Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм бактерий Pseudomonas putida М

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм бактерий Pseudomonas putida М"

, р ,, ,г1 133№АДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК 579.842.11.:579.222.08

БЛАЖЕВИЧ ОЛЬГА ВАЛЕНТИНОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО ПИГМЕНТА ПИОВЕРДИНА Рм БАКТЕРИЯ PSEUDOMONAS PUT IDA М

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МИНСК - 1994

Работа выполнена в НИЛ молекулярной генетики бактерий при кафедре микробиологии Белорусского государственного университета.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Фоиичев Ю.К. кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Максимова II. П.

Официальные оппоненты -

доктор биологических наук, Цхганков Ю.Д. кандидат биологических наук, Гриц Н. В.

Ведущее учреждение -

Научно-исследоватльский и проекгно-конструкторский медико-биотехнологический институт. "

Защита диссертации состоится 17 июня 1994 года в 11 часов на заседании специализированного совета К 006.09.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Институте микробиологии АН РБ по адресу: 220141, г.Минск, ул.Жодинская,2.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке имени Я. Коласа.

Автореферат разослан 16 мая 1994 года.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Образцова Н.В.

-з-ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теш. В связи с актуальностью проблемы создания новых эффективных и экологически безвредных средств защиты растений особое значение приобретает изыскание и характеристика новых природных бактерий-антагонистов, способных существовать в ассоциации с растениями и продуцировать при этом высокоактивные антимикробные вещества, угнетающие развитие фитопатогенов. В этом плане весьма перспективными объектами являются флуоресцирующие бактерии рода Pseudomonas, в частности, виды Р.fluorescens и Р.putida.

К числу наиболее важных проблем изучения флуоресцирующих Pseudomonas следует отнести исследование их антимикробной активности, выяснение природы продуцируемых ими веществ, а также определение путей их синтеза и механизмов действия. Среди антимикробных веществ, синтезируемых клетками Pseudomonas, особый интерес вызывают флуоресцирующие пигменты (пиовердины и псевдобактины), представляющие собой уникальные соединения, выполняющие функцию сидеро-форов, в основе антимикробного действия которых лежит способность связывать находящиеся в окружающей среде ионы трехвалентного железа и переводить их в недоступную для других микроорганизмов форму, в результате чего развитие последних подавляется. Помимо способности • супрессировать развитие фитопатогенов флуоресцирующие пигменты, а также продуцирующие их штаммы могут оказывать выраженное стимулирующее действие на рост растений.

Несмотря на повышенный интерес к флуоресцирующим пигментам и их продуцентам, а также значительный объем накопившейся информации об их строении и свойствах, сведения о метаболических путях биосинтеза данных соединений ограничиваются лишь единичными сообщениями (Taraz et al., 1991; Budzikiewicz, 1993).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась характеристика синтезируемого бактериями Р.putida М нового флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм, а также выяснение биохимических путей и механизмов регуляции его синтеза.

В соответствии с этим в работе последовательно ставились следующие задачи:

- определение антимикробной активности бактерий Р.putida М и установление природы действующего вещества;

- выяснение физиологических условий, обеспечивающих максимальную продукцию флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм бактериями P.puUdn М;

- характеристика физико-химических свойств и строения шювер-дина Ри;

- исследование механизмов регуляции биосинтеза пигмента;

- выявление основных предшественников диоксихинолинового ядра пиовердина Рм и этапов их синтеза.

Научная новизна работы. Установлено, что антагонистическая активность бактерий P.putida М определяется продукцией флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм, относящегося к соединениям класса си-дерофоров, синтез которого осуществляется в достаточно широком диапазоне температур (от 23°С до 33°С) и pH среды (от 4,0 да 9,0); наиболее'подходящи.! для продукции пигмента источником углерода является сукцинат. Сингев пиовердина Рм помимо ионов трехвалентного железа угнетается также ионами Sn£-+', и частично стимули-

руется ионами марганца. Зарегистрировано подавление продукции пигмента глюкозой.

Определены основные физико-химические свойства и аминокислотный состав пиовердина Рм. Показано, что в пептидную часть молекулы пигмента входит пять аминокислот - треонин, серии, лизин, оксиас-парагиновая кислота и М^-оксиорнитик в молярных соотношениях 3:2:1:1:1.

Установлено, что основными предшественниками диоксихинолинового ядра пиовердина Рм являются Фенилаланин и дигидроорогат. На основании полученных данных предложена гипотетическая схема синтеза диоксихинолинового ядра данного пигмента.

Показано, что синтез ферментов, участвующих в образован™ ди-гидрооротата, у бактерий P.putida М происходит конститутивно, а регуляция их активности осуществляется на уровне аспартат-транс-карбамоилазы путем ингибирования пирофосфатом, ЦТФ, ГТФ, УТФ и стимуляции фенилаланином.

Практическая значимость работы. Практическая значимость полученных результатов определяется тем, что охарактеризован новый штамм флуоресцирующих Pseudomonas, обладающий широким спектром антимикробного действия в отношении ряда фитопагогенных микроорганизмов. Основные свойства изученного штамма позволяют рассматривать его в качестве перспективного объекта для создания препарата широкого спектра противомикробного действия.

Структура работы. Диссертация состоит из разделов "Введение", "OSDcp литературы", "Материалы и методы", "Результаты Э!:спер;:.мон-

тов", "Обсуждение результатов", " Выводы" и списка цитированных работ. Работа содержит ft" станиц машинописного текста, 32 рисунка, 14 таблиц, библиография включает 3СТ литературных источников.

Апробация. Результаты работы представлялись на научной конференции "Актуальные проблемы социально-гуманитарных и естественных наук" (Минск, 1991), VI съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров (Горки, 1992), VI съезде Общества генетиков и селекционеров им.Н.И.Вавилова (Минск, 1992), IV Всесоюзной научной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущно, 1992), Международной научной конференции по фитопатогенным бактериям (Франция, Версаль, 1992).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы микроорганизмов. В работе использован бактериальный штамм Pseudomonas putida М (ВКПМБ-4303), а также ряд бактериальных культур (Pseudomonas, Erwinla, Xanthomonas, Agrobacterium, Bacillus, Staphylococcus, Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Sarci-na, Gorynebacterium) и грибных культур (Alternaria, Cladosporium, Fusarium), применявшихся в качестве индикаторных для определения антимикробной активности изучаемого штамма.

Среды и условия культивирования. Бактерии выращивали в питательном бульоне, среде Кинг В (King et al., 1954), а также агари-зованной или жидкой среде М9 (Миллер, 1976), которую перед авток-лавированием обрабатывали 8-оксихиколшюм для удаления ионов железа (Waring & Werkman, 1942).

Бактерии P. putida М культивировали при 28°С-30°0 с аэрацией в колбах Эрленмейера (объемом 250 мл), содержащих 50 мл жидкой среды Ш с сукцикатом натрия либо глюкозой в течение 18-36 часов. Инди-гсаторные культуры выращивали в питательном бульоне при соответствующем для («зждаго штамма температурном режиме.

Получение мутантов. Мутанты бактерий P.putida М получали путем обработки меток Ы-метил-л'-иитро-М-нитрозогуанидином по стандартной методике (Миллер, 1976).

Выделение пигмента. Пигмент выделяли из культуральной жидкости в связанной с Ге3+-ионами форме путем колоночной хроматографии по методике, предложенной Meyer & Abdallah (1978).

Методы изучения пиовердина Рм. Спектрофотометрический анализ

пигмента проводили на спектрофотометрах СФ-46 или Specord М40.

Гель-фильтрацию пигмента осуществляли на колонке (0,7x25 см) с биогелем Акрилекс Р2, уравновешенной дистиллированной водой, при объеме наносимой пробы, равном 1,0 мл, и объеме собираемых фракций 1,0 мл.

Колоночную хроматографию проводили на колонке с CM Sephadex С25 (2,5x90 см), уравновешенной 0,5 M ацетатным буфером (pH 5,6), при объеме наносимой пробы - 20 мл.

Чистоту получаемого препарата пигмента определяли методом тонкослойной хроматографии (Teintze et al., 1981).

Аминокислотный анализ HCl- и HJ-гидролизатов пигмента осуществляли как описано ранее (Teintze et al., 1981; Cody & Gross, 1986) о помощью аминокислотного анализатора Т339.

Связывание пигмента с Ге3+-ионами, а также с ионами других металлов изучали согласно методу Meyer & Abdallah (1978).'

Включение меченого 14С-фенилаланина в синтезирующийся пигмент определяли с использованием DL-3-фенил-(2-14С)аланина по методике, описанной Максимовой и др. (1993), с измерением радиактивности препаратов с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика Бе-та-2.

Антимикробную активность на плотной среде изучали методом "отсроченного антагонизма" (Fredericq, 1957); антибактериальную активность культуральной жидкости определяли согласно методике, описанной Misaghi et ai. (1982).

Способность пигмента восстанавливать рост бактерий на агаризо-ванной среде с ЭДТА определяли по методике, предложенной Leong & Neilands (1982).

Определение активности ферментов. Бесклеточные экстракты получали по описанной ранее методике (Максимова и др., 1993).

Активность карбамоилфосфатсинтазы (КФС-азы; КФ 2.7.2.5.) определяли по методике, предложенной для B.subtilis (Potvin & Gooder, 1975); кгполъауемую в реакции дилитиевую соль карбамоилфосфата синтезировали химически (Spector et al., 1957).

Активность аспартаг-транскарбамоилааы (АТК-азы; КФ 2.1.3.2.) определяли методом, описанным Chu & West (1990). Образующийся в результате реакции карбамоиласпартат определяли с использованием актгтарин-диадетшшонооксимового реагента (Prescott & Jones, 1969).

Определение активностей дигидрооротааы (ДГО-азы; КФ 3.5.2.3.) и дигидрооротагдегидрогенааы (ДГО-дегидрогенавы; КФ 1.3.3.1.) проводами согласно Beckwith et al. (1962).

Активность оротатфосфорибо зилтрансферазы (ОЭТ-азы; КФ 2.4.4.10) определяли по методике, предложенной Schwartz & Neuhard (1975).

Удельную активность фермента выражали в нМ/мин•мг белка. Количественный .анализ белка проводили по Lowry et al. (1951).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУНДЕНИЕ.

1. Изучение природы антагонистической активности бактерий P.putida М.

В серии предварительных экспериментов было установлено, что бактерии P.putida М обладают антимикробной активностью как по отношению к представителям рода Pseudomonas, так и некоторым другим филогенетически неродственным микроорганизмам: бактериям (Erwinia, Xanthomonas, Agrobacterium, Bacillus, Staphylococcus, Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Sarcina, Corynebacterlum) и грибам (Fusa-riutn, Alternaria, Cladosporiuro), причем чувствительными оказались более 95Х от общего числа проверенных культур (772 штамма), большинство из которых являются фитопатогеными (686 штаммов).

С использованием гель-фильтрации освобожденной от клеток куль-туральной жидкости бактерий P.putida М показано, что проявляемая ими антимикробная активность обусловлена продукцией флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм, являющегося соединением класса сидз-рофоров; других антибиотических веществ клетки изучаемого штамма не обравуют. Дополнительным доказательством антимикробной активности данного флуоресцирующего пигмента является отсутствие антимикробной активности бактерий, у которых синтез пигмента репрессирован наличием Fe3*-ионов в среде. Кроме того, неспособность синтезировать пигмент Flu~,SicT-MyTanTaMH P.putida М также коррелирует с утратой антимикробной активности.

2. Фиаиолого-биохимические особенности продукции пиовердина Рм.

При изучении зависимости продукции пигмента от температуры, рН

среды, а также источников углерода и энергии было установлено, что его синтез осуществляется в достаточно широком диапазоне температур (от 23°С до 33°С, с оптимумом при 30°С) и рН среды (от 4,0 до 9,0, с оптимумом 7,0). Из числа 14 углеродсодержащих соединений, способных утилизироваться клетками бактерий Р.риЫсЗа М (глюкоза, этанол, сукцинат, аспарагин, глутамин, метанол, ацетат, глицерин, пируват, лактат, мальтоза, маннит, фруктоза, бензоат) лучшим для продукции пигмента субстратом оказался сукцинат, тогда как при выращивании на средах с глюкозой, аспарагином, метанолом, мальтозой, маннитом, бенаоагом синтез пигмента практически не осуществляется (рис.1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис.1. Диаграмма продукции пковердина Рм на различных источниках углерода.

I-глюкоза, 2-этанол, 3-сукцинат, 4-аспарагин,5-глутамнн, 6-метанол, 7-ацетат, 8-глицерин, 9-пируват, 10-лактат,

II- мальтоза, 12-маннит, 13-фруктоза, 14-бекеоат.

При выращивании бактерий на среде, содержащей одновременно

глюкозу и сукцинат в концентрации 0,12 (рис.2), регистрировался двухфазный рост культуры, напоминающий диауксический, причем, первая фаза сопровождалась задержкой образования пигмента, а активный его сингев соответствовал второй фазе. Очевидно, во время первой фазы утилизируется глюкоэа, а после ее истощения начинает потребляться сукцинат (вторая фаза). Наблюдаемое явление может быть следствием.проявления катаболиткой репрессии.

Рис.2. Динамика, роста и продукция пиовердина Рм на средах,

содержащих: а) глюкозу или сукцинат (по 0,1%) и б) оба источника углерода одновременно

1 - рост и 2 - продукция пигмента на глюкозе; 3 - рост и 4 - продукция пигмента на сукцинате; 5 - рост и 6 - продукция пигмента на глюкозе и сукшшате одновременно.

Показано, что синтез пиовердина Рм, также как и у всех известных п этом отношении флуоресцирующих пигментов Pseudomonas, репрессируется ионами трехвалентного железа. Помимо Fe3+-ионов, уп:е-roDXfjC! синтез пигмента действие 01сазивали ионы Ni'-1", , Sn~+, W°+. Более слабым действием обладали ионы Li+, Са2+, Cd2+, ZnA*, Lb.3*,

А13+, в то время как ионы К+, Ме*-+, РЪ?Л, Сцг+, Ва'*, Сг3"1, №Сз* не оказывали влияния на синтез пиовердина Рм, а ионы Мп';+ стимулировали его продукцию.

3. Физико-химические свойства пиовердина Рм.

Изучение спектральных характеристик очищенного до гомогенного состояния пиовердина Рм показало, что спектр поглощения пигмента имеет два максимума: первый в ультрафиолетовой области (230 им) и второй в видимой области спектра (около 400 нм). При этом положение второго максимума зависит от рН среды. Например, при рН 4,0 максимум находится в области 378 нм, при рН 7,0 - в области 404 нм, а при рН 9,0 - в области 407 нм. При связывании пигмента с ионами трехвалентного железа положение максимума поглощения устанавливается в области 400 нм и не зависит от реакции среды.

Аминокислотный анализ гидролизованных 6М НС1- и Ш- препаратов пиовердина Рм позволил обнаружить в составе его молекулы пять аминокислот: треонин, серин, лизин, оксиаспарагиновую кислоту и -оксиорнитин в молярных соотношениях 3:2:1:1:1 (табл.1).

Таблица 1.

Аминокислотный состав пиовердина Рм

Аминокислота Содержание Молярное соотношение

аминокислот*

Треонин 3,1 3

Серин 2,2 2

Лизин 1.0 1

Оксиаспарагиновая 1.2 1

кислота

N*1-оксиорнитин 1.2 1

* - содержание аминокислот в нМ нормализовано по отношению к лизину

Известно, что флуоресцирующие пигменты Pseudomonas обладают высоким сродством к ионам трехвалентного железа, образуя с ними стабильные комплексы (Leong, 1986). Подобные свойства присущи и пиовердину Рм, что выражается в исчезновении флуоресценции пигмента, а также изменении его спектральных характеристик: утрате зави-С17..;роти положения максимума поглощения в видимой части спектра от pH срсды и появлении дополнительного "плеча" в области 450 нм. Это

свойство было использовало при разработке подходов для изучения взаимодействия пиовердина Рм с ионами других металлов. Установлено, что пиовердин Рм обладает способностью связываться с ионами двухвалентных М2+, Со2+, Бл2*, Си2+, Сс12+ и шестивалентных

Уб+, Мо6+ металлов. Такие ионы, как 1л+, К"1", Мд2+, Са2+, РЬ2+, Мп2+, Ва2+, Ьа3*, Сгэ+, А13+ не образуют комплексов металл-пигмент.

4. Идентификация путей биосинтеза пиовердина Рм.

Выявление ароматического предшественника. Известно, что предшественником бактериальных сидерофоров фенолятного типа является синтезирующаяся из хоривмага 2,3-диоксибенаойная кислота. Учитывая то обстоятельство, что диоксихинолиновое ядро флуоресцирующих пигментов (рис.3) имеет определенное сходство с дкоксибензойной группой тагах фенолятных сидерофоров, как энтерохелин (энтеробактин) и агробактин, было сделано предположение, что синтез хромофорной части пиовердина Рм тагане осуществляется по ароматическому пути.

Я, = СО-СН2-СН2-СО~Ш2

К 2 = пептидная часть молекулы плгмепта

Рис.3. Строение джжеихинолинового хромофора флуоресцирующих пигментов Рзеис1о1гапаа.

Для выяснения пути синтеза диоксихинолшового ядра пиовердина Рм были получены аго1рЬи1-мутанты Р. ри11с)а М с блоком одного из ранних этапов общего участка ароматического пути и дефектные по синтезу фенилаланингидроксилазы. В предварительных экспериментах было установлено, что при выращивании мутантных бактерий в среде с ограниченным содержанием ароматических аминокислот (однако, достаточным для обеспечения нормального роста) продукция пигмента не имела места. На следующем этапе мутантные клетки аго1рЬи1 выращивали в условиях избытка каждой из ароматических аминокислот и определяли образование пигмента. В результате было показано, что продукция пиовердина Рм регистрировалась только при избытке фени-лаланина в среде (100 мкг/мл), тогда как триптофан и тирозин подобного действия не оказывали (рис.4).

Рис.4. Продукция пиовердина Рм клетками аго1р]1и1"мутанта Р.риШа М при избытке трех аминокислот (1), фенилаланина (2), триптофана (3), тирозина (4) и лимите всех, аминокислот (5).

Вместе с тем, взятые поочередно в избытке 2,3-диокскбензойная кислота, 3,4-диоксибензойная кислота, 2,4-диоксибензойная кислота, п-оксибенвойная кислота, п-аминобензойная кислота, катехол, сали-цилат, 3,4-диоксифенилаланин (ДОФА) или антранилат г.родукщпо пигмента не обеспечивали. Минимальная концентрация фенилалашна, достаточная для обеспечения синтеза пиоЕердина Рм мутантными клетками аго1рЬи1, соответствовала 40-50 мкг/мл, а максимальная продукция пигмента наблюдалась при концентрации 100-200 мкг/мл. Синтезируемый иа экзогенного фенил ал анина пиовердин Рм по своим фивико-хши-ческим свойствам не отличался от пигмента, продуцируемого бактериями дикого типа.

Дополнительное доказательство того, что фенил ал анин участвует в биосинтезе пиовердина Рм, было получено в экспериментах по включению в пигмент меченого 14С-фенилаланина (табл.2). Используя приведенные в таблице результаты с учетом коэффициента разбавления пигмента (в 1,607 раза), было рассчитано, что в пигмент переходит 42,81% радиоактивной метки.

. Таблица 2

Включение 14С-фенилаланина в молекулу пиовердина Рм

Анализируемый препарат Концентрация пигмента* Удельная радиоактивность в мкКи/мл Доля остаточной радиоактивности в £

Культура в стационарной фазе роста 0,612 100

Культуральная жидкость после осаждения клеток 9,0 0,282 46,05

Выделенный и очищенный пигмент 5,6** 0,163 26,57

* - концентрация пигмента в связанной с Ре3 -ионами форме в условных единицах при А400» ** - степень разведения 1,607

Выявление пиримидинового предшественника. Было высказано предположение, что вторым компонентом диоксихинолинового ядра пигмента является одно из соединений пиримидинового ряда. Для проверки этого предположения была получена серия зависимых по пиримидинам аук-

сотрофных мутантов Р.р1Йлс1а М, у которых затем изучался синтез пиовердина Рм.

Полученные Руг~-мутанты характеризовались разными уровнями продукции пиовердина Ри - от полного отсутствия его синтеза у мутантов ругА19 и ругВ2 - до нормального.уровня у мутантов ругОб, ругП? и ругЕЗЗ. Как видно из табл.3, в норме пигмент синтезируется лишь клетками, не имеющими изменений в области ругА - ругС-генов, кодирующих синтез карбамоилфосфатсинтазы, аспартат-гранскарбамои-лазы и дигидрооротазы, тогда как мутации в этих генах вызывают либо полную утрату пигментообразования (мутации ругА и ругВ-генов), либо существенно снижают синтез пигмента с одновременным изменением его свойств (мутация ругС-гена). Дефекты генов ругЮ или ругЕ (кодирующих синтез дигидрооротатдегидрогенагы и оротатфосфорибо-зилтрансферазы) не влияют «а образование пигмента. Отсюда следует, что пиримидиновым предшественником пиовердина Рм у бактерий изучаемого штамма является дигидрооротат (либо его производное).

Таблица 3

Продукция пигмента Руг~-мутантами

Мутанты Уровень Антибактериальная Способность

продукции активность связывать FeJ -ионы

пигмента*

Руг+ (дикий тип) 100,0 + +

ругА19 0,6 - н.о.

ругВ2 2,9 - н.о.

pyrCD22 28,6 ±

ругС41 23,13 - ±

pyrD6 100,0 +

pyrD7 100,0 + +

ругЕ32 100,0 + +

* - приведены уровни продукции пигмента (ь %) по отношению к дикому типу, у которого ОП4.00 соответствует величине 3,2

Дополнительное доказательство участия соединений пиримидиново-го ряда в биосинтезе пиовердина Рм было получено при анализе его продукции мутантами P.putida М, резистентными к токсическому аналогу урацила - 5-фторурацилу. Определенная часть (примерно 2%) аналогреаистентных мутантов (обозначены как ругИ-мутанты) характеризовалась повышенной продукцией пигмента, что коррелировало с возрастанием у них удельной активности карбзмо;ц$ас6;у1синтааы в

2,4-10 раз, а аспартат-транскарбамоилазы и дигидрооротаэы примерно на 40% (табл.4).

Таблица 4

Активность ферментов пиримидинового пути у мутантов P.putida М, рееистентных к 5-фторурацилу

Мутанты Удельная активность в нМ/мин'мг белка

КОС-аза АТК-аза ДГО-аза ДГ0-дегидрогеназа

Руг+ (дикий тип) pyrR12 pyrR23 ругК24 0,554 1,340 2,000 5,700 41,10 57,71 57,94 53,00 43,02 56,15 60,64 55,47 0,71 0,85 0,61 0,71

На следующем этапе работы изучалась регуляция синтеза дигидро-оротата у бактерий P.putida М. Для этих целей использовали мутант ругб с поврежденным pyrD-геном, что позволяло лимитировать концентрацию урацила в среде. Было установлено, что у клеток изучаемого штамма различий в активности аспартат-транскарбамоилазы в условиях избытка или недостатка урацила, а также оротата и цитозина не обнаружено, что свидетельствует о конститутивном синтезе данного фермента. Поскольку аспартат-транскарбамоилаза является ключевым ферментом пиримидинового пути, то отсутствие регуляции ее синтеза позволяет предполагать конститутивный характер функционирования всех Руг-генов.

Другой способ регуляции синтеза пиримидинов - аллостерическое ингибирование, ивучали in vitro на уровне аспартат-транскарбамоилазы. Из данных табл.5 видно, что наиболее сильными ингибиторами этого фермента являются пирофосфат, ЦТФ, ГТФ, УТФ. Неожиданным оказался факт стимулирования активности этого фермента фенилалани-ном, который, как было показано ранее, является одним из предшественников пиовердина Рм. В целом следует отметить, что активность аспартат-транскарбамоилазы бактерий P.putida М регулируется слабо, и для ее ингибирования требуются, как правило, достаточно высокие концентрации ингибиторов. Такие продукты пиримидинового пути, как урацил и цитозин, не влияют на активность фермента.

Таблица 5

Ингибирование активности асггартаг-транскарбамоияазы бактерий P.put ida М

Ингибиторы X ингибирования при концентрации ингибитора

1 мМ 5 мМ

Урацил 0 1,10

Цитозин 0 2,00

Оротат 6,60 11,71

Аденозин 10,49 11,70

Гуанозин 8,66 10,64

Цитидин 6,40 7,60

АТФ 10,70 11,60

ЦТФ 10,20 34,00

ГТФ 8,80 25,20

УТФ 5,55 19,90

Фенилаланин +111,11 +137,58

Пирофосфаг 26,20 57,10

Анализ литературы и результатов собственных экспериментов позволяет сделать следующие основные выводы:

ВЫВОДЫ

1. Антагонистические свойства штамма Pseudomonas putida М определяются продукцией его клетками желто-зеленого флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм, являющегося соединением класса свдеро-форов. Антимикробная активность пиовердина Рм проявляется в отношении широкого спектра бактерий и грибов, включая фитопатогенше. Других соединений, обладающих антимикробным действием, у бактерий Р.putida М не обнаружено.

2. Синтез пигмента клетками изучаемого штамма осуществляется в достаточно широком диапазоне температур (от23°С до 33°С) и pH среды (от 4,0 до 9,0). Наиболее подходящим для продукции пигмента источником углерода является сукцинат.

3. Синтез пиовердина Рм подавляется ионами трехвалентного железа, а такзг.е Ni2'*'-, Sn2+- и И^-ионами; ионы Ivín2+ оказывают стимулирующий эффект. Зарегистрировано угнетение продукции пигмента глюкозой.

4. Спектр поглощения пиовердина рм характеризуется двумя максимумами: первым в ультрафиолетовой области спектра (230 ни) и вторым в видимой области (400 нм); положение второго максимума

зависит от pH сроды и может смешдться от 378 им (при pH 5,0) до 407 нм (при pH 9,0). При нейтральном pH максимум поглощения находится в области 404 нм. В связанной с Fe3''-иона).)« форме положение максимума поглощения фиксируется в области 400 нм.

5. Аминокислотный анализ гидролизованного 6N HCl и 6Н HJ ниовердина Рм позволил установить, что в его состав входит пять аминокислот - треонин, серин, лизин, оксиаспарагиновая кислота, Я^-оксиорнитин - в молярных соотношениях 3:2:1:1:1.

6. Показано, что помимо Fe3+-HOHOB пиовердин Рм может связываться со следующими ионами двух- и шестивалентных металлов: Zn2\ Niz\ Со2\ Sn2+, Cu2+, Cd2+, Моб+, W6+.

7. С использованием Aro" и Руг" мутантных бактерий P.putida M установлено, что предшественниками диоксихинолинового ядра пиовердина Рм являются фенилаланин и-дигидрооротат.

8. Синтез основных ферментов пиримидинового пути у P.putida M происходит конститутивно, а регуляция их активности осуществляется на уровне аспартат-транскарбамоилааы путем ингибирования пиро-фосфатом, ГТФ, УТФ, ЦТФ и активации фенилаланином.

9. Получены регуляторте 5-фторурацидрезистентные pyrR-мутан-ты бактерий P.putida M, способные к сверхпродукции флуоресцирующего пигмента и характеризующиеся возрастанием активности отдельных ферментов пиримидинового пути: карбамоилфосфатсинтазы, аспар-тат-транскарбамоилазы и дигидрооротазы.

Работы, опубликованные по материалам диссертации:

1. Максимова Н.П., Блажевич о.В. Аго"-мутанты Pseudomonas sp.M с нарушенным синтезом флуоресцирующего пигмента // Тез.докл. Всес.симпоз."Молекулярные механизмы генетических процессов". М.-1900.-С.240-241.

2. Максимова Н.П., Лысак В.В., Блажевич О.В. Природа антибактериального агента бактерий Pseudomonas sp.M, активного против фи-топагогенных бактерий // В сб. Фитонциды. Бактериальные болезни растений. -Киев-Львов. -1990. -4.2. -С.112.

3. Максимова Н.П., Лысак В.В., Блажевич О.В. Характеристика пиовердипа Рм флуоресцирующих бактерий Pseudomonas sp.M // Тез.докл.Всес.ко:фер."Новые направления биотехнологии4. -Пущино. -1990. -С.44-45.'

4. Максимова Н.П., Лнсак В.В., Блажевич О.В., Фомичев Ю.К.

Штамм Pseudomonas putida M - продуцент пиовердина Р^; использование для защиты растений от фитопатогенов // Тез.юбил.науч. конф."Актуальные проблемы социально-гуманитарных и есте-ствек-ных наук". -Минск. -1991. -С.153-154.

5. Максимова Н.П., Блажевич О.В., Фомичев Ю.К. Роль фенилала-нина в биосинтеае флуоресцирующего пигмента у бактерий Pseudomonas putida М // Микробиология. -N5. -1992. -С.818-823.

6. Максимова Н.П., Лысак В.В., Блажевич О.В., Игнатович O.K. Штамм Pseudomonas putida М - перспективный объект агробиотехноло-гии // Тез.докл.IV Всес.науч.конф."Микроорганизмы в сельском хозяйстве". -Пущино. -1992. -С.122.

7. Блажевич О.В. Использование Аго~-мутантов для идентификации путей синтеза флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм у бактерий P.putida М J/ Тез.докл. VI съезда БелОГиС. -Горки. -1992. -С.99.

8. Блажевич О.В., Фомичев Ю.К. Генетические аспекты биосинтеза флуоресцирующих пигментов у бактерий Pseudomonas putida М // Материалы VI съезда ВОГиС им.Н.И.Вавилова. -Минск. -1992. -С.94.

9. Blagevich О.V., Makslmova N.P., Fomichev Yu.K. Characterization of fluorescent pigment of new plant-growth stimulating bacteria Pseudomonas putida M // International conference on plant pathogenic bacteria. -Paris des Congress Versalles, France. -1992. -Abstract, section P5/A2.

10. Блажевич O.B., Максимова Н.П. Биосинтез пиримидинов бактериями Pseudomonas putida М // Вестник Белгосуниверситета. Сер.2. -1993. -N2. -С. 21-27.

11. Максимова Н.П., Блажевич О.В., Фомичев Ю.К. Роль пиримидинов в биосинтезе флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм У бактерий Pseudomonas putida М // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -1993. -N5. -С.22-28.

12. Блажевич О.В., Максимова Н.П. Биосинтез флуоресцирующего пигмента у ризосферных бактерий Pseudomonas putida М // Известия РАН. -1994. -N2. -С.205-210.

Подписано к печати 5.05.94 г. Формат 60x84 1/16 Объем печ.л. 1,0 Тираж 75 эка. Зака^&'сплагао. Отпечатано на ротапринте Велгосунпаере;;тета