Исследование геномного разнообразия популяций человека методом мультилокусного ДНК-фингерпринтинга

Шаброва, Елена Вадимовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование геномного разнообразия популяций человека методом мультилокусного ДНК-фингерпринтинга
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование геномного разнообразия популяций человека методом мультилокусного ДНК-фингерпринтинга"

2<ьоз-А

15" РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГУ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 577.21:612.6

Шаброва Елена Вадимовна

Исследование геномного разнообразия популяций человека методом мультилокусного ДНК-фингерпринтинга

03.00.26 - Молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2003

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики человека Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор С. А. Лимборская

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. А. Спицын кандидат биологических наук, О. Н. Токарская

Ведущая организация:

Российская Медицинская Академия последипломного образования

Защита состоится " " 2003 г. в часов ^ ^оГр се, г

на заседании Диссертационного совета Д.001.016.01 при ГУ Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН.

Автореферат разослан " " ¿¿^¿<7/1 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук,

профессор

Л.Ф. Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Полиморфизм является важнейшей фундаментальной характеристикой генома. Использование полиморфизма геномной ДНК для изучения структуры и эволюции популяций человека представляет собой одно из современных направлений молекулярной генетики. Полиморфизм геномной последовательности сформировался вследствие многочисленных мутационных изменений, накопленных в ходе биологических и исторических процессов. Вариабельность генома человека обусловлена точковыми заменами, инсерциями, делециями, а также изменчивостью числа тандемных повторов - мини- и микросателлитов. Уровень полиморфизма, определяемый значительными различиями числа копий основной единицы, и как следствие, информативность, таких локусов необыкновенно высока, гетерозиготность составляет 85-90% [Wong et al, 1987; Jeffreys et al, 1985]. Одним из методов анализа полиморфизма минисателлитных последовательностей является мультилокусный ДНК-фингерпринтинг, который основан на способности зондов на основе «кор»-последовательности выявлять множество подобных локусов в геноме при блот-гибридизации с тотальной ДНК. Метод разработан A.J. Jeffreys [Jeffreys et al, 1985] и получил свое название вследствие крайней специфичности индивидуальных паттернов гибридизации. В настоящее время известно значительное количество последовательностей, при гибридизации которых с ДНК человека получается картина фингерпрингинга, одной из них является 15-ти нуклеотидный тандемный повтор в последовательности бактериофага М13 [Джинчарадзе и др.,1987; Vassart et al, 1987].

Метод мультилокусного ДНК-фингерпринтинга нашел широкое применение в криминалистике, генеалогических исследованиях, близнецовом анализе и исследованиях мутационных процессов. Работы в популяционной биологии показали возможность использования метода для анализа взаимоотношений между индивидуальными организмами на различных уровнях, от близких семейных до эволюционно далеких филогенетических. Ряд работ, выполненных мультилокусным ДНК-фингерпринтингом с использованием минисателлитов М13 на популяциях человека, показали высокую

информативность метода для популяционно-генетических исследований на уровне этнических групп и народов [Семина и др., 1993а, 19936; Хуснутдинова, 1997; Хуснутдинова и др., 1999а, 19996; Ка1шп е1 а1,1995]. Однако большинство работ выполнено на популяционном материале различных видов животных, результаты исследований популяций человека фрагментарны и, в большинстве случаев, сводятся к решению прикладных задач. Поэтому представляет определенный интерес детальная разработка мультилокусного ДНК-фингерпринтинга, как метода, позволяющего достаточно быстро и адекватно сопоставлять генетические структуры близких и отдаленных в этническом отношении популяций человека. Цель и задачи работы. Целью представленной работы являлась оценка генетической вариабельности и генетического родства различных в этническом отношении популяций из Восточной Европы и Северной Азии по результатам ДНК-фингерпринтинга на основе мультилокусной пробы - ДНК фага М13.

Основные задачи для достижения поставленной цели были следующие:

- детальная разработка методики эксперимента, позволяющей получать воспроизводимые результаты

- подбор оптимальных методов статистической обработки данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга, позволяющих адекватно анализировать полученные результаты

- получение данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга для ряда популяций из различных регионов

- сопоставление полученных результатов с аналогичными результатами исследования популяций Волго-Уральского региона и их совместная статистическая обработка

Научная новизна. Усовершенствована экспериментальная методика и разработаны способы первичной обработки картин гибридизации, «то позволило добиться необходимого качества и воспроизводимости результатов.

Получены результаты ДНК-фингерпринтинга для популяций из России и Белоруссии.

Впервые выполнено сопоставление и совместная обработка результатов мультилокусного ДНК-фингерпринтинга, полученных в разных исследованиях.

Впервые получены оценки критериев генетической дифференциации (Ся-) по данным мультилокусного ДНК-фингерпринтинга.

Продемонстрирована высокая дифференцирующая способность мультилокусного ДНК фингерпринтинга при исследовании различных в этническом отношении популяций человека.

Практическая значимость работы.

Различные варианты статистической обработки, представленные в работе, показали широкие возможности их использования не только для анализа результатов мультилокусного ДНК-фингерпринтинга, но и для анализа любых неколичественных данных.

Результаты работы могут быть использованы для дальнейших популяционно-генетических исследований, а также для судебной и медицинской экспертизы. Методические разработки, представленные в работе, могут представлять интерес для медико-генетических исследований, в том числе, при использовании метода для определения зиготности близнецов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) С помощью детальной разработки методики эксперимента и способов первичной обработки данных достигнута необходимая воспроизводимость и качество результатов мультилокусного ДНК-фингерпринтинга.

2) Совместный статистический анализ результатов мультилокусного ДНК-фингерпринтинга для 4 популяций из России и Белоруссии и 9 популяций Волго-Уральского региона показал разделение системы популяций на 3 кластера: «Славянский» кластер, кластер «Башкиры-Якуты» и смешанный кластер остальных популяций Волго-Уральского региона.

3) Оценен уровень генетической дифференциации в группах, формируемых на разных уровнях организации популяционной структуры.

4) Показана высокая дифференцирующая способность мультилокусного ДНК-фингерпринтинга при анализе взаимоотношений между

близкородственными и отдаленными в этническом отношении популяциями человека. 5) Показана устойчивость картины дифференциации популяций, полученной с использованием различных методов многомерного статистического анализа, что свидетельствует об адекватности и эффективности использования метода мультилокусного ДНК-фингерпринтинга для исследований популяций человека.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на Международном симпозиуме по эволюции человека (Колд Спринг Харбор, США, 1997), на международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва - Минск, Россия -Белоруссия, 2001), на Ежегодном конгрессе Организации по изучению генома человека (Страсбург, Франция, 2002), на III Съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, Россия, 2002), на 52 симпозиууме Американского общества генетиков человека (Балтимор, США, 2002).

Публикации. По материалам работы опубликовано 9 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из б разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Заключение" "Выводы", "Список литературы". Работа изложена на 139 стр. машинописного текста, содержит 18 таблиц и 40 рисунков. Список литературы включает 130 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на материале ДНК, выделенном из образцов крови коренных жителей России и Белоруссии, собранных в ходе экспедиций 19942001гг. Отбирались индивидуумы, которые являются потомками уроженцев данного района в трех последних поколениях. Отбор крови производился после письменного добровольного согласия и только у неродственных индивидуумов.

Выделение геномной ДНК человека проводили методом фенол-хлороформной экстракции [МаШе\у, 1984]. Выделение ДНК фага М13 проводили согласно методической разработке фирмы "АтегеЬат" ["АтегзЬат", 1984]. Гидролиз геномной ДНК человека рестрикгазой ВврШ проводили в стандартных условиях [Маниатис и др., 1984]. Электрофорез образцов рестриктированной

ДНК проводили в горизонтальном блоке 0.8% агарозного геля в 1.5х буфере ТАЕ. В качестве маркера молекулярных масс использовали смесь меченных 32Р фрагментов ДНК фага X, полученных в результате рестрикций с помощью эндонуклеаз EcoRI, Hindlll, PstI, Smal. Перенос ДНК из геля на нитроцеллюлозный фильтр осуществляли при помощи нисходящего блотгинга (модификация метода Саузерна [Sambrook et al, 1989], предложенная А.В. Лихтенштейном [Lichtenstein et al, 1990]). ДНК фага М13 метили с использованием специфического праймера и фрагмента Кленова. Предгибридизацию и гибридизацию проводили в формамидном буфере при 42°С, экспозицию - в течение 2-3 недель при комнатной температуре.

Идентификацию фрагментов гибридизации на радиоавтографах осуществляли с использованием градуировочных зависимостей, рассчитанных по маркерным фрагментам с использованием программы ORIGIN [MicroCal Inc., USA] и матрицы размеров фрагментов гибридизации, полученной на основе экспериментальных данных. Результаты первичной обработки представлялись в виде популяционных бинарных матриц типа «объект - признак».

Коэффициенты межпопуляционного разнообразия (Gst) рассчитывали согласно М. Nei [Nei, 1986; Livshits and Nei, 1990], гетерозиготность -J.C. Stephens [Stephens et al, 1992], APD - D.A. Gilbert [Gilbert et al, 1990].

Шесть типов матриц расстояний для качественных признаков (метрика Спулера, расстояния Сангхви, Нея, Оливье-Хауэллса и Эдвардса - Кавалли-Сфорца (2 варианта)) [Пасеков, 1983; Дерябин, 2001], рассчитанные по популяционным частотам фрагментов гибридизации, были проанализированы с помощью многомерного шкалирования и кластерного анализа. Дендрограммы были получены с использованием двух алгоритмов кластеризации. Многомерный анализ соответствий выполнен на основе бинарных популяционных матриц. Для многомерного анализ был использован пакет статистических программ STATISTICA версия 5.0 и 6.0 (StatSoft, Inc.).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Мультилокусный ДНК фингерпринтинг популяпионпых образцов.

При постановке экспериментов, был разработан ряд методических дополнений к стандартной методике ДНК-фингерпринтинга, которые позволили

добиться необходимого качества и воспроизводимости экспериментальных результатов.

Разработанные принципы первичной обработки картин блот-гибридизацли, позволили с достаточной точностью идентифицировать фрагменты гибридизации на радиоавтографах и, следовательно, сопоставить данные многих экспериментов. Для идентификации фрагментов на радиоавтографах были получены размеры фрагментов, выявляемых при гибридизации с ДНК фага М13, в хорошо разрешаемой и наиболее информативной области фингерпринтинга (10 1.8 тпн). Показано, что мажорные фрагменты, а также мономорфный фрагмент, который обнаружен во всех популяциях человека [Барышева и др., 1991; Малюта и др., 1996; Хуснутдинова и др., 1999], могут быть использованы как вспомогательные внутренние маркеры размеров фрагментов. Значительная часть фильтров содержала образцы из разных популяций. Такой способ постановки экспериментов позволял точно установить наличие популяционных различий в размерах мажорных фрагментов. Все фильтры содержали повторенные образцы, которые использовались как внутренние маркеры для состыковки результатов разных экспериментов. Пример радиоавтографа, полученного для образцов из двух популяций, приведен на рисунке 1.

Путем сравнения размеров и частот фрагментов и выбора наиболее оптимального варианта соответствия результаты, полученные для русской, якутской и белорусских популяций, были сопоставлены с аналогичными данными для популяций Волго-Уральского региона [Хидиятова, 1993; Хуснутдинова, 1997]. Совместная бинарная матрица включала 86 фрагментов гибридизации и 636 индивидуумов из 13 популяций Восточной Европы и Северной Азии (таблица 1).

Количественная опенка геномной вариабельности.

Для изученных популяций получены распределения частот фрагментов гибридизации. В таблице 2 представлены различные параметры геномной вариабельности. Белорусские популяции имеют наибольшее среднее число фрагментов на индивидуум (Р<0.05). Средние значения APD (средний процент различий) у белорусских популяций оказались практически одинаковы, при этом

M1 2 3 M 4 5 6 7 8 9 ЮМ 11 1213 M 1415161718 M 19

Рисунок 1. Пример радиоавтографа фрагментов Й5рД/-рестрикции образцов геномной ДНК, выявляемых при гибридизации с ДНК фага М13. Цифрами обозначены индивидуальные паттерны гибридизации: 1-12 - образцы индивидуумов из якутской популяции; 13-19 - образцы индивидуумов из русской популяции. М - маркер молекулярных масс: меченные 32Р фрагменты EcoRI, HindlH, Pstl и Smal- рестрикции ДНК фага X.

гетерозиготности заметно различаются. Одной из причин полученного несоответствия, очевидно, является потеря минорных фрагментов в малой выборке (Белорусы2), что не сказывается на APD, рассчитанных путем сравнения индивидуальных паттернов гибридизации, но значительно сказывается на гетерозиготности, рассчитанной по частотным профилям. Наиболее гомогенной оказалась популяция мари, которая имеет минимальные значения APD и гетерозиготности.

Таблица 1. Описание и лингвистическая классификация популяций.

Лингвистическая принадлежность обозначение Этническая принадлежность, географическая локализация Размер выборки

Восточно -Славянская группа Индо -Европейской лингвистической семьи Русские Русские, Смоленский район, деревня Сычевка 58

Белорусы 1 Белорусы, Хойникский район 46

Белорусы2 Белорусы, Гродненский район 26

Тюркская группа Алтайской лингвистической семьи Якуты Якуты, Хангаласский район, деревня Улахан-Ан 59

Башкиры1 Северо-Восточные Башкиры, Архангельский район 59

Башкиры2 Северо-Западные Башкиры, Илишевский район 38

БашкирыЗ Юго-Восточные Башкиры, Абзелиловский район 45

Башкиры4 Юго-Западные Башкиры, Стерлибашевский район 51

Чуваши Чуваши, Моргаушский район 48

Татары Татары, Елабужский и Альметьевский районы 49

Угро - Финнская группа Уральской лингвистической семьи Мордва Мордва-мокша, Старошайгинский район 52

Мари Луговые Мари, Звениговский район 49

Удмурты Удмурты, Мало-Пургинский район 56

Предложены два варианта расчета критериев генетической дифференциации: через показатели сходства (путем сопоставления индивидуальных паттернов гибридизации) и гетерозиготность (с

использованием популяционных частот фрагментов гибридизации). Для первого варианта расчета получена формула, которая позволяет работать с минимально необходимыми блоками показателей и рассчитывать конечные величины через средние арифметические для блоков. Предложенная формула снимает проблемы, связанные с различием в размерах выборок. Первый вариант, " несмотря на большую сложность расчета, оказался более приемлемым для

анализа подобных данных, так как позволяет работать с малыми выборками и ( дает более сопоставимые результаты с результатами, полученными другими

методами анализа.

Таблица 2. Количественные параметры геномной вариабельности

Популяция Среднее число фрагментов на индивидуум (¿вЕ) Общее число фрагментов в популяции Средняя частота фрагментов, Р Средний процент различий, АРВ{%) Гетерози-готность, Н

Русские 22.2+2.0 71 0.30 49.7 0.616

Белорусы1 26.2+2.7 74 0.34 47.5 0.617

Белорусы2 25.0+2.7 65 0.37 47.8 0.594

Якуты 20.1+2.3 56 0.35 49.6 0.591

Башкиры 1 19.2+1.5 60 0.31 49.6 0.602

Башкиры2 16.4+1.6 61 0.26 54.4 0.622

БашкирыЗ 17.7+2.4 62 0.27 54.7 0.649

Башкиры4 19.2+2.6 59 0.31 45.5 0.568

Чуваши 21.1+3.0 66 0.31 52.3 0.601

Татары 19.1+3.1 63 0.29 48.5 0.551

Мордва 17.6+3.3 67 0.25 50.2 0.594

Мари 19.4+2.0 65 0.29 45.1 0.508

Удмурты 19.3+2.4 70 0.27 50.2 0.604

На основе лингвистической классификации построена иерархическая структура [Рычков, Ящук, 1980], представленная на рисунке 2, которая состоит

из четырех уровней: первый уровень включает локальные популяции, второй -этнические группы, образованные локальными популяциями, третий -лингвистические группы и последний - лингвистические семьи. Полученная структура характеризуется тремя видами коэффициентов, рассчитанными как средние арифметические для каждого уровня: 1) Gsr'i для локальных популяций внутри этнических групп, 2) Gst'2 для этнических групп внутри лингвистических семей, 3) GSt '3 для лингвистических семей в пределах исследованного региона. В целом, оба варианта расчетов дали аналогичные результаты. Высокий уровень межпопуляционного разнообразия выявлен для группы башкирских популяций (Gsr'BauiK=0,078(0,093)) и для тюркской лингвистической группы. В обоих случаях, высокие значения коэффициентов, главным образом, обусловлены относительно высоким уровнем межпопуляционной дифференциации (рисунок За). Соответствующие коэффициенты для славянских популяций значительно ниже (GST^=0.006(0.041), GST'Cnae = 0.030(0.033)). Для угро-финнской лингвистической группы уровень межпопуляционного разнообразия также оказался достаточно высоким (Сзт'У-Финн=0.074(0.079)). В данном случае, основной причиной является низкая величина среднего из субпопуляционных APD и гетерозиготностей (рисунок 36), что, в свою очередь, обусловлено низкой внутрипопуляционной гетерозиготностью и APD популяции мари. В целом, два варианта расчетов дали аналогичные результаты. Причины различий значений Gst'1 обусловлены смещенной оценкой гетерозиготности для популяции «Белорусы2».

Результаты подтверждают выводы, полученные традиционными методами при анализе данных по различным биохимическим и ДНК маркерам: существует контраст между уровнями генетической дифференциации европейских и сибирских популяций: известно, что уровень разнообразия по всем европейским популяциям ниже, чем в пределах отдельных сибирских этносов; вклады уровней иерархической структуры в общее разнообразие сопоставимы: наиболее древняя стадия формирования популяционной системы, которая характеризуется Gst3, играет не менее важную роль в формировании современных популяций, чем современный период развития популяций в пределах этнических групп.

X х х

к <?

о а

Белорусы Белорусы

Белорусы

Русские

Башкиры1

Башкиры

Башки ры2

БашкирыЗ

1— Башкиры4

Якуты

Чуваши

Татары

Мари

Мордва

Удмурты

б5г'Бел=0.006(0.041)

65Т'Слав-0.030<0.033)

-о-

65Г'/-Финн=0.074(0.079)

Сет7=0.042(0.067) '2=0.062(0.069) 6^=0.062(0.052)

Ся/о/а/М).166(0.188)

Сет-0.062(0.052)

Рисунок 2. Лингвистическая иерархическая структура рассчитаны с использованием показателей сходства и

геггерозиготности (в скобках).

0,09 -0,08 ®sr' (а) Угро-финнская Тюркская группа группа

0,07 0,06 -0,05 -0,04 0,03 -0,02 - ^^^ Башкиры

Славянская группа ^^^

0,01 - "белорусы Dm

I < 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

0,47 0,48 0,49 0,5 0,51 0,52

Рисунок 3. Эмпирические зависимости показателей разнообразия, рассчитанные через показатели сходства для узлов иерархической структуры: (а) - Gsr коэффициентов от показателей абсолютной межпопуляционной дифференциации (Dm); (б) - бя-коэффициентов от средних значений APD для субпопуляций (APDS).

Дифференциация популяций методами многомерного статистического

анализа.

Все использованные методы многомерной статистики для четырех исследованных популяций (белорусы, русские, якуты) дали идентичный результат, который совпадает с лингвистической классификацией. В качестве примера приведены результаты кластерного анализа и многомерного

шкалирования (рисунки 4, 5): белорусские популяции фактически не показали региональных различий и занимают отдельный сектор в многомерном пространстве; группа славянских популяций значительно отделена от якут по оси 1-й размерности.

" I ! 1 ; I ;

I , I !

Якуты -;-1-1

к :

Русские-;-;-

Белорусы!

Белорусы2

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Расстояния

Рисунок 4. Дендрограмма агломеративной кластеризации, полученная по данным для 4 популяций. Матрица расстояний Эвклида, алгоритм Варда.

(

0,8 ~ А Белорусы2 Белорусы 1 ▲ СТ ------ . . , ...... 6 0 И 3 Якуты 1 •

-0,7 -0,3 -0,2 - -0,7 " Русские ♦ -1,2 - 0,1 0,5 0,9 1,3 размерность 1

Рисунок 5. Многомерное шкалирование матрицы расстояний Эвклида,

Все варианты кластерного анализа данных для 13 популяций дали два варианта дендрограмм (рисунок 6), которые выделяют три мажорных кластера:

Якуты Башквры2 Башкиры1 БашкирыЗ Башкиры4 Мордва Удмурты Чуваши Татары Мари Русские БелорусыХ Белорусы2

12345678

расстояния

Русские Белорусы1 Белорусы2 Чуваши Татары Мари Мордва Удмурты Башкиры4 Якуты Башкиры1 БашкирыЗ Башкиры2

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14

^ расстояния

Рисунок 6. Дендрограммы агломеративной кластеризации, построенные по данным для 13 популяций. Варианты кластерного анализа: (а) - матрицы расстояний Сангхви и Оливве-Хауэлса, алгоритм Варда; матрицы обоих вариантов расстояний Эдвардса - Кавалли-Сфорца и оба алгоритма кластеризации, (б) - матрицы расстояний Оливье-Хауэллса и Сангхви, алгоритм средневзвешанной связи; матрицы расстояний Спулера и Нея, оба алгоритма кластеризации.

ь- Ь| 1 1 1 1 1 1 I | 1 ! 1 1 1

1- 1 1 1 1— 1 ! 1 ! 1

1 1 н 1 ; ! ; 1

1 1 \ 1 1 !

«Славянский», кластер «Башкиры - Якуты» и смешанный кластер из остальных популяций Волго-Уральского региона («Уральская группа»). Популяция юго-западных башкир, «Башкиры4», однозначно попадает в кластер «Уральская группа». «Славянский» кластер оказался наиболее отдаленным от остальных и присоединяется к комбинированной группе «Якуты» - «Волго-Уральский регион» на последнем шаге агломеративной процедуры кластеризации. Два варианта дендрограмм незначительно различаются структурой второго кластера. Наблюдаемые различия связаны с тем, что популяция северо-западных башкир «Башкиры2» занимает промежуточное положение между популяцией якут и группой «Башкиры1» - «БашкирыЗ». Тот факт, что 12 вариантов кластерного анализа дали идентичные результаты, показывает, что анализируемая система популяций имеет четко выраженную структуру, в которой выделяются группы близких популяций, и эти группы значительно различаются между собой.

Многомерное шкалирование 6 типов матриц расстояний дало аналогичные результаты с некоторыми минорными отличиями (рисунок 7). Три мажорных кластера, полученные по результатам кластерного анализа образуют

Рисунок 7. Многомерное шкалирование матрицы расстояний Эдвардса -Кавалли-Сфорца. Изображение популяционных центров в пространстве 1-й и 2-й размерности.

-2,0 -1,5 -1,0

треугольник в условном многомерном пространстве. Популяции с наибольшим содержанием монголоидного компонента (башкиры и якуты) отделены от всех остальных популяций по оси второй размерности.

Многомерный анализ соответствий бинарных популяционных матриц дал аналогичные результаты (рисунок 8).

м 1,5 - б / о / И / Р* У 2 Бащкиры/^.О • 3 / а ж < Башкир дЗ^^, 0,5 - БрЖирйгК / ♦ Марич. '^ЯкуЫл О ) ►^Башкиры 1 размерность 1

/ А \ -1,5 /-1,0 -0,Т » ♦ Татай Удмурты _0 1 „Г Чуваши/ Мордва ф у ^---- 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Белорусы2

Рисунок 8. Изображение популяционных центров, полученное многомерным анализом соответсвий, в пространстве 1-й и 2-й размерности.

Для того чтобы оценить, насколько полученный вариант разделения популяций устойчив в возможным экспериментальным ошибкам и ошибкам первичной обработки картин гибридизации, был проведен анализ различных вариантов редуцированной матрицы частот фрагментов:

1) матрица, включающая фрагменты "верхней" (выше мономорфного фрагмента), наиболее гетерогенной области фингерпринтинга - 57 фрагментов;

2) матрица, включающая фрагменты "нижней" (ниже мономорфного фрагмента), наиболее однородной области фингерпринтинга - 28 фрагментов;

3) матрица, включающая только общие, встречающиеся во всех 13 популяциях фрагменты - такой вариант исключает влияние фрагментов, специфических

для отдельных популяций (или групп популяций) на картину разделения - 35 фрагментов;

4) матрица, включающая только фрагменты, наиболее часто встречающиеся во всем массиве полученных данных (со средней частотой (для всего массива данных) большей 0.25 для верхней области и большей 0.30 для нижней области фингерпринтинга) - 38 фрагментов.

Несмотря на частичное перекрывание кластеров, редуцирование матрицы не приводит к принципиальному изменению взаимного расположения популяций: по оси первой размерности происходит отделение славянской группы от смешанного кластера Волго-Уральских популяций, при этом второй кластер занимает промежуточное положение и отделяется от всех остальных популяций по оси второй размерности. Во всех вариантах полностью сохранен кластер славянских популяций и кластер «Башкиры - Якуты» - можно считать, эти кластеры обладают наиболее устойчивой внутренней структурой, которая отличает их от остальных популяций по всем группам фрагментов, использованных в анализе. Наименее стабильным оказался смешанный кластер Волго-Уральских популяций.

Для того чтобы оценить вклад межпопуляционных внутрикластерных отличий и характерных для каждого кластера признаков в полученную картину дифференцирования популяций был проведен следующий анализ. Путем усреднения частот были получены три комбинированные искусственные популяции: славянская, башкирская - из всех башкирских популяций, смешанная - из остальных популяций Волго-Уральского региона («Уральская группа»). При усреднении частот происходит размывание популяционных различий в пределах объединенной группы и образуется частотный профиль, характеризующий группу в целом. Совместный анализ трех искусственных популяций совместно с якутской показал (рисунки 9,10):

• Ярко выраженное подразделение на два кластера и значительный разброс популяций Волго-Уральского региона обусловлены локальными межпопуляционными различиями, отличие башкирского этноса от остальной группы уральских популяций в целом незначительно.

• Межпопуляционные различия в пределах славянского этноса незначительны, основной вклад в обособление славян вносят характерные особенности славянской группы в целом.

• Для якутской популяции, единственной сохранившей свои популяционные характеристики, наибольшие различия остались со славянской группой, по сравнению с остальными комбинированными популяциями.

Башкиры Уральская группа Якуты Славяне

1,0 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0

расстояния

Рисунок 9. Дендрограмма агломеративной кластеризации. Матрица расстояний Эдвардса - Кавалли-Сфорца, алгоритм Варда.

О Якуты 0,5 ■ & о X о. <0 £ <ч а Ф Славяне

-1 -0,5 ф ( Башкир! -0,5 Уральская группа А и- 0,5 1 1,5 ( размерность!

Рисунок 10. Многомерное шкалирование матрицы расстояний Эдвардса -Кавалли-Сфорца.

Многомерный анализ соответствий был использован для построения этнических облаков, образованных индивидуумами разных популяций. На рисунке 11 приведен пример совместной обработки бинарных матриц для популяций с наибольшим содержанием монголоидного компонента: якутской и 4 башкирских. Несмотря на то, что популяционные центры первых трех башкирских популяций сгруппированы в одном секторе, наблюдается небольшой сдвиг популяции «Башкиры2» из области полного перекрывания популяций «Башкиры1» и «БашкирыЗ» в сторону якутской популяции. Популяция «Башкиры4» полностью выделяется в отдельный сектор из группы остальных башкирских популяций. Популяция «Якуты» также занимает отдельный сектор, но частично перекрывается с группой «Башкиры 1» -«БашкирыЗ» - «Башкиры2». Популяция северо-западных башкир («Башкирьй») занимает центральное положение и может рассматриваться как популяция со средними для анализируемой системы характеристиками.

О Банкиры 1

• Баикиры2

♦ БаикирыЗ О Банкиры4

-з

А Якуты О Банкиры 1 (центр)

• Баикиры2(центр)

♦ БаикирыЗ(центр) О Баикиры4(центр) А Якуты(центр)

размерность2| А

• Л А * А1

Рисунок 11. Изображения этнических облаков в пространстве 1-й и 2-й размерности, полученные многомерным анализом соответствий, по данным для якутской и четырем башкирским популяциям.

В целом, многомерный статистический анализ данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга для 13 популяций выявил следующее:

Исследованная система популяций разделяется на три мажорных кластера: «Славянский», кластер «Башкиры - Якуты» и «Уральскую группу». Не наблюдается абсолютного соответствия между полученным подразделением популяций Волго-Уральского региона с общепринятой лингвистической классификацией: популяции татар и чувашей, которые принадлежат к алтайской лингвистической семье, формируют третий кластер с популяциями уральской лингвистической семьи. Исследованная нами якутская популяция примкнула к группе башкирских популяций, которые, по разным оценкам [Хуснутдинова, 1999], характеризуются наибольшим содержанием монголоидного компонента.

Кластеры формируют треугольник в условном пространстве 1 и 2 размерности. Популяции с наибольшим содержанием монголоидного компонента (якутская и башкирские популяции) отделяются от всех остальных популяций по оси 2 размерности, при этом наиболее монголоидная якутская популяция, в большинстве случаев, показывает максимальные различия по координате. Ось 1 размерности разделяет славянские популяции и «Уральскую группу», второй кластер занимает промежуточное положение.

Славянские популяции образуют наиболее компактную и гомогенную группу, которая значительно отличается от остальных.

Белорусские популяции не показали региональных различий в отличие от группы башкирских популяций. Популяция юго-западных башкир («Башкиры4») значительно выделяется из группы остальных башкирских популяций и занимает промежуточное положение между кластером «Башкиры - Якуты» и смешанным кластером остальных популяций Волго-Уральского региона.

Наблюдаются значительные межпопуляционные различия для кластеров, сформированных популяциями Волго-Уральского региона, при этом, различия между башкирским этносом и «Уральской группой» в целом незначительны.

ВЫВОДЫ

1) Оптимизированы условия мультилокусного ДНК-фингерпринтинга и разработаны способы первичной обработки данных, что позволило добиться необходимой воспроизводимости результатов и провести исследование группы популяций из России и Белоруссии.

2) Предложены варианты статистической обработки данных и способы их использования для анализа результатов мультилокусного ДНК-фингерпринтинга, которые позволяют охарактеризовать исследуемую систему популяций и оценить уровень генетической дифференциации в группах, формируемых на разных уровнях организации популяционной структуры.

3) По результатам многомерного статистического анализа данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга выявлено, что исследованная система популяций разделяется на три мажорных кластера, которые формируют треугольник в условном пространстве 1 и 2 размерности. Ось первой размерности разделяет группы славянских и уральских популяций, ось второй размерности отделяет группу популяций с наибольшим содержанием монголоидного компонента.

4) Показано, что славянские популяции образуют наиболее компактную и гомогенную группу, которая характеризуется наименьшим уровнем межпопуляционного разнообразия (0$т = 0.030(0.033)) и наиболее существенными отличиями от остальных групп.

5) Обнаружены различия в уровнях популяционной подразделенное™ в пределах одного этноса: высокая гетерогенность группы башкирских популяций и значительное сходство белорусских популяций из различных регионов.

6) Показана устойчивость картины дифференциации популяций, полученной различными методами многомерного статистического анализа, что свидетельствует об адекватности результатов и эффективности использования метода мультилокусного ДНК-фингерпринтинга для исследований популяций человека.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Шаброва Е.В., Просняк М.И. Некоторые методические аспекты геномной дактилоскопии в приложении к популяционным исследованиям // Генетика. 1999. Т.35, № 4, С. 453-457.

2. Шаброва Е.В., Боровик А.С., Микулич А.И. Мультилокусный ДНК-фингерпринганг в популяционных исследованиях: первичная обработка хартин гибридизации // Генетика 2000. Т.36, № 2, С. 291-296.

3. Тарская Л.А., Варзарь A.M., Ельчинова Г.И, Шаброва Е.В.//Генетико-демографическая характеристика якутской популяции // Генетика. 2002. Т. 38, №7, С. 985-991.

4. Шаброва Е.В., Тарская Л.А., Микулич А.И., Аболмасов Н.Н. Дифференциация близкородственных и отдаленных популяций человека на основе данных мультилокусного ДНК-фингерпрингинга // Генетика. 2003. Т. 39, №2, С. 236-243.

5. S.A. Limborska, Р.А. Slominsky, М. I. Shadrina, S. N. PopOva, O.V. Belyaeva, E. V. Shabrova, Т. V. Pogoda, M. V. Khorte, E. K. Khusnutdinova, V. A. Spitsyn, A. I. Mikulich, «DNA diversity in east European populations», Abstracts of the 1997 Meeting on Human Evolution, Cold Spring Harbor, USA, 1997, p. 100.

6. Шаброва E.B., Микулич A.M., «Анализ полиморфизма ДНК, выявляемого методом мультилокусного ДНК-фингерпринтинга», Абстракты международного Симпозиума «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», Москва - Минск, Россия - Белоруссия, 2001, С. 183.

7. Shabrova EV, Khusnutdinova ЕК, Mikulich AI, Tarskaya LA, Limborska SA, «Multilocus DNA Fingerprinting Analysis as a Tool for Human DNA Divertsity Study» Abtracts of European Society of Human Genetics, Strasbourg, France, 2002.

8. Шаброва E.B., Микулич A.M., Тарская Л.А.,Хуснутдинова Э.К.,Лимборская С. А. «Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в популяционнпгх исследованиях», Абстракты III Съезда Биохимического общества, Санкт-Петербург, Россия, 2002, С. 319.

9. Shabrova EV, Khusnutdinova ЕК, Tarskaia LA, Mikulich AI, Limborska SA. «Use of multilocus DNA fingerprinting for the studies of human population from Eastern Europe and North Asia», Abstracts of 52nd Annual Meeting of American Society of Human Genetics in Amer. J. Human Genet., Baltimore, USA, V 71, № 4,2002, p. 371.

На правах рукописи

Подписано в печать 09.07.2003. Бум. офсетная. Формат 60 х 84/16. Гарнитура "Times". Усл. печ.л. \Ч2. ТираУ#0 экз. Заказ 1007-01,

Типография ЗАО «Эребус-Принт», 123060, г. Москва, ул. Соколовского, д. 3

*7J3 7 5

t«

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шаброва, Елена Вадимовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ

1.1) Актуальность проблемы.

1.2) Цель и задачи исследования.

1.3) Научная новизна.

1.4) Практическая значимость работы.

1.5) Основные положения, выносимые на защиту.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

11.1) Структурные компоненты популяционной системы и критерии оценки межпопуляционного разнообразия.

11.2) Системы генетических маркеров.

И.З) Характеристика минисателлитных локусов. Механизмы нестабильности минисателлитов.

11.4) Использование минисателлитов в популяционных исследованиях человека.

11.5) Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг на основе минисателлитов М13 в исследованиях геномного разнообразия

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

111.1) ПОПУЛЯЦИОННЫЕ ВЫБОРКИ.

111.2) ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ

111.2.1) Выделение ДНК из образцов крови человека.

111.2.1.1) Осаждение ядерной фракции лейкоцитов

111.2.1.2) Экстракция смесью фенол-хлороформ.

111.2.1.3) Контроль качества ДНК с помощью гель-электрофореза.

111.2.2) Рестрикция.

111.2.3) Получение ДНК фага М13.

111.2.3.1) Получение компетентных клеток.

111.2.3.2) Трансформация компетентных клеток.

III.2.3.3) Выделение одноцепочечной ДНК фага М

111.2.4) Получение меченного маркера молекулярных масс.

III.2.5) Саузерн блот-гибридизация с ДНК фага М13.

III.2.6) Методы первичной обработки картин блот-гибридизации.

III.3) СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 111.3.1) Количественные параметры геномной вариабельности.

III.3.2) Многомерный статистический анализ.

111.3.2.1) Кластерный анализ.

111.3.2.2) Многомерное шкалирование.

111.3.2.3) Анализ соответствий.

VI. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

VI.1) ДЕТАЛЬНАЯ РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕТОДИКИ.

VI.2) РАЗРАБОТКА ПРИНЦИПОВ ПЕРВИЧНОИ ОБРАБОТКИ КАРТИН

БЛОТ - ГИБРИДИЗАЦИИ.

VI.2.1) Получение матрицы размеров фрагментов.

VI.2.2) Результаты первичной обработки картин блот-гибридизации j VI.3) ВЫВОД ФОРМУЛ ДЛЯ РАСЧЕТА ПОКАЗАТЕЛЕЙ j ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ.

VI.3.1) Расчет коэффициентов межпопуляционного разнообразия.

VI.3.2) Расчет показателей сходства популяций.

VI.3.3) Расчет гетерозиготности популяций.

VI.4) ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ГРУППЫ ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЙ МЕТОДАМИ МНОГОМЕРНОГО СТАТИСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА . 83 VI.5) ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМНОГО РАЗНООБРАЗИЯ В ГРУППЕ ПОПУЛЯЦИЙ ИЗ ВОСТОЧНОЙ ЕВРОПЫ И СЕВЕРНОЙ АЗИИ

VI.5.1) Сопоставление экспериментальных результатов с данными по популяциям Волго-Уральского региона.

VI.5.2) Количественные параметры геномной вариабельности.

VI.5.3) Результаты расчета Gst для пар популяций

VI.5.3.1) Расчет с использованием показателей сходства.

VI.5.3.2) Расчет с использованием гетерозиготности . 96 VI.5.4) Расчет Gst* для лингвистической иерархической структуры.

VI.5.5) Дифференциация популяций методами многомерного статистического анализа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование геномного разнообразия популяций человека методом мультилокусного ДНК-фингерпринтинга"

1.1) Актуальность проблемы

Одно из современных направлений фундаментальных исследований популяционной генетики - использование полиморфизма геномной ДНК для изучения структуры и эволюции популяций человека. Полиморфизм геномной последовательности не случаен и является следствием многочисленных мутационных изменений, накопленных в ходе биологических, исторических и экологических процессов. В настоящее время изучение полиморфизма ДНК проводится на многих популяциях мира, при этом в исследования включаются как диаллельные, так и гипервариабельные локусспецифические последовательности ДНК ядерного и митохондриального генома. Популяционные различия в распределении частот аллелей установлены для многих полиморфных систем; однако показано, что гипервариабельные локусы ДНК в силу своей большей гетерозиготности в популяциях, являются наиболее информативными маркерами при изучении структуры популяций. Одним из методов, использующих гипервариабельность минисателлитных локусов, является мультилокусный ДНК-фингерпринтинг, который визуализирует множественный полиморфизм длины рестрикционных фрагментов, что позволяет достаточно быстро выявлять генетическую вариабельность на внутри- и межпопуляционном уровнях. Метод разработан A.J. Jeffreys [Jeffreys et al, 1985] и получил свое название вследствие крайней специфичности индивидуальных паттернов гибридизации. Результаты ДНК-фингерпринтинга являются чувствительным индикатором геномного полиморфизма, так как вследствие высокой вариабельности картин гибридизации мала вероятность совпадения паттернов у случайных индивидуумов. Метод нашел широкое применение в криминалистике, генеалогических исследованиях, близнецовом анализе и исследованиях мутационных процессов. Результаты использования метода в популяционных исследованиях позволяют сделать вывод о его высокой эффективности для описания как популяционной структуры большой подразделенной популяции, принадлежащей к одному этносу, так и генетической структуры различных в этническом отношении популяций. Тем не менее, в настоящее время мультилокусный ДНК-фингерпринтинг не получил широкого применения в популяционных исследованиях из-за ряда методических проблем и проблем, связанных со статистической обработкой результатов. Значительным недостатком метода является отсутствие генетической интерпретации происхождения фрагментов гибридизации, что не позволяет использовать традиционные статистические методы популяционно-генетического анализа результатов. Другой серьезной проблемой является сопоставление результатов, полученных в различных лабораториях, даже при условии использования одного гибридизационного зонда. В настоящее время известно значительное количество последовательностей, при гибридизации которых с ДНК человека получается картина фингерпринтинга, одной из них является 15-ти нуклеотидный тандемный повтор в последовательности бактериофага М13 [Джинчарадзе и др.,1987; Vassart et al, 1987]. Первые работы по исследованию популяций человека, выполненные методом мультилокусного ДНК-фингерпринтинга на основе ДНК фага М13, показали широкие возможности метода и проблемы, связанные с анализом полученных данных. Поэтому представляет определенный интерес детальная разработка мультилокусного ДНК-фингерпринтинга, как метода, позволяющего достаточно быстро и адекватно сопоставлять генетические структуры близких и отдаленных в этническом отношении популяций человека.

Территория Северной Евразии является зоной контакта монголоидной и европеоидной рас, поэтому исследования генофонда современного коренного населения представляют особый интерес для популяционной генетики и широко проводятся в настоящее время. Накоплен огромный материал популяционно-генетических исследований народонаселения различных регионов Северной Евразии, в том числе по популяциям из России и Белоруссии, которые были изучены в представленной работе [Микулич, 1989; Рафиков и др., 1981, 1987, 1992; Шнейдер и др., 1989, 1995; Хуснутдинова, 1999; Хуснутдинова и др., 1999а, 19996]. Исследования, выполненные методом мультилокусного

ДНК-фингерпринтинга, могут внести значительный вклад в изучение генетической структуры народонаселения Восточно-Европейского региона.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Шаброва, Елена Вадимовна

выводы

4) Показано, что славянские популяции образуют наиболее компактную и гомогенную группу, которая характеризуется наименьшим уровнем межпопуляционного разнообразия (Gsr = 0.030 (0.033)) и наиболее существенными отличиями от остальных групп.

5) Обнаружены различия в уровнях популяционной подразделенности в пределах одного этноса: высокая гетерогенность группы башкирских популяций и значительное сходство белорусских популяций из различных регионов.

Выражаю глубокую благодарность Светлане Андреевне Лимборской за предоставление темы, терпение и руководство;

Василию Евгеньевичу Дерябину за консультации по вопросам многомерной статистики.

Также благодарю всех сотрудников Отдела молекулярных основ генетики человека за благожелательное отношение и помощь при обсуждении полученных результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование генофонда современного коренного населения бывшего Советского Союза широко проводится в настоящее время с использованием генетических маркеров различных типов. Признано, что для получения несмещенных оценок генетических расстояний между популяциями необходима информация по многим полиморфным локусам. В этом смысле мультилокусный ДНК-фингерпринтинг с использованием ДНК фага М13 в качестве зонда представляет значительный интерес, так как позволяет выявлять множество гипервариабельных локусов, которые равномерно распределены по всей геномной последовательности и имеют менделевский тип наследования.

Тем не менее, в настоящее время мультилокусный ДНК-фингерпринтинг не получил широкого применения в популяционных исследованиях из-за ряда методических проблем и проблем, связанных со статистической обработкой результатов.

При постановке экспериментов, был выработан ряд дополнительных рекомендаций к стандартной методике фингерпринтинга, которые позволили добиться необходимого качества и воспроизводимости результатов эксперимента:

• для ДНК-фингерпринтинга необходимо использовать только хорошо очищенные высокомолекулярные образцы ДНК

• особое внимание необходимо уделять качеству используемых реактивов, особенно, агарозы, формамида и ТРИС

• при использовании буфера ТАЕ для проведения электрофореза, помимо ежедневной смены буфера, для повышения буферной емкости можно увеличить его концентрацию до 1.5х

• при проведении электрофореза при комнатной температуре, оптимальным напряжением является 50 - 55 В (1.8 - 2.0 В/см); проблема диффузионного размывания полос полностью снимается при проведении электрофореза при низкой температуре (+4 С): полосы хорошо сфокусированы даже при более низком напряжении (35-40 В)

• точность идентификации позиций фрагментов гибридизации на радиоавтографах в значительной степени определяется качеством используемого маркера молекулярных масс: маркер должен иметь достаточное количество реперных фрагментов во всей исследуемой области

• постановка гибридизации в малом объеме, использование качественного формамида и 1 % SDS в гибридизационном буфере значительно улучшают гибридизационную картину

• из разных типов фильтров, использованных в работе, наиболее подходящими оказались Hybond С extra

В представленной работе также были разработаны принципы первичной обработки картин блот-гибридизации, которые позволяют достаточно точно идентифицировать фрагменты гибридизации на радиоавтографах и, следовательно, сопоставлять данные разных экспериментов. В рамках представленной работы была получена матрица размеров фрагментов, выявляемых при гибридизации с ДНК фага М13, в наиболее разрешаемой и информативной области фингерпринтинга (10 -1.8 тпн). Матрица размеров фрагментов может быть использована для анализа аналогичных данных по другим популяциям.

Получены распределения частот фрагментов гибридизации для изученных популяций и рассчитаны различные параметры геномной вариабельности. Предложены два варианта расчета критериев генетической дифференциации: через показатели сходства и гетерозиготность. Первый вариант, несмотря на большую сложность расчета, оказался более приемлемым для анализа подобных данных, так как позволяет работать с малыми выборками и дает более сопоставимые результаты с результатами, полученными другими методами анализа.

Результаты первичной обработки картин ДНК-фингерпринтинга, представленные в виде бинарной матрицы, были сопоставлены с аналогичными данными для популяций Волго-Уральского региона [Хидиятова, 1993; Хуснутдинова, 1997]. Выполнен совместный статистический анализ данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга для 13 популяций, который выявил следующее:

Исследованная система популяций разделяется на три мажорных кластера: 'Славянский', кластер 'Башкиры' - 'Якуты' и 'Уральскую группу'. Не наблюдается абсолютного соответствия между полученным подразделением популяций Волго-Уральского региона и общепринятой лингвистической классификацией: популяции 'Татары' и 'Чуваши', которые принадлежат к Алтайской лингвистической семье, формируют третий кластер с популяциями Уральской лингвистической семьи. Исследованная нами якутская популяция примкнула к группе башкирских популяций, которые, по разным оценкам [Хуснутдинова, 1999], характеризуются наибольшим содержанием монголоидного компонента.

Кластеры формируют треугольник в условном пространстве 1 и 2 размерности. Популяции с наибольшим содержанием монголоидного компонента (якутская и башкирские популяции) отделяются от всех остальных популяций по оси 2 размерности, при этом наиболее монголоидная якутская популяция, в большинстве случаев, показывает максимальные различия по координате. Ось 1 размерности разделяет славянские популяции и 'Уральскую группу', второй кластер занимает промежуточное положение.

Славянские популяции образуют наиболее компактную и гомогенную группу, которая характеризуется наименьшим уровнем межпопуляционного разнообразия (Gsr'Cnae = 0.030 (0.033)) и наиболее существенными различиями от остальных групп.

Белорусские популяции не показали региональных различий в отличие от группы башкирских популяций. Популяция юго-западных башкир ('Башкиры4') значительно выделяется из группы остальных башкирских популяций и занимает промежуточное положение между кластером 'Башкиры' - 'Якуты' и смешанным кластером остальных популяций Волго-Уральского региона.

Наблюдаются значительные внутрикластерные (межпопуляционные) различия для кластеров, сформированных популяциями Волго

• Максимальный уровень межпопуляционного разнообразия выявлен для тюркской лингвистической группы (Gsr'7Vop/c=0.081(0.096)) по сравнению с межпопуляционным разнообразием для других лингвистических групп, сформированных в соответствие с лингвистической классификацией.

В работе представлен, вероятно, наиболее полный на сегодняшний день набор различных вариантов статистического анализа данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга. Сопоставление полученных результатов позволяет рекомендовать многомерное шкалирование, как оптимальный с точки зрения информативности и простоты необходимых для выполнения анализа расчетов, метод для получения представления об анализируемой системе популяций.

Анализ данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга различными статистическими методам, в целом, дал идентичные и адекватные результаты. Исследование гетерогенной группы популяций человека выявило сходство между территориально удаленными популяциями, принадлежащими одному этносу и значительные различия между популяциями разных этносов. Результаты работы позволяют сделать вывод о целесообразности использования метода для исследования генетической структуры, оценки генетической вариабельности и генетического родства в сложных группах различных в этническом отношении популяций. Доступность компьютерных программ, в частности, пакета статистических программ STAJISTICA, дают возможность применения различных методов многомерного статистического анализа, которые позволяют наглядно представлять полученные результаты, выявлять взаимосвязи и внутреннюю структуру в исследуемой группе популяций.

Расчет показателей сходства и критериев генетической дифференциации позволяет оценить вариабельность на внутри- и межпопуляционных уровнях и сравнить полученные результаты с данными по другим ДНК и биохимическим маркерам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шаброва, Елена Вадимовна, Москва

1. Amarger V., Gauguier D., Yerle M., Apiou F., Pinton P., Giraudeau F.t Monfouilloux S., Lathrop M., et al. Analysis of the human, pig, and rat genomes supports a universal telomeric origin of minisatellite sequences // Genomics. 1998. V. 52. P. 62 71.

2. Appelgren H., Cederberg H., and Rannug U. Meiotic interallelic conversion at the human minisatellite MS32 in yeast triggers recombination in several chromatids // Gene. 1999. V. 239. P. 29 38.

3. Appelgren H., Cederberg H., and Rannug U. Mutations at the human minisatellite MS32 integrated in yeast occur with high frequency in meiosis and involve complex recombination events // Mol. Gen. Genet. 1997. V. 256. P. 7-17.

4. Armour J. A. L, Povey S., Jeremiax S., and Jeffreys A. J. Systematic cloning of human minisatellites from ordered array charomid libraries // Genomics. 1990. V. 8. P. 501 512.

5. Ashley T. Mammalian meiotic recombination: a reexamination // Hum. Genet. 1994. V. 94. P. 587 593.

6. Baker C.S., Gilbert D.A., Weinrich M.T., Lambertsen R., Calambokidis J., McArdle В., Chambers G.K., and O'Brien S.J. Population Characteristics of DNA Fingerprints in Humpback Whales (Megaptera novaeangliae) И J. Hered. 1993. V. 84. P. 281 290.

7. Bellamy R.J., Inglehearn C.F., Jalili I.K., Jeffreys A.J., and Bhattacharya S.S. Increased band sharing in DNA fingerprints of an inbred human population // Hum. Genet. 1991. V. 87. P. 341 347.

8. Benson G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences // Nucleic Acid. Res. 1999. V. 27. P. 573 580.

9. Boan F., Rodriguez J. M., and Gomez-Marquez J. A non-hypervariable human minisatellite strongly stimulated in vitro intramolecular homologous recombination // J. Mol. Biol. 1998. V. 278. P. 499 505.

10. H.Bo/'s P., Stead J. В., Bakshi S., Williamson J., Neumann R., Moghadaszadeh В., and Jeffreys A. J. Isolation and characterization of mouse minisatellites // Genomics. 1998. V. 50. № 3. P. 317 330.

11. Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W., 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms //Am. J. Hum Genet. V. 32. P. 314 331.

12. Brusco A., Saviozzi S.t Cinque F., Bottaro A., and DeMarchi M. A recurrent breakpoint in the most common deletion of the Ig heavy chain locus (del A1-GP-G2-G4-E) // J. Immunol. 1999. V. 163. P. 4392-4398.

13. Buard J. and Vergnaud G. Complex recombination events at the hypermutable minisatellite CEB1 (D2S90) // EMBO J. 1994. V. 13. P. 3203 -3210.

14. Buard J., Collick A., Brown J., and Jeffreys A. J. Somatic versus germline mutation processes at minsatellite CEB1 (D2S90) in humans and transgenic mice // Genomics. 2000. V. 65. P. 95 103.

15. Burke Т., and Bruford M.W. DNA fingerprinting in birds // Nature. 1987. V. 327. P. 149-152.

16. Chaillet J. R., BaderD. S., and Leder P. Regulation of genomic imprinting by gametic and embryonic processes // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 1177 — 1187.

17. W.Chakravarti A. Population genetics making sense out of sequence // Nature genetics supplement. 1999. V. 21. P. 56 - 60.

18. Christmann A., Lagoda P. J. L, Zang K. D. Non-radioactive in situ hybridization pattern of the M13 minisatellite sequences on human metaphase chromosomes // Human Genetics. 1991. V.86. P.487-490.

19. Greenacre M. J. Theory and applications of correspondence analysis / New York: Academic Press. 1984.

20. Huey B. and Hall J. Hypervariable DNA Fingerprinting in Escherichia coii: Minisatellite Probe from Bacteriophage M13 //J. Bacteriol. 1989. V. 171. № 5. P. 2528 2532.

21. Jeffreys A. J. and Neumann R. Somatic mutation processes at a human minisatellite // Hum. Mol. Genet. 1997. V. 6. P. 129 136.

22. Jeffreys A. J., Neil D., and Neumann R. Repeat instability at human minisatellites arising from meiotic recombination // EMBO J. 1998. V. 17. P. 4147-4157.

23. Jeffreys A.J. Spontaneous and induced minisatellite instability in human genome // Clinical Science. 1997. V. 93. № 5. P. 383 390.

24. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable "minisatellite" regions in human DNA // Nature. 1985. V. 314. P. 67 73.

25. Jeffreys AJ, Murray J, Neumann R. High-resolution mapping of crossovers in human sperm defines a minisatellite-associated recombination hotspot II Mol. Cel. 1998. V. 2. № 2. P. 267 73.

26. Kennedy G. C., German M. S.$ and Rutter W. J. The minisatellite in the diabetes susceptibility locus IDDM2 regulates insulin transcription // Nat. Genet. 1995. V. 9. P. 293 298.

27. Lebart L, Morineau A., Warwick K.M. Multivariate Descriptive Statistical Analysis. Correspondence Analysis and Related Techniques for Large Matrices / New York. Chichester: J Wiley & Sons. 1984. P. 231.

28. Lewin R. DNA Fingerprints in Health and Diseases // Science. 1986. V. 233. P. 521 522.

29. Lichtenstein A.V., Moiseev V.L., Zaboikin M.M. A procedure for DNA and RNA transfer to membrane filters avoiding weight-induced gel flattening // Anal. Biochem. 1990. V. 15. № 1. P. 187 191.

30. Livshits G., Nei M. Relationships between intrapopulational and interpopulational genetic diversity in man // Ann. Hum. Bio.l 1990. V. 17. P. 501-513.

31. Lynch M. Analysis of population genetic structure by DNA fingerprinting // EXC. 1991. V. 58. P. 113-126.

32. Lynch. M. The similarity index and DNA fingerprinting // Mol. Biol. Evol. 1990. V. 7. P. 478-484.

33. M13 cloning and sequencing handbook II SPL, Blenheim Crescent, London. Amersham UK. 1984. Amersham International pic.

34. Mathew C.G.P. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA. In: Methods in Molecular Biology / Humana Press (ed Walker JM). 1984. V. 2. P. 31 34.

35. Monckton D.J., Neumann R., Guram Т., Fretwell N., Tamaki K., MacLeod A., and Jeffrey A.J. Minisatellite mutation rate variation associated with a flanking DNA sequence polymorphism // Nat. Genet. 1994. V. 8. P. 162 -170.

36. Murray J., Buard J., Neil D.L., Yeramian E., Tamaki K., Hollies C., and Jeffreys A.J. Comparative Sequence Analysis of Human Minisatellites Showing Meiotic Repeat Instability // Genome Res. 1999. V. 9. P. 130 136.

37. Nakamura Y., Leppert M., O'Connell P., Wolff R., Holm Т., Culver M., Martin C., Fujimoto E. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping // Science. 1987. V. 235. P. 1616 1622.

38. Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1973. V. 70. P. 3321 3323.

39. Nei M. Definition and estimation of fixation indices // Evolution. 1986. V. 40. P. 643 645.

40. Nei M. Molecular Population Genetics and Evolution // North-Holland Publishing Company. Amsterdam. 1975. P. 290.

41. Neumann В., Kubicka P., and Barlow D. P. Characteristics of imprinted genes // Nat. Genet. 1995. V. 9. P. 12 13.

42. O'Brien S.J., Wildt D.E., Goldman D., Merril C.R., and Bush M. The cheetah is depauperate in genetic variation // Science. 1983. V. 221. P. 459 462.

43. Reeve H.K., Westneat D.F., Noon W.A., Sharman P.A., Aquadro C.F. DNA "fingerprinting" reveals high levels of inbreeding in colonies of the eusocial naked mole-rat // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 2496 2500.

44. Ryskov A.P., Jincharadze A.G., Prosnyak M.L, Ivanov P.L, and Limborska S.A. M13 phage DNA as a universal marker for DNA fingerprinting of animals, plants and microorganisms // FEB. 1988. V. 233. P. 388 392.

45. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning // Cold Spring Harbor, Laboratory Press. USA. 1989.

46. Satoh C. and Kodaira M. Effect of radiation on children // Nature. 1996. V. 383. P. 226.

47. Smith E.G., Summers M.D. The Bidirectional Transfer of DNA and RNA to Nitrocellulose or Diazobenzyloxymethyl-Paper // Texas A @ M University. 1980. V.109. P. 123-129.

48. Sneath P.H.A., and Sokal R.R. Numerical taxonomy / San Francisco: W. H. Freeman & Co. 1973.

49. Stead J.D. and Jeffreys A.J. Allele diversity and germline mutation at the insulin minisatellite // Hum. Mol. Genet. 2000. V. 20. № 5. P. 713 723.

50. Stephens J.C., Gilbert D.A., Yuhki N., O'Brien S.J. Estimation of heterozygosity for single-probe multilocus DNA fingerprints // Mol. Biol. Evol. 1992. V. 9. P. 729-743.

51. Sutherland G. R., Baker £., and Richards R. I. Fragile sites still breaking // Trends Genet. 1998. V. 14. P. 501 506.

52. Sybenga J. What makes homologous chromosomes find each other in meiosis? A review and an hypothesis // Chromosoma. 1999. V. 108. P. 209 -219.

53. Te/ca/a F.t Yeramian E., Dujon B. Amino acid composition of genomes, lifestyles of organisms, and evolutionary trends: a global picture with correspondence analysis // Gene. 2002. V. 297. P. 51 60.

54. Tishkoff D.X., Filosi N., Gaida G.M., and Kolodner R.D. A novel mutation avoidance mechanism dependent on S. cerevisiae RAD27 is distinct from DNA mismatch repair // Cell. 1997. V. 88. P. 253 263.

55. Tokarskaya O.N., Kalnin V.V., Panchenko V.G., Ryskov A.P. Genetic differentiation in a captive population of endangered Siberian crane (Grus leucogeranus Pall) // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 245. P. 658 660.

56. Turn M. G., Cuin K. A., and Porter A. C. Characterization of a novel minisatellite that provides multiple splice donor sites in an interferon induced transcript // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 1854 1861.

57. Vassart G., Georges M., Monsieur R., Brocas H., Lequarre A.S., Christophe D. A sequence in M13 phage detects hypervariable minisatellites in human and animal DNA // Science. 1987. V. 235. P. 683 684.

58. Vergnaud G. and Denoeud F. Minisatellites: Mutability and Genome Architecture II Genome Research. 2000. V. 10. P. 899 907.

59. Vergnaud G. Polymers of random short oligonucleotides detect polymorphic loci in the human genome // Nucleic Acids Res. 1989. V.17. P. 7623 7630.

60. Vergnaud G., Mariat D., Apiou F., Aurias A., Lathrop M., and Lauthier V. The use of synthetic tandem repeats to isolate new VNTR loci: cloning of a human hypermutable sequence // Genomics. V. 11. P. 135 -144.

61. Vogel F. ABO blood groups and diseases // Amer. J. Hum. Genet. 1970. V. 22. P. 464.

62. Wahls W. P. and Moore P. D. Recombination hotspot activity of hypervariable minisatellite DNA requires minisatellite DNA binding proteins // Somat. Cell Mol. Genet. 1998. V. 24. P. 41-51.

63. Ward J.H. Hierarchical grouping to optimize an objective function // Journal of the American Statistical Association. 1963. V. 58. P. 236.

64. Wetton J.H., Carter R.E., Parkin D.T., Walters D. Demographic study of a wild house sparrow population by DNA fingerprinting // Nature. 1987. V. 327. P. 147-149.

65. Wildt D.E., Bush M., Goodrowe K.L., Packer C., Pusey A.E., Brown J.L., Joslin P., and O'Brien S.J. Reproductive and genetic consequences of founding isolated lion populations // Nature. 1987. V. 329. P. 328 331.

66. Williamson R., Bowcock A., Kidd K. et al. Report of the DNA committee and catalogues of cloned and mapped genes and DNA polymorphisms // Cytogenet. Cell. Genet. 1990. V. 55. P. 457 778.

67. Wong Z., Wilson V., Patel I., Poiey S.t Jeffreys A.J. Characterisation of a panel of highly variable minisatellites cloned from human DNA // Am. J. Hum. Genet. 1987. V. 31. P. 269 288.

68. Wright S. The genetical structure of populations // Ann. Eugen. 1951. V. 15. P. 323 354.

69. Wyman A. R. and White R. A highly polymorphic locus in human DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. 1980. V. 77. P. 6754-6758.

70. Барышева Е.В., Букина A.M., Петрова Н.В., Лимборская С.А., Гинтер Е.К. Использование полиморфизма ДНК, выявляемого с помощью ДНК фага М13, в популяционных исследованиях // Генетика. 1991. Т. 27. № 3. С. 399 403.

71. Бунак В.В. Геногеографические зоны Восточной Европы, выделяемые по факторам крови АВО // Вопр. антропологии. 1969. Вып. 32. С. 6.

72. Дерябин В.Е. Современные восточнославянские народы. Восточные славяне. Антропология и этническая история / М: Научный мир. 1999а. С. 30 - 59.

73. Дерябин В.Е. Многомерное количественное антропологическое изучение современных народов Кавказа. Часть I // Вестник антропологии. 19996. Вып.6. С. 39 58.

74. Дерябин В.Е. Многомерное количественное антропологическое изучение современных народов Кавказа. Часть II // Вестник антропологии. 1999в. вып.6. С.59 -78.

75. Дерябин В.Е. Многомерные биометрические методы для антропологов // Рукопись, депонированная в ВИНИТИ. 2001. № 37-В2001.

76. Иванов П.Л., Семиохина А.Ф., Рысков А.П. Геномная дактилоскопия крыс Rattus Norvegicus: новый подход к генетическому маркированию // Генетика. 1989. Т. 25. № 2. С.238 249.

77. Кайданов Л.З. Генетика популяций / Москва: Высшая школа. 1996. С. 319.

78. Кимура М. Молекулярная эволюция: теория нейтральности / М: «Мир». 1985. С. 398.

79. Лебедева И.А. Генофонд народонаселения России и сопредельных стран по данным молекулярной гибридизации ДНК. В книге Рычкова

80. Люблинский А. В. Результаты произведенных в Кронштадте в последние 5 лет исследований зрения у нижних чинов: Из медицинских прибавлений к Морскому сборнику / СПб. 1885. С. 23.

81. Малюта С. С., Дыбков М.В., Телегеев Г.Д. Изучение полиморфизма ДНК жителей Украины, выявляемого зондом на основе фага М13 // Цитология и генетика. 1996. Т. 30. № 1. С. 31 35.

82. Микулич А.И. Геногеография сельского населения Белоруссии // Минск: Наука и техника. 1989. С. 181.

83. Пасеков В.П. Генетические расстояния // Итоги науки и техники. Общая генетика. М. ВИНИТИ. 1983. Т. 8. С. 4 75.

84. Рафиков Х.С., Белова И.Ю., Юмагужина Н.Х., Кузеев Р.Г. Структура популяции башкир в регионе среднего Поволжья и Урала // В сб.: Популяционно-генетические исследования народов Южного Урала. Уфа: БФ АН СССР, 1981. С. 3-36.

85. Рафиков Х.С., Хуснутдинова Э.К., Долматова И.Ю. с соав. Структура и генетическая близость башкир к народам Волго-Уральского региона и Сибири // В сб.: Антропология и популяционная генетика башкир. Уфа. 1987. С. 60-76.

86. Рафиков Х.С., Хуснутдинова Э.К., Хидиятова И.М. Особенности формирования генетической структуры башкир // Материалы к антропологии уральской расы. Уфа. 1992. С. 60-70.

87. Рысков А.П. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях биоразнообразия // Молекулярная биология. 1999. Т. 33. № 6. С. 997-1011.

88. Рысков А.П., Токарская О.Н., Вербовая Л.В. Джинчарадзе А.Г., Гинсбург А.Л. Геномная "дактилоскопия" микроорганизмов: использование в качестве гибридизационного зонда ДНК фага М13 // Генетика. 1988. Т. 24. № 7. С. 1310 1313.

89. Рысков А.П., Фаизов Т.Х., Алимов A.M., Романова Е.А. Геномная "дактилоскопия": новые возможности в определении видовой принадлежности бруцелл // Генетика. 1990. Т. 26. № 1. С. 130-134.

90. Рычков Ю.Г. Система древних изолятов человека в Северной Азии в свете проблем стабильности и эволюции популяций. Поиски и решения на путях популяционной генетики // Вопросы антропологии. 1973. Вып. 44. С. 3 22.

91. Рычков Ю.Г., Жукова О.В., Шереметьева В.А. и др. Генофонд и геногеография народонаселения / ред. Рычков Ю.Г. и Алтухов Ю.П. 2000. Санкт-Петербург: Наука. Т. I. С. 611.

92. Рычков Ю.Г., Ящук Е.В. Генетика и этногенез // Вопросы антропологии 1980. Вып. 64 С. 23 39 .

93. Рычков Ю.Г., Ящук Е.В. Генетика и этногенез. Состояние и тенденции генетического процесса в связи с особенностями развития народонаселения Европы (зарубежной) // Вопросы антропологии. 1983. Вып. 72. С. 3-17.

94. Рычков Ю.Г., Ящук Е.В., Веселовская Е.В. Генетика и этногенез. О генетической прапамяти систем коренного населения Северной Азии и Америки // Вопросы антропологии. 1982. Вып. 69.

95. Семина (Барышева) Е.В., Букина A.M., Гинтер Е.К., Лимборская С.А. Семейный анализ «фингерпринтов» человека, полученный с помощью зонда ДНК фага М13 // Генетика. 1993а. Т. 29. № 10. С. 1608 -1611.

96. Спицын В. А. Биохимический полиморфизм человека / М. 1985. С. 214.

97. Токарская О.Н., Зуев А.В., Сорокин А.Г., Панченко В.Г., Рысков А.П. Геномная дактилоскопия журавлей: новый подход для генотипирования видов // Генетика. 1990. Т. 26. № 4. С. 599-605.

98. Хидиятова И.М. Использование рестрикционного полиморфизма ДНК в популяционно-генетических исследованиях // Дисс. канд. биол. наук. М. 1993.

99. Хуснутдинова Э.К. Молекулярная этногенетика народов Волго-Уральского региона //Уфа: Гилем. 1999. С. 237.

100. Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетическая характеристика популяций башкир и других народов Вол го-Уральского региона // Дисс. докт. биол. наук. М. 1997. С. 343.

101. Шнейдер Ю.В., Тихомирова Е.В., Шильникова И.Н. Генетический полиморфизм и геногеография коренного населения Уральского региона. 1. Генетическая структура народов Волго-Уральского региона И Генетика. 1995. Т. 31. № 4. С. 560-572.

Информация о работе

Шаброва, Елена Вадимовна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.26

Диссертация

Исследование геномного разнообразия популяций человека методом мультилокусного ДНК-фингерпринтинга - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы