, 50,100 мкг/кг.

Аналоги вводили только крысам: cHis-Pro-NH2 и PR-546 (DHO-HisPro-NH2)-Последний имеет в составе дигидрооротовую кислоту, которая замещает глютамат. Молекулярный вес синтетического пептида 45.4 Интраназальное введение осуществляли одному и тому же животному по методу убывающих концентраций: 10"9 М, Ю"10 М, 10"12 М. Электрофизиологические исследования судорожной активности Электрофизиологические исследования проводили с помощью 4-х канальной усилительной системы с компьютерным анализом ЭЭГ - "CONAN" А.П.Кулаичева. Система является интегрированным аппаратно-программным комплексом, она позволяет визуально исследовать запись, вычислять амплитудно-частотные характеристики (вычисление спектра ч текущей эпохи по методу быстрого преобразования Фурье). Регистрацию суммарной электрической активности мозга проводили биполярно с помощью нихромовых электродов диаметром 75 мкм, расстояние между кончиками 0.5 мм), которые вводили в лобный отдел коры по общепринятой методике, стереотаксическим координатам атласа мозга крысы

Е.Фифковой и Дж.Маршалла. Электрическую активность в условиях свободного поведения регистрировали не ранее, чем через двое суток после операции. Инертный электрод вживляли в кости черепа. По окончании опытов проводили морфологический контроль.

Таблица 2. Координаты, используемые для введения регистрирующих электродов по атласу Е.Фифковой и Д.Маршалла (Буреш с соавт., 1962)

Структура АР L H

Cortex +2 2 1-1.5 frontalis

2 3.5 1-1.5

Cortex parietal. -6 4 1.5-2

• -3 3 1.5-2

Модель формирования эпилептического очага, вызываемого металлическим кобальтом

Кобальтовая модель была разработана на кафедре С.А.Чепурновым и

Н.Е.Чепурновой (1980) для изучения эпилептогенеза и зеркальных очагов в ядрах миндалевидного комплекса мозга кролика. .Нами использованы эти методические приемы для формирования первичного очага в зоне фронтальной коры мозга кролика и зеркального очага в симметричном участке коры противоположного полушария.

Металлический порошок атомарного кобальта помещали в стеклянную канюлю t диаметром менее 1 мм, которую вживляли в кору на глубину 2 мм. Использовали t координаты атласа С.М.Блинкова, Ф.А. Бразовской и М.В. Пуцилло (1973). Стеклянная канюля (из пирекса) находилась на уровне -6 мм от брегмы, регистрирующий монополярный никелиновый электрод диаметром 70 мкм располагали впереди канюли. В противоположное полушарие погружали симметрично другой электрод.

Операции и забор материала для последующего электронно-микроскопического анализа проводили совместно с доктором А.А.Суворовым.

Методика проведения • эксперимента на кроликах. Эксперименты с формированием первичного и зеркального очагов в коре осуществляли на кроликах обоего пола в возрасте 3.5 месяцев. Перед началом операции кролики взвешивались на электронных весах. Оперативное вмешательство выполняли в стерильных условиях под глубоким наркозом на операционном столе. Наркоз выполнялся внутривенным введением раствора нембутала в краевую вену уха из расчета 30 мг/кг. Местная анестезия производилась 0.25 % раствором новокаина. Кожу в области разреза обрабатывали 5 % спиртовым раствором иода. Кролику фиксировали задние и передние конечности марлевыми бинтами.

В области предполагаемого разреза кожи на голове изогнутыми по плоскости ножницами выстригали шерсть. Затем скальпелем делали кожный разрез по средней линии головы. Гемостаз обеспечивался тампоном, смоченным 3 % раствором перекиси водорода. Распатором освобождали кость от надкостницы. Поверхность кости обезжиривали 70 % раствором этилового спирта. Отмерялось расстояние в проекции правого полушария от срединного шва 4 мм, от брегмы +2 мм. На пересечении данных линий простым карандашом делалась отметка предполагаемого отверстия для стеклянной канюли, заполненной порошком металлическогоо кобальтом. Были введены два нихромовых электрода для регистрации на расстоянии 4 мм от срединной линии и +4 мм от брегмы, а также два индифферентных электрода на расстоянии 4 мм от срединной линии и - 8 от брегмы. Для надежного крепления в толще кости черепа был установлен винт. Данные конструкции были зафиксированы Протакрилом М. Операция продолжалась 50-60 минут.

Кролики содержались в виварии, по одному в клетке. Кормили их комбикормом.

Электрокортикограмма (ЭКГ) регистрировалась начиная с 3-х суток. По окончании эксперимента у животных забирали мозг для морфоконтроля. Под глубоким нембуталовым наркозом производили отделение спинного мозга от продолговатого по первому шейному позвонку. Затем вскрывали полость черепа, вставляли одно лезвие на расстоянии 1 мм позади отверстий, оставшихся после канюли, по плоскости лезвия наносили небольшое количество глутарового альдегида (2.5%), затем вторым лезвием делали забор серого и белого вещества толщиной 1.5 мм, глубиной 3 мм и шириной 5 мм в правом и левом полушариях, а также в лобной доле. После этого мозг доставали из черепной коробки и помещали в 10% раствор нейтрального формалина.

Взяты образцы белого вещества мозга кроликов из первичного, зеркального очагов и мозолистого тела, электронно-микроскопические исследования которых будут проводиться под руководством д.б.н. О.Н.Гайковой (кафедра нервных болезней Военно-Медицинской Академии, Санкт-Петербург).

Таблица 3 Животные, используемые в опытах.

Кролик Вес Операция по Наркоз Время в гр. вживлению «Норматон» в мин мл.

Grey-ear 3200 28.05.05 1 55

Red-ear 3200 28.05.05 1.6+0.9 60

Red tail 2900 20.06.05 1 65

154X702 3100 20.06.05 0.9 60

110X56 3200 20.06.05 1+0.8 50

108X56 2700 20.06.05 1+0.4 65

Статистическая обработка результатов. Данные представлены в форме среднее+ст.ошибка. Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием пакета статистических программ STATISTICA (StatSoft Inc, USA). Использовали точный метод Фишера, U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, парный критерий Вилкоксона, а также метод анализа вариаций (ANOVA). Уровень достоверности р<0.05 принимался за значимый.

Рис.3

Сверху: Мозг кролика, вид сверху (по П.В.Терентъеву. и др., 1952 - с изменениями). Вскрыта кора для обозначения мозолистого тела; показано положение первичного очага и регистрирующих ЭГ электродов во фронтальных отделах коры.

Внизу -фронтальный срез левого полушария, показано положение погружного электрода на уровне -б от брегмы.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Гончаров, Олег Борисович

ВЫВОДЫ

1. Подтверждено на модели генерализованной судорожной активности, вызванной хемоконвульсантами (пентилентетразол), противосудорожное действие ТРГ в

Q 11 ультрамалых дозах (от 10" М до 10- < М) при его интраназальной аппликации на слизистую носа крысы.

2. Доказана необходимость целостности молекулы трипептида ТРГ, поскольку введение его метаболита дипептида cHis-ProNH2 в тех же ультрамалых дозах и концентрациях не вызывает аналогичных противосудорожных эффектов.

3. Выявлено, что синтетический аналог ТРГ (PR-546) в дозах 10"9М, Ю"10М, 10"12М обладает слабо выраженным противосудорожным эффектом, который зависит от чувствительности животного к ПТЗ, т.е. от величины исходного судорожного порога.

4. Выявлена устойчивость к пентилентетразолу у крыс генетически модифицированной линии WAG/Rij (гомозиготных по локусу D2 Tagl - А типа в рецепторах к дофамину).

5. Показано развитие фокальной эпилепсии при одностороннем введении кобальта во фронтальный отдел неокортекса мозга кролика с формированием на третьи сутки зеркального эпилептического очага в коре противоположного полушария. На данной модели выявлено противосудорожное действие ТРГ при интраназальном введении кролику в дозах 1(Г9М и 10"12М. Преимущественно действие оказывается на зеркальный очаг и процессы межполушарной генерализации эпилептической активности.

6. Внутривенное введение ТРГ в больших дозах (25 мкг/кг) кроликам со сформированной I фокальной эпилепсией усиливает судорожную активность в неокортексе.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность за направление моего научного пути и поддержку исследований зав кафедры физиологии человека и животных академику И.П.Ашмарину, зав. кафедрой физиологии ВНД профессору В.В.Шульговскому, зав. лабораторией эволюции памяти профессору Н.А. Тушмаловой.

Благодарю за помощь в работе сотрудницу кафедры физиологии человека и животных МГУ\ к.б.н. К.Р. Аббасову, и ординатора кафедры нервных болезней Военно-Медицинской Академии (Санкт Петерубург) Александра Суворова за сотрудничество.

THE ROLE OF THYROLIBERIN IN REGULATION OF GENERALISED AND FOCAL EXPERIMENTAL EPILEPSY Oleg B. Goncharov

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение и внедрение новых иротивосудорожных препаратов нейропептидной природы остается актуальной задачей. Приходится констатировать, что несмотря на большие успехи физиологии и биохимии регуляторных нейропептидов, в неврологии отсутствуют противоэпилептические лекарства нового поколения нейропептидной природы. Фармакология новых противосудорожных средств опирается в основном на данные по изучению ГАМК-ергической и глутамат-ергической систем, прямой регуляции ионных каналов (Rogawski, 2000, Noebls, 2005). Однако каждый пятый больной сегодня страдает рефрактерной формой эпилепсий; которая не поддается лечению. Исследование механизмов противосудорожного действия нейропептидов на животных остается актуальной задачей экспериментальной эпилептологии и нейробиологии.

Нами продолжены исследования противосудорожного действия нейропептида тиролиберина при его локальных аппликациях на слизистую носа (Ашмарин и др., 2002). Введение ТРГ в ультрамалых дозах и концентрациях от 10'12 до 10"8 моль/л достоверно тормозило судорожные припадки, вызываемые пентилентетразолом. ПТЗ-тест позволяет объективно оценить торможение судорог. В опытах на крысах ТРГ при интраназальном введении вызывает увеличение латентностей отдельных фаз судорог, снижение тяжести моторных судорожных припадков или полностью их блокирует. При этом в ЭЭГ наблюдается торможение пароксизмальной - пик-волновой активности в неокортексе, гиппокампе, миндалине. Значительное увеличение дозы ТРГ (l<r*M) вызывает противоположный эффект: облегчение судорожной активности.

Внеклеточная инактивация ТРГ осуществляется специфическими энзимами, принадлежащими семейству цинк-зависимых металлопептидаз (Клуша, 1984). Известно, что в крови и тканях одним из путей метаболизма ТРГ является распад на глютамат (pGlu) и дипептид His-Pro. Метаболит ТРГ - дипептид cHis-Pro (Ю*10 моль/л, 10'8 моль/л), несмотря на возможность его связывания с рецептором ТРГ, не вызывает противосудорожных эффектов.

Молекулярно-генетические исследования рецепторов к тиролиберину показали, что именно ароматическое кольцо является местом связывания в положении Туг282 ТРГ-рецептора с His. Малые размеры молекулы ТРГ позволяют ей связываться с трансмембранным доменом ТМ6. Доказано также и другое взаимодействие в ТМ7 между Arg306 и терминальным карбоксиамидом ТРГ (Perlman et al., 1996). Следовательно PyroGlu связывается с ТРГ-рецептором в положении Туг 106 и Arg306 (см. схему строения рецептора к тиролиберину ), а возможность связывания дипептида не исключается.

Лиганд-рецепторный комплекс включает связывание ТРГ с Ilel09, Ilel 16 в НХЗ и ТугЗЮ и Ser313 в НХ7 (Laakkonen et al., 1996). Возможно ли, чтобы дипептид His-Pro, возникающий после расщепления ТРГ, самостоятельно «продолжал» его противосудорожное действие. Применение дипептида His-Pro на основании наших данных представляется менее перспективным.

Схема строения рецептора к тиролиберину по M.Gershengorn R.Osman (1996) Предполагаемая двуразмерная топология рецептора к ТРГ на мембране клетки мозга мыши. Аминокислоты пронумерованы предположительно, начиная с первой позиции в NH2 терминальном конце. Структура мембраны дана серым цветом. NH2 конец и три экстраклеточных петли расположены сверху; три внутриклеточных петли и СООН конец раположены внизу. Топология основана на анализе 39 последовательностей G-протеин-связанных рецепторов с агонистами пептида.

Полученные факты противосудорожной эффективности тиролиберина в ультрамалых дозах требуют объяснения, как с позиции петид-рецепторного взаимодействия, так и по другим причинам.

Исследования и теоретические разработки в области физиологии и биохимии ультрамалых доз биологически активных веществ позволили предположить феномен физиологической мультипликации эффекта при вовлечении в ответ популяции нейронов. Расчеты показывают, что при ультрамалых дозах реальное количество вводимого нейропептида чрезвычайно мало (пикограммы). При эндоназальной аппликации ТРГ важно оценить, какое минимальное экзогенно вводимое количество нейропептида становится эффективным. И.П.Ашмарин, Е.П. Каразеева и Т.В.Лелекова (1999) приводят данные, что при уровне концентраций в крови и ликворе в 200-250 10"12 моль/л приращение концентраций при экзогенном введении ТРГ в 10"12 моль/л равно 0.002 - 0.0002. Но и в этом случае наблюдаются мембранные эффекты ТРГ на клетках лимфатических сосудов, клетках печени при действии ТРГ в концентрациях от 10"4 до Ю"18 моль/л. Эти расчеты подтверждают и обнаруженную нами эффективность эндоназального применения ТРГ в концентрации 10"12М. Дополнительным подтверждением высказанных положений являются эндогенные изменения содержания ТРГ в ультрамалых дозах в структурах мозга в результате серии судорожных припадков. Содержание ТРГ повышается более чем в два раза в структурах мозга (гиппокампе,' миндалине, энторинальной коре),-а содержание предшественника ТРГ (TRH-Gly) может увеличиваться в 30 раз (Satin, Pekary, 1995). Локализованное введение ТРГ, обеспечивающее его поступление в обонятельную луковицу и структуры лимбической системы, позволяет предположить включение аналогичных защитных механизмов, которые по данным R.Post и S.Weiss (1994) начинаются значительно раньше - с включения ранних генов (c-fos). На примере электрического киндлинга миндалины эти процессы хорошо изучены. C-fos, кодирующий Fos-белок, взаимодействуя с другими факторами транскрипции белка и с FRAS (fos-связанный антиген), вновь мигрирует в ядро нейрона, связывается с AP-I сайтом ДНК. Это событие индуцирует транскрипцию других генов рецепторов, регуляторных генов, генов ростовых факторов. Однонаправленно в ответ на повышение возбудимости при киндлинге меняется программа клеточного ответа. Теперь судьба нейрона, стимулируемого электрическим током или синаптически -в системе лимбических кругов, зависит от пространственно - временной экспрессии генов предшественников различных пептидов. В ответной реакции просматривается две тенденции регуляций, а именно: индукция секреции про- и противоэпилептических пептидов. Это соотношение, по мнению R.Post и S.Weiss (1994), не только объясняет патологические механизмы эпилептизации, но и развитие механизмов потери эффективности противосудорожных средств. Доказательства этих механизмов в отношении ТРГ были представлены J.Rosen (1992) при киндлинге миндалины (экспрессию ТРГ предшественников наблюдали в зубчатой извилине гиппокампа, пириформной коре). Однако эта собственная защита мозга «срывается» через две недели полного развития киндлинга, когда все еще наблюдается повышенная секреция энкефалина (Rosen Abramovitz,1993). Повышение уровня энкефалина и соматостатина следует за импульсным выбросом кортиколиберина. Локализация его в гипоталамических клетках и именно в гиппокампе является стратегическим событием. Так, в развивающемся мозге и отсутствии рецепторов к ГАМК, увеличение экспрессии рецепторов к кортиколиберину связано с периодом повышенной чувствительности к проэпилептическим агентам. Секреция кортиколиберина нейронами миндалины и гиппокампа создает условия повышенной возбудимости в лимбических нервных кругах. Представленные в работе

I • данные являются еще одним нейрохимическим доказательством плодотворности концепции акадамика Г.Н.Крыжановского о роли проэпилептической и антиэпилептической систем мозга.

Механизм противосудорожных эффектов ТРГ при интраназальной локальной аппликации нуждается в дополнительном изучении. Аппликация ТРГ в ультрамалых дозах на слизистую носа может по И.П.Ашмарину индуцировать физиологическую реакцию малыми концентрациями сигнальных молекул посредством нейронов «первого порядка» с последующей передачей уже нервных сигналов на «собирательные нейроны высших порядков». В наших опытах к нейронам' первого порядка можно отнести обонятельные клетки и нейроны прилежащих структур (древней коры на пути распространения сигнальных молекул ТРГ в лимфотоке). При этом следует подчеркнуть, что усиление лимфотока под влиянием ТРГ, открытое Т.В.Лелековой, будет способствовать его распространению. К нейронам высшегсГ порядка следует отнести нейроны лимбической системы (пириформная кора, миндалина, вентральный гиппокамп), вовлеченные в совозбуждение лимбических нервных кругов. Именно в этом случае происходит секреция ТРГ как защитная реакция мозга на развитие судорожного процесса.

Схема И.П.Ашмарина (2003), объясняющая физиологические эффекты нейропептидов в ультрамалых дозах при интраназальной аппликации (с изменениями).

Схема показывает индукцию физиологического ответа малыми концентрациями сигнальных молекул посредством возбуждения единичных нейронов первого порядка (nl) с последующей передачей сигнала на «собирательные» нейроны высших порядков (nil nlll).

Дальнейшие события развиваются по "неврологическому сценарию" вовлечения либо про-эпнлептической, либо анти-эпилептической систем мозга. Исследования последних лет подтверждают, что ключевой для про-эпилептической системы является секреция кортиколиберина и опиатных пептидов, а для противосудорожной системы -секреция ТРГ. Это только запускает механизмы секреции эндогенного - синаптического ТРГ и выделение эндогенного ТРГ в ликвор, что выявлено приямыми измерениями ТРГ при эпилептических приступах, причем, как мы уже отмечали, увеличивается содержание предшественника ТРГ (TRH-Gly) в 30 раз (Satin, Pekary, Lloyd, 1995).

Однако эта собственная защита мозга «срывается» через две недели полного развития киндлинга, так как продолжается повышенная секреция энкефалина (Satin et al., 1995). Эндогенная секреция ТРГ снижает предрасположенность и генерализацию судорожных процессов в мозгу. Ряд фактов говорит за его эффективность: 1) в ядрах мозга имеется высокая плотность рецепторов к ТРГ; 2) доказано синаптическое выделение ТРГ непосредственно в ликвор, в частности нейронами PVN гипоталамуса; 3) in vitro на срезах гиппокампа мозга крыс ТРГ может также модулировать ответ NMDA рецепторов; 4) антигипоксические свойства ТРГ обнаружены И.Г.Власовой при системном введении ТРГ (Власова и др., 1994). При уровне концентраций в крови и ликворе 200-250 10"12 моль/л приращение концентраций при экзогенном введении ТРГ в 10~12 моль/л равно 0.002

0.0002.(Ашмарин и др., 1999).

Расчеты подтверждают обнаруженную нами эффективность интраназального применения ТРГ в концентрации 10"12 моль/л. Но и при меньших дозах ТРГ Н.П.Пальминой и Н.Г.Богдановой, выявлены мембранные эффекты на клетках печени при действии ТРГ в концентрациях до 10"18 моль/л (изменяется вязкость липидного бислоя на поверхности мембраны эндоплазматического ретикулума печени мыши) (Жерновков и др., 2002, Пальмина и др., 2005). Последняя публикация Н.П.Пальминой и В.Е.Жерновкова (2005) носит, с нашей точки зрения, исключительно перспективное название: «Модификация структуры биологических мембран как один из механизмов противосудорожного действия тиротропин рилизинг гормона в низких концентрациях». Наблюдаемые изменения в структуре приповерхностных областей липидов, индуцируемые ТРГ, по-видимому, являются существенными для проявления его физиологической активности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гончаров, Олег Борисович, Москва

1. Ашмарин L1.П., Кулаичев А.П., Чепурнов С.А. Каскадные однонаправленные регуляторные процессы, осуществляемые короткоживущими пептидами (Тиролиберин). //Физиол. журн. СССР. 1989. Т.75: С.627-632.

2. Ашмарин И.II, Гаврюшов В.Ю., Иониди В.Ю., Ефимов М.С., Дуленков А.Б., Чепурнова Н.Е., Чепурнов С.А. Тиролиберин нормализует мозговое кровообращение и рОг у новорожденных. //ДАН СССР. Т.312: С.241-244. 1990.

3. Ашмарин И.П., Гусева А.А. и др. Тиролиберин, новые физиологические эффекты и перспективы применения. //Вестник РАМН, 1992. № 6. С.40-44.

4. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Стукалов П.В. Биохимические пути в исследовании механизмов психических и нервных болезней. // Нейрохимия. М. С.430-435. 1996.

5. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Лелекова Т.В. К вопросу о развитии проблемы эффективности сверхмалых доз биологически активных соединений. //Росс. Хим. Журн. Т.53: С.21-28. 1999.

6. Ашмарин И.II., Асанова Л.М., Аббасова К.Р., Чепурнова Н.Е. и др. Нейропептид тиролиберин противосудорожная защита мозга в сверхмалых дозах. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43. № 3. С.324-327.

7. Бердиев Р.К, ван Луителаар Ж., Купен А., Чепурнова Н.Е., Чепурнов С.А. Роль холинергических механизмов в развитии генетически обусловленной абсансной эпилепсии у крыс // Архив клинической и экспериментальной медицины. 2001. Т. 10(2). С.125-126.

8. Бердиев Р.К.,.Чепуриов С.А, Чепурнова Н.Е., Ван Луителаар Ж. Холинергические механизмы в патогенезе генетически обусловленной абсансной эпилепсии // Успехи физиологических наук. 2003. Том 34. № 1. с.28-35.

9. Богданов Н.Н. Значение интегральных подходов в поиске предикторов и изучение механизмов возникновения и развития эпилепсии. //Успехи физиол. наук. 1997. Т.28. №2. С. 28-35).

10. Блинков С.М, Бразовская Ф.А., Пуцилло М.В. Атлас мозга кролика М., 1973.

11. Буреш Я., Петранъ М., Захар И. Электрофизиологические методы исследования. -1962. М.: Ин. лит.

12. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. //М. «Высшая школа». 1991.

13. Воронина Т.А. Фармакология современных противосудорожных средств. // в кн.: Антиконвульсанты в психиатрической и неврологической практике. М.: Мединформ Агентство. 1994. С. 3-30.

14. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Худяков И.В. Воздействие химических агентов в сверхмалых дозах на биологические объекты. //Докл. АН СССР. Сер. Биол. 1990. №2 С.379-380.

15. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г., Гачок И.В., Белова А.Б., Каменская Э.О. 1999. Химические основы биологических процессов. ИМ.: Изд-во химического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова 191с.

16. Власова И.Г, Чепурнова Н.Е., Чепуриов С.А., Ашмарин И.П. Об антигипоксических свойствах тиролиберина. //Физиология человека. 1994. Т.20. №6 С. 118-123.

17. Воронина Т.А. Фармакология современных противосудорожных средств. Антиконвульсанты в психиатрической и неврологической практике. //М. Мединфо Агентство. 1994. С.5-30.

18. Гомазков О.А. Физиологически активные пептиды. Справочное руководство. //М. С.143. 1995.

19. Гончаров О.Б., Ретинская О.М. и др. Противосудоржная защита мозга нейропептидами и поликарбоновыми кислотами .М «Ломоносов — 2000» тезисы, МГУ. 2000 с.

20. Гусев Е.И., Бурд Г.С. Эпилепсия 1994.

21. В.Е. Жерновков, Н.Г. Богданова, Н.П. Пальмина Структурные изменения в мембранах эндоплазматического ретикулума при воздействии сверхмалых доз тиролиберина in vitro, Биологические мембраны, 2005, том 22 №5 с. 388-395.

22. Зенков Л. Р. Клиническая эпилептология (с элементами нейрофизиологии). //М.: ООО Медицинское Информационное Агентство. 2002. 415с.

23. Зенков Л. Р. Клиническая электроэнцефалография с элементами эпилептологии. 1996 Изд во Таганрогского радио техн. ун-та. 357 с.

24. Инюшкин А.Н., Меркулова НА., Чепурнов С.А. Комплекс пре-Бетцингера участвует в реализации эффектов ТРГ на дыхание. //Росс. Физиол. Журн. 84: С.285-292. 1998.

25. Кабанова Н.П., Чепурнова Н.Е. Изменение электрической проводимости кожи у крыс при однократном введении тиролиберина. Методы и технические средства рефлексотерапии и диагностики. //Тверь. 1991. С.64-68.

26. Каменский А.А, Титов С.А., Чепурнов С.А.,. Чепурнова Н.Е. Нервно-психические заболевания // В книге:Патологическая физиология и биохимия. Учебное пособие для вузов. Коллектив авторов. / (Глава 8. С. 202-272) М., Издательство «Экзамен». 2005. - 480.

27. Карлов В.А. Эпилепсия. //М. Медицина. 1990.

28. Карлов В.А. Судорожный эпистатус. //М. 2003.

29. Клуша В.Е. Пептиды регуляторы функций мозга. // Рига. 1984.

30. Крыжановский Г.Н. Детерминантные структуры в патологии нервной системы. М.: Медицина. 1980. 358с.

31. Крыжановский Г.Н., Глебов Р.Н. Пептиды мозга и эпилептическая активность. // Журн. Невропатологии и Психиатрии. 1983. - Т.83. №6. - С. 918-1025.

32. Крыэ/сановский Г.Н., Шандра А.А., Годлевский Л.С. и др. Антиэпилептическая система. //Успехи физиол. наук. 1992. Т.23. №3. С.53-57.

33. Крушинский Л. В. Формирование поведения животных в норме и патологии. М.: Изд-во Моек ун-та. 1960.

34. Кузнецова Г.Д., Спиридонов A.M. Картирование спайк-волновых разрядов у крыс линии WAG/Rij (генетическая линия с эпилепсией типа абсанс). //Журн. Высш. Нерв. деят. Т.48. С.664-670. 1998.

35. Лелекова Т.В., Романовский ПЛ., Александров П.Н, Ашмарин И.П. 1989. Действие фемто- и пикомолярных концентраций тиролиберина и тафцина на сократительную активность лимфатических сосудов брыжейки крысы. //Бюлл. эксп. биол. и мед. Т.108. № 7. С.8-10.

36. Лелекова Т.В., СанжиеваЛ.Ц. Роль адренорецепторов в механизме действия тиролиберина на лимфатические сосуды. Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. №1. С. 32-39.

37. Лелекова Т.В., . Санжиева Л.Ц., Ашмарин И.П. Сократимость лимфососудов -пептидная регуляция. Рос. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 8. С. 496.

38. Майковский Е. Взаимодействие противоэпилептических и непротивоопилептических препаратов// Вестник новых медицинский технологий 1999 том. 6 №3-4 с. 108-112.

39. Мукииби Нозмо Ф.Б. Электрофизиологический анализ феномена "раскачки" при стимуляции миндалины мозга крыс. //Автореф. канд. дисс. МГУ. М. 1986.

40. Пенфильд У., Джаспер Г. Эпилепсия и функциональная анатомия головного мозга человека.//М. 408с. 1958.

41. Подколзин А.А., Донцов В.И. «Факторы малой интенсивности»: Новый эффективный и безопасный подход к биологической активации организма. // Ежегодник Национального геронтологического центра1998. С.64-73.

42. Подколзин А.А., Донцов В.И. Факторы малой интенсивности в биоактивации и иммунокоррекции. //М.: Панас-Аэро1995. 200с.

43. Подколзин А.А., Гуревич КГ. 2. Действие биологически активных веществ в малых дозах. //М. Изд-во КМК 200170с.

44. Попомаренко А.А., Чепурнова Н.Е., Чепурнов С.А., Хаас Г.Л. Гиппокампальные риппл-осцилляции (200 Гц) в механизмах консолидации памяти // Успехи физиологических наук. 2002. Том. 33. № 4. С. 34-42.

45. Саркисова К.Ю., Куликов М.А., Шацкова А.Б. Тревожны ли крысы линии Wag/Rij с генетической аЬзепсе-эпилепсией? Журнал высшей нервной деятельности, 2005, том 55, №2, с. 253-261.

46. Толмасская Э.С., Неробкова Л.Н., Щебланов В.Ю. Успехи физиологических наук. 1980. Т.11, №4. С 99- 110.

47. Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е. 1982 Миндалевидный комплекс мозга Изд Моск. Ун-та 1982.

48. Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е., Аишарин И.П. Нейропептиды (тиролиберин и тахикинины) в ультрамалых дозах как предшественники лекарственных противосудорожных средств. //Человек и лекарство. 1995. М. С.108.

49. Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е., Аббасова К.Р., Смирнова М.П. Нейропептид галанин и судорожные реакции развивающегося мозга. //Успехи физиол. наук. 1997. Т.28. № 2. С.3-19.

50. Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е. Нейробиологические основы эпилептогенеза развивающегося мозга.//Успехи физиол. наук, Т.З.№28 С.3-62. 1997.

51. Чепурнова НЕ., Попомаренко А.А., Чепурнов С.А. Пептидергические механизмы экспериментальных фебрильных судорог в раннем постнатальном онтогенезе: роль

52. AVP и РАС АР. // Росс. Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. .2001. Том. 85. №2. С. 217-226.

53. Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е., Аббасова К.Р., Гончаров О.Б. Нейропептид тиролиберин эндогенная "противосудорожная защита мозга. //Успехи физиол. наук. 2002. Т.ЗЗ. № 1. С.29-39.

54. Чепурнов С,А„Чепурнова Н.Е., Аббасова К.Р, Гончаров О.Б. Нейропептид тиролиберин эндогенная противосудорожная защита мозга // Успехи физиол. наук. 2002. Т. 33. № 1. С. 29-39.

55. Amano S., Ihara N, Uemura S., Yokoyama M., Ikeda M., Serikawa Т., Sasahara M., Kataoka II., llayase Y., Hazama F., Development of a novel rat mutant with spontaneous limbic-like seizures. //Am. J. Pathol. V.49: P.329-336. 1996.

56. Analysis of the electrical activity of the brain (Eds. F.Angeleri, S.Butler, S.Giaquinto, J.Majkowski) John Wiley & Sons 1997 356p.

57. Arle J.E., Simon R.H. (1990) An application of fractal dimention to the detection of transients in the electroencephalogram. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 75:296305.

58. Ashmarin I.P., Asanova L.M., Chepurnova N.E. et al. Neuropeptides in the ultra low doses (Physiological bases for clinical application in Epilepsy) //Absrt. 21 Intern. Epilepsy Congr. Sydney. //Epilepsia. 1995. V.36. Suppl.3. P.44.

59. Banerji A, Prasad C. In vivo autoregulation of rat adenohypophyseal thyrotropin-releasing hormone receptor. //Life Sci. 1982. V.30: P.2293-2299.

60. Baram Т., Hatalski C.G. Neuropeptide-mediated excitability: a key triggering mechanisms of seizures generation in developing brain. //TINS V.21(ll): P.471-476. 1998.

61. Battaini F, Pcterkofsky A. Histidyl-proline diketopiperasizine, an endogenous brain peptide that inhibits (Na+ + K+)-ATPase. //Biochem. Biophys. Res. Commun, 1980. V.94: P.240-247.

62. Begely D.J., Chain D.G. Clearance of glutamic acid, glutamine and pyroglutamic acid from the cerebrospinal fluid of the rabbit; a comparison with TRH. //J. Physiol (L). V.320: P.22-23. 1982.

63. Biagini G., Avoli M, Mareinkiewicz J., Marcinkiewicz M. Brain-derived neurotrophic factor superinduction parallels anti-epileptic-neuroprotective treatment in the pilocarpine epilepsy model. //J Neurochem. 2001 V.76. №6. P.1814-1822.

64. Boroni F., Pizzi M., Moratis C. et al. TRH prevents excitotoxic insult in brain slices and primary cultures. //Soc. Neurosci. Abstr. 1997. V.897: P.2300.

65. Broberger C\, McCormiek D.A. Excitatory effects of thyrotropin-releasing hormone in the thalamus. //J Neurosci. 2005. V.25(7): P. 1664-1673.

66. Browning R.A. Neuroanatomical localisation of structures responsible for seizures in the GEPR: lesion studies. //Life Sci. V.39: P.857-867. 1986.

67. Browning R.A. Role of the brain-stem reticular formation in tonic-clonic seizures: lesions and pharmacological studies. //Fed. Proc. V.44: P.2425-2431. 1985.

68. Burt D.R., Snyder S.H. Thyrotropin releasing hormone (TRH): apparent receptor binding in rat brain membranes. //Brain Res. 1975. V.93: P.309-328.

69. Burt D.R., Taylor R.L. Binding sites for thyrotropin-releasing hormone in sheep nucleus accumbens resemble pituitary receptors. //Endocrinology. 1980. V.106: P.1416-1423.

70. Cha B.H., Silveira D.C., Liu X., Ни Y., Holmes G.L. Effect of topiramate following recurrent and prolonged seizures during early development. //Epilepsy Res. 2000. V.51. №3. P.217-232.

71. Chepurnov S.A. Psychomotor seizures and limbic circuits of the brain. //(The patophysiology of predisposition). //In: International society for pathophysiology. Moscow. 1991. P. 18.

72. Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., Kabanova N.P. et al. Normalization of peripheral vegetative reflexes by tachikinins (neurokinin, kassinin) and galanin during motor seizures. //Neuropeptides. 1994. V.26. Suppl.l. P.52.

73. Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., Jin Kyu Park, et al. //Korean Ginseng Science. V. 18: P.165-174. 1994.

74. Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., Asanova L.M., Ashmarin I.P Anticonvulsant neuropeptide TRH adaptive endogenous defence of brain. Treatment for epilepsy in chidhood. //Epileptologia (Warsaw). V.7 (Supp 1.): P.86-87. 1999.

75. Coenen A.ML., Blezer E.M.H., Van Luijtelaar E.L.J.M. Effects of the GABA-reuptake inhibitor tiagabine on electroencephalogram, spike-wave discharges and behaviour, in WAG/Rij rats. //Epilepsy Res. V.21: P.89-94. 1995.

76. Coenen A.M.L., Drinkenburg W.H.I.M., Inoue M., Van Luijtelaar E.L.J.M., Genetic models of absence epilepsy, with emphasis on the WAG/Rij strain of rats.//Epilepsy Res. V.12: P.75-86. 1992.

77. Coenen A.M.L., Stephens D.N., Van Luijtelaar E.L.J.M. Effects of the (3-carboline abecarnil on epileptic activity, EEG, sleep and behaviour of rats //Pharmacol. Biochem. and Behav. V.42: P.401-405. 1992.

78. Coenen, A.M.L., Van Luijtelaar, E.L.J.M. The WAG/Rij model for generalized absence epilepsy: age and sex factors. //Epilepsy Research.V. 1: P.297-301. 1987.

79. De Giorgio CM, Altman K, Hamilton-Byrd E. et al. Lidocaine in refractory status epilepticus: confirmation of efficacy with continuous EEG monitoring. //Epilepsia. 1992. V.33: P.913—916.

80. Drago F., Grassi M., Valerio C. et al. Behavioural changes induced by thyrotropin-releasing hormone analogue, RGH 2202. //Peptides. 1991. V.12: P. 1309-1313.

81. Duhe C., Boyet S., Marescaux C., Nehlig A. Progressive metabolic changes underlying the chronic reorganization of brain circuits. //J. Neurosci. 2000. V.21. №10. P.3593-3599.

82. Duhe C., Chen K., Eghbal-Ahmadi M. et al. Prolonged febrile seizures in the immature rat model enhance hippocampal excitability long term. //Ann. Neurol. 2000. V.47: P.336-344.

83. Engel J Jr. Inhibitory mechanisms of epileptic seizure generation //In: Fahn S., Hallett M., Liiders И.О., Marsden C.D. Advances in neurology. Philadelphia. Lippincott-Raven Publishers. 1995. Vol. 67.

84. Engler D„ Chad D., Jackson I.M. Thyrotropin-releasing hormone in the pancreas and brain of the rat is regulated by central noradrenergic and dophaminergic pathways. //J. Clin. Invest. 1982. V.69: P. 1310-1320.

85. Flohe L., Bauer K., Friderichs E. et al. Biological effects of degradation-stabilized TRII analogues. //In: Thyrotropin-releasing hormone (Griffits E.C., Bennett G.W., Eds) Raven press. N.Y. 1983. P.327-340.

86. Francis J., Jugloff D.G., Mingo N.S. et al. Kainic acid induced generalized seizures alter the regional hippocampal expression of the rat Kv4.2 potassium channel gene. //Neurosci. Lett. 1997. V.232: P.91-94.

87. Frey H.H., Loescher IV, Reiche R., Schultz D. Anticonvulsant potency of common antiepileptic drugs in the gerbil. //Pharmacology. V.27: P.330-335. 1983.

88. Frey IV. H. II Intranasal delivery. Bypassing the blood-brain barrier to deliver therapeutical agents to the brain and spinal cord. //Drug Delivery Technology. 2002 V.2. № 5. P.46-49.

89. Fukusumi S., Ogi K., Onda //., Hinuma S. Distribution of thyrotropin-releasing hormone receptor mRNA in rat peripheral tissues. //Regul. Pept. 1995. V.57: P.115-121.

90. Gale K. Chemoconvulsant seizures: advantages of focally-evoked seizures models. // Ital. J. Neurol. Sci. 1995. V.16: P.17-25.

91. Gasior M, Ungard J.T., Within J.M. Preclinical evaluation of newly approved and potential antiepileptic drugs against cocaine-induced seizures. //J.Pharmacol. Exp. Ther. 1999. V.290. № 3. P.l 148-1156.

92. Graig R.C., Colasanti K.B. A study of Pentylenetetrazol kindling in rats and mice. //Pharmacology Biochemistry and behaviour. V.31: P.867-870. 1989.

93. Grijfiths E.G., Webster V.A. Thyrotropin releasing hormone and its metabolites as modulators of CNS activity. //Lancet. 1981. V.l 1: P.834-835.

94. Gullemin R. The expending significance of hypothalamic peptides, or is endocrinology a branch of neuroendocrinoloigy. //Recent. Prog. Horm. Res. 1977. V.33: P.1-20.

95. Harkness D.H., Brownjield M.S. A thyrotropin-releasing hormone-containing system in the rat dorsal horn separate from serotonin. //Brain Res. 1986 V.384: P.323-333.

96. Harkness D.H., Brownfield M.S. Segmental distribution of thyrotropin releasing hormone in rat spinal cord. //Brain Res. Bull. 1986 V.17: P.l 1-19.

97. Heal D.J., Stoodley N., Elliott J.M. et al. Behavioural and biochemical evidence for the release of noradrenaline in mouse brain by TRH and some of its biologically stable analogues. //Neuropharmacology. 1987. V.26: P.313-322.

98. Hennies H.H., Flohe L. Effects of the thyroliberin analogue CG 3703 on noradrenergic and serotoninergic transmission in rodents. //Biochem. Pharmacol. 1982. V.31: P.2430-2432.

99. Higuchi Т., Yamazaki A., Ukai Y. et al. NS, a TRH analogue, increases extracelluar dopamine in the striatum of freely moving rat brain: A microdialysis study. //Jpn. J. Pharmacol. 1991. V.55. Suppl. 1: P.356.

100. Hokfelt Т., Fiixe К., Johansson О. et al. Distribution of thyrotropin-releasing hormone (TRH) in the central nervous system as revealed with immunohistochemistry. // Eur. J. Pharmacol. 1975. V.34: P.389-392.

101. Horst W.D., Spirt N. A possible mechanism for the anti-depressant activity of thyrotropin releasing hormone.// Life Sci. 1974. V.15: P. 1073-1082.

102. Hort J., Brozek G., Komarek V., Langmeier M., Mares P. Interstrain differences in cognitive functions in rats in relation to status epilepticus. //Behav. Brain Res. 2000. V.112: P.77-83.

103. Hosford D.A. Models of primary generalized epilepsy. //Curr. Opin. Neurol. V.2: P.121-125. 1995.

104. Inanaga A., Kumashiro II., Fukuyama Y., Ohtahara S., Shirouzu M. Clinical study of oral administration of DN-1417, a TRH analog in patient with interictal epilepsy. //Epilepsia. V.30: P.438-445. 1989.

105. Imaizuma K., Nakao Т., Mutant stocks, strain El. //Mous News Letter. V.31: P.57. 1964.

106. Itoh Y„ Sugimoto t., Ukai Y. et al. Permeability of a TRH analog, NS-3(CG3703), into the rat cerebral cortex, as studied by microdialysis. //Jpn. J. Pharmacol. 1995. V.67. Suppl.l: P.308.

107. Itoh Y., Yamazaki A., Ukai Y. et al. Enhancement of brain noradrenaline and dopamine turnover by thyrotropin-releasing hormone and its analogue NS-3 in mice and rats.// Pharmacol. Toxicol. 1996. V.78: P.421-428.

108. Jackson I.M.D., Reichlin S. Thyrotropin-releasing hormone (TRH): Distribution in hypothalamic and extrahypotalamic brain tissues of mammalian and submammalian chordates.//Endocrinology. 1974. V.95: P.854-862. 1979.

109. Jackson I. Thyrotropin-releasing hormone. //New Engl. J. Med. 1982. V.306: P. 145155.

110. Jaworska-Feil /,., Turchan J., Przewlocka B. et al. Effects of Pentylenetetrazole-induced kindling on thyrotropin-releasing hormone biosynthesis and receptors in rat brain. //Neurosci. 1999. V.90: P.695-704.

111. Jaworska-Feil L., Turchan J., Przewlocka B. et al. Effects of pilocarpine- and kainite-induced seizures on thyrotropin-releasing hormone biosynthesis and receptors in the rat brain.// J. Neural Transm. 1999. V.106: P.395-407.

112. Jaworska-Feil L, Kajta M, Budziszewska B, Leskiewicz M, Lason W. Protective effects of TRH and its stable analogue, RGH-2202, on kainate-induced seizures and neurotoxicity in rodents. //Epilepsy Res. 2001. V.43(l): P.67-73.

113. Kalivas P.W., Horita A. Thyrotropin-releasing hormone: neurogenesis of actions in the pentobarbital narcotized rat. //J. Pharmacol. Exp. Ther. 1980. V.212: P.203-210.

114. Kalivas P.W., Simasko S.M., Horita A. Effect of septohippocampal lesions on thyrotropin releasing hormone antagonism of pentobarbital narcosis. //Brain Res. 1981. V.222: P.253-265.

115. Kasparov S., Pawelzik H„ Zieglgansberger W. Thyrotropin releasing hormone enhances excitatory postsynaptic potentials in neocortical neurons of the rat in vitro. //Brain Res. 1994. V.656: P.229-235.

116. Kinoshita K., Fujitsuka Т., Yamamura T. et al. Effects of TA-0910, a novel orally active thyrotropin-releasing hormone analog, on the gait of ataxic animals. //Eur. J. Pharmacol. 1995. V.274: P.65-72.

117. Kinoshita K., Yamamura M, Sugihara J. et al Taltirelin hydrate (TA-0910): An orally active thyrotropine-releasing hormone mimetic agent with multiple actions. //CNS Drug Rev. 1998. V.4: P.25-41.

118. Knake S., Rasenow F., Vescovi M. et al. The Status Epilepticus Study Group Hessen (SESGH). Incidence of status epilepticus in adult in Germany: a prospective population-based study. //Epilepsia. 2001.V.42: P.714-718.

119. Knoblach S.M., Kubek M.J. Changes in thyrotropin-releasing hormone levels in hippocampal subregions induced by a model of human temporal lobe epilepsy: effect of partial and complete kindling. //Neurosci. 1997. V.76: P.97-104.

120. Knoblach S.M., Kubek M.J. Increases in thyrotropin-releasing hormone messenger RNA expression induced by a model of human temporal lobe epilepsy: effects of partial and complete kindling. //Neurosci. 1997. V.76: P.85-95.

121. Koenig M.L., Yourick D.L., Meyerhoff J.L. Thyrotropin-releasing hormone (TRH) attenuates glutamate-stimulated increases in calcium in primary neuronal cultures. //Brain Res. 1996. V.730: P. 143-149.

122. Kubek M.J., Garg, B. Thyrotropin-Releasing Hormone in the Treatment of Intractable Epilepsy. //Pediatric Neurology. 2002.V.26: P.9-17.

123. Kubek M.J., Knoblach S.M., Sharif N. A. et al Thyrotropin-releasing hormone gene expression and receptors are differentially modified in limbic foci by seizures. //Ann. Neurol. 1993. V.33: P.70-76.

124. Kubek M.J., Meyerhoff J.L., Hill T.G. et al. Effects of subconvulsive and repeated electroconvulsive shock on thyrotropin-releasing hormone in rat brain. //Life Sci. 1985. V.36: P.315-320.

125. Kubek M.J., Sattin A. Effects of electroconvulsive shock on the content of thyrotropin-releasing hormone in rat brain. //Life Sci. 1984. V.34: P.l 149-1152.

126. Kuznetzova G., Coenen A., Chepurnov S., van Luijtelaar G. Eds. The WAG/Rij rat model of absence epilepsy. //NICI. The Netherlands. 139 p. 2000.

127. Leehan R.M., Jackson l.M. Immunohistochemical localization of thyrotropin-releasing hormone in the rat hypothalamus and pituitary. //Endocrinilogy. 1982. V.l 11: P.55-65.

128. Leite J.P., Garcia-Cairasco N., Cavalheiro E.A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. //Epilepsy Res. 2002. V.50. № 1-2. P.93-103.

129. Leung Y., Guansing A.R., Aslouni K. et al. The effect of hypoglycemia on hypothalamic TRH in rat. //Endocrinology. 1975. V.97: P.380-384.

130. Loescher W, Ebert U. Experimental models for Intractable epilepsy. //In: Svien I. Johannessen, Gram L., Sillanpaa M., Tomson T. (Eds), Intractable Epilepsy. Petersfield, Hampshire. P.53-71. 1995.

131. Loescher W. Genetic animal models of epilepsy. //In: Driscoll P. (Ed.) Genetically Defined Animal Models of Neurobehavioral dysfunctions. Birkhauser. Boston. P.l 11135. 1992.

132. Majkowski J. Interaction between new and old generation of antiepileptic drugs. //Epileptologia (Warszawa). 1994. V.2. Suppl. 1. P.33-42.

133. Marescaux C„ Micheletti G„ Vergnes M., Depaulis A., Rumbach L., Warter J.M. A model of chronic spontaneous petit mal-like seizures in the rat: comparison with pentylenetetrazol-induced seizures. //Epilepsia. V.25: P.326-331. 1984.

134. Matsumoto A., Kumagai Т., Takeuchi Т., Migazaki Sh, Watanabe К Factors influencing effectiveness of TRH for severe epilepsy in childhood: significance of serum prolactine levels. //Epilepsia. V.30: P.45-49. 1989.

135. Maxon S.C., Fine M.D., Ginsburg B.E., Koniecki D.L., A mutant for spontaneous seizures in C57B1 10 Bg mice. //Epilepsia. V.24: P.15-24. 1983.

136. Miller J.W., Ferrendelli J.A. The central medial nucleus: thalamic site of seizure regulation. //Brain Res. V.508: P.297-300. 1990.

137. Morimoto It, Fahnestock M., Racine R. Kindling and status epilepticus: rewiring the brain. //Progress in Neurobiol. (May 26). 2004.

138. Morimoto M„ An В., Ogami A., Shin N., Sugino Y., Sawai Y., Usuku Т., Tanaka M„ Hirai K., Nishimura A., Hasegawa K„ Sugimoto T. Infantile spasms in a patient with Williams syndrome and craniosynostosis. //Epilepsia. 2003. V.44(l 1): P. 1459-1462.

139. Moriyasu M., Nasu M., Honda H. et al. Effect of TA-0910, a new TRH analog, on plasma levels of TSH and thyroid hormones in rats. //Nippon Yakurigaku Zassi. 1996. V.107: P.285-297.

140. Morrisett R.A., Jope R.S., Snead O.C. Effects of drugs on the initiation and maintenance of status epilepticus induced by administration of pilocarpine to lithium-pre-treated rats. //Exp. Neurol. 1987. V.97: № 1. P. 193-200.

141. Nehlig A., Duhe C, Koning E. Status epilepticus induced by lithium-pilocarpine in the immature rat does not change the long-term susceptibility to seizures. //Epilepsy Res. 2002. V.51. № 1-2. P. 189-97.

142. Ogawa N., Mizuno S., Mori A. et. al. Potential anti-depressive effects of thyrotpoin-releasing hormone (TRH) and its analogues. //Peptides. 1984. V.5: P.743-746.

143. Ogawa N. Mizuno S., Nukina I. et al Chronic thyrotropin releasing hormone administration on TRH receptors and muscarinic cholinergic receptors in CNS. //Brain Res. 1983. V.263: P.348-350.

144. Ogawa , Yamawarai. et al. Discrete regional distribution of thyrotropin-releasing hormone (TRH) receptor binding in monkey central nervous system. //Brain Res. 1981. V.205: P. 169-174.

145. Oka M., Ochi Y., Furukawa K. et al. L-6-ketopiperidine-2-carbonyl-L-Ieucyl-L-proline amide as a novel TRH analogue with improving effects on impaired central nervous system functions. //Arzneim. Forsh. 1989. V.39: P.297-303.

146. Osonoe K., Mori N. Ohno E., Kumdshiro H. Effects of thyrotropin-releasing hormone (TRH) on status epilepticus in rats. //No To Shinkei. 1991. V.43. № 3. P.247-254.

147. Pekary A.E., Meyerhoff J.L., Sattin A. Electroconvulsive seizures modulate levels of thyrotropin releasing hormone and related peptides in rat hypothalamus, cingulate and lateral cerebellum. //Brain Res. 2000. P. 174-183.

148. Perlman J.H, Laakkonen L.J., Guarnier F., Osman R., Gershengorn M.C. A refined model of TRH receptor binding pocket. Experimental analysis and energy minimization of the complex between TRH and TRH receptor. //Biochemistry. V.35: P.7643-7656. 1996.

149. Pizzi, M„ Boroni F„ Benarese M. et al. Neuroprotective effect of thyrotropin-releasing hormone against excitatory amino acid-induced cell death in hippocampal slices. //Eur. J. Pharmacol. 1999. V.370: P. 133-137.

150. Pomeau Y, Manneville P. (1980) Intermittent transition to turbulence in dissipative dynamical systems. Commun. Math. Phys. 74:189.

151. Post R.M., Weiss S.R. Kindling: Implications for the course and treatment of affective disorders. In: Anticonvulsants in Psychiatry (Eds.: Modigh M., Robak O.N., Vestergsaard P.V.). 1994. P.l 13-137.

152. Prange A.J.Jr., Wilson 1С. Effects-of TRH in depression. //Lancet. 1972. P. 9991002.

153. Prasad C, Edwards R.M. Thyrotropin-releasing hormone: apparent receptor binding in rat spinal cord. //Brain Res. 1984. V.311: P. 1-6.

154. Przewtoeka В., Labnz D., Mika J. et al. Protective effects of TRH and its analogues in chemical and genetic models of seizures. //Pol. J. Pharmacol. 1997. V.49: P.373-378.

155. Rice A.C., Lorenzo R.J. NMD A receptor activation during status epilepticus is required for the development of epilepsy. //Brain Res. 1998. V.782: P.240-247.

156. Rocha L., Maidment N.T. Opioid peptide release in the rat hippocampus after kainic acid-induced status epilepticus. //Hippocampus. 2003. V.13. № 4. P.472-480.

157. Rosen J.В., Abramovitz JU., Post R.M. Co-localization of TRH and mRNA and Fos-like innumoreactivity in limbic structures following amygdala kindling. //Mol. Cell. Neurosci. V.4: P.335-342. 1993.

158. Rosen J.В., Cain C.J., Weiss S.R., Post R.M. Alterations in mRNA of enkephalin and TRH during amygdala kindling: an in situ hybridisation study. //Mol. Brain. Res. V.15: P.247-255. 1992.

159. Sankar R„ Shin D.H., Liu H. et al. Patterns of status epilepticus-induced neuronal injury during development and long-term consequences. //J. Neurosci. 1998. V.18: P.8382- 8393.

160. Sarkisova K. Y„ Kulikov M.A. The WAG/Rij rats: a new genetically -based model of depression? // The WAG/Rij rat model of absence epilepsy: The Nijmegen Moscow Research (Eds.: G.Kuznetcova, A, Coenen, S,Chepurnov, G. van Luitelaar.) 2000/ 105112.

161. Satin A., Pekary A.E., Lloyd R.L. TRH gene and implicated in the antidepressant mechanisms of seizures. //Annal N.Y. Acad Sci. V.739: P.135-153. 1995.

162. Schomburg L., Bauer K. The TRH-degradating ectoenzyme. Peptidergic Neurion. (Eds.: B.Krisch, R.Mentlein). Birkhauser Verlag Basel. 1996.

163. Schwartzkroin P.A., Moshe S.L., Noebels J.L., SwannJ.lV. (Eds.) Brain Development and Epilepsy//N.Y. Oxford Univ. Press. 1995. 330 p.

164. Seegers U., Potschka H, Loscher W. Transient increase of P-glycoprotein expression in endothelium and parenchyma of limbic brain regions in the kainate model of temporal lobe epilepsy. //Epilepsy Res. 2002. V.51. № 3. P.257-268.

165. Segerson T.P., Hoefler H., Childers H. et al. Localization of thyrotropin-releasing hormone prohormone messenger ribonucleic acid in rat brain in situ hybridization. //Endocrinology. 1987. V.121: P.98-107.

166. Segerson T.P., Kauer J., Wolfe H.C. et al. Thyroid hormone regulates TRH biosynthesis in the paraventricular nucleus of the rat hypothalamus. //Science. 1987. V.238: P.78-80.

167. Semba K., Komisaruk, B.R., Neural substrates of two different rhythmical vibrissal movements in the rat. //Neuroscience. V.12: P.761-774. 1984.

168. Serikawa Т., Yamada J., Epileptic seizures in rats homozygous for two mutations, zitter and tremor. //J. Hered. V.77: P.441-444. 1986.

169. Simasko S.M., Horita A. Chlordiazepoxide displaces TRH binding. //Eur. J. Pharmacol. 1984. V.98: P.419-423.

170. Simasko S.M., Horita A. Localization of thyrotropin-releasing hormone receptors in the septal nucleus of the rat brain. //Brain Res. 1984. V.296: P.393-395.

171. Stocca G., Nistri A. Enhansment of NMD A receptor mediated synaptic potentials of rat hippocampal neurones in vitro by thyrotropin releasing hormone. //Neurosci. Lett. 1995. V.184: P.9-12.

172. Straub R.E., Or on Y., Gillo B. et al. Receptor number determines latency and amplitude of the thyrotropin-releasing hormone response in Xenopus oocytes injected with pituitary RNA. //Mol. Endocrinol. 1989. V.3: P.907-914.

173. Szirtes Т., Kisfaludy L„ Palosi E., Szporny L. Synthesis of thyrotropin-releasing hormone analogues. 1. Complete dissociation of central nervous system effects from thyrotropin-releasing activity. //J. Med. Chem. 1984. V.27: P.741-745.

174. The WAG/Rij model of absence epilepsy: the Nijmegen Moscow research. A tribute to. five years of co-operation. (Eds. Kuznetsova et al.). Mediagroep, University of Nijmegen. 2000. 139 p.

175. Tsuji S., Akamatsu N. Treatment of status epilepticus. //Rinsho Shinkeigaku. 2001. V.41. № 12. P.1097-1099.

176. Van Luijtelaar E.L., Coenen A.M\ (Eds.). The WAG/Rij rat model of absence epilepsy: ten years of research. //Nijmegen Univ. Press. 1997.

177. Vergnes Al, Atarescaux C. Cortical and thalamic lesions in rats with genetic absence epilepsy.//J. Neural Transm. (Suppl). V.35: P.71-83. 1992.

178. Vezzani A., Moneta D„ Riehichi C. et al. Functional role of inflammatory cytokines and antiinflammatory molecules in seizures and epileptogenesis. //Epilepsia. 2002. V.43. Suppl. 5. P.30-35.

179. Ward D.J., Finn P.W., Griffiths E.S., Robson B. Comparative conformation-activity relationship for hormonally and central-acting TRH analogues. //Int. J. Pept. Protein Res. 1987. V.30: P.263-274.

180. Wolf P. Ed. Epileptic seizures and syndromes with some of their theoretical implications. //London: J.Libbey&Co. Ltd. 1994. 678 p.

181. Yamamura Al, Kinoshita K, Nakagawa H. et al. Pharmacological study of TA-0910, a new thyrotropin-releasing hormone analog, (I): Effects on the central nervous system by oral administration. //Jpn. J. Pharmacol. 1990. V.53: P.451-461.

182. Yatsugi S., Yamamoto Al. Anticonvulsive properties of YM-14673, a new TRH analogue, in amygdaloid-kindled rats. //Pharmacol. Biochem. Behav. 1991. V.38: P.669-672.

183. Yoshida At., Izumi K, Nakanishi T. Effects of TRH on glutamate-induced seizures in rats. //Tohoku J. Exp. Med. 1987. V.152: P.311-317.

184. Zabavnik J., Arbuthnott G., Eidne K.A. Distribution of thyrotropin-releasing hormone receptor messenger RNA in rat pituitary and brain. //Neuroscience. 1993. V.53: P.877-887.

185. Zlokovich B.V., Segal At.В., Begley D.S., Davson H„ Rakic L. Permeability of the blood-cerebrospinal fluid and blood-brain barriers to TRH. //Brain Res. V.358: P.191-199, 1985.

Информация о работе

Гончаров, Олег Борисович
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Роль тиролиберина в регуляции генерализованной и фокальной экспериментальной эпилепсии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы