Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ РЕГЕНЕРАЦИИ И КЛОНИРОВАНИЯ НЕКОТОРЫХ ПЕРУАНСКИХ ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ РЕГЕНЕРАЦИИ И КЛОНИРОВАНИЯ НЕКОТОРЫХ ПЕРУАНСКИХ ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO"

Л

На правах рукописи

ВАЛЬДЕРРАМА РОМЕРО Антонио Саломон

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ РЕГЕНЕРАЦИИ И КЛОНИРОВАНИЯ НЕКОТОРЫХ ПЕРУАНСКИХ ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2002

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им К А. Тимирязева

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук, доцент Е А. Калашникова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Л Д Прусакова

кандидат биологических наук, И В. Голденкова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Защита диссертации состоится « 26 » июня 2002 г в 12 00 заседании диссертационного совета Д 220.043 10 в (■• сельскохозяйственной академии им К.А. Тимирязева по адрес; Москва, И - 550, ул. Тимирязевская, 49, отдел защиты диссертзь

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной ( с

МСХА

Автореферат разослан « 10 »

U>bflA, 2002 г

Ученый секретарь Диссертационного совета.

-v //

кандидат биологических наук '------Г.И Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы! Картофель — одна из ' ведущих и наиболее ценных продовольственных культур в мире, наряду с зерновыми (пшеница, рис, кукуруза). Он превосходит все остальные сельскохозяйственные культуры по производству белка на единицу площади и времени, и большинство — по производству энергии. Особенную ' ценность картофель представляет для решения мировой продовольственной проблемы. Его по праву называют вторым хлебом.

: Изучение молекулярных и клеточных основ клонального микроразмножения, каллусогенеза и морфогенеза in vitro важно не только для понимания закономерностей онтогенеза высших растений, но и для успешного развития методов клеточной и генной инженерии растений. Усилия клеточных и генных инженеров, направленные на создание новых форм растений, сочетающих признаки устойчивости к абиотическим стрессам и патогенам ' с высокой продуктивностью и качеством продукта, могут быть успешными только при получении от генетически измененной клетки растения, способного передать потомству приобретенные признаки. Управление ' селекционным процессом картофеля с помощью методов культуры тканей обязательно предполагает знание клонального микроразмножения, условий индукции и обеспечения процессов дедифференцировки тканей растения. ' '

Хотя картофель вегетативно размножаемая культура,' у которой, казалось бы, должен легко идти морфогенез in vitro, однако существует немало сложностей в индукции морфогенеза при культивировании клеток. Влияние самых различных факторов на морфогенез in vitro у многих сортов картофеля изучено целым рядом авторов (Аветисов, Мелик-Саркисов, 1984; Алексеева, 1990; Рассадина, Хромова, Юрьева, 1990; Litz, Jarret, 1991; Семанюк, Яковлева, 2000; Богомаз, Лутова, 2001). Практически для каждого сорта надо подбирать свои оптимальные условия для морфогенеза in vitro. Поэтому изучение и оптимизация условий индукции морфогенеза ' картофеля из культивируемых клеток является необходимой составной частью работы по изучению в культуре in vitro новых ценных форм' растений этой культуры. ' < -

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение в культуре in vitro влиян]

СпТРЛЛБг

среды на процессы erfcdt^irfWAik Sht&tfUfiStëEEAfA п| обирочных растений' и Моск. сельскокоз академии

Инв

редиентов питательной

изолированных эксплантов 11 генотипов перуанского картофетя

Для достижения поставленной цели быю необходимо решить следующие задачи'

- изучить в динамике рост и развитие микропобегов 11 генотипов картофеля при клональном микроразмножении,

- подобрать оптимальные условия культивирования для плохо растущих генотипов,

- выявить устовия культивирования микрочеренков, обеспечивающих получение микроклубней,

- изучить вчияние первичного экспланта (междоузлий стебля, лист, сепиент микроклубней) на процесс каллусогенеза,

- изучить влияние различных ауксинов на формирование и пролиферацию каллусной ткани,

- изучить влияние различных сочетаний цитокининов и ауксинов на морфогенез каллусной ткани,

- изучить влияние различных сочетаний цитокининов, ауксинов и гибберелловой кислоты на индукцию образования адвентивных побегов непосредственно на корневых эксплантах,

- оптимизировать устовия выращивания гриба Rhizoctonia solara Kühn с получением культурального фильтрата данного патогена,

- провести оценку роста и развития микрочеренков картофеля на питательных средах в присутствии культурального фильтрата гриба Rhizoctonia sotaní Kühn

Научная новизна. Впервые проведено детальное исследование регенерационной способности 11 генотипов перуанского картофетя в условиях in vitro и усовершенствован процесс их клонального микроразмножения Выявлена возможность размножения картофеля с использованием корневых эксплантов Оптимизированы питательные среды на всех этапах культивирования картофеля Изучена зависимость формирования микроктубней от упеводных и гормональных факторов питательной среды Впервые проведена оценка микрочеренков картофеля на устойчивость к Rhizoctonia solani Kiihn с использованием культурального фильтрата данного патогена. Установлено, что реализация морфогенетического потенциала у растений рода Solanum L. в значительной степени ¡аписит от генотипа, эпигенетических особенностей экспланта и условий кучьтивирования

Практическая значимость. Экспериментальные данные по оптимизации условий культивирования пробирочных растений' и изолированных эксплантов картофеля могут быть • использованы' для физиологических и генетических исследований, в селекционном процессе для отбора устойчивых к стрессовым факторам сортов, в работах по направленной и сомаклональной клеточной селекции картофеля, а также в создании на их основе растений с улучшинными признаками с помощью методов клеточной и генной инженерии растений.

Апробация работы.; Результаты диссертационной работы были представлены на • ' Международной научно-практической конференции «Сельскохозяйственная биотехнология» (Горки, 1998),' на V Международной конференции «Регуляторы ' роста и развития • растений» (Москва, 1999), на Международной научно-практической ■ конференции «Молодые* ученые-возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (Брянск, 2000), на II Международной научной конференции «Биотехнология'' в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000), на Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология-возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2001), и на заседаниях кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 13 научных работ. ' ' '

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, а также из пяти глав экспериментальной части, выводов и' списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 183 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц и 49 рисунков и фотографий. Список использованной литературы включает 299 наименований, из которых 139 зарубежной литературы."

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объекта исследования использовали 11 перуанских сортов и видов картофеля: Рунтус {Solarium goniocalyx Juz. et Buk. cv. Runtus), 2n=24. Кашпадана (Solarium goniocalyx Juz. et Buk. cv. Cashpadana), 2n=24. Гуайро (Solatium x ' chaucha Juz. et Buk. cv. Huayro), 2n—36. Сани Имилья (Solatium andigenum Juz. et Buk. cv. Sani Imilla или Solarium tuberosum ssp. andigena cv. Sani Imilla), 2n=48. Тикагуаси (Solanum tuberosum L. cv. Ticahuasi). Томаса (Solanum tuberosum L.

cv. Tomasa Tito Condemayta) Июнгай (Solatium L cv Yungay). Марива (Solatium tuberosum L cv Mariva). Револусвон (Solatium tuberosum L cv Revolucion). Мария Гуанка (Solatium tuberosum L cv Maria Huanca) Канчан (Solatium tuberosum L, cv Canchan). Перуанские генотипы были любезно предоставлены Международным центром по картофелю (CIP) г Лима, Перу

В работе придерживались принятых на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА принципов стерилизации растительного материала, питательных сред, инструментов и оборудования изложенных в «Лабораторно-практичсские занятия по сельскохозяйственной биотехнологии» (1996)

Микроразмножение картофеля. Изучали влияние активированного угтя 8 г/л (Tabulettae Carbotus activatt 0,25), а также сочетание индолилуксусной кистоты (ИУК) 1 мг/ч и кинегина 0,1 мг/л, на процесс роста микрочеренков с целью получения максимального коэффициента размножения В качестве контроля была использована безгормональная среда МС

Образование микроклубней С целью получения микроклубней, микрочеренки с 1-ой пазушной почкой культивировали на модифицированной питательной среде МС, содержащей различные цитокинины и сахарозу в концентрации 7 % В качестпе цитокининов использовали БАП или кинетин в концентрации 2 мг/л Повторность опыта - 16-ти кратная Наблюдения за образованием микроклубней осуществляли каждые 10 дней, начиная с 15-ого дня культивирования микропобегов по 90-ый день

Образование каллуса из эксплантов стеблевого, листового и клубневого происхождения с использованием различных ауксинов. Зкспланты выращивали на модифицированной питательной среде МС с добавлением кинетина 0,2 мг/л и зеатина 0,05 мг/л Изучали влияние 2,4-Дихлорофеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) в концентрациях 0,0, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 и 10.0 мг/л, и ИУК (0-индолилуксусная кислота), НУК (а-нафтилуксусная кислота), ИМК ([¡-ицдолил-3-масляная кислота), в концентрациях 0,0, 0,3, 1,0, 3,0 и 10,0 мг/л на процесс каллусогенеза. Пересадку каллусной ткани осуществляли один раз в шесть недель

Прирост биомассы каллуса анализировали путем индивидуального взвешивания каллусных агрегатов в стерильных усчовиях на аналитических весах в момент очередного пассирования

Наблюдения проводили еженедельно, при этом учитывали следующие показатели: размер (мм), и среднюю массу каллуса (мг), способность к каллусогенезу (%), а также прирост сырой биомассы каллусной ткани (%), который рассчитывали по формуле 1.

Формула 1.

W - [( т- Wo) : Wo¡ 100 (%)

W - Величина относительного прироста (%) Wo - Исходный вес ткани Wí — Конечный вес ткани

Влияние разных цитокининов на морфогенез каллусной ткани. Каллусную ткань выращивали на твердой авизованной питательной среде MC с добавлением 0,05 мг/л НУК, 0,3 мг/л гибберелловой кислоты (GA3-C15H2206). Для морфогенеза изучали следующие цитокинины: БАП (6-бензиламинопурин), кинетин (6-фурфуриламинопурин), 2iP (N6-( у, у -диметилаллил) аденин, кинетин-рибозид и зеатин. Концентрация цитокининов была 3,0 мг/л для всех вариантов питательных сред за исключением зеатина, концентрация которого составила 0,4 мг/л.

Влияние различных ауксинов на фоне постоянных конценирации ■ цитокининов на морфогенез каллусной ткани картофеля. Морфогенез каллусной ткани изучали на питательных, средах, содержащих кинетин 0,2 мг/л и зеатин 0,1 мг/л с добавлением ИУК и ИМК в концентрациях 0,3;1,0;3,0 и 10,0 мг/л.

Адвентивное побегообразование непосредственно на корнях картофеля. Основная среда содержала минеральные соли по Мурасиге и Скугу, сахарозу 2,5 % и агар 0,8 %. Было изучено 3 варианта питательной среды: I среда содержала ИУК 0,1 мг/л и БАП 1 мг/л; II среда - ИУК 0,1 мг/л, зеатин 2 мг/л и ГК 10 мг/л; III среда -ИУК 0,1 мг/л, БАП 1 мг/л и ГК 10 мг/л. Экспланты культивировали при постоянном освещении (3000 люкс), создаваемой флуоресцентными лампами ЛД-40, при температуре 24-25°С днем и 19-20°С ночью. В каждом варианте число сегментов корней составило 30-50 шт.

Выращивание гриба Rhizoctonia solanl Kühn и получение культурального фильтрата. Патоген выращивали на агаризованных и жидких средах, в двух вариантах: I-безгормональная среда Мурасига и Скуга и Ii-среда Чапека. Гриб культивировали в течение 70-ти дней. Определяли оптическую плотность (D) культурального фильтрата каждые пять дней, с момента выращивания патогена, на свегофотометре КФК-2-УХЛ 4.2, ГОСТ 8711-78.

Культивирование микрочеренков картофеля на средах в присутствии культурального фильтрата гриба Rhizoctonia \olani Kuhn. Pa6oia проводи им. с микромер елками картофеля,- В качестве селективного фактора бьш использован культуральный фильтрат фиба Rhizoctonia solam Пспучеиный кутьтураяьный фильтрат добавляли в питательную среду в концентрациях 25, 50, 75 и 100% В процессе культивирования опредечятн длину микропобегов (см) количество листьев, длину корней (см) и коэффициент размножения (штЛкапанг)

Статистическая обработка. Резу1ьтаты жепериментов бьпи стагистически обработаны с испозьзованием профаммы Slrav и Гхсе! Проведен дисперсионный анализ и определена наименьшая существенная разница (HCPoi) а также найтена стандартная ошибка И1И ошибка выборочной средней (Гага Y.tmrme 1480, Izquierdo! оре/,1991, Усманоя, Васичьева, Васитьен. 1993) РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 1. Изучение особенностей роста н развития карюфеля при

клональном микроразмножении (микрочеренкование) Из всех изучаемых перуанских генотипов картофеля /иибоштю морфогенстическую активность проявили сорта I икаг\аси. Марива и Кошпадана Эго выражалось в i ом, что на протяжении полутора лет кучьтивировачия т vurn и» микрочеренков формировались побеги высоюй 10— 12 см с «отечеством листьсв от 12 до 17 tirr на один микропобе!, в го время как остальные copra имели ш ico i у побега 4-8 см и количество зистьев 6-10 шт Тту морфогенетическую активность можно рассмотреть более подробно на рисунке 1 Причем и ало отмстить, что при длительном микрочеренковании побегов уменьшалась способное!!, пазушных почек формировать нормальные по развитию побеги а максимум отмечался на VI пассаже для всех исстедуемых генотипов ')то в свою очередь требовало дополнительных исследовании в подборе питательных сред пя нормализации ростовых процессов Во всех вариантах коэффициент размножения был в прете iax от 5,7 до 15,1 (шт/эксплант) причем максимальный котффициект размножения бь. i отмечен для всех отучаемых генотипов через 6 месяцев с начата к\ тьтивировання

Способность микропобегоч к укоренению у всех изучаем}ix генотипов находитесь в пределах ог 58 1 ío 100 %. Особо отчичался сорт Маривт. ля которого во всех изучаемых временных чкешпидиях ггот показатс ib cocí ави i 90,1 - 100%

£

.. . Коэффициент размножения,шт/эксллант

О . К) ^ /о».*". , 00 о м л го

' я

а а -к

1

М

Вт

в I

В а х

я

8 $

8Г 28

а

м

£ а 3 Й

а

I ^ 1 ¡§

181

Тикзгуаси

Томаса

Июньгай

Марива

Револусион

Мария Гуанка

Канчан

Рунтус Э. допюсз1уж

Кашпадана 8. допюса1ух

■ ■ Гуайро в. х сИаисЬа

С. Имипьй -Э. апсйдепит

1.1. Действие активированного угля и фитогормонов на рост и развитие пробирочных растений картофеля.

Исследования показали, что существует зависимость клонального микраразмножеиия картофечя от исходного генотипа и состава питателыюй среды Коэффициент размножения изучаемых генотипов картофеля представлен на рисунке 2 Для всех исследуемых генотипов и вариантов сред пот показатель находился в пределах от 4,3 до 12,4 (пгг/эксплант), причем максимальный коэффициент размножения был отмечен для всех изучаемых генотипов в варианте с активированным углем, исключение составил лишь сорт Марива.

Изучая процесс роста микрочеренкоа и формирования микропобегов в динамике было установлено, что культивирование эксплантов на безгормональной среде и на среде, содержащей активированный уголь заметно влияло на рост основного побега и практически не оказывало действие на формирование боковых побегов (от 1 до 3 шт) На среде с ИУК 1мг/л и кинетином 0,1 мг/т микрочеренки формировали более короткий главный побег, но при этом наблюдалось массовое образование боковых побегов (от 4 до 6 шт) Причем, как при внесении индивидуальных регутяторов роста, так и при их сочетании отчетливо проявлялась сортовая реакция Например, по видам наибольший выход микрочеренков получен при внесении в среду активированного угля, а по улучшенным сортам - при совместном применении ИУК и кинетина.

Гуаиро С Имилья Июньгай Марива Канчан

SxChaucha S andigenum

ТЭМС ■ МС+Уголь 8 г/л ОМС+ИУК 1 0 мг/л-ИСинатин 0 1 мг/л

Рас. 2. Влияние среды на коэффициент размножения картофеля в условиях in vitro.

2. Влияние БЛП, кинетика н компонентов питательной среды на образование микроклубней в культуре Ы \ltro.

Результаты представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что способность эксплантов формировать микроклубни различных генотипов картофеля, зависела от содержания в питательной среде регуляторов роста и сахарозы. , Установлено, что культивирование микрочеренков: на среде, содержащей БАП. 2 мг/л . и сахарозу 7% приводило к более высоким показателям, по способности микропобегов. формировать микроклубни, по сравнению со средой, содержащей кинетин и сахарозу в тех же концентрациях. Так, средний диаметр микроклубней в этом варианте колебался от 1,44 до 3,47 мм, а средний вес составил от 4,21 — 43,65 мг. В среднем на 1 растении образовывалось по 0,44—1,56 шт. микроклубня...... , .. л

Таблица 1.

Влияние условий культивирования на развитие микроклубней in vitro -' некоторых генотипов картофеля (90 дней наблюдения). ■

Вариант опыта Количество микроклубней на 1 растение, шт. Средний диаметр микроклубней, мм Средний вес микроклубней, .. мг

Тикагуаси (Solanum tuberosum L. cv. Ticahuasi)

Сахароза 7% >■■ Сахароза 7%+БАП2,0мг/л Сахароза 7%+Кин 2,0мг/л ■ НСРм • 0,31 . 1Д5 . 0,75 1,60 ±0,22 2,99 ±036 2,66 ±032 0,88 3,40 ±0,5 . . 35,01 ±4Д ' ' 18,54 ±2,2 .. 4,51

Томаса (Solanum tuberosum L. Cv. Tomasa)

. ' Сахароза 7% Сахароза 7%+БАП2,0мг/л Сахароза 7%+Кин 2,0мг/л НСРи 0,38 0,44 0,44 1,62 ±0,13 1.74 ±0,43 1,87 ±0,26 0,91 5,78 ±0,5 4,21 ± 1.0 6.49 ±0,9 4.50

Револусион (Solanum tuberosum L. Cv. Revolución)

Сахароза 7% Сахароза 7%+БАП2,0мг/л Сахароза 7%+Кин 2,0мг/л НСРи 0,0 1,56 0,69 0,0 2,68 ±031 2,12 ±0,38 0,67 0,0 24,48 ±2,8 13,56 ±2,4 3,68 '

Мария Гуанка (Solanum tuberosum L. Cv. Maria Huanca)

Сахароза 7% Сахароза 7%+БАП2,0мг/л Сахароза 7%+Кин 2,0мг/л НСРи 0,0 1,0 1,13 0,0 3,47 ± 036 3,14 ±031 0,74 0,0 43,65 ±4,5 29,88 ±2,9 3,65

Каичан (Solanum tuberosum L. cv. Kanchan)

Сахароза 7% Сахароза 7%+БАП2,0мг/л Сахароза 7%+Кин 2,0мг/л НСРи 0,44 ' 1,13 1,0 2,11 ±0,31 '2,33 ±0,17 . 2Д2 ± 0,17 0,48 12,54 ±1,9 9,71 ±0,7 8,63 ±0,6 10,71

Из результатов, приведенных в таблице I видно, что микрочеренки сортов Револусион и Мария Гуанка при культивировании на безгормоналыгой среде МС, содержащей сахарозу 7 %, не была отмечена способность микропобегов формировать микроклубни на протяжении всего периода наблюдений В то же время, для сорта Револусион на среде МС с БАП (2 мг/т) и сахарозы 7 % были отмечены наилучшие показатели (25 шт) в конце наблюдений Установлено, что не все изучаемые генотипы способны образовывать с высокой эффективностью микроклубни Культивирование микрочеренков на среде с кинетином также было эффективно для клубнеобразования, однако некоторые показатели были ниже, чем в варианте с БАП 2 мг/л Анализируя процесс формирования микроклубней в динамике, было замечено, что начиная с 45-го дня культивирования микрочеренков на средах, содержащих цитокинины, резко возрастает процесс клубнеобразования Из всех изучаемых генотипов лишь сорт Томаса проявил низкую способность формировать микроклубки Во всех вариантах питатечьных сред, общее количество микроклубней для этого сорта не превышало 6-7 шт, по сравнению с остальными генотипами, для которых было характерно формирование 11-25 шт микроклубней в зависимости от варианта.

Как видно из рисунка 3, микрочеренки сорта Гомаса лишь в 25-37,5% случаев были способны к клубнеобразованию Для остальных генотипов этот показатель был выше и находился в пределах 43,8-87,5 % Оптимальной средой для микроклубнеобразования являлась среда МС, содержащая сахарозу 7% и БАП 2 мг/л

Визуальные наблюдения позволили выявить некоторую закономерность в образовании микроклубней на микропобегах Было установлено, что клубни могли формироваться на верхушке стебля, в пазухе листа или в питательной среде на столонах.

Тип образования микроклубней зависел от генотипа и варианта используемой среды Так, при культивировании микрочеренков всех изучаемых генотипов, на безгормональной среде МС с 7% сахарозой, приводило к формированию клубней лишь на верхушке побега В то время как на средах с кинетином и БАП этот процесс имел место, как на верхушках побегов, так и в пазухе листа, и очень редко в питательной среде на столонах Как правило, микроклубни формировались удлиненной, столонообразной формы или крупой, схожей с нормальным клубнем

......я

Тишуаси Тоиса Р«волусмон Март Г^аяж. Кммн

Генотипы

|вСа>ароаа7% HCgxBpoaa7%*fiAn2.0MrfH |ЗС»арои7%*К*«пм2.0мг/л |

Рис. 3. Влияние регуляторов роста иа способность микропобегов картофеля к клубнеобразоваиию.

Цвет микроклубней полностью совпадал с клубнями, получаемыми в условиях in vivo и имел разброс цветовой гаммы от светло-зеленого до темно-фиолетового в зависимости от генотипа.

3., Изучение влияния 2,4-Д на процесс каллусогенеза различных эксплантов картофеля.

Исследования показали, что экспланты различных частей растения по разному реагировали на гормональный состав среды. Так для листовых и клубневых эксплантов увеличение в среяе концентрации 2,4-Д стимулировало каллусогенез. Оптимальной средой для получения каллуса является среда с содержанием 2,4-Д 3 мг/л. Однако, эта зависимость не прослеживается на стеблевых эксплантах, и при увеличении концентрации 2,4-Д интенсивность каллусообразования даже несколько снижалась (рис. 4). При культивировании на среде с 2,4-Д (3 мг/л), кинетином (0,2 мг/л) и зеатином (0,05 мг/л) наилучшие результаты были получены на стеблевых и листовых эксплантах, тогда как на клубневых эксплантах каллусообразование было менее интенсивно.

Для изучения динамики образования каллуса была отобрана среда с 2,4-Д" (0,1-10 мг/л), кинетином (0,2 мг/л) и зеатином (0,05 мг/л) для стеблевых, листовых и клубневых эксплантов. Использование этих сред обеспечивало возможность

03 I

Концентрации 2 4-Д, мг/л

—*— Рунтус -»-Кашпадана -«-Гуаиро -»-СаниИмилья(

03 I

Концентрация 2 4-Д мг/л

г—Тикагуаси -»-Мария Гуама

03 1

Концентрация 2 4-Д, ыг'л

-Томаса ■

-Июньгаи

03 1

Коцвктрацня 2 4-Д, мг/л

-Мариаа -»-Реаолусион -»-Канчан

Рис. 4. Зависимость прироста каллуса, полученною из стеблевых эксплантов картофеля, от концентрации 2,4-Д.

получать интенсивно растущую каллусную ткань.

Специализированная клетка дифференцированной ткани in vitro изменяется под влиянием условий выращивания Подбор условий культивирования для каждого генотипа и типа ткани носит индивидуальный характер Однако, на оптимальной среде различные ткани претерпевают по направленности развития аналогичный путь, приобретая свойства, характерные для каллусных тканей

На основании проведенных исследований можно сделать вывод что для многих генотипов картофеля универсальной средой, для интенсивного стеблевого, листового и клубневого каллусообразования и минимальной по составу регуляторов роста, является среда с минеральной основной и органическими добавками по Мурасиге-Скугу, содержащая t-З мг/л 2,4-Д, 0,2 мг/л кинетина и 0,05 мг/л зеатина.

3.1. Изучение действия различных ауксинов на пролиферацию каллусной ткани.

Анализ полученных результатов показал, что образование каллусной ткани зависит от типа и концентрации ауксинов В работе были изучены следующие ауксины ИУК, НУК и ИМК и сорта Канчан и Мария Гуанка. Во всех вариантах эксперимента отмечалось образование каллусной ткани Отрезки междоузлий через 5-10 дней увеличивались в размере, а через 2 недели образовывался каллус Причем с разными ауксинами формирование ткани происходило по-разному Каллус формировался определенного цвета, формы и консистенций Так, в варианте с присутствием в питательной среде ИУК каллус формировался на концах экспланта, имел гтобулярно-зернистую консистенцию и светло-зеленый цвет Каллус в варианте с НУК имел фиолетово-зеленый цвет и плотно-сахаристую консистенцию, а в варианте с ИМК наблюдалось образование плотного каллуса с желто-зеленым цветом

Прирост сырой биомассы каллусной ткани сорта Канчан (рис 5) составил в варианте с ИУК - 296,6 - 1094 8 %, в варианте с НУК этот показатель был в пределах от 1213,5 до 5335 5 %, а в варианте с ИМК этот показатель был ниже по сравнению с ИУК и ИМК, и составил 289,1 - 921,0 %. Прирост сырой биомассы каллусной ткани сорта Мария Гуанка (рис 5) составил в варианте с ИУК 173,5 -875,9 %, в варианте с НУК этот показатель был в пределах от 985,7 до 2890,9 %, а в варианте с ИМК этот

Концентрация ауксинов, мг/л

—»-ИУК -ж-НУ К -»-Ш I

Рис. 5. Зависимость прироста каллуса стеблевых эксплантов от концентрации ауксинов сортов Канчан и Марна Гуанка (рисунок снизу) в культуре in vitro.

показатель был ниже по сравнению с ИУК и ИМК, и составил 176,0 - 268,6 %. Экспериментально установлено, что оптимальными концентрациями ИУК, НУК и ИМК, вызывающие максимальный рост каллуса, является 1,0 мг/л, 10,0 мг/л и 3,0 г/л соответственно. Однако концентрации, при которых' можно получить оптимальный рост каллуса составляют: 0,3-1,0 мг/л для ИУК, 3,0-10,0 мг/л для НУК И 1,0-3,0 мг/л для ИМК.

4. Влияние различных ауксинов на фоне постоянных конценирации цитокинннов на морфогенез каллусной ткани картофеля.

Данные по регенерационной способности (число регенерантов на один экеплант), представлены в таблице 2 Из нее следует, что для сорта Канчан, с повышением концентрации ИУК в среде снижался учитываемый

показатель, а повышение концентрация ИМК до 3,0 мг/л приводило к увеличению регенерационной способности Дальнейшее повышение концентрации ИМК сопровождалось угнетением этого показателя У сорта Мария Гуанка в варианте с ИУК этот показатель также снижался с повышением концентрации этого фитогормона, л в варианте с ИМК регенерационная способность была ниже, чем в варианте с ИУК Наилучшие результаты по регенерационной способности для двух сортов были получены в варианте с ИУК - 0,3 -1,0 мг/л, а в варианте с ИМК в пределах от 1,0 до 3,0 мг/л

Интенсивность регенерации сорта Канчан (табл 2) в варианте с ИУК повышалась до использования данного ауксина в концентрации 1,0 мг/л и ниже Дальнейшее повышение концентрации ИУК сопровождалось снижением этого показателя В варианте с ИМК получили схожие результаты как и по регенерационной способности, учитываемый показатель повышался до концентрации 3,0 мг/л ИМК. Уветачение концентрации вызывало снижение интенсивности регенерации Интенсивность регенерации для сорта Мария Гуанка (табл 2), уменьшалась с повышением концентрации ИУК, в варианте с ИМК наблюдалось повышение этого показателя до концентрации ИМК 3 0 мг/л, дальнейшее увеличение концентрации ИМК сопровождалось угнетением этого показателя Наилучшие результаты по интенсивности регенерации для двух изучаемых сортов, были получены в варианте с ИУК в пределах от 0,3 до 1,0 мг/л, а в варианте с ИМК в пределах от 1,0 до 3,0 мг/л

У сорта Канчан с повышением концентрации ИУК наблюдалось снижение всех учитываемых показателей (табл 2) С повышением концентрации ИМК отмечалось повышение всех показатетей до концентрации 3,0 мг/л, а дальнейшее повышение концентрации приводило к снижению морфогенетического потенциала. У сорта Мария Гуанка с применением ИУК наблюдались такие же результаты, как у сорта Канчан В варианте с ИМК для сорта Мария Гуанка регенерация была получена только при концентрациях 1,0 и 3,0 мг/л

Таблнпа2.

Влияние концентрации ауксинов на образование растеннй-регенерянтов из первичного каллуса картофеля в культуре in vitro.

Число. Число Число

Концен- Частота регенератов регенеран- регенератов

трация регенерации, (регенерацией •:• тов на на 1регене-.

Ауксинов, % ный эксплант, рирующицй

мг/л * потенциапь), шт. каллуса, шт.

ШТ.

Канчан (Solanum tuberosum L cv. Kanchan)

ИУК. 0,3 . 68,8 34 2,13 •' 3,09

1,0 4U 23 135 3,29

3,0 11,8 " ' з ■ 0,18 1,50

* .10,0 , , 5.5 . 1 ■ 0,06 1,00

ИМК 0,3 17,6 3 0,18 1,00

1,0 35,0 19 0,95 2,71

3,0 68,4 "42 2Д1 3,23

10,0 - -

Марна Гуанка (Solanum tuberosum L. cv. Maria Huanca)

ИУК 0,3 58,8 ' 41 2,41 • ' 4,10

1,0 36,4 15 . 1,36 3,75

3,0 16,6 5 0,42 2,50

10,0 . . -

ИМК 0,3 - , • - ■ -

1,0 20,0 4 0,27 из

3,0 14,3 ■ 4 0,29 2,00

10,0 . . - - - -

4.1. Влияние фитогормонов на адвентивное побегообразование на корнях картофеля.

Полученные результаты показали, что существует возможность индуцировать адвентивные микропобеги из сегментов корней картофеля в культуре in vitro. В ходе культивирования на корнях формировались особые компактные структуры зеленого цвета (узлы). Впоследствии из этих узлов развивались регенеранты. Меристематические очаги закладывались на корнях через 2-3 недели от начала эксперимента. Количественные данные о закладке узлов представлены в таблице 3.

Для сорта Канчан развитие регенератов из заложившихся адвентивных почек начиналось уже через 5-6 недель от начала эксперимента. Формирование узлов необязательно приводило к развитию регенератов. Так у сорта Тикагуаси адвентивные побеги не развивались в варианте с зеатином и ГК, однако узлы на корнях растений во всех вариантах формировались.

Таблица 3.

Регенерацирнная способность корней картофеля в культуре in vitro

Вариант опыта Число эксплангов Общее число узлов.

с узлами % шт

Гикагуаси (Solanum tuberosum L. cv Ticahuasi)

МС *- ИУК 0,1мг/-! +

БАП 1мгУл (контроль) 45,4 17

МС + ГК Юмг/л * ИУК 0,1 мг/л -

БАП 1мг/л 54,5 12

МС + ПС Юмг/л + ИУК 0 1 мг/л ч-

Зеатин 2мг/л 36 6 6

Канчан (Solanum tuberosum L cv Canchan)

MC + ИУК 0 1мг/л *

БАГ11мг/л (кошроль) 81,8 11

MC +• ГК 10мг/л + ИУК 0,1 «г/л +

БАП lvir/i 84 6 18

MC + ГК Юмг/л + ИУК 0,1 мг/л *

Зеатин 2мг/л 92.3 30

Эти данные свидетельствуют, что даже корневые системы разных растений одного сорта способны формировать регенераты с различной интенсивностью

Из одного уз та формировалось до 5 регенератов Помимо главных побегов-регенерантов, через I 1п месяца начиналось формирование боковых побегов, что свидетельствовало о завершении к этому сроку формирования пазушных почек. По результатам исследований наилучшими вариантами питательной среды для сорта Гикагуаси является морфогенная среда следующего состава 0,1 мг/л ИУК + 1,0 мг/т БАП и ГК Юмг/1 + ИУК 0,1мг/л +• БАП 1,0 мг/л Где соотношение ауксинов и цитокининов при этом представлено как 1.10 В этих вариантах был получен самый высокий регенерационный потенциал (35 и 22 регенеранта соответственно), что свидете чьствуст о том, что эти питательные среды являются оптимальными

Для сорга Канчан наилучшими вариантами были среды содержащие ГК Шмг'л ИУК 0,1 мг/л БАП 1мг/л и 0,1 мг/л ИУК +■ 2,0 мг/т зеатин + 10,0 мг/т ГК В этих вариантах соотношение ауксинов и цитокининов было 1 10 и 1 20 и наилучший регенерационный потенциал составил 37 и 54 регенеранта соответственно Для сорта Канчан, питательная среда, где присутствовала гибберелловая кислота, оказалась предпочтительнее

5. Оптимизация условий выращивании гриба Rhizoctonia solani Kühn и получение культу радьного фильтрата.

Как следует из рисунка 6, начало активйого выделения трксиноя в питательную среду приходится на 20-й день с начала выращивания патогена на среде Чапека. В этом случае оптическая плотность составила 0,14 ед„ а коэффициент светопропускания - 73%, При дальненйшем культивировании гриба в жидкой питательной среде наблюдалось значительное повышение оптической плотности жидкости, которая достигла максимума на 40-й день культивирования. При этом оптическая плотность составила 0,53 ед., а коэффициент свегопролускания - 30%; Последующее культивирование гриба в течении 30 дней (с 40-ого по 70-ый день) приводило к незначительным изменениям оптической плотности раствора, что свидетельствует о прекращении выделения токсинов в питательную среду. Культурадьный фильтрат, полученный на питательной среде Чапека, имел характерно темно-коричневую окраску среды, что свидетельствовало о более высоком накоплении токсинов в растворе.

При культивировании гриба Rhizoctonia solani Kühn на питательной среде Мурасига и Скуга начало активного выделения токсинов наблюдалось лишь на 40-ой день.

Количество дней

|——Ъ/С —*—:Чапека!

Рис. 6. Оптическая плотность КФ гриба Rhizoctonia solani. (100 мл),

Причем оптическая плотность в лом с чу чае была в 5 раз меньше по сравнении) со средой Чапека и составила О 05 ед а коэффициент свегопропуекания - 90°«. Максимальная оптическая плотность была печучена на 60-ый день культивирования и составила 0.20 ед. при этом коэффициент светопропуекаиия« составил 64% Дальнейшее культивирование гриба на срече MC в чечении 10 дней (с 60-ого но 70-й) не приводите к увеличению оптической плотности ку чьтуральной жидкости При сравнении оптической тотности КФ н<г 70-й день выращивания пагогена в жидкой питатечьнои среде было показано, чго оптическая тотность раствора, ночученного на среде Чапека, была в 3 раза выше по сравнению со средой MC

5.1. Культивирование микрочеренков картофеля на средах в присутстии

культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani Kühn. Проведенные жеперименгы позвонки выявить некоторою закономерность по поведению пробирочных растений картофеля в присутствии КФ в питатечьной среде Дчя изучаемых генотипов характерна обшая закономерность в развитие растений » стресс; вых ус юанях Гак. с увеличением концентрации КФ в питатетьной среде \ менынаются все ростовые процессы Однако следует отметить, что при концентрации 2^ % К.Ф, в питательной среде отмечался некоторый етичучирующии эффект Гак в этих вариантах, рост пробирочных растений увечичивалея на 10-25% по оч ношению к контролю Для copia Июньгай этот показатеи. в варианте 1 (Чапека) находился на уровне 24.4%. в варианте II (MC) этот показатель был 13 7°«. Для сорта канчан нот показатечь в варианте с питатешной средой Чапека составил 11,3°«. а в варианте со средой MC этот показатечь был ниже н составил 7 1% Дальнейшее повышение концентрации КФ в питатетьной среде приводите к достоверном) снижению всех ростовых процессов Резучьтаты по коэффициента размножения представлены на рисунке 7 Из него cTC'fvcT. что с увечичением концентрации КФ в питатечьной среде чо 50°Ь. коэффициент размножения снижался на 30 40% по сравнению с вариантом 25% Дальнейшее повышение концентрации КФ в питательной среде до 75% привило к проюлжению снижения коэффициента размножения

При концентрации КФ в nwrateibnoiJ среде 100''л. у сорта Июньгай в обоих вариантах питате тьной среды было видно не полное угнетение роста и развитие растении Для сорта Канчан коэффициент размножения составил

о

О • 25 50 ' 75 100

Концентрация культурального фильтрата, в %

[^—Контроль ж МС —« Чапека!

Концентрация культурального фильтрата, в %

[ « Контроль — Ж МС ■ * Чапека |

Рис. 7. Влияние концентрация КФ на коэффициента размножения пробирочных растений картофеля сортов Июньгай и Канчан (рисунок снизу).

3,4 шт/эксплант в варианте с питательной средой МС, а в варианте со средой Чапека наблюдалось полное угнетение роста и развития пробирочных растений картофеля. Это свидетельствует о том, что сорт Канчан является более чувствительным к ризоктониозу.

выводы

1 Выявлено, что для получения регенерантов перуанских генотипов картофеля необходимо проводить уточнение состава и ингредиентов питательных сред и других факторов в культуре т vitro Повышение их коэффициента размножения обеспечивается на питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей активированный уголь 8 г/л, а для укоренения - на безгормональной среде.

2 Длите чьное кутьтивирование микрочеренков картофеля т vitro в нескольких пассажах приводит к ослаблению интенсивности роста растений-регенерантов этой культуры

3 Дтя увеличение количества микроклубней перуанских генотипов картофеля микрочеренки целесообразно культивировать на питательной среде MC, содержащей БАП 2 vtr/л или кинетин 2 мг/л в сочетании с сахарозой 7%

4 Наибольшей регенерационной способностью из надземных органов обладают стеблевые эксплангы Для груднорегенерируемых из стеблевых эксплантов генотипов разработан альтернативный путь размножения исходного материала из корневых эксплантов

5 Подобраны оптимальные питательные среды для каплусогенеза и регенерации растений для 11 перуанских генотипов картофетя Оптимальной средой дтя индукции каллусной ткани является среда MC, содержащая 2,4-Д 1-3 мг/л для изучаемых видов и 3-10 мг/л - для сортов, а для регенерации - зеатин 0,1 мг/л, кинетин 0,2 мг'д и ИУК 0,3 мг/т

6 Показано положительное влияние НУК в концентрации 3-10 мг/л на пролиферацию калл>сной ткани В этом варианте прирост сырой биомассы каллусной ткани увеличился примерно в 30-50 раз по сравнению с вариантами ИУК и ИМК в питатетьной среде

7 Получение культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solam Kühn целесообразно проводить на среде Чапека. В этих условиях выделение токсичных метаболитов гриба в 3 раза выше по сравнению со средой Мурасига и Скуга.

8 Экспериментально определено, что культуральный фильтрат патогена в концентрации от 25% оказывает стимулирующий эффект на рост пробирочных растений в стрессовых условиях Культу ральный фильтрат с концентрацией 50% и более - оказывает ингибирующий эффект Подобранные концентрации могут быть использованы в работе по клеточной селекции картофеля на устойчивость к ризоктониозу

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Антонио Вальдеррама, Е.А. Калашникова. Особенности роста и развития безвирусного картофеля при длительном культивировании его в условиях in vitro // Материалы междунар. научно-практической конф. «Сельскохозяйственная биотехнология» г. Горки, 1998.-С. 20-21.

2. Вальдеррама А. Зависимость роста и развития перуанских сортов картофеля от условий культивирования // Тез. докл. V международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» Москва, 1999,-С. 310-311.

3. Антонио Вальдеррама, Е.А. Калашникова. Влияние условий культивирования микрочеренков перуанских сортов картофеля на образование микроклубней in vitro II Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы / Под ред. Шевелухи B.C. Том I,- М.: Евразия +, 2000.- С. 71-79.

4. Вальдеррама А., Калашникова Е.А. Влияние 2,4-Д на каллусогенез эксплантов изолированных из микроклубней картофеля в условиях in vitro I/ Материалы международной научно-практической конференции молодых , ученых «Молодые ученые-возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» Брянск, 2000.-С. 22-24.

5. Вальдеррама А., Калашникова Е.А. Влияние ауксинов на процесс каллусообразования картофеля в культуре in vitro /I Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодые ученые-возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» Брянск, 2000.-С. 24-27.

6. Вальдеррама А., Калашникова Б.А. Действие активированного угля на динамику роста и развития пробирочных растений картофеля // Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодые ученые-возрожцению сельского хозяйства России в XXI веке» Брянск, 2000.- С. 28-30.

7. Вальдеррама А., Калашникова Е.А. Морфогенез в культуре первичного каллуса картофеля И Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодые ученые-возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» Брянск, 2000,- С. 31-33

8 Вальдеррама Антонио., Калашникова Е А. Влияние ауксинов на регенерацию побегов в культуре первичного каллуса картофеля//Тез докл II международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Москва, 2000 - С 33-34

9 Вальдеррама Антонио., Калашникова Е А. Влияние ИУК, НУК и ИМК на процесс каллусообразования картофеля в культуре in vitro // Тез докл II международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Москва, 2000 - С 34-35

10 Вальдеррама Антонио., Калашникова ЕА. Действие БАП и кинетина на формирование микроклубней пяти сортов картофеля в условиях т vitro // Тез докч II международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Москва, 2000 - С 51-52

11 Вальдеррама Антонио., Калашникова Е А. Каллусогенез у чксплантов, изолированных из микроклубней картофеля на среде с 2,4-Д в культуре м vitro // Тез докл II международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Москва, 2000 - С 103-104

12 Вальдеррама Антонио , Леонова М В, Калашникова Е А Целесообразность использования культурапьного фильтрата гриба Rhizoctonia solum в селекции картофеля па устойчивость к ризоктониозу // Тез докт II международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Москва, 2000 - С 204-205

13 Вальдеррама А., Калашникова Е А Влияние регуляторов роста на адвентивного побегообразование на корнях картофеля в культуре in vitro // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Биотехнология-возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» Санкт-Петербург, 2001 - С 18-20

Отпечатано с готового оригинал-макета Объем 5_Зак. 338 _Тираж ¡00

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44