Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Картирование эпитопа человеческого лейкоцитарного интерферона альфаА, способного взаимодействовать с мышиными моноклональными антителами NK2

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Картирование эпитопа человеческого лейкоцитарного интерферона альфаА, способного взаимодействовать с мышиными моноклональными антителами NK2"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

АЛЕКСЕНКО Андрей Петрович

КАРТИРОВАНИЕ ЭПИТОПА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА «А, СПОСОБНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВОВАТЬ С МЫШИНЫМИ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ 1МК2

(03.00.03 — Молекулярная биология)

Авторефер ат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории белковой инженерии ВсесО' юзного научно-исследовательского института генетики и селекци промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель: чл.-корр. АН СССР Дебабов В. Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. П. Кузнецов,

доктор биологических наук, профессор С. А. Кетлинский

Ведущее учреждение — НПО «Фермент», г. Вильнюс.

Защита диссертации состоится /О 1991 г,

в часов на заседании Специализированного совета при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке «ВНИИге-нетика».

Автореферат разослан %, //. 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

¡1 / / в- И- Щербакова

Ц/

Актуальность теки диссертации- Интерфероны (ИФН) - г.в-мейство полифункциоиальных индуцибельных белков, которые обладают антивирусной! антипролиферативнойi иммуноиадулируюией активностями и о связи с этин находят широкое клиническое применение- Клонировано больыинство известных генов ИФН» получены высокопродуктивные бактериальные штанин-продуценты и разработаны схемы очистки, позволившие полечить достаточные количества данных белков как: для нужд медицины, так и для структурно-функциональных исследований- Тем не менее,к иасто-ящему времени удалось установить пространственную структуру Лишь для одного ИФН - ишиноро НФН-бета (Senda et al-, l"í90>, до сих пор неизвестен механизм биологического действия ИФН, сведения по локализации "активного центра" различны, а иногда противоречивы. В связи с этин для обнаружения Функционально важных районов молекулы ИФН больмое значение приобретают исследования с использование« моноклинальных антител и сднт-специфического мутагенеза-

Цель работы. Цель» данного исследования была разработка практических подходов, позволяющих локализовать антигенную детерминанту на примере взаимодействия лейкоцитарного ИФН-А и моноАТ NK2.

Научная новизна работы. Было показано* что широко используемые в исследовании ИФН нейтрализующие противовирусную активность мышиные лоноАТ NK2 узнают район последовательности АК остатков, локализованных > С-концевон области молекулы И<РН-А <ЙК остатки КН 112-117). Ат"3 121» вероятно« также играет определенную роль а поддержании необходимой кон^орнации эпитопа-

Изучена специфичность взаимодействия 21 моноАТ о .пятью лейкоцитарными человеческими генно-инженерными интерферонами ИФА в трех кодификациях*На основания полученных результатов и данных па взаимодействии ВгСМ фрагментов ИФН-А с панелью домой! Была предположено, что поверхность ИФН может быть разделена по крайней мере на 7 антигенных областей, состояыих из перекрывающихся АГ детерминант, уэчавагкых различии«« антителами. Обнаружено, что три моноАТ способны взаимодействовать со всеми субтипапи исследованных рекохЗимантных ИФН.

Анализ »сей совокупности полученных данных дает основа-

ние считать» что АГ детерминанта NK2 образована в результате конфорнацианного взаимодействия АК остатков NM 113-121 и предположительно 38-42•

Практическая значииость работы. Разработанный нами стчпенчатый подход» использованный для картирования элитопа коноАТ >1К2 в пределах ЯК последовательности ИфН-А» можно применять для нахождения соответствующих эохтопоа в молекулах других Селкок* в особенности» если семейство исследуемых белков состоит из нескольких представителей с извес-. t. »im AK последовательностями. Возможно также» что полученные . ¿ ;ные позволят локализовать участки молекулы ИфН» вовлеченные в связывание с рецептором и во вторичные хюаимодеиствия с компонентами клеточной мембраны- Метод выделения ИфН-F вошел в регламент на производство этого белка-

Структура работы- Диссертация состоит ко введения» обзора литературы» описания материалов и методов исследования» 7 глав изложения собственных результатов и их обсуждения» эа-ключеяшь выводов и списка литературы из наименований со-

ветских н иностранных авторов- Объем диссертации составляет /J¿ страниц основного текста» a также /ф рисунков «¿^таблиц-

Апробачия результатов-* Материалы диссертации докладывались на 7-ой международной конференции молодых ученых по органической и биологической химии (Болгария,1990), международной конференции "Медицинская биотехнология» иммунизация, СПИД",(Ленинград, 1991>» а также на семинарах отдела биотехнологии Е1Ы11генэтина (198В - 1991).

Список сокращений- ИфН - интерферон, ДсМа - додецжлсудь-«ат натрия, ВСП - внутриклеточная сериновая протеинаэа» ИФА -имиунофериентный анализ, АГ- антиген» моноАТ - моноклональные антитела, KAM - козьи мтиюшивю антитела, ПХ - пероксидаза из хрена, СПЭВ - культура клеток эмбриональной свиной почки-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ-

Бактериальные ытаииы-В работе были использованы следуш-ыие- итаыш Е- coli: С-600 «F+, Thi-1. thr-1» 1еч В6. lac Y1» ton А21, SUP Е44) (ко коллекции штампов ВНИИгенетика )»

TGK ( lan-pro),sopE.tlii , hsdD5/F' traD36, proA*B+» lacl ) (лябезно предоставлена д-ром Т-Гибсоноа J i

RZ1032 (HfrKL16 PO/45 СlysA(61-62)3, dilti, vngl, thi 1 , relAl, Zbd-279"Tt\10, BupE44) для направленного- метагенеза (любезно предоставлен д-ром Т.А- Кчнкелем);

ытамп Pseudomonas pulida PpG6 ( thrB) любезно предоставлен Т-Г-Плотниковой ( ВШШгеиетика).

Плазккды к нэдлеотядные фрагменты. Нчклеотндиые фрзгмпн-THi содержащие гены IFN-A и IFN-F (Sverdlov et al-, 1934) выли лмбезно предоставлены про»- Е-Д-Свердловым <ИНГ АН СССР). Ген, кодирующий ИфН-М (Gren et а 1 -1 1984), был любезно предоставлен проф- Э-51-Греной (Институт органического синтеза АН Латвии, Рига). Плаэпиды pAYC-32, pIFW«(2-P2, были любезно предоставлены д-ром Ю-Д-Цыганковым , рРИЮЗ и pPRIF)WF-2 - д-роя С-В.Машко (ВНИИгенетнка)- Олигонуклеотиды для направленного мутагенеза были синтезированы в НПО "'Вектор" (Новосибирск)-

Электрофоретичесхи чистые ИФН (ИфН-А.-АС 1-92>/-К< 93-1Í-6), -F(A 113,114,121), -D, -F, -N, -11) были выделены методом им-пчноаффинной хроматографии, HPUC к/ид* FPLC из рвковёинант-ных ытанноп Pseudomonas putida (Костров и др-, 1997) и E-coli (Secher and Burke, 1980; Ерепгтавили vi др., 19BQ) -

Концентрации» бедка определяли по методу Брэдфорд ( 1 '^76 > -Электрофорез с ДС-Na проводили в соответствии с методикой Лэнмли (Laeromli,1970) и по методч "Hoeffer Scientific"-Огранхченный протеолпз ИфН-Й проводили .при 37вС э течение 5-120 нин при соотношении ^ериент/счбстрат lílOO с трипсином и терполизинон (Signa), пепсином (Serva) и ВСП, любезно предоставленной про». В-М.Стелановын ( ВНИИгенетика)-

ИштаярВлспянг проводили в соответствии с описанием Тanbin et al - ( 1979).. •

Трансфекцкя я трансфоряавдоо клеток E-coli проводили в соответствии с методикой Chang and Mil Jер С 198В)-

Выделение двзкктевьгх ДНК ллазннд н Фагов проводили по яетод-j Biraboio and Dol 1 v < 197В), однонитевой ДИК фага - по иетод-j (Sangen et al-»-1977)•

Сайт-специфический «гэтагенеэ-Сайт-направленные точечные

• а

иатаиия вводили с полошьи 1В- 13*- GACTACTTCCTCCTGAGG-5') и

•

16-членнсго (3*~CCGfiCACTCCTTTATG-5') олш ончклеотидов, солгр-жачиэс соответственно двойну» и единична» замены (замены обозначены звездочками> • Имтагенез проводил!! по KunVel et al-С 1987). Секвенгрование ичтзнтшга НфН проводили по методике, описанной Сэнгероп (1977), используя однонитевые яатриот, после того как Фрагменты геяа были клонированы в вектор

- 4 -

M13tgl30 (Kieny et al-,.1983).

Получение пептидных фрагментов ИФН-(Сл. ВгСН-фрагменты ИФН- tí А получали в соответствии о описанием, данный в работе (Lydart et al ., 1985), используя электрофоретически гомогенный препарат белка, не содержащий примесей олигояеров, а также форм ИФН- «Í А с восстановленными и неправильно замкнутыми S-S мостиками, полученный ипмуноаффинной хроматографией м ионообменной ВЭЖХ ( Борзхов и др., 19ВВ ). Обраиенно-фазовую ВЭЖХ проводили на хроматографе GiI son (Франц»»), используя колонки TSK 0DS-120T, 5 мки, (4,6 X 250 пи) ("Toyо Soda", Япония) и Ш traspillare Octyl, 5 hkhi <4,6 >{ 250 ми) ("B^ckman", Австрия)- Аминокислотный состав выделенных фрагмент п.• определяли на аминокислотном анализаторе Vцггцга D500-

Анализ М-концевой АК последовательности проводили на автоматическом секвенаторе Beckman S90C < "BecVroan" , Австрия).

Количественные излереиня ИФН проводили методой ИфА в различных модификациях (Костров и др.,1985b«Еремаывмли и др., 19(33) - Моноспецифические кроличьи анти-ИФН-А поликлона ль ные антитела и козьи антипышиные антитела были получены из ВНИИ ОЧБ (Ленинград)-Панели иыыиных ноноАТ к ИфН-А были предоставлены В.Л.Ириным ( ВНИИгенетика) и Л.П.Коробициным (ВНИИ ОЧБ). МоноАТ NK2 были поставлены фирмой "CelItech"( Великобритания)-

Противовирусную активность препаратов ИфН проверяли во ВНИИОЧБ (Ленинград)• , "

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Для картирования зпитопа ИФН-А, способного связывать во-ноАТ NK2 использовали несколько подходов 51) ограниченный про-теолиэ полипептидной цепи ИфН-А Ферментами, обладающими различной субстратной специфичность»,с последующий иммуноблотин-гон и анализом полученных фрагментов с помощь» ЫК2 »кон-ькггиро-аапнон с п&раксидазой хрена; 2) анализ взаимодействия с WK2 панели субтипов ИФН, несущими АК замены в области предполагаемого зпитопа с последующим сравнением человеческих ИфН с мышиными, поскольку ИфН-А использовался в качестве антигена для наработки антител в мышах? 3) конструирование по общим сайтам рестрикции ИФН-А и ИФН-F- рекомбинацией in vitro гибридного ИФН-А(l-92)/F( 93-166), в которой предполагаемый эпитоп ИфН-А, 'способный связываться с НК2,был заменен на последовательность ИФН-F,в результате чего полученный гибрид утратил способность связывать NK2; 4) направленный мутагенез гена ИФН-F»позволив-

кий получить иутантный ген, кодирующий И5Н-К(А113, 114, 121), о которой била создана АК последовательность эпитопа ИФН-А и полиосты» восстановлена способность связывать МК2-

1- Ограниченкма протеоляз Щ>Н-А» первичная локализация ра&ояаа связывания о КК2-

Для предварительной локализации районз. молекулы ИФН-А, спязязакпдего ионоАТ 1ПС2* использовали ограниченный протеоляз ИфН-Л четырьмя отличавшимися по специфичности протеиназаяи (сепсиноп! трипсином, термолиэинои и ЗСП) и определяли имму-нсблотингои способность образующихся пептидн-л— Фрагментов бедна святавать ксноАТ ЫК2. Экспериментально ёыл:* подобраны уолопия ограниченного протеолнза ИфН-А и мдггнтяфтоирозаны относительно крупные пептидные фрагменты, появление которых отражает начальные этапы деградация бол:са- Еыло абнарунено, что только фрагнгнты с II а 15 ООО я 14 ООО и кепротеолиэованный И5Н-А способны всаикодЕЙствоэать с ЫК2, в то время как трип-тический фрагмент с Н в 12 ООО н сба термолитнческих фрагмента (Из 12 ООО и 6 ООО) такой способность» не обладают. Осноз-кыа. характеристики пйптядеях фрагментов, обнаруженных в ходе протэодиза ИФ11-А, прг1В!эдйны в таблице 1 •

Таблица 1. Протеолитическкв фрагменты ШРН- А.

Прстениаэа Предполагаемый размер Фрагяен • тов (АК остатков )» И.О.- Способность фрагмента взаимодействовать с КК2

Трипсин 1-150 15 ООО +

1-113 »» 12 ООО —

Пепсин 1-140 14 ООО • +

ВСП ' 1-14». 15 ООО +

Теряодизни 1-110 «» 12 ООО -

111-166 *♦ & ООО . _______"______ - !

•РНуяэрацая АК оотатков дана в соответствии о последовательность» H?H-D t Weissaarm íc Weber, 1*586) • ** Фрагменты- появлялись лиш> посла восстановления S-S связей 2-нэркаптоэтанолом.

Определенная секвенировапнеп М-концевая АК последсва-тсЗльносггьС Суsi-Asp-Leu-Pra) пептического фрагмента с Нв около 14 ООО полностью совпадает о М-концевой последовательность» иативного ИФН-А•

Сравнивая На пратеолнтаческнх фрагментов и специфичности протемназ с последовательностью ИСРН-А и учитывая наличие в молекуле ИФН двух дисздъфидтагс связей Cysl-Cys99 и Cys29-Cysl39

(Wetzel et a)., 198)), оказалось возможным локализовать участки протеолиза (Таблица 1). Ранее Акерпан и др. (1984), изучав термолитические фрагменты ИФН-А» идентифицировали соответствующий единичный участок растепления и показали, что фрагменты с Мв около 12 ООО и 6 ООО аналогичны АК последовательностях HN1-110 и 111-166 соответственно- Аналогично нашим данным эти фрагменты обнаруживантся лишь пооле восстановления связыв&зс-цего их дисульфидного мостика Cys29 - Cysl33. По-вкдюмоку, наиболее вероятным следует считать, что фрагменты о Мэ 14 ООО -15 ООО соответствуют И-концевой области МфН-А и появляются в результате разрыва связей Argl50-Serl51 (трипсин), 11e!40-Metl49 <ВСП> к А1а140-Тгр141 (пепсин). Появление три-птического фрагмента с Мв около 12 ООО скорее всего является результатом расщепления связи Lysl13-Glul14-

Таким образом было показано, что три различные протеина-эы гидролизуют молекулу ИфН-А за эсороткий временной, промежуток- в пределах относительно небольшого участка АК последовательности NN140-150,которая.по-видимому»экспонирована на поверхности белка- Анализ структуры протеолитических фрагментов и их способности взаимодействовать с NK2 дает основания считать, что эпитоп, вероятно» локализован в предела:" последовательности АК NN110-140 мо^.зкулы ИфН-А. С другой стороны,нельзя исключить возможность того, что в Формировании 1зайта связывания о антителом определенную роль играют ' некие, пока не локализованные АК участки N-концевой области молекулы ИфН-А•

2. Анализ АК последовательностей И<?Н, иоаикодейотвуюцмх и не взаимодействующих о МК2, сравнение о АК пооледователь-ноотяни мышиных ИфН.

Для того, чтобы более точно картировать эпитоп, способный связывать МК2, нами с попоиь» ИфЛ-1 (кроличьи полиАТ к ИФН - ИФН - NK2 - КАМ/ПХ) были проанализированы субтипы ИфН, несущие яамены в области АК остатков MN110-J40- Контролем служил ИфА-2 (полиАТ к ИФН - ИФН полиАТ/ПК), в которой с высокой чувствительностью можно было определить все исследуе-мие субтипы ИФН. В соответствии с нашими данными NK2 эффективно связывается не только о ИфН-А, но и о ИФН-N и ИФН-П, no in? с ИфН-F и ИФН-D (таблица 2). Ранее фирма "Cell tech" проиииодитель N1C2, сообщала, что эти ноноАТ способны связывать ИФН-р» ИФН-1 и ИФН-К, но не взаииодействуят с ИФН-G и ИФИ-J (таблица 2)- Сравнение последовательностей "АК остатков различных субтииов ИФН указывает на то, что их способность

связывать КК2 xopouo коррелирует с константной Ail последовательность» Gloll4-ñsp-Ser—Ile-Leu-ñla-Val-Argl21- Субтипы ИфН, которые? не узнаются NK2, несут АК замены в положениях НЫ 114, 116, 119 и/или 121. Эти замены могут в значительной степени искажать антигенную структуру данного района.

Сравнение АК последовательности И<5Н-А, использовавшегося в качестве антигена для наработки в m-плах мог.пАТ NK2 с секве-нировэнвывк к настоящему моменту сувтипани яымнных ИФН (Traproan et al-, 1980) также дает возможность сделать определенные выводы ( Таблица 2).

Очевидно, что пытйиные AT могут быть ттт:;::", ЛЫ только лишь к ñK заменам в ИЧ>Н-А| отличающимся ото всех гомологичных последовательностей в мышиных ИФН {ИФН-А против Мишиных ИФН). В пределах последовательности АК остатков №1110-140 человеческий ИФН-А и субтипы ныщикых HtpH обладают высокой гомологией к отличается лишь двумя уникальными соседствующими заменами в положениях NN !12 и 113, другие ближайыие замены локализованы в положениях НИ 109 и 117. Таким образом вполне возможно, что последовательность ÁK остатков NM 109-117 человеческого ИфН-А монет быть антигенной, если данным белкой иммунизировать кымей- Вакно также отяетить, что в соответствии с предсказанными пространственными моделями ИФН последовательность АК остатков NN109-117 экспонирована иа поверхности молекулы ИфН-А и> следовательно, ножет узнаваться антителами.

Таким оврагом, в этой части работы нами было показано, что последовательность АК остаткоп KN112-117 может яблвться эпитсэпом для NK2. С другой стороны, эти данные не исключают возможности, что в связывание с ЫК2 вовлечен так^е и определенный участок АК последовательности, локализованный в N-кон-цевой области молекулы ИФН-А. Для того, чтобы определить к кую роль во взаимодействии с NK2 играет Н-концевая область молекулы ИфН-А, нами был сконструирован гибридный ген ИФН, кодирующий ИфН-А( 1-92)/F4 93-166).

3« Конструирование гибридного OTH-A/F.

Ген гибридного ИФН А< 1-92) /F<93-1£.S) был сконструирован с поислиью рекомбинации in vitro генов И'?Н-А и ИфН-F по общему сайту рестрикции PvuII» расположенному кежду АК остатками №192 и 93- После серии генетических манипуляций, была получена рекомбинантная плазмида pIFN fi/F, обеспечивающая экспрессию гена ИФН А(l-92)/F(93-166) под контголем конститутивного

- в -

Таблица 2- Сравнение района АК последовательностей NN 93 - 130 человеческих а кыатпых ИФН.

Сдбтип ИФН Аминокислотная пас/игдавзт&лыюсть Способность

смамзап ШС2

ИФН (чел) 93 100 110 120 130 A* LNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSÍt^VHKVFQPXTLY + В** .....VLCD.E...I.S.--Y..................................♦

С** 11* *

к** ♦

N* *

D* .ЕЕ -KV. • - • • «К* • • • • • - -

К* -

G** -

J** _

( l-92)/F<93- 166)* -

( А 113,114, 121)» *

А F

ИФН (кышь) ....Q...M.Q...Q.F..TQ--.

К V.L К- Р Q

Е S

АК последовательности человеческих я ныаиных ИСН даны в соответствии о Ие^езяагга & МеЬег <19В5) и Т*>арвап еЪ а1. (1988)»

Точками оЗозначекы идентичные относительно человеческого ИфН-А АК последовательности' Для иыииных -ИФН <-1,. -2, -4', -5, -вТ, . -6Р1 -9, -10 и -А) в соответсгвуюдах полояениаз: показаны только те АК замени, в которых ни в донок из известных субтипов мышиных ИФН нет АК остатков, идентичных человеческолу ИРН-А. В пределах последовательности МЫ 130-140 ИФН-А отличается от субгв-иов мышиного ИФН только двумя замеиашз в половенпях 432 и 136-

*Наши данные- .

»»Данные представленные «ирной "Се114есЬ" - производящей ЫК2-( +) указывает способность 5-10 п» "йФй Шрвделеппсга сЪ'бтипа связывать КК2 с эффективностью, сравпЯИЙ^ в Таковой ИФН- А при анализе с поиощьи ИфА-1. <-> указывает на го,что приблизительно 100 по определенного субтипа ИфН не обнаруживаются при анализе ИФА-1•

L

- 9 -

Л»емотора гена О фага 0X174 < рис. 1) .

Рис-1. Схема получения реконБинантнан плазииды р1™ А/К,в которой ген гибридного ИФН-А( 1-92)/Р(93-166) находится под контролем конститутивного промотора О фага /5X174 СРО-промотор).

' ' - ген ИЧИМ-А - ген ИФНА-Р Е - ЕсоПI, Р - Ре«, Р» - Р>/чХ1, В - ВааНХ

Продуктом экспрессии полученного гена в клетках Е-соП является гибридный ИфН, содержаний М-кониеву» часть ИфК-А <АК остатки NN 1-92) н С-концевую часть ИфН-Р <АК остатки NN 93-166). Биологическое тестирование на линии СПЭВ показало, что новый интерферон полностью сохраняет биологическую активность- С помощь» ИФА-1и ИЧ>А-2 было показано, что, в отличие

- io -

от ИФН-А, гиЗридный ИФН-At 1-92) /Г(93-166) не взаимодействует с NK2 подобно другому родительской? белку - ИфН-К (Таблица 2)• Такик образом, ложно сделать вмвод о той, что АК остатки в пределах АК последовательности MN 1-92 не игракт заметной роли в Формировании эпитопа, способного связывать ЫК2, или по крайней пере не могут связывать данные ионоАТ независимо. Тем не менее, окончательный ответ на вопрос, действительно ли эпитоп NK2 сформирован АК остатками, локализованыии в пределах последовательности ЫШ12-117, может быть получен только в том случае, ^сли не вэаинодействущий с NK2 субтип ИФН окажется возможным превратить в ИфН, который будет узнаваться ЫХ2. Для этого кы направленным метагенезом гена И<?К-К пагсеиклн в полипептидной цепи ИФН-F три АК остатка Asnl13, ' Val114, Lysl21 на АК ост. тки ИфН-А (Lysll3, Clall4, Argl21).

Предварительно нами был разработан метод выделения к очистки до гомогенного состояния ИфН-F-

4- Выделение Н?И- F в гомогенноя вйстсяша кз клатозс Е.соИ .

Для исследования иммунологических свойств ИфН-F необходимо было иметь определенные количества белка в .гомогенной состоянии . Получить нужные .соличества выоогсоочтагнного препарата долго не удавалось, поскольку ' в - отличие от И?Я"-А, большая часть ИФН-F (около 90Vi) после обработки клеток ультразвуком находится в связанном состоянии с клеточными мембранами. Нами был разработан метод очистки-с использованием обработки клеточных мембран мелочью. В результате очистки, включающей последовательную обработку клеточной биомассы ультразвуком, перевод ИфН, связанного с мембранами, в раствор Oil Н МаОН, ионообменную хрояагсграфи» на ДЭАЭ-сеФарозе и аФФинНу» хрома-, тогра'фим на HI 1Р6-сефарозе, получен препарат ИФН-F с удельной антивирусной активностью 1,65X10(8) МЕ/иг белКа-Результаты очистки суммированы в таблице 3-

Гомогенность выделенного ИФН-F подтверждена ПААГ электрофорезом в присутствии Дс-Na (Рис. 2).

Эта методика была также применена для очистки как гибридного, так и мутантных ИфН-

ТаЗлица 3- Выделения ИОН-V вз вяспассы мтакна-пгодучен-та Е-соИ ВКПН В-4567.

Стадия ОВъеп очистка ( ил ) Белах ( ят/ид) Активность Выход Очистка о5иая удельная ('Л) (раз)

Ыэлочкой •

экстракт 15 . -3 320X10! 8) 5X10(6) 100 1

ЯЭАЭ-свфа-

роза 10 3 300X10(8) 10X10(6) 2

Н11Р6-оеФз- .

роза 10 0,08 132X10(0) 165X10(6) 44 75

—

Е=

аа

3.

и

О.

с—

=

О

ЕЯ вз

ев

—

' ш

а

гая

1 1

Рас. 2- Схема 12,ПАЯГ препарата ИфН-Р« Исходный препарат (Л), Н9и-Р после очистки на ионоАТ Й11Р6 ( Б).

S-. Получение направленный яутагеназон кутантных Н9Н- Г по 113, 114 и 121 AKi восстановление АГ детерминанты у тройного путанта-

Рис 3. Направленный мутагене.i и пореклокирование иутантнш генов в экспресоирукпдие векторы* Е - EcoJH В - BamHI, Рг - промотор *ага А •

Сайт-специфические точечные мутации вводили* в одноцепо-чечнч» матрицу ИФН-F« используя 16- и 18-тм членные олжгонук-леотиды, несущие соответственно единичнум и двойную замены-Мутантные HTH-F<fil 13,114> и H4>H-F<A12t> получалм, вводя в кодирующею последовательность гена ИФН-F двойнум нутащос, пеняющую Ásó на Lys и Val на Glu в 113 м 114 положениях соответственно в 'случае двойного мутанта и единичнум нутация, пеняющую Lys на Arg е положении N121 в случае одинарного- мутанта-

Патентный H<PH-F<Al 13* 114,121 ) получали, аваля ■ кодирующим последовательность гена нцтантного ИФН-К( Л113.114) единичную нутации, меняющую Lys на Ary а 121 положении•Проверка наличия необходикых m отсутствия дополнительных нуклеотидных замен в одноцепочечной ДНК одинарного, двойного и тройного мутантов ИфН-К осуществлялась секвеняроваияеп по Сэнгеру. Гены мутант-мых ИФН-К(А 113.114), ИфН-FiA 113,114,121) H?H-F<A 121) были □атеп клонированы по EcoRI-BamHI сайтах рестрикция в плазмиду рРШОЗ, обеспечивакиду» экспрессию яутантных белков в клетках Е- coll под контролен промотора-оператора гена РгОг и репрес-сора гена Clts857 фага лямбда и SD последовательности геиа его E« coli (Рис. 3).

На рно. 4 представлены данные по ямлуноферпентнопу аиа-. лизу ИфН-А, MÇH-F, ИфН-А( l-92)/CF93-i66î м нутантных H9H-F о помощь» ИФА-1 и ИфА-2»

В случае НфН-А я модифицированного ИЦ>Н-К(Л 113,114,121) результаты ИФА-2, в котором использовались только кроличьи поликлональные антитела, оказались пдентячныли результатам, полученным НФА-1, в которой использовались как кроличьи поля-АТ, так и мышиные монеАТ №2< Эти данные однозначно свидетельствуют, что нам удалось ооздать в пределах АК последовательности НФН-F ИФН-А-гаэдовюой эпитегп я полностью воостано-вить способность ИФН-F узназатьоя м взаимодействовать о NK2» Необходимо также отметить « что Удельная антивирусная ектяв-ность ИФН-FCA US', 114,121) Кыла практически такой ве, как я я неяодифицнреэанлот-о И9Н-Р- Эти даяние, также подтверждает результаты Тзйлор-Пападяяятряу я др> ( 1987) м Кострова и ДР* (1985а), свидетельствунп-гка о топ, «кто эпхтоп, способный взаимодействовать о №2, включает Lysll3, С lall 4 я окружающие их ASC остатки - Arg 121, вероятно, такхе кграет определенную роль в поддержания' необходимой конфррнация эпитопа, поскольку, как видна из рис-4, двойной нутант HSH-Flftl13, 114> лишь частично восстанавливает способность овяоыэаться о МК2 а сравнении о ИФН-А. . ' .

"б га п> врепя наыя данные противоречили результата» ии-иуиохяяяческого картирования молекулы ÛÎ3-12 о использование* . BrCN Фрагментов, полученным Лядоион и др> (198S)> Для выяснения причин этого противоречия мы также провели анализ пептидных Фрагментов ИФН-А, полученных в результате расцепления' ВгСН, рядом поиск/тональных антител, вклячатаях я НК2.

J

ш

präg

iits'2

csiss

s2223

es23 ¡»uu

esi csaessa ICwuiMl] _f. )cesassaL_ sossss:

eim m-w m •? 133 bss

(ÄlJli (4113,1Н) 14113,Ш,Ш)

8

< m

gutta ииш ша 1ШШ ШШ ииш

m Ш11И 1ШШ iüüU mau 2ШШ 1ШШ

ШШ1 оши Ш5Ш ШШЗ

iO Ш1Ш 1ШШ ШШ MIHI ШШ! Ш1Ш

Ш1Ш ишц i mm ШШ ШШ! наги

tä 1ШШ 1НП11 шии иши НШ52 гит

ШШЗ 1ШШ {¡Ulli ииш 1ШШ ими

n ШШ1 Ш1Ш Ш1Ш иши 11Ш12 mim

e »Ulli шод Ш1211 ШШ! ИИШ ШШЗ

iH-a iti-r m-i/r m-t un'-t w-f

(Ш11 («113,11«) («13,114,131»

P*c 4. Взаимодействие KK2 о ИФН-А, ИФН-F, H<PH-A( 1-92)/FC 93-166), H?H-F(ß 113,114), ИФН-Р<А 121», lä<SK-F<A 113,114«121». й) МфА-1. Б> И9А-2. За 100* принята способность ИфН-А связывать когюАТ ( в И5А-1 ) в ■ полиАТ ( в ИФА-2 )>

Вр-сн Рйсдаепдвпнв ИФН-А на пап-подошв «pertzsm» а «а: «налн» ионэАТ.

Известно,что • яодеслгле ИФН-А содержится 3 остатков Hat в оодояеяиах ЫМ 16, 21, 59, 111 и 148 «Lydcra et al.,1983). Следовательно, > результата обработок исходного ИФИ ВгСМ дод-якы образоваться & врагвевтов: Ф1 - Cyel-..-Hsal6, Ф2 -Leal7----Hse21, 93 - А*чз22----Hse59, 94 - 11 ®GO. . - .Haei 11, tS

- Lysl12.•.•Hsel48 и 46 - firgl49...-Glal65. Учитывая наличие дисуль фидных связей в нативнол невосстановленном' И?Н-с£А (Cysl - Су 590 и Cys29 - Су si 33) (Lydon et al >11985), фрагменты Ф1 м Ф4, а также я 93 будут связаны между собой S-S постнкаии, образуя 2 больших фрагмента о пол. массой 7684 Да (91 - 94) и 8999 Да С ФЗ - Ф5), соответственно (Риа.5).

1-8-в- Г.

W. "ТГ™

17 Sí й

ВтЯ

1 • !5

■ 8—3

И ~I U9

I' М

■ 9—5 •

Ш -

н» т

ТГ

I 117

Рно« 5. фрагмент;-! подплсвтаХной цепи лейкоиигорпого И1?Н-Л,подучя?е!ип а результате расцепления ВуСЙ.

Поскольку наиболь&гай интерес д-sa итганозснняческого картирования ИФН-cíA представлпят ияоико эгн пептидкыэ фрагвеиты, дадьпгйиая работа проводилась тйлько с шшп.

Выделение Фрагментов 01-4 и ФЗ-5 проводи ля в два этапа, lía яирвоя этапе для предварительного разделения фрагментов, а такая для удаления части веярореагиров4?'!,1эго ИФИ и продуктов его неполного расиепланая была вспользсзйиа евравденно-фаэовая ВЭЖХна колонке TSK 003 120Т, 5 вки» (4»<S X 250 т) (Рпо- 6> -

Han удалось получить частично отгазэяамй фрагмент - 4 о вядшшя подекудярвыя в eco я 7 кДа> содержащий принеси исходного ИФН иля продуктов его частичного ргестплеиия, а также ФРагявит ФЗ - 5, представленный на электрофорезе двумя Ферма-он о вадлгага кслгасулнриыя в ее es G,Q кД» <03 - 5А> и 9,5 кДа

<ФЗ - 5Б> (Рис 7).

1 280

* И/»

13-5»

I 3-3 I 1(1-1

м

м

Л .

лЛ— ——«-

туи

V "

V»

/ *

__________./ ч__

1 П 1з То Е 5 Б 1» 43

(■м)

Тю- 6- Мракгшо-Каовм ВЭХ! ВгСН гпдролиэата ИФН-А на колонке Т5К ООБ 120Т, 5 госи, (4,6 X 250 пи).

Рис. 7. Схева 205С ПААГ частично очищенных ВгСЫ фрагпен-тов ИфН-А- Исходный препарат ИФН-А .(А), Фрагмент 1-4 (Б) , фрагмент 3-5 (В).

Поскольку рехроиатогрпфаем выделенных «ракцнн на колонка Т8К 0118-1201 даже при пологой градиенте концентрации ацето-интрнла не удалось получить высокоочищенных Фрагментов, то на следующем этапе, оптнннзжровав форпу градиенте концентрации ацетонитрила, кы прооелм обращекно-фазовум ВЭЖХ на колонке иПгаарЬеге , 5 ккм (4,6 X 250 мл) (Рис. В).

Рво» О- ОЗракгяио-Фазовая на колоске

иНгагрЬеге Ос(уЬ 3 осп (4,6 Я 250 ет) фрагивнтов 91-4 (А), ФЗ' - 5А (Б) И СЗ - 5Б (В).

Посла дояолиятельвой рехронатогра'Мга нэдязядуальных фракций пептидоз были получек» выел* оочитчениыэ • элегггро-Форетпчески гокогвнякэ фрагменты (31 - 4, <33 - 5А и ФЗ - 5В, не содеряаиви прияесп исходного 1191! ша его водифкцироватшх форп (Ряс.9).

сз

i В 2 г

Ркз. 9. Схгпа 20Í ПААГ ВгСМ фрагиентов ИФН-ñ после ре-Зсропатографии. '^сходный препарат ИфН-А <A>s <fpari:cnr Ф1-4 <Б)t фрагк.лт ФЗ-5А (Б)t фрагмент C3-5S <Г).

Поскольку к чистоте фрагвгктсз кредпязднлизъ

повышенные требование, Сыли иаоледсзака их Ж состс..-, si iS-коа-цесыэ кос.'^лзг.ателькостк! прьч'.'а ocoSce вкксаиис уделядсо^ проверке секвэапрозакиеп.

Пг-огелсйШ'х; акадиз показал s что авкнсгскслотиый состаг., а такве Н-ютнцевва последовательность подученных пептндш. cacv-ветствуют теоретическ»: предсказании;; для ВгСЛ-^рагкептоь ИФН-А- Интересно откатить» что дла фрагкентов £3 - 5А и фЗ -5Б эти характеристюки сказались практически одинаковый!-;. Наличие Двух форм этого пептида! близких по хронатографическмп свойства«, но отличающихся по электрофарэтической подвижности, вероятно, связано с дозаннднрованиек остатков Азп или Gln при кислой рН в ходе реакции расцепления.

Как видно из paso. В, однократной обреченно-фазовой ВЭлК Kt*достаточно для полного удаления принесен исходного ИФН-^А к денатурированных продуктов ьго частичной иодиФикацнз? нлм рас-usen ленкя. Б первую очарэдь это касазтоя гядро^оЗнаго фрагмента Ф1 - 4, отдкчамцегося от фрагмента ФЗ - 5 Залансон гидро-ФоСных/аарваенкых акянокно.асткых остатков, в поэтому значительно Еолеэ прочно casaüasiíKiTDca о сорбентов в ходе обрз-ь!»ино-фазово£ "ЗЖХ < Рио- БД >. Б связи о этим, необходкла ответить, что наличие одного щгка пре рехроиатографим гидрофобного пептидного фрагввитл - 4 не ио*ет валяться достаточным критериев чнототм полученного препарата» Поскольку

")

присутствие даже небольшой•принеся исходного ИФН яли продуктов его деградации может значительно исказать реальнуя картину взаимодействия BrCH-фрагиентов ИФН-Л о воноАТ, больыое внимание было уделено доказательству чистоты полученных пептидов» используя совокупность данных ВЗЖХ, электро«среад а ЗОЙ ПААГ в присутствия Дс-Na, аминокислотного анализа и определения N-концевой последовательности»

Для характеристики антигенных свойств ИфН-oíA я ВгСН -фрагментов 1-4 я 3-5 А,Б, а такяе специфичности полученных антитэл» был использован ИФД в трех постановках-Анализ сэвси-вания ксноАТ о ВгСЫ Фрагментами показал полное отсутствие взаинодействкя ноноАТ NK2 о фрагментом 1-4 а лвбой постановке К?А. Необходимо сткэтить, что взаакодействве WK2 о фрагнентоа 3-5 проявляется талька в одной постановке ИОА, а ннгино (ио-ноАТ - ИФН - полиАГ/ПХ), когда фрагмент находятся в растворе, а яе фиксирован г:а плгйте или в комплексе о полнАТ- Поскольку при восстановлении 2-меркаптоэтанолом диоульфиднэй связи в фрагменте 3-5 АГ детерминанты для данных АТ не сохраняютсяi логична предполояить, что нх эпитоп является конфоряеционным. Для того, чтобы ''спмтаться локализовать вероятны» дополнительный фрагмент, еходкиий з ДГ детерминанту» необходимо было использовать результат зпатопного картирования группа 1!?Н.

7. KopS-aponaann Л, - 0« - 11« - Р я - И а понизь»

пкнелп во 21 иоггаклскааыгет-о ЛТш

Изучалось взапяодеяст9>ш пятя лейкоцитарвыз челсзеческнх н?н: -A, -D, -У, -II, -и -1 ГЕбридяото И7Н-Л/Г с 21 неягаАТ, полеченным к И!?Н-А.

Для характеристики ааткгецкых свойств И<5И-**А» а также специфичности полученных антител, ймля вспадьзоаапи три постановки И<?А: И"Л-К йопоАТ-ОТН-пслкЛТ/Пх'> характеризует способность nouoAT связывать интерферон, находящийся в нативнон Ферме в жидкой фазе и возможность пх применения для выделения в очистки И?Н. И9Л-2К подиАТ-1!9Н-понсАГ-КаМ/Пх> представляет интерес в тоя отношении, что нояоАГ рпагкр'лзт о ИФН идя его фрагментами, специфически свызанкг-чез а палиЛТ, сорбированными на твердой фазе. Эта постановка водеглврвет возможность для данных яоноАТ образовывать тандем в двуг.гйтовол ИФА- Необходимость проведения И?А в двух постановках связана также и о тэи, что эпитопы, узнаваемые ноноАТ, могут зависеть- от различных конфориацяй молекулы ИФН, находящейся в растворе или в

- 20- •

связанной о твердой фазой Форие. ИСД-Ш < воноАТ-и$11-консА? ЕЛ6/Ех) демонстрирует вознозность пртгенениа двусактового ПСА ели возяоанасть одяозроисшюгсэ свягызашда ИФН-А однкг: кс во-сладуекых нспоАТ • оовксстно о коноДТ 5Ао, козткгнрсзанньгп о ссра;соидь.оой хргна-

Лругкс £ейко.и;таркые челозечссгске И?И» а тшаш гибридна;; К5И- А/Р тестировали ИфА-1 в ИЗА-11.

Дли харсистсрсоткки панэлп нопоАТ учитывались слсдс^чис Крите^к;;: 111 Бзапкадяйствиг с определенный ВгСЫ <грсг!:е!ггом к вдваиие 1:3 это взатшдвйствке 2-кер$:гптсэтакола, 2) аиглво р&глкчг::: во взакгсодействни о вятыэ р&зличиынн дейксяштарныик ИЗН, 3) сравнение ггжалагмчаих АК пооладоватольноотей человеческих в шлшых И5Лч 4) вдкгкка некоторые иоиаАТ на прэтгэзо-Бцруонтги ахткзкость 112Н< 3) способность воакаодейотвозать с копплгксо.ч Н?Н-аокоАТ 5Д6.

По сзссоЗности езазхиадэйетзовать а ВгСН (рспгэптагв юв-следдэиые всноАТ кояно разладить на три ргалнчнкг грзпшз (та&дица 5)*

Таблица 5 ■ КэеоАТ к ИФН-Д, есааподанстауждио о раадичеып фрагвептаки Вт>СЫ расшоплгнкя кадекулг*

Фрагиевт,3-5 «Ррзгиент 1-4 Ь '

А-1. А-2« А-3, А-5, А-6, А-7, А-В, 5А6, ЫК2, 258, 268, 21В, В4В4, Н11Р6, НЮ1 А-10, А-Л, Е1С1, А-4, 4В7, А-12

Дснеш по воаииодгйстакы 21 нстоАТ с 5 различкыил ог-Зги-паии КФИ позволила разделить эти всиаЯТ на 7 групп, направленных к оходзшн эгпгтешая. Сравнительный анализ с данный» работы Алхака <А1Ъап| 19В5 0 в аяаллз результатов других -авторов позволил определить воноАТ - аналоги исследовавшейся ват: панели аятател (таблкца 6).

Таблица 6. Взаимодействие ионоАТ с рядом лейкоцитарных И?Н.

Эпитопы

ИфН I II III IV V VI VT' VII

А ♦ ♦ + + + ♦ + + + + + + ♦ + +

F + + + ♦ «■ + - - + + ♦ + t +

М + * + + ♦• ♦ + + + - -

D «■ + + - - + + t + ♦ +

11 + + + + ♦+ + + + + + ♦ ♦♦ + + + ♦ + ♦ -

1» А-10 А-11 Н1С1 А-1 А-6 А-2 А-3 A-12 B4B4 218 A-7 5A6 NK2 258 2ьа A-5 A-8 Hl 1F6 H1D1 A-4 4D7

2»* 2К-2 L-3B7 L0-22 74 IK-2 6N-5.2 Li-3 Li-5 Li -й Li-9 EBI-I EBI-3 Cys 3/2 Cys 3/7 Cys 3/8 Cys 3/21 Cys 3/22 Cys 4/4 Cys 4/7 7Ы 4-1 1/24 7Ы 2-4 Li -1 7N 4-6 Li-7 23/4 Li-8 4F2 ST-IO ST-126 BT- ISO ST-254 HC-46 Cys-1/3 Cys-1/4 Cys-1/5 Cys-3/8 Cys-3/12 Cys-3/14

1* - Наши данные 2»«- Литературные данные (-) - 0-25/. (♦) - 25-50* <*♦> За 100-Х принято связывание ИФН с - 50-75% («■ + ♦) полиАТ - 75- 1005i

Результаты разработанного нами подхода по изучения рао-пгеделенвг ЛГ. сайтов полностья совпадают о результатами пре-дыддиах ot т^одав. (Lydon et al-, 19В55 Cebrlan et aj., 1985! Alkan, 1935). Так, нами локализованы 7 эпитопо» в пределах AK последовательности с 1 по 148 АК ИФН-альфа. Из литераторы известен эпитоп в С-концевсй области молекулы ИфН, сформированный 16 последнипи С-концевыми АК остатками. Данный эпнтоп узнается ионоАТ AIII/21, способными взаимодействовать как с ИФН-^2» так и с ИФН-ntl, предварительно сорбированными на клеточных рецепторах (Arnheiter et al•■ 1983). Таким образом, наши данные такие подтверждают, что на поверхности интер»еро-новой глобулы могут существовать 8 эпятопов, узнаваемых различными mohdAT (таблица 6 >-

Способность 12 ионоАТ из исследуемой панели отменять или яягибировать противовирусная активность ИфН-А контролировали

на линии СПЗВ-Полное мотивирование противовирусной активкости наблюдалось при взаимодействии Н?Н-А лишь с антителом A3- При 100-кратнои молярной избытке ионоАТ по отношению к ИФН отмена противовирусной активности обнаружена с моноАТ А-11, А-12, ЫК2, H11F6, 5А6, А6. МоноАТ А-2, А-В, А-10, 21В, В4В4 оказались иенейтрализукщини AT-

Проведенный наяи комплекс исследований позволил выделить моноАТ А10, All, А12, взаимодействующие с ВгСЫ-фрагментом 1-4 ИФН-А, в котором при восстановлении дксульфидной связи 2-г.ер-каптозтанолол сохраняются АГ детерминанты для данных AT- В то же время эпитопы, узнаваемые ими, четко различимы- Анализ взаимодействия ионоАТ с пятью субтипзии ИФН показал, что моноАТ А10, Ail, а также моноАТ HICI способны взаимодействовать со всеми исследовавшимися HÏ>H.

Влияние 2-НЗ на взаимодействие моноАТ ЫК2 с ВгС-Ы фрагментом 3-5 указывает на то, что в эпитоп помимо уже локализованных АК остатков 113-121 фрагмента S могут вхоаятъ АК остатки 22-59 Фрагмента 3- Анализ гидрофильности фрагмента 3 по методу Норр & Woods (19Э2) позволяет выделить четыре участка, которые могут обладать ¿нтигбнныки свойствами: АН NN19-25, 2В-34, 38-43, 47-52- Как следует из полученных нами результатов, НК2 не полностью отиеняет противовирусную активность, что является косвенный свидетельством • того, что АК остатки ЫЫ 113-121 не взаимодействуют непосредственно с предполагаемым противовирусным "активным центром", вклнчаюыяи АК остатки NN 30-33 (СахЫе et al-, 1986).

На основании данных эпитопного картирования ж эффективности связывания И<?Н Ь ионоАТ А2 « A3 можно с больной степенью вероятности предположить,, что основной вклад в формирование АГ детерминанты для • них принадлежит АК остаткам NN22-26, а поскольку эти антитела взаимодействуют с комплексом ИФН - 5А6/ПХ, есть основания считать, что этот участок не входит в эпитоп НК2- В пользу того, что из двух оставшихся гидрофильных учаотков в эпитоп ЫК2 может входить участок NW38-43, свидетельствуют данные работы Шехтер н др. (Шехтер и др-, 1990), по которым при введении изменений в структуру Ччастка АК последовательности ЫЫ 38-42 наблюдалась корреляция с изменением связывающей способности NK2- Таким образом наиболее вероятный участком N-концевой области молекулы ИфН-А, входящей в состав эпитопа ЫК2, по-видииоиу, следует считать

АК остатки 38-42.

ЕЫВОДЫ.

1 - Четырьмя независимыми подюлани показано, что пыниные? ноноАТ NK2 узнают АК остатки 112-121 ИФН-А, локализованные в С-котдевой области иодекули-

2- Разработан метод выделения рекоибинаитного лейкоци-тарного lifpH-F из K-col i -

3- На основании изучения специфичности взаимодействия панели из 21 ионоЛТ к ИфН-А с пятью лейкоцитарными ИФН правомерно предположить, что поверхность И ¡41 го*ет выть разделена пр крайней мере на семь антигенных областей* состоящих из перекрывающихся АГ детерминант.

4. В результате анализа взаимодействия ряда ионоАТ с ВгСН' фрагментами ИфН-А п эпитолного картирования пяти субтипов ИФН обнаружено, что ноноАТ А10, All, Н1С1 связываются со всеми исследованными субтипами И5>Н-

5- Пи лиз взаимодействия ЫК2 с BrCN Фрагментами ИФН-А и пять» субтипами И7Н, характер влияния NK2 на противовирусную активность И<?И, а также сравнение полученных результатов с данными других авторов, позволяет предположить, что эпитоп данного ноноАТ является конфоркационным и сфорннров ан аминокислотными остатками 113-121 и, поувидимоиу, 38-42-

Перечень работ, в которых отражены основные научные результаты диссертации»

1. Стронгнн А-9 ■, Костров С.В., Борухов С-И. , Алексенко А-П-, Баг via В.Г., Новиков А.А>, Рыжавская A.C., Изотова Л.С. "Природные и генно-инженерные белки - сходство и отличия" • Биотехнология, 1987, т.З, N3, стр. 325-331.

2. Алексекко A.n., Стронгнн А.9., Изотова A.C., Костров С.В. "Локализация антигенной детернинанты лейкоцитарного человеческого интерферона альфа-А с помощь» конструирования гибридного интерферона A/F".

Тезисы 5 конференции молодых ученых соц. стран по биоорганической химии* Пуыино, 1988, стр. 74.

3' Дебабов В-Г., Свердлов Е-Д., Козлов И.К., Маыко С.В.,

Стронгин A. S-, Стеркнн В-Э-, Юрин В.А., Лапидус A.A., Лебедева М.И., Изотова A.c., Алексенко А.П. , Скворцов а H.A., Ионов Ю.В., Царев С.А., Монастырская Г.С-"Реконбинантная влазмидная ДНК pPH-IFH-oiF-2, обеспечива»-мая микробиологический синтез лейкоцитарного (o£F) интерферона человека, штамм Escherichia coli ВКПМВ-4567 - продуцент интерферона^ человека".Авт. св-во СССР, N4627942/13, положительное решение от 23-06.89.'

4. Alexenko А.Р., Izotova L.S., Strongin A. Ya.

"Reconstruction of an epitope, capable of binding murine jaonoclonal antidodies NK2 within the sequence of htman leukocyte interferon alpha-F by site-directed mutagenesis". Biochem. Biophys. Res- Comnun-, 1990, v.169, N3, pp. 1061-

5. Alexenko A-P., Izotova L.S., Kostrov S.V., Strongin A. Ya. " Mapping of an epitope of human leukocyte interferon A, capable of binding murine monoclonal antibodies NK2"• 7-th International Conference of Young Scientists on Organic and Biological Chemistry. Abstracts. Varna, Bulgaria, September 17-23, 1990, pp-59-60.

1067