Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфо-физиологические особенности регенерации картофеля in vitro

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анварова, Мавлюда, Душанбе

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН

ТАДЖИКСКИЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 635.21:631.533.3

АНВАРОВА Мавлюда

М0РФ0-ФИЗИ0Л0ГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ ГЕНОТИПОВ

КАРТОФЕЛЯ IN VITRQ

(03.00.12 - физиология растений)

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, академик АН Республики Таджикистан, профессор Ю.С.Насыров

кандидат биологических наук, доцент Х.А.Муминджанов

Душанбе - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Введение .............................................3-5

Глава I. Обзор литературы ..................................6-33

Глава 2. Материалы и методы исследований ..................34-45

ЭКСПЕРШЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 3. Особенности каллусогенеза генотипов картофеля в зависимости от состава

среды и типа экспланта ................................46-54

Глава 4. Генотипические особенности морфогенеза и регенерации растений различных сортов

картофеля in vitro ............................................................55-67

Глава 5. Селекция картофеля на теплоустойчивость

с применением технологии культуры in vitro ....... 68-75

Глава 6. Физиологические особенности мериклонов

картофеля при выращивании их в почвосмеси........ 76-92

6.1. Особенности роста и развития мериклонов

картофеля в почво смеси ...........................78-83

6.2. Фотосинтетическая деятельность и

водный режим мериклонов картофеля...................84-90

6.3. Продуктивность мериклонов картофеля .....................90-92

Заключение и выводы............................... 93-97

Список использованной литературы ..................98-121

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Достижения физиологии и биохимии растений, генетики и молекулярной биологии способствовали возникновению и развитию нового направления исследований - биотехнологии растений. Используя уникальную способность растительной клетки -тотипотентноеть, биотехнология призвана решать ряд фундаментальных и прикладных проблем биологии и сельского хозяйства. Одним из первых среди других сельскохозяйственных культур, которые по биологическим особенностям стали удобными объектами для биотехнологических исследований проблем физиологии и генетики растений, является картофель.

Наглядным примером достижений биотехнологии растений является широкое использование метода культуры апикальных меристем в оздоровлении картофеля от вирусов и других патогенов, который и заложил основу для развития безвирусного растениеводства. Несмотря на большие достижения культуры апикальных меристем in vitro, существуют сомнения в цитологической и генетической стабильности мерис-темных растений, которые проходят каллусогенез в пробирочных условиях и неоднократно микрочеренкуются. Представляет большой научный интерес изучение особенностей каллусогенеза и регенерации различных генотипов картофеля в зависимости от типа выбранного эксплан-та, гормонального состава культуральной среды и времени года. Эти показатели весьма необходимы для проведения скрининга устойчивых и продуктивных линий и сортов картофеля на клеточном уровне. Очень важно фенотипическое изучение растений-регенерантов для выявления степени устойчивости морфологических параметров и их соответствие сортовым характеристикам. Представляет интерес изучение фотосинте-

тической деятельности и водного режима растений картофеля при переходе от миксотрофного к автотрофному режиму питания.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение стабильности и изменчивости сортоспецифичных признаков различных генотипов картофеля при их регенерации из меристемати-ческих клеток, фрагментов листа, стебля и междоузлий in vitro и выявление высокопродуктивных образцов.

В задачи исследований входило:

- выявление особенностей дедифференциации соматических клеток, каллусообразования и морфогенеза различных генотипов картофеля;

- изучение регенерационной способности генотипов картофеля при культуре апикальных меристем и микрочеренков in vitro;

- определение степени устойчивости различных генотипов картофеля к тепловому шоку in vitro и проведение клеточной селекции по принципу многоступенчатого скрининга;

- изучение фотосинтетической деятельности и водного режима мериклонов картофеля при переходе от миксотрофного к автотрофному режиму питания;

- выявление сортов, формирующих высокие урожаи миниклубней.

Научная новизна. По результатам проведенных комплексных исследований показано сохранение генетической стабильности физиологических особенностей различных генотипов картофеля в культуре апикальных меристем in vitro. Изучены физиологические особенности роста, развития, фотосинтетической деятельности, водного режима, клубнеобразования и продуктивности мериклонов картофеля при их выращивании в почвосмеси. Показана возможность проведения селекции картофеля на устойчивость к экстремальным факторам среды в условиях in vitro.

Практическая ценность. Установление сроков интенсивного кал-лусогенеза и выбор сортов с высоким морфогенным потенциалом позволяют проведение клеточной селекции на устойчивость к неблагоприятным факторам и продуктивность. Высокопродуктивные сорта картофеля Бинелла, Невский и Сантэ, могут быть успешно размножены в горных и предгорных зонах для развития семеноводства картофеля на безвирусной основе.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены (или представлены): на научной конференции "Пути повышения продуктивности сельскохозяйственных культур" (Душанбе, 1995), на второй научной конференции Биохимического общества Таджикистана (Душанбе, 1996), на Международной конференции "Состояние и перспективы развития биотехнологии растений" (Алматы, 1997), на Республиканской конференции, посвященной 50-летию Таджикского госуниверсчитета (Душанбе, 1998), на Международной конференции "Экологические особенности биологического разнообразия в Республике Таджикистан и сопредельных территориях" (Худжанд, 1998), на ежегодных конференциях профе-сорско-преподавательского состава Таджикского аграрного университета (1991-1998), на расширенном заседании кафедр физиологии растений и биотехнологии, плодоовощеводетва и виноградарства, технологии хранения и переработки сельхозпродукции и защиты растений плодвинбиотехфака Таджикского агроуниверситета, совместном семинаре лабораторий молекулярной биологии и генной инженерии, генетики фотосинтеза и продуктивности и биохимии фотосинтеза Института физиологии растений и генетики АН РТ.

Глава I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I.I. К вопросу культуры клеток и тканей in vitro

Одним из величайших открытий XIX века - сформулирование клеточной теории послужило предпосылкой ряда других открытий, разработки новых идей и методов в биологии. Многие успехи биотехнологии, а также технологии культуры клеток и тканей, разработки приемов генетической инженерш растений связаны с открытием биологии жизни клетки. Методы биотехнологии растений основываются на уникальной способности растительных соматических клеток - их тотипо-тентности, то есть восстановлении целостности живого организма из отдельной соматической клетки.

Еще в 1839 г. Шлейден и Шванн сформулировали концепцию клеточной тотштотентности, а в 1858 г. Вирхов начал ее популяризовать. Первые попытки экспериментального доказательства тотипотентности соматических клеток растений были предприняты Фехтингом в 1884 г. (Уайт, 1949; Pterik, 1987; Биотехнология растений¡культура клеток, 1989).

Для доказательства тотштотентности отдельной изолированной клетки необходимо было провести серию экспериментов, включающую:

а) изоляцию отдельных клеток;

б) размножение изолированной клетки;

в) выращивание целого растения из отдельной изолированной клетки.

Известно, что идея культуры изолированных клеток растений принадлежит Габерланду (Haberlcmdt, 1902), а первые успехи в этом

направлении исследований были достигнуты в 1921 г. Моллиардом и в 1922 г. Котте и Робинсом,которые культивировали клетки корней растений несколько недель. Интерес к этой проблеме возрастал и только в середине 1930-х годов, после предложения искусственной питательной среды Уайтом, техника культуры клеток начала развиваться и достигла определенных успехов лишь после 1950-х гг. (Уайт, 1949; Penso, Balducci, 1963; Бутенко, 1964, 1977; Paul, 1970; Carlson, Polacco, 1975; Quak, 1977; Singh, 1983; Глеба, Сытник, 1983).

Методами культуры клеток и тканей достигнуты большие успехи в биологии растений, хотя эти технологии впервые находили применение в культуре тканей животных, о чем свидетельствуют эксперименты, проведенные Роксом, Арнольдом, Джолли, Биби, Евингом и Харри-соном с тканями кур, саламандр и лягушек (Paul,1970). История развития исследований по культуре клеток и тканей растений более подробно описана в ряде работ отечественных и зарубежных ученых (Уайт,1949; Бутенко, 1964; Глеба, Сытник, 1983; Píerík, 1987; Биотехнология растений: культура клеток, 1989;.

Объектом культуры in vitro могут быть клетки и ткани, взятые из различных частей растений. Наиболее часто выращивают в изолированной культуре прокамбиальные части стебля, ткани, содержащие первичный и вторичный камбий, ткани завязи, первичные меристемы стебля и корня. Значительно реже встречаются указания на культивирование in vitro тканей лепестков цветка, листьев, пыльников. Трудным объектом в смысле проявления тотипотентности у многих растений оказались клетка зеленых листовых пластинок, для злаковых -изолированные протопласты.

Практически любую часть растения можно успешно культивировать in vitro и получить регенеранты, если эксплантат отобран на соот-

ветствущей стадии развития. Незрелые ткани и органы всегда более пластичны с точки зрения способности к морфогенезу in vitro, чем зрелые ткани и органы. Более того, при выборе материала следует отдавать предпочтение меристематически активным тканям и органам, поскольку они удобнее при клонировании, легче выживают в культуре, обладают большой скоростью роста и тотипотентностыо (Бутенко, 1975).

Метод культуры клеток и тканей растений служит в качестве модельной системы для изучения морфогенеза на клеточном и молекулярном уровне. Этот метод позволяет моделировать в культуре in vitro различные морфогенетические процессы, которые при нормальном онтогенетическом развитии растений протекают сопряженно. Но на сегод-няшный день проблема клеточных и молекулярных основ морфогенеза, не говоря уже о механизмах морфогенеза, остается малоизученной (Моисеева, 1991).

Механизмы морфогенеза,возникшие в ходе филогенетического развития закодированны в наследственном аппарате многоклеточных организмов. Непосредственными причинами морфогенеза являются физиоло-го-биохимические процессы, происходящие в индивидуальном развитии организма, в определенных условиях внешней среды. Фенотип, по определению Ю.С.Насырова, - это реализация генотипа в онтогенезе под влиянием условий окружающей среды, то есть в процессе онтогенеза реализуются генетически закрепленные особенности и нормы морфоге-нетических реакций и формируется фенотип. Конкретный морфогенез высшего растения, который можно рассматривать как создание определенной пространственной структуры - результат влияния на наследственно закрепленные нормы не только условий внешней среды, но и сложных физиологических взаимодействий между органами, тканями,

- § -

клетками, часто разделенными в пространстве (Бутенко, 1975; Быков, Казакова, 1991).

Р.Г.Бутенко (1985) установила, что в культуре тканей и клеток растений происходят следующие процессы дифференцировки и морфоге-за:

1. Дедифференцировка исходной специализированной или меристе-матической клетки изолированного из растения экспланта с превращением ее в каллусную клетку. Процесс связан со структурной перестройкой исходной клетки, и с индукцией в ней способности к последовательным делениям.

2. Дифференцировка каллусной клетки, вышедшей из цикла деления и специализирующейся на синтезе видоспецифических вторичных соединений.

3. Гистогенез, в процессе которого каллусная клетка превращается во фяоэмные или ксилемные элементы.

4. Органогенез - образование зачатков корней или вегетативных и цветочных почек.

5. Соматический эмбриогенез - процесс, в котором каллусная клетка имитирует зиготу и дает начало биполярной эмбриоидной структуре.

Главнейшей причиной, вызывающей дифференцировку клеток и их переход к гистогенезу с последующим формированием органогенных структур, можно считать действие фитогормонов. При этом основным фактором, определяющим тот или иной тип морфогенеза выступает отношение ауксинов и цитокининов в питательной среде. Эта закономерность впервые была обнаружена Скугом ж Миллером (Skoog, Miller, 1951). Согласно их концепции, можно вызвать образование стеблей, корней или недифференцированный рост каллуса, изменяя относитель-

ное содержание ауксинов и цитокининов. Высокое соотношение ауксин/ цитокинин вызывает корнеобразование (ризогенез), а низкое - способствует формированию почек (геммогенез). В то же время, одна и та же каллусная ткань, находящаяся в пробирке, может дать начало самым различным морфогенным структурам, т.е. может иметь место и ризогенез, и геммогенез и эмбриоидогенез (Fat ост 9 Yamada, 1984).

1.2. Культура клеток и тканей в решении проблем биологии

Методы культуры клеток и тканей способствуют ускоренному решению фундаментальных и прикладных проблем экспериментальной биологии растений. Иследования по клеточной биотехнологии высших растений начались на модельных объектах, представленных в основном видами семейства пасленовых, представителем которого является картофель (Бутенко, 1964; Глеба, Сытник, 1985; Сидоров, 1990; Nerem, 1991; Potato, 1993; Belknap et al., 1994).

Картофель (Solanum tuberosum L.) является первым среди основных продовольственных культур, который служит примерным объектом в манипуляции клеток и тканей in vitro. Образно говоря, картофель является культурой, революционизировавщей технику in vitro. По нему накоплен наиболее ценный теоретический материал и стала реальной разработка клеточных технологий, нужных сельскохозяйственному производству. Стала возможной не только культура соматических клеток различных органов (листьев, стеблей, клубней, корней и т.д.), но также культуры пыльцы и пыльников с последующим формированием цветков in vitro, культуры каллусов и протопластов с последующим получением протоклонов и гомозиготных гаплоидных и полиплоидных растений картофеля, как ценный исходный материал для селекции (Dunwell, Sunderland, 1973; Upadhya, 1975; Попов, 1976; Sopory,

Rogan, 1976; Вутенко и др., 1977; Foroughi-Wehr et al., 1977; She-pard et al., 1980; Хромова и др., 1986; BajaJ, 1987; Philip, 1990; Долбик, Бердичевец, 1992; Матвеева, Паршикова, 1992; Rokka et al«, 1996; Рахимбаев, 1997; Лигай, 1997; Смолякова и др.,1997). Известны эксперименты по слиянию протопластов картофеля и получению межвидовых, межродовых и межсемейственных гибридов с важными признаками устойчивости к болезням и стрессовым факторам. Получены цибриды картофеля с цитоплазмой различных видов (Meleherз, Sacristan, 1978; Вутенко, Кучко, 1979; Shepard et al., 1980; Сидоров и др., 1990).

Применение методов соматической гибридизации,клеточной селекции, мутагенеза и скрининга позволили получить устойчивые к экстремальным факторам и возбудителям болезней новые высокопродуктивные сорта картофеля (ВеТтке,1979,1980; Day,1980;Heigeson,Haber-lach,1980; Singh,1983; BaJaJ, Soporу,1986; Hassan et al.,1989; Na~ bors, 1990; Pomell, 1990; Cardi et al., 1993; Potluri, Devi, 1994; Kim et al.,1995; Stephen et al.,1995; Watanabe et al.,1995).

Культура тканей и криогенный способ хранения генетического материала картофеля широко используется при создании и межгосударственном обмене банка генов (Westcott et al., 1977; Иванов,1980; Hensham et al., 1980; Klan, 1982; Mix, 1983; Бургутин, Вутенко, 1984;. Создается молекулярная карта генома картофеля с целью эффективного использования его генетического потенциала в селекционном процессе (Powell, 1990; Watanabe et al.,1995}. Рассматриваются возможности использования Agrobacterivm tmerfaciense и Tl-плазмид в качестве вектора для трансформации генетической информации в геном картофеля с целью получения трансгенных растений с высокой фотосинтетической продуктивностью, способствующей большему

- TS -

X»

накоплению крахмала и других питательных соединений, гербицидоус-тойчивых форм и линий (Sa/a/, Sopory,1986; Wenzel et al1988; Аветисов и др., 1991; Gatsky et al7993; Martín, 1994; Kuli et al., 1995).. Появляются сообщения о получении трансгенных растений картофеля, устойчивых к вирусной инфекции (Бабота, Фирсукова,1991; Marianne et al.,1992; Сергеева и др.,1992; Martin, Saâava,1994).

Одним из наглядных примеров применения методов биотехнологии в практике сельского хозяйства - это оздоровление картофеля от патогенов путем культуры каллусов, клеток и тканей. На настоящий момент все большее распространение получает оздоровление картофеля методом культуры апикальных меристем in vitro.

Проблема вирусных болезней в картофелеводстве существует с давных времен. Картофель относится к культурам, которые в большей степени поражаются грибковыми, бак