Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование пространственной структуры трансмембранных сегментов бактериородопсина

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование пространственной структуры трансмембранных сегментов бактериородопсина"

Р Г О'^юСШ'и; ощнл трудового красного энамеии -, п ,..«шко-технический институт

На правах рукописи

УДК 543.422.25 547.963.02 577.322.5 577.322.523

МАСЛЕИОШОВ ИшокепяШ Вячеславович ИССЛЕДОВАНИЕ ГЦ ОСТРА11СТВЕРИ0Л СТРУКТУРЫ

тра11с1-ш.шрагаай сегментов еактериоропопсина

03.00.02 - ОпоЗпзшса

Автореферат диссертэщгк на соискагше ученой степени кзндвдатз '^изнко-мзтеыатических наук

Долгопрудный - 1993

Работа выполнена в Институте биооргашческой химии им. М.Ы. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель: доктор химических наук А.С.Арсеньев.

(финальные оппоненты: доктор физико-математических наук A.B. Кессених

доктор химических наук, профессор В.Л. Флорептьев

Ведущая организация: Институт химической физики РАН

Защита состоится "21" декабря4993 г. в 15 часов 30 минут на заседании специализированного совета К.063.91.10 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Московском физико-техническом институте со адресу: I4I700 г. Долгопрудный Московской области, Институтский переулок, 9, МФТИ.

С диссертацией моано ознакомиться ^ библиотеке МФТИ. Автореферат разослан " " IS93 г.

Ученый секретарь, специализированного совета кандидат физико-матоматичесюк наук

В.Б. Киреев

ОЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. . Важное место в современной физико-химической биологии занимают исследования механизма функционировать интегральных мембранных белков, участвующих в ионном транспорте, регуляции нервной проводимости и других функциях клетки. Один из основных этапов выяснения механизмов перечисленных процессов - установлений пространственной организации соответствующих мембранных систем. Исследование так называемых "двумерных кристаллов" методами электронной микроскогаш и рентгеновской дифракции дает, в случае мембранных белков, лишь общее представление о структуре молекулы. Используются также такие экспериментальные подходы как химическая модификация, ограниченный протеолиз, а:плиз взаимодействия с поли- и моноклоналышми антителами, точечный мутагенез. Каждому из перечисленных методов присущи свои ограничения, и все они дают Л1шь косвенную информацию о структуре молекулы. В связи с этим является актуальным разработка новых методов установления пространственной структуры мембранных белков.

Бактериородопсин (БР) пурпурных мембран галсфилыых бактерий

На1оЬасГ.ег1ит Ьл1оЫит - реТИНЭЛЬСОДержаЩИЙ ХрОМОПрОТеИД, осуществляющий Ф> тоиндуцируемый транспорт протонов через мембрану против градиента рн. В настоящее время это один из наиболее подробно охарактеризованных мембранных белков, однако многие вопросы, касающиеся специфических особешгостей его строения и фу|!кцио1шроваш1Я, нуждаются в дальнейием уточнении. Это, прежде всего, детализация пространственной оргаьизащш Сактериородопсина и выяснение структурной и функциональной роли отдельных аминокислотных остатков.

Цель настоящей работы, являющейся частью проводимых в Институте биосргаш: ческой химии ш М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН комплексных структурно-функциональных исследоваш!й мембрагашх белков, состояла в изучении," на ирш.-ерэ бзктериородопсина, возможности применения методов спектроскопии ЯМР высокого ра^репония для вгясн^шя тонких деталей пространствешюй структуры мембранного белка, В задачи Д'л;нг,Л работы входило установление прзстрэнстЕешюй структура синтетических аналогов трансмембраннык соп."-нтог;

бактериородопсина, солюбилизированных в смеси органических растворителей, моделирующей мембранное окружение белка. Основными средствами для этого служили двумерная спектроскопия 'н-ЯМР в сочетании с компьютерными методами реконструкции пространственной структуры Оелков.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены с немощью спектроскопии ЯМР данные о пространственном строешш трансмембранных сегментов мембранного белка, солюбилизированных в смеси органических растворителей. Разработаны метода реконструкции пространственной структуры трансмомбранных фрагментов бактериородопс1ша по дашшм спектроскопии ЯМР.

На примере бактериородопскнэ показана принципиальная возможность выяснения пространственной организации трансмембрашшх участков полилептидной цепи мембранного белка прямыми методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения.

Апробация работы и публикации. Результаты исследования доложены и обсуждены на У1-м Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны, ^руктура и функции" (Ывейцария, 1590), международной конференции по пентиум и белкам (Канада, Торонто, 1991), ху-ой международной конференции "Магнитный резонанс в биологических системах" (Израиль, Иерусалим, 1992). Но материалам диссертации опубликовано 6 статей.

Структура л объем диссертации. Диссертация изложена на 231 странице и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературыпосвященный наследованиям пространственной структуры бактериородопсина (глава I), обсуждение результатов (глава 2), экспериментальная часть, выводы и список литератур:;, включающий 235 наименований. Диссертация содержит 33 рисунка и 21 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Исследования пространственной структуры С.чтериородопсина (обзор литературы).

Установление пространствешюй структуры бактериородопсина •является целью многолетних работ ряда лабораторий. Ролк.^е ' количество изложенных в литера г. ре данных требуй ¡ас систематического анализа для выбора оптимальной стратегии

А В С Э Е Р в

гаэ ТАААООЗАЗРЕр

v О М

-еп

3 0,

о

А

А

рО <

•V

V

о у У I

0 Рн м

уТо!

I

Оа

гтоттп

2 0 р г

Е I

а з

'О АО

V/

УУ

и

т

о

Рис. I. Схема укладки полипептидной цепи БР в мембране в виде семи трансмембранных тяжей (использовано однобуквенное обозначение аминокислотных остатков). Участки трансмембранных тяжей, заключенные в прямоугольщки, располагаются внутри пурпурной мембраны, а за их пределами - вне мембраны. Буквы а, в, с, о, е, г и а нзд рисунком - обозначения соответствующих тяжей.

дальнейших исследований. В первой части литературного обзора приведены данные о пространственном строении бактериородопсина, полученные при помощи протеолиза, химической ' модификации, точечного мутагенеза и других химических методов исследования. Во второй части обзора изложены основные резу^таты исследования

з

пространственной . структуры Оактериородопсина дифракционными методам, оптической и радио-спектроскопией.

Глава II. Исследование пространственной структуры синтетических аналогов трансмембранных сегментов оактериородопсина в смеси органических растворителей.

Синтетические пептида, аналоги трансмембранных сегментов Оактериородопсина в (остатки 34-65), с (67-106), о (102-136), е (128-162), в (205-231 и 190-233) (рис. I) получены методом пептидного синтеза в растворе (пептиды вис (205-231)) и твердоу,;¡зным методом (остальные пептиды) в лаборатории академика В.Т.Иванова (ИБХ им. М.М.Шемякина РАН). Остатки ме»:-5б, ме^бо (бВ); МеС-ОЭ (бС); Ие1-Х18 (еО)( Ие1-145 (эЕ); Met-209 (га и (205-231)-бактериоопсин) били заменены на остатки норлейцина.

Выбор среды, моделирущей гидрофобное мембранное окружение БР и разработка приеллелого протокола сомбилизацш лолекулы являются основной проблемой при изучении пространственной структуры ЕР методами ЯМР высокого разрешения. Ранее, в качестве искомой среды для ЕР и его фрагментов была предложена смесь органических растворителей хлороформ - метанол (1:1). Однако, в отличие от методики солюбилизации природного белка, направленной на сохранение его нативной конформации, процесс растворения синтетического пептида в смеси хлороформ - метанол должен учитывать отсутствие упорядоченной конформации в исходном препарате. Разработанный нами протокол включал в себя следующие этапы: растворение пептидов в трифторэтаноле, упариланме, затем солюбилиэация в смеси хлороформ - метанол.

После растворения пептидов в смеси хлороформ - метанол, 0,1 м 1лсю4 были сняты 2М спектры ЯМР (вдк-созу (рис. 2), тосбу и ыоезу). Проведено полное отнесение сигналов в 2м спектрах ЯМР. Обнаруженные при анализе спектров (гоебу 'а-связи суммированы на рис. 3.

ИреО&артелъный анализ конформации трансмембранных сегментов бэктериородопслша по данным спектроскопии ЯМР включал в себя два этЕпа: оиред^лошю конфигураций пептидных связей х-рго и .покашьйцяя участков вторичной структуры.

<56,

(1 "5fl ,-,G63 B

tsii*;

ш„В . iS

i

ю»

(.Г51

4V'V

V"5 V1

161NC65 a"6 .CO ® HO

«39 H7„ A5I

-uB ^Iti

itSM ' Jr,

[JKl

.jr

COSY

VJi V x r> «>

1« V

><>?? «0 • « •* .:■•<:«;; s» Ги,<л s

* 4« 43 Jtf и

•V J

остзтка ■ i*ioo

J'

> . j'j ¡5

6 .1 С

»••J >73 t, it »

АЯЫ. 'till '>)ЬН

" 15Ч"ЕД!|<,!

" MOO . а ■ - -

v я

¡•ХМ ,

»газ; И1И

16- И---- F'

ода;,. Л$

F88 [75

OK-5

6-fl

П131 '

visi

A'39 S J"8 VI3S

! IM, St S

G-.55

(JV130

«С* W,3«vf «^f g«»

S AUi ( "v

FI56cYI50t 4155

« ® > » t , F153 ..VI37 Jp —

K,„>"Vt37/>F,3S M31

Pu -J, . U.z. 75

G (205-231)

мом^р остатка ■ 1*200

> vii,.

I}.

17Z

rp ' '

J1' s"

.Г'З CI,-. • *

1 • _ .J??7

„no COSY

V

12'.'

w , w л

g (190-233)

in ?

s

. 4 i'" i'-i „_ "laVti'^ls Г

«3 е.З 7,5 с;?. л 8.5 f.3 "5

U> , М fi

Рис. 2. Области ин/сан спектров dqf-cosy сегментов в, с, n, е. g (2С5-2зi) и g (юо-233 ). Показано отнесение КрОСС-ПИХОВ ип/с'и.

VI", <„11.

шгаип .нтигиктпишн •• •• — «Л

.......

I

ЧИ'.'*»!

«.„и.«* || «.!•>!

мшкит сттт

М VI II |» ♦» II III ш

Т1» Г Г 6619 »I1«М «С П. П ТГ а «I 1ЮЫЧ «

■гзд гммаиа III II* ш ш 111 ш I» •и^иитичокпииппипп

•♦в"'1*1' •••••V -»•■Л

<,,1ым шЯ+Ш М шт Ш Л 'I М I

я ш-шГшГ

. . •

«в ер • »я

«.,11,1.4 «„И.Ю)

ЮСИСПММММНН«« III III 14« 1«! Ш 11« КО

. т - .'тишиаштггспши

,1М

,11.1 ,11.1 „1М

л,'

еимиглиштин:

!>• 1*1 ш к* ив ш 1>о I из ......

•„в I 'к-«"'!. •

¡»а»--» »'

. V* ......

И

и

Рис. 3. Аминокислотные последовательности синтетических аналогов сегментов в, с, о, е и с НР и сьсвязи с участием протонов ин, с н и сгн (с н-протоны остатков пролина рассматривались как нн-протоны). Цифры нэд однобуквеиными обозначениями аминокислот-кых остатков соответствуют номеру остатка в аминокислотной последовательности БР. Толщина линий, отвечающих а-связям, харок-терисует интенсивности соответствующих кросс-пиков в спектрах моебу. Кружками отмечены ЯЭО-свяни, присутствие которых в спектре вызывало сомнение. Остатки с замедленной и промежуточной скоростью обмена амидных протонов ын ни дейтерий отмечены квадратами над аминокислотной последовательностью. Остальные значки над аминокислотной поспедовптельностыо означают, что для соответствующих остатков сигналы протонов ин в одномерном спектре входят в состав, групп перекрытых сигналов с замедленной усреднегчой скоростью полуоумена.

Из исследованных а настоящей работе полипептидов три содержали остатки пролива - сегменты в, с и и. Характерные кросс-пики в спектре koesy (рис. 3) однозначно указывают на яранс-конфигураиию пептидных- связей Asp-Зб - Рго-37, Val-49 -Рго5о (сегмент в), vai-бэ - рго-70, Asn-76 - Рго-77 (сегмент с) к vai-199 - Pro - 200 (сегмент а). Наблюдаемым картшам кросс-пиков в спектре noesy с участием протонов остатко^з Pro-so и рго-91 (рис. 3) удовлетворяет лишь mpcwc-конфигурация пептидных связей Val-49 - Рго-50 И Thr-90 - Pro-91.

При исследовании пространственной структуры трансмембрашшх сегментов БР го результатам предварительного анализа данных 'н-ЯМР выявлен зф$ект смещения химического сдвига протона nh послепролиновых остатков, расположенных на «-спиральном участке, приблизительно на 0,5 м.д. в сильное поле. Аномальность химического сдаига протонов амидных групп послепролиновых остатков объясняется, возможно, отклонением от планарности пептидной связи Pro-х, вызванным наталкиванием атомов пролинового кольца на атомы боковой цепи предыдущего по аминокислотной последовательности остатка. По-вэдимому, подобный эффект характерен и для других молекул, содержащих остатки пролила на <х-епиральных участках и может использоваться при установлении их пространственной структуры.

Участки Вторичной структуры определены путем сравнения межпротонных расстояний и двугранных углов, характерных для соответствующих типов структуры, с экспериментальными данными о ядерном эффекте Оверхауяера (ЯЭО) и константах спин-спинового взаимодействия- (КССВ) между протонами, дополнив их данными о скоростях обмота водородов групп m на дейтерий.

•Сопоставляя экспериментальные данные (рис. 3) с характерный! для e-спирали, а такие принимая во внимание то, что лн группы четырех первых остатков в «-спирали не образуют водородные связи, мы пришли к выводу о наличии в исследованных пептидах следующих участков стабильной «-спирали:

со-группа остатка Phe-4 2 - ш-группа остатка nie-so; со-гр.угша остатка Asn-76 - га-группа остатка vai-ioi; со-группа остатка тьг-Ю7 - NH-группа остатка туг-i3i; со-группа остатка Arg-i34 - neh-rpyma остатка Lys-159; ' со-груша остатка Leu-207 - ин-группа остатка Аг^-227; со-группа остатка iie-гоз - Nah-rpynna остатка Агд-гг?.

Аминокислотные остатки, расположенные вне приведенных регионов, более подвижны, хотя и они сохраняют тенденцию (быстро убывающую по направлениям к концам молекул) продолжать «-спираль.

Пептид g (205-231) несколько короче на н-концеъом участке, чем соответствувдий сегмент молекулы ЕР, имевдий потенциальную возможность образовывать a-спираль, так как ы-концевые остатки (Thr-2u5 и Leu-2 06) молекулы имеют явную тенденцию продолжать a-спираль. На с-конце сегмента g (205-231) наблюдаются несколько конформаций, часть из которых характеризуется солевой связью гуанидиновой группы Arg-227 с с-концевой карбоксильной группой, не реализующейся в природном БР. Чтобы избежать подобных эффектов и максимально приблизиться к нативной конформащш Б'Р, в дальнейшем использовались более длинные пептиды, заведомо перекрывающие внутримембранные участки сегментов БР.

Действительно, для пептида sg (190-233) конформация, близкая к а-ишральной, определена, по крайней мере, начиная с остатка iie-198. Не наблюдается также характерного для пептида sg (205231) смег^кия сигнала от протонов nch(Arg-227) в слабое поле, вызванного образованием солевой связи между гуанидиновой группой боковой цепи остатка Arg-227 и с-концевой карбоксильной группой.

Предварительный анализ данных ЯМР показал, что расположение участков стабильной «-спирали для sb, se и sg (190-233) согласуется с соответствующими трансмембранными «-сииралышми сегментами в электронно-микроскопической структуре (ЗИЛ) БР (Henderson et ai., 1990), Сильное перекрывание сигналов в спектрах ЯМР и, как следствие, неполная картина контактов ЯЭО средней дальности не позволяют с большой точностью локализовать участок стабильной а-спирали se. Имеется небольшое различие в определении «-спирального участка сегмента о, которое, по-видимому, объясняется недостаточно высоким разрешением метода ЭКМ. Полученные предварительные результаты подтверждают правильность-и перспективность выбранной стратегии исследования пространственной структуры ЕР методом ЯМР.

После предварительного анализа спектров ЯМР и установления участков вторичной структуры проведена количественная обработка спектров (измерены объемы кросс-пиков ЯЭО) четырех пептидов -sB, ас, вЕ и BG (190-233).

Реконструкция пространственной структуры трансмембранных фрагментов бактериоопсина, проведенная с использованием объ'мов кросс-пиков ЯЭО, после качественного анализа вторичной структуры пептидов включала в себя следующие основные этапы: (I) анализ локальной структуры по данным спектроскопии ЯМР и оценка времени корреляции вращательного движения . молекулы; (2) сборка пространственной структуры трансмембранных сегментов бактериоопсина; (3) систематический поиск конформаций боковых цепей и (4) уточнение пространственной структуры полипептидов п минимизация конформационной энергии.

Анализ локальной структуры и оценка врелени корреляции т проводились по программе conforhmr (Ломизе и др., 1990).

В результате предварительной оценки тс для sb, sc и ве время корреляции вращения молекулы в дальнейших расчетах для этих пептидов было принято равным 4 не. Оцененное при минимизации штрафной Функции время корреляции вращательного движения молекулы sg находилось в диапазоне 5-7 не и было принято равным 6 не во всех дальнейших расчетах.

Используя полученное время для каждой пептидной единицы молекулы определены диапазоны значений углов ?> и Ф, удовлетворяющие экспериментальным данным SMP и стерическим ограничениям. Для всех остатков sb с рго-37 по туг-64, sc с Тгр-80 по Val-101, sE с Arg-134 по Phe-156 И sG с V. 1-199 по Arg-227 определились области, соответствующие конформации а-спирали. Диапазоны углов ? и к-концевых остатков пептидов свидетельствуют о реализации на участках vai-34 - Pro-37, Thr-67

r Gin—75, Thr-128 - Туг-131 И Gly-192 - А1а-19б КОНфЭрМаЦ-ОННЫХ

состояний, характеризующихся термином "неупорядоченная структура". Из 151 остатка в исследованных пептидах ограничения на торсионные углы т и ф определены для 137.

Анализ локальной структуры дает возможность корректно обосновать выбор стартовой конформации молекулы, т.к. пйденные при анализе локальной структуры области конформационной карты учитывались при конструировании стартовой конформации молекулы на этапе уточнения пространственной структуры с помощью программы DIANA.

При анализе локальной структуры sb предпринята попытка определить возможность реализации -одного из трех ротамзров боковых цепей аминокислотных остатков \о связи са-сР. Однако,

использование усеченного набора кросс-гиков ЯЭО на этапе расчета локальной структура вв не позволило определить конформации боковых цепей большинства аминокислотных остатков. По-видимому, такая ситуация обусловлена как выравниванием в ряде случаёв населенности ротамеров вокруг связи Са-С0, так и отсутствием информации об интенсивностях некоторых кросс-пиков ЯЭО и влиянием погрешностей измерения интенсивностей. В дальнейшем, при уточнении пространственной структуры других трансмембранных сегментов БР конформации боковых цепей остатков определялись* только при минимизации энергии спирали с перебором возможных конформаций боковых цепей и учетом интенсивностей всех кросс-пиков ЯЭО с участием протонов данного остатка (см. ниже).

Сборка пространственной структуры трансмембранных фрагментов с, е и g БР проводилась с использованием программы diana (Guntert et al., 1991). При первом старте программы diana были использованы ограничения на торсионные углы полученные при анализе локальной структуры, и ограничения на межпротонные расстояния, сформированные с использованием программы анализа матрицы релаксации mardigras (Borgias et ai.,

1990).

Систематический перебор и оценка возможности реализации ротамеров боковой цепи для каждого 1-го остатка проводился на участках с хорошо определившимся ходом полипептидной цепи. В качестве стартовой использовалась одна из комюрмаций пептида, полученных с помощью программы diana.

Использование полного наборь кросс-пиков ЯЭО позволило точнее чем при расчете локальной структуры sb описать конформации боковых цепе« аминокислотных остатков трансмембранных сегментов в, с, t и с ЕР. Ротамер по связи са-сР, преимущественно |юализушийся в растворе, определился однозначно для 57% остатков о-спиралей sc и sc, eo£ остатков se, 53Я остатков sc.

После нескольких независимых стартог рограммы diana с дополнительными ограничениями на торсионные углы и хг боковых цепей аминокислотных остатков, найденными на предыдущем этапе, получены наборы из 40 конформаций для пептидов -с, se и sg. Минимизацию конформационной энергии полученных структур в пространстве координат атомов с вариацией величин валентных углов И связей проводили по потенциалам спаши (Brooks et al.,

с

Рис. 4. Стереоизображения 12 (для sb) и 20 (sc) совмещенных по атомам основной цепи коиформаций трансмембрашшх сегментов ЕР в смэси хлороформ - метанол, полученных после расчета по данным ЯМР и минимизации конформационной энергии с использованием потенциалов charm. Конформзции совмещс j по атомам основной цепи «-спиральных участкоз.

1983) С ПОМОЩЬЮ программы QUANTA.

Соответствие полученных в результате минимизации структур экспериментальным данным оценивали по величинам штрафной функции fa30, рассчитанной с помощью программы confornmr (пептид ев) или стандартных штрафных функций, вычисленных в щюграмме diana (для остальных пептидов). Наборы окончательных структур состояли из 12 (sb) или 20 (остальные пептиды) конформаций с наилучшими штрафы? ч функциями и обладающих наименьшими значениями конформационной энергии.

Полученные в результате расчета наборы структур пептидов показаны на рис. 4 и 5, а результаты статистического анализа полученных конформаций приведены в таблице.

Пространственная структура синтетического сегмента в ' (остатки 34-65) БР, солюбилизированного в смеси хлороформ -метанол, 0,1 И lício4, включала a-спиральный участок Asp-зв -Leu-62. На и- И С-Концевых участках Val34 - Рго-37 И Gly-63 -ciy-65 реализуется набор различных неупорядоченных конформаций. Присутствие остатка Pro-so на o-спиральном участке молекулы приводит к излому оси спирали на «27°. Конформации боковых цепей сегмента в однозначно определились для 57?«' аминокислотных остатков a-спирального участка.

Проведенный на основе данных ЯМР расчет пространственной структуры синтетического сегмента с (остатки 67-106) БР в смеси хлороформ - метанол показал, что участок Pro-77 - vai-ioi образует правую «-спираль. Присутствие остатка Pro-9i в середине a-спирали приводит к ее "излому" на 27°, который сопровождается ослаблением характерной для «-спирали водородной связи, образованной группой мн послепролинового остатка. На участке iie-78 - vai-ioi для большинства боковых цепей (57%) однозначно определились значения торсионых углов Найденные конформ ции боковых цепей энергетически ' предпочтительны и чаще всего встречаются в «-спиралях глобулярных белков, ы-коьцеьой участок Asn-7G - iie-78 образует т.н. "Asx-turn" (рис. 6). ы-концевые (67-75) и с-концевыа (102-106) остатки пептида не имеют упорядоченной структуры.

Бо всех полученных в результате расчета пространственных структурах сегмента е участок Arg-i34 - ser-isa находится в конформации о-спирали. На участках тпг-128 - vai-130 и Lys-i-59 -заг-162 реализузтся набор неупорядоченных структур, ь-концевой

Рис. 5. Стереоизображения 20 совмещенных по атомам основной цепи конформаций трэнсмембранных ■ сегментов е и с БР в смеси хлороформ - метанол, полученных после расчета по данным ЯМР и минимизации .конформационной энергии с использованием, потенциалов снакм. Кокфэрмации совмещены по атомам основной цепи а-спиралъных участков.

участок, Слизкий к началу а-спирального фрагмента (туг-m -туг-1зэ), формирует последовательность изломов (типы viib -viia), которая, возможно. определяет взаимную ориентацию трансмембранных сегментов d и е в составе молекулы HP. Однозначно определился торсионный угол х1 для В0% (17 из 21) аминокислотных остатков а-спирального участка be.

Полученные в настоящей работе данные однозначно определяют конформацию синтетического сегмента с (остатки 190-233) БР как «-спираль, начинающуюся с со-группы остатка iie-i9e и заканчивапцуюся №н-группой остатка Агд-22/. На участке Leu-i90 - Giy-197 реализуется набор неупорядоченных конформаций. Однозначно определился торсионный угол для 53% (14 из 26) аминокислотных остатков «-спирального участка sg.

Из-за отсутствия достаточного количества кросс-пиков в спектрах hoesy, что, по-видшиому, вызвано большой подвижностью, не определена однозначно конфзрмэция н- и с-концевых остатков молекул - Val-34 - рго-37 И Gly-65 (sb); Thr-67 - Gln-75 И Asp-102 - Gly-106 (sC); Thr-128 - Val-130 И Ala-160 - Ser-162 ;

Leu-190 - Gly-197 И Ser-228 - Ala-233 (sG). Наибольшие OL

расстояниях наблюдаются для кросс-пиков с участием протонов потенциально наиболее подвижных' боковых цепей (тпг, ьег), а также кросс-пиков типа i/i+3(4) в ситуации, когда между i-м и 1+3,4-м остатками расположен пролин в «-спирали.

Присутствие остатков пролина (рго-эо и pro-9i) в середине спиралей sb и sc дестабилизирует «-спираль, поскольку атомы про-лтювого кольца наталкиваются на атомы боковой цепи предыдущего остатка. При этом в «-спирали возникает излом приблизительно на 27°. Можно было бы предположить, что энергетически невыгодная структура «-спирали с пролином в середине стабилизируется за счет компактной упаковки «-спирали в белках. Однако проведенный в настоящей работе расчет пространственной структуры, основанный на данных ЯМР, однозначно указывает на то, что и одиночная а-сгшраль в неполярном окружении не прерывается из-за присутствия пролива. При этом излом оси «-спирали пептидов («27°) несколько больше, чем в структуре бактериородопсина, полученной по данным ялектронной крисмикроскопии (20°) (Henderson et al., 1990). В такой конформации возможна реализация бифуркационной водородной связи, так как расстояния между атомом водорода амид-кой грушш послепролинового х-го остатка и атомами кислорода

Азр-76

Рис. 6. Схематическое изображение м-ковдевого участка а-спирали сегмента с: обозначены остатки аэп-76, Ие-78 и туг-79. Прерывистыми линиями обозначена бифуркационная водородная связь, стабилизирующая конфэрмашга т:-ша "Азх-сигп".

Рис. 7. Схематическое изображение участка (остатки 45-55) правой а-спирали сегмента в. Прерывистыми линиями обозначена бифуркационная водородная связь, образованная с участием протона ш послепролиново-го остатка.

СП

Таблица.

Анализ результирующих наборов конформацкй сегментов в, с, е и в в смеси хлороформ - метаиол, нолучешах в результате расчета по данным ЯМ? и энергетической минимизации.

пентзд. количество процент остатков с определившимся углом * конформзционная энергия лучшей структуры из набора • кДз/моль попарное имвэ (пм) координат атомов а-спкральных участков

ковформаций в наборе кросс-шгкоз ЯЭО нарушений контактов

лг>0,1пм лг>0,05пм с", n,040 все атомы

БВ 34-65 12 274 | 5 18 57 -856 65 105

■ БС 67-106 20 405 2 о 57 -923 36±2 105+4

ЭЕ 128-162 20 392 4 15 80 -960 27±2 87 + 4

эй 190-233 20 427 2 10 53 -1007 . 2 0±2 10145

карбом^чьных rpj.iii остатков i-4 («-спираль) и i-з (310-спираль) различаются всего на 0,15 Я (рис. 7).

Сравнение пространственной структуры бактериородопсина в пурпурной мембране, смеси органических растворителей и мицеллах sds проведено на основе результатов данной работы, ЭКМ структуры ЕР (Henderson et ai., 1990) и литературных данных, касающихся исследования копформации протеолитических Фрагменте)) сг (остатки I-7I), вр2 (163-231), за (1-36) в смеси хлороформ - метанол, а также фрагментов сг (остатки I-7I), sa (г-эб), и синтетического сегмента з (34-65), встроенных в мицеллы sds.

Участки регулярной вторичной структуры трансмембранных ЕР, определенные по дашшм спектроскопии 'н-ЯМР показаны на рис. 8. Для сравнения приведены участки «-спиральной структуры, соответствующие наиболее точной на сегодняшний день, ЭЮ."-модели структуры ЕР. Как видно из рисунка, участки стабильной «-спирали сегментов а, в, с, е, fug, полученные с помощью спектроскопии ЯМР, практически совпадают с а-спиральными участками br, определенными по данным ЭКМ. Различие в о пределе:™ «-спирального участка трансмембранного сегмента d и небольшое расхождение на n-концевом участке «-спирали сегмента с, по-видимому, объясняются недостаточно высоким разрешением метода ЭКМ.

В смеси органических растворителей хлороформ-метанол большинство протяженных «-спиральных трансмембрашшх сегментов ЕР заканчиваются неструктурированными подвижными участками. Исключение составляют н-концевые фрагменты Aia-2 - GiyT6 сегмента a, Asn-76 - iie-78 сегмента с и туг-131 - туг-133 сегмента е. Расчет конформации участка Aia-2 - Giy-e sa в смеси органических гтстворнтелей показал (pervushin et ai., 1992), что на этом участке образуется спираль 2*27, стабилизированная двумя водородными связями. В смеси органических растворителей «-спиральный участок сегмента с на л-конце терминируется asx—ИЭГИбОМ (остатки Aen-76 - Рго-77 - 11е-78, РИС. 66). В нативном br, скорее всего, также реализуется asx-изгиб, терминирующий с N-конца «-спиральный участок трансмембрагаюго сегмента с. Реализация конформации. предложенной по данным ЭКМ (Henderson et al. , 1990), В КОТОРОЙ «-СШфаЛЬ ПрОДОЛЖавТСЯ ДО остатка Gin-75, маловероятна и объясняется ошибочным отнесением

я»,«* нмр ЯШ» ЯМР

экм

ЯМР ЯМР ЯМР * ЯМР

зим

ЯМР *

экм

О ЯМР *

экм

юа по?

1Э1 1эе

Е ЯМР *

экм

1 ее 169 1 вг

F ям1*

экм

G ямр

ЯМР

^ 20Е 207

ЯМР * 2zzmmm

ЭКМ

гог zos

Рис. 8. Сравнение вторичной структуры трансмембрашшх сегментов

■ЕР, определенной по данным 'н-ЯМР-спектроскогош (ЯМР) в смсзи хлороформ - метэнол (черные прямоугольники) и в шщеллах sc^ (серые прямоугольники), С ЭКЫ-МОДелЫО БР (Henderson et al., 1990). Пептиды, конфрмацил которых определена в настоящей работе , помзчены звездочками. Прямоугольниками обозначош участки стабильной «-спирали. Заштрихованы а-спир^льные участки, характеризующиеся ускоренным обменом ашщшх протоков ин (ЯМР-структуры) или низкой электронной плотностью .(ЗКМ-структура). Дугой и ломаными линиями обозначены участки 62-64 (sb в sds), 75-77 (sc), I3I-I34 (se), терминирущие а-спирзли и имекцяе характеров конформ&цик (см, текст). Волнистой линией обозначены участки неупорядоченной конформзцшь

наблюдаемой от боковой цепи остатка Asn-76 электронной плотности к основной цепи остатка Gin-75. а-Спиралышй участок сегмента е на н-конце терминируется остатком Arg-134, у которого углы основной цепи »> и ф соответствуют конформации з10-спирали. Блике к м-концу основная цепь молекулы se име°т фиксированную конформаци», характеризующуюся последовательностью изломов. Остатки vai-130 и Tyr-i3i во всех структурах из окончательного набора образуют излом типа viib, а остаток ser-132 образует излом тта viia.

w-Концевые участки «-спиралей se и sg, определенные по данным ЯМР, соответственно на 3 и -5 остатков длиннее, чем з ЭКМ-структуре: тагам образом, оминокислотная последовательность на участках Arg-134 - Val-136 (петля de) и Ile-198 - Asn-202 • (fg) БР предполагает возможность реализации «-спиральной конформации. По—видимому, оба участка расположены на поверхности мембраны. Полученные в настоящей работе даннче о локализации трансмембранной сшфали se подтвервдаются и данными по гИССЛеДОВаШШ МеТОДОМ ЭПР г:утаНТНЫХ анаЛОГОВ БР (Altenbach et íBl., 1990).

:в мицеллах sds обнаружена жесткая структура с-концевого участка ьеи-к? - Het-ьв, терминирующего трансмембранную -«-спираль сегмента В (Per\ Jshin et al., 1993). Участок Gly-65 -Met-68 формирует виток правой спирали, остаток Giy-бз находится в конформации левой спфали, что приводит к специфической ориентации оси витка сшфали ' участка Giy-65 - Met-68, ориентированной в направлении трансмембрашюй «-спирали сегмента с, также как оно определено в ЭКМ модели БР. Поскольку в органических растворителях участок Giy-65 - Met-68 не имеет фиксированной структуры, то можно предположить, что поверхность раздела фаг мембрана/вода или мицелла/вода индуцирует образование «-спирали, а ориентс ига ее по направлению соседнего сегмента с определяется конформацией остатка Giy-сз.

Конфор.гль,!■ -иное пространство боковых цепей аминокислотных остатков исследовано для спиралей а, в, с, е, f и g. Структура «-сшфали накладывает сильные стерическне ограшпегаш на возможные ротамеры боковых цепей и особешю для остатков # с объемной боковой цепью, Т-КИХ как Trp, File, Туг, Leu, lie, Val. Как правило, во всех i ;следовашшх полипептидах эти оста;.'и

имеют единственный ротэмер вращения вокруг связи са-с". в отличие от полученных нами результатов, конформации многих боковых цепей, выявленные в ЭКМ, не выгодны энергетически и практически не встречаются в а-спираняк. По-видимому, указанные различия обусловлены не взаишюй упаковкой «-спиралей в бактериородопсине, а неточным определением его пространственной структуры по данным электроннг;; криомикроскопии. Достигнутое методом ЭКМ разрешение не всегда позволяет достаточно надежно охарактеризовать вторичную структуру, и тем более оказывается недостаточным для построения подробной атомной модели br.

Сравнение разрешенных ротамеров боковых цепей остатка трансмембранных спиралей вв и С2 в различных средах показывай что конформации их боковых цепей, как правило, и античны и не зависят ни от среды солюбилизации ни от присутствия других трансмембранных «-спиралей в ш.'/екуле. То есть конформации боковых цепей остатков, находящихся в области контакта между взаимодействующими «-спиралями, ¿фиксированы или значительно ограничены стерически уже в одиночные «-спиралях. За счет этого формируется специфическ; i 1 - ¡ология области контакта «-спирали.

Расчет ii;<ocTpaiicTB9HHoft структур пептидов sb и ос в смеси органических растворителей показал, что лролинсодержзщие участки трансмембранных a-спиралей sb п sc имеют сходную конформации. Аналогичные искажения канонических к-сщралышх конформаций на участках, содержании остатки пролила, обнаружены в структуре «-спиралей трансмембрашшх сегментов в <.?го-50) в мицеллах sds

(Lomize et al., 199?; Pcrvushin et al.. 1593) И F (Pro-186) В

смеси хлороформ - метанол (Barsukov eL al., 19'>2). 1.0 конформация трансмембрашшх а-спиралей Кг, содержании остатки пролина, определяется, в основном, arv"-¡кислотной последовательностью молекулы, и не зависит от среды солюбилизации или взаимодействия с другими «-спиральным сегментами БР.

Полученные результаты показывают, что синтетические фрагменты БР, солюоилизированные в смеси хлороформ - метанол, моделирующей мембранное окружение LT, приобретают конфэрм- -ira, практически совпадающую, с конформацией соответствующих участков БР пурп" ншх мембран, определенную _'«=тодами ЭКМ. Использование спектроскоп"* ЯМР позволяет прл ьтом существенно повысить точность ощ"' ,'ления пространственной структуры (локализация

«-спиральной конформации. конформации боковых цепьй, конформация N- и с-концевых участков трансмембранных сегментов) и изучить влияние различных факторов среды солюбилизации 'на тонкие детали пространственной структуры молекулы.

ВЫВОДЫ

1. Получены двумерные' спектры 'н-ЯМР синтетических пептидов, аналогов трансмембранных сегментов бактериородопсина: в (остатки 34-65), с (67-106), D (102-136), Е (128-162) и g (205-231 и 190-233) в смеси хлороформ - метанол, 0,1 М lício4. Проведено полное отнесение сигналов и измерены скорости обмена протонов амидных групп nh со средой. На основании полученных данных локализованы «-спиральные участки сегментов в - ьув-ю -Met-60, С - Рго-77 - Val-101, D - Thr-107 - Tyr-131, Е - Arg-134 - Lys-159, G - Leu-207 - Arg-227 И Ile-198 - Arg-227.

2. По данным спектроскопии 'н-ЯМР проведена реконструкция пространственной стуктуры трансмембранных сегментов в (34-65), с (67-106), в (128-162) и g (190-233) бактериородопсина. Анализ полученных конформаций показал, что участки Lye-4i - Met-eo (сегмент В), Рго-77 - Val-101 (С), Val-136 - Ser-138 (Е) И iie-203 - ser-226 (g) имеют конформации стабильных правых «-спиралей. Присутствие остатков рго-бо и pro-9i в середине «-спиральных участков сегментов вис приводит к их "излому", сопровождающемуся ослаблением водородной связи, образованной амидной группой послепро лилового остатка. Определено доступное конформационное пространство боковых цепей аминокислотных остатков трансмембрашшх «-спиралей.

3. Показано, что локализация «-спиральных участков синтетических пептидов, аналогов трансмембранных фрагментов бактериородопсина, солюбилизированных в смеси хлороформ -метанол, моделирующей мембранное окружение белка, практически совпадает с локализацией а-спиральных участков белка пурпурных мембран, определенной методами электронной микроскопии. Однако, использование спектроскопии ЯМР позволяет при 'jtom существенно повысить точность определения пространственной структуры.

4. На примере бактериородопсина показана принципиальная возможность выяснения пространственной организации трансмембраиных участков полипептидной цепи мембранного белка прямыми методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Реализованная в настоящей работе методика уточнения пространственной структуры мембранного белка может быть успешно применена при исследовании некристаллизувдихся мембранных белков или беллов с высокой внутренней подышюстью.

Основные результаты диссертации изложены в следувдих работах:

I, Arseniev A.S., Maslennikov I.V., Bystrov V.F., Kozhich А.Т., Ivanov V.T., Ovchinnikov ¥u.A. Two-dimensional 'lI-NMR study of bacterioopsin-(34-65)-polypeptide conformation, FEBS letters, 1988, V. 231, N 1, p. 81-88. Z. Bystrov V.F., Arseniev A.S., Barsukov I.L., Lomize A.L., Abdulaeva G.V., Sobol A.G., Haslennikov X.V., Golovanov A.P. 2D-HMR for 3D-structure of membrane spanning polyp .ptides: Gramicidin A and fragments of Bacteriorhodopsin, in Protein Structure and Engineering-Ed. O.Jardetzky, NATO ASI Series, Ser. A: Life Sciences (1989), v. 183, 111-138.

3. A.S.Arseniev, A.G.Sobol, I.V.Maslennikov, G.V.Abdulaeva, 1.h.Barsukov, V.F.Bystrov. High-resolution HMR approach to spatial structure of bacteriorhodopsin, Journal of Cellular Biochemistry, 1989, N 13A, p. 37.

4. Масленников И.В., Арсеньев А.С., Кошч А.Т., Быстрое В.Ф., Иванов В. Т. Конформация трансмембранного -егмента g бактериородопсина, Биол. мембраны, 1990*, т. 7, ¡í 3, с. 222229.

5. A.S.Arseniev, A.G.Sobol, I.L.Barsukov, I.v Haslennikov, A.Т.Kozhich, G.V.Abdulaeva, V.F.Bystrov. High-resolution HMK approach to spatial structure of membrane proteins. Bacteriorhodopsin, VI Joint Swiss-Soviet symposium "Biological membranas structure and fanctions". Zurich, 1990, p. 2.

6. Масленников И.В., Арсеиьев А.С., Чикин Л.Д., Коасич А.Т., Быстрое В.Ф., Иванов В.Т. Конформация трансмембрзнного

2 Л

сегмента п бактериородопсина, Биол. мембраны, 1991, т. 8, /6 2, с. 156-160.

7. V.T.Ivanov, A. S. Arseniev, I. V.Maslennlkov, A.T.Kozhich, A.G.Sobol, I.L.Barsukov, G.V.Abdulaeva. Reconstruction of bacterlorhodopsin structure from its synthetic and proteolytic fragments, International conference "Peptide -Protein bridge", Toronto, 1991, p. 32.

8. Масленников И.В., Ломизе А.Л., Арсеньев A.C. Конформацион-ный анализ сегмента в бактериоопсинэ по данным двумерной спектроскопии ЯМР, Биоорган, химия, 1991т. 17, й II, с. I456-1469.

9. A.S.Arseniev, I.V.Maslennikov, V. Yu.Orekhov, К.V.Pervushin, A.G.Sobol, A.T.Kozhich, G.V.Abdulaeva, High-resolution KUR analysis of bacteriorhodopsin structure, V-th International Conference on Retinal Proteins,' Dourdan, 1992, p. 12.

10. Масленников И.В., Арсеньев A.C., Чикин Л.Д., Кожин А.Т., Иванов В.Т. го-'н-ЯМР-исследование копформаций трансмемб-рашшх сегментов с, е и g бактериородопсина, Биоорган, химия, 1993, Т. 19, № I, с. 5-20.

16 1уик. '^П-jCj Т0.р ■ GO