Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функциональной активности химически модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека in vitro и in vivo

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование функциональной активности химически модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека in vitro и in vivo"

На правах рукописи

Илюшин Денис Григорьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO И IN VIVO

Специальность 03.01.03 - «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук 1 8 АПР 2013

Москва 2013

005052148

Работа выполнена в Лаборатории биокатализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).

Научные руководители: Доктор биологических наук

Пономаренко Наталья Александровна Кандидат химических наук Смирнов Иван Витальевич Официальные оппоненты: Деев Сергей Михайлович, доктор биологических

наук, профессор, чл.-корр. РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии Федерального государственном бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).

Лагарькова Мария Андреевна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией генетических основ клеточных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук (ИОГЕН РАН).

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН).

Защита состоится «14» мая 2013 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Автореферат разослан «10» апреля 2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Кандидат фармацевтических наук^/7 ^^Грановская Любовь Сергеевна

І. ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В конце 1930-х гг. в качестве инсектицидов был синтезирован ряд фосфороргани-ческих токсинов (ФОТ). Доступность ряда ФОТ в странах с развивающейся аграрной экономикой приводит к частым случаям отравлений и летальных интоксикаций. По данным Всемирной организации здравоохранения бытовое летальное отравление ФОТ получает более 300 ООО человек в год. Несмотря на то, что 185 государств в 1992 г. присоединились к Конвенции «О запрещении химического оружия», сохраняется угроза использования нервно-паралитических агентов и других ФОТ в ходе военных действий и террористических актов.

Методы медикаментозного лечения отравлений фосфорорганическими токсинами на настоящий момент обладают целым рядом побочных эффектов. Альтернативным подходом к терапии и профилактике отравлений ФОТ является использование биологических антидотов. В качестве таких антидотов могут выступать антитела и ферменты, которые изолируют и инактивируют высокотоксичные соединения до того, как те достигнут своей биологической мишени. Из всех потенциальный кандидатов на роль биологического антидота против ФОТ только бутирилхолинэстераза(БуХЭ, ЕС 3.1.1.8) плазмы крови человека в 2006 г. получила статус «New development drug» (Новый лекарственный препарат, подлежащий дальнейшей разработке - англ.) от Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA).

Обзор современных биотехнологических методов получения БуХЭ позволяет сделать следующие выводы.

1. Получение БуХЭ из плазмы крови человека (чБуХЭ) - дорогостоящий процесс, осложненный возможностью контаминации препарата патогенами из зараженной плазмы.

2. Попытки экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека (рчБуХЭ) в клетках бактерий и дрожжей не привели к получению активного фермента;

3. Проект создания трансгенных животных в качестве источника рчБуХЭ закрыт в связи с нерентабельностью производства.

4. Несмотря на высокий уровень продукции активной рчБуХЭ в трансгенных растениях, применение этого препарата в качестве медикамента невозможно, так как на сегодняшний день FDA не одобрило использование трансгенных растений для получения препаратов рекомбинантных белков, пригодных для инъекции в кровь человека.

5. Из всех существующих на сегодняшний день систем экспрессии рчБуХЭ, только клетки линии СНО (Chinese hamster ovary cells - англ., клетки яичников китайского хомячка) полностью удовлетворяют требованиям FDA, однако низкий уровень продукции делает применение этой системы в промышленных масштабах нерентабельным. Таким образом, на сегодняшний день не существует эффективной и экономически

выгодной системы экспрессии рчБуХЭ, пригодной для инъекции в кровь.

Цель работы и основные задачи исследования

Цель работы состояла в создании эффективной системы экспрессии рекомби-нантной БуХЭ человека и исследовании функциональной активности полученного фермента в экспериментах in vitro и in vivo. Для ее достижения были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. создание эффективной эукариотической системы экспрессии функционально активной БуХЭ человека;

2. изучение физико-химических свойств рекомбинантной БуХЭ человека;

3. оптимизация фармакокинетических характеристик рекомбинантного фермента;

4. определение эффективности полученного препарата рчБуХЭ для профилактики отравлений ФОТ.

Научная новизна и практическая значимость работы

Для получения рекомбинантной БуХЭ человека была выбрана система экспрессии на основе клеток линии СНО, которая сертифицирована для синтеза медикаментозных препаратов на основе рекомбинантных белков. Ген БуХЭ был клонирован под контроль промотора фактора элонгации полипептидной цепи (EF-al). После проведения стабильной трансфекции и оптимизации условий продукции на специализированных безбелковых ростовых средах удалось получить клон A3 продуцирующий до 30 мг рчБуХЭ на литр ростовой среды, что как минимум на порядок выше, чем в ранее разработанных системах. Для изменения олигомерного состава рекомбинантного фермента клон A3 был трансфицирован фрагментом ДНК, несущим ген обогащенного остатками пролина пептида PRAD под контролем промотора EF-al. В результате отбора был получен стабильный клеточный клон АЗН9, продуцирующий БуХЭ в форме димера и тетрамера. Опыты на мышах линии BALB/c показали, что фармако-кинетические параметры полученной рчБуХЭ не позволяют эффективно использовать рекомбинантный фермент для профилактики отравлений ФОТ.

Для радикального увеличения времени полувыведения препарата рчБуХЭ из крови была предложена химическая модификация гомополимерами N-ацетил-нейраминовой кислоты - сиалирование. В отличие от полимеров этиленгликоля, широко применяемых для модификаций рекомбинантных белков, гетеро- и гомопо-лимеры сиаловой кислоты являются биодеградируемыми молекулами, не токсичны и не накапливаются в тканях и внутренних органах. Таким образом, модификация полисиаловыми кислотами позволяет снизить риск возможных побочных действий рчБуХЭ, тем самым лучше вписываясь в концепцию биологического антидота. Применение комбинаторного подхода позволило определить оптимальные условия реакции химического полисилирования рчБуХЭ, при которых удалось добиться не менее 80% выхода реакции при относительно невысокой (не более 10%) потере удельной активности рекомбинантного фермента.

Полученный конъюгат рчБуХЭ с гомополимерами сиаловой кислоты (рчБуХЭ-СА027) был подвергнут всестороннему анализу in vitro и in vivo. Установлено, что

химическая модификация полисиалированием не влияет на олигомеризацию рчБу-ХЭ. Масс-спектрометрическое исследование конъюгата рчБуХЭ-СА027 позволило выявить по меньшей мере 6 потенциальных сайтов модификации рекомбинантного фермента. Сравнение кинетических констант (АГМ, к , Kss и Ь) гидролиза бутирилти-охолин иодида модифицированной и немодифицированной рекомбинантной рчБуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что полученные значения отличались от известных из литературы в пределах ошибки, что свидетельствует об интактно-сти активного центра фермента и его окружения. Фармакокинетические испытания in vivo на мышах линии BALB/c свидетельствуют о том, что в результате химического полисиалирования время полувыведения конъюгата рчБуХЭ-СА027 возросло в 5,5 раз по сравнению с немодифицированной рчБуХЭ и стало сопоставимо со временем полувыведения препарата нативной БуХЭ плазмы крови человека. Таким образом впервые успешно применен метод химического полисиалирования для модификации сложного глобулярного фермента.

Способность рчБуХЭ и рчБуХЭ-СА027 эффективно связывать агент VR in vitro стала основанием для проведения эксперимента на животных. В результате испытания in vivo на беспородных мышах доказано, что препарат рекомбинантной БуХЭ плазмы крови человека, модифицированный полимерами N-ацетилнейраминой кислоты при внутривенном введении в дозировке 21 мг/кг живого веса, обеспечивает профилактическую защиту от действия 4,2 ЛД50 агента VR, не вызывая долгосрочных изменений в поведенческой активности и физической выносливости подопытных животных.

Настоящая работа описывает метод получения конъюгата рекомбинантной бути-рилхолинэстеразы плазмы крови человека с гомополимерами N-ацетилнейраминовой кислоты, полностью удовлетворяющего современным требованиям к биологическому антидоту.

Публикация и апробация работы

По теме диссертации опубликовано 2 статьи и подана заявка на патент. Результаты диссертации были представлены на 4 международных конференциях: XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2008, Москва); Русско-французской конференции «Химия в молекулярной биологии» (2011, Москва); XXIV зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2012, Москва); Международной научной конференции «The 11th Meeting on Cholinesterases» (2012, Казань). Структура и объем работы

Диссертация состоит из Введения, трех глав - «Литературный обзор», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», Выводов, Списка литературы, включающего 129 работы, и Приложений. Работа изложена на 107 страницах, включая 41 рисунок и 15 таблиц.

бычью фетальную сыворотку. По достижению клетками 70-90%-ной конфлюент-ности среду заменяли на одну из тестируемых безбелковых сред и инкубировали в ней клетки на протяжении нескольких суток. Инкубация клеток в средах РергЛесИ и ЕХ-СеП приводила к их гибели на 1-2 сутки. Данные среды были признаны не подходящими для моноклона АЗ. При инкубации клеток в среде РгоСН04 наблюдался значительный прирост продукции рчБуХЭ клетками на 96 часу инкубации (рис. 4). Олигомеризация рекомби-нантной БуХЭ

Анализ олигомерного состава продуцируемой клоном АЗ рчБуХЭ по методу Карновского (рис. 5) показал, что в основном рчБуХЭ представлена в форме мономера, в то время как продукция тетраметра невелика. С фармакологической точки зрения представляет интерес именно тетрамер БуХЭ, поскольку время его полувыведения из организма составляет 3-4 дня, а мономера - несколько часов. Ранее было показано, что при добавлении к БуХЭ пептида РЯАЭ - домена коллагенопо-добного белка Со1(} - количество тетрамеризованного продукта увеличивается.

В настоящей работе было решено использовать коэк-спрессию рчБуХЭ и пептида РИАО.

Создание экспрессионных конструкций пептида РЯАЭ

Исходная экспрессионная конструкция рК.С/К.8У-г<345 была любезно предоставлена Оксаной Локридж.

Для выбора промотора, обеспечивающего наиболее эффективную продукцию РКАБ, были созданы две новые экспрессионные конструкции: рсОЫА/СМУ/ВСНЕ (рис. 6, А) и рВис!СЕ/ЕЕ/ВСНЕ (рис. 6, Б), несущие ген пептида РЯАЭ под контролем СМУ и ЕБ промоторов соответственно. Корректность сборки конструкций подтверждена методом рестриктного анализа и секвенированием по Сэнгеру.

24 ч 48 ч 72 ч 96 ч Рис. 4.Анализ подбора условий экспрессии бинантной БуХЭ человека клоном АЗ в разл ростовых средах

120 ч

реком-

И Ч Н Ы X

12 3

Рис. 5.Анализ олигомерного состава рчБуХЭ методом Карновского. Разделение рчБуХЭ осуществляли в 8% ПААГ в не-денатурирующих условиях:

Культуральная среда клона A3 (1); образец плазмы крови человека [2]; образец очищенной бутирилхолиэстеразы плазмы крови человека (3); Т - тетрамер, А - димер альбумина и БуХЭ, Д-димер,М-мономер

Hindill

Bglll *

Nhel

rEF -(BGHpolyA)—| j-frf EF ^/tctag ^""[bGH polyA>-%

pBudCE/EF L I

( Zeocin 1 ' ' ( Zeocin 1 '

Hindlll К *

p|CMV ' (

CMV PRAD ^-[BGH polyA

pcDNA/CMV/PRAD

Spei

Neomycin

H_

CMV X"r-6-CA

Neomycin )-<(^BGH polyA ]■

1

pcDNA/EF/PRAD

~^)»[bGH polyA^)'

Рис. 6. Схема создания конструкций рсОМА/СМУ/РРАЭ [А] и рсРМА/ЕР/РРАО [Б]

Получение клона-продуцента АЗН9

Экспрессионные конструкции рсОЫА/СМУ/РКАО и рсЭНА/ЕР/РКАВ, транс-фицировали методом липофекции в клетки клона АЗ. Через 72 ч после проведения трансфекции количество тетрамерной формы рчБуХЭ в среде контролировали элек-трофоретически по методу Карновского. По результатам проведенного анализа (рис. 7) были выбраны клетки клона АЗ, трансфицированные плазмидой pcDNA/EF/PRAD. Использование ЕР промотора в данном случае позволяет получать клетки, производящие большее количество тетрамерной формы БуХЭ в ростовую среду.

Для получения стабильного клона экспрессионную конструкцию pcDNA/EF/ РЯАЭ линеаризовали и проводили трансфекцию методом липофекции в клетки клона АЗ. Селекцию проводили добавлением в ростовую среду 1,5 мг/мл гигромицина Б и 600 мкг/мл зеоцина. Продукцию изоформ БуХЭ моноклонами определяли по методу Карновского. По результатам тестирования был отобран клон АЗН9 (рис. 8). После оптимизации условий экспрессии в ростовой среде РгоСН04 (Ьопга) по ранее описанной схеме удалось получить стабильно продуцирующий клон АЗН9, характерной особенностью которого является продукция тетрамерной и димерной формы БуХЭ при полном отсутствии продукции мономера.

Разработка системы детекции и оценки продукции рекомбинантного белка

В ходе работы оценку эффективности трансфекции и отбор клонов клеток линии СНО, продуцирующих рчБуХЭ, проводили по функциональной активности фермента

Рис. 7.Анализ олигомерного состава рчБуХЭ после временной трансфекции клеток клона АЗ экспрессионными конструкциями рсйМА/СМУ/РІЗАО и рсРІМА/СМУ/РРАО:

Культуральная среда клона АЗ (11; культураль-ная среда клона АЗ после временной трансфекции конструкцией рсОМА/СМУ/РРАО (2); культуральная среда клона АЗ после временной трансфекции конструкцией рсОМА/ЕР/РРАР (3); образец плазмы крови человека 14]; образец коммерчески доступной БуХЭ плазмы крови человека (Бідта, США) (5); образец очищенной БуХЭ плазмы крови человека (6); Т -тетрамер, А - димер альбумина и БуХЭ, Д - димер, М - мономер

с применением методик Эллмана и Карновского. В основе этих методик лежит способность БуХЭ гидролизовать бутирилтиохолин, что делает их неприменимыми в случаях, когда БуХЭ неактивна или ингибирована.

Известно, что высокий уровень экспрессии рекомбинантных продуктов в клетках эукариот иногда сопровождается снижением их удельной активности, т. е. появлением некоторой доли неактивного белка. Часто это связано с тем, что собственная система посттрансляционных модификаций клетки не справляется с объемом продуцируемого белка, что приводит к появлению неактивных продуктов с некорректным фолдингом, неотщепленным про-пептидом и другими дефектами. В связи с этим представлялось интересным оценить удельную активность нашего фермента при экспрессии. Таким образом, встала дополнительная задача разработки системы прямой оценки содержания БуХЭ в образцах. Для определения концентрации

ІІ и:ішсіоезХш

го тготтттготт < <<<<<<<<<

Рис. 8. Сравнительный анализ количества олигомерных форм рчБуХЭ отобранными клонами, трансфицированными линеаризованными конструкциями рВис1СЕ/ЕР/ВСНЕ и рсОМА/ЕР/РРАО: образец очищенной БуХЭ плазмы крови человека, 100 нг (11; образец очищенной БуХЭ плазмы крови, 400 нг (2); Т - тетрамер, Д-димер, М - мономер

Получение и анализ мышиных моноклональных антител к полноразмерной БуХЭ плазмы крови человека

Мышиные моноклональные антитела ЗС6Б8,1АШ1,1В4Р4,1В4012,1А1Р7,4С608 и 1АШ11 к полноразмерной БуХЭ человека были получены стандартным методом гидбридомной техногии.

При гибридизации по Вестерну полученных антител с С-, N1- и Ш-полипептидами БуХЭ обнаружилось, что все семь антител взаимодействуют с С-концевым фрагментом рекомбинантного фермента (рис. 10). Анализ методом конкурентного ИФА подтвердил, что все антитела конкурируют друг с другом за связывание с С-концевым полипептидом (рис. 11), из чего следует, что иммунизация мышей полноразмерной БуХЭ плазмы крови человека стимулировало выработку антител к одну эпитопу. Таким образом, полученные моноклональные антитела не пригодны для анализа методом "сэндвич"-ИФА. Для преодоления возникшей проблемы были получены поликлональ-ные сыворотки кроликов с использованием в качестве антигенов рекомбинантных фрагментов БуХЭ N1 и N2.

.¿Г

і^

ш •т L______І - м в

□ □□□ иппп

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 -1од10(Разведенения)

Рис. 10. Гибридизация по Верстерну. Мышиные моноклональные антитела ЗС608, 1А1Р1, 1В4Р4, 1В4012, 1А1Р7, С-пептид ДС608 и 1АЮ11 к полноразмерной БуХЭ человека М-пептид гибридизовали с С-, N1-и М2-полипептидами БуХЭ

Ы2-пептид

■ ЗС608 'Эис- 11-Анализ взаимодействия монокло-1Д1Р1 нальных антител с полноразмерной БуХЭ

методом конкурентного ИФА:

■ 1В4Р4 На оси абсцисс указан обратный десятичный

■ 1В4Р12 логарифм разведения исследуемых антител

■ 1А1Р7 'стаРтовая концентрация 100 нг/мл|; концен-

трация биотинилированного антитела ЛС608

■ 4С608 оставалась неизменной и составляла 10 нг/мл. □ 1АЮ11 Проявку осуществляли конъюгатом стрептави-

дина с пероксидазой корней хрена

Создание системы детекции БуХЭ на основе ИФА

Очищенными препаратами N1- и ^-фрагментов БуХЭ иммунизировали кроликов. Анализ полученных сывороток методом ИФА показал одинаковый титр антител к обоим N-концевым фрагментам БуХЭ в сыворотках, однако с полноразмерной БуХЭ лучше связывались антитела к полипептиду N1. Несмотря на высокий уровень специфического взаимодействия антител с БуХЭ в непрямом ИФА, максимальный уровень сигнала в формате «сэндвич» ELISA не превышал 0.6 ОЕ. Было предположено, что частичная денатурация антигена увеличит доступность эпитопов и тем самым повы-

Табл. 1. Таблица очистки рекомбинантной БуХЭ из ростовой среды

Стадия выделения Общая активность БуХЭ', Выход, Общее количество БуХЭ", Удельная активность,

ед. акт. % мг ед. акт./мг

Ростовая среда 915 100 2,03 451

Концентрат среды 890 97 1,96 454

Элюат со стадии аффинной хроматографии 825 90 1.81 456

Элюат с гельфитрации [21-я мин) 650 71.5 1,41 461

Примечания: *по данным методики Эллман;

**по данным методики ИФА.

Табл. 2. Кинетические константы гидролиза бутирилтиохолин йодида рчБуХЭ в сравнении с БуХЭ плазмы крови человека

К„. к ,, Kss, Ь

мкМ с'1 мМ

рчБуХЭ 25±1 820±1G 250±30 2,4±0,2

БуХЭ плазмы крови* 23±2 665±30 140±20 2,5±0.1

* Duysen EG. Bartels CF, Lockridge О (20021 J Pharmacol Exp Ther 302:751-758.

рекомбинантной БуХЭ проводили в диапазоне концентраций субстрата 10 - 1000 мкМ при концентрации фермента 5 нМ. На основании этих данных были рассчитаны индивидуальные кинетические параметры реакции гидролиза. Сравнение кинетических констант рекомбинантной БуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что константы Ки одинаковы в пределах ошибки расчетов, а константы к2 лишь незначительно различаются, что по-видимому связано с различными способами определения концентрации активных центров изучаемых ферментов (табл.2). Также известно, что для бутирилхолинэстеразы, полученной из плазмы крови человека, характерна активация субстратом в реакциях с соединениями холинового ряда. Аналогичный эффект наблюдается и для гидролиза бутирилхолин йодида рекомбинантной БуХЭ при концентрациях субстрата выше 500 мкМ. Это позволило рассчитать константы Kss и параметр Ь. Для рекомбинантной БуХЭ параметр b отличался от литературного значения в пределах ошибки. Таким образом, можно сделать вывод, что полученная рекомбинантная БуХЭ функционально активна, а организация активного центра фермента идентична с природной БуХЭ (табл. 2).

Для определения фармакокинетических характеристик рекомбинантной БуХЭ были проведены испытания на мышах. Самцам мышей BALB/c весом 25-30 г внутривенно вводили препарат рчБуХЭ в количестве 100 ед. акт. на животное быстрой инъекцией в хвостовую вену. После введения препарата 10 мкл крови отбирали из глазного синуса в разные временные промежутки в течение пяти дней для определения остаточной активности рчБуХЭ. По полученным данным была построена фарма-кокинетическая кривая, по которой, исходя из двух-камерной фармакокинетической модели, были рассчитаны среднее время удержания (MRT), время полураспределения

(t'/2pacnp) и полувыведения (tl/2BblBea) (табл. 3). Полученные in vivo данные находятся в строгом соответствии с данными литературного источника. Тем не менее, препарат рекомбинантной БуХЭ, экспрессированной клоном АЗН9, продемонстрировал на порядок более низкие параметры по сравнению с БуХЭ плазмы крови человека (табл. 3); быстрое выведение препарата затрудняет его использование в качестве профилактического антидота против действия ФОТ.

Табл. 3. Сравнение полученных в работе фармакокинетических параметров рчБуХЭ с литературными данными

MRT, мин t"'p„np. мин

рчБуХЭ 220±50 4±1 180±30

рчБуХЭ ICH0I* 205±50 - Н<±36

чБуХЭ* 2791 - 1683

* Saxena A et al. 11998] Mol Pharmacol 53:112-122.

Оптимизация фармакокинетических параметров рчБуХЭ химическим полисиалированием

Исследования биологических антидотов на основе холинэстераз последние годы сосредоточены на получении рекомбинантных ферментов с улучшенными фармако-динамическими показателями. Пегилирование стало одним из наиболее популярных и хорошо изученных методов увеличения времени полувыведения из крови как рекомбинантной, так и нативной БуХЭ плазмы крови человека. Тем не менее, ряд исследователей отмечают, что пегилирование не влияет на иммуногенность рекомбинантного фермента; это приводит к падению фармакодинамических параметров при повторных введениях рекомбинантного фермента. В качестве альтернативы была предложена модификация полисиаловыми кислотами. В отличие полимеров этиленгликоля, гетеро- и гомополимеры Ы-ацетилнейраминовой кислоты являются биодеградируемыми молекулами, не накапливаются в организме и не являются токсичными. В организме человека не обнаружено специальных рецепторов распознающих полисиаловые кислоты. Модификация полисиаловыми кислотами позволит снизить риск возможных побочных действий рекомбинантного препарата БуХЭ, тем самым лучше вписываясь в концепцию биологического антидота. Препаративное выделение рчБуХЭ из ростовой среды

Для проведения химической модификации рчБуХЭ была очищена из ростовой среды. Разработанный протокол очистки был адаптирован для препаративных количеств белка и включал стадии ультрафильтрации, концентрирования, аффинной очистки и ионообменной хроматографии. В результате было наработано 35,8 мг рекомбинатного фермента. По данным электрофоретической оценки, конечный выход белка составил около 80% с чистотой 95% (рис. 13).

Так как С-концевой фрагмент чБуХЭ, отвечающий за тетрамеризацию фермента, наиболее уязвим для действия протеаз, деградация этого участка может привести к

-f" DX-o T

OH NH 2) NaBH3CN OH ^NH

♦ HjN—BC(lE-^ HO

3) 6уХЭ:САО '

4) Время. чн00с' 5| pH

Рис. 15. Схема реакции химического полисиалирования рсБуХЭ (А] и поэтапный подбор оптимальных условий реакции химического полисиалирования. Остаточная активность и выход реакции изображены сетчатой и цветной плоскостями соответственно (Б-Е]

Healthcare, США). В результате было получено 16 мг рчБуХЭ, модифицированной по-лисиаловыми кислотами, со средней молекулярной массой 27 кДа (рчБуХЭ-СА027). Характеристики препарата рчБуХЭ-СА027

Полученный конъюгат рчБуХЭ-СА027 был подвергнут всестороннему анализу. Данные электрофоретического анализа (рис. 16), свидетельствуют о изменении молекулярной массы комплекса минимум на 20 кДа. При электрофоретическом разделении продуктов реакции химического сиалирования рчБуХЭ на 10%-ном ПААГ наблюдалось появление диффузной полосы с молекулярной массой более 82 кДа (рис. 16, 2), что также свительствует о прохождении реакции.

Табл. U. Выявленные с помощью масс-спектрометрического анализа пептиды с вероятной модификацией остатком N-ацетил нейраминовой кислоты [СА] в результате химического сиалирования

m/z г Мол. ДМасс, Пептид Позиция Модификации

Масса,

_Да ррт_

1674,773 и 1674,773 -2,5 KPQSLTK 45- -51 ЗхСА

1226,992 5* 6130,929 3.0 RDNYTKAEEILSRSIVKRWANFAKyGNPNETQNNST-SWPVFKSTEQK 453- -499 2хСА;Оксиление

1112,557 3* 3335,655 3.0 DNYTKAEEILSRSIVKRWANFAK 454- -476 2хСА; Метилирование

1434,007 3+ 4300,007 -1.6 LRAQQCRFWTSFFPKVLEMTGNIDEAEWEWK 514- -544 CA;2хМетилирование

1329,562 3* 3986,671 -1,7 AGFHRWNNYMMDWKNQFNDYTSKK 545- -568 ЗхСА

1182,478 3+ 3545,421 4,5 WNNYMMDWKNQFNDYTSKKESCVGL 550 -574 CA; Фосфорилирование

Табл. 5. Кинетические константы гидролиза рчБуХЭ и рчБуХЭ-СА027 бутирилтиохолин йодида в сравнении с БуХЭ плазмы крови человека

к„, kat. kss, ь

мкМ с"1 мМ

рчБуХЭ 25±1 820±10 250±30 2,4±0,2

рчБуХЗ-СА027 28±2 830±10 230±20 2,2±0,2

БуХЭ плазмы крови* 23±2 665±30 140±20 2,5±0.1

* Duysen EG, Bartels CF, Lockridge 0 I2002] J Pharmacol Exp Ther302:751-758.

Табл. 6. Фармакокинетические параметры рчБуХЭ и рчБуХЭ-СА027 в сравнении с БуХЭ плазмы крови человека

MRT, „р.. мин мин

рчБуХЭ 220±50 4±1 180±30

рчБуХЭ CHO* 1400±200 21±13 1000±140

чБуХЭ* 2791 - 1683

* Saxena A et al. (1998I Mol Pharmacol 53:112-122.

Время, мин

Рис. 18. Фармакодинамические кривые выведения из крови препаратов рчБуХЭ и рчБуХЭ-СА027

Исследование защитной эффективности модифицированной рчБуХЭ

Для определения защитной эффективности конъюгата рчБуХЭ-СА027 на первом этапе эксперимента были определены бимолекулярные константы ингибирования модифицированного и немодифицированного фермента агентом VR (рис. 19). Полученные данные (табл. 7) свидетельствуют о способности чБуХЭ и рчБуХЭ эффективно связывать агент VR, а также о том, что химическое полисиалирование не влияет на способность рчБуХЭ связывать данный ФОТ.

Способность рчБуХЭ эффективно связывать агент VR стало основанием для проведения эксперимента на животных. Мышам внутривенно вводили препараты рчБуХЭ-СА027 и чБуХЭ в количестве 21 мг/кг быстрой инъекцией в хвостовую вену; через 30 мин после введения антидота внутримышечно вводили водный раствор агента VR в объеме 50-100 мкл инъекцией в большую ягодничную мышцу. Дозу агента VR варьировали от летальной (ЛД100) до нелетальной для точного определения ЛД50. Животных наблюдали в течение пяти дней, падеж считали через 30 минут после введения агента VR.

Полученные данные были обработаны методом пробит-анализа по методике Девида Финни (David Finney). В результате удалось рассчитать величины защитных индексов для двух препаратов (табл. 8): для дозы 21 мг/кг рчБуХЭ-СА027 и чБуХЭ величина защитного индекса составила 4,2 и 4,7 соответственно.

Для контроля скрытых побочных эффектов препаратов рчБуХЭ-СА027 и чБуХЭ на протяжении всего эксперимента животные наблюдались в серии тестов «Открытое поле» и проходили испытание на физическую выносливость на тредбане. Результаты наблюдений представлены на рис. 20. Видно, что в течении первых трех часов после отравления агентом VR наблюдался значительный спад в активности испытуемых животных во всех группах, вероятно вследствие переживаемого стресса, однако спустя сутки все животные восстанавливали свои поведенческие показатели. Это позволяет сделать следующие выводы:

1. Внутривенное введение препаратов рекомбинантной и нативной БуХЭ плазмы крови человека не вызывает видимых отклонений в поведении испытуемых животных. Эти данные соответствуют литературным источникам.

2. Полное восстановление испытуемых животных через сутки после отравления агентом VR свидетельствует о том, что весь ФОТ был связан препаратами БуХЭ до того, как достиг своей биологической цели.

Таким образом было доказано, что препарат рекомбинантной БуХЭ плазмы крови человека, модифицированный полимерами N-ацетилнейраминой кислоты при внутривенном введении в дозировке 21 мг/кг живого веса обеспечивает профилактическую защиту от действия 4,2 ЛД50 агента VR, не вызывая побочных последствий. Полученный конъюгат рчБуХЭ-СА027 полностью удовлетворяет основным требованиям к биологическому антидоту.

Табл. 7. Бимолекулярные константы ингибирования рчБуХЭ и рчБуХЭ-СА027 агентом в сравнении с БуХЭ плазмы крови человека

Мин"1 С"1

рчБуХЭ |8,5±0,8Ы05

СНз рчБуХЭ-СА027 (10±1]-10=

Рис.19. Структурная формула агента УРЗ БуХЭ плазмы

крови человека

(7.2±0,71-10=

Табл. 8. Защитная эффективность рчБуХЭ-СА027 и чБуХЭ простив действия агента УР

ЛД50х10>,

_мг/<г_ Защитный индекс,

95% доверительный интервал ЛД^ЗащищенньеулД^Контрольиые!

Среднее Верхний предел Нижний предел

рчБуХЗ-СА027 (п=20) 79 69 90 4,2

чБуХЭ |п=24) 89 80 100 4,7

Контроль |п«61] 19 18 20

I-рчБуХЭ-СА027

| СЧБуХЭ

Т I Медиана и ИКР I I тестовой группы ИКР контрольной группы

Рис. 20. Результаты наблюдений за животными, защищенными от действия агента \/Р? препаратами рчБуХЭ-СА027 и чБуХЭ, в тестах «Открытое поле» (А-В) и испытании на физическую выносливость на третбане (Г):

Животных наблюдали до начала эксперимента за сутки до введения препаратов белков И), в момент введения 12] и после отравления агентом УР (3). Медианное значение контрольной группы во всех экспреиментах- 100%

III. выводы

1. Разработана эффективная система экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэ-стеразы человека в клетках линии СНО, позволяющая получать до 30 мг/л активного фермента в олигомерной форме.

2. Полученный рекомбинантный фермент обладает сравнимыми структурно-функциональными характеристиками с препаратом бутирилхолинэстеразы плазмы крови человека.

3. Впервые успешно осуществлено химическое полисиалирование гидролитического фермента. Подобраны условия реакции, позволяющие получать конъюгат рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека с полисиаловыми кислотами с 80%-ным выходом. Показано, что данная модификация не изменяет кинетические характеристики фермента, что свидетельствует об интактности его активного центра.

4. Применение химического полисиалирования существенно улучшило фармакоки-нетические параметры рекомбинантного фермента, увеличив время полувыведения модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека в 5,5 раз.

5. Полисиалированный препарат показал высокую эффективность в качестве профилактического биологического антидота. Защитный индекс по веществу УЯ составил 4,2 ЛД50, что сопоставимо с бутирилхолинэстеразой плазмы крови человека.

IV. СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Denis G. Ilvushin. Ivan V. Smirnov, Alexey A. Belogurov Jr., Igor A. Dyachenko, Tatiana Iu. Zharmukhamedovad, Tatjana I. Novozhilova, Eugene A. Bychikhin, Marina V. Serebryakova, Oleg N. Kharybin, Arkadii N. Murashev, Konstantin A. Anikienko, Eugene N. Nikolaev, Natalia A. Ponomarenko, Dmitry D. Genkin, G. Michael Blackburn, Patrick Masson, Alexander G. Gabibov (2013) Chemical polysialylation of human recombinant butyrylcholinesterase delivers a long-acting bioscavenger for nerve agents in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 110(4): 1243-8.

2. Д. Г. Илюшин. О. M. Эртле, Т. В. Бобик, О. Г. Шамборант, Е. А. Сурина, В. Д. Кнорре, P. Masson, И. В. Смирнов, А. Г. Габибов, Н. А. Пономаренко (2013). Рекомбинантная бутирилхолинэстераза человека как биологический антидот нового поколения: разработка эукариотической системы экспрессии // Acta Naturae, том 5, № 1(16), С. 76-87

3. Ilvushin DG. Smirnov IV, Masson Patrick, Dyachenko IA, Novojilova TI, Bychihin EA, Anikienko KA, Myrashev AN, Ponomarenko NA, Gabibov AG. Sialylation as a novel approach of long-live recombinant human butyrylcholinesterase obtaining. // Материалы конференции Международная научная конференция «The 11th Meeting on Cholinesterases». Казань, 4-9 июля, 2012 г.

4. Д.Г.Илюшин. И.В.Смирнов, Masson Patrick, И.А.Дьяченко, Т.И.Новожилова, Е.А.Бычихин, К.А.Аникиенко, А.Н.Мурашев, Н.А.Пономаренко, А.Г.Габибов. Рекомбинантная бутирилхолинэстераза человека как биологический антидот нового поколения // Материалы конференции "XXIV зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»", Москва, 7-9 февраля 2012

5. Ilvushin DG. Smirnov IV, Masson Patrick, Dyachenko IA, Novojilova TI, Bychihin EA, Anikienko KA, Myrashev AN, Ponomarenko NA, Gabibov AG. The new approach in creating long-live recombinant human butyrylcholinesterase: sialilation // Материалы Pyc-ско-французкой конференци «Химия в молекулярной биологии», 16-19 декабря 2011 г.

6. Илюшин Д.Г.. Дурова О.М., Пономаренко Н.А., Габибов А.Г., Masson Р.. Сравнительная характеристика систем экспрессии человеческой бутирилхолинэстеразы, основанных на культуре клеток животных // Материалы конференции "XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»". Москва, 11-15 февраля 2008 г.

Отпечатано в ООО «Репаблика». Заказ КЕ01478 от 26.03.2013. Тираж: 100 экз. Усл. п.л. 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Илюшин, Денис Григорьевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (ИБХ РАН)

04201356191

На правах рукописи

ИЛЮШИН Денис Григорьевич

Исследование функциональной активности химически модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека in vitro и in vivo

03.01.03 - Молекулярная биология

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Доктор биологических наук Пономаренко Наталья Александровна;

Кандидат химических наук Смирнов Иван Витальевич

Москва 2013

Оглавление

Введение 3

Список сокращений 6

Обзор литературы 7

Терапия и профилактика отравлений ФОТ 8

Биологический антидоты как средство профилактики и терапии 14 отравлений ФОТ

Бутирилхолинэстераза человека 23

Биотехнологическое получение рекомбинантной бутирилхолинэстеразы 31 человека

Материалы и методы 39

Реактивы и материалы 39

Бактериальные штаммы 40

Клеточные линии 40

Растворы и бактериальные среды 40

Антибиотики 41

Методы работы с нуклеиновыми кислотами 41

Методы работы с бактериями Escherichia coli 45

Методы работы с эукариотическими клетками линии СНО 46

Методы работы с белками 49

Методы работы с животными 56

Результаты и обсуждение 58

Создание эукариотической системы экспрессии человеческой 58 бутирилхолинэстразы

Разработка системы детекции и оценки продукции рекомбинантного белка 69

Характеристики рекомбинантной БуХЭ 74

Оптимизация фармакокинетических параметров рчБуХЭ химическим 77 полисиалированием in vitro

Исследование защитной эффективности модифицированной рчБуХЭ in vivo 87

Выводы 90

Список литературы 91

Приложения 103

Введение

Цель работы состояла в создании эффективной системы экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы (БуХЭ) человека и исследовании функциональной активности полученного фермента в экспериментах in vitro и in vivo. Для ее достижения были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. создание эффективной эукариотической системы экспрессии функционально активной БуХЭ человека;

2. изучение физико-химических свойств рекомбинантной БуХЭ человека;

3. оптимизация фармакокинетических характеристик рекомбинантного фермента;

4. определение эффективности полученного препарата рекомбинантной БуХЭ для профилактики отравлений ФОТ.

Клетки линии СНО были выбраны в качестве наиболее сбалансированным решения проблемы экспрессии рекомбинантной БуХЭ. Ген БуХЭ был клонирован под контроль промотора фактора элонгации полипептидной цепи (EF-al). После проведения стабильной трансфекции и оптимизации условий продукции на специализированных безбелковых ростовых средах удалось получить клон A3 продуцирующий до 30 мг рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека (рчБуХЭ) на литр ростовой среды, что как минимум на порядок выше, чем в ранее разработанных системах. Для изменение олигомерного состава рекомбинантного фермента клон A3 был трансфицирован фрагментом ДНК, несущим ген обогащенного остатками пролина пептида PRAD под контролем промотора EF-al. В результате отбора был получен стабильный клеточный клон АЗН9, продуцирующий БуХЭ в основном форме димера и тетрамера. Опыты на мышах линии BALB/c рчБуХЭ показали, что фармакокинетические параметры смеси олигомеров рчБуХЭ не позволяет эффективно использовать рекомбинантный фермент для профилактики отравлений ФОТ.

Для радикального увеличения времени полувыведение препарата рчБуХЭ из крови была предложена химическая модификация гомополимеры N-ацетилнейраминовой кислоты - сиалирование. В отличие по полимеров

3

этиленгликоля, широко применяемых для модификаций рекомбинантных белков, гетеро- и гомополимеры сиаловой кислоты являются биодеградируемыми молекулами, не являются токсичными и не накапливаются в тканях и внутренних органах. Таким образом, модификация полисиаловыми кислотами позволяет снизить риск возможных побочных действий рчБуХЭ, тем самым лучше вписываясь в концепцию биологического антидота. Применение комбинаторного подхода позволило определить оптимальные условия реакции химического полисилирования рчБуХЭ, при которых удалось добиться не менее 80% выхода реакции при относительно не высокой (не более 10%) потере удельной активности рекомбинантного фермента.

Полученные конъюгат рчБуХЭ с гомополимерами сиаловой кислоты (рчБуХЭ-СА027) был подвергнут всестороннему анализу in vitro и in vivo. Установлено, что химическая модификация полисиалированием не влияет на олигомеризацию рчБуХЭ. Масс-пекрометрическое исследование конъюгата рчБуХЭ-СА027 позволило выявить по меньшей мере 6 потенциальных сайтов модификации рекомбинантного фермента. Сравнение кинетических констант гидролиза (Хм, ксat, Kss и Ъ) бутирилтиохолин иодида модифицированной и не модифицированной рекомбинантной рчБуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что полученные значения отличались от известных из литературы в пределах ошибки, что свидетельствует об интактности активного центра фермента и его окружения. Фармакокинетические испытания in vivo на мышах линии BALB/c свидетельствуют о том, что в результате химического полисиалирования время полувыведения конъюгата рчБуХЭ-СА027 возросло в 6 раз по сравнению с немодифицированной рчБуХЭ и стало сопоставимо со временем полувыведения препарата нативной БуХЭ плазмы крови человека. Таким образом впервые химическое полисиалирование было успешно применено для модификации сложного глобулярного фермента.

Способность рчБуХЭ и рчБуХЭ-СА027 эффективно связывать агент VR in vitro стало основанием для проведения эксперимента на животных. В результате испытания in vivo на беспородных мышах доказано, что препарат рекомбинантной БуХЭ плазмы крови человека, модифицированный полимерами N-ацетилнейраминой кислоты при внутривенном введении в дозировке 21 мг/кг живого веса обеспечивает профилактическую защиту от действия 4.2 ЛД50 агента

VII, не вызывая долгосрочных изменений в поведенческой активности и физической выносливости подопытных животных.

Таким образом, настоящая работа описывает метод получения конъюгата рекомбинантной бутирилхолинэстеразы плазмы крови человека с гомополимерами Ы-ацетил нейраминовой кислоты, полностью удовлетворяющего современным основным требованиям к биологическому антидоту.

Список сокращений

АцХЭ - ацетилхолинэстераза БуХЭ - бутирилхолинэстераза рмБуХЭ - рекомбинантная бутирилхолинэстераза мыши рчБуХЭ - рекомбинантная бутирилхолинэстераза человека чБуХЭ - бутирилхолинэстераза человека

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

кДа - тысяча Дальтон

п.о. - пар оснований

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

т.п.о. - тысяч пар оснований

ТАЕ - Трис-ацетатный буфер

TBE - Трис-боратный буфер

ФОС - фосфоорганические

соединения

ФОТ - фосфоорганические токсины ЭФ - электрофоретическое разделение

BSA - бычий сывороточный альбумин ВТС - бутирилтиохолин иодид CAO - окисленные полисиаловые пислоты (Colominic oxidized acids) CIAP - щелочная фосфатаза кишечника телёнка (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) CMV - цитомегаловирус DMEM - Среда Игла в модификации

Дульбекко (Dulbecco's modified Eagle's medium)

DNTB - динитротиобензойная

кислота

dNTP-

дезоксирибонуклеозидтрифосфат EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

EF - фактор элонгации пептидной цепи al

FDA - Управление по контролю

качества пищевых и лекарственных

препаратов США (Food and Drug

Administration)

Gal - галактоза

Ig - иммуноглобулин

mQ - вода особой чистоты из

установки "Milli-Q" (Millipore, США)

MRT - среднее время удержания

NeuAc - N-ацетил нейраминовая/

сиаловая кислота

PBS - фосфатно-солевой раствор

PRAD - обогащенный пролином

пептид, (proline-rich attachment domen)

PRiMA - обогащенный пролином

мембранный якоро (proline-rich

membrane anchor)

RSV - промотер вируса папилломы

человека

Tris-

трис(гидроксиметил)аминометан

Обзор литературы

В конце 1930 г. в качестве инсектицидов был синтезирован ряд фосфоорганических токсинов (ФОТ). Высокая токсичность этих веществ сразу привлекла внимание военных. Хотя такие ФОТ как табун, зарин или зоман, так и не нашли широкого применения в период Второй мировой войны, большие количества этих токсинов до сих пор хранятся на военных складах многих стран [1]. Доступность ряда ФОТ в качестве пестицидов в странах с развивающейся аграрной отраслью экономики приводит к частым случаям отравлений и летальных интоксикаций [2]. По данным Всемирной организации здравоохранения бытовое летальное отравление ФОТ получает более 300 ООО человек в год [3].

Несмотря на то, что 185 государств в 1992 присоединились к Конвенции «О запрещении химического оружия», сохраняется угроза использования нервно-паралитических агентов и других ФОТ в ходе военных действий и террористических актов. Известно несколько документированных случаев применения ФОТ в качестве боевых-отравляющих веществ: военные конфликты между Ираком и Ираном, агрессия Ирана против курдов [4], террористические акты секты Aum Shinrikyo в японских городах Матсумото и Токио [5].

За последние 60 лет исследований методы медикаментозного лечения отравлений фосфорорганическими токсинами активно развивались. Тем не менее, они все еще несовершенны, так как позволяют избежать смерти, но не потери трудоспособности и необратимых поражений головного мозга. Альтернативным подходом в терапии и профилактике отравлений ФОТ является использование биологических антидотов [6]. Ими могут быть антитела, разнообразные функциональные циклодекстрины и ферменты, которые изолируют и инактивируют высокотоксичные соединения до того как те достигнут своей биологической мишени [7]. Из всех антидотов против ФОТ только бутирилхолинэстераза плазмы крови человека получила статус «New development drug» от Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) в 2006 г.

Терапия и профилактика отравлений ФОТ

История открытия и применения ФОТ

Класс фосфорорганических соединений очень многообразен. Среди множества этих соединений можно выделить подгруппу веществ, называемых фосфорорганическими токсинами (ФОТ), селективно действующих на холинэстеразы различных организмов. Общим для этих соединений является наличие ассиметричного атома фосфора. ФОТ можно разделить на такие подгруппы как инсектициды (рис. 1. А-В), нервно-паралитические агенты типа «в» (рис. 1. Г—И) и нервно-паралитические агенты типа «V» (рис. 1. К-О).

ск ^сн3

О і чоґ о

СІ /

НзС

Б

Н3С'

в II

о

Н3С

в

Н3С.

і т

,СН3

Н3С

чСНз

НзС Н I Н3С/ |Т|

СН3

СН3

Рис. 1. Структурные формулы некоторых фосфорорганических соединений:

Пестициды широкого спектра действия, токсичные для человека: А - дихлофос, 6 - тиофос, В -карбофос; Нервно-паралитические агенты типа «Є»: Г -ЄА, табун, Д -ЄВ, зарин, Е -ЄР, зоман, Ж -Ор цикпозарин, 3 - Нервно-паралитические агенты типа «V»: И - ЕА-3148, К - УЕ, Л - М - УМ, Н -УИ и О - УХ.

История ФОТ начинается в 1936 г. в Германии в лаборатории доктора Геральда Шрадера (Gerhald Schräder), где впервые был синтезировано вещество, названное впоследствии табун (рис. 1. Г). В опытах доктора Шрадера табун зарекомендовал себя в качестве эффективного инсектицида, однако довольно скоро обнаружилась его высокая токсичность для человека. Это вещество стало первым соединением, относящимся к нервно-паралитическим агентам в целом и к нервно-паралитическим агентам типа «G». [8]. Так как по законам Германии было необходимо информировать государство о вновь открытых соединениях, которые возможно применять в военных целях, о токсичном свойстве табуна быстро стало известно в вооруженных силах Германии [9]. Доктор Шрадер и его коллеги продолжили свои исследования и вскоре обнаружили еще более токсичное вещество, названное зарином, в честь его создателей [10].

Как и доктор Швадер, британский химик Ранажит Гош (Ranajit Ghosh) занимался поиском новых инсектицидов. В начале 1950-х гг. ему удалось синтезировать ряд веществ, токсичность которых была признана избыточной для использования в качестве инсектицидов [10]. Эти вещества, теперь известные как нервно-паралитические агенты типа «V», в целом являются более токсичными, чем G-агенты [11].

Высокая токсичность и трагический опыт применения этих и других аналогичных веществ в ходе вооруженных конфликтов стало причиной подписания в 1992 году конвенции «О запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожении». Согласно этой конвенции, крайним сроком разоружения являлся апрель 2012 г., однако в 2010 г. многие страны-участницы соглашения еще не уничтожили от 10 до 100% своих запасов ФОТ. Кроме того ФОТ до сих пор распространены в качестве инсектицидов. По данным Всемирной организации здравоохранения в Шри-Ланке отравления ФОТ составляют до 70% случаев бытовых несчастных случаев с летальным исходом, в Китае в период с 1998 по 2000 г. - 62%, в Индии в 1999 г. - 30%.

Механизм действия ФОТ

Высокая токсичность ФОТ обусловлена способностью этих веществ

эффективно связываться с ацетилхолинэстеразой в нервно-мышечных синапсах,

необратимо разрывая нервно-мышечную передачу. На схеме, представленной на рис. 2.

отображены современные представления о процессах, происходящих в неврно-

мышечных синапсах. При деполяризации синоптической терминали аксона

9

мотонейрона открываются потенциал-чувствительные кальциевые каналы. Ионы кальция запускают механизм слияния синаптических пузырьков с мембраной, вследствие чего ацетилхолин выходит в синаптическую щель и связывается с белками-рецепторами постсинаптической мембраны. Рецептор ацетилхолина включает 5 белковых субъединиц (а1, а1, Р1, у, 8), формирующих натриевый канал. Связывание двух молекул ацетилхолина с двумя а1 субъединицами рецептора приводит к открыванию канала. В следствие этого изменяется мембранный потенциал мышечной клетки, что, в свою очередь, запускает каскад событий, приводящих к мышечному сокращению [12].

Медиатор действует в течение очень короткого времени благодаря действию ацетилхолинэстеразы (АцХЭ, ЕС 3.1.1.7). АцХЭ катализирует гидролиз ацетилхолина, освобождая рецептор ацетилхолина для нового связывания с нейромедиатором [13].

ацетилхолин

терминаль мотонейрона

ацетил-СоА

а цетил холинтра нсфера за

СоА

-ацетилхолин

Ь < ■

синаптическая щель

ацетилхолиновыи рецептор

- холин

переносчик холина

ацетилхолинэстеразэ

холин

\

У

ацетат

постсинаптическая мембрана

Рис. 2. Схематическое изображение событий в нервно-мышечном синапсе

ФОТ - необратимые ингибиторы АцХЭ [14], высокие дозы ФОТ приводят к коллапсу холинергических синапсов, вызывая мышечные судороги и остановку дыхания. Помимо АцХЭ, мишенями ФОТ являются бутирилхолинэстераза (БуХЭ, ЕС 3.1.1.8), карбоксиэстеразы, другие сериновые гидролазы, а также трипсин и химотрипсин, и другие близкие по структуре ферменты [15].

Современная медикаментозная терапия отравлений ФОТ

Одновременно с появлением ФОТ шла разработка их антидотов. Одними из первых нашли свое применение антимускариновые и противосудорожные препараты, такие как атропин (рис. 3. А) и диазипам, более известный как валиум (рис. 3. Б). Принцип действия этих препаратов как антидотов основан на конкурировании с ФОТ за связывание с активным центром АцХЭ [16]. По сути являясь ядами, эти медицинские препараты требуют высоких дозировок для достижения терапевтического эффекта и вызывают целый ряд осложнений, начиная с дисфункции гладкомышечной мускулатуры и заканчивая галлюцинациями [17]. Тем не менее, атропин, согласно Всемирной организации здравоохранения, входит в список обязательных препаратов для больниц и полевых госпиталей. Применение атропина на модельных животных совместно с миорелаксантами, такими как скополамин и мидазолан, позволило существенно снизить количество мышечных судорог, вызванных действием высоких

Рис. 3. Структурные формулы атропина (А) и диазипама (Б)

Основным профилактическим средством против интоксикаций ФОТ является пиридостигмина бромид (рис. 4). Этот медицинский препарат является обратимым ингибитором АцХЭ. Препарат был одобрен FDA в качестве первого средства индивидуальной профилактики при отравлениях зоманом в боевых условиях. Однако применение этого препарата вызывает ряд побочных действий, в их числе рвота,

доз GA, GD и VR [18].

А

О

диарея, брахикардия, мышечная дисфункция, которые наблюдались у многих американских солдат, участвовавших в конфликте в Персидском заливе в период 1990— 1991гг. [19-21].

Рисунок 4. Структурная формула пиридостигмина бромида

К реактиваторам АцХЭ относятся оксимы, такие как обидоксим и препараты 2-РАМ, HI-6, ТМВ-4 [22]. Оксимы - органические соединения, включающие в себя одну или несколько изонитрозогрупп. Принцип их действия состоит в высвобождении органофосфатов из соединений с АцХЭ, и обеспечивает нормальный метаболизм ацетилхолина [23]. На сего