Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование факторов, определяющих избирательное влияние производного 6-метилурацила на активность ацетилхолинэстеразы в органах и тканях Rattus norvegicus

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование факторов, определяющих избирательное влияние производного 6-метилурацила на активность ацетилхолинэстеразы в органах и тканях Rattus norvegicus"

На правах рукописи

005020591

Ланпик Наталья Ивановна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНОГО 6-МЕТИЛУРАЦИЛА НА АКТИВНОСТЬ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ЛАТТиБ

А'ОШЕ&СиБ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 дпр 2012

Казань -2012

005020591

Работа выполнена на кафедре генетики биолого-почвенного факультета ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент - Ризванов Альберт Анатольевич Официальные оппоненты:

Багаева Татьяна Вадимовна - доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой физиологии и биотехнологии растений Казанского (Приволжского) федерального университета, Казань;

Зайцев Сергей Юрьевич - доктор химических наук, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой органической и биологической химии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, Москва

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха, РАН, Москва

Защита состоится «26» апреля 2012 г. в 13-00 на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

Факс 8(843) 238-71-21, 233-78-40. E-mail: natalya.lannik@gmail.com

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета по адресу: Казань, ул. Кремлевская, д. 35.

Автореферат разослан «Л » марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Абрамова З.И.

Актуальность. Ацетилхолинэстераза (ацетилхолин-ацетилгидролаза, АХЭ, К.Ф. 3,1,1,7) - фермент семейства сериновых гидролаз, играющий ключевую роль при передаче возбуждения в центральной и периферической нервной системе. Известно, что АХЭ играет важную роль в патогенезе таких заболеваний как болезнь Альцгеймера, черепно-мозговые травмы, сосудисто-мозговые патологии, миастения Гравис и т.д (Jeffrey & Cummings, 2000; Jones et al., 2011; Shakil et al., 2011). Эти заболевания сопровождаются гибелью нейронов, дегенерацией аксонов, нарушением коммуникаций в нейронных сетях и контролируемых ими функций. Известно, что одним из основных принятых методов терапии является применение антихолинэстеразных (анти-ХЭ) препаратов. В настоящее время имеется большой выбор препаратов с анти-ХЭ действием. Однако, большинство из них характеризуются недостатками, наиболее важным из которых является неселективность действия применяемых препаратов по отношению к подвергающимся действию (препарата) органов, в том числе - не требующих коррекции. Неселективность действия известных препаратов приводит к развитию широкого спектра тяжелых побочных явлений и является причиной частых патологических или смертельных исходов (Сосюкин и др., 2005; Lester et al., 2010).

Особую актуальность и значимость приобретает поиск и определение механизма действия новых высокоселективных, тканеспецифичных ингибиторов АХЭ. В лаборатории химико-биологических исследований Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова (ИОФХ) были синтезированы производные урацила, классифицированные как новый класс необратимых и высокоселективных ингибиторов АХЭ (Резник и др., 1998; Аникиенко и др., 2001). К этому классу соединений относится и исследуемый нами ингибитор С-547 (далее по тексту С-547), проявляющий избирательность действия по отношению к АХЭ разных органов и тканей (Аникиенко и др., 2001; Petrov et al., 2006, 2009). Однако в литературе отсутствуют данные о механизмах действия С-547, приводящих к избирательному ингибированшо АХЭ, что необходимо для оптимизации процессов синтеза новых высокоселективных анти-АХЭ препаратов на основе 6-метилурацила.

На основании вышеизложенного, целью настоящей работы явилось выявление основных факторов, определяющих избирательное влияние ингибитора С-547 на активность ацетилхолинэстеразы в разных тканях и органах Rattus norvegicus.

В соответствии с поставленной целью требовалось решение следующих задач:

1. Определить нуклеотидную последовательность 5' и 3' участков гена ацетилхолинэстеразы (ache) R. norvegicus и построить модель его интронно-экзонной структуры;

2. Выявить различия в экспрессии мРНК изоформ гена ацетилхолинэстеразы (ache) в органах и тканях R. norvegicus;

3. Установить различия в экспрессии мРНК гена бутирилхолинэстеразы (bche) в органах и тканях R. norvegicus;

4. Провести сравнительную оценку влияния ингибитора С-547 на активность различных форм ацетилхолинэстеразы, отличающихся по степени гликозилирования и наличию якорных субъединиц (коллаген Q и богатый пролином мембраносвязанный белок - PRiMA).

Научная новизпа. Впервые определена нуклеотидная последовательность 5' и 3' недостающих участков гена ache R. norvegicus и на ее основе построена интронно-экзонная структура гена. Данные депонированы в международную базу данных GeneBank (GQ338831 и GQ338832). Впервые разработаны праймеры для ПЦР в режиме реального времени по технологии TaqMan, позволяющие оценить уровень экспрессии мРНК изоформ гена ache в разных органах и тканях организма. Впервые разработаны вектора экспрессии для гена ache R. norvegicus, содержащие нуклеотидные замены в сайтах гликозилирования.

Научно-практическая значимость работы. Данные об интрон-экзонной структуре гена ache R. norvegicus имеют важное теоретическое и практическое значение, позволяют провести сравнительный анализ в строении гена ache разных видов животных, исследовать процессы альтернативного сплайсинга, выяснить взаимосвязи между регуляторными последовательностями гена и различными внешними и внутренними факторами, их влияние на избирательную экспрессию гена ache в разных органах и тканях. Практическая значимость заключается в разработке специфических праймеров и гибридизационных зондов для оценки экспрессии изоформ АХЭ, амплификации фрагментов гена, создании плазмидных и вирусных векторов, несущих ген ache. Полученные нами данные об уровне экспрессии мРНК АХЭ органов и тканей R. norvegicus расширяют представление о разнообразии изоформ фермента в синапсах, что необходимо при разработке и установлении механизмов действия новых лекарственных препаратов-ингибиторов АХЭ. Данные об уровне экспрессии мРНК гена bche необходимы при исследовании ее компенсаторной роли в различных органах и тканях и роли при различных патологических процессах. Созданные генетические конструкции для

экспрессии гена ache, содержащего нуклеотидные замены в сайтах гликозилирования в различных комбинациях, позволяют оценить влияние гликанов на биологическую активность АХЭ, транспорт к клеточной мембране, стабилизацию функциональной конформации, на функционирование головного мозга в норме и патологии (например, при болезни Альцгеймера), а также в исследовании других заболеваний, в патогенезе которых принимает участие АХЭ. Результаты исследований будут полезны для практического применения при разработке новых лекарственных препаратов селективного действия, свободных от недостатков ныне применяемых препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Структура гена ацетилхолинэстеразы (ache) Rattus norvégiens гомологична структуре гена ацетилхолинэстеразы (ache) Mus museulus;

2. Уровень экспрессии мРНК гена бутнрилхолинэстеразы (behe) в поперечно-полосатой мускулатуре задних конечностей Rattus norvégiens ниже, чем в тканях сердца, головного мозга и диафрагмы;

3. Различная степень гликозилирования ацетилхолинэстеразы и образование гетероолигомеров в комплексе с якорными белками (коллаген Q и богатый пролином мембраносвязанный белок - PRiMA) не влияет на степень ннгибирования АХЭ производным 6-метилурацила (С-547).

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена при поддержке грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований (07-04-12097 офи-м), Правительства Республики Татарстан по подготовке и переподготовке кадров в зарубежных научных центрах и «Пятьдесят лучших инновационных идей для Республики Татарстан» в номинации Молодежный инновационный проект «МИП» (Государственный контракт № р/14180). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2008, 2009); конкурсе «50 лучших инновационных идей для Республики Татарстан» (Казань, 2010); конкурсе «У.М.Н.И.К»-2010; научной конференции, посвященной 35-летию кафедры генетики КФУ «Современные проблемы генетики» (Казань, 2011); ежегодных научных отчетных конференциях сотрудников КФУ (Казань, 2010, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 статьи в центральных отечественных и зарубежных

рецензируемых журналах: Ученые записки Казанского университета, секция естественные науки и British Journal of Pharmacology.

Место выполнення работы Казанский (Приволжский) федеральный университет.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит то введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и И таблиц. Библиография содержит 190 наименований, в том числе 177 - зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали штамм Escherichia coli XLl-Blue (recAl end Al gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac [F' proABqrlacIZ ДМ15 TnlO (Tetr)]), крыс породы Wistar и клетки эмбриональной почечной линии 293Т человека (НЕК 293Т, коллекция АТСС CRL-11268).

Выделение нуклеиновых кислот. Для выделения геномной ДНК использовали набор EZ-10 Spin Column Genomic DNA Kit, Animal Samples (Bio Basic Inc.). Для выделения плазмидной ДНК использовали набор Plasmid Midi Kit (Qiagen). Для выделения общей РНК использовали набор RNeasy mini kit (Qiagen,). Выделения проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя. Количество и чистоту оценивали спектрофотометрически и в ходе электрофореза в агарозном геле (Sambrook et al., 2007).

Амплификация ДНК. Амплификацию исследуемых фрагментов ДНК проводили в реакционной смеси, содержащей MgCl2, dNTP, праймеры, буфер и Taq-полимеразу (Promega) при помощи автоматического термоциклера MJ Mini (BioRad). Оценку проводили с помощью электрофореза в агарозном геле (Sambrook et al., 2007).

Секвенирование ДНК. Секвенирование очищенных продуктов ПЦР осуществляли с помощью ПЦР-праймеров и набора для секвенирования ABIprism BigDye Terminator v 3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Анализ сиквенсных хроматограмм и ассемблинг проводили с использованием программы SeqMan, входящей в программный пакет Lasergene 5.03 (DNASTAR Inc.) (Burland, 2000).

Выравнивание последовательности гена ache осуществляли с помощью алгоритма needle из пакета EMBOSS с использованием штрафа за вставку 10.0, матрицы сходства EDNAFULL. Анализ EST-последователыюстей проводили по базе данных UniGene (Pontius et al., 2003) с помощью программы

ASPTC (Bonizzoni et al., 2005) для поиска потенциальных сайтов сплайсинга использовали программу ASSP (Wang & Marín А. 2006).

Реакция обратной транскрипции. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием шестинуклеотидных рандом нраймеров-гексамеров (Random 6) (Сиитол), dNTP, буфера и обратной транскриптазы MMLV-RT (Fermentas) согласно инструкции фирмы-производителя (Qiagen).

Количественная оценка экспрессии мРНК генов ache и bche с помощью полимеразпои цепной реакции в режиме реального времепи (ПЦР-РВ). Количественный анализ уровня экспрессии мРНК генов ache и bche проводили на приборе iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Каждая реакция включала в себя универсальный мастер-микс для ПЦР, специфичные прямой и обратный праймеры, флуоресцентную пробу TagMan (Синтол) и кДНК. Количество РНК было нормализовано по ß-актину (Chintalgattu et al., 2003). Уровень экспрессии мРНК ache и bche в диафрагме был принят за единицу.

Сайт-направленный мутагенез выполнен фирмой Еврогеп.

Культивирование и трансформация бактерий. Культивирование проводили в среде LB (Luria-Bertani) ив агаризованной среде LB. Трансформацию бактериальных клеток Е. coli XL 1-Blue проводили с помощью СаС12 (Sambrook et al., 1989).

Трансфекцию культуры клеток НЕК 293Т проводили набором TransFast согласно инструкции фирмы-производителя (Promega).

Иммуноблоттинг. Клетки НЕК293Т, трансфицированные экспрессионными плазмидами, разрушали в буферном растворе для нанесения проб и использовали для электрофореза в 10% полиакриламидном SDS-PAGE геле (Laemmli, 1970). Белки переносили на PVDF мембрану (BioRad) и блокировали 5% раствором обезжиренного молока в фосфатно-солевом буферном растворе. Мембраны инкубировали с первичными антителами (AT) к АХЭ Е-19 (1:1000, SantaCruz) и к ß-актину (1:2000, Sigma) и вторичными видосиецифичными AT, коньюгированными с пероксидазой хрена (1:3000, Sigma). Анализ проводили с помощью набора DAB Substrate Kit (Vector).

Активность АХЭ в гомогенатах клеток определяли по методу Эллмана (Ellman et al., 1961) спектрофотометрически, по скорости исчерпания субстрата за одну минуту, при помощи спектрофотометра PerkinElmer À25 при длине волны 412 нм.

Определение концентрации белка проводили при помощи спектрофотометра PerkinElmer À25.

Программное обеспечение. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием приложения NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) и пакета программ DNA Star Lasergene (DNASTAR Inc.), ASPIC (www.caspur.it/ASPIC/) и ASSP (Wan & Marin 2006). Разработку праймеров проводили с использованием пакета программ Primer Select (DNASTAR Inc.). Для графического представления рестрикционных карт созданных плазмид использовали программу Vector NTI 9 Software (Invitrogen).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel-2007. Статистическая достоверность разницы определялась с помощью t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение первичной нуклеотидной последовательности и интронно-экзонной структуры гена ache Rattus norvegicus

Интронно-экзонная структура гена ache млекопитающих исследована на примере гена Mus musculus (домовая мышь) и Homo sapiens (человек). Для определения взаимодействия между ферментом и ингибитором, мы проанализировали нуклеотидную последовательность гена ache Rattus norvegicus (крыса) из базы данных GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank). В ходе исследования мы обнаружили отсутствие участков нуклеотидной последовательности гена ache длиной 229 п.н. с 5'- конца и 391 п.н. с 3'- конца в районах гена, важных для процессов альтернативного сплайсинга.

В литературе описаны три канонические изоформы АХЭ, имеющие одинаковые каталитические свойства, но различающиеся по вариабельности С-конца, характером сборки субъединиц, скоростью седиментации, а также типом ассоциации с клеточной мембраной. Из данных литературы, помимо приводящего к образованию фермента с различными вариантами С-конца 3'-альтернативного сплайсинга, происходит также альтернативный сплайсинг 5'-конца (Legay et al., 1995; Grisaru et al., 1999; Rotundo 2003; Mesliorer et al., 2004; Camp et al., 2008). В связи со значимостью данных участков для альтернативного сплайсинга нами разработаны специфичные праймеры для амплификации неизвестных областей гена ache, проведено выделение геномной ДНК, ПЦР и секвенирование. В результате секвестрования нами получены нуклеотидные последовательности длиной 1019 п.н. для 5'- конца и 847 п.н. для

3- конца гена ache R. norvégiens, которые перекрыли пробелы в последовательности гена ache 12-й хромосомы NW_001084677,1.

Для выявления порядкового (линейного) расположения экзонов и интронов в гене дс/;е Л. norvégiens мы провели глобальное выравнивание (алгоритм Нцдлмана-Вунша) последовательности гена R. norvégiens с последовательностью гена Mus museulus. Выравнивание показало, что эти последовательности являются гомологичными на 84,5%. В результате выравнивания и попарного сравнения нуклеотидных последовательностей гена ache R. norvégiens и M. museulus обнаружены нуклеотидные замены, вставки и делеции. Общее число замен в нуклеотидной последовательности экзонов гена ache R. norvégiens составило 115 п.н., число вставок - 34 п.н., делеций - 13 п.н.

В связи с тем, что наличие делеций не позволяет достоверно определить интронно-экзонную структуру гена, мы выравнивали нуклеотидные последовательности гена с последовательностями мРНК. Поиск в базе данных UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene) позволил найти 36 фрагментов экспрессированных последовательностей (EST-последователыгостей) для гена ache R. norvegicus. С помощью программы ASPIC (www.caspur.it/ASPIC/) нами получен прогноз возможных интронов и экзонов с данными относительных позиций начала и конца в нуклеотидной последовательности гена. Из альтернативных экзонов 5'- конца в гене R. norvégiens подтвердилось только существование экзона Е1е. Кроме того, подтвердилось наличие и позиции экзонов Е2, ЕЗ, Е4 и Е6. В результате пояска потенциальных сайтов сплайсинга с помощью программы ASSP нами выявлены донорные сайты после экзонов Eld, Elc и El а, что служило косвенным подтверждением границ экзонов.

На основании анализа и полученных данных, построена модель интронно-экзонной структуры гена ache R. non'egicus (Рис.1).

человек

Е1С eu Ht ЕЮ £13 E2 C3 EJ 14 £5 1(1

крыса

в» Eld Etc E1S «la £2 63 El « 65 ГЛ

Рис. Л.Интронно-экзонная структура гена ache Mus mus cuius, Homo sapiens и Rattus norvegicus. Буквами с Ele по E6 отмечены экзоны, линией - интроны. Между 4 и 5 экзоном располагается короткий нитрон, образующий совместно с другими экзонами изоформу «R» гена ache при альтернативном сплайсинге

Построенная нами модель интронно-экзонной структуры гена ache R. non>egicus отличается от последовательности гена ache M. musculus (Рис.1) разницей в количестве нуклеотидов. При сравнении с моделью гена ache H. sapiens (Рис.1) в структуре гена ache R. norvegicus отсутствует интрон, расположенный между 5 и 6 экзоном. Таким образом, структура гена ache R. norvegicus на 3' и 5' областях нуклеотидной последовательности не содержит экзонов или интронов, способных к образованию дополнительных изоформ фермента в процессе альтернативного сплайсинга, соответствующих избирательной чувствительности различных органов и тканей к производному 6-метилурацила. Полученные нами данные легли в основу для проведения сравнительного анализа продуктов альтернативного сплайсинга гена ache R. norvegicus.

Различие в уровне экспрессии мРНК изоформ гена ache органов и тканей Rattus norvegicus

Экспрессия различных изоформ АХЭ происходит в большинстве тканей организма. Полиморфизм АХЭ возможен благодаря нескольким процессам, одним из которых является альтернативный сплайсинг 3' конца. В литературе описаны три канонические изоформы АХЭ, экспрессия которых различается в разных органах и тканях (Legay et al., 1993; Legay 2000; Meshorer et al., 2004; Camp et al., 2008). В поперечно-полосатой мускулатуре и в ЦНС основная масса АХЭ представлена в виде изоформы

10

«Т», в крови - «Н», а изоформа «R» возникает в процессе воздействия на организм различных факторов, вызывающих стресс (Meshorer & Soreq 2006; Camp et al., 2008). Из экспериментов по исследованию ингибирования АХЭ производным 6-метилурацила установлено, что АХЭ тканей диафрагмы, головного мозга и миокарда более устойчива к ингибированию С-547 по сравнению с поперечно-полосатой мускулатурой конечностей (Petrov et al, 2009). С целью количественной оценки уровня экспрессии мРНК изоформ гена ache и выявления их компенсаторной роли проводили ПЦР в режиме реального времени.

10 г

s

У

Мышца Мозг Диафрагма Сердце

Рис. 2 Относительный уровень экспресии мРНК изоформы «Т» гена ache, содержащей альтернативный экзон 6. На диаграмме представлены нормализованное по (3-астину среднее значение уровня экспресии и стандартная ошибка. Уровень экспрессии мРНК гена ache в диафрагме принят за единицу

Как видно из данных (Рис. 2), уровень экспрессии мРНК изоформы «Т» в скелетной мышце EDL (Extensor Digitorum Longus - длинный разгибатель пальцев) в 6 раз превышает таковой в мозге, и в 3 раза выше по сравнению с тканью диафрагмы. Согласно гипотезе избыточности АХЭ, данный аспект говорит о вероятном присутствии в синапсах тканей диафрагмы и головного мозга других ХЭ, выполняющих компенсаторную роль при ингибировании изоформы «Т». Как известно, уровень синаптической АХЭ в мышцах не остается постоянным, а меняется в процессе развития, подвержен нейротрофическому контролю, зависит от различных эндогенных факторов, один из которых - стресс. Исходя из данных литературы, стресс индуцирует изменения в сплайсинге пре-мРНК, в результате чего происходит сверхэкспрессия изоформы «R» с более длительным периодом полужизни

11

вместо «Т». Таким образом, изменение в стресс-индуцированном сплайсинге с образованием изоформы «R» приводит к восстановлению нормальных электрофизиологических потенциалов после изначального чрезмерного возбуждения, способствует восстановлению двигательной активности, ускоренному восстановлению нервно-мышечных контактов и повышению порога чувствительности к агонистам и антагонистам холинэргической передачи нервного импульса. Изоформа «R», как известно из данных литературы, обладает более длительным периодом полужизни (McCahill et al., 2002; Sternfeld et al., 2002; Rotundo 2003; Meshorer et al, 2005; Meshorer & Soreq, 2006). Для проверки данной гипотезы проводили анализ уровня экспресии мРНК изоформы «R». Не наблюдалось различий в уровне экспрессии мРНК изоформы «R» между мышцами разного функцион&аьного профиля и головным мозгом. Выполнен сравнительный анализ уровня экспрессии мРНК изоформы «R» и мРНК изоформы «Т».

0Е6 0J4

10 -

Мышца Мозг Диафрагма Сердце

Рис.. 3 Сравнительный уровень экспресии мРНК изоформ гена ache, включающих экзон 6 (изоформа «Т») или 4 интрон (изоформа «R»). На диаграмме представлены нормализованное по (5-астину среднее значение уровня экспресии двух изоформ, и стандартная ошибка. Уровень экспрессии мРНК гена ache в диафрагме принят за единицу

Как видно из данных (Рис. 3), различия в уровне экспресии мРНК изоформ «Т» и «R» наблюдаются лишь в мышце EDL. Так, уровень экспресии мРНК изоформы R, включающей в результате альтернативного сплайсинга 4-й интрон, в два раза меньше по сравнению с мРНК изоформы «Т». Из этого следует, что основной пул фермента в нервно-мышечном синапсе представлен

изоформой «Т», в то время как в остальных исследуемых органах помимо экспресии мРНК изоформы «Т» наблюдается в равной степени экспрессия мРНК изоформы «К».

Из данных, представленных на диаграмме (Рис. 3) можно сделать вывод, что в синапсах исследуемых органов и тканей помимо «Т» присутствует и определенное количество изоформы «Л», вероятно менее (по сравнению с «Т») подверженнной влиянию С-547 и выполняющей частичную компенсаторную роль.

Однако, как известно, в нервно-мышечном синапсе помимо АХЭ существует еще один фермент, способный гидролизовать ацетилхолин, бутирилхолинэстераза (БХЭ), которая также может компенсировать недостаток активности АХЭ (Горбунов и Резник, 2009). В связи с этим, мы проверили гипотезу о компенсаторной роли БХЭ в синапсах (Рис. 4).

8 БХЭ ПЕ6 В14

100 р

Мышца Мозг Диафрагма Сердце

Рис. 4 Корреляция уровня экспрессии мРНК гена bche и изоформ гена ache в разных тканях и органах. На диаграмме представлены нормализованное по (3-астину среднее значение уровня экспрессии гена bche и изоформ гена ache, стандартная ошибка. Уровень экспрессии мРНК гена bche и ache в диафрагме принят за единицу

Как видно из данных (Рис. 4), уровень экспрессии мРНК bche в ткани диафрагмы в 4,2 раза превышает таковой в скелетной мускулатуре. Уровень экспрессии мРНК bche в мозге - в 4,9 раза, а в сердце - в 183,5 раза выше, чем в ткани скелетной мускулатуры. При этом, установлена отрицательная зависимость уровня экспрессии мРНК гена ache по отношению к мРНК bche. Коэффициент корреляции равен - 0,4 для мРНК bche и мРНК изоформы «Т» и - 0,53 для мРНК bche и мРНК изоформы «R».

Полученные в ходе этого исследования данные полностью согласуются с данными о степени ингибирования производным 6-метилурацила БХЭ и АХЭ в

тканях диафрагмы и сердца (Petrov et al., 2009). Функциональная значимость БХЭ в синапсах диафрагмы, головного мозга и сердца может быть выше, чем в мышце EDL, Поскольку производное 6-метилурацила является избирательным ингибитором АХЭ (Anikienko et al., 2008), то активность БХЭ может компенсировать недостаток активности АХЭ. Следует отметить, эксперименты по исследованию полного ингибирования БХЭ в присутствии С-547 выявили увеличение чувствительности диафрагмы к производному 6-метилурацила. Однако, это не устраняло полностью различий между мышцей EDL и диафрагмой (Petrov et al., 2009). Таким образом, должен существовать другой механизм, который обеспечивает устойчивость дыхательных мышц, сердца и головного мозга к алкиламмониевым производным 6-метилурацила.

Влияние гликозилироваиия ацетилхолинэстеразы на обеспечение чувствительности к производным 6-метилурацила

Так как С-547 относится к разряду псевдонеобратимых ингибиторов неконкурентного действия (Аникиенко и др., 2001), а время жизни комплекса «лиганд-АХЭ» может превышать период полуобновления фермента, поиск особенностей строения АХЭ, обеспечивающих разную чувствительность к производным 6-метилурацила, мы продолжили на уровне различий в пострансляционной модификации белка. По данным литературы, посттрансляциошгой модификацией АХЭ является N-гликозилирование. АХЭ содержит три потенциальных сайта N-гликозшшрования (Cohen et al., 2001; Chitlaru et al., 2002; Chen et al., 2011). Сложная разветвленная структура ингибитора свидетельствует о потенциально большом количестве контактных точек в образующемся комплексе, в связи с чем высказано предположение, что алкиламмониевые производные 6-метилурацила теоретически способны вступать во взаимодействие с N-гликанами. Для проверки данной гипотезы с помощью сайт-направленного мутагенеза мы провели аминокислотные замены Asn в позициях 296, 381 и 495 на Gin, по отдельности и в разных комбинациях с последующей экспрессией рекомбинантных АХЭ в культуре клеток и определением степени ингибирования С-547. Схема аминокислотных замен приведена на Рис. 5. С помощью программы Vector NTI 9 (Invitrogen) строили рестрикционные карты плазмид (Рис. 6).

Рис. 5 Схема аминокислотных Рис.6 Плазмидный вектор рАСНЕ.

замен в сайтах гликозилирования АХЭ (Chitlaru et al., 2002).

Для оценки экспрессии гена ache, клонированного в плазмидный вектор и содержащего нуклеотидные замены, в ответственных за гликозилирование белка областях мы проводили трансфекцию клеток линии НЕК293Т. В ходе флуоресцентной микроскопии показана экспрессия репортсрного белка EGFP в клетках НЕК293Т, трансфицированных рекомбинантными плазмидами, несущими клонированный ген ache с мутациями в сайтах гликозилирования. Данные результаты свидетельствуют в пользу того, что произошла генетическая модификация клеток НЕК293Т, а генетические конструкции стабильны и экспрессируют клонированный ген ache с мутациями в сайтах гликозилирования. Экспрессию наблюдали в течение 10 дней с момента трансфекции клеток. Для определения биосинтеза рекомбинантного белка АХЭ в трансфицированных клетках НЕК293Т мы проводили иммуноблоттинг при помощи антител к АХЭ. В ходе анализа выявлена положительная реакция с антителами к АХЭ в трансфицированных образцах и отрицательная реакция в контрольном образце. Полученные данные позволяют утверждать, что произошла плазмидная трансфекция клеток НЕК293Т. Трансфицированные конструкциями pACHE-N495Q, pACHE-3xN->Q, pACHE-N381Q, рАСНЕ-N296Q и pACHE-wt, клетки биосинтезируют АХЭ. Эти данные коррелируют с результатами, полученными в ходе флуоресцентного анализа экспрессии репортерного гена egfp в трансфицированных клетках НЕК293Т. Результаты свидетельствуют в пользу того, что произошла плазмидная трансфекция и трансфицированные клетки экспрессируют белковые продукты гена ache с мутациями в сайтах гликозилирования.

С целью проверки влияния проведенных нами аминокислотных замен в сайтах гликозилирования АХЭ на кинетическое поведение фермента нами исследована зависимость ферментативной активности генетически модифицированной АХЭ от концентрации С-547. Лизаты модифицированных клеток НЕК293Т анализировали с помощью биохимического анализа по методу Эллмана (Е11гаап е! а1., 1961). Активность АХЭ в гомогенатах клеток определяли спектрофотометрически, по скорости исчерпания субстрата за одну минуту. Влияние ингибитора первоначально оценивали по действию известной ингибирующей концентрации Ю-3 моль (М) С-547 (Табл. 1).

Таблица 1.

Активность АХЭ с разной степенью гликозилирования

Название плазмидного вектора, содержащего ген ache Активность без ингибитора ДАда/мин Активность при концентрации 10"5М С-547

pACHE-N495Q 0,0122 0,0049

рАСНЕ 3xN->Q 0,0050 -

pACHE-N381Q 0,0126 0,0050

pACHE-N296Q 0,0124 0,0049

pACHE-wt 0,0169 0,0050

«-» контроль 0,0050 0,0050

Как следует из данных (Табл. 1), фермент с тройной заменой не активен. Вероятно, это связано с полной потерей ферментативной активности из-за отсутствия гликанов на поверхности белка, что привело к возросшей чувствительности по отношению к протеолитическим ферментам. АХЭ с одной из замен (Asn на Gin) проявляет различную активность, но все они (модификации белка) при концентрации КГ3 М С-547 полностью ингибируются, что согласуется с данными отрицательного контроля. С целью уточнения диапазона ингибирующих мутантную АХЭ концентраций С-547 мы определили активность модифицированного белка при различных концентрациях ингибитора (Ю-9, 1(Г8, 1(Г7, 1(Г6, 10"5, 10"4М С-547).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Концентрация С-547 (М)

1 Рис. 7 График зависимости ферментативной активности АХЭ от концентрации С-547.

I

Как видно из данных (Рис. 7), ингибирующее действие С-547 при | концентрации 10"9, 10"8 М практически не определяется как для фермента с I разной степенью гликозилирования, так и для дикого типа АХЭ. Степень 1 полного ингибирования АХЭ С-547 варьирует в пределах от 10"6 до 1(Г5 М.

Разница в процентном отношении активности АХЭ дикого типа и ' модифицированной по сайтам гликозилирования объясняется частичной потерей ферментативной активности за счет снижения стабильности функциональной конформации модифицированного белка. Для определения I степени полного ингибирования мы проводили повторный анализ активности АХЭ при 10"6 и 10"5 М концентрации С-547 (Табл. 2).

Таблица 2.

Концентрация С-547, при которой происходит полное ингибирование АХЭ

Название плазмидного вектора, содержащего ген ache Концентрация С-547 (М)

pACHE-N495Q 1,5* 10'6

рАСНЕ- N296Q 1,5хЮ"6

pACHE-N38lQ 1,5x10-6

рАСНЕ 3xN-> Q нет

pACHE-wt 0,5x10'6

«-» контроль нет

I Как видно из данных (Табл. 2), полное ингибирование мутантных АХЭ

| происходит при концентрации С-547 1(Г6 М, кроме случая тройной мутации,

I где активность АХЭ не определяется. Как показал анализ, все

I 17

Ю"» 10-» 10"7

—рАСНЕ N495Q

—* -pACHE-N38IQ

-■*--pACHE-N296Q

— « -pACHE-wt

•»ж* • отрицательный контроль

модифицированные по сайтам гликозилирования АХЭ, кроме белка с тройной заменой, в равной степени проявляют ферментативную активность и способность ингибироваться С-547. Полученные нами данные сопоставимы со значениями, полученными рядом авторов для АХЭ из тканей головного мозга R. norvégiens, и имеют большее значение, чем для АХЭ мышцы EDL (1(TS M) (Petrov et al., 2009). Таким образом, избирательное выключение сайтов гликозилирования не оказывает влияния на чувствительность АХЭ к С-547.

Вероятно, в случае ингибирования мышцы EDL С-547 играют роль процессы, опосредованно связанные с конформацией активного центра, но оказывающие сильное регуляторное действие. Одним из вариантов регуляции активности АХЭ может служить регуляция трехмерного пространственного расположения глобулы АХЭ в гетероолигомере, образованном с якорными белками ColQ (коллаген Q) и PRiMA (богатый пролином мембраносвязанный белок), то есть ее (АХЭ) четвертичная структура. В этом случае одна молекула С-547, занимающая положение вблизи контакта АХЭ с пролин-богагой областью ColQ, способна повлиять на активность 12-ти глобул АХЭ. В связи со сказанным, мы провели исследование влияния якорных субъединиц PRiMA и ColQ на значения ингибирования АХЭ С-547. Для этого проводили ко-трансфекцию клеток линии НЕК293Т плазмидами, содержащими гены ache и якорных субъединиц PRiMA и ColQ. Эффективность трансфекции оценивали при помощи флуоресцентной микроскопии. С целью проверки влияния якорных субъединиц ColQ и PRiMA на кинетическое поведение фермента нами исследована зависимость ферментативной активности АХЭ от концентрации С-547. Влияние ингибитора первоначально оценивали по действию на ферментативную активность АХЭ известной ингибирующей концентрации 10~5 M С-547 (Табл. 3).

Таблица 3.

Активность АХЭ с якорными белками PRiMA и ColQ

Название Активность без ингибитора ДА4[2/мин Активность при концентрации 10"5 M С-547

АХЭ + ColQ 0,0173 0,0051

АХЭ + PRiMA 0,0167 0,0053

«-» контроль 0,0050 0,0050

Как видно из данных (Табл. 3), АХЭ в комплексе с якорными белками СоК} и PRІMA проявляет одинаковую ферментативную активность и при концентрации 10'5 М С-547 полностью ингибируется, в связи со значениями активности, близкими к отрицательному контролю. Для уточнения диапазона

ингибирующих концентраций С-547 мы определили активность АХЭ в комплексе с якорными белками СоК) и РЯ1МА, при различных концентрациях инг ибитора (10"9, 1(Г8, 1(Г7, 1(Г6, 10"5, Ю-4 М С-547; Рис. 8).

Концентрация С-547 (М)

Рис. 8 График зависимости ферментативной активности АХЭ дикого типа (коэкспрессируемой совместно с якорными белками ColQ и PRiMA) от концентрации С-547

Как показал проведенный нами биохимический анализ (Рис. 8) активность АХЭ дикого типа и с якорными белками одинакова при всех использованных концентрациях С-547. Полное ингибирование АХЭ совместно с якорными белками ColQ и PRiMA характеризуется концентрацией Ю-6 М. АХЭ, как было сказано выше, представлена в виде множества молекулярных форм, различных по своей четвертичной структуре и типу ассоциации с клеточной мембраной. Вероятно, АХЭ в гетероолигомерном комплексе с якорными белками ColQ и PRiMA существует в лишь агрегированном состоянии, т.е. приобретая лишь способность прикрепляться к поверхности клеточной мембраны, увеличивая число точек взаимодействия с субстратом и ингибиторами, однако ее каталитические свойства при этом остаются неизменными.

Таким образом, наличие якорных субъединиц и образование гетероолигомерных структур не влияет на каталитическую активность АХЭ в присутствии С-547.

Следует заключить, что при взаимодействии фермента и ингибитора, вероятно, задействованы другие механизмы, выполняющие опосредованную роль в работе фермента, но оказывающие критическое значение при ингибировании. Также следует отметить особое строение молекулы С-547,

которая может принимать множество различных пространственных конформаций, что делает затруднительным предсказание вероятных точек взаимодействия лиганда с ферментом. Сложная организация межсинаптического пространства, в котором происходит взаимодействие ингибитора и АХЭ, также может опосредованно влиять на процесс ингибирования.

ВЫВОДЫ

1. Определена первичная нуклеотидная последовательность недостающих 5' и У участков гена ацетилхолинэстеразы (achej Rattus norvégiens (229 и 391 пар нуклеотидов соответственно), важных для процессов альтернативного сплайсинга. На основании компьютерного анализа построена интронно-экзонная структура гена ache Rattus norvegicus. Показано, что интронно-экзонная структура гена ache Rattus norvegicus соответствует структуре гена ache Mus musculus на 84.5%;

2. Показано, что мРНК изоформы «R» гена ache присутствует во всех исследуемых органах и тканях Rattus norvegicus. Статистически достоверное различие в уровне экспрессии мРНК изоформ гена ache отмечено в поперечнополосатой мускулатуре задних конечностей, где уровень экспресии мРНК изоформы «R» в 2 раза меньше по сравнению с мРНК изоформы «Т»;

3. Выявлены различия в экспрессии мРНК гена бугарилхолинэстеразы (bche) в органах и тканях Rattus norvegicus: уровень экспрессии мРНК гена bche в ткани диафрагмы в 4,2 раза, в мозге - в 4,9 раза, а в сердце - в 183,5 раза выше, чем в мышце EDL. Установлена отрицательная зависимость уровня экспрессии мРНК изоформ гена ache по отношению к мРНК гена bche;

4. Разная степень гликозилирования АХЭ Rattus norvegicus и образование гетероолигомеров в комплексе с якорными белками (коллаген Q и богатый пролином мембраносвязанный белок - PRiMA) не влияет на активность фермента в присутствии ингибитора С-547.

Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Лапник Н.И. Уточнение первичной нуклеотидной последовательности и интронно-экзонной структуры гена ацетилхолинзстеразы Rattus norvegicus / Н.И. Ланник, Д.С. Тарасов, К.А. Петров, Э.А. Бухараева, Е.Е. Никольский, А.А. Ризванов // Ученые записки Казанского университета, серия «Естественные науки». - 2011. - Т. 153, кн. 1. — С. 120-126.

2. К.А. Petrov Différent sensitivities of rat skeletal muscles and brain to novel anti-cholinesterase agents, alkylammonium derivatives of 6-methyluracil (ADEMS) / K.A. Petrov, L.O. Yagodina, N.I. Lannik, G.R. Valeeva, A.D. Nikitashina, A.A. Rizvanov, V.V. Zobov, E.A. Bukharaeva, V.S. Reznik, F. Vyskocil, E.E. Nikolsky // British Journal of Pharmacology. - 2011, - V. 163, - P. 732-744.

Другие публикации по теме диссертации:

3. Лапник Н.И. Уточнение первичной нуклеотидной последовательности гена ацетилхолинзстеразы Rattus norvegicus. / Н.И. Ланник, А.А. Ризванов, А.А. Ларин, Д.С. Тарасов. // XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молодые ученые в медицине», -Казань, 2008. - С.212-213.

4. Лашшк Н.И. Изучение экспрессии гена ацетилхолинзстеразы в различных тканях Rattus norvegicus / Н.И. Ланник, К.А. Петров, А.А. Ризванов, Е.Е. Никольский // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: Материалы II Международной научно-практической конференции. - Казань, 2008.-С.71.

5 Лашшк Н.И. Изучение экспрессии отдельных экзонов гена ацетилхолинзстеразы в различных тканях Rattus norvegicus / Н.И. Ланник, А.А. Ларин, К.А. Петров, А.А. Ризванов, Е.Е. Никольский // XIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молодые ученые в медицине», Казань - 2009, - С. 169

6. Лашшк Н.И. Изучение экспрессии сплайс-вариантов гена ацетилхолинзстеразы в дыхательной и локомоторной мышцах крысы / А.А. Ларин, Н.И. Ланник, К.А. Петров, Э.А. Бухараева, А.А. Ризванов // XIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2009. - С. 178

7. Лашшк Н.И. Влияние аминокислотных замен в сайтах гликозилирования АХЭ на кинетическое поведение фермента / Н.И. Ланник, А.А. Ризванов, Е.Е. Никольский // I научно-практическая конференция с

международным участием «Современные проблемы генетики», Казань -2011,-С. 32

Список сокращений

АХЭ - ацетшгхолинэстераза БХЭ - бутирилхолинэстераза

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

п.н. - пар нуклеотидов

ЦНС - центральная нервная система

ColQ - Collagen Q - коллаген Q

EDL - Extensor Digitorum Longus - длинный разгибатель пальцев

НЕК293Т - Human embryonic cidney cells - эмбриональные клетки почки

человека

PRiMA - Proline Rich Membrane Anchor - богатый пролином мембраномсязанный белок

Биохимический анализ проводили совместно с к.б.н. Ягодиной Л.О. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей гена ache проводили совместно с к.б.н., с.н.с. КФ МСЦ РАН Тарасовым Д.С.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н., доценту Ризванову A.A. за постановку проблемы, внимательное отношение к работе, и помощь в расстановке приоритетов; д.м.н., профессору, академику РАН Никольскому Е.Е. за плодотворное сотрудничество, воспитание, знания и идеи; сотрудникам лаборатории биофизики синаптических процессов КИББ КазНЦ РАН за предоставленный исследуемый препарат и сотрудничество; д.б.н., профессору Барабанщикову Б.И., сотрудникам кафедры генетики и межкафедральной радиологической лаборатории за помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.

_Особую благодарность автор выражает своим родителям Ланник Зинаиде Ивановне и

| Ланнику Ивану Петровичу!за безграничную любовь, личный пример, поддержку и понимание.

Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу:

420008, Казань, ул. Кремлевская 18, главное здание КФУ, к.104, отдел аттестации, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.081.08 проф. Абрамовой З.И., факс: (843)238-76-01. E-mail: Natalya.lannik@gmail.com

Подписано в печать 21.03.12. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 1,27 Уч .-изд. л. 1,01. Тираж 130 экз. Заказ 93/3

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательства Казанского университета

420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. (843) 233-73-59, 292-65-60

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ланник, Наталья Ивановна, Казань

61 12-3/1229

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования Казанский (Приволжский) федеральный университет

На правах рукописи

Ланник Наталья Ивановна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНОГО 6-МЕТИЛУРАЦИЛА НА АКТИВНОСТЬ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ RA TTUS NOR VEGICUS

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, доцент A.A. Ризванов

Казань 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................11

1. Ацетилхолинэстераза, ее функции и строение...........................................11

2. Бутирилхолинэстераза и ее функции...........................................................33

3. Ингибиторы ацетилхолинэстеразы..............................................................27

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................47

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................................60

1. Определение первичной нуклеотидной последовательности и интронно-экзонной структуры гена ache Rattus norvégiens............................................60

2. Различие в уровне экспрессии мРНК изоформ гена ache органов и тканей Rattus norvegicus.................................................................................................65

3. Влияние гликозилирования ацетилхолинэстеразы на обеспечение чувствительности к производным 6-метилурацила.......................................73

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................88

ВЫВОДЫ...............................................................................................................93

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................94

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................................................117

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АХЭ - ацетилхолинэстераза АХ - ацетилхолин

АТХ - ацетилтиохолин йодистый (CH3COSCH2CH2N(CH3)CI) анти-ХЭ - антихолнэстеразные препараты ацетил-КоА - ацетил коэнзим А БХЭ - бутирилхолинэстераза

гяРНП - гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиды

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

мяРНП - малые ядерные рибонуклеопротеиды

МТКП - миниатюрные токи концевой пластинки

М-ХР - мускариновые холинорецепторы

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция ПАС - периферический анионный сайт

пре-мРНК - предшественник матричной рибонуклеиновой кислоты ПКП - потенциал концевой пластинки п.н. - пар нуклеотидов

Полимераза Taq - термостабильный фермент Thermus aquaticus ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени

РНК - рибонуклеиновая кислота

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ХАТ - холинацетилтрансфераза

ЦНС - центральная нервная система

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ache - ген, кодирующий ацетилхолинэстеразу

3

AML1 - Acute Myeloid Leukemia - транскрипционный фактор острого миелоидного лейкоза

bche - ген, кодирующий бутирилхолинэстеразу

BDNF - Brain Derived Neurotrophic Factor - нейротрофический фактор мозга

BSA - Bovine Serum Albumin - бычий сывороточный альбумин

CREB - с AMP Response Element-Binding protein - белок связывающий цАМФ

CGRP - Calcitonin Gene-Related Peptide - кальцитонин ген-связанный пептид

ColQ - CollagenQ - коллаген Q

dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфат

DMEM - Dulbecco's modified Eagle's medium - среда Игла, модифицированная Дульбекко

DTNB - 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoicacid) - 5,5'дитиобис-2-нитробензойная кислота

EDL - Extensor Digitorum Longus - длинный разгибатель пальцев

EGF - Epidermal Growth Factor - эпидермальный ростовой фактор

EGFP - Enhanced Green Fluorescent Protein - улучшенный зеленый

флуоресцентный белок

FBS - Fetal Bovine Serum - эмбриональная бычья сыворотка

GDNF - Glial Cell Derived Neurotrophic Factor - глиальный

нейротрофический фактор

GPI - Glicophosphotidil inositol - гликофосфотидил инозитол

HEK293T - Human embryonic cidney cells - эмбриональные клетки почки

человека

HSPG - Heparan Sulfate Proteoglycan - гепаран сульфат протеогликан

IL-1 - interleukine - интерлейкин-1

NGF - Nerve Growth Factor - фактор роста нервов

NT-3 - Neurotrophin-3 - нейротрофин 3

NT-4 - Neurotrophin-4 - нейротрофин 4

PPII - Polyprolinell - полипролинП

PRAD - Proline Rich Attached Domain - богатый пролином прикрепляющий домен

PRiMA - Proline Rich Membrane Anchor - богатый пролином мембраносязанный белок

RPMI 1640 - Roswell Park Memorial Institute medium 1640 - среда для культивирования клеток №1640, разработанная в Институте раковых исследований Розвелла Парка

RRM - RNA Recognition Motif - РНК - Распознающий мотив SDS - Sodium Dodecyl Sulfate - додецилсульфат натрия

SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis -додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель для электрофореза в денатурирующих условиях ТЕ - Tris-EDTA - трис-ЭДТА буфер

WAT - Tryptophan (W) Amphiphilic Tetramerization domain - триптофановый амфифильный тетрамеризующий домен

ВВЕДЕНИЕ

Ацетилхолинэстераза (ацетилхолин-ацетилгидролаза, АХЭ, К.Ф. 3,1,1,7) - фермент, семейства сериновых гидролаз, играющий ключевую роль при передаче возбуждения путем гидролиза ацетилхолина с образованием холина и уксусной кислоты в синапсах центральной и периферической нервной системы. Известно, что АХЭ играет важную роль в патогенезе таких заболеваний как болезнь Альцгеймера, черепно-мозговые травмы, сосудисто-мозговые патологии, миастения Гравис, и т.д.(Jeffrey & Cummings, 2000; Jones et al., 2011; Shakil et al., 2011). Эти заболевания сопровождаются гибелью нейронов, дегенерацией аксонов, нарушением коммуникаций в нейронных сетях и контролируемых ими функций. Несмотря на то, что большинство заболеваний являются мультифакторными, одним из основных повсеместно принятых методов терапии остается применение антихолинэстеразных (анти-ХЭ) препаратов. В настоящее время имеется большой выбор препаратов с анти-ХЭ действием. Однако, большинство из них характеризуются недостатками, наиболее важным из которых является неселективность действия применяемых препаратов по отношению к органам, в том числе - не требующим коррекции. Это приводит к развитию широкого спектра тяжелых побочных явлений со стороны организма и является причиной частых патологических или смертельных исходов из-за нарушения работы дыхательной мускулатуры (Голиков и др., 1986; Сосюкин и др., 2005; Lester et al., 2010). В связи с этим, особую актуальность и значимость приобретает поиск и определение механизма действия новых высокоселективных, тканеспецифичных ингибиторов АХЭ.

В лаборатории химико-биологических исследований Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова (ИОФХ) были синтезированы производные урацила, содержащие тетраалкиламмониевые

1 3

группы при N и N атомах пиримидинового цикла, классифицированные, в дальнейшем, как новый класс необратимых и высокоселективных

ингибиторов АХЭ (Резник и др., 1998; Аникиенко и др., 2001). Являясь представителями хорошо известного класса необратимо действующих ингибиторов холинэстераз, они, в то же время, проявляют ряд аномальных свойств. Существенной особенностью действия производных 6-метилурацила у млекопитающих in vivo является большой диапазон между дозами, в которых они парализуют мышцы конечностей при функциональной нагрузке, и летальными дозами, в которых они блокируют дыхательные мышцы. К этому классу соединений относится и исследуемый нами ингибитор С-547 (далее по тексту - С-547), проявляющий избирательность действия по отношению к АХЭ разных органов и тканей (Аникиенко и др., 2001 ;Petrov et al., 2006, 2009). Однако в литературе отсутствуют данные о механизмах действия С-547, приводящих к избирательному ингибированию АХЭ, что необходимо для оптимизации процессов синтеза новых высокоселективных анти-АХЭ препаратов на основе 6-метилурацила.

На основании вышеизложенного, целью настоящей работы явилось выявление основных факторов, определяющих избирательное влияние ингибитора С-547 на активность ацетилхолинэстеразы в разных тканях и органах Rattus norvegicus.

В соответствии с поставленной целью требовалось решение следующих

задач:

1. Определить нуклеотидную последовательность 5 ' и 3 ' участков гена ацетилхолинэстеразы (ache) R. norvegicus и построить модель его интронно-экзонной структуры;

2. Выявить различия в экспрессии мРНК изоформ гена ацетилхолинэстеразы (ache) в органах и тканях R. norvegicus;

3. Установить различия в экспрессии мРНК гена бутирилхолинэстеразы (behe) в органах и тканях R. norvegicus;

4. Провести сравнительную оценку влияния ингибитора С-547 на активность различных форм ацетилхолинэстеразы, отличающихся по степени

гликозилирования и наличию якорных субъединиц (коллаген Q и богатый пролином мембраносвязанный белок - PRiMA).

Научная новизна. Впервые определена нуклеотидная последовательность 5' и 3' недостающих участков гена ache R. norvegicus и на ее основе построена интронно-экзрнная структура гена. Данные депонированы в международную базу данных GeneBank (GQ338831 и GQ338832). Впервые разработаны праймеры для ПЦР в режиме реального времени по технологии TaqMan, позволяющие оценить уровень экспрессии мРНК изоформ гена ache в разных органах и тканях организма. Впервые разработаны вектора экспрессии для гена ache R. norvegicus, содержащие нуклеотидные замены в сайтах гликозилирования.

Научно-практическая значимость работы. Данные об интрон-

экзонной структуре гена ache R. norvegicus имеют важное теоретическое и

практическое значение, позволяют провести сравнительный анализ в

строении гена ache разных видов животных, исследовать процессы

альтернативного сплайсинга, выяснить взаимосвязи между регуляторными

последовательностями гена и различными внешними и внутренними

факторами, их влияние на избирательную экспрессию гена ache в разных

органах и тканях. Практическая значимость заключается в разработке

специфических праймеров и гибридизационных зондов для оценки

экспрессии мРНК изоформ АХЭ, амплификации фрагментов гена, создании

плазмидных и вирусных векторов, несущих ген ache. Полученные нами

данные об уровне экспрессии мРНК гена ache органов и тканей R. norvegicus

расширяют представление о разнообразии изоформ фермента в синапсах,

что необходимо при разработке и установлении механизмов действия новых

лекарственных препаратов-ингибиторов АХЭ. Данные об уровне экспрессии

мРНК гена bche необходимы при исследовании его компенсаторной роли в

различных органах и тканях и роли при различных патологических

процессах. Созданные генетические конструкции для экспрессии гена ache,

содержащего нуклеотидные замены в сайтах гликозилирования в различных

8

комбинациях, позволяют оценить влияние гликанов на биологическую активность АХЭ, транспорт к клеточной мембране, стабилизацию функциональной конформации, на функционирование головного мозга в норме и патологии (например, при болезни Альцгеймера), а также в исследовании других заболеваний, в патогенезе которых принимает участие АХЭ. Результаты исследований будут полезны для практического применения при разработке новых лекарственных препаратов селективного действия, свободных от недостатков ныне применяемых препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Структура гена ацетилхолинэстеразы (ache) Rattus norvégiens гомологична структуре гена ацетилхолинэстеразы (ache) Mus musculus;

2. Уровень экспрессии мРНК гена бутирилхолинэстеразы (bche) в поперечно-полосатой мускулатуре задних конечностей Rattus norvegicus ниже, чем в тканях сердца, головного мозга и диафрагмы;

3. Различная степень гликозилирования ацетилхолинэстеразы и образование гетероолигомеров в комплексе с якорными белками (коллаген Q и богатый пролином мембраносвязанный белок - PRiMA) не влияет на степень ингибирования АХЭ производным 6-метилурацила (С-547).

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена при поддержке грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований (07-04-12097 офи-м), Правительства Республики Татарстан по подготовке и переподготовке кадров в зарубежных научных центрах и гранта «Пятьдесят лучших инновационных идей для Республики Татарстан» в номинации Молодежный инновационный проект «МИП» (Государственный контракт № р/14180). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на II

Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в

биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); Всероссийских

9

научно-практических конференциях с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2008, 2009); конкурсе «50 лучших инновационных идей для Республики Татарстан» (Казань, 2010); конкурсе «У.М.Н.И.К» - 2010; научной конференции, посвященной 35-летию кафедры генетики КФУ «Современные проблемы генетики» (Казань, 2011); ежегодных научных отчетных конференциях сотрудников КФУ (Казань, 2010, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 статьи в центральных отечественных и зарубежных рецензируемых журналах: Ученые записки Казанского университета, секция естественные науки и British Journal of Pharmacology.

Место выполнения работы Казанский (Приволжский) федеральный университет.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и 11 таблиц. Библиография содержит 190 наименований, в том числе 177 -зарубежных.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ацетилхолинэстераза, ее функции и строение.

Роль ацетилхолинэстеразы в процессе передачи нервного импульса.

Основной структурно-функциональной единицей организации нервной системы является нейрон. Взаимодействия между нейронами осуществляются посредством синапсов, обеспечивающих передачу сигнала при помощи химических и электрических импульсов (Lester et al., 2011). В синаптической передаче задействованы специальные механизмы. Так, для ее выполнения в химических синапсах используется нейромедиаторы (у-аминомасляная кислота, глицин, глутаминовая кислота, адреналин, норадреналин, дофамин, ацетилхолин и т.д.). Химические синапсы обеспечивают сложное взаимодействие клеток, а также связаны с рядом патологических процессов и изменяют свои свойства под воздействием ряда химических веществ. Химическая передача нервного импульса в холинергическом синапсе происходит в 4 этапа: первые два этапа - синтез нейромедиатора и его освобождение из нервного окончания -пресинаптические, вторые два этапа - взаимодействие с постсинаптическими рецепторами и освобождение синапса от медиатора - постсинаптические (Monte-Mi 11 an et al., 2006; Martinez-Pena et al., 2011; Lester et al., 2011). Нейромедиатор ацетилхолин (АХ) представляет собой сложный эфир холина и уксусной кислоты, который легко поддается гидролизу ферментом ацетилхолинэстеразой (АХЭ) в водных растворах. Биосинтез АХ осуществляется в теле нервной клетки с помощью ацетил-КоА и холинацетилтрансферазы (Ordentlich et al., 1992; Grutter & Changeux 2001; Yao et al., 2011). Синтезированный АХ накапливается в везикулах, где вступает в связь со специфическим белком - везикулином (Ordentlich et al., 1992; Grutter & Changeux 2001; Monte-Millän et al., 2006). Выход АХ из везикул, так же как и его накопление, происходит квантами. Когда нервный импульс доходит до нервного окончания и деполяризует мембрану, везикулы

11

вступают в контакт с пресинаптической мембраной, и ацетилхолин путем экзоцитоза поступает в синаптическое пространство. Освобождение АХ из синаптических везикул возрастает при возбуждении, таким образом, в период протекания нервного импульса выделяется от 100 до 300 квантов АХ. Достигнув постсинаптической мембраны, АХ вступает во взаимодействие с холинорецепторами (ХР) в результате чего в постсинаптической мембране открываются ионные каналы и проходящие через них токи изменяют мембранный потенциал постсинаптической мембраны, что приводит к деполяризации и возникновению потенциала действия. Действие АХ в синаптической щели лимитировано действием АХЭ, которая разрушает его до холина и уксусной кислоты, тем самым предотвращая гиперполяризацию постсинаптической мембраны. Значение данного фермента для синаптической передачи хорошо заметно при воздействии ингибиторами АХЭ. Так, при воздействии эзерином, потенциал концевой пластинки нарастает дольше, чем в норме, достигая более высокого уровня, поскольку АХ взаимодействует с рецепторами необычно долго и в повышенной концентрации. При взаимодействии медиатора с АХЭ, катионная часть АХ в результате электростатического притяжения соединяется с анионным участком каталитического фермента, что приводит к образованию фермент-субстратного комплекса, который далее расщепляется на ацетилированный фермент и холин. В свою очередь, ацетилированный фермент гидролизуется водой на уксусную кислоту и свободный фермент (ОгШег & СЬап§еих2001, Сеа-с1е1 Шо (Л а1., 2011; В1ипёоп & а1., 2011).

Альтернативный сплайсинг и регуляция экспрессии

АХЭ существует в виде множественных изоформ, имеющих одинаковые каталитические свойства, но значительно различающихся �