Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование молекулярной динамики бактериородопсина методом гетероядерной 1 H-15 N ЯМР спектроскопии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярной динамики бактериородопсина методом гетероядерной 1 H-15 N ЯМР спектроскопии"

ргв од

мостозсют отдай трудового красного ашш

физийо-техническии институт

^ £»--■> ------' на правах рукописи

УДК 577.182, 577.322.5, 543.422.25, 547.964

Орехов Владислав Юрьевич

исследование молекулярной динамики бактер1юродопсина негодом гегероядернол 'н-,$м ямр спектроскопии

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации из соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

долгопрудный - 1993

Работа выполнена в группе ядерного магнитного резонанса Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю. А.Овчинникова РАН.

Научний руководитель: доктор имлеских наук А.С.Арсеньев

Офщиалыше оппонента:

доктор фгико-математических наук, гл.н.с. Э:И. Федин кандидат химических наук, ст.н.с. ii.II. Цыгашшк

Ведущая рганизация: Институт гю.ич-скоП физики

им. H.H. Семенова РАН

Защита состоится "21" декабря 1993 г. в 16 ч 30 мил на заседании специализированного совета К.063.91.10 при московском физико-техническом институте по адрес": 141700 г. Долгопрудный Московской области, Институтский переулок, 9, М'.ТИ.

С диссертацией шкно ознакомиться в библиотеке МФТИ

Автореферат разослан " " I9S3 г.

Ученый секретарь специализированного совета

В.Б. Киреев

Актуальность проблем. Мембранные белки выполняют наиболее ваэхные функции в процессе жизнедеятельности >: тых организмов: процессы межклеточного узнавания и взаимодействия, активный и пассивный транспорт ионов и метаболитов через клеточную мембрану, создание неселективных гидрофильных пор в мембране, фоторецепция и рецепция нейротрансмиттеров, гормонов и факторе® роста и другие.

Центральной проблемой в понимании молекулярных механизмов, организации и функционирования мембранных белков является установление их пространственного строения на итомном уровне и построение моделей, описывающих"внутримолекулярные динамические процессы, играющие существенную роль в' работе мембранных белке-. Спектроскопия ЯМР высокого разрешения в растворе являе- -я уникальным инструментом, позволяющим не только реконструировать пространственную структуру молекул пептидов и. белков, но также исследовать их динамическое поведение в широком диапазоне времен, от 10 пс до десятков часов.

В настоящей работе представлено развитие методов исследования внутримолекулярной динамики и определения пространственной структуры мембранныг белков с использованием ЯМР высокого разрешения в применении к относительно большому (248 аминокислотных остатков) белку бактериородопашу.

Бактериородопсин (БР) представляет собой простейшую природ-' ную модель фэтосинтеэирущей системы. БР является светозависи.гай транслоказой 1протонов - ретинальсодержащим хромопротеидом пурпурных мембран галофильных микроорганизмов На1оЬас1еГ1ит })а1оЫ -ит.

В настоящее время БР является достаточно хорошо охарактеризованным белком. Однако, многие вопросы, касающиеся специфических особенностей его строения и функционирования, нувдаюхея в уточнении. Эфо, прежде всего, выяснение структурной и функциональной роли отдельных участков полипептидной цепи, детализация пространственной организации БР, а также влияние среды солвбили-зации на конформацию бежа. При транслокации протона происходит значительные конформациошше перестройки молекулы БР, т.о. значение приобретают исследования внутримолекулярной динамики белка.

Цель и задачи работы. Основными задачами данной раО^и являлись: (I) отнесение сигналов в гетероядерных спектрах ЯМР бакте-

- г -

■ риородопсина, солюбилизированного в системе, моделирующей мембранное окружение - смеси хлороформ/метанол; (2) Исследованге внутримолекулярной дтаажки бактер;юродопскна на уровне индивидуальных аминокислотных остатков; (3) Определение пространственной структура и детальное изучение динамических свойств фрагмента (1-71) Сактериородопсина; (4) развитие необходимых методических подходов. Можно падеятся, что полученные данные о структуре и динамики фрагментов БР позволят построить динамическую модель мембранного белка, примером которого -является ЕР. Основными средствами для этого служили 2Ы и ЗМ гетероядерная 'н, 15н ЯЫР спектроскопия в сочетании с компьютерными методами реконструкции пространственного строения белков.

Научная новизна и практическая значььг.остъ работы. В настоящей работе впервые получены помощью 'я, гетероядерной спектроскошы ЯМР данные о внутримолекулярной подчижности в молекуле Сактериородопсина, растворенного в смеси органических растворителей, которая моделирует мембранное окружение бежа. Показано, что взаимодействие между а-спиральными участками в молекуле приводит к процессам конформационного обмена в милли-секундном масатабе времени в части молекулы БР, включающей «-спиральные участки с, п, е и г.

На основе методики, разработанной в группе ЯМР ИБХ, получена пространственная структура фрагмента (1-71)БР, содержащего две взаимодействующие «-спирали, в смеси органических растворителей. Проведен исчерпывающий поиск доступного конформационного пространства боковых цепей аминокислотных остатков трансмембранных а-спиралей. В результате найдены ориентации боковых цепей, согласующиеся с данными ЯМР и обладающие низкой конф-рмацио-'ной энергией.

Разработаны подходы к исследованию внутримолекулярной динамики белков в миллисекундам масштабе времен на основании анализа данных релаксации ядер 15н. Установлено, что взаимодействие между трансмембраннкми а-спиралями фрагмента (1-71)ЕР приводит к появлению конформационного обмена между несколькими близкими кокформациями (1-71)БР. Такие изменения взаимной упаковки трансмембранных а-спиральных сегментов могут играть существенную роль при "функционировании бактериородопсинэ и других мембранных белков.

Апробация работы и публикации. Результаты работы доложены на

международном рабочем совещании "Магнитный резонанс и динамика белков" (СССР, Казань, 1391), Мевдународаой пколе по биолсгичес-кому магнитному резонансу (Ериче, Италия, Сицилия, 1992), v-oй международной конференции по ретиналь-содержацим белкам (Франция, Дурдан, 1992), х\'-ой мевдународаой к нфзренции по мзгпитно-му резон нсу в биологических системах (Израиль, Иерусалим, 1992). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Сбьел работ. Диссертация изложена на 202 страницах, состоит из введеыя, двух глав, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 165 наименований. Работа содержит 55 рисунков и 9 таблиц.

I. Молекулярная динамика в четырехс,глральном участке БР.

К началу настоящей работы емзсь мэтакола с хлороформом <1;1>, 0,1 и Ысю была использована как растворитель, моделирующий мембранное окружение для "г ЯМР исследования НР. В. ли отнесены сигналы и обнаружены несколько дальних контактов в "г ШР спектрах "г-тгр и "г-рье меченых НР. С помоаью метода нейтронной дифйракщи показано, что размер молекул в растворе близок к тому, что наблюдается для нативного состояния белка в пурпурной мембране. Из этих результатов и КД измерений, следует, что ь этой среде Е? сохраняет сь^в вторичную структуру и некоторые (если не все) элементы нативной тр тичноа структуры. С помощью пептидного сзитеэа и селективного расщепления получены фрагменты БР (длиной 30 - 70 амшюкислотных остатков). Они изучались методом гМ спектроскогаш 'н-1н ЯМР и локализовали а-спиралыше участки в аминокислотной последовательности ЕР.

Спектр полностью "ь-леч°нного бшапер^ородопсина. На рис. I показан корреляционный 'н-,5н нкос спектр несэлективно ,5и меченного (1-231)БР. В соответствии с аминокислотной последовательностью ЕР, в спектре должно присутствовать 249 кросс-пиков, включая 222 от амидных групп основной цепи (исключая 9 проли-нов) и 27 от боковых цепей. Обнаружено, однако, только около но пиков. Среди них 8 кросс-пиков от 8 боковых груш тгр в райоь^ и - 128 - 132 м.д., и2= 9.5 - ю.5 м.д. Таким образом, в спектре нп^с отсутствует большое количество 'н-'5н кросс-пиков, даже если учесть возможное перекрывание сигналов. Кросс-пики от части молекулы белка в к"ос спектрах могут исчезать по нескольким причинам: (I) уиирзние сигналов из-за парамагшгных ионов,

м.д.

Рис I. Спектр нмос фрагментов С1, сг, врг, В1 15и-туг-меченого БР и 15н-туг-меченого (1-231)ЕР.

связывающихся с молекулой, (хорошо известно, что БР ' имее.т несколько мест связывания двухвалентных катионов, (II) обменные процессы, уширяющие линии. Для выяснения причшш исчезновения сигналов варьировали процедуру приготовления образца и условия ямр эксперимента.

Двух к трехвалентные катионы могут быть эффективно удалены из пурпурной мембраны обработкой холаторами катионов, что приго-дит к так называемой голубой мембране, нмос спектр (не показав голубой мембраны, еолюбилизированной в хлороформу с метанолом (1:1), 0.1 м мн^нсоо, был точно таким же, как тот, что приведен на рис. I. Варьирование условий приготовления образца и снятия спектров также не привело к появлешш дополнительных сигналов. Таким образом, мояео заключить, что 'н-15н кросс-пики в спектрах БР отсутствуют из-за динамического процесса (в промежуточном масштабе времени для химииских сдвигов ¿.ротонов и/илк амидакх азотоъ, то есть, на частотах 50-500 Гц ) в молекуле, и что этот

динамический процесс мало зависит от условий эксперимента. В работе Сегере и сотр. (1992) также обнаружено отсутствие примерно половины сигналов в 'н-"и корреляционном спектре БР, солюби-лизированного в мицеллах н-додецилмэльтозидз, где БР сохраняет свой фотоцикл.

Отнесение сигналов б спектре ,sn леченого БР. Для отнесения сигналов, присутствующих в спектре неселективно ,s» меченого БР получили набор образцов селективно "n меченых по отдельным типам аминокислотных остатков (Trp, Phe, Туг, Lys, Gly, Leu, Val и île). При отсутствии процессов трансминирования во время биосинтеза БР двумерные 'h-,sn iímqc спектры таких образцов должна содержать сигналы только от того типа аминокислотного остатка, который содержит изотоп I5n. У'.лтывая консервативность лшичес-ких сдвигов 'н и ,5н при переходе от спектров целого БР к спектрам отдельных фрагментов, приблизительное отнесение сигналов в спектрах таких образцов проводилось с использованием ранее полученного отнесения сигналов 'н для отдельных а-спирзльных фрагментов и спектров 'н-|5м hmqc фрагментов ci, сг, bi и врг, селективно 15м мечешх по тому же типу аминокислотного остатка (рис. 2). Перенос *'и метки в другие тепн аминокислопшх остатков из-за трансаминирования контролировали по спектрам фрагмента С?., количество сигналов в спектре hmqc которого соответствует его аминокислотной последсзательности.

Во всех случаях, когда аминокислотные остатки находились далеко от мест щепления фрагментов, химические сдвиги '» и |5м в спектрах (Г-23Т)БР и фрагментов оказывались очень близкими. Химический сдвиг, в свою очередь, сильно зависит от окружения ядра - значений торсионных углов ближайших химических связей, сближенности с заряженными группами, ориентации боковых цепей ближайших ароматических остатков и от ряда других структурных и динамических параметров. Тогда консервативность значений химических сдвигов 'н, 1sn, обнаруже:лая в этой работе, и "г, показанная ранее, при переходе от целого БР к фрагментам указывает на сохранение локального окружения соответствующих ядер в основной цепи и в боковых группах белка, т.е. на сохранение не только вторичной структуры, но и ориентации ротамеров боковых цепей. На консервативность ориентации ротомеров боковых цепей указывает и сравнение пространственных структур отдельных а-спиралышх фрагментов БР, полученных в мицеллах sos и в смеси хлороформ.i с

111 < - 120 ПГ2 Л 185 -1 ао

■ 31.1» д'50 о О'"0вз 7» 0 • ii

0 43.64 я- «г-

(

) -1 за - 124

• 4 1.0 ■н М .д. ■ о м.д.

С2 < - 130 С1 1 « из - 120

< 2*.57 ) 1 »' ' о" 7'0

в - 124 - 114

и • 0 •II М •д. и »11 я о К .д.

(1-23 ОПИ

О

Ряс 2 Спектр пмдс фрагментов о, сг, вр2, в1 ^я-туг-меченого БР и "ч-туг-меченого (1-231)БР.

О

•••а ШАШюаиРЕ,,

v*

у'-

гр

[¿и

о л "иу^

У1

шц

й1

.»р

оРГ жР

.ЮР

"ТЕГ

К

кР

л*'

ш8

<] ш

IV!"

„1Я

(и

"И

'V

и1'

Рис 3. Модель вторичной структуры, «-спиральные сегменты а-с л^ка лизоваш по данным электрошюй криомикроскопии, Я1<£Р и сайт- напра-вленого мутагенеза. Серыми и пустым!! квадратами отмечены амшокис-лотные остатки, кросс-пики о. которых соответственно присутствовали и отсутствовали в спектрах ннос (1-231)БР.

метанолом. Это свойство «-спиральных участков БР подтверждает возможность разбивши задачи определения его пространственной структуры на два этапа: (I) определение структуры отдельных фрагментов и (II) сборка структуры в целом из а-спиральшх блоков с фиксированными ротамерами боковых цепей. Такая процедура, поводимому, применима и к другим интегральным трансмембранным белкам.

Локализация участков ЕР вовлеченных в обменный процесс. На рис. 3 показан семиспиральный трансмембранный мотив БР. Остатки, для которых крссс-пики были обнаружены или отсутствовали в спектрах даос (1-231)БР по разному отмечены на рис. 3. На схеме ясно видно две области. В первой, включающей спирали а, вив, обнаружены 'н-,5н кросс-пики от всех селективно "и меченых остатков. Вторая область включает в себя трансмембранные спирали с, ч, гя соединяющие петли. В соответствии с модэльг Хендерсона

- а -

эта область образует четкрехспиральный блок. Кон^ормациоиная динамика в этом блоке и приводит к уширению и исчезновению 'н->5н кросс-пиков в hhqc спектрах (I-23I )БР и частично в спектрах фрагмента ci.

Если взаимодействия между сшфалями ЕР нарушается растеплением полипептидной цепи на фрагменты ci, сг, bi и вр2, то 'h-,sh кросс-пики, отсутствовавшие в (I-23DEP, проявляются, имея при этом разные интенсивности в случае фрагментов ci (трансмембран-ше спирали с, d, е, г и g) и bi (трансмембрашше спирали а, в, с, d и е) (см. рис. 2). С другой стороны, ни каких эффектов уши-рения сигналов не было замечено в 'н ЯКР спектрах единичных спиралей БР. Таюол образом мы приходим к выводу, что информационная подвижность, обнаруженная в иное спектрах БР, обусловлена специфическими взаимодействиями между a-спиралями с, d, е и f.

II.2 Исследование внутримолекулярной динамики фрагмента (I-7I).

Фрагмент (1-71)БР является удобным объектом для изучения внутримолекулярной динамики БР, поскольку его можно рассматривать как минимальную структурную единицу, в которой возможно взаимодействие двух а-спиралей.

Отнесение сигналов 'н и ,sn б спектрах тотально .печенного фрагмента (1-71) проводилось в спиновых системах аминокислотных остатков при помощи ЗМ tocsy-hmqc и 2М tocsy экспериментов. Последовательное отнесение получали в ЗМ noesy-hhqc спектрах. Мы использовали также отнесение сигналов 'и и 15n, полученное в спектрах фрагментов (I-7I) БР селективно меченных 15н по отдельным типам аминокислотных остатков. На рис. 4 показан пример спектра hmqc (I-7I) Б? с отнесением сигналов. На рис. 5 показаны отдельные 'н-'н срезы ЗМ noesy-hhqc спектра, иллюстрирующие процедуру последовательного отнесения.

Реконструкция пространственного строения фрагмента (1-71)БР состояла из следующих этапов: (I) анализ локальной структуры и оценка времени корреляции вращательного движения молекула т (программа confornmr (Арсеньев, 1990)): (2) расчет пространственной структуры по методу дистанционного геометрического алгоритма (программа diana, (Гюнтерт, 1990)); (3) систематический пегебор всех возможных ротамеров боковых цепей остатков и селекция конформаций боковых цепей, обладающих минимальной кияформа-

ониз $ @ озз

аз!

(§?0«5 о"1

МЕЧ!

Т5 О

О«7

115

15М Н.Д.

0 п»

—1-Г—Т-?—|-1-1—г-

10

О 5" ТМО ОЛЗ

К40.41 0УМ

■«о

о и

гм О ы»

тп, пзв

Угчоум №

"'I ои,,

— о

I» »4 VI»

из о Щр @ ь» 01,1

«2 4? 0 м„

©' кзо 0 и»

Г-

«'ПИ А44

№ МЗ.ООи, АЛ„

'(? О'

-г-р-т 9

'Н М.Д.

Гт~т~

8

Рис. 4 Спектр иное 1,п. мм фрагмента (1-71 )БР в смеси хлороформ/метанол 1:1, 0,1 М нн4сгноо, зо°С. На спектре указано отнесение соответствующих кросс-пиков к аминокислотным остаткам.

2-

4 -1

м.д.

0 9

£

и

«

Л

о

а

1

' 0

т

• о'Ч с

й

1

С£>

оС

4*

«Я О.

ж

о

а

• В I*

17 Г «

О

О

о

*

в

Ш ТО из ан 115 С16 т17 л!8 а51 152 МЗ РМ т55 М56 ЧП Ь58 559

Рис. 5 'н-'н плоскости спектра нмос-ноебу "^-меченного фрагмента (1-71)БР соответствующие химическим сдвигам сигналов ядер :5н емидннх групп остатков тгргг-магв и ;аа51-Бег59. Для удобства представления из каэдой 'н-'н шюскости вырезалась область спектра шириной 0,1 м.д., содержащая кросс-пики протона нн группы соответствующего остатка.

циошюй энергией к нриюхящих к соглиь-овшмю теоретических и экспериментальных объемов кросс-пиков ЯЗО; (4) расчет по программе diana с дополнительными ог; аничениями, полученными на предыдущем этапе, минимизация коиформационной энергии с потенциалами ЕСЕРР/2 (Кзмети, 1987) и статистический анализ полученного набора конформаций.

После предварительного расчета пространственной структуры пептида с помощью программы diana, систематического анализа разрешенного конформациснного пространства боковых цепей и мичи-мизашш коиформационной экерпш получен набор из 12 конформаций С2, согласующихся с данными ffl«I? и обладающих одновременно низкими значешшми коиформационной анергии. Все конформэции С2 содержат два а-спиралышх участка: Ргов-Ме«2 И Phe<12-Tyr64, соответствующие двум трансмембрашшм сегментам А и В БР (рис. 6). В середине второй а-сгшрали находится ргобо, вызывающий ее излом. Угол излома «-спирали составляет 26°. Присутствие рго50 приводит к систематическому отклонению значений углов *> и vi остатков Thr4 6, Thr47( Leu4 8 от средних значений, характерных для a-спирали, и также вызывает некоторую дестабилизацию системы водородных связей a-спирали. Статистический анализ полученных структур 02 приведен в табл. I.

В спектрах hoesy и hmqc-moesv не были обнэружслы кросс-пики, соответствующие ЯЭО контактам между протоками трансмемб-рашшх a-сшфэлей. Причины отсутствия таких кросс-пиков связаны, по-видимому, со сложной внутримолекулярной динамикой взаимодействующих «-спиралей. Остатки Giy33-Lys4i, образующие перемычку между двумя трансмембран^ыми a-спиралями С2, не имеют определенной кон'{лрмации, что также препятствует определешю взаимной ориентацг:' этих a-сгофалей. Близк"е времена тс рчащателъной корреляции гделышх трансмембрашшх a-спиралей л и в в смеси хлорофэр;- метанол (ПерЕушин, 1992) и С2 свидетельствуют о сходстве мак чальных линейных размеров молекул. Такие же времена корреляции были получеш для С2, солюбилизированного в мицеллах sds, где размер комплекса C2/sds ограничен размерами мицеллы '3,5-4,0 км) и соответствует длине одной трансмембранной а-спирэга. это указывает на то, что две траксмембрашше a-спиралд фрагмента С2, повидимому, ксмпектно упакованы как в мицеллах sds, так и j растворе.

в

Рис. 6 Стереоизображение 12 совмещенных по атомам основной цепи са, н, с' и с конформвщш участков 1-36 (а) и 37-70 ^б) фрагмента (3-71)ЕР, полученных после расчета по программе diana е минимизации конфэрмационной энергии по программе confornkr с использованием потенциалов есерр/2. Конформашс: совмещены по атомам основной цепи остатков Pro8-Met32 (а) и Phei2-Leu62 (б). Цифрами обозначены атомы С11 остатков Giu9 и Giy3i (а), и Lys^o, Proso к Leuei (0). Показаны тольп атомы са, n, с и о основной цепи.

Таблица I.

Анализ результирующего набора из 12 конфэрмаций (1-71)ЕР.

параметр

значение ± стандартное отклонение

Количестго кросс-пиков в спектре ыоеэ^ Количество кросс-пиков в спектре нмос-иоезу Количество ограничений на меютротошше расстояния

остатков i и 1 для программы 01ама:

всего

Ц-Я - 1

Ц-Л > 1

Штрафная функцьл гг (гол) Количество нарушающихся ЯЮ контактов с лг 0,1 нм дг 0,05 нм Энергия есерр/2 (кДж/моль) Попарное гшзй (пм) координат атомов са, ы, с и со остатков:

8-32 41-62

Попарное ямбо (пм) координат атомог с", и, с' и о остатков набора ЯМР конформаций и ЭКМ* модели Б?:

8-32 41-62

304 482

651 184 157 21 + 1

3±1 3014 -1800430

3 3 41,4 40+1,б

61415 95+18

Примечание: "Электронно-микроскопическая модель структуры бакте-риородопсина (Хендерсон, 1990).

Измерения скоростей продольной и^) и поперечной ) релаксации и гетероядерный ЯЭО (гЯЭО) между ядром ,5ы и связан ным с шил протоном '5н-меченного С2 проводились с использованием импульсных последовательностей, основанных на непрямо" детектировании гетероядра. Для 60 амидных азотов основной цепи С2 были измерены скорости релаксации й^), й(8), а также гЯЭО, что позволило расчитать скорость конформационного обмена к и разницу Ларморовых частот пех сигналов ядер 15м в приближении модели двух обменивающихся состояний, а такжз оценить параметры

быстрого внутримолекулярного движения.

Параметры быстрого (пико-, наносекундного) внутри^юлекуляр-ного движения. Для расчетов параметров Оыстрохло (быстрее, чем время корреляции вращательного движения молокули) внутримолекулярного движения в модельнезависимом подходе использовали функцию спектральной плотности .т(и), описывающую изотропное движение молекулы:

Д(и ) - + «V) ч Б=(1 - + о^2) (I)

где е.* и б*, так называемые обобщенные параметры порядка, харак теризующие степень пространственной ограниченности внутримолекулярных движений медленных, со временем т соизмеримым с временем т_ вращательной корреляшш молекулы, и быстрых (термических движений, со временами менее 10 пс. Времена корреляции тс и т - характеризуют, соответственно, скорость вращательной диффузии молекулы и медленных внутримолекулярных движений.

Т.к. скорости релаксации гиз^), ) и гЯЭО зависят от значений з{и), то искомые параметры внутримолекулярного движения могут быть найдены при согласование экспериментальных и расчетных значений скоростей релаксации.

Время т^ корреляции вращательного движения молекулы как целого является общим для всех аминокислотных остатков и состав-лят 7,0 не, что хорошо согласуется с оценкой тс (6,0-Й,0 не), полученной при анализе локальной структуры С2. Параметры порядка внутреннего движения приведены на рис. 7. Все остатки испытывают быстрое внутреннее движение в пикосекундном диапазона, ассоциированное с параметром порядка в . Все остатки имеют близкое значение бг около 0,75 со стандартным отклонением, не превышавшем 0,1. Этот тип движения отражает термические йтуктуации векторов ны.

Напротив, параметр порядка б^ внутримолекулярного движения в промежуточном между 10-1000 пс диапазоне времен существенно зависит от вторичной структуры пептида (рис. 7). Промежуточное движение этого типа довольно ограничено на участках, имеющих вторичную структуру «-спирали (б^ 0,7), но его амплитуда увеличивается на н- и с-концах С2, а также в области перемычки между трагемембранныдш а-спиральными участками и в области ргоэо, что отратеет уменьшение параметра порядка э на этих участках . К

11(51)

и!111111|1[1Ш|У!Ц!Л|Ц|||1и

( !• II М 11 М и

■ Остаток

«•<511

• II и Я ¡1

и »• и М М Г»

Остаток

лэо

"Л

I* II 10 11 К и I

остаток

ними»

5«* (») ii»

л/.

ю

41 П II М II «• 41 И 11 •• И 7*

Остаток

-р—гтггк

Рис. 7 Экспериментальные значешш скоростей продольной и

поперечной н^) релаксашш ядер 15н аминокислотных остатков (I-71 )БР солюбилизировэнного в смеси хлороформ/метанол и ('н-15н) гЯЭО, а также параметры порядка внутримолекулярного движе-

шь, получешгае при модельнезависимой интерпретации данных релаксации ядер ' 5н арагмзнта (1-71)БР. В нижней части схематически представлена вторичная структура , определенная по дашшм ЯЫР.

сожалению, модельнезависимая интерпретация данных релаксации не позволяет установить механизм этого внутримолекулярного движения. Возможными вариантами этого движения могут быть искривление оси одиночных а-спиралей, переход между конформациями спиралей и ап. На неструктурированных участках пептидов это движение отражает, возможно, случайное замыкание различных водородных связей и солевых мостиков.

Исследование ¡сонфорлациоккого обмена. Конформационный (химический) обмен и диполь-дтюлыше взаимодействия приводят к уширению линий .наблюдаемых в спектре ,5н ЯМР, однако, временная икала процессов конформациошюго обмена (от милисекунд и медленнее) и диполь-дгаюлыюй релаксации п(з^) (пико-, наносекундный диапазон) сильно отличается. Это позволяет разделить вклада химического обмена л и релаксации кв измеряемую скорость поперечной релаксации и , воздействуя на систему спичов радиочастотными импульсами, следующими с частотой порядка скорости процессов конформациошюго обмена:

И = Щв ) + Л (2)

я к

Если предположить, что конформационный обмен происходит между двумя метастабильными равновероятными состояниями молекулы а и в, в которых Ларморовы частоты сигналов ЯМР определенного ядра ,5н отличаются на величину со средней константой скоростей прямой л->в и обратной в->/. определенной как к = (к + к„_>4)/2« то мо'шо вычислить ьклад такого обменного процесса в измеряемую скорость поперечной релаксации г^ (Блум, 1965):

|к - 1/(2т)з1пЬ"1[т); в1пП(ги)/\1} .если П < к

4 вХ 9 1 <))(

к - 1/ (2т)б1пН [ 2тк 1, еСЛИ П «= к (3)

в* еи' .«к «х

к - 1/(2т)гичЬ~ [тк Б1п(2и)/и], еСЛИ П > к

где и = т (| к^ - п'^ ] )'/г, т - времешюй интервал между 180° импульсами срмс. Измеряя р ,гри нескольких значениях т можно определив параметры щэ^, к^ и ов1<

В работе Риверса (1975) приводится выражение для общего случая N состояний с заселен ностями р, (Ер, - 1), выведешюе в

предположении к^ » ^, с-йратноэ rjv-мл апни ;яого больше дисперсии химических сдвигов мевду состояниями <Е рд - о).

д = (1 - 1/(2тк )tanh(2Tk ))/(2к ) [ р,^ (4)

9Х ОХ ti ФХ I I

Т.о. в случае коалесценции детектируемых сигналов ЯМР ядер ,5н. когда неизвестно истинное количество состояний и их засоленности , значение п_ж, полученное по формуле 3 для двух равнозаселен-них состояний, можно трактовать как среднеквадратичное отклонение химических сдвигов в наборе обменивающихся состояний.

Как следует из рис. 8. наибольшая зависимость измеряемых поперечных скоростей релаксации r^ от частоты следования импульсов в последовательности cpmg наблюдается для остатков С2 находящиеся в конформащш a-спирали. На н- и с-коцевых участках и в перемычке, соединяющей a-спирали, конформационшй обмен практически отсутствует. Скорости конформационного обмена к оказались близкими для всех остатков а-спиралышх участков С2. что, позидимому, отражает коопе'ративность конформационных изменершй в a-спиралях. В зависимости от соотношения к и конформацион-ный обмен может приводить к значительному уишрению линий в спектрах 'и или ,5n ffl.lP. В этсТ связи отсутствие в спектрах hmqc кросс-пиков от нескольких трансмембранных а-спиралышх участков Ег, солкбшшзировашюго в мицеллах п-додецилмальтозида (Сегере, 1992) или органическом растворителе, может объясняться процессами конформационного обмена, возникающими при взаимодействии о-спиралей. Т.о., можно предположить, что взаимодействие между «-спиралями носит динамический характер, причем влияние среды солюбилизации мембранного белка или его фрагментов сводится к изменению скорости такого обменного процесса, не оказывая существенного влияния на его характер.

Сравнение внутримолекулярной динамки. фрагмента (1-71) б слеси хлорофор*-леланол и сомобилизированного в лицеллах sds. Представляется интересным сравнить пэраметры внутримолекулярной динамики, полученные для (I-7I)БР, солкбилизированного в смеси хлороформ/метанол и в мицеллах sds. Анализ поведения пептида в различных> системах, моделирующих мембранное окружение, может оказаться полезным для выявления динамических свойств, присуши (I-7I)БР в пурпурной мембране в составе молекулы БР и, возможно,

(iii!li!!!!i!l!l!l!il!i'!iill i'| |l!|,!{ »illlll'iii'llll,,, § i tv h n « ' H it «i ' ' ' il m и " T%'

octbi^k

«•(s»)

•..................... •

ни1 lWl W ''I HUuj ^l^lKhlij,

11.« (рад c"|

,11

I MtlMMMUMiaMIlMIIH

Остаток

-f—rrrrrrrm—F-

Phc. 8 g) Экспериментально иомерешше скорости r_ поперечной релаксации ядер ,sn аминокислотных остатков (1-71)БР солюОилизиро-вашюго в смеси хлороформ/метанол при 5 значениях задержки т следования ieO° импульсов cpmg: т=Г,25, 0.5, 0,25, 0,12 и 0,08 мс. б) Вычисленные по уравнению 5 значения скоростей релаксации R*(sx) ядер ,5н аминокислотных остатков (1-71)БР для 5 измерений Лшшями соединены значения полученные при т=0,08 мс. в)

Вычисленные значегая разности Ларморовых частот n между сигналами ядер 1sn аминокислотных остатков (1-71)БР по модели двух обменивающихся равнозаселенных состояний (уравнения 9). В лижней части схематически представлена вторичная структура (1-71)БР, определенная по данным ЯМР.

БР в целом.

На рис. 9 и 10 показаны результаты анализа конформационного обмена и быстрых движений, полученные для (1-71)БР, солюбилизи-рованного в мицеллах sds. При сравнении рис. 7, 8 и 9, 10 можно сделать вывод, что в целом пептид проявляет сходные динамические свойства в обоих средах. Значения гЯЭО для аминокислотных остатков перемычки в случае мицелл sds существенно ниже, чем для (I-71)БР, растворенного в смеси органических растворителей, что приводит к уменьшению параметров порядка s для быстрых внутримолекулярных движений в диапазоне сотен гыкосекунд. Это может указывать на то, что перемычка между участками «-спирали более упорядочена в изотропной среде смеси органических растворителей, чем в мицеллах sds.

Конформациошшй .^бмен в случае мицелл sds замедлен и его скорость составляет 1,0 мс"1. Это приводит к большей дисперсии величин поперечной релаксации r_, измеряемых при различных интервалах между импульсами в cpmg последовател*ности. Несмотря • на четырехкратное различие в скоростях конформационного обмена для (I-7I)БР, растворенного в смеси органических растворителей и в мицеллах sds, локализация, кооперативный характер и характерные значения величин пех для обменного процесса олтакосн в обоих случаях.

Линатческая лодель бсиаг^риородопсина. При транслокации протона через клеточную мембрану имеют место конформациошшз перестройки молекулы ба.-териородопсина при которых, возможно, щюнсходит некоторое изменение взаимной ориентации или угла наклона трансмембранных «-спиральных сегментов по отношению к плоскости мембраны (Кассим, 1987). Установлено (Сегере и сотр., 1992), что в мицеллах н-додецилмальхозида БР находится в состоянии, близком к нзтпвному и при этом испытывает внутримолекулярное движение в милисекундном временном диапазоне, которое приводит к селективному уширешго сигьалов в спектрах 'ни 15n ЯМР. В данной работе показано, что и в изотропной модельной среде органических растворителей наблюдается аналогичное внутримолекулярное движение, сосредоточенное в структурной связке трансмембранных a-спиралей сегментов с, d, ей f, Прямое исследование внутримолекулярных динамических процессов с помощью измерения релаксации ядер ,5н показало наличие динамических процессов конформационного обмена и для фрагмента С2, структура которого включает

„ А l'll' ' • ft «i JT lllllilliii ........ К И К « •> Остаток I i МЧЖу!,. ¿ а м* м n

1 «( u n 4 ti 11 П • Остаток lllluuí II 1, П « 1t Остаток rm—f—ппг Éilli и M M u n г rrmcrrr

Рис. 9 а) Экспериментально измеренные скорости Ra поперечн-" релаксации ядер ,sn аминокислотных ост^тзшв (I-7I)БР солюОилизнро-ванного в мицеллах sos при 5 значениях издержки т следовать 180° импульсов cphg: х=1,25 , 0,5 , 0,25 , 0,12 и 0,08 мс. 0) Вычисленные по уравнению 5 значения скоростей релаксации r*(sj ядер |5н аминокислотных остатков (I-VI)BP для 5 измерений Rm. Линиями соединен^ значения R*(s>) получешше при т=0,08 мс. в) Вычисленные значения разности Ларморовых частот q<j( между сигналами ядер 15н аминокислотных остатков (I-7I)БР по модели двух обменивающихся равнозаселенных состояний (уравнения 9). В нижней части схематически представлена вторичная структура (1-71)БР, определенная по данным ЯМР.

Рис. 10 Экспериментальные значения скоростей продольной R(st) и поперечной r(sj релаксации ядер ,5м аминокислотных остатков (I-71 )БР солюОилизированного в мицеллах sds и (*н-15м) гЯЭО, а также параметры порядка s^, sf внутримолекулярного движения, полученные при модельпезависимой интерпретации данных релаксации ядер 15n Фрагмента (1-71)ЕР. В ниу-'ей части схематически ттредстав~ена вторичная структура , определенная по данным ЯМР.

только две взаимодействующие трансмембранные «-спирали БР в мицеллах sds (Первушин, 1993) и в смеси органических растворителей . Отсутствие жесткой фиксированной структуры пары взаимодействующих a-спиралей БР, невидимому, приводит также к отсутствию в спектре - noesу кросс-пиков, соответствующих .прямым ЯЭО контактам а-спиралей, как в случае С2 в мицеллах sds и смеси органических растворителей, так и врг в смеси хлороформ/метанол (1:1) (Барсуков, 1992). Можно предположить, что взаимодействие мезду «-спиралями носит динамический характер, причем влияние среды солюбилизации мембранного белка или его фрагментов сводится к изменению скорости такого обменного процесса, не оказывая существенного влияния на структуру.

Т.о., внутримолекулярную динамику БР можно разделить на процессы, связанные с внутренней динамикой а-спиралей, протекающие в пико- и наносекундном диапазоне, и медленные (в масштабе времени ЯМР) кооперативные ковариационные перестройки молекулы, обусловленные взаимодействием трансмембрэнных a-спиралей. Внутреннюю динамику а-сшфалей можно эффективно исследовать применяя модельнезависимый подход к интерпретации скоростей релаксации ядер 15n. Исхо, i из данных по компьютерному моделированию молекулярной динамики небольших белков, можно предполагать, что в наносекундном временном диапазоне возможны стох . -тические процессы изменения конформации некоторых боковых цепей и соответствующая подстройка конформации основной цепи «-спирали, разворот угла наклона пептидных групп по отношению к оси спирали (т.н. переход ), перезамыкание некоторых а-спиральных

водородных связей по типу спирали з , изменение угла излома a-спирали в области остатка Pro. в целой молекуле БР это приводит к изменению характерных параметров a-спирали, таких как угловой радиус искривления оси спирали, количество остатков на • виток и другие. Такие процессы связаны с одновременной конформ -ционной перестройкой всех остатков «-спирали, что приводит к примерно одинаковым параметрам и к(> -онформационного (химического) обмзна для всех векторов hn «-спиральных остатков для с2 б мицеллах и смеси органических растворителей. Можно надеяться, что применение методов компьютерного моделирования позволит построить соответствующие модели внутримолекулярных движений и связать их с измеряемыми в эксперименте р лаксациошгыми параметрами JP или его фрагментов.

ВЫВОДЫ

(1) В настоящей работа впервые получены с помощью 'н, 15м гетероядерной спектроскопии ЯМР данные о внутримолекулярной подвижности в молекуле Оактериородопсина, растворенного в смеси органических растворителей, моделирующей мембранное окружение белка. Показано, что взаимодействие между «-спиральными участка-тли в молекуле приводит к процессам конформацяонного обмена в миллисекундном масштабе времени в части молекулы Б?, включающей «-спиральные участки с, d, е и f.

(2) Установлено пространственное строение фрагмента (I-71)БР, содержащего две взаимодействующие «-спирали, в cms си органических растворителей. Проведен исчерпывающий поиск доступного конфирмационного простран-тва боковых цепей амднок"слотшх остатков трансмембраншх «-спиралей. В результате найдены ориентации боковых цепей, согласующиеся с данными ЯМР и обладающие низкой конформационной энергией.

(3) На основании анализа данных по релаксации ядер ,sn исследована внутримолекулярная- динамика фрагмента (I-7DEP в миллисекундном масштабе гремени. Показано, что «-спиральные участки С2, солюбил"зированного как в смеси органических растворителей так и в мицеллах sds, вовлечены в кооперативный динамический процесс, характеризующийся дисперсией химических сдвигов около 50 Гц. Эти движения повидимому, индуцировании взаимодействием между «-спиральными участками С2. Внутримолекулярная динамика такого Tima может играть существенную роль при функционировании бзктериородопсина- и других мембранных белков.

(4) На основе измерений релаксации ядер 1gn и гетерсядер-ного эффекта Оверхаузера получены данные о внутримолекулярной подвижности в основной цепи в модельнезависимом приближении для (I-7I)БР в диапазоне времен 1-1000 пс. Быстрые движения (менее 10 пс) не зависят от вторичной структуры и имеют параметр порядка 0,8-0,7. Движения в диапазон" времен 50-1000 пс сильно зависят от наличия вторичной структуры. Параметры порядка для них составляют 0,7 на участке «-спирали и 0,1-0,5 на неструктурированных участках.

ОсиОЕные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Arseniev A.S., Maslonnikov I.V., Orekhov V.Yu., Pervushin K.V., Sobol A.G. Bacteriorho'dopsin spatial structure, an NMR approach, XV International Conference on Magnetic Resonance in Biological System^, Jerusalem, 1992, p. 23.

2. Arseniev A.S., Maslennikov I.V., Orekhov V.Yu., Pervushin K.V., Sobol A.G., Kozhich A.T., Abdulaeva G.V., High resolution NMR analysis of Bacteriorhodopoin structure, V-th International Conférence en Retinal Proteins, Dourdan, 1992, p. 12.

3. Orekhov V.Yu., Pervushin K.V., Ars-.'.içv A.S. Spatial structure and backbone dynamyes of uniformly 15N-labeled (1-71)bacteriorhcdopsin Halobacterium halobium. I course: Magnetic resonance and protein dynamics, Erice, Italy, 1992, p. 18

4. Arseniev A.S., Maslennikov I.V., Orekhov V.Yu., Pervushin K.V., Sobol A.G., Kozhich A.T.,VIII FRG-USSR syrop. on chem. of peptides and proteins, Aachen, 1991, p.24.

5. Orokhov V.Yu., Abdulaeva G.V., Musina L.Yu., Arseniev A.S. 1H-1GH NMR Gtudies of bacteriorhodopsin Halobacterium halobium: conformational dynamics of the ¿.¿'ür-tielical bundle. Eur. J. Biochem., 1992, v. 210, p. 223-229.

6. Pervushin K.V., Orekhov V.Yu, Vopov A.G., Musina L.Yu., Arser4ev A.S. Three-dimensional structure of (l-VlJbacteri'-vopsin solubilized in methanol-chloroform and SDS micelles determined by 15N-1H heteronuclear NMR spectroscopy. Euf. J. Biochem., 1993, in press.

7. Orekhov V.Yu, Pervushin K.V., Arseniev A.S. Backbone Dynamics of (1-71)Bacterioopsjn studied by two dimensional 1H-15N NMR spectroscopy, 1993, Eur. J. Biocht.a., 1993, in press.