Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуногенные свойства гликопротеина NS1 и других белков вируса клещвого энцефалита

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуногенные свойства гликопротеина NS1 и других белков вируса клещвого энцефалита"

?rО ОД 18 Д£К ?ава

На правах рукописи

МАТВЕЕВА ВЕРА АЛЕКСАНДРОВНА

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ГЛИКОПРОТЕИНА NS1 И ДРУГИХ БЕЛКОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2000 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Морозова О.В.

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Ходырева С.Н. доктор биологических наук, профессор Локтев В.Б.

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится « 2000 г. в -У_часов

на заседании диссертационного совета

в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН

Автореферат разослан « 2 К А^Лс^/г Л 2000 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор химических наук Фёдорова <

4/Г-УО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Необходимость исследований вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) обусловлена его постоянной циркуляцией в природных очагах, приводящей к сезонным заболеваниям населения с тяжелым поражением центральной нервной системы и смертельными исходами. Периодический рост заболеваемости населения вызывает необходимость совершенствования средств вакцинопрофилактики и иммунодиагностики. Исследование антигенных и иммуногенных свойств белка Е оболочки вирионов позволило использовать его для диагностики клещевого энцефалита и для эпидемиологических оценок природных очагов. В настоящее время для профилактики клещевого энцефалита применяют очищенные инактивирован-ные вирионы. Однако индуцируемый такой вакциной иммунитет не приводит к полной нейтрализации ВКЭ. При лечении весенне-летнего клещевого энцефалита используются иммуноглобулины, направленные к структурным белкам. Функции неструктурных вирусных белков в развитии патологических и иммунных процессов в организме хозяина остаются неясными. К моменту начала данной работы было известно, что иммунизация гликопротеином NS1 флавивирусов и антителами к нему обеспечивает защиту от заражения летальными дозами гомологичного вируса. Кроме этого, предполагалось участие белка NS1 в репликации вируса. Таким образом, исследование иммуногенных и антигенных свойств неструктурных белков ВКЭ является актуальным. Одним из перспективных подходов к исследованию свойств вирусных белков является использование моноклон&чьных антител (МКА). Структурно-функциональный анализ неструктурного гликопротеина NS1 ВКЭ с использованием набора МКА представляет несомненный интерес для молекулярной вирусологии и практического здравоохранения.

Цель и задачи работы.

Цель работы состояла в изучении иммуногенных и антигенных свойств гликопротеина NS1 и других неструктурных белков ВКЭ. В связи с этим было необходимо решить следующие задачи:

J) изучить антигенные и иммуногенные свойства вирусных белков посредством выявления специфичных антител в сыворотках крови и спинномозговых жидкостях больных клещевым энцефалитом;

2) получить гибридные лимфоидные клеточные линии и охарактеризовать секретируемые ими МКА к неструктурным белкам ВКЭ штамма Софьин;

3) выделить неструктурный гликопротеин NS1 ВКЭ методом аффинной хроматографии с использованием полученных МКА;

4) исследовать антигенную структуру белка NS1 с помощью МКА и поли-клональных антисывороток.

Научная новизна. Показано, что неструктурные белки ВКЭ являются им-муногенами как для людей, так и для мышей. Впервые получены гибридные клеточные линии, стабильно секретирующие МКА к неструктурным белкам ВКЭ (штамм Софьин). Иммобилизация МКА, направленных к неструктурному белку NS1 ВКЭ на сефарозу, и последующая аффинная хроматография на полученных иммуносорбентах позволили выделить гликопротеин NS1. Пропедено сравнение

антигенных структур нативного и рекомбинантного белков NS1 ВКЭ (штамм Со-фьин). Доказано, что неструктурный белок NS1 ВКЭ на поздней стадии инфекции способен образовывать комплекс с белком Е оболочки вирионов.

Практическая значимость работы. Полученные результаты показали отсутствие корреляции между формой заболевания клещевым энцефалитом и развитием гуморального иммунного ответа. Обнаружение в сыворотках и спинномозговых жидкостях больных специфичных антител к неструктурным белкам ВКЭ предполагает возможность использования этих антител в качестве новых маркеров для диагностики клещевого энцефалита. Полученные МКА используются в лабораторных исследованиях для изучения свойств неструктурных белков ВКЭ.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Результаты работы представлены на международной научной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами" (Иркутск, 1996 г.), научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 1998 г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 131 странице, состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы и содержит 28 рисунков и 13 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Иммуногенность белков ВКЭ для людей

1.1. Гуморальный иммунный ответ в сыворотках крови больных клещевым энцефалитом

Индукция иммунного ответа неструктурными белками ВКЭ ранее не изучалась из-за малых количеств и сложности выделения индивидуальных вирусных белков из инфицированных клеток. Для исследования антигенных и иммуногенных свойств белков ВКЭ нами был применён метод иммуноблотинга, преимуществами которого являются детекция иммунных комплексов в сложных многокомпонентных смесях без предварительной очистки антигенов и возможность одновременного выявления спектра антител к различным вирусным антигенам.

Было исследовано 120 сывороток крови больных клещевым энцефалитом Новосибирской, Омской, Иркутской областей и Хабаровского края методом иммуноблотинга и сыворотки 20 доноров, ранее не вакцинированных против ВКЭ. У 43 пациентов была лихорадочная форма заболевания, у 53 - менингеальная, у 12 человек - менингоэнцефалитическая; 4 человека были с хроническим течением инфекции. Диагнозы заболевания клещевым энцефалитом были подтверждены клиническими эпидемиологическими данными, реакцией торможения гемагглютинации (РТГА) и ИФА. Возраст больных варьировал от 4 до 84 лет.

Оказалось, что не только структурный белок Е, но и большие NS5, NS3, NS1 и малые NS2A и NS4B неструктурные белки вызывают образование специфических антител (рис.1).

Рис. 1. Результаты иммуноблотинга сывороток крови больных клещевым энцефалитом.

Номер 1 - белки из незараженных клеток СПЭВ, номер 2 - белки зараженных ВКЭ клеток СПЭВ. Слева указаны положения маркеров молекулярных масс белков ("Sigma", США). Справа (схематично) -результаты иммунологического окрашивания белков ВКЭ поликлональными антителами к белкам ВКЭ из гипериммунной асцитной жидкости (ИАЖ) мыши. Буквы (А, Б, В, Г и Д) соответствуют результатам иммуноблотинга сывороток разных больных клещевым энцефалитом.

Так, в сыворотке А обнаруживали антитела к белку NS5. Сыворотка Б содержала антитела к белку NS3. В сыворотке В присутствовали антитела к большим белкам NS3 и NS1 и малым NS4B и NS2A. В сыворотке Г были выявлены антитела к белкам Е и NS1. Антитела сыворотки Д взаимодействовали с низкомолекулярными

12 12 12 12 12

116К—

54К-

4S5K-

У "ТС

2&6К"

Г

-îîSS

- NS3

1 - F ! -NS1 : -NS4B ■ "NS2A

А Б В Г Д

вирусными белками. Сравнение полученных результатов не выявило преобладания антител к структурному белку Е и неструктурному гликопротеину NS1, находящимся на поверхностях вирионов и заражённых клеток, соответственно, по сравнению с антителами к другим неструктурным белкам ВКЭ. Следовательно, антитела к вирусным неструктурным белкам составляли значительную долю в суммарном гуморальном иммунном ответе против ВКЭ. Поскольку неструктурные белки образуются только в инфицированных клетках и отсутствуют в вирионах, то с клетками иммунной системы непосредственно не взаимодействуют. По-видимому, лизис части зараженных клеток приводит к выходу неструктурных белков и индукции гуморального иммунного ответа организма хозяина. Вероятно, появление антител к различным белкам флавивирусов без преобладания какого-нибудь из них является ответом организма хозяина на лизис зараженных клеток до завершения созревания вирионов.

Антитела против белков ВКЭ были обнаружены через 8-70 дней после начала заболевания при острой форме инфекции. При хроническом клещевом энцефалите наблюдалось присутствие вирусспецифичных антител класса IgM в течение года и отсутствие детектируемых количеств иммуноглобулинов класса IgG. Существенных отличий в спектрах гуморального иммунного ответа на антигены ВКЭ между мужчинами и женщинами, а также лицами разных возрастных групп не было обнаружено.

1.2. Определение специфических антител к белкам ВКЭ в спинномозговых жидкостях больных клещевым энцефалитом

Согласно литературным данным нейротропный ВКЭ способен размножаться в клетках центральной нервной системы и поэтому возможно появление противовирусных антител не только в крови, но и в спинномозговых жидкостях больных. Методом иммуноблотинга было исследовано 63 спинномозговые жидкости больных клещевым энцефалитом Новосибирской, Омской, Иркутской областей и Хабаровского края и 4 спинномозговые жидкости больных другими заболеваниями.

Антитела к неструктурным белкам ВКЭ были выявлены впервые нами в спинномозговых жидкостях больных клещевым энцефалитом (рис. 2Б, дорожка 4). Несмотря на полную идентичность используемых в обоих случаях методов анализа, спектры выявляемых антител к вирусным белкам в спинномозговых жидкостях не совпадали с таковыми в сыворотках крови одних тех же больных при инфекции ВКЭ. На рисунке 2 показано, что антитела спинномозговой жидкости больного взаимодействали с двумя вирусными белками - NS1 и низкомолекулярным белком (дорожка 2Б). В то же время антитела сыворотки крови того же больного были специфичны к более широкому спектру вирусных белков: NS3, Е и нескольким более низкомолекулярным белкам, часть из которых, возможно, представлена укороченными формами белка NS1 (рис. 2А, дорожка 2).

кДа

116

84 58 48,5

36.5

26.6

1 2

■

I

Б

3 4 1

Рис. 2. Сравнение гуморального иммунного ответа против белков ВКЭ в сыворотке крови и спинномозговой жидкости больного клещевым энцефалитом.

Л - сыворотка крови. Б - спинномозговая жидкость. Номера 1, 3 соответствуют нитроцеллюлозным фильтрам с иммобилизованными белками контрольных незараженных клеток СГ1ЭВ. Номера 2, 4 - фильтрам с белками зараженных ВКЭ клеток СПЭВ. Стрелками слева указаны подвижности маркерных белков.

Анализ полученных данных не выявил корреляции между формой заболевания (лихорадочная, менингеальная или менингоэнцефалитичеекая) и наличием антител, специфичных к индивидуальным вирусным белкам или группе белков ВКЭ. Известно, что тяжесть течения инфекции зависит от степени поражения лим-фоидной системы хозяина ВКЭ. Ключевое значение на ранней фазе инфекции имеют клеточные реакции иммунитета. По-видимому, выявление только антител, специфичных к антигенам ВКЭ, при определении патогенетических возможностей вируса недостаточно. Вероятно, необходимо определение антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов.

Анализ сывороток доноров и спинномозговых жидкостей больных другими инфекционными заболеваниями, а не клещевым энцефалитом, показал отсутствие антител к белкам ВКЭ. Это свидетельствует о высокой специфичности применяемого нами метода, а также о возможности использования в качестве диагностических маркеров при заболевании клещевым энцефалитом наряду со специфичными антителами к белку Е оболочки ВКЭ, и специфичных антител к неструктурным белкам.

2. Получение МКА к неструктурным белкам ВКЭ 2.1. Иммунизация

Поликлональные антитела сывороток крови и спинномозговых жидкостей больных отличаются исключительной гетерогенностью как по распознаваемому репертуару антигенов, так и по эпитопам. Для детального изучения механизмов иммунного ответа, направленного против ВКЭ, необходим переход к модельной

системе, состоящей из гомогенных МКА, способных узнавать один эпитоп в сложной структуре антигена.

Поскольку ВКЭ является высоковирулентным вирусом для мышей линии BALB/c, то для предотвращения возможной гибели иммунизированных животных в результате введения вируса, их предварительно иммунизировали очищенным белком Е для создания защитного иммунитета. Затем вводили внутрибрюшинно 20%-ную мозговую суспензию инфицированных мышей-сосунков. Первую гибридизацию с миеломной линией SP2/0-Agl4 проводили через 41 день. Было отобрано 5 гибридом, образующих МКА к неструктурным белкам. Более длительные сроки иммунизации (55 дней) и использование миеломной линии клеток NSl-Ag4/l позволили отобрать 16 клонов, секретерующих МКА к неструктурным белкам ВКЭ. Таким образом, всего в результате двух гибридизаций был отобран 21 клон, стабильно продуцирующий МКА к неструктурным белкам ВКЭ.

2.2. Антигенная специфичность полученных МКА

При первой гибридизации клоны клеток, секретирующие МКА, отбирали методом иммуноблотинга. Белки клеточных лизатов разделяли в градиентном 725% SDS-ПААГ. Пробы перед нанесением на гель прогревали. Выявление иммунных комплексов проводили при помощи антител кролика, специфичных к суммарным иммуноглобулинам мыши, коньюгированными с пероксидазой хрена. При второй гибридизации МКА к неструктурному белку NS1 отбирали методом ПИФА с использованием гликопротеина NS1, выделенного аффинной хроматографией с использованием иммобилизованных МКА 4С4, полученных в результате первой гибридизации. Примеры выявления некоторых МКА методом иммуноблотинга приведены на рисунке 3. Из полученных МКА 4 взаимодействовали с вирусным белком NS1 с молекулярной массой 49 кДа (дорожки 7, 8). 5 МКА взаимодействовали с белком, молекулярная масса которого (69 кДа) соответствовала белку NS3 (доржки 5, 6), 1 клон (дорожки 3, 4) секретировал МКА к белку с молекулярной массой 100 кДа (NS5) и один клон - МКА к низкомолекулярному белку NS4B (27,7 кДа) (дорожки 9,10).

Результаты пятенного иммуноферментного анализа (ПИФА) определения некоторых МКА, специфичных к нагивному белку NS1, представлены на рисунке 4. Обратные титры всех 14 МКА к белку NS1 в асцитных жидкостях находились в диапазоне от 1x10й до 1 х 107 за исключением МКА 25F4 с титром около 2х105. Активность МКА в ПИФА лишь в некоторых случаях превышала активность поли-клональных антител. Полученные результаты позволяют сделать вывод об иммуно-генности белков ВКЭ в организмах млекопитающих, а именно людей и мышей.

Таким образом, данные схемы иммунизации позволили получить МКА к различным белкам ВКЭ, а также широкую панель специфичных антител к глико-протеину NS1. Полученные МКА преимущественно относились к подклассу IgGl. Получение иммуноглобулинов, содержащих другой изотип константного участка тяжелых цепей, по-видимому, затруднено при использовании таких схем иммунизации.

кДа

116,0 84,0

58,0 48,5

36.5

26.6

12 34 56 78 9 10

Рис. 3. Определение специфичности МКА, направленных к неструктурным белкам ВКЭ.

Полоски 1, 2 - ИАЖ; 3, 4 - МКА 23G2 к белку NS5; 5, 6 - МКА 18В2 к белку NS3; 7,8 - МКА 4С4 к белку NS1; 9, 10 - МКА 27D8 к белку NS4B. Нечетные номера обозначают нитроцеллюлозные фильтры с иммобилизованными белками клеток, зараженных ВКЭ, четные номера - незараженных клеток. Слева стрелками указаны положения маркеров молекулярных масс белков.

Титры МКА 10 J

10"

10

1 2 3 4 5 6

Рис. 4. Определение DOB000®S®eB® специфичности МКА к

неструктурному белку NS1 О 0000000®®®® методом ПИФА.

OQ300SËES0S0 ПИФА проводили в 2-х

повторах. Под номером 1 0 Р о D S В 3 Э В 0 Э S представлены результаты

иммунологического титрова-П П Q О О Q 0 0 £ 0 3 0 1ШЯ отрицательного контроля

-среды IMDM; 2 - МКА 25F4; OnOODDOODOaD 3 - положительный контроль

- ИАЖ, специфичная к белкам ВКЭ; 4 - МКА 20В4; 5 - 17СЗ; 6 - 29G9. К - результаты ПИФА без добавления МКА (контроль на неспецифическое связывание конъгогата с иммобилизованным белком NS1 ВКЭ). Слева указаны разведения МКА.

10" 107 К

3. Выделение белка NS1 методом аффинной хроматографии на сефарозе CL-4B с полученными иммобилизованными МКА.

Неизвестность функций и способность неструктурного гликопротсипа NS1 вызывать защитный иммунный ответ у млекопитающих обусловили выбор его для дальнейшего исследования. Аффинная хроматография на иммуносорбентах позволяет выделять целевые белки из сложных смесей, содержащих большое количество примесных белков, с минимальными изменениями их нативных структур и биологических свойств. Для выделения белка NS! методом аффинной хроматографии использовали специфичные МКА, которые иммобилизовали на активированную бромцианом сефарозу CL-4B. Экспериментальной проверкой различных МКА к белку NS1 было показано, что в большинстве случаев ковалентное присоединение МКА к сефарозе приводило к частичной или полной потере антителами способности связывать антиген. Активность сохраняли МКА 4С4. При иммобилизации на 1 мл активированной сефарозы 6-8 мг МКА иммуносорбент был способен извлекать из вирус-содержащей культуральной среды до 1,5 мг белка NS1. Профили стандартных хроматограмм, построенные по результатам иммуноферментного титрования гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ, приведены на рисунке 5.

Обратные титры ИФА ^

105

104

10

102

Рис. 5. Результаты аффинной хроматографии с использованием МКА 4С4. Линия -<>-0~ соответствует результатам ИФА с МКА против белка Е ВКЭ. Кривая показывает

результаты ИФА с МКА, направленными к белку N81.

3 6 9 12 Номер фракции.

После аффинной хроматографии с применением иммобилизованных МКА 4С4, направленных к белку NS1, образец помимо целевого белка NS1 содержал также и структурный гликопротеин Е. Содержание белка Е составляло около 10% от неструктурного гликопротеина NS1 по данным ИФА. В связи с этим возникла необходимость дальнейшей очистки белка NS1. Для этого проводили дополнительную аффинную адсорбцию полученого препарата с использованием иммобилизованных МКА, специфичных к белку Е ВКЭ. После второй стадии очистки содержание белка Е не првышало 0,2 - 0,5 %. Следует отметить, что пределы чувствительности ИФА по определению белков Е и NS1 ВКЭ практически совпадают (1,5-4,0 нг/мл

для Е и 1,5-2,0 иг/мл для NS1). Электрофорез в 10% SDS-ПААГ и последующий иммуноблотинг не выявляли белка Е в выделенном образце. Последующие аффинные хроматографии на этих сорбентах не приводили к дальнейшей очистке глико-протеина NS1.

4. Исследование свойств неструктурного белка NS1 ВКЭ. 4.1. Комплекс гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ.

Разделение белков образца, полученного в результате десорбции после второй аффинной хроматографии препарата белка NS1, проводили методом электрофореза в 10% SDS-ПААГ без предварительной обработки р -меркаптоэтанолом и прогревания. Последующий иммуноблотинг выявлял комплекс с молекулярной массой около 110 кДа, который реагировал с МКА, специфичными к белкам NS1 и Е (рис. 6А). Наличие комплекса между белками Е и NS1 также подтверждали результаты ПИФА, при котором на твердую фазу сорбировали МКА, специфичные к белку Е, а выявление антигена проводили МКА, специфичными к белку NS 1. Следовательно, методами иммуноблотинга и ИФА было показано наличие комплекса белков Е и NS1 ВКЭ.

Известно, что белки флавивирусов образуются посредством расщепления единого полипротеина-предшественника под действием вирусных и клеточных протеаз. В соответствии с молекулярной организацией генома белки Е и NS1 находятся в непосредственной близости в полипротеине-предшественнике.

кДа 1 2 12

Рис. 6. Результаты иммуноблотинга элюатов после аффинной хроматографии с ¡5 Ш использованием МКА 14Д5, направленных

94 " к белку Е ВКЭ.

Пробы перед нанесением на 10% SDS-^ _ ПААГ не обрабатывали (3-меркапто-этано-

В лом и не прогревали, в Д. Дорожка 1 -иммуноблотинг с использованием МКА 4С4, специфичных к белку NS1.

Дорожка 2 - иммуноблотинг с использованием МКА 14D5, специфичных к белку Е ВКЭ.

Б. Пробы перед нанесением на 10% SDS- ПААГ обрабатывали Р-меркаптоэтано-лом и прогревали.

Дорожка 1 -иммуноблотинг с использованием МКА 4С4, специфичных к белку NS1.

Дорожка 2 - иммуноблотинг с использованием МКА 14D5, специфичных к белку Е. Слева указаны положения маркеров молекулярных масс белков.

Следовательно, наличие высокомолекулярного продукта может быть как следствием существования комплекса белков Е и NS1, так и присутствием не полностью процессированного белка-предшественника. Методом электрофореза в SDS-ПААГ с последующим иммуноблотингом показано наличие белков Е и NS1 ВКЭ в мономерных формах (рис. 6Б), что опровергает гипотезу о неполном расщеплении полипротеина-предшественника. Существование протеина-предшественника белков Е и NS1 в клетках насекомых показано для флавивирусов японского энцефалита, долины Мюррей, Канджин, Западного Нила и энцефалита Кокоберии.

Таким образом, комплекс белков Е и NS1 образован белками Е и NS1 ВКЭ, а не их предшественником.

4.2. Условия образования комплекса белков Е и NS1 ВКЭ.

Условия образования комплекса между гликопротеинами Е и NS1 были исследованы in vitro (рис. 7) в лизатах клеток млекопитающих и насекомых. Клетки лизировали смесью детергентов, содержащей 1% раствор дезоксихолата натрия, 1% раствор тритона Х-100, 0,1% раствор SDS. Смесь выделенных гликопротеинов Е и NS1 инкубировали без или с добавлением клеточных лизатов. Вирусные и клеточные белки разделяли при помощи электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях, без предварительной обработки проб р -меркаптоэтанолом и прогревания, с последующим иммуноблотингом с использованием МКА, специфичных к гликопротеину Е или гликопротеину NS1. Было показано, что смесь очищенных гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ не образует комплекса без добавления клеточных лизатов (рис. 7А, дорожка 3; рис. 7Б, дорожка 2).

Рис. 7. Оценка молекулярной массы комплекса гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ. А. Результаты иммуноблотинга с МКА 29G9, специфичными к белку NS1. Дорожка 1 - гликопротеины Е и NS1 после инкубации с лизатом зараженных клеток; 2 - гликопротеины Е и NS1 после инкубации с лизатом незараженных клеток; 3 - смесь гликопротеинов Е и NS1; 4 - лизат зараженных клеток.

Б. Результаты иммуноблотинга с МКА 14D5, специфичными к белку Е. Дорожка 1 - лизат незараженных клеток; 2 - смесь гликопротеинов Е и NS1; 3 - гликопротеины Е и NS1 после инкубации с лизатом незараженных клеток; 4 - гликопротеины Е и NS1 после инкубации с лизатом зараженных клеток.

Слева указаны положения маркеров молекулярных масс белков. Содержание вирусных белков в лизатах зараженных клеток было ниже уровня чувствительности данного метода.

A MKA29G9 Б MKA14D5 кДа 1 2 3 4 12 3 4

220 * "" >

!

9Г- 13, р ' *

j,,..; - ;

66-

При добавлении лизатов контрольных или инфицированных ВКЭ клеток млекопитающих (рис. 7А, дорожки 1,2; рис. 7Б, дорожки 3,4) наблюдали образование комплексов гликопротеииов Е и NS1. Полосы, выявляемые обоими типами МКА, специфичными к белкам Е и NS1, свидетельствуют об образовании высокомолекулярных комплексов гликопротеииов Ей NS1. Исходя из значений мол. масс, можно предположить, что комплекс с молекулярной массой около 110 кДа состоит из одной молекулы белка NS1 (49 кДа) и одной молекулы молекулы белка Е (58 кДа), а комплекс с молекулярной массой приблизительно 220 кДа, возможно, содержит по две молекулы белков NS1 и Е (рис. 7А, дорожки 1,2; рис. 7Б, дорожки 3,4). Комплекс с молекулярной массой около 110 кДа был выделен из культуральной жидкости клеток млекопитающих, инфицированных ВКЭ (см. рис. 6). Как показано выше, для образования комплекса белков Е и NS1 необходимы клеточные факторы. Для определения клеточных факторов лизаты клеток млекопитающих (зараженные ВКЭ или незараженные) или насекомых предварительно обрабатывали РНКазой А или проназой Е, с последующей инактивацией ферментов. К приготовленным лизатам клеток добавляли смесь гликопротеииов Е и NS1. Вирусные и клеточные белки разделяли методом электрофореза в 10% SDS-ПААГ без предварительной обработки проб ß-меркаптоэтанолом и прогревания. Затем проводили иммунобло-тинг с использованием МКА, специфичных к гликопротеинам Е и NS1. Предварительная инкубация клеточных лизатов с РНКазой А не влияла на образование комплекса гликопротеииов Е и NS1 in vitro, в то время как добавление проназы к лизатам клеток с её последующей термической инактивацией препятствовало формированию комплексов вирусных белков Е и NS1. По-видимому, клеточные факторы, способствующие образованию данного комплекса, были белками.

Экспрессия гена NS1 ВКЭ в составе плазмидной ДНК pUR290(NSl)2, полученной ранее в нашей лаборатории, приводила к синтезу рекомбинантного белка NS1 в трансформированных клетках Escherichia coli. Однако образование комплекса между индивидуальным рекомбинантным белком NS1 и нативным гликопротеином Е не наблюдали даже при добавлении клеточных лизатов (рис. 8А, дорожки 3,4; рис. 8Б, дорожки 3,4), несмотря на появление комплексов белка Е, по-видимому, с клеточными белками и гомодимеров гликопротеина Е (рис. 8Б, дорожки 3,4).

Возможность образования комплексов гликопротеииов Е и NS1 можно объяснить способностью этих белков к олигомеризации, которая у белка NS1 обусловлена олигосахаридами, которые присоединяются по а.о. Asn в последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X - любая аминокислота, кроме а.о. Pro. Отсутствие гликозилирования рекомбинантного белка NS1, возможно, приводит к нарушению его конформации, необходимой для взаимодействия с белком Е или к нестабильности комплекса, поскольку известно, что стабильность димерной формы гликопротеина NS1 связана с наличием углеводов.

A MKA29G9 Б МКА 14D5 1 2 3 4 12 3 4

"W

кДа 116 84 58 48,8 36,5

Рис. 8. Образование комплекса гликопротеина Е и рекомбинантного белка NS1 ВКЭ in vitro.

А. Результаты иммуноблотинга с использованием МКА 29G9, специфичных к белку NS1 ВКЭ.

Дорожка 1 соответствует рекомбинантному белку NS1. 2 -смесь рекомбинантно-гого белка NS) и гликопротеина Е после инкубации. 3 - рекомбинантный белок NS1 и гликопротеин Е после инкубации с лизатом незараженных клеток. 4 - рекомбинантный белок NS1 и гликопротеин Е после инкубации с лизатом зараженных клеток.

Б. Результаты иммуноблотинга с использованием МКА 14D5, специфичных к белку Е ВКЭ.

Дорожка 1 - гликопротеин Е, дорожка 2 - смесь рекомбинантного белка и гликопротеина NS1, дорожка 3 - рекомбинантный белок NS1 и гликопротеин Е после инкубации с лизатом незараженных клеток, дорожка 4 - рекомбинантный белок NS1 и гликопротеин Е после инкубации с лизатом зараженных клеток, дорожка 5 - лизат незараженных клеток. Справа указаны маркеры молекулярных масс белков.

4.3. Локализация комплекса белков E-NS1 ВКЭ.

Для определения локализации комплекса гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ исследовали его наличие в заражённых клетках и культуральной жидкости через 16, 24 и 48 часов после инфекции. Внутриклеточный комплекс, возможно, ассоциирован с мембранами. Поэтому для лизиса клеток использовали забуференную смесь 1% раствор дезоксихолата натрия, 1% раствор тритона Х-100 и 0,1% раствор SDS (буфер А) или 0,5% NP-40 (буфер Б). Клеточные лизаты и комплекс белков Е и NS1, выдслешшый из культуральной ж пакости инфицированных ВКЭ клеток СПЭВ с помощью аффинной хроматографии, через различное время после заражения, анализировали методом электрофореза в 10% SDS-ПААГ без предварительного нагревания проб и обработки Р-меркаптоэтанолом. После разделения белков проводили иммуноблотинг. В качестве первых антител использовали гипериммунную асцитную жидкость мыши, специфичную к белкам ВКЭ. Для прояв-

ления иммунных комплексов использовали антитела козы, специфичные к IgG мыши, копыогировапные со щелочной фосфатазой. На рисунке 9 представлены результаты иммуноблотинга комплекса гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ из культу-ральной жидкости (дорожки 1-4) и клеток (дорожки 5-8), инфицированных ВКЭ, через различное время после заражения.

В условиях частично денатурирующего электрофореза помимо мономерной формы белка NS1 с молекулярной массой около 49 кДа и его димерной формы с молекулярной массой приблизительно 98 кДа можно было наблюдать появление более высокомолекулярного комплекса (рис. 9, дорожка 4) в культуральпой жидкости через 48 часов после заражения. Сравнение дорожек 3-4 и 6-8 показало, что на поздней стадии инфекции преобладает внеклеточная форма комплекса белков Е и NS1, несмотря на присутствие данных гликопротеинов в клетках в мономерной форме. Хотя белки Е и NS1 ВКЭ в индивидуальном состоянии присутствуют в клетках через 24 часа после заражения, мы не обнаружили внутриклеточный комплекс методом иммуноблотинга даже спустя 48 часов после инфекции (рис. 9, дорожка 8). В то же время, в культуральпой жидкости через 48 часов после инфекции мы наблюдали накопление комплекса (рис. 9, дорожка 4).

кДа

116,0 84,0

48,5

Рис. 9. Иммуноблотинг комплекса гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ из культуральпой жидкости и клеток, инфицированных ВКЭ, через различные времена после заражения.

Дорожки 1-4 представляют результаты иммуноблотинга комплекса из культуральпой жидкости после аффинной хроматографии на сефарозес иммобилизованными МКА против белка NS1 ВКЭ. Дорожка 1 - культуральная жидкость незараженных клеток; дорожки 2-4 - культуральные жидкости клеток через 16, 24 и 48 ч после заражения, соответственно.

Дорожки 5-8 представляют результаты иммуноблотинга лизатов незараженных (дорожка 5) и зараженных ВКЭ клеток - через 16 часов (дорожка 6), 24 часа (дорожка 7) и 48 ч после инфекции (дорожка 8). Слева указаны положения маркеров молекулярных масс белков.

Комплекс белков Е и NS1 ВКЭ был обнаружен не только в клеточных культурах, но и у больных клещевым энцефалитом. Для получения клеточных лизатов к лимфоцитам крови добавляли буфер А. Разделение клеточных и вирусных белков проводили методом электрофореза в 10% SDS-ПААГ в денатурирующих условиях, к пробам не добавляли (3-меркаптоэтанол и не прогревали. Последующий иммуноблотинг проводили с использованием антисыворотки кролика, специфичной к белку NS1 (рис. 10А, дорожки 1,2) и МКА, направленных к белку Е (рис. 10А, дорожки 3,4).

Рис. 10. Детекция комплекса гликопротеинов Е и NS1 ВКЭ в крови больных клещевым энцефалитом. А Иммуноблотинг мононуклеарной фракции клеток крови (дорожки 1, 3) и сыворотки человека (дорожки 2, 4). Дорожки 1,2- результаты иммунобло-тинга с использованием антител кролика, специфичных к белку NS1 ВКЭ. Дорожки 3, 4 - результаты иммун-облотинга с использованием МКА мыши, направленных к белку Е ВКЭ. Выявление иммунных комплексов проводили антителами козы, специфичными к IgG мыши и коньюгированными с щелочной фосфатазой. Слева указаны подвижности маркеров молекулярных масс белков.

kDa

220 —

97.4 — 66 — 46 —

3 4

30 • 21.514.3

Б - ПИФА комплекса белков Е и NS1 ВКЭ в сыворотках крови больных клещевым энцефалитом.

ПИФА проводили в 2-х повторах. Номера 1-6 представляют результаты титрования сывороток крови больных клещевым энцефалитом; 7-9 - сывороток крови здоровых доноров; К - результаты ПИФА без добавления сыворотки (контроль на неспецифическое связывание). На нитроцеллюлозные фильтры сорбировали МКА 2НЗ, специфичные к белку Е, выявление комплекса гликопротеинов Е и NS1 проводили МКА 4С4, специфичными к белку NS1. * - разведения исследованных сывороток.

В дорожках 2 и 4 (рис. 10) наблюдали появление полос в районе 110 кДа, которые окрашивались как МКА к белку NS1, так и МКА к белку Е, что указывает на наличие комплекса белков Е и NS1. Отсутствие специфического окрашивания в лизатах

Б

1 23456789 К };JJJ* ШВЕИ ШЕИ ш m Ш Ш Ш OD

!;„" ви ш m в ш ш m оо со

1--5(" □□ЕИССШСОШШСОШ

лимфоцитов, по-видимому, свидетельствует об отсутствии вирусных белков. При исследовании локализации комплекса в крови больных клещевым энцефалитом было обнаружено, что комплекс белков Е и NS) выявлялся в сыворотках крови и не обнаруживался в лимфоцитах (рис. ЮЛ и Б). Функции комплекса белков Е и NS1 ВКЭ можно предположить на основании известных свойств составляющих его субъединиц. Показано, что белок Е является отрицательным регулятором репликации, а белок NS1 в зараженных флавимрусами клетках обнаруживается в непосредственной близости от двухцепочечной репликативной формы. Однако секреция комплекса на поздней стадии инфекции исключает участие данного комплекса в репликации вируса. Возможно, внеклеточная локализация комплекса основных вирусных антигенов Е и NS 1 приводит к индукции преимуществено гуморального иммунного ответа и к конкуренции за специфичные антитела с внеклеточными вирионами. Необходимо отметить, что антигенный район 375-471 а.о. домена Е2 белка Е ВКЭ, находящийся в области взаимодействия с антителами, нейтрализующими ВКЭ, не участвует в формировании комплекса, так как белок Е в составе комплекса был выявлен нейтрализующими МКА 14D5 и МКА 2НЗ.

Таким образом, комплекс белков Е и NS1 обнаруживается при развитии клещевого энцефалита как в перевиваемых клеточных культурах, так и в организме человека. По-видимому, это способствует сохранению ВКЭ в организме хозяина.

4.4.1. Антигенные детерминанты гликопротеина NS1.

При иммунизации нативным белком образуются антитела, специфичные к нативным эпитопам белка. Основную часть МКА, специфичных к белку NS1, отбирали с использованием нативной секретируемой формы гликопротеина NS1 (8 из 12) методом ПИФА. 4 вида МКА (4С4, 16В1, 17СЗ, 20В4) выявляли методом им-муноблотинга. Следовательно, необходимо было дополнительно исследовать с помощью этих двух методов взаимодействие МКА, специфичных к белку NS1, с внутриклеточной и внеклеточной формами гликопротеина NS1. При иммунобло-тинге в качестве антигена использовали белки зараженных ВКЭ клеток. Пробы перед нанесением на 7-25% градиентный SDS-ПААГ гель прогревали. В качестве антигена для ПИФА использовали нативный гликопротеин NS 1 ВКЭ, очищенный аффинной хроматографией, который сорбировали на нитроцеллюлозные фильтры. Для выявления иммунных комплексов использовали антитела кролика, специфичные к суммарным иммуноглобулинам мыши, коныогированные с пероксидазой хрена. Результаты взаимодействия МКА с белком NS1 представлены на рисунке 11.

При электрофорезе в SDS-ПААГ наблюдается денатурированная форма белка NS1 с молекулярной массой 49 кДа. С внутриклеточной формой белка NS1 взаимодействовало большинство МКА (6 из 8), специфичных к внеклеточной форме гликопротеина NS1 (рис. ПА и Б, дорожки 7-12). Это свидетельствует об устойчивости антигенных детерминант нативного секретируемого белка к денатурирующим условиям и нагреванию. Кроме того, МКА, которые отбирали с использованием денатурированной внутриклеточной формы белка NS1 (рис. 11А и Б, дорожки З-б), взаимодействовали с секретируемым гликопротеином NS1 в нативных условиях. Исключение составляли эпитопы для МКА 22G8 и 25Н10 (рис. 11А,В дорожки 1, 2). Данные МКА взаимодействовали с нативным гликопротеином NS1

только в ПИФА и не связывались с денатурированным белком при иммуноблотин-ге, что свидетельствует об их направленности к конформационным эпитопам. Таким образом, исследование взаимодействия полученных МКА с гликопротеином NS1 выявило конформационные антигенные детерминанты для МКА 22Е8 и 25Н10 и линейные эпитопы для всех других МКА. По-видимому, иммунный ответ против белка NS1 ВКЭ был направлен преимущественно к линейным антигенным детерминантам.

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 аб аб аб аб аб аб аб аб аб аб аб аб аб

^№5 ■4- NS3

NS1

яз в J a s ir $ "з $ Ф

Рис. 11. Анализ взаимодействия МКА с белком NS1 ВКЭ.

А - Результаты иммуноблотинга с иммобилизованными белками заражённых ВКЭ клеток СПЭВ.

Дорожки а - белки контрольных незараженных клеток СПЭВ. Дорожки б - белки заражённых ВКЭ клеток СПЭВ.

Дорожки 13 (а б) - результаты иммуноблотинга с поликлональными полиспецифичными антителами к белкам ВКЭ из гипериммунной асцитной жидкости мыши. Справа обозначены положения вирусных белков.

Б. - Результаты ПИФА.

1. - МКА 22Е8, 2. - 25Н10, 3. - 4С4, 4. - 16В1, 5. - 17СЗ, 6. - 20В4, 7. - 22G8, 8 -22Н8, 9. - 25А8, 10. - 25Е7, И. - 29G9, 12, - 29F10, 13. - ИАЖ, специфичная к белкам ВКЭ.

В реакции диффузной преципитации в агаре (РДПА) гликопротеин NS1 не давал полос преципитации со специфичными МКА, что можно объяснить растворимостью комплексов антиген-антитело. По-видимому, нативный белок NS1 ВКЭ

является моновалентпым антигеном по отношению к МКА. Это позволяет предположить отсутствие повторяющихся антигенных детерминант у гликопротеина NS1.

4.4.2. Антигенные детерминанты рекомбинантного белка NSI.

Взаимодействие рекомбинантного белка, выделенного из клеток Escherichia coli, трансформированных ллазмидой pUR290(NSl)2 с МКА, специфичными к нативному гликопротеину NS 1, исследовали методом иммуноблотинга. Результаты иммуноблотинга представлены на рисунке 12.

1 - j :

' :ы

- I Ч ! I

I A4 :i , I И ii

Î. Ч ; I Ч ' i ' У < I lî ! H ,1

« V Ws. ■ ■* У vw Si \

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12

.39 кДа

Рис. 12. Результаты иммуноблотинга рекомбинантного белка NS1 ВКЭ с различными МКА, специфичными к гликопротеину NS1 ВКЭ. Цифры соответствуют следующим МКА: 1 - 4С4, 2 - 20В4, 3 - 29F10, 4 -29G9, 5 - 25Е7, 6 - 25F4, 7 - 25А8, 8 -16В1, 9 - 22Н8, 10 - 22Е8, 11 - 17СЗ, 12 - без МКА. Электрофорез проводили в 10% SDS-ПААГ в денатурирующих условиях. Выявление иммунных комплексов проводили антителами козы, специфичными к суммарным иммуноглобулинам мыши и конъюгированны-ми с пероксидазой хрена.

Было показано, что все исследованные МКА связывались с антигенными детерминантами генноинженерного аналога этого белка (рис. 12). Таким образом, эти МКА взаимодействовали с нативным секретируемым гликопротеином (Рис.11 Б), внутриклеточной формой денатурированного гликопротеина (Рис.11 А) и денатурированной формой рекомбинантного белка NS1 (Рис.12). Поскольку ре-комбинантный белок не гликозилирован, а МКА связываются с ним, следовательно, все исследованные МКА взаимодействуют именно с белковой частью молекулы. Аналогичные результаты были получены ранее и для белка Е ВКЭ. Эпитопы рекомбинантного белка NS1 для МКА определяются, в первую очередь, аминокислотной последовательностью белка NS1 и являются линейными. Согласно неопубликованным данным, полученным в нашей лаборатории, эти МКА взаимодействовали с фрагментом рекомбинантного белка NS1. Фрагмент белка, кодируемый рекомбинантной плазмидной ДНК pUR290(NSl)dell, содержал 268 N-концевых а.о. и 19 а.о. от С-конца белка, и делецию средней части размером 64 а.о. Он взаимодействовал со всеми исследованными МКА, за исключением МКА 20В4, как предполагают, антигенная детерминанта этого МКА, возможно, расположена в области делеции. Этот факт дополнительно указывает на то, что антигенные детерминанты нативного секретируемого белка NS1, взаимодействующие с МКА, являются преимущественно линейными.

Иммунологические исследования гликопротеина NSI ВКЭ и его генно-инженерных аналогов были также проведены с использованием поликлональных антител. Экспрессия гена NSi ВКЭ в составе плазмидной ДНК pUR290SAE полученной ранее в нашей лаборатории, приводила к синтезу химерного белка Р-галактозидаза-NSl' в трансформированных клетках Е. coli. Для получения антисывороток была проведена иммунизация кроликов химерным белком Р-галактозидаза-NSl', выход которого составляет 80 мг белка на 1012 клеток Е. coli. В качестве антигена в ИФА использовали индивидуальный рекомбинантный белок NS1, очищенный из трансформированных плазмидой pUR290(NSl)2 клеток E.coli. При взаимодействии антисывороток кролика, специфичных к химерному белку Р-галактозидаза-NSl ', с индивидуальным рекомбинантным белком NS1 были выявлены высокие значения титров в ИФА, что свидетельствует о сходстве этих двух антигенов (табл. 1). Подобие антигенных детерминант рекомбинантных белков Р-галактозидаза-NSl' и NS1 также подтверждается РДПА.

Иммуноферментное титрование антисыворотк&чи кролика, специфичными к гликопротеину NS1, индивидуального рекомбинантного белка NS1 также выявило высокие титры связывания этого антигена с гетерологичной сывороткой (табл. 1 II).

Таблица 1. Иммуноферментное титрование антисывороток, специфичных к гликопротеину NS1 и соответствующему рекомбинантному белку (обратный титр разведения антисывороток).

антигены Р -галактозидаза рекомбинантный NS1 гликопротеин NS 1

сыворотки

I 10 2,6*106 1,0-107 1,6-106

11 2,6-106 1,0-107 1,6-106

13 1,0-107 1,0-107 6,5-105

652 4,0-10" 6,5-105 1,6-105

653 4,0-104 6,5-Ю5 4,0-106

654 1,0-104 1,6-105 4,0-106

666 1,6-105 6,5-105 2,5-Ю3

667 1,6-105 1,6-105 2,5-103

668 1,6-105 6,5-105 1,0-Ю4

681 2,6-10" 2,6-105 1,6-105

682 6,5-105 6,5-105 4,0-104

II 15 0 1,2-05 6,4-105

17 0 6,0-105 6,0-105

18 0 3,0-105 1,5-105

655 0 1,0-104 1,6-105

656 0 7,5-103 6,4-105

662 0 3,0-Ю4 1,5-105

I - иммунизация химерным белком Р-галактозидаза-ШГ; П- иммунизация глико-протеином NS1.

Кроме того, высокие титры разведений антисывороток кролика, специфичных к химерному белку -галактозидаза-NSl '; выявляемые при взаимодействии с нативлым гликопротеином NS1, свидетельствуют о значительном перекрестном связывании нативного белка NS1 с гетерологичны-ми антисыворотками (табл. 1 I).

Таким образом, рскомбииантиый белок NS1, так же как и гликопротеин NS1 являются хорошими иммуногенами. Антигенные детерминанты гликопротеи-на NS1 и его негликозилировапных генноинженерных аналогов являются сходными, что подтверждается перекрестным взаимодействием этих антигенов с гипериммунными антисыворотками и МКА.

ВЫВОДЫ.

1. Методом иммуноблотинга показано, что белки вируса клещевого энцефалита обладают иммуногенными свойствами независимо от их молекулярных масс, функции и локализации. Обнаружено отсутствие корреляции между формой заболевания и наличием антител к определенным вирусным белкам или группе белков в сыворотках крови и спинномозговых жидкостях больных клещевым энцефалитом.

2. Получен ряд гибридных лимфоидных клеточных линий, секретирующих мо-ноклональные антитела к неструктурным белкам вируса клещевого энцефалита, из которых 14 направлены к гликопротеину NS1; 5 - к белку NS3; 1 - к белку NS5 и 1 - к белку NS4B.

3. Показано, что полученные моноклональные антитела могут быть использованы для создания иммуносорбентов. Методом аффинной хроматографии с иммобилизованными моноклональным антителами 4С4 к гликопротеину NS1 выделен комплекс белков Е и NS 1 вируса клещевого энцефалита из культураль-ной жидкости зараженных клеток млекопитающих на поздней стадии инфекции. Комплекс гликопротеинов Е и NS1 выявлен в сыворотках крови больных клещевым энцефалитом.

4. Показано, что большинство антигенных детерминант гликопротеина NS1 вируса клещевого энцефалита являются линейными за исключением информационных эпитопов для моноклональных антител 25Н10 и 22G8.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Matveeva V.A., Popova R.V., Kvetkov? Е.А., Chernicina L.O., Zlobin V.I., Puchovskaya N.M., Morozova O.V. Antibodies against tick-borne encephalitis virus (TBEV) non-structural and structural proteins in human sera and spinal fluid. // Immunology Letters, 1995, v.46, p. 1-4.

2. Матвеева B.A., Добрикова Е.Ю., Цехановская H.A., Попова Р.В., Прессман Е.К., Караванов А.С., Матвеев Л.Э. Получение и свойства моноклональных антител к неструктурным белкам вируса клещевого энцефалита. // Вопросы вирусологии, 1998, т.50, N3, стр. 134-137.

3. Матвеева В.А., Бугрышева Ю.В., Бахвалова В.Н., Морозова О.В. Секреция гетерокомплекса гликопротеинов Е и NS1 вируса клещевого энцефалита на поздней стадии инфекции. // Вопросы вирусологии, 1997, т. 51, N 3, стр. 179182.

4. Pressman Е.К., Karavanov A.S., Matveeva V.A., Matveev L.E., Pugachev K.V., Vinogradova I.V. Comparative analysis of serological activity of non-structural protein (NS1) from tick-borne encephalitis virus and its analog expressed in bacterial cells. // Immunilogy Letters, 1993, v. 38, p. 173-178.