Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуногенные свойства гликопротеина NSI и других белков вируса клещевого энцефалита

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Матвеева, Вера Александровна

Введение.

Глава I. Молекулярно-генетическая характеристика флавивирусов (обзор литературы).

1.1.1. Морфология вирионов.

1.1.2. Молекулярная организация генома.

1.1.3. Процессинг полипротеина-предшественника.

1.1.4. Свойства флавивирусных белков.

1.2. Структура и свойства гликопротеина Е флавивирусов.

1.3. Первый неструктурный белок (NS1) флавивирусов.

Глава II. Экспериментальная часть (Материалы и Методы).

2.1. Материалы, реактивы, буферные растворы.

2.2. Методы исследования.

Глава Ш. Результаты и обсуждение.

3.1. Иммуногенность белков ВКЭ для людей.

3.1.1. Гуморальный иммунный ответ в сыворотках крови больных клещевым энцефалитом.

3.1.2. Определение специфических антител к белкам ВКЭ в спинномозговых жидкостях больных клещевым энцефалитом.

3.2. Получение МКА к неструктурным белкам ВКЭ.

3.2.1. Иммунизация.

3.2.2. Антигенная специфичность полученных МКА.

3.2.3. Изотип антител.

3.3. Выделение белка NS1 методом аффинной хроматографии на

Сефарозе CL-4B с полученными иммобилизованными МКА.

3.4. Исследования свойств неструктурного белка NS1 ВКЭ.

3.4.1. Антигенные детерминанты гликопротеина NS1.

3.4.2. Антигенные детерминанты рекомбинантного белка NS 1.

3.4.3. Функциональная активность МКА и гипериммунных сывороток, специфичных к гликопротеину NS1 и его генноинженерному аналогу.

3.4.4. Протективные свойства белка NS1 ВКЭ. 91 3.5.1. Гетерокомплекс гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ.

3.5.2. Активность антисывороток, направленных к гликопротеину NS1 ВКЭ,

3.5.2. Активность антисывороток, направленных к гликопротеину NS1 ВКЭ, в реакциях специфичных для гликопротеина Е.

3.5.3. Условия комплексообразования.

3.5.4. Локализация гетерокомплекса белков E-NS1 ВКЭ. ЮЗ Выводы. 109 Список литературы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуногенные свойства гликопротеина NSI и других белков вируса клещевого энцефалита"

Актуальность проблемы. Необходимость исследований вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) обусловлена его постоянной циркуляцией в природных очагах, приводящей к сезонным заболеваниям населения с тяжелым поражением центральной нервной системы и смертельными исходами. Периодический рост заболеваемости вызывает необходимость совершенствования средств вакцинопрофилактики и иммунодиагностики. Исследование антигенных и иммуногенных свойств белка Е оболочки вирионов позволило использовать его для диагностики клещевого энцефалита и для эпидемиологических оценок природных очагов. В настоящее время для профилактики клещевого энцефалита применяют очищенные инактивированные вирионы. Однако индуцируемый такой вакциной иммунитет не приводит к полной нейтрализации ВКЭ. При лечении весенне-летнего клещевого энцефалита используются иммуноглобулины, направленные к структурным белкам. Функции неструктурных вирусных белков в развитии патологических и иммунных процессов в организме хозяина остаются неясными. К моменту начала данной работы было известно, что иммунизация гликопротеином NS1 флавивирусов и антителами к нему обеспечивает защиту от заражения летальными дозами гомологичного вируса. Кроме этого, предполагалось участие белка NS1 в репликации вируса. Таким образом, исследование иммуногенных и антигенных свойств неструктурных белков ВКЭ является актуальным. Одним из перспективных подходов к исследованию свойств вирусных белков является использование моноклональных антител (МКА). Структурно-функциональный анализ неструктурного глико протеина NS1 ВКЭ с использованием набора МКА представляет несомненный интерес для молекулярной вирусологии и практического здравоохранения.

Цель работы состояла в изучении иммуногенных и антигенных свойств гликопротеина NS1 и других неструктурных белков ВКЭ. В связи с этим было необходимо решить следующие задачи:

1) изучить антигенные и иммуногенные свойства вирусных белков посредством выявления специфичных антител к ним в сыворотках крови и спинномозговых жидкостях больных клещевым энцефалитом;

2) получить гибридные лимфоидные клеточные линии и охарактеризовать секретируемые ими МКА к неструктурным белкам ВКЭ штамма Софьин;

3) выделить неструктурный гликопротеин NS1 ВКЭ методом аффинной хроматографии с использованием полученных МКА;

4) исследовать антигенную структуру белка NS1 с помощью МКА и поликлональных антисывороток.

Научная новизна. Показано, что неструктурные белки ВКЭ являются иммуногенами как для людей, так и для мышей. Впервые получены гибридные клеточные линии, стабильно секретирующие МКА к неструктурным белкам ВКЭ. Иммобилизация МКА, направленных к неструктурному белку NS1 ВКЭ, и последующая аффинная хроматография на полученных иммуносорбентах позволили выделить гликопротеин NS1. Проведено сравнение антигенных структур нативного и рекомбинантного белков NS1 ВКЭ (штамм Софьин). Доказано, что неструктурный белок NS1 ВКЭ на поздней стадии инфекции способен образовывать комплекс с белком оболочки вирионов Е.

Практическая значимость работы. Полученные результаты показали отсутствие корреляции между формой заболевания клещевым энцефалитом и развитием гуморального иммунного ответа. Обнаружение в сыворотках и спинномозговых жидкостях больных специфичных антител к неструктурным белкам ВКЭ предполагает возможность использования этих антител в качестве новых маркеров в диагностике клещевого энцефалита. Полученные МКА используются в лабораторных исследованиях для изучения свойств неструктурных белков ВКЭ.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Результаты работы представлены на международной научной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами" (Иркутск, 1996 г.), научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 1998 г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 131 странице,, состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы и содержит 28 рисунков и 13 таблиц.