Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика микобактериальной популяции при саркоидозе и туберкулезе

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика микобактериальной популяции при саркоидозе и туберкулезе"



Сафонова Светлана Григорьевна

ХАРАКТЕРИСТИКА МИКОБАКТЕРИАЛЬНОИ ПОПУЛЯЦИИ ПРИ САРКОИДОЗЕ И ТУБЕРКУЛЕЗЕ

ОЗ.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Носква 19 9 8

- г -

Работа выполнена в Центральном научно - исследовательском институте туберкулеза Российской Академии медицинских наук

/

Научный консультант: - доктор медицинских наук

профессор В. И. Голшевская

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук

Т.Н. Большакова

- доктор медицинских наук Д. т. Леви

- доктор медицинских наук И. Е. Мазурова

Ведущая организация - научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им, н. Ф. Гамалеи РАНН

Зашита состоится "____" 1998г.

в "112-" часов на заседании диссертационного совета Д. 084.18.01 носковского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.н. Габричевского нз РФ ул. Адмирала Нахарова, д. 10)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Носковского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. г.н. Габричевского нз РФ

Автореферат разослан "_____" "________________"1998г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

Е. Н. Горская

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕНЫ

В связи с ростом показателя роста заболеваемости туберкулезом в настоящее время актуальным является совершенствование микробиологической диагностики заболеваний легких, в тон числе и саркоидоза органов дыхания.

Заболевание под названием "саркоидоз" или болезнь "Бенье-Бе-ка-Жаумана" в последние годы привлекает все больше внимания представителей самых различных медико-биологических специальностей, и особенно Фтизиатров. Саркоидоз хроническое системное заболевание, при котором поражаются в основном легкие и внутриг-рудные лимфатические узлы (БГЛУ) (Струков А. И., КауФман о. Я., 1989). Б последнее десятилетие многие авторы отмечают учашени£. случаев заболевания саркоидозом органов дыхания (ОД) (Хоменко А. Г., 1984; Костина з. и., 1984; Озерова Л. В. и соавт., 1987; James D. Y., 1988; Seville Е., 1988 и многие др.).

Диагностика саркоидоза часто вызывает серьезные трудности, поскольку это заболевание не имеет строго специфического комплекса симптомов, в то же время диагноз чаше устанавливается на

0/"тт/\пптттгтт т/ гтуттгг^/ч — плптплттл плштцллшпу ттптттттгр' ГГлт^лппттл гттл тлл mi-vuvod.xiixti ¿vrfiiicuxcw f^aii invdivi iiH^^ivn^x маишлА. uvivajauv» niv iw«ш

чество диагностических ошибок при саркоидозе колеблется от 60и до 90к (Соколова В. А. и соавт., 1983; Полетаев С. Д. и соавт., 1984; Хоменко А. Г. и соавт., 1984; Илькович н. н., ПутовН. В., 1986; Борисова Н. К., ДауровБ. И., 1988, 1991; Костина 3. И., 1989; Филиппов В.П. и соавт., 1989). Причинами столь частых ошибок является также большое гистологическое сходство саркоидозной и туберкулезной гранулемы, особенно образовавшейся в результате гематогенной диссемшашш. и нередкое обнаружение микобактерий туберкулеза,

как в тканях саркоидозной гранулемы, так и в различном диагностическом материале от больных саркоидозом (Хоменко А.Г., 1982, 1983; Голышевская В. И. и соавт., 1987, 1988; кьотепко А., 1988). Этиология саркоидоза и до настоящего времени остается неясной. Нногие авторы высказываются в пользу туберкулезной этиологии саркоидоза (Рабухин А. Е.. Доброхотова н. Н.. Тонитрова н. с., 1975; Голышевская В. й. и соавт, 1994, 1995, 1996; Гедымин Л. Е., Ерохин В. В., Хоменко А. Г. и соавт., 1995, 1996; БсЬагша О, ег. а1., 1970; Неигясьтап Н. ег. а1., 1977). Ряд авторов приводят данные о вирусном происхождении саркоидоза (Бса<ш11б •]., 1985; ННсЬеП Б. е!.. а1.» 1989) и о возможной совместной роли вируса и микобактерий туберкулеза. Вследствие противоречивости имеющихся данных об этиологии саркоидоза ряд специалистов придерживается мнения о полиэтиологической природе этого заболевания.

В литературе довольно широко освешен вопрос о роли типичных и измененных Форм микобактерий, включая ь-Формы и зернистые формы НБ е развитии саркоидоза (Хоменко А. Г. и соавт., 1983; Голышевская В.И. и соавт., 1988). Вместе с тем роль НБТ в этиологии саркоидоза до настоящего времени остается спорной.

Таким образом, изучение проблемы связанной с выделением зернистых Форм микобактерий у больных саркоидозом и туберкулезом, с последующим нзученкек к£ свойств является актуальной проблемой для научно-практической медицины.

Целью настоящего исследования явилось выявление и изучение особенностей микобактериальной популяции при саркоидозе и туберкулезе с использованием комплекса лабораторных методов.

Для выполнения поставленной пели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать новый состав жидкой питательной среды для культивирования измененных микобактерий,

2. Изучить биологические свойства микобактериальной популяции при саркоидозе и туберкулезе.

3. Охарактеризовать кислотоустойчивые никобактерии, выделенные от больных саркоидозом и туберкулезом с применением иммунологических и молекулярно-генетических методов.

4. Изучить биохимические свойства выделенных микобактерий с последующим определением лекарственной чувствительности к антибактериальным препаратам.

5. Провести сравнительный патоморФологический анализ органов экспериментальных животных после введения кислотоустойчивых микобактерий, выделенных из диагностического материала больных саркоидозом и туберкулезом.

Новизна - Создан комплекс лабораторных методов по выявлению и изучению зернистых Форм микобактерий. впервые охарактеризована микобактериальная популяция у больных саркоидозом.

Положения выносимые на защиту:

1. Разработанный комплекс методов микробиологического исследования диагностического материала позволяет выявить, выделить и изучить измененные Формы микобактерий.

2. Установлено, что у 57,37. больных саркоидозом выявляются зернистые Формы микобактерий и в 14 7. получена их реверсия.

3. Показано, что в 80 у. случаев выделенные микроорганизмы от больных саркоидозом относятся к роду Н. ШЬегси1оз1з,

- б -

4. Иммунологические, морфологические и генетические методь исследования позволили охарактеризовать структуру культур зернистых Форм микобактерий.

5. Частота лекарственной устойчивости, выделенных культур зернистых Форм от больных саркоидозом составляет 24. 5Х, от больных туберкулезом бох.

6. Установлено морфологическое сходство культур зернистая Форм микобактерии гистологическим и электронно-микроскопические методами.

7. Антигенная структура культур зернистых Форм микобактерий, выделенных от больных саркоидозом и туберкулезом,изученная с помощью иммуноблотпшга, имеет большое сходство по экспрессии эпи-топов: м на 19кДа. 30-25 кДа; 4Н4 на 16 кДа; юш на 19-20 кда, а также различие 1Р9 на 55 кДа.

Практическая ценность - заключается е создании комплекса методов выявления и выделения измененных Форн микобактерий из диагностического материала больных саркоидозом в туберкулезом, что позволяет повысить результативность диагностики саркоидоза.

Внедрение в практику - разработанный ком-комплекс микробиологической диагностики у больных саркоидозон и туберкулезом внедрен в работу отдела микробиологии ЦНИИТ РАНН. Выделенные культуры-ревертанта от больных саркоидозом и туберкулезом используются для научно-практической работы в отделах пато-морфологии и иммунологии ЦНИИТ РАНН.

Публикации но теме: По теме диссертационного исследования опубликованы 22 работ

Данные диссертационного исследования доложены:

1. На заседании городского научного обшества никробиологов, эпидемиологов и паразитологов им. И. И. Мечникова на секции микробиологии и иммунологии туберкулеза. 1993-1997 гг., Москва.

г. На Всероссийской научной конференции "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций управляемых специальными средствами профилактики", 1993 г., Пермь.

3. На IV, V и VI Национальных Конгрессах по болезням органов дыхания, 1994-1996 гг., Москва, Новосибирск.

4. На II и III Всероссийских съездах Фтизиатров, 1994, 1997, Носква, Екатеринбург.

5. На IV конференции московского обшества гемаФереза, 1996, Москва.

6. На XX Научно-практической конференции Фтизиатров г. Москвы, 1996, Москва,

7. На 18 Конгрессе Европейского обшества микробиологов Cordoba, 18th Annual Congress of the European Society of mucobaKteriology (ESV-97) Spain, 17-18 VI, 1997.

диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на .138 стр. машинописного текста, иллюстрирована ю фотографиями, 16 таблицами и 11 рисунками. В обзоре литературы использованы 103 отечественных и 92 зарубежных источников.

НАТЕРИАЛН И НЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящее исследование посвящено выделению и изучению мико-бактериальной популяции из диагностического материала от больных саркоидозом органов дыхания и внутригрудных лимфатических узлов (сод и ВГЛУ), и туберкулезом органов дыхания (ОД). В работе использованы методы по выявлению как типичных, так и измененных Форм никобактерий (НБ), разработанные в лаборатории микробиологии ЦНИИТ РАНН.

Для микробиологического исследования использовали различный диагностический материал (д. м.) от больных; кровь, БАС, мокроту, а также паренхиматозные органы экспериментальных животных.

Кровь, взятую из локтевой вены от больных стерильно, дополнительной обработке не подвергали, нокроту и ВАС обрабатывали 10/ раствором 3-х замешенного фосфорнокислого натрия.

Объектом исследования являлись также бактериальные штаммы, выделенные от больных СОД и ВГЛУ, туберкулезом. Всего был исследован диагностический материал от 314 больных СОД и ВГЛУ (кровь -от 152, мокрота - от 28, БАС - от 134) и от 290 больных туберкулезом (кровь - от 72, мокрота - от 88, БАС - от 130). Всего мик-

плйилплпттплттнтг Hftnwffnm Т»ИТ*ТТ#\ТТ ПТГП Т*1ТТ ну....... I Л у. Т*ТГТ> (1ПГЛЛП.(111 лш СЛИ

jfvuiWMVi nic^nnmi ncivHami irio/nca Ailai nv^ Ü14C.Uivim naicr/iau vi uui

больных легочной патологии.

В работе также, исследовали органы (печень, легкие, селезенка) 320 экспериментальных животных. Выделено всего 142 штамма никобактерий - 45 КУЛЬТУР от больных СОД и ВГЛУ и 97 КУЛЬТУРЫ от больных туберкулезом.

Для выявления типичных и измененных Форм никобактерий в диагностическом материале больных саркоидозом и туберкулезон, использовали метод люминесцентной микроскопии. Фиксированный мазок

- 9 -

окрашивали смесью ауранина и родамина.

Культуральное исследование проводили методом посева мокроты, крови. Бас и органов животных на плотные яичные питательные среды. Из питательных сред использовали: л-Иенсена, Финн-2. также разработан новый метод культуральной диагностики зернистых Форм микобактерий с использованием жидкой питательной среды.

Биологическое исследование проводили на морских свинках весом не менее 250 г., прошедших карантин. В качестве инокулята использовали различный диагностический материал: мокроту, бас, кровь. Нокроту и бас после "подращивания" на жидкой питательной среде центрифугировали, осадок засевали на плотные питательные среды, одну каплю использовали для приготовления мазка и 0. 5 мл осадка вводили в правую паховую область подкожно морским свинкам.

Для изучения структуры и идентификации выделенных культур микобактерий от больных саркоидозом и туберкулезом, была получена бактериальная масса. Нарашвание биомассы проводили в два этапа с использованием различных питательных сред.

Первый этап заключался в получении бактериальной пленки на картофельной среде Петроньяни, второй этап - в получении бактериальной пленки на жидкой питательной среде. В качестве жидкой среды использовали синтетическую питательную среду Сотон.

Arm о ттА пглтттжл ггдтдпп/чпплттлтг пттп/чтоттп гтт пл/тпп ппяа frontiTIV mmou-#ic.r.a.f ч- jl ocuxivix ~iv ov i uin^tivuvv i д uumw»iч^алхаа«л шхип

мов проводили методом абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левешггейна-Иенсена согласно приказу Н556 из СССР.

Для дифференциации атипичных микобактерий использовали методики, рекомендованные Приказом Н 558 ИЗ СССР и ряд сред и методик американской схемы определения микобактерий (Mycobacterial culture collection, 1980). Для дифференциации микобактерий туберкулеза человечьего и бычьего видов от других микобактерий использовали способность последних к росту на среде Левенштейна-Иенсена с

500-1000 мкг/мл салипиловокислого натрия и паранитробензойной кислоты , а такхе на специальной среде с 50-100 мкг/нл пиразина-нида.

В комплект сред для первичной идентификации выделенной культуры микобактерий включали: комбинированную среду с ТСХ и НаНОЗ, салицшкЙшслым натрием, цитратом аммонийного железа, парааминоса-лициловой кислотой (ПАСК), изониазидон, среду для определения ка-талазной активности, среду с твином -80, жидкую среду жкольнико-вой, диски с тиомочевиной. три контрольных пробирки для выращивания никобактерий при 25 град С, 37 град С, 45 град С. Все среды готовили на основе среды Левенштейна-Иенсена.

По американской схеме определения никобактерий для характеристики уреазной активности применяли диски с тиомочевиной. Время определения уреазной активности по этой методике составляет 30

суток.

Для выявлений, никобактерий методом полимеразно-иепной реакции (ПЦР) была использована амплификационная тест-система^, разработанная лабораторией молекулярной генетики НШШ им. Н. Ф, Гамалеи под руководством проф. Гинпбурга а. Л., Нестеренко Л. Н.. Маги-нян и. А., Корнеева а. а., Гришиной т. д,.

Иммунологические методы исследования включали: иммуноФер-

11/\Г»ГТТТТТ пттп /ТЖЛ.А 1 Т»ЛШЛТ«1Т> ппттл гтгтлтт лппмплттп " ич Слпчтяпт.пт.

ШЛИШЛШ (ШШШ^ , ЛУХУГИИ ОДШК/ЛПСП и I Н"1 СI- 1II ч, шии^аш^псй

биотехнологии ЦНИИТ РАНН под руководством чл. корр. Литвинова в. и. при участии черноусовой л. Н., Коваленко 0.0.; иммуноблоттинг с моноклональными антителами, разработанный к. б. н. Черноусовой л. Н. и проведен совместно с лабораторией биотехнологии ЦНИИТ РАНН при участии Калининой 0. А.

Патоморфологические исследования проводились совместно с лабораторией патоморфологии ЦНИИТ РАНН под руководством проф. Еро-хина В. В., Гедымин Л. Е., Панасек И. А.. Для гистологического исс-

- и -

ледования легких, печени, селезенки и ВГЛУ экспериментальных животных, использовали окраску срезов органов морских свинок гематоксилином и эозином,

При анализе полученных данных использованы методы математической статистики.

Достоверность разности (р) между двумя относительными величинами (экстенсивными и интенсивными показателями), вычисленными на основании двух больших выборок, определялись следующим образен:

при наличии двух выборок, состоящих из пл и пл наблюдений, в которых ал элементов первой выборки и а.2. элементов второй выборки, обладают одним и тем же признаком, находят сначала величины:

а^ а^> а^+а^ —; —; к------;

П/ П^

Тогда величина (1 записывается в виде:

Ел -

= --------------------

К(1-Ю*\пл П 2~)

В качестве критерия уровня значимости принято р <= 0.05, что соответствует <1=+/- 1,96.

Для определения достоверности разности между тремя и более относительными величинами использован критерий хи-квадрата().

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

После анализа литературы основное внимание в нашей работе было обращено на выявление и выделение измененных - зернистых Форм НБ у больных саркоидозом и туберкулезом, с последующим изучением этих Форм in vitro и in vivo с целью оценки их значимости в этиологии туберкулеза и саркоидоза.

Измененные формы НБ выявлялись практически во всем диагностическом материале: сыворотке крови, над-осадочной жидкости после гемолиза, БАС, мокроте и др. . Так, после бактериоскопи-ческого исследования крови от 152 больных саркоидозом число положительных находок зернистых Форм НБ составило 54. бх, а в 2-х случаях были выявлены и типичные Формы НБ, при исследовании крови от 72 больных туберкулезом, зернистые Формы нбт были выявлены 68. 5ü, а в 9 случаях были выявлены типичные Формы нбт.

Поскольку мокрота у больных туберкулезом выделяется чаше, чем у больных саркоидозом, ее исследование было проведено у 88 больных туберкулезом и только у 28 больных саркоидозом. В результате зернистые Формы НБ методом никроскопии выявлены 50И из числа больных саркоидозом и 59Х из числа больных туберкулезом. Исследование БАС позволяет увеличить процент положительных находок у больных саркоидозом. зернистые формы НБ в БАС от больных саркоидозом выявлены в 61. 9* и зернистые Формы НБ в БАС от больных ту-беркулезон выявлены в 68.5у. случаев, а у 18. 5'/ обнаружены типичные формы микобактерий. Следует отметить, что у больных саркоидозом как в мокроте, так и в БАС, типичные Формы НБ методом бактериоскопии не определялись.

таким образом, полученные данные свидетельствуют о том. что наиболее информативным диагностическим материалом как у больных

туберкулезом, так и у больных саркоидозом является кровь и БАС.

Известно, что длительное применение антибактериальной терапии приводит к снижению жизнеспособности возбудителя и также к его изменчивости, что и объясняет необходимость применения дополнительного культивирования диагностического материала на питательных средах.

Подращивание материала на жидкой питательной среде позволило увеличить частоту выявления зернистых форм МБ методом бактериоскопии у больных саркоидозом: из крови - с 54. бх до 66.4Х; из мокроты - с 50. ОУ- до 64. 2^; из БАС - с 61.9у. до 76. 1'/, а у больных туберкулезом легких: из крови - с 68. ох до 86.1 '/■; из мокроты - с 59. О у. до 65. 9 У.-, из БАС - с 68. 5 У- до 80. 8*.

Б средней процент выявления зернистых Форм МБ в диагностическом материале больных саркоидозом составил 70. 4/, а от больных туберкулезом 77.6К. Частота обнаружения ЗФ МБ у больных саркоидозом является серьезным доводом в пользу предположения о их этиологической роли в развитии саркоидоза.

Для выделения микобактериальных штаммов из диагностического материала больных туберкулезом легких и саркоидозом од и вглу нами были проведены посевы диагностического материала на плотный, питательные среды.

Всего проведено 2416 посевов на плотные питательные среды диагностического материала от 314 больных саркоидозом ОД и ВГЛУ и от 290 больных туберкулезом легких.

Частота выделения штаммов зернистых Форн МБ культуральным методом из диагностического материала, взятого от больных саркои-дозон составила:

- и з крови - 7. 2у. культур ЗФ НБ;

- и з мокроты - 7.1'/ культур ЗФ НБ;

- И 3 БАС - 1. 5И КУЛЬТУР ЗФ МБ.

Из обшего числа образцов различного диагностического материала от 314 больных саркоидозом ОД и ВГЛУ выделено 4. ей культур не.

Частота выделения штаммов зернистых Форм нб культуральнын методом путем посева диагностического натериала на плотные питательные среды от больных туберкулезом легких составила:

- и з крови - 30. 5 v. культур зф НБ;

- и з мокроты - 30. Т/. культур ЗФ НБ;

- и 3 БАС - 36. 9У. культур ЗФ НБ.

Таким образом, из образцов различного диагностического материала от 290 больных туберкулезом легких методом посева на твердые питательные среды выделено 33.17. культур НБТ.

Таким образом, культивирование зернистых Форм микобактерий на твердых питательных средах выявило существенные различия в способности роста на этих средах в зависимости от того у каких больных был взят диагностический материал, а именно: зернистые Формы НБ полученные от больных туберкулезон отличаются по способности роста на твердых питательных средах от зернистых Форм НБ, полученных от больных саркоидозом. С целью дальнейшего изучения свойств зернистых Форм НБ было необходимо изучить их способность к реверсии в живом организме, и в случае удачи изучить свойства и

о/'ЛЙЛТТТТЛ/ЧПТ! Т^ТГГГТ 11ИМ1_'ПЛПАТлтМПП1ЛГ1

^уиспяу!»- ип сь/иих^г ¿'ссспадхио«

Следующим этапом нашего исследования явилось проведение биологической пробы на морских свинках. В качестве инокулята использовался осадок диагностического материала, полученного от больных, после его подращивания на жидких питательных средах, который вводили подкожно. Через 3 месяца животных забивали, а паренхиматозные органы (легкие, печень, селезенку) исследовали микроскопическим, культуральными, патоморфологическим нетодами.

Для микробиологического исследования использовали легкие,

печень и селезенку, Бактериоскопическим методом исследовали мазки-отпечатки паренхиматозных органов. Культуральное исследование осуществляли путем посева органов экспериментальных животных на плотные питательные среды.

Опытную группу составили 270 морских' свинок, инокулированны)( диагностическим материалом (213 из них - диагностическим материалом от больных саркоидозом и 57 - от больных туберкулезом легких) .

В качестве контрольной группы были использованы 50 интактных морских свинок, прошедших карантин. Контрольную группу животных забивали через 3 месяца, после начала эксперимента. Паренхиматозные органы исследовали методами, что и животных опытной группы.

При бактериоскопическом исследовании мазков-отпечатков органов инокулированных животных обнаруживались как зернистые, так палочковидные Формы микобактерий. Палочковидные Формы НБ чаше обнаруживались в органах, которые имели очаговые поражения.

При посеве органов 213 морских свинок, которым был введен диагностический материал от больных саркоидозом, у 14* были выявлены культуры микобактерий, а из органов 57 морских свинок, ино-кулированнын диагностическим материалом от больных туберкулезом легких, выделено 45. &'/. культур микобактерий.

Мо1лп/\^тл/\тттетт£1/*тл/\о иго гтоттАтзатттго лпл^пли »тгалтпит V л пит) л ггт.илй

41и1Ч£* Ч/ Ч^ АЪЧ/ ии, Т. Ч^ Чи АЧЧ/ 4 ¿4, ЧгМ^НЧ/ иШШЬ Ч/1"1 и лихи V 1Ш«и Х»Ч/АЛ Л. 1Г V»* ылл >/и

группы показало, что изменений в органах экспериментальных животных выявлено не было. Посевы органов контрольных морских свинок на плотные питательные среды по истечению 10 недель оставались отрицательными.

Обращает на себя внимание, что проведение биологической пробы на морских свинках, позволило увеличить частоту выделения культур микобактерий у больных саркоидозом с 4. &'/. до 14. Оа у больных туберкулезом с 33. 4Х до 45. б/С. (рис. 1, 2).

541.6

6II

Ж©.©

'ИД т.г

50.0

л. а»

Ш11МММ

А. 5

г.;1

1.6. О

.....т.л

кровь БАС мокрота

| — бактЕРИоскопмчсский мет од

~ Биологический метой — культуральный метоЭ

Рис,. 1. Частота выявления зерни с ты к форм МБ

у больных о а. 1Р к. о и О о з о и различными методами

у

100-"°

в 01 60 40 20 -

С»..13

С» 0.3

О

59.0

.»--таг:; 55.5

37.О

:зс

А 30.7

V////

У////

кровь БАС мокрота

б а к т е р иоско п и ч е с к и й м е т о с) б и о л о г и ч с с к и й м I: т о д к V л ь 7' у р а л ь 14 м й м гг т о й

Рис., 2„ Частота выявления зе: и истых форм МБ

у больны К Т^бЕРКЛцГЛЕЗОМ различными мЕгойами

Гистологически изучены легкие, печень, селезенка и лимфатические узлы опытной группы морских свинок. Морфологические изменения в исследуемых органах можно разделить на 3 типа: к первому типу морфологических изменений были отнесены изменения, свидетельствующие об иммунном ответе , которой характеризовался гиперплазией внутригрудных лимфатических узлов и селезенки с множеством бласт-клеток и увеличением размеров Фолликул, В легких снижалась воздушность за счет расширения альвеолярных перегородок и инфильтрации их многочисленными клетками накроФагального ряда. Свидетельством иммунной перестройки организма являлась активизация в-клеточного иммунитета (пролиферация В-клеток в лимфатических узлах и селезенке, появление плазматических клеток и эози-ноФиляов, интертициаяьный отек и васкулиты во всех органах свинок).

Норфологические изменения 2-го типа отнесены нами к грануле-матозным образованиям. В органах морских свинок отмечались Формирующиеся макроФагально- эпителиоидноклеточные гранулемы. Норфологические изменения были различны в зависимости от стадии развития процесса. На ранней стадии изменения в органах характеризовались диффузной смешанной клеточной реакцией. Выраженную стадию грану-лематоза характеризовала диффузная эпителиоидноклеточная реакция

п лшттл гтт ттттжггт АпСплптгтмпмпттп лп1пп»т тт гтт ттлптлтттгттг АтгЛплпл«! л гттг_

v ¿мсииишиа * ли j-1 w xif j juuuiruri V4Qi arm Л iwtfiOHUOiJMiUitri Ynufvjvn ^ i n

алином. Очаги были продуктивными, без казеоза в центре.

Третий тип морфологических изменений характеризуется наличием туберкулезных изменений, хотя бы в одном органе. Вместе с тем морфологические изменения в органах животных, инокулированных диагностическим материалом от больных туберкулезом и саркоидозом были различные.

У морских свинок, инокулированных материалом от больных сар-кодозом, третий тип морфологических изменений характеризовался

наличием специфических изменений бронхиального дерева в виде продуктивного бронхита, появлением аллергических реакций во всех органах животных, преобладанием продуктивного и экссудативно-про-дуктивного воспаления над зкссудативно-некротическим.

У морских свинок, инокулированных материалом от больных туберкулезом, в основном преобладал генерализованный пролиФератив-ный эндобронхит со склерозом стенок и генерализованным поражением одного или более органов, отмечались выраженные экссудативно-нек-ротические реакции с некрозом в центре очагов.

Сопоставляя морфологические варианты воспаления с результатами микробиологического исследования нами выявлена следующая закономерность: при развитии иммунного ответа в организме экспериментальных животных в мазках - отпечатках органов морских свинок с первым типом морфологических изменений, выявлялись только единичные зернистые Формы микобактерий, которые не давали роста на питательных средах; при развитии гранулематоза в органах морских свинок со вторым типом морфологических изменений, чаше обнаруживались зернистые Формы и единичные палочковидные микобак-терии; при наличии очагов по типу туберкулезных в органах морских свинок в значительном количестве обнаруживались палочковидные и единичные зернистые формы микобактерий. При посеве органов экспериментальных животных на плотные питательные среды была выявлена реверсия от больных саркоидозом в 14Х случаев и в 45/ слу^ёв от больных туберкулезом.

Подводя итог данным морфологического исследования можно отметить следующее, все животные дали различные морфологические реакции на введение инокулята. В организме морских свинок, инокулированных диагностическим материалом от больных туберкулезом чаше выявлялось туберкулезное воспаление в 42 х случаев, реже изменения свидетельствовали об иммунной перестройке, в организме - в зох

случаев, и еше реже отнечались признаки гранулематоза - в 28г случаев. При инокуляции животных материалом от больных саркоидо-зом морфологические реакции, характерные для гранулематоза отмечались у большинства животных - в бгх случаев, что более чем в 2 раза чаше у животных выше описанной группы. В тоже время, типичное туберкулезное воспаление отмечалось в 5 раз реже- в &'/■ случаев, чем у животных . инокулированных материалом от больных туберкулезом. Реакции свидетельствующие о нарушении иммунного ответа встречались у одной трети больных обеих групп.

Полученные данные свидетельствуют об определенной роли зернистых Форм МБ в течении саркоидоза. Вместе с тем обнаружение типичных туберкулезных изменений у незначительного числа животных < Sк i может свидетельствовать или о случайном выявлении возбудителя туберкулеза, или о том что возбудитель саркоидоза находится в генетическом родстве с микобактериями туберкулеза.

При посеве органов 213 морских свинок, инокулированных диагностическим материалом от больных саркоидозом ( 106 животных -кровью; 20 животных - мокротой; 87 животных - БАС) выделено 30 культур-ревертантов (Ш) , проведение биологической пробы на 57 морских свинок, инокулированных материалом от больных туберкулезом (11 животных - кровью; 36 животных - мокротой; 10 животных -

Т7АГ*\ ПТГТГЛ гтлттл ОК тлттгтт iiwm_'nAnAT>m'iTtinAn Í/> С С V \ i XjjaíMváiCXlV Lá\S rw diO i/l' rCDCh loniVD \T-J. V* J ,

Обращает на себя внимание, тот Факт, что проведение биологической пробы на морских свинках, позволило увеличить частоту выделения культур никобактерий у больных саркоидозом с 4,8Х до И. ох, а у больных туберкулезом с 33,4Х до 45, бх. Частота выявления культур-ревертантов, полученных от больных саркоидозом на плотных питательных средах, возросла почта в 3 раза, но оставалась значительно ниже, чем частота роста культур, полученных от больных туберкулезом. Этот Факт также может свидетельствовать о

более глубоких процессах изменчивости микобактерий, полученных от больных саркоидозом.

Следующим этапом данного исследования явилось изучение выделенных культур ЗФ НБ, как прямых , полученных из диагностического материала, после его посева на плотные питательные среды, так и культур- ревертантов , полученных при посеве органов морских свинок.

Полученные культуры были идентифицированы с использованием биохимических, иммунологический и молекулярно-генетических тестов.

Изучение морфологии микобактерий проводили на мазках-препаратах, приготовленных из 142 культур и 710 препаратов органов экспериментальных животных, при изучении мазков-препаратов нами выявлен полиморфизм культур. Форма микобактерий была разнообразной: от палочковидных длинных 4,0 и более микрон (мкн) до утолщенных коротких микобактерий до 1 мкн, а иногда от больших по размеру коккобацилл -4,0 мкм, до мелкозернистых Форм от 0,2 до 0,6 мкм. Также следует отметить, что в одном препарате и поле зрений наблюдали сразу две, три различные Формы микобактерий.

Морфологическое изучение выделенных культур ЗФ НБ от больных саркоидозом методом растровой электронной микроскопии. Исследова-

тттт nm ittnn 111л i/wítt mtmn ^А Ш? тъттттл ялттттттл wnw m гт г»лтгттг*т пиппгпо гтt — Iii* 1W tfll? IV fp» IiX/t 13£«MC<fiCIXn£*i; ¿1(2 11614/ iilA*¿l milUiueiü

ных средах непосредственно из диагностического материала ( названные прямыми), так и из органов морских свинок (культуры-ревер-танты).

При изучение культур методом электронной микроскопии выявлено некоторое морфологическое сходство как у прямых культур, так и у ревертантов. Установлено морфологическое различие между культу-рани ЗФ НБ, в зависимости от исследуемого диагностического материала. Культуры ЗФ НБ как прямые, так и ревертанты, выделенные из

мокроты и БАС имели рост колоний в виде "кос" и "жгутов", состоящих только из палочковидных особей. Бее культуры ЗФ НБ, выделенные из крови, имели рост колоний не только в виде "кос", но и многочисленных, различных по величине шаровидных образований от 2,0 до 4,0 нкм в диаметре, состоящих из зернистых Форм микобакте-рий, в том числе с нарушением лшшдно-капсульного покрова, вероятно л-Форм. Это может быть связано с тем, что кровь является особой средой обитания микроорганизма, которая оказывает бактерицидное воздействие на микроорганизм, (рис. 3, 4).

При цитировании микобактерии, мы придерживались классификации их по группам Ranyon.

Так из 45 культур ЗФ НБ ( 15 прямых культур ЗФ НБ и 30 куль-тур-ревертантов), выделенных от больных саркоидозом, 80Х культур отнесены к роду Н. tuberculosis, 8. 9У. культур были отнесены к атипичным никобактериям I и II группам Ranyon (2 - н. Kansasii, 2 -Н. xenopii) и п. ix культур идентифицировать не удалось, однако по основным критериям эти культуры можно отнести к роду Н.tuberculosis, также данные культуры способны утилизировать НаС1 на питательной среде, что является характерным признаком для ми-кобактерий III и IV группам Ranyon.

Из 97 культур ЗФ НБ (71 прямая культура и 26 культур- ревер-тантов). выделенных от больных туберкулезом, 94. ЗУ- культур были отнесены к роду Н. tuberculosis, за исключением 5. г/, культур, которые по данным критериям были отнесены к III и I группам Ranyon (1 - Н.avium, 2 - Н.triviale, 2 - Н.Kansasii).

Таким образом, можно сделать вывод, что выделенные культуры ЗФ НБ как от больных туберкулезом, так и от больных саркоидозом имели сходные биохимические показатели, кроме того 80Х их отнесены к роду Н. tuberculosis.

Для более точной идентификации культур нами определялась ле-

Едс.З Культура шкобактерий, выделенная из мокроты . больного саркоидозш

а) рос? колоний в виде "кос" и " жгутов"

б) Зрагменга колони! состоят аз палочковидных клеток

4. Кулз^тра щхобакгергй, шдаленкая аз крош ¿охъ-::огс ^рг.о^дозо:-: a) poor еслсннё з виде. шрсзздкзс зсрукгп? о зершсоюй

ПСЗЗр XliOCïbS

б) f.pai'HeZiíH КОЛОНИЙ О H£pyi¡!2£j.s:.;: ^П^ДЕО-^ЯДСу.!!^ зло

покрова, в злце^чол-сз'7, не liatón овя^- ьлз'гол

карственная устойчивость к основным противотуберкулезным препаратам: стрептомицину, изониазиду. этамбутолу, риФампицину, пирази-намиду, зтионамиду методом абсолютных концентраций и ускоренным методом.

Так из 45 культур ЗФ НБ выделенных от больных саркоидозом, 24.5у. культур имели ЛУ, из них 8.9'/. культур были устойчивы к Б,

6. т/. культур к Н, б. 7Х культур к БН и 2. 2У- культур устойчивы к

БЕ. К другим препаратам устойчивости не выявлено.

Из 97 культур ЗФ НБ. выделенных от больных туберкулезом, 60.8Х культур инели ЛУ к одному, двум и более препаратам. Из них

15. 5/С КУЛЬТУР имели УСТОЙЧИВОСТЬ к Б, 12. 4* КУЛЬТУР - БН, 32. Щ

культур к Бшг.

Для изучения вирулентности культур ЗФ НБ проводили экспериментальное заражение 30 морских свинок культурами ЗФ НБ, выделенных от больных саркоидозом и 30 морских свинок культурами ЗФ НБ от больных туберкулезом.

Животные, которым были введены культуры ЗФ НБ от больных саркоидозом, распределены следующим образом: 4 морские свинки были заражены атипичными НБ 1 и 2 группы (2-М. КамазИ, 2-Н. хепорШ, 5 животных - кислотоустойчивыми микобактериями, которые идентифицировать не удалось и 21 животное микобактериями туберкулеза, из них у 3 морских свинок гибель наступила на 50-65 день.

Культуры ЗФ МБ, полученные от больных туберкулезом . были изучены биологическим методом (30 морских свинок), 5 животным введены атипичные НБ 1 и 3 группы и 25 животным - микобактерии туберкулеза, из них у 5 животных гибель наступила на 56-60 день.

У 8 погибших животных гистологически были изучены печень, легкие и селезенка. У всех животных отмечались очага по типу туберкулезных во всех органах.

Особый интерес представляет патологическая картина у морских свинок, зараженных культурами ЗФ НБ от больных саркоидозом и туберкулезом, гибель которых не наступала на 90 день, после введения НБ, Данные животные были выведены из эксперимента через 90 дней.

Изучена вирулентность двух культур первой группы (Н. КамазШ. выделенных от больных саркоидозом и двух культур выделенных от больных туберкулезом биологическим методом. Указанные культуры не вызывали видимых изменений в паренхиматозных органах, и лишь на месте введения инокулята определялось незначительное уплотнение.

Вирулентность двух культур второй группы (Ш(й1ор1). выделенных от больных саркоидозом также изучена на морских свинках. На вскрытии животных не было выявлено изменений ни на месте заражения, ни во внутренних органах.

При изучении вирулентности трех культур третьей группы (Н. ауАии, Н. 1гшп.а1е) через три несяда на месте введения культуры у морских свинок определялся инфильтрат, и отмечались единичные очаги воспаления в печени и селезенке.

Вирулентность пяти не идентифицированных культур ЗФ НБ выделенных от больных саркоидозом, изучали на морских свинках, морфологическая картина внутренних органов была различной. На вскрытии установлена обструкция сосудов в результате пролиферативного васкулита, а в регионарной ткани легкого выявлялись очаги воспо-ления с малой клеточной реакцией по периферии (в основном Фибро-ластической). Отмечено избыточное Формирование Фиброза в капсуле по ходу синусов и вокруг очагов, т. е. преобладал продуктивный тип воспаления.

Таким образом, по местной реакции, а также по макроскопическим изменениям и гистологической картине показана различная

степень вирулентности микобактерий. При заражении вирулентно» культурой у морских свинок процесс прогрессирует, а на введении атипичных микобактерий. он имеет регрессивный характер. Нетод подкожного заражения морских свинок использован, как дополнительный тест при дифференциации культур.

В последние годы все шире используется метод полимераз-но-депной реакции (MP) для решения Фундаментальных и прикладных вопросов в инфекционной патологии.

С помощью пцр была проведена идентификация 45 культур ЗФ НБ, выделенных от больных саркоидозом, в качестве контроля проведена идентификация 30 культур ЗФ НБ от больных туберкулезом. Положительная реакция с ДНК Н. tuberculosis с TUB и lHS-праймерами была выявлена у 35 из 45 культур от больных саркоидозон, что составило 77. 8Z, и у 28 из 30 культур от больных туберкулезом - 93. зх.

Такин образом, метод ПНР является более чувствительным и специфичным в отношении определения вида микобактерий. Кроме того, использование тест-систем позволило исключить идентичность зернистых Форм н. tuberculosis с н. bovis BCG,

Для определения развития иммунного ответа к микобактериям туберкулеза у морских свинок, которым был введен диагностический материал, содержащий ЗФ НБ от больных саркоидозом. был проведен

тшитгтт/ч Алтч/лптш »rV лил m»r» иг\лптг 1w/»ttA'ntmATTim гтт гтгтл *»m/\mmm Йттгпг

turns nvvui-riGiiiJUxi'i опашню ivfv/ort. ■и'л^исгшсп i аишияс MÍDO ИШС ЧЛВДХ.М.

разделены на 3 группы.

Первую группу составили 30 морских свинок, которым был введен диагностический материал от больных саркоидозом, содержаний ЗФ НБ.

Вторую группу составили 20 животных, которым были введены культуры- ревертанты ЗФ НБ, выделенные культуры на плотных питательных средах и из органов морских свинок (от больных саркоидозом).

Третью группу (контрольную) составили 25 интактных морских свинок, находившихся в одинаковых условиях с опытными группами.

Антитела к Н. Tuberculosis H37Rv были обнаружены у 11 из 30 морских свинок 1-ой группы, что составило 36,бх. в третьей (контрольной) группе антител у морских свинок обнаружено не было. Также не было обнаружено антител к Е. coli ни у одной свинки, как в опытной, так и в контрольной группах.

Определение антител в сыворотке крови к Н. Tuberculosis H37Rv у животных 2-ой группы проводили методом ИФА по той же схеме, что и в предыдущей части эксперимента. Антитела к H.Tuberculosis H37Rv были выявлены у 16 животных, что составило 80*.

таким образом, при введении ЗФ НБ морским свинкам, у большинства животных был индуцирован иммунный ответ к микобактериям туберкулеза. Наличие положительных иммунологических реакций может косвенно свидетельствовать о том, что ЗФ НБ в диагностическом материале части больных саркоидозом могут относиться к роду HycobacteriiHD tuberculosis. Более убедительные доказательства принадлежности ЗФ НБ к H.Tuberculosis были получены при введении морским свинкам культур-ревертантов, выделенных от больных саркоидозом.

Для изучения особенностей антигенной структуры микобактерий,

TYTiTTrt гтлтттгтгсг лгп Йлпт mm лопмлптглпл!» тг тчгСлгммтплчл» Сгтгг гтлплггт «члппгт

шлмсдлсшхидд V i W4i¿DOJ*n ^oj^xwiiMv^vn ti i J ci'iw «ucovni un<ii ii^uviiDJVcan

метод икнуноблоттинга с моноклональными антителами (HAT) специфическими к Н. tuberculosis complex, полученными в лаборатории биотехнологии ЩШИТ ранн: 1f9, т, 10g10, 4н4-, 10d5, направленных к эпитопам экспрессированным на полипептидах разной молекулярной массы. Инмуноблоттингу были подвергнуты 60 культур зф нб, выделенных от больных саркоидозом и туберкулезом.

От больных туберкулезом и саркоидозом было исследовано по 30 культур, из них по 15 прямых культур, получены методом посева ди-

агностического материала на плотные питательные среды, и по 15 культур-ревертантов, выделенные из органов морских свинок.

Анализ результатов показал, что культуры ЗФ НБ выделенные от больных саркоидозом, как пряные, так и ревертанты имеют сходную иммунологическую характеристику, а именно: обшие эпитоп^ 04 на полипептидах 30-25 кда, эпитопы 4Н4 на 16 кДа, эпитопы ЮБб на 19-20 кДа. Однако, у культур-ревертантов появляется экспрессия эпитопа 1Р9 на полипептидах ТО кДа, что мы не наблюдали ни в одном случае у прямых культур, подобное явление мы наблюдали при анализе культур ЗФ НБ, выделенных от больных туберкулезом.

При сравнении культур ЗФ НБ, выделенных от больных саркоидозом и туберкулезом, мы получили аналогичные результаты не завистно от того, из какого диагностического материала они были получены, а именно: по экспрессии эпитопа В4 на полипептидах 30-25 кДа, 19 кДа, эпитопа 4Н4 на 16 кДа и эпитопа ЮБб на 19-20 кДа, По экспрессии других зпитопов наблюдались различия. Экспрессия эпитопа 1Р9 на полипептидах 55 кДа характерна для культур, выделенных от больных туберкулезом.

Изучение особенностей эшггопной структуры культур ЗФ НБ, выделенных от больных саркоидозом и туберкулезом, проведенное методом иммуноблоттинга с моноклональными антителами к микобактериям

М 4-пКлт»/Ч11 л п 1 я г> лтп 1 птг ттлт/тл гтл ттп гттгттггл т^от* гтг тлпл п^тт г>

антигенной структуре измененных микобактерий, так и некоторых различий по экспрессии отдельных зпитопов на пептидах определенной молекулярной массы.

Таким образом, комплексное микробиологическое изучение диаг-ностичекского материала от больных саркоидозом и туберкулезом позволило выявить сходство выделенных культур микобактерий, которое свидетельствует об определенной роли ЗФ НБ в течении саркои-доза.

выводы

1. Показано, что частота выявления зернистых Форм микобактерий у больных саркоидозом составляет 57.3/ и у больных туберкулезом 65.5* .

г. зернистые Формы, выделенные от больных саркоидозом и туберкулезом. относятся к роду НУсоЬаклеПит и характеризуются однотипностью их морфологической структуры: кокковидной Формой, выраженным полиморфизмом.

3. Емкая питательная среда с Ю'/С содержанием сыворотки крупного рогатого скота является оптимальной средой для подращивания зернистых Форм микобактерий. Культивирование диагностического материала на жидкой питательной среде увеличивает удельный вес выявления зернистых Форм микобактерий у больных саркоидозом на 14'/, у больных туберкулезом на 18Х .

4. Разработан комплекс методов микробиологической диагностики у больных саркоидозом и туберкулезом, включающий: выявление зер-

тттг^гптттт Л-.лт\н тп.лЛ'лтАтл^тЛ тттгт/мг 1ггут^глл/.т|«лггтггт ттл тгтьпттгтттттто п ГШ** 1 \.1*М пллч/ч^алЧАС^тА Ач_ 11 Цим^сшиШаллс £>

жидкой питательной среде и проведение биологической пробы с дальнейшим посевом органов морских свинок на плотные питательные среды.

5. Применение комплекса микробиологических методов позволяет увеличить частоту выделения культур-ревертантов из диагностического материала от больных саркоидозом с 4. 8'/- до 14'/. и от больных туберкулезом с 18.5/ до 36.9/,

б. Результаты микробиологических, биохимических и иммунологических методов исследования показали, что культуры-ревертанты из зернистых Форм микобактерий, выделенных от больных саркоидозом в 80/ относятся к роду Н. tuberculosis .

7. Установлены различия по спектру и частоте лекарственной устойчивости культур, выделенных от больных саркоидозом и туберкулезом: при саркоидозе - частота лекарственной устойчивости микобактерий составляет 24.5/, из них - 15.0/ устойчивы к одному препарату, 8.9/ - к двум препаратам; при туберкулезе частота устойчивости микобактерий туберкулеза составила 60. О/, из них - 15.5/ к одному, 12.4/ - к двум, 32.9/ - к трем препаратам, (патенты: Н2099425 "Способ определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза", 20.12.1997г.; Н2099417 "Питательная среда с пиразинамидом для определения лекарственной устойчивости возбудителей туберкулеза и их идентификации", 20, 12. 1997Г.. )

8. Установлено сходство морфологических реакций в органах морских свинок на введения зернистых Форм микобактерий как от больных

muí ti

9. Исследование методой растровой электронной микроскопии позволило установить сходство прямых культур и культур-ревертантов, выделенных из мокроты и БАС от больных саркоидозом, и их отличие в морфологической характеристике культур, выделенных из крови.

10. Иммуноблоттинг с моноклональными антителами, специфическими к "Н. tuberculosis complex" показал большое сходство в антигенной структуре микобактерий, выделенных от больных саркоидозом и туберкулезом по экспрессии эпитопов: D4 на 19 кДа, 30-25 кДа; да на 16 кДа; 10D6 на 19-20 кДа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОНЕНДАЦИИ

1. Для увеличения удельного веса выявления зернистых форм микобактерий из диагностического материала больных саркоидозом и туберкулезом рекомендуется применение жидкой питательной среды с 10у. содержанием сыворотки крупного рогатого скота.

2, Для выделения культур-ревертантов зернистых Форн микобактерий от больных саркоидозом и туберкулезом рекомендуется применять разработанный комплекс микробиологических исследований : люминесцентную микроскопию осадка диагностического материала, его подращивание на жидкой питательной среде, с последующим проведением биологической пробы на морских свинках и высевом органов животных на плотные питательные среды.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕКЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Голышевская В. И., Гришина Т. А., карпенеко 0. Л., Сафонова С. Г., Гришина Т. Д. Биологические свойства микобактерий туберкулеза в зависимости от чувствительности к антибактериальным препаратам //ПРОбЛ. ТУб. -1993. -Н4. -С. 37-41.

2. голышевская В. й., Сафонова с. Г. микробиологическая диагностика саркоидоза. //Натериалы Всероссийской научной конференции " Актуальные вопросы разработки микробиологических и питательных сред и тест-систем для диагностики инфекционных заболеваний" : Тез. док. - нахачкала. 1994 г. - с. 241.

3. голышевская В. и., Черноусова Л. Н., Сафонова С. Г., Шевченко Н. И., Коваленко О. О. Микробиологическая диагностика легочной патологии. //Натериалы 4 Национального конгресса по болезням органов дыхания: Тез. док. -Носква, 1994.- С. 646.

4. Голышевская В. И., Корнеев А. А., Черноусова Л. Н., Пузанов

B. А., Гришина Т. Д., Сафонова С. Г. Микробиологическая диагностика туберкулеза. // Вестн. Акад. мед. наук. Носква. - 1995. - Н7, -

C. 16-18.

5. голышевская в. И., Корнеев А. А., Черноусова Л. Н., Гришина Т.Д., Сафонова С. Г. Биологические особенности Н. Ш>егстшз1з и трудности микробиологической диагностики//Пробл. туб. -1995. -н2-С. 30-32.

6. Голышевская В. И., Сафонова С. Г., Пузанов В. А., Митинская Л. А., Юхименко Н. В. Диагностика туберкулеза путем выделения культур микобактерий из крови больных // Натериалы пленума научно-медицинской ассоциации Фтизиатров: Тез. док.-Йошкар-Ола, 1996.-

г1 оп

и. ^:7.

7. Демьяненко Н. В., Эргешев Э. Э., Черноусова Л. Н., Яворский О. I., Литвинов В. И,, Сафонова С. Г. Определение антибактериальных антител при туберкулезном плеврите//Пробл. туб.-1994.-С. 24-27.

8. Корнеев А. А, Гришина Т. Д., Пузанов в. А., Сафонова С. Г. Диагностика бактеримии в клинике туберкулеза. // Натериалы б Национального конгресса по болезням органов дыхания: Тез.док.- Новосибирск, 1996.-С. 590,

9. Корнеев А. А., Голышевская в. и., Севастьянова Э. В.. Сафонова С. Г., Пузанов В. А,, Влияние состава питательных сред на результативность определения лекарственной устойчивости микобакте-рий туберкулеза. / Сборник резюме 3 Всероссийского съезда Фтизиатров:- Екатеринбург, 1997.-С. 346.

10. Калинина 0. А.. Куликовская Н. В., Капина И. А.. Черноусова Л.Н., Сафонова С. Г. Сходство и различие антигенной структуры ми-кобактерий, выделенных от больных саркоидозом и туберкулезом. / Сборник резюме 3 Всероссийского съезда Фтизиатров:- Екатеринбург, 1997. - С. 418.

11. Литвинов В. И., Калинина 0. А., Демьяненко Н. В., Куликовская Н.В., Капина Н. А., Сафонова С. Г. Изучение гуморального иммунитета на антигены микобактерий при саркоидозе // Пробл. ТУб. -Нб. -1997. -С. 40-42

12. Пузанов . Б. А., Сафонова С. Г., Корнеев А. А., Юхименко Н. В., Ларионова Е. Е. использование крови в диагностике туберкулеза. / Сборник резюме 3 Всероссийского съезда Фтизиатров:- Екатеринбург, 1997. - С. 552.

13. Романов В. в., Озерова Л. В., Сафонова С. Г., Абрамова з. п. Прогностические признаки рецидивирующего течения больных саркоидозом. // Материалы 5 Национального конгресса по болезням органов дыхания: тез. док. - носква, 1995. - с. 266.

14. Романов В. В., Степанян И. Э., Фомина Н. н., Сафонова С. Г. Экстракорпоральная пр&шизолоновая гематерапия в комплексном лечении саркоидоза. // Натериалы 4 конференции московского общества гемаФереза: Тез. док. - Носква, 1996.-С. 47.