Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гистологические и цитологические особенности молочной железы кроликов как объекта генно-инженерных манипуляций

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Гистологические и цитологические особенности молочной железы кроликов как объекта генно-инженерных манипуляций"

На правах рукописи

ГРЕЗИНА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРОЛИКОВ КАК ОБЪЕКТА ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ МАНИПУЛЯЦИЙ

03.0023 - биотехнология 03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровины -2004

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Зиновьева Наталия Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Дьяконов Лев Петрович; доктор биологических наук Воробьева Светлана Владимировна

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт пушного

звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева

Защита диссертации состоится 22 июня 2004 года, в 10.00 часов, на заседании диссертационного совета Д.006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЖа.

Автореферат разослан мая 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, / кандидат биологическгаснау!

В. П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Одним из основных условий для проведения фундаментальных и прикладных исследований в области экспериментальной морфологии, биологии развития, биотехнологии молочной железы животных является знание особенностей ее строения и развития. Молочная железа представляет собой уникальную модель для изучения роста и дифференцировки клеток в динамике, так как ее становление близко к процессам, протекающим при органогенезе эмбрионов животных.

С точки зрения биоинженерии, научный интерес к маммогенезу кроликов обусловлен тем, что на сегодня это практически единственный вид сельскохозяйственных животных, на котором многочисленные попытки клонирования с использованием соматических клеток оказываются неудачными. Вполне вероятно, что именно клетки молочной железы найдут применение в качестве доноров кариопласта.

Актуальной в настоящее время является проблема получения так называемых соматических трансгенных животных. Так как молочная железа обладает огромным потенциалом синтеза протеинов, а секрет железы, содержащий белки, может быть легко извлечен традиционными технологиями, перспективным является ее использование в качестве продуцирующего органа рекомбинантных белков. Широкое распространение в работах по локальной трансформации молочной железы получили ретровирусные векторные системы [Эрнст. Л.К. и др., 2003]. Одной из особенностей ретровирусов является возможность их репликации и интеграции лишь в интенсивно делящиеся клетки. Поэтому с целью достижения оптимальных результатов необходимо четко представлять динамику развития исследуемого органа.

Если маммогенез мышей и большинства сельскохозяйственных животных охарактеризован достаточно полно, то о развитии молочной железы кроликов в литературных источниках имеется лишь незначительная информация.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение гистологических и цитологических особенностей развития молочной железы кроликов как объекта для генно-инженерных манипуляций.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

- получить гистологические препараты молочной железы кроликов на разных физиологических стадиях (до полового созревания, во время беременности, лактации, в послеотъемный период);

- определить сроки активной пролиферации маммоцитов;

- выделить и охарактеризовать первичную культуру клеток молочной железы кроликов на разных физиологических стадиях;

- определить эффективность трансформации клеток молочной железы крольчих ретровирусными генными конструкциями in vitro;

- изучить возможность трансформации секреторного эпителия молочной железы крольчих ретровирусными конструкциями in vivo.

13. Научная новизна работы. В ходе выполнения диссертационной

работы впервые детально изучено развитие молочной железы крольчих в динамике. Изучен морфологический состав клеток молочной железы in vitro. Впервые дана количественная оценка наличия в популяции клеток молочной железы крольчих, культивируемых in vitro, клеток, обладающих свойствами стволовых- Исследована эффективность трансформации маммоцитов кролика in vitro и in vivo с использованием ретровирусной конструкции pLN-a. Показана возможность переноса чужеродных генов в клетки, молочной железы посредством рекомбинантных аденовирусов.

1.4. Практическая значимость. Установлены сроки наибольшей пролиферативной активности клеток молочной железы крольчих. Показано наличие в молочной железе крольчих популяции стволово-подобных клеток.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

• Пролиферативная активность клеток молочной железы зависит от физиологического состояния крольчих.

• В молочной железе крольчих присутствует популяция клеток с характерными признаками стволовых элементов.

• Малодифференцированные клетки сохраняются в первично-перевиваемой культуре маммоцитов.

• С помощью ретровирусной векторной системы pLN-a возможна трансформация клеток молочной железы кролика in vitro.

1.6. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п. Дубровицы, 2003 год; на научно-практической конференции «Повышение

конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», п. Быково, 2003; на научном отчете отдела биотехнологии, ВИЖ, п. Дубровицы, 2003; на конференции отдела биотехнологии, ВИЖ, п. Дубровицы, 2004 год.

1.7. Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

1.8. Структура и объем работы. Диссертация написана на 114 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, который включает 187 источников, в том числе 80 на иностранных языках. Работа содержит 6 таблиц и 32 рисунка.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Экспериментальные исследования проводились в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных в 2001-2004 гг. в соответствии с планом научно-исследовательской работы отдела биотехнологии ВИЖ.

Работа выполнялась согласно схеме (рис. /).

Исследования проводили на разновозрастных помесных (шиншилла х белый великан) крольчихах, содержащихся на экспериментальном физиологическом дворе Всероссийского ГНИИ животноводства, находящихся на разных физиологических стадиях. Материал отбирали непосредственно после забоя животных или хирургическим путем (биопсия).

Гистологические препараты и необходимые растворы готовили по классической методике [Ромейс, 1953]. Анализ гистопрепаратов проводили с использованием компьютерной программы Image Scope.

В работе были использованы ретровирусные векторные системы, состоящие из двух компонентов: генной конструкции и линии клеток-«упаковщиц», и аденовирусный вектор.

Рекомбинантный ретровирусный eeimopLN-a. В его состав входит рекомбинантный ген эритропоэтина человека, поставленный под контроль промотора a-Si-казеина крупного рогатого скота (представлена ВНИИФБиП). Для упаковки данного вектора была использована линия клеток АМ-12 (предоставлена Фоминым И.К., Белорусский НИИ переливания крови, г. Минск).

Рис. 1. Схема опыта.

Рекомбинантный ретровирусный вектор pBMN-lacZ. В его состав

входит ген /?-гапакгозидазы под контролем вирусного промотора цитомегаловируса человека (CMV). Для упаковки были использованы клетки-упаковщицы» линии pgI3 (предоставлены Судариковым А.Б., Гематологический центр, г. Москва).

Аденовирусный вектор Ad5 SEAP был получен на основе человеческого вируса Ad5, ген белка Е1 которого заменен на рекомбинантный ген плацентарной щелочной фосфатазы (предоставлен профессором Народицким Б.С., Всероссийский НИИ экспериментальной медицины, г. Москва).

Линии клеток-«упаковщиц» выращивали в среде БМЕМ с 10% БС8 и гентамицином (конечная концентрация 50 мкг/мл).

В качестве клеток-мишеней использовали клетки молочной железы кролика, ростовой средой которых являлась среда БМЕМ/Б-12 1:1 с добавлением 10% БС8, 2тМ а-глутамина, 10 нг/мл ЕвБ, 5 мг/мл инсулина и гентамицина (конечная концентрация 50 мкг/мл).

Анализ интеграции и экспрессии трансгена проводили гистохимическим, цитологическим и гематологическим методами.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Становление молочной железы у кроликов.

3.1.1. Гистологическая структурамолочнойжелезыкрольчих.

В ходе проведения исследований разных групп животных {табл. 1) было установлено, что молочная железа крольчих в период полового созревания была представлена в основном жировой тканью, в которой происходило формирование протоковой системы.

Таблица. 1. Группыживотнъж.

Неполовозрелые, мес 3,4,5

Половозрелые, мес. 6

Беременность, дней 5,10,15,20,25,30

Лактация, дней 2,7,14,21,28

Отъем, дней 2,7

Наибольшее становление молочной железы отмечалось во время беременности. К 10 дню сукрольности у разновозрастных самок на концах молочных протоков располагались альвеолоподобные образования с двухслойным кубическим эпителием. В 20 дней беременности они уже имели узкий просвет и были выстланы двух-, трехслойным эпителием, при этом отмечалось значительное количество молочных долек, разделенных толстыми слоями соединительной ткани.

С 20 по 25 дни сукрольности наблюдали интенсивное разрастание секреторной ткани в латеральном направлении. На разрезе в это время выделялось незначительное количество секрета. На гистологических препаратах было видно, что молочные дольки сложены в сплошной пласт паренхимы железы с хорошо выраженными пограничными зонами из рыхлой соединительной ткани. Эта стадия характеризовалась наличием альвеол, выстланных однослойным кубическим эпителием с уплощенными клетками.

В подсосный период молочная железа у кроликов была распластана по грудобрюшной стенке, при пальпации ощущалось незначительное утолщение; на разрезе обильно выделялся секрет. Между молочными дольками на гистологических препаратах визуализировались тонкие прослойки соединительной ткани. Альвеолы были хорошо сформированы, плотно прилегали друг к другу. В одном поле зрения можно было видеть как растянутые накопившимся секретом, так и спавшиеся альвеолы, с сильно сплющенными, в первом случае, и кубическими эпителиальными клетками, во втором. Нередко встречались двуядерные клетки. На протяжении всей лактации гистологическая картина молочной железы практически не изменялась.

После отъема кроликов на 7-ой день железа все еще была представлена сплошным пластом, однако, при разрезе выделялся густой липкий секрет. На гистологических препаратах было видно, что альвеолы уменьшались в размере, имели неопределенную форму, паренхима заменялась соединительнотканной стромой, структура и упорядоченность клеток нарушалась, что свидетельствовало о происходящих процессах инволюции.

Доля паренхиматозной ткани в молочной железе крольчих наразных физиологическихстадиях.

Суммируя данные по количеству секреторной ткани (рис. 2), можно сделать вывод, что у самок в период полового созревания отмечалось незначительное количество паренхимы. С наступлением беременности этот

показатель возрастал, и наибольшее увеличение количества секреторной ткани было отмечено с 20 по 25 дни сукрольности.

После отъема крольчат к 7 дню доля секреторной ткани снижалась (рис. 2). Однако полной инволюции секреторного отдела не происходило, в связи с чем, у холостых ранее кролившихся самок отмечались значительные различия в структуре молочной железы, и превосходство в количестве паренхиматозной ткани по сравнению с половозрелыми молодыми самками.

Рис 2. Зависимость доли железистой ткани молочной железы от физиологического состояния.

70

С I I I I I I I I I I I I I I I I I I

3 4 S X 5 10 16 20 25 30 2 7 14 21 28 2 7 возраст.'мес беременность, дн лактация, дн отъем, дн

Примечание: х) половозрелые холостые самки.

3.1.2. Изменениеядрамаммоцитов.

Одним из показателей пролиферативной активности клеток является плотность и размер их ядер.

Ядра клеток молочной железы неполовозрелых крольчих обладали относительно высокой плотностью (рис. 3) и были незначительных размеров (рис. 4). Как видно из рисунка 3, по мере полового созревания ядра клеток уплотнялись, с наступлением беременности этот показатель резко увеличивался, и одновременно уменьшался размер ядер (рис. 4). В 10 дней беременности при относительно больших размерах ядер отмечалась слабая плотность, что свидетельствует о деконденсации хроматина и наличии в этот период, в основном, диплоидных клеток.

Усиление процесса пролиферации секреторных клеток отмечалось во вторую декаду сукрольности, в связи с чем ядра становились крупными, с четко видимыми ядрышками, причем их плотность до конца беременности колебалась в незначительных пределах и оставалась на достаточно высоком уровне (рис. 3).

Рис 3. Зависимость плотности ядра клеток молочной железы от физиологического состояния.

Примечание: х) половозрелые холостые самки.

Рис 4. Зависимость размера ядра клеток молочной железы от физиологического состояния самки.

Примечание: б) половозрелые холостые самки.

и

Размер ядер с начала беременности увеличивался и в начале третьей декады достигал максимума, затем перед родами этот показатель снижался, а во время лактации снова возрастал (рис. 4).

Ядра лактоцитов имели четкие контуры, хорошо красились, их плотность уменьшалась с первых дней и до 21-ого дня лактации (рис. 3).

При биометрической обработке данных была установлена незначительная обратная связь между долей паренхиматозной ткани и плотностью ядра клеток молочной железы молодых и ранее кролившихся самок (г=-0,397 и -0,338, соответственно). Более выраженная обратная зависимость прослеживалась между площадью и плотностью ядер маммоцитов у ранее кролившихся животных (г=-0,587) и прямая зависимость - между долей паренхимы и площадью ядер клеток молочной железы (г=0,656).

3.1.3. Определение относительного количества ДНК в ядрах клеток молочной железы.

Определение относительного количества ДНК в ядрах маммоцитов показало, что в молочной железе крольчих в период полового созревания содержались преимущественно диплоидные клетки, при этом происходило незначительное накоплении ДНК в ядрах клеток, по-видимому, до триплоидного состояния.

На начальных стадиях беременности, наблюдалось хорошо выраженное накопление клеток с диплоидным и тетраплоидным содержанием ДНК, что характеризует нормальную митотическую активность ткани развивающейся железы. Однако со второй половины беременности заметно увеличение числа полиплоидных клеток. И если при 15-дневной беременности ядра клеток, в основном, были триплоидными, то к 25 дню превалировала популяция тетраплоидных клеток.

На 2-7 дни лактации наблюдалось накопление, в основном, диплоидных клеток с небольшим дополнением полиплоидных. Новая волна активизации биосинтеза ДНК отмечалась на 14 день лактации, когда выделялось наибольшее количество молока.

3.2.

Культивирование клеток молочной железы.

Доя изучения морфологического состава клеток молочной железы была получена первично перевиваемая культура от холостых и лактирующих самок.

Было отмечено три типа клеток: крупные и мелкие круглые клетки с большим ядром и узким ободком цитоплазмы, которые интенсивно окрашивались по Гимза, фибробластоподобные клетки, имеющие веретенообразную форму.

Процентное соотношение их менялось в зависимости от количества пассажей. Как видно из графика (рис. 5), культура маммоцитов кролика, независимо от пассажа, представлена, большей частью, фибробластоподобными клетками. Сильно варьировало количество круглых клеток разных размеров. При каждом пересеве процент круглых клеток снижался, и уже на У-УГ пассажах культура состояла в основном из фибробластоподобных клеток.

Рис 5. Процентное соотношение разных типов клеток молочной железыкролика взависимости от пассажа._

1 2 з

□мелкие круглые О крупные круглые

□фибробластоподобные клетки

Клетки молочной железы в период лактации, культивируемые in vitro, были больших размеров, после прикрепления к чашке в их цитоплазме обнаруживались капли секрета. Наличие желтого цвета при окраске Суданом (характерная реакция на жир) показало, что в клетках действительно происходил синтез молока. На этой стадии пролиферация клеток in vitro не отмечалась.

3.2.1. Качественная и количественная характеристика клеток молочной железы крольчих, обладающих свойствами стволовых клеток.

Первично трипсинизированная суспензия клеток молочной железы, полученная от животных на разных физиологических стадиях, была обработана флуоресцентным красителем Hoechst 33342, который применяется для обнаружения стволовых клеток в разных органах.

Как видно из рисунка 6, популяция клеток, обладающих свойствами стволовых клеток, присутствовала в молочной железе крольчих всегда, но количество их менялось - до половой зрелости процент малодифференцированных клеток наивысший, а в период лактации он резко снижался, так как клетки к этому времени окончательно специализировались, и основной их задачей становился биосинтез молока.

Рис 6. Количество малодифференцированных клеток в молочной железе на разных физиологических стадиях.

3.2.2. Изучение поддержания в культуре клеток молочной железы крольчих, обладающих свойствами стволовых элементов, в процессе культивирования in vitro.

Согласно нашим исследованиям, малодифференцированными элементами молочной железы кролика являются мелкие круглые клетки с большим ядром и узким ободком цитоплазмы, интенсивно окрашивающиеся по Гимза, обладающие повышенной активностью щелочной фосфатазы и светящиеся характерным красным цветом в УФ (длина волны 350 нм) при обработке Hoeclist 33342.

□ иеполоюзралая Ябеременная

вполояоэрелая Влагмрующая самка

Рис 7. Соотношение количества мелких круглых клеток и клеток, окрашивающихся Hoechst 33342, in vitro в зависимости от пассажа.

30,5%

' 2 3

□ светящиеся ■ мелкие круглые клетки

Установлено, что в процессе культивирования происходит утеря стволово-подобных клеток (12,8% во II пассаже и 5,4% в III пассаже) (рис. 7), которая коррелирует с уменьшением количества мелких круглых клеток (r=0,832).

33. Использование вирусных векторных систем для трансформации соматических клеток кролика.

3.3.1. Перенос генов вмаммоциты in vitro.

Селекция клеточныхпопуляций.

Рекомбинантные ретровирусные конструкции pBMN-lacZ И pLN-a несут доминантный маркер пео, что обеспечивает возможность селекции клеток-«упаковщиц», интегрировавших данные генные конструкции, на среде с G418. Нами были протестированы клетки-«упаковщицы» и клетки молочной железы.

Гибель клеток, продуцирующих рекомбинантный ретровирус pBMN-lacZ, и клеток-мишеней в селективной среде отмечалась на 3-5 сутки. При этом, как видно из таблицы 2, полная гибель маммоцитов наблюдалась при концентрации генетицина 300 мкг/мл, клеток pgl3 - 400 мкг/мл, а клетки-«упаковщицы» генно-инженерной конструкции выживали и хорошо

пролиферировали даже при концентрации генетицина 900 мкг/мл.

Таблица. 2. Устойчивость клеток к различным концентрациям генетицина в селективной среде.

Тип клеток Титр G 418 (мкг/мл)

100 200 300 400 500 600 700 800 900

Маммоциты + + - - - - - - -

pgl3 pBMN-lacZ + + + - - - - - -

AM- 12 pLNa + + + + + + + + +

Примечание: + наблюдается пролиферация клеток; ± частичная гибель клеток; - гибель всех клеток.

Трансфекциямаммоцитов геномpBMN-IacZ В результате гистохимического исследования в трех повторах культуры клеток молочной железы кролика после сокультивирования с продуцентами модифицированного ретровируса pBMN-lacZ, клеток, синтезирующих /¡-галактозидазу (характерный сине-зеленый цвет), обнаружено не было.

Анализ экспрессиирекомбинантного гена hEpo в клетках молочной железы in vitro. В результате сокультивирования маммоцитов и клеток, продуцирующих модифицированный ретровирус, регистрировалась экспрессия рекомбинантного белка эритропозтина.

При микроскопии иммуноцитологических препаратов были выявлены различия в эффективности трансфекции в зависимости от типа клеток (табл. 3).

Таблица. 3. Частота генетической трансформацииклетокмолочной железы геном hEpo in vitro.

Тип клеток Сокультивирование

клетки-«упаковщицы» супернатант конц. супернатант

общее число 2,45xl0"J 2,5x10"4 3,7x10"*

круглые мелкие 6,6x10"* 1x10° 3x10"5

круглые крупные 5x10"* 4x10"3 1,6x10"4

фибробластоподобные 3,6x10° 2x10"* 1,8x10"*

Частота генетической трансформации клеток молочной железы кролика снижалась при использовании в качестве источника рекомбинантного гена супернатанта клеток-«упаковщиц».

3.3.2. Микросферы при генетической трансформации клеток молочной железы in vitro.

С целью возможного повышения эффективности генетической трансформации клеток молочной железы кроликов были использованы полимерные гранулы и капсулы, предоставленные Всероссийским НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии,1 г. Покров. В результате исследований установили, что в процессе культивирования через отверстия данных конструкций во внешнюю среду проникали рекомбинантные ретровирусы, что подтвердилось трансформацией клеток молочной железы, культивируемых в течение суток в очищенной длительным высокоскоростным центрифугированием ростовой среде, где находились гранулы и капсулы. Однако наряду с ретровирусами через отверстия гранул и капсул выходили и продуцирующие их клетки. Освободившиеся клетки прикреплялись к чашке и начинали активно делиться, образуя целые колонии, тем самым, загрязняя культивируемые клетки-мишени.

3.4. Перенос генов посредством аденовирусных векторов in vitro.

Использование аденовирусного вектора Ad5 SEAP, несущего кДНК плацентарной щелочной фосфатазы, делает возможным перенос чужеродных генов в клетки молочной железы кролика. Анализ показал наличие в ростовой среде рекомбинантного белка, причем количество его варьировало (табл. 4).

Таблица. 4. Количество щелочной фосфатазы в ростовой среде после обработки клеток аденовирусным препаратом Ad5 SEAP, mED/мл

Культивирование маммоцитов со сменой ростовой среды

I смена II смена

24 ч 48 ч 24 ч 48 ч

4,9 10,6 5,2 5,3

Примечание: одна mED/мл — это количество фосфатазы, которое гидролизует 1,0pmolPNPP до min.

3.5. Трансформация клеток молочной железы in vivo.

Инъекции ретровирусных векторов осуществляли в несколько точек второй-третьей пары молочной железы кроликов на 19-23 дни беременности и сразу после спаривания

Таблица. 5. Введение ретровирусных векторных систем в молочную железу крольчих.

Показатели Конструкция

pBMN-lacZ pLN-a

супернатант клетки супернатант клетки

число животных, гол 5 5 5 3

доза на одну долю 2 мл 1 млн 1 мл 0,5 млн

Образцы молочной железы отбирали на 14 день лактации или после гибели всех крольчат в гнезде, при этом исследования проводили гистологическим и цитологическим методами.

3.5.1. Изучение трансформирующей способности ретровирусной векторной системы pBMN-lacZ.

При микроскопии 18 гистосрезов, полученных из разных мест молочной железы от каждого животного, участков с характерным для клеток, синтезирующих . /?-галактозидазу, сине-зеленым цветом обнаружено не было. Микроскопический анализ выделенной и обработанной культуры клеток также не дал положительных результатов.

3.5.2. Оценка интеграции и экспрессии рекомбинантного гена hEpo in

vivo.

В результате микроскопии 16 гистосрезов от каждого животного участков с характерным красно-коричневым окрашиванием для комплекса эритропоэтин-антитела не наблюдалось.

Кроме тканей молочной железы на наличие экспрессии рекомбинантного гена hEpo было исследовано молоко опытных животных методом ИФА. В результате сигнал присутствия рекомбинантного эритропоэтина не поступил, что могло быть связано с его наличием ниже порога детекции метода, т.е. менее 50 нг/мл.

Таблица 6. Показатели гематологических исследований

Показатели м 2 Супернатант рЫУ-а Клетки рЫ\'-а Контроль

О. о 384 389 404' 358' 388 427 437' 475 433 336 405" 438" 400"

Я

1 2 1 2 1 2

Гемоглобин, VI ...........Ч П 1

г% N 1 о о" •—< Т—< ■У» 00 о" 14,4 чо О* ■о Г—< ■ч а Ч см с? , Г' ..!< и. . о" о* сл оС см оо" Ч

Эритроциты, V/' { 1

млн/мкл 5-7,5 \0 „ р. * (г > 6,29 СП Т Г»" 00 «-Г 'О- VI С\ и-Г 7,02 о * £ ■»Г »о 6,09 6,56 О-. V© СМ О, 1Л см 5,44 СО ^ VI

Примечание *) ретровирусный вектор введен в день спаривания,

**) контроль для животных, ретровирусный вектор которым был введен в день спаривания,

1) анализ на 3 день после введения конструкции,

2) анализ на 2 неделю лактации

Поскольку уровень экспрессии ретровирусных генных конструкций может быть относительно низким, нами были выполнены исследования косвенной оценки экспрессии эритропоэтина у опытных животных. Для этого провели гематологические, исследования крольчих, в молочную железу которым были введены рекомбинантные ретровирусы (табл. 6).

В качестве контроля использовались животные, аналогичные по физиологическому состоянию.

Из табличных данных следует, что в группе животных, которым в день спаривания вводили ретровирусный вектор рЬЫ-а в виде супернатанта клеток-«упаковщиц», количество эритроцитов и гемоглобин на третий день после инъекций увеличивались, соответственно, на 6% и 11,2%. Показатели крови у этих же животных на вторую неделю лактации соответствовали физиологическим нормам.

Таким образом, полученные данные можно рассматривать в качестве косвенного доказательства наличия экспрессии эритропоэтина, обусловленной введением в молочную железу крольчих генно-инженерной- конструкции. Однако уровень экспрессии был относительно низким и поэтому не мог быть выявлен ни одним из используемых химических методов детекции.

4. ВЫВОДЫ

1. Молочная железа кроликов меняет свою структуру и размеры в зависимости от физиологического состояния: до половозрелости молочная железа в основном представлена жировой тканью, в которой происходит формирование системы выводных каналов; в период сукрольности наблюдается интенсивное становление паренхиматозной ткани, достигающее максимума в третьей декаде беременности; лактационный период характеризуется наивысшей секреторной деятельностью маммоцитов; в послеотъемный период в молочной железе происходят инволюционные процессы, но альвеолы при этом полностью не исчезают, а лишь уменьшаются в размерах и сжимаются.

2. Наибольшая пролиферативная активность клеток молочной железы кроликов отмечается в первые дни беременности с началом деления малодифференцированных элементов и с 20 по 25 дни сукрольности в период максимального увеличения количества секреторных клеток. Независимо от физиологического состояния в молочной железе кроликов всегда присутствуют

малодифференцированные клетки, но количество их варьирует от 1,7% в период лактации до 6,8% - в период, предшествующий половому созреванию.

3. Первичная культура клеток молочной железы крольчих in vitro представлена тремя типами клеток: мелкие и крупные круглые, и фибробластоподобные клетки, на долю которых в I пассаже приходится, соответственно, 30,5, 19,9 и 49,6%. Среди популяции мелких круглых клеток, которые морфологически подобны стволовым клеткам (большое ядро и узкий ободок цитоплазмы, повышенная активность щелочной фосфатазы), обнаружены малодифференцированные клетки, количество которых в I пассаже составляет 14,4%. Установлено, что в процессе культивирования происходит утеря стволово-подобных элементов (12,8% во II пассаже и 5,4% в III пассаже), что коррелирует с уменьшением количества мелких круглых клеток (r=0,832).

4. Культура клеток молочной железы крольчих может быть трансформирована ретровирусным вектором несущим ген эритропоэтина человека, с частотой генетической трансформации до 2,45x10-3. Наиболее компетентными к генно-инженерной конструкции оказались фибробластоподобные клетки (до 3,88хЮ"3), в то время как частота трансформации мелких и крупных круглых клеток не превышала, соответственно, 6,76x10-4 и 6,5х10-4

5. Доказана возможность трансформации молочной железы крольчих ретровирусной генно-инженерной конструкцией in vivo, однако уровень экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке крольчих был ниже 50 нг/мл.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Лабораториям, занимающимся локальным трансгенезом молочной железы кроликов, рекомендуем учитывать период наибольшей пролиферативной активности маммоцитов - 20-25 дни сукрольности.

2. Рекомендуем продолжить изучение малодифференцированных клеток молочной железы, необходимых при биоинженерных работах на кроликах.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Грезина Н.М., Шихов ИЛ., Зиновьева Н.А. Приготовление гистологических препаратов маточной железы кроликов / Сб. Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных». - ВИЖ. - Дубровицы. - 2002. - С. 2532.

2. Грезина Н.М. Определение пролиферативной активности клеток молочной железы крольчих / Сб. Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных. - ВИЖ. - Дубровицы. -2002. -С. 115-120.

3. Грезина Н.М. Становление молочной железы крольчих // Материалы международной научно-практической конференции по проблеме: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». - Быково. - РАМЖ, вып. 9. - 2003. - С. 175-176.

4. Грезина Н.М. Использование ретровирусных векторов для трансформации клеток молочной железы кроликов in vitro / Сб. Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных. - Дубровицы. - 2003. - С. 99-101.

5. Грезина Н.М., Зиновьева Н.А. Стволовые клетки молочной железы как инструмент биоинженерии сельскохозяйственных животных // Достижения науки и техники АПК. - 2003.-№ 10.-С. 14-16.

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл, Подольский р-н, п Дубровицы Тел. (8 - 27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14-07

Сдано в набор 17.05 2004. Подписано в печать 18.05 2004 _Заказ №17. Печ л. 1,1 Тираж 90 экз

ч -98 40

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грезина, Наталья Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молочная железа как сложный эпидермапьный комплекс.

1:1.1. Строение молочной железы животных.

1.1.2. Рост и развитие молочной железы.

1.1.3. Гормональная регуляция маммогенеза.15>

1.1.4. Изменения плоидности клеток молочной железы в динамике.

1.2. Пролиферация клеток молочной железы.

1.2:1. Стволовые клетки и их характеристика.

1.2.2. Клетки-предшественники молочной железы.

1.2.3. Ддерно-цитоплазматические изменения клеток.

1.3. Методы генетической трансформации клеток.

1.3.1. Ретровирусные векторы как метод переноса и экспрессии чужеродных генов у млекопитающих.

1.3.2. Семейство Adenoviridae.

1.4. Молочная железа как источник рекомбинантных белков.

115. Экспрессирующая способность трансформированных in vitro клеток.

1.6. Селекция клеток.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Оборудование, реактивы и используемые растворы.

2.2. Подготовка животных.

2.3. Получение и анализ гистологических препаратов.

2.4. Культивирование клеток.

2.5. Окраска клеток молочной железы Hoechst 33342.

2.6. Определение активности щелочной фосфатазы в клетках молочной железы in vitro.

2.7. Используемые рекомбинантные вирусные векторы.

2.8. Совместное культивирование.

2.9J Анализ интеграции и экспрессии трансгена.

3. СОБСТВЕННЬШ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Структурные характеристики становления и функции молочной железы у кроликов.

3.1.1. Гистологическая структура молочной железы крольчих.

3.1.2. Изменение ядра маммоцитов.

3.1.3. Определение относительного количества ДНК в ядрах клеток молочной железы.

3.2. Культивирование клеток молочной железы.

3.2.1. Качественная и количественная характеристика клеток молочной железы крольчих, обладающих свойствами стволовых клеток.

3.2.2. Изучение поддержания в; культуре клеток молочной железы крольчих, обладающих свойствами стволовых элементов, в процессе культивирования in vitro.

3.3. Использование ретровирусных векторных систем; для трансформации соматических клеток кролика.

З.ЗЛ. Перенос генов в маммоциты in vitro.

3.3.2. Микросферы при генетической трансформации клеток молочной железы in vitro.

3.4. Перенос генов посредством аденовирусных векторов.

3.5. Трансформация клеток молочной железы in vivo.

3.5.1. Изучение трансформирующей способности ретровирусной векторной системы pBMN-lacZ.

3.5.2. Оценка интеграции и экспрессии рекомбинантного гена hEpo in vivo

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гистологические и цитологические особенности молочной железы кроликов как объекта генно-инженерных манипуляций"

Актуальность темы.

Одним из основных условий при проведении фундаментальных и прикладных исследований в области экспериментальной морфологии, биологии развития, биотехнологии молочной железы животных является; знание особенностей ее строения и развития. Молочная железа представляет собой уникальную модель для изучения роста и дифференцировки клеток в процессе развития. Процесс ее становления близок к процессам, протекающим при органогенезе эмбрионов животных.

С точки зрения биоинженерии, научный интерес к маммогенезу кроликов обусловлен тем, что на сегодня это. практически; единственный вид сельскохозяйственных животных, на котором, многочисленные попытки клонирования с использованием соматических" клеток оказываются; неудачными. Основываясь на том, что первое успешное: соматическое клонирование сельскохозяйственных животных было проведено, с использованием маммоцита в качестве донора кариопласта (Долли) [Wilmut et al., 1997], вполне вероятно,, что для разработки; технологии получения кроликов данным методом найдут применение именно клетки молочной железы.

Так как молочная железа обладает огромным потенциалом синтеза протеинов, а секрет железы, содержащий рекомбинантные белки, может быть легко извлечен традиционными технологиями, перспективным является ее использование в качестве продуцирующего органа? для получения рекомбинантных белков. В качестве одного из практических приемов достижения экспрессии рекомбинантных белков в молоке: животных рассматриваются методы так называемого локального трансгенеза. Преимуществами локальной трансформации молочной- железы животных являются возможность работы уже: с взрослыми животными, относительная простота метода, а так же короткий период времени от начала эксперимента до получения; первых данных об экспрессии рекомбинантных белков, и их производстве [Эрнст и др:, 1994; Титова, 2001; Волкова, 2002];

Широкое распространение в; работах по локальной: трансформации? молочной железы получили ретровирусные векторные системы. Одной из особенностей ретровирусов является возможность их репликации и интеграцию лишь Ъ1 интенсивно делящиеся клетки: Поэтому с целью- достижения' оптимальных результатов необходимо «четко представлять динамику развития-исследуемого; органа:. Если маммогенез мышей и большинства сельскохозяйственных животных охарактеризован достаточно полно [Богдашев s и др., 1957; Овчинникова, 1977, 1985; Георгиевский и др., 1988; Медведев и др., 1988; Daniel et al., 1971? a, b; Michel, 1983; Cordon et aK, 1998; Smith, 1998], to o развитии молочной железы кроликов в литературных;источниках имеется-лишь незначительная информация [Курбатова; 1973i 1977 а, б].

Цель и задачи исследований;

Целью настоящей работы являлось изучение гистологических и цитологических особенностей развития молочной железы кроликов как объекта; для генно-инженерных манипуляций:

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

- получить гистологические препараты' молочной- железы кроликов на разных физиологических стадиях (до полового созревания, во=время; беременности, лактации, в постотъемный период);

- определить сроки активной пролиферации маммоцитов;

- выделить и ■■ охарактеризовать первичную культуру клеток молочной железы кроликов на разных физиологических стадиях;,

- определить эффективность трансформации клеток молочной i железы крольчих ретровирусными генными конструкциями in vitro;

- изучить возможность трансформации секреторного эпителия молочной железы крольчих ретровирусными конструкциями ш vivo.

Научная новизна работы.

В ходе выполнения диссертационной работы впервые детально изучено развитие молочной железы крольчих в динамике и определена оптимальная стадия для введения ретровирусных генных конструкций с целью локального трансгенеза молочной железы. Изучен морфологический состав клеток молочной железы in vitro. Впервые дана количественная оценка наличия в популяции клеток молочной железы крольчих, культивируемых in vitro, клеток, обладающих свойствами стволовых (£Р-клетки). Исследована эффективность трансформации маммоцитов кролика in vitro и in vivo с использованием ретровирусной конструкцией pLN-a. Показана возможность переноса чужеродных генов в клетки молочной железы посредством рекомбинантных аденовирусов.

Практическая значимость.

Определен период наибольшей пролиферативной активности клеток молочной железы кролика, обнаружены стволово-подобные клетки в молочной железе кроликов.

Положения, выносимые на защиту.

• Пролиферативная активность клеток молочной железы зависит от физиологического состояния крольчих.

• В молочной железе крольчих присутствует популяция клеток с характерными признаками стволовых элементов.

• Малодифференцированные клетки сохраняются, в первично-перевиваемой культуре маммоцитов.

• С помощью ретровирусной векторной системы pLN-a возможна трансформация клеток молочной железы кролика in vitro.

Структура и объем работы.

Диссертация написана на 114 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, который включает 187 источников, в том числе 80 на иностранных языках. Работа содержит 6 таблиц и 32 рисунка.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Грезина, Наталья Михайловна

5. ВЫВОДЫ

Г. Молочная железа кроликов меняет свою; структуру и размеры в зависимости от физиологического состояния: до половозрелости молочная; железа; в; основном; представлена жировой; тканью, в которой; происходит формирование системы выводных каналов; в период сукрольности наблюдается интенсивное становление1 паренхиматозной ткани, достигающее максимума в третьей декаде беременности; лактационный; период характеризуется; наивысшей, секреторной деятельностью маммоцитов; в послеотъемный период в; молочной железе происходят инволюционные; процессы, но альвеолы прю этом полностью не исчезают, а лишь уменьшаются в размерах и сжимаются.

2. Наибольшая пролиферативная активность клеток молочной» железы кроликов отмечается в первые дни; беременности с началом5 деления, малодифференцированных элементов и с 20 по 25 дни сукрольности в период максимального увеличения количества секреторных клеток. Независимо от физиологического состояния в молочной железе кроликов < всегда присутствуют малодифференцированные; клетки, но? количество? их варьирует от 1,7% в период лактации до 6,8% - в период, предшествующий половому созреванию.

3. Первичная культура клеток молочной железы крольчих in vitro представлена тремя типами клеток: мелкие и крупные: круглые,- и фибробластоподобные клетки, на долю которых в I; пассаже приходится;, соответственно, 30,5, 19,9'и 49,6%. Среди популяции мелких круглых клеток, которые морфологически подобны стволовым клеткам (большое ядро и узкий ободок цитоплазмы, повышенная активность щелочной фосфатазы), обнаружены малодифференцированные клетки, количество которых в I пассаже составляет 14,4%. Установлено, что в процессе культивирования г происходит утеря стволово-подобных элементов (12,8% во II пассаже и 5,4% в III пассаже), что коррелирует с уменьшением количества мелких круглых клеток (г=0,832).

4. Культура клеток молочной железы крольчих может быть трансформирована ретровирусным вектором pLN-a, несущим ген л эритропоэтина человека, с частотой генетической трансформации до 2,45x10". Наиболее компетентными к генно-инженерной конструкции оказались фибробластоподобные клетки до 3,88x10 ), в то время как частота трансформации мелких и крупных круглых клеток не превышала, соответственно, 6,76x10"4 и 6,50x10"4.

5^Доказанавозможность трансформации молочной железы крольчих ретровирусной генно-инженерной конструкцией in vivo, однако уровень экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке крольчих был ниже 50 нг/мл.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Лабораториям, занимающимся локальным трансгенезом молочной железы кроликов, рекомендуем учитывать период наибольшей пролиферативной активности маммоцитов — 20-25 дни сукрольности.

2. Рекомендуем продолжить изучение малодифференцированных клеток молочной железы, необходимых при биоинженерных работах на кроликах.

97

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грезина, Наталья Михайловна, п. Дубровицы, Московской обл.

1. Акаевский А.И; Анатомия домашних животных М.,«Колос», 1975—592с.3^ Александровская О.В. и др. Цитология, гистология и эмбриология. — М.: Агропромиздат, 1987. с. 334-337.

2. Алов И.А., Брауде А.И., Аспиз М.Е. Основы функциональной морфологии клетки.— Mi: Медицина, 1969. -е. 332-341.

3. Андреева З.П., Тарнавич Г.Н., Овчинникова Р.Е. и др. Сравнительная; анатомия выводной системы молочной железы; у домашних животных / Трудьг свердловского сельскохозяйственного института. Т. 43. Пермь, 1977. — с. 3-7.

4. Биотехнология: В 8 кн. Кн. 1: Прблемы и перспективы. М.: Высш. шк., 1987.-159 с.

5. Битюков; И.П. и др. Практикум по физиологии сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат, 1990.-256 с.

6. Богдашев Н.Ф:, Елисеев А.П. Молочные железы сельскохозяйственных животных. — М-Л., 1957. — с. 131.

7. Бойд Дж. Цветной атлас «Топографическая анатомия собаки и кошки». — М.: Скорпион, 1998. 190 с.

8. Н.Волкова Н.А. Интеграция и экспрессия экзогенов< в молочной железе соматических трансгенных животных, полученных с использованием ретровирусных векторов // Дисс. . канд. биол. наук. Дубровицы, 2002.-100 с.

9. Волкова Н.В., Титова В.А. Иммуноферментный анализ определения концентрации рекомбинантного эритропоэтина в молоке / Школа-практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2002.-с. 12-17.

10. Газарян: K.F. Трансгенные животные: перспективы использования в животноводстве// Сельскохозяйственная биология, 1988, № 2. с. 31-39.

11. Галанцев В.П., Гуляева Е.П. Эволюция лактации.-JL: Наука, 1987.-176 с.

12. Гвоздь И.М. Экспрессия рекомбинантных белков в молоке трансгенных овец и коз // Дисс.канд. биол. наук. Дубровицы, 2003. - 110 с.

13. Гедеон Рихтер в СНГ // Научно-информационный медицинский журнал, №3.

14. Георгиевский В.И., Медведев И.К., Булачев В.Н. и др. Регуляция роста и развития молочной железы у жвачных животных // Известия ТСХА, 1988, № 1. -с. 141-151.

15. Георгиевский В.Н. Физиология сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат, 1990. — 511 с.

16. Гистология. — М.: Медицина, 2002. 744 с.

17. Глазко В.И. Трансгенез и соматическое клонирование у животных // Сельскохозяйственная биология, 2001, № 6. — с. 3-22.

18. Глебов G.K. Генетическая трансформация соматических клеток. JL: Наука, 1989.-351 с.

19. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. М.: Мир, 1989. - 367 с.

20. Грачев И.И.;, Галанцев В.П. Физиология лактации сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1974. - 279 с.

21. Грачева А.А., Малов А.В. Микроскопическое строение молочных желез тонкорунных овец в период суягности // Сельскохозяйственная биология, 1985, №8.-с. 99-100.

22. Грачева А.А., Малов А.В. Строение молочной железы овец романовской породы разного возраста в первую половину суягности // Сельскохозяйственная биология, 1983, № 8. с. 86-87.

23. Грезина Н.М., Шихов И.Я., Зиновьева Н.А. Приготовление гистологических препаратов молочной железы кроликов / Школа-практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2002;-с. 25-32.

24. Дыбан А.П. Трансгенные млекопитающие в биологии развития // Онтогенез, 1989, Т. 20, № 6. с. 577-592.

25. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Генетическая трансформация млекопитающих / Молекулярные, механизмы генетических процессов. — М., 1985.-с. 84-93.

26. Дыбан А.П;, Городецкий С.И. Интродукция в геном млекопитающих чужеродных генов: пути и перспективы. В кн.: Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. -JI.: Наука, 1986. с. 82-97.

27. Дьюкар Э. Клеточные взаимодействия в развитии животных. — М.: Мир, 1978;-330 с.

28. Дьяконов JI.П. Гибридные и генетачески трансформированные культуры клеток в биотехнологии и ветеринарной медицине // Сельскохозяйственная; биология, 1994, № 4. с. 26-33.

29. Елисеев В.Г., Афанасьев Ю.И., Котовский Е.Ф. Атлас микроскопического и ультрамикроскопического строения клеток, тканей и органов. — М.: Медицина, 1970. с. 394-397.

30. Епифанова О.И., Терских B.Bi, Полуновский В!А. Покоящиеся: клетки. Свойства и функции в организме. -М.: Наука, 1983. 176 с.

31. Зиновьева Hi А,,. Эрнст Л;К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности- их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве. ВИЖ. — 2000. - 128 с.

32. Зиновьева HiA., Эрнст Л.К., Прокофьев М.И. и др. Использование молока трансгенных животных в качестве источника' РНК для анализа экспрессии генной конструкции // Доклады РАСХН, 1998, № 4. с. 28-29.

33. Иванов И.Ф., Ковальский П.А. Цитология, гистология, эмбриология. -М.: Колос, 1969. с. 544-550.

34. Иванова' М.М., Народицкий E.G. Перспективы использования современных методов введения генетического материала в эмбрионы млекопитающих // Сельскохозяйственная биология; 2000, № 2. с. 3-11.

35. Иммуногенез и клеточная дифференцировка. -М;: Наука, 1978. -232 с.

36. Казимирчук H.G. Микростроение вымени; коров по периодам лактации в зависимости от уровня молочной; продуктивности / Использование высокоценных племенных сельскохозяйственных животных. Сб. тр. Ч; 1. — М., 1988.-с. 46-49.

37. Карлсон Б. Основы эмбриологии по;Пэттену. М.: Мир, 1983. - Т. 1. -360 с.

38. Кондрахина К.Н. Клеточный состав секрета вымени здоровых коров // Ветеринария, 1977, № 1. с. 84-87.51 .Крстич Р.В. Иллюстрированная энциклопедия по гистологии человека. — СПб.: СОТИС, 2001. 536 е.

39. Курбатова Л.В. Макро- и i микроскопическая анатомия молочных желез; крольчих пород шиншила и белый великан в возретном аспекте // Автореферат дисс. канд. вет. наук. Свердловск, 1973.-23 с.

40. Курбатова Л.В. Особенности развития секреторных: отделов! молочных желез, при первой сукрольности у пород шиншила; ш белый великан / Возрастные и типовые особенности строения органов, сельскохозяйственных животных. Т. 43. Пермь, 1977 а. - с. 37-441

41. Курбатова Л.В. Развитие протоковой и емкостной систем молочных желез у крольчих / Возрастные и типовые особенности строения органов сельскохозяйственных животных. Т. 43; Пермь, 1977 б. - с. 45-49.

42. Медведев И.К., Журавлев; И.В., Калантар И.Л. Метаболизм изолированных клеток молочной железы коз / Труды ВНИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных. Т. 22. Боровск, 1979. — с. 29-39.

43. Медведев И.К., Журавлев И.В;, Хрусталева Г.И; и; др. Морфология и макромолекулярный состав клеток молочной железы коз / Биосинтез продуктов животноводства. Науч. тр. Т. 16. — Боровск, 1976. с.87-99.

44. Мед вед ев И.К., Нечипуренко Л.В. Пролиферация клеток; молочной' железы у жвачных животных на разных стадиях беременности и. лактации // Сельскохозяйственная биология; 1988, № 2: — с. 69-75.,

45. Молекулярная биология клетки: В 5-ти томах. М.: Мир, 1987. - с. 158.

46. Ныот Д. Рост и развитие животных. М.: Мир, 1973. — 88 с.

47. Овчинникова Р.Е. Макро-микроскопическое строение молочной железы у свинок двух- и шести-семимесячного возраста; / Возрастные и типовые особенности строения органов сельскохозяйственных животных. Т. 43. — Пермь, 1977.-с. 26-30.

48. Прасолов B.C. Вирусные векторы эффективная система переноса5 и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих // Молекулярная биология; 1989; Т. 23; вып. 2. - с. 348-355.

49. Прасолов B.C., Иванов Д.С. Ретровирусные векторы в генной терапии-// Вопросы медицинской химии, 2000, №3. http://medi.ru71 .Пульняшенко П.Р. Анестезиология и реаниматология собак и кошек. — М.: Аквариум, 2000. 192 с.

50. Райцина С.С. Идентификация: стволовых клеток в некоторых системах клеточных дифференцировок у млекопитающих / Успехи современной биологии, 1980, Т. 90, вып. 1(4).-с. 123-137.

51. Ромейс Б. Микроскопическая техника. М.: Изд-во иностранной литературы, 1953. -718 с.

52. Савченкова И.П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее. — Дубровицы, 1999.-95 с.

53. Серов О.Л. Перенос генов в соматические клетки. — Новосибирск, 1985: — 20 с.

54. Скопичев, В.Т., Гайдуков С.Н. Анализ морфогенетических процессов формирования альвеол: молочной железы / VII Всесоюзный симпозиум по физиологии и биохимии лактации. Тезизы докл. Ч. 2. М., 1986. - с. 63-65.

55. Спиер Р.Е., Адаме Г.Д., Гриффите Дж.Б. и др. Биотехнология клеток животных. В 2 т. Mi: Агропромиздат, 1989.

56. Суетина И.А., Кругликова Г.Г., Мичурина Т.В. и др. К вопросу о роли стромальных элементов в гистогенезе молочных желез / Цитологические механизмы гистогенезов. — Ташкент, Изд-во «Фан» Узбекской ССР, 1982. е. 165-167.

57. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В: и др. Вирусные болезни животных. М:, ВНИТИБП, 1998; - 928 с.

58. Тарнавич Г.Н., Овчинникова. Р.Е: Сравнительная морфология дольки молочной железы некоторых сельскохозяйственных животных / Анатомия молочной железы сельскохозяйственных животных в состоянии нормы и при патологии. — Пермь, 1985. с. 29-33.

59. Тейлор Д., Грин Н:, Стаут У. Биология: В 3-х т. М.: Мир, 2002.

60. Тиняков Г.Г., Чумаков В.П; Цитогенетическая характеристика молочной железы крупного рогатого скота / Тезисы докладов всесоюзной конференции по анатомии, гистологии и эмбриологии сельскохозяйственных животных. Ч. 2. — М., 1972.-с. 38-39.

61. Титова В.А. Молекулярно-генетические аспекты использования; ретровирусных векторов для трансгенеза в животноводстве // Дисс. . канд. биол. наук. Дубровицы, 2001'. - 120 с.

62. Титова; BLA., Зиновьева Н.А., Савченкова, И.П. и др. Использование ретровирусных векторов! для; переноса: генов in vivo у сельскохозяйственных животных / Науч. тр. ВИЖа, вып. 61. Дубровицы, 2001. - с. 225-228.

63. Титомиров А.В., Зеленин А.В. Новые методы трансфекции клеток млекопитающих // Молекулярная биология,. 1988; Т. 22, вып. 6. — с. 1445-1449:

64. Токин Б.П. Общая эмбриология. -М;: Высш. шк., 1987. -480 с.

65. Томилин Н.В. Новые системы генетической: трансформации соматических клеток млекопитающих // Биотехнология, 1987, Т. 3, № 3. — с. 343-350;

66. Туманишвили Г.Д., Козлова Н.В., Саламатина Н.В. О теории внутритканевой регуляции скорости размножения клеток // Журнал общей биологии, 1968; Т. 29, № 6. с. 711-718.

67. Туревский А.А. К развитию молочной железы крупного рогатого скота в постнатальном периоде / Закономерности индивидуального развития сельскохозяйственных животных. — М.: Наука, 1964. — с. 185-189.

68. Физиология сельскохозяйственных животных. Mi: Агропромиздат, 1991.-432 с.

69. Хирургические операции у собак и кошек. — М.: Аквариум ЛТД; 2001 i — 232 с.

70. Хрусталева; Г.И. Формирование альвеол из эпителия' протоков; в. молочной железе жвачных животных / Бюллетень ВНИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных. Вып. 4 (51). Боровск, 1978; - с. 40-42.

71. Хрусталева Г.И., Суетина И.А., Ахобадзе В.В. Роль, лимфоузлов различной локализации в маммогенезе сельскохозяйственных: и лабораторных животных / VII Всесоюзный симпозиум по физиологии и биохимии лактации. Тезизы докл. Ч. 2. М., 1986. - с. 112-114.

72. Хэм А., Кормак Д: Гистология. М.: Мир, 1983. - Т. 5. - 296 с:

73. Чекиров Т.Ч., Скопичев В.Г. Развитие альвеолярной; структуры паренхимы молочной железы овец в различные периоды суягности // Сельскохозяйственная биология, 1988^ № 2. с. 98-101.

74. Эрнст JI.K. Проблемы селекции и биотехнологии сельскохозяйственных животных. М.: РАСХН, 1995. - 359 е.,

75. Эрнст Л:К. Фенотрансгены новое направление генной инженерии: сельскохозяйственных животных // Сельскохозяйственная биология, 2002, № 2. -с. 3-7.

76. Эрнст Л.К., Брем Г., Зиновьева Н.А. Генно-инженерные технологии-новый путь развития животноводства // Зоотехния, 1994, № 5. с. 2-4.

77. Ю7.Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А., Волкова Н.А. и др. Некоторые аспекты использования ретровирусных векторов для переноса чужеродной ДНК in vivo и in vitro. -М., 2003; 84 с.

78. Aguirre A., Castro-Palomino N., De la FuenteJ. et al. Expression of human erythropoietin trabsgenes and of the endogenous WAP gene in the mammary gland of transgenic rabbits during gestation and lactation // Transgenic Res, 1998, 7 (4). p. 311-7.

79. Alvi A.J;, Clayton Hi, Joshi C. et al. Functional and molecular characterisation of mammary side population cells//Breast Cancer Res 2003,5:R1-R8.

80. Anderson E., Clarke R.B. Epithelial stem cells in the mammary gland: casting light into dark corners // Breast Cancer Res, 1999, 1(1). p. 11-13.

81. Archer J., Kennan W., Gould M. et al. // PNAS USA, 1994, 91 (15), 68406844:

82. Atwood C.S., Hovey R:C., Glover J.P. et al. Progesterone induces side-branching of the ductal epithelium in the mammary glands of peripubertal mice // Journal of Endocrinology 167, 2000. P. 39-52.

83. Bittner R.E.,. Schofer С., Weipoltshammer К. et al. Recruitment of bone-marrow derived cells by skeletal and cardiac muscle in adult dystrophic mdx mice // Anat. Embryol. 199, 1999.-P. 391-396.

84. Bond V.C., Wold B. Poly-L-ornitin mediated transformation of mammalian cells // MoL Cell: Biol. - 1987. - V.7. - N 6. - P.,2286-2293.

85. Bowen R.A. Efficient Production> of Transgenetic Cattle by Retrovial Infection of Early Embryos // Moleculare Reproduction and Development. — 1995. — V. 40.-P. 386-390.

86. Brem G. Transgene Nutztiere // Zuchtungkunde, 1988, 60, №3. S. 248-262.

87. Capecchi M.R. High efficiency transformation by direct microinjection DNA into cultured mammalian cells // Cell., 1980, V. 22. p. 479-4881.

88. Cera K., Mahan D.C., Simmen F.A. In vitro growth-promoting activity of porcine mammary secretions: initial* characterization and relationship to known Peptide Growth Factors //J; of Animal Sc., 1987, 65 (4). p. 1149-1159.

89. Chepko G., Smith G.H. Three division-competent, structurally-distinct cell populations contribute to murine mammary epithelial renewal // Tissue and Cell 29, 1997.-p. 239-253.

90. Chisholm O., Symonds G. Transfection of myeloid cell lines using polibrene / DMSO // Nucleic Acids Res,, 1987, V. 15. p. 1311.

91. Chomczynski P., Qasba P., Topper Y.J. Essential role of insulin in transcription of the rat 25;000 molecular weight casein gene // Science 226, 1984. — P. 1326-1328.

92. Cone R.D., Mulligan R.C. High-efficiency gene transfer into mammalian cells generation of helper free recombinant; retrovirus with broad t mammalianhost range // Proc. Natl. Acad. USA. 1984, V. 81. -p. 6349-6353.

93. Cordon E.C., McKnight R.A., Jhappen C. et al. Ectopic TGFp expression in the secretory mammary epithelium induces early senescence of the epithelial stem cell population // Dev Biol 168, 1995. p. 47-61.

94. Cordon Е.С., Smith G.H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development 125, 1998. p. 1921-1930.

95. Daniel C., DeOme K., Young L. et al. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61, 1968. p. 53-60.

96. Daniel C.W., Young L.J.T., Medina D. et al. The influence of mammogenic hormones on serially transplanted mouse mammary gland // Exp. Geront. 6, 1971. -p. 95-101.

97. Das R., Vonderhaar B.K. Prolactin as a mitogen in breast cells // J; Mammary Gland Biology and Neoplasia; 2, 1997: p. 29-39.

98. Das R., Vonderhaar В .К. Tamoxifen inhibits prolactin signal transduction in estrogen receptor negative NOG-8 mammary epithelian cells // Cancer Lett, 116, 1997.-p. 41-46.

99. DeOme K.B., Faulkin L.J., Bern H.A. et al: Development of mammary tumors from Ьуреф1аз^с alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice//Cancer Res., 19, Л 959.-p. 515-520.

100. Ginsburg E., Vonderhaar B.K. Prolactin: an autocrine growth factor in the mammary gland:. In: Biological: Signalling and; the Mammary Gland; Hannah Research Institute, Ayr, UK. 1997. p. 47-58;

101. Goodell M; et all Hoechst.33342 HSG Staining and Stem cell Purification. Protocol. J Exp Med 183, 1996.-p. 1797-1806.

102. Graham F.L., Bacehetti S., Mackinnan R. Transformation of mammalian cells with DNA using the calcium technique. In: Introduction of macromolecules into viable mammalian cells // Ed; by Baserga R. et al. — New York, 1980. - p. 3-25.

103. Grimm S.L., Seagroves T.N., Kabotyanski E.B. et al. Disruption of steroid and; prolactin receptor patterning in the mammary gland correlates with a block in; lobuloalveolar development // Molecular Endocrinology 16, 2002. P.2675-2691.

104. Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C.D. et al; Dystrophin expression in the. mdx mouse restored by stem cell transplantation // Nature, 1999, 401. S. 390-394.

105. Hasnain S.E., Ganesan K., Upadhyaya K.C. Mechanism of enchantment of DNA-uptake by polycation: Effect of polycations on DNA, DNAasa and plasma membrane//Indian J; Exp. Biol., 1980, V. 18.-p. 1230-1232.

106. Jackson K.A., Mi Т., Goodell1 MiA. Haematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1999. S. 14482-14486.

107. Kawais S., Nishizawa Mi New procedure for DNA transfections with polication and dimethylsulfoxide // Moli Cell. Biol., 1984, V. 4: p. 1172.

108. Kenney N. J., Smith G.H.V Lawrence E. et al. Identification of stem cell units inv the terminal end bud; and duct of: the mouse mammary gland П Journal- of Biomedicine and Biotechnology 2001; 1:3: S. 133-143.

109. Kopchick Ji1, Francoise P., Leung F.C. Expresion of the bovine growth hormone gene in cultured rodent cells // Genetic engieering of animals. Plenum Press. New York. London, 1986. p. 19-37.

110. Lagasse • E., Connors Hi, Al-Dhalimy M. et al. Purified hematopoietic stem, cells can differentiate into hepatocytes in vivo // Nature Medicine 6, 2000. Pi 12291234;

111. Lai C.J:, Nathans D. Mapping temperature-sensitive mutants of simialvirus 40: rescue of mutants by fragments of viral DNA // Virology, 1974,V.60.-p.466-475.

112. Le Doux J.M., Landazuri N., Yarmush M.L. et ah Complexatiom of Retrovirus with Cationic and Anionic Polymers Increases the Efficiency of gene Transfer // Human gene therapy 12, 2001. p. 1611-1621.

113. Lee H.T., Yoon J.Y., Uhm S.J. Production of transgenic bovine embryo by microinjection of retroviral; vector into perevitelline space / Abstracts of 14th International Congress on Animal Reproduction. Stockholm; 2-6 July, 2000. — p. 246.

114. Michel G. Zur Entwicklung der Milchdriise beim Rind // Mh. Vet. Med; 38, 1983: - S. 899-902.

115. Miller A.D;, Buttimore C. Redesingn of retrovirus packaging cell lines to avoids recombination leading to helper virus production; II Mol. Cell. Biol. — 1986, V.6. -p. 2895-2902.

116. Monisano D.F., Hankinston O. Transfection by genomic DNA of cytochrome Pj-450 enzimatic activity and indibility // Mol: Cell; Biol., 1985,V.5,N4.- p. 698-704.

117. Morgenstern G.P., Land H. Advanced mammalian5 gene transfer: high titer retroviral vectors with multiple drug selection markers and complementary helper-free packaging cell line//Nucl. Acids. Ras.-1990, V. 18.-p. 3587-3596;

118. Ortiz de Solorzano С. Characterization'of Adult Stem Cell Involvement in Mammary Gland Development // LBNL, Funding period: 2002-2003.

119. Salmons В., Gunzburg W.Hi,, Janka I: u.a. Verwendung rekombinanter subretrovirales Partikel zur effizienten und sicheren Erstellung transgener Sauger // Fortschritte in der Tierzuchtung (Festschrift), Ulmer, 1991. S. 437-449.

120. Scarpa M:,, Cournoyer D., Muzny D.M. Characterization of recombinant helper retrovirus from Moloney — based vectors in ecotropic and amphotropic packaging cell lines // Virology. 1991, V. 180. - p. 849-852.

121. Smith G;H. Experimental mammary epithelial morphogenesis in an in vivo; model: evidence for distinct cellular progenitors of the ductal andilobular phenotype // Breast Cancer Res .Treat 39, 1996. p. 21-31.

122. Smith G.H. The Mammary Gland Contains Distinct Ductal and: Alveolar Progenitor Cells. 1998; — mailto:smith@ltiblp.nci.gov.

123. Smith G:Hi, Chepko G. Mammary epithelial stem cells // Microsc; Res. Tech. 52, 2001.-p. 190-203.

124. Smith G.H., Medina D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland// Journal of Cell Science 89,1988. P. 173-183.

125. Sorge J;, Wright D., Erdman V.D. Amphotropic retrovirus vector:system for human cell gene transfer // Mol. Cell. Biol. 1984- V.4.- p. 1730-1737.

126. Takai Т., Ohmori H. DNA transfection of mouse: lymphoid cells by the combination of DEAE-dextran-mediated DNA uptake and osmotic shock procedure // Bioch. Bioph. Acta, 1990; V. 1048. -p.105-109.

127. Tetsuo Y., Toshitaka A. Stable expression of the hepatitis В virus surfaceantigen containing Pre-S2 protein in mouse cells using a bovine papilomavirus vector НУ. Gen. Virol., 1988; V. 69.-p. 1931-1939.

128. Tsai Y.C., Lu Y., Nichols P.W. et al. Contiguous patches of normal human mammary epithelium derived from a single stem cell: implications for breast carcinogenesis // Cancer Res 56,1996. p. 402-4041

129. Tucker H;A. Mammary Gland Development // DASC 4374, Chapter 3. (90)

130. Turkington R.W; Hormonal regulation of cell proliferation and differentiation // Developmental Aspects of the Cell Cycle, Academic Press, New York, 1971. p. 315-355.

131. Varmus H.E. Form and function of retroviral proviruses // Science 216, 1982. -p. 812-820.

132. Vonderhaar B.K. Prolactin in development of the mammary gland and reproductive tract. In: Hormones and Growth Factors in Development and Neoplasia. Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1998. p.193-206.

133. Withers-Ward E.S., Kitamura Y., Barnes J.P. et al; Distribution of targets for avian retrovirus DNA integration in vivo // Genes Dev. 8, 1994. p. 1473-1487.

134. Yamazaki Y., Fujimoto H., Ando H. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation // Biol. Reprod., 1998, V. 59 (6). p. 1439-1444.

135. Zhoun! S., Schuetz J.D., Bunting K.D. et al. The ABC transporter Bcrpl/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype//Nat. Med;, 2001, 7. -p. 1028-1034.