Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические особенности формирования защитных реакций пшеницы при действии хитоолигосахаридов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиологические особенности формирования защитных реакций пшеницы при действии хитоолигосахаридов"

На правах рукописи

РГК од

АХМЕТОВА1ШДИРА ЭМЕЛЬЕВНА

1 7 Н!лп 2000

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ ХИТООЛИГОСАХАРИДОВ

03.00.12 Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2000

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Научный руководитель - кандидат биологических наук, с.н.с. Хайруллин P.M. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кудоярова Г.Р. доктор биологических наук, с.н.с. Максютова H.H.

Ведущее научное учреждение:

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Защита диссертации состоится «11» мая 2000 г в 14 часов на заседании специализированного диссертационного Совета К. 064.13.09 при Башкирском государственном университете им. 40-летия Октября.

Адрес: 450074, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32. Биологический факультет Башкирского государственного университета. Аудитория 332.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослан « fo » ^УШсШ 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук J P'JT^ Кузяхметов Г.1.

Pl/lf- bU.5$Q

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Выявление механизмов индуцированной устойчивости астений к грибным фитопатогенам с целью разработки эффективных способов ащиты сельскохозяйственных культур от болезней является актуальной адачей физиологии растений. Считается, что индукция защитных реакций •астений при инфицировании грибами происходит благодаря взаимодействию >астительной клетки с элиситорнымн молекулами, в том числе и углеводной фироды, образующимися в результате деградации клеточных стенок [»итопатогенных грибов [Albersheim et al., 1983]. К числу таких элиситоров штинсодержащих грибов относятся хитоолигосахариды (ХОС). ХОС широко пучаются в связи с использованием хитина и хитозана в качестве индукторов 'стойчивости растений к болезням [Тготерев, 1999]. В то же время, ХОС тгосятся к нетрадиционным регуляторам роста растений, выделенным в класс )лигосахаринов [Озерецковская, Роменская, 1996; Creelman, Mullet, 1997]. Однако природа рострегулирующей активности хитоолигосахаридов остается юка неясной [Chon^etal., 1998].

Известно, что в пшенице и других видах злаковых растений содержатся 5елки - лектины, специфически взаимодействующие с хитином и его 1роизводными [Peumans, Stinissen, 1983]. Можно полагать, что эти белки способны принимать участие в регуляции ответа растений на действие ХОС. В пом аспекте биологическая активность хитоолигосахаридов по отношению к ¡лаковым растениям остается недостаточно исследованной.

Цель работы заключалась в изучении особенностей развития защитных эеакций пшеницы в ответ на действие хитоолигосахаридов, как наиболее вероятных элиситорных молекул хитинсодержащих фитопатогенных грибов. Тля достижения этой цели решались следующие задачи:

• получить препарат водорастворимых хитоолигосахаридов, близких по лруктуре с хитином;

- изучить влияние препарата на рост и развитие интактных растений и каллусиых культур пшеницы;

- определить ранние ответные реакции пшеницы при обработке растений хитоолигосахаридами;

- исследовать влияние ХОС на баланс эндогенных фитогормонов в пшенице;

- установить характер количественных изменений уровня хитинспецифичного агглютинина зародыша пшеницы (АЗП) в растениях при обработке хитоолигосахаридами;

- изучить влияние ХОС на рост и развитие некоторых фитопатогенных грибов.

Научная новнзна. Впервые исследовано влияние хитоолигосахаридов на содержание в растениях пшеницы свободных эндогенных фитогормонов -абсцизовой (АБК), индолилуксусной (ИУК) кислот и цитокининов. Выявлено, что в ответ на экзогенную обработку хитоолигосахаридами наиболее быстрым и характерным изменением баланса фитогормонов в растениях является повышение уровня цитокининов. Методом хемилюминесцентного анализа впервые показана быстрая (5-10 мин) продукция перекиси водорода (Н202) интактными проростками пшеницы под действием низких концентраций (10 нг/мл) хитоолигосахаридов. Показано, что одним из источников быстрого образования Н202 может быть окисление щавелевой кислоты эндогенной оксалатоксидазой.

Практическая значимость. Предложена модификация способа получения водорастворимых хитоолигосахаридов и одновременного фракционирования их по массе многократным осаждением в ацетоне из водного раствора, исключающая использование длительной колоночной хроматографии. Полученный препарат состоит из смеси хитин-хитозановых олигомеров со средней степенью ацетилирования (СА) 65% и молекулярной массой 5-10 кД. Предложен метод хемилюминесцентного анализа продукции Н202 интактными растениями пшеницы с использованием нового прибора ХЛ-003. Показано, что ХОС в концентрации более 0,1 мг/мл подавляют рост

эитопатогенных грибов пшеницы Bipolaris sorokiniana (Sacc. Shoem) и Tilletia ;aries (DC.) Tul., что может быть использовано в создании новых препаратов (ля защиты растений.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались ra III ежегодном симпозиуме «Физико-химические основы физиологии >астений и биотехнология» (Москва, 1997), на международной конференции NTERLEC 17 (Wurzburg, 1997), на XI конгрессе FESPP (Varna, 1998), на :жегодной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 999), на IV съезде ОФРР (Москва, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, >бзора литературы, изложения методов исследований, результатов [сследовапий и их обсуждения, заключения и выводов. Работа на 122 стр. :одержит 26 рисунков, 11 таблиц, список литературы, включающий 170

1СТОЧНИКОВ.

Благодарности. Автор сердечно благодарит научного руководителя ■Сайруллина P.M., сотрудника ИОХ УНЦ РАН к.х.н. Муллагалиева И.Р., а акже коллег Сурину О.Б., Юсупову З.Р., Трошину Н.Б., Яруллину Л.Г., "аниева P.M. и д.б.н. Шакирову Ф.М. за помощь при выполнении работы.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований были растения мягкой яровой пшеницы rriticum aestivum L. сортов Московская 35, Симбирка и Жница. В зависимости >т условий эксперимента проростки из поверхностно стерилизованных 80%-1ым этанолом семян проращивали в эмалированных кюветах на влажной [ш.'п.тровальной бумаге в термостате (26 °С) в темноте или в комнате на :петоплощадке с 16-часовым светопериодом, при освещенности 12-16 тыс. гкже. Для определения продукции Н202 проростки отделяли от эндосперма и 1срс11()сили на 6-8 ч на 10 мМ калий-фосфатный буфер (pH 6,3-6,5),

приготовленный на бидистилированной воде, содержащий по 1мМ KCl и СаС12. Затем корни промывали буфером и растения переносили на свежую среду.

Каллусы из зрелых зародышей пшеницы сорта Жница выращивали на среде Мурасиге и Скуга (MC), содержащей 0,7% агара, 3% сахарозы, макро- и микроэлементы и витамины [Murashige, Scoog, 1962], а также 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) (2мг/л) и кинетин (0,2мг/л).

Хитин из панцирей крабов очищали обработкой в 2М HCl, 1 М NaOH и 96%-ным этанолом по методу Хайруллина и др. [1992].

ХОС получали гидролизом хитина в 65%-ной серной кислоте согласно Максимову и Смирновой [1993]. Гидролизат многократно переосаждали ацетоном из водного раствора. Затем водный раствор ХОС нейтрализовали ЮМ КОН и углеводы вновь переосаждали ацетоном и лиофилизировали.

Степень ацетилирования ХОС оценивали по методу Плиска и др. [1977]. а молекулярную массу углеводов определяли гель-фильтрацией на акрилексе Р-10 (Reanal, Венгрия) и сефадексах G-10, G-15 и G-25 (Serva, ФРГ).

Концентрацию Н202 в среде определяли хемилюминесцентный анализом на приборе ХЛ-003, используя окисление люминола пероксидазой i присутствии Н2Ог. Вторичным эталонным стандартом служил СХФМ-1 с интенсивностью излучения 5,1x105 квант/сек-4тг в диапазоне 470-670 мкм.

Содержание фитогормонов в растительном материале определял! методом иммуноферментного анализа (ИФА), разработанным Кудояровой Г. Р с соавторами [1989, 1990]. Количествешюе содержание цитокинино! анализировали, используя кроличьи антитела, полученные к конъюгату зеатин-рибозида с овальбумином, а ИУК и АБК — к конъюгату соответствующей фитогормона с тем же белком. Содержание АЗП в растениях пшеницы такжч определяли методом ИФА [Хайруллин и др., 1992].

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что биологическая активность хитоолигосахаридов зависит от труктуры молекулы, ее размеров, а также наличия функциональных групп, -¡аиболее активными но отношению к растениям пшеницы являются ХОС с СП юлее 4 и степенью ацетилирования (C'A) 60-70% [Valider et а!., 1998]. Толучевпе таких олнгосахаридов было одной из важных задач нашей работы.

Многократное переосаждение водораст воримых хитоочигосачаридов »дноврсмспно г удалением избытки SOr'-ионои позволило пронес m фракционирование олшомеров по молекулярной массе. !ак как при таком зюсобе осадгдени;-: углеводов первыми из водных рас i воров выпаданл в осадок «ысокочолокуяярныс компоненты.

Полученный upeiiapai хнчоолигосахаридоь в виде белою порошка был «створим в воде (не менее ¡00 мг в 100 мл) и содержал не более 0.05% золы.

пектры ЯМР С" показали наличие в структуре хитоолнгосахаридов лишь дпозановых и хитиновых фрагментов с существенным преобладанием юследних. C'A upeiiapai а составила 65%. Методом гель-фильтрашш было (ыявлсио. что молекулярная масса ХОС находи 1ся в пределах от 5 до 10 к/1.

Хорошо шьестио. что хитоолигосахариды инд\ аируюч заданные ■»еакини растений. В то же время .мало внимания уделяется росгрегулируюшей П\ I ивности этих молекул. В связи с тгим мы исследовали влияние полученного ipcnapara на рост проростков пшеницы. Замачивание семян в водных эастворах ХОС в концентрации 100 и 1000 мг/'л приводило к значительному .меньшению длины надземной части проростка и главного корня, а также ллрон массы 4-суточных проростков по сравнению с обработкой семян тс тиллировапной водой. Обработка ссмян мономером хитина N-ацетнл-П)-люкозамином (GlcNAc) даже в концентрациях 4000 мг/л существенно не '.лпяла на poci растений.

11ш пбирование роста растений (на 30% по массе по сравнению с

контролем) также наблюдалось в случае, когда 4-суточные проростки помещали на 1%-ную сахарозу, содержащую ХОС в концентрации 1000 мг/л. Однако интересно отметить, что этот эффект наблюдался лишь в течение первых 12-16 ч опыта, а затем масса опытных проростков сравнивалась с массой контрольных. Более низкие концентрации ХОС не влияли в этом опыте на рост проростков.

В связи с имеющимися литературными данными об ауксин-подобном действии ХОС на растения [Петрухина и др., 1994] мы оценивали рострегулирующую активность хитоолигосахаридов в тест-системе с отрезками колеоптилей пшеницы [Кефели и др., 1975]. Оказалось, что водные растворы ХОС в концентрациях более 10 мг/л оказывали слабое ингибирующее действие на растяжение отрезков колеоптилей в течение 18 часов по сравнению с контролем (вода). В концентрациях 1 мг/л и меньше ХОС не влияли на элонгацию отрезков колеоптилей. Инкубирование отрезков колеоптилей в растворах, содержащих вместе ИУК (10мг/л) и ХОС (выше 50 мг/л), приводило к подавлению растяжения отрезков колеоптилей по сравнению с действием только ИУК. При этом следует отметить, что замена хитоолигосахаридов на Ы-ацетил-В-глюкозамин в концентрации 1000 мг/л не приводила к ингибированию ростстимулирующей активности ауксина по отношению к отрезкам колеоптилей.

Таким образом, мы выявили, что ХОС не обладали ростстимулирующей активностью по отношению к интатктным растениям пшеницы при обработке семян и 4-суточных проростков, и не оказывали ауксин-подобного эффекта на рост отрезков колеоптилей пшеницы, что, вероятно, связано как со структурой полученных олигомеров, так и чувствительностью тканей растений к их действию [СЬоп е! а1., 1998].

Известно, что для изучения рострегулирующей активности олигосахаринов использовались культуры клеток, но, в основном, двудольных растений [Шгапо е1 а1., 1989; Rhorig е! а!., 1995]. Поэтому для оценки

биологической активности ХОС мы использовали также каллусы пшеницы, полученные из зрелых зародышей. Однотипные по внешнему виду и одинаковые по массе каллусы первого пассажа делили на две группы. Одну пересаживали на среду МС с регуляторами роста 2,4-Д и кинетином, другую -на такую же среду, но без стимуляторов роста. Эти среды служили контролем. В опыте и в ту, и в другую среды добавляли ХОС в различных концентрациях.

Введение ХОС в среду МС с 2,4-Д и кинетином ингибировало рост каллусов пшеницы после 10 суток культивирования по сравнению с соответствующим контрольным вариантом (рис.1). В то же время, внесение ХОС в среду МС без регуляторов роста приводило к многократному стимулированию роста каллусов (рис. 2). Степень индукции роста каллусов в этом эксперименте была обратно пропорциональна концентрации ХОС в среде, что не позволяет рассматривать стимуляцию роста каллусов, вызванную добавлением ХОС, как результат внесения дополнительного питательного субстрата. Концентрация ХОС порядка 0,1 мг/л была минимальпой для стимуляции роста каллусов и вызывала образование плотной каллусной ткани с глобулярной структурой.

Для того чтобы выявить за счет чего происходила стимуляция роста каллусов на среде МС, содержащей только ХОС в концентрации 0,1 мг/л, мы определяли размеры паренхимоподобных и митотическую активность мсристемоподобных клеток каллусов. Оказалось, что в контроле культивирование каллусов в течение 14 дней снижало митотическую активность клеток, а размер клеток оставался постоянным (табл. 1). В опытных же каллусах вначале наблюдалось снижение числа митозов клеток. При этом размеры паренхимоподобных клеток были несколько больше, чем в контроле. Затем происходило как увеличение размеров клеток, так и усиление их митотической активности.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что ХОС обладали высокой физиологической активностью по отношению к каллусной культуре пшеницы.

Рис. 1. Влияние ХОС на рост каллусов в течение 18 суток культивирования. Контроль - среда МС с 2,4-Д и кинетином, опыт -контрольная среда + ХОС.

« 250-1

к ё 200-

£ « 150-

<а а 100-

Я

Я

§ О

ь

о. С 0-

14

К

1000

10

0,1

Рис. 2. Влияние ХОС на рост каллусов в течение 10 суток культивирования Контроль - среда МС без 2,4-Д и кинетина. Опыт - контрольная среда + ХОС Цифрами внизу указаны концентрации ХОС (мг/л).

При внесении препарата в среду МС, не содержащую 2,4-Д и кинстии наблюдался интенсивный рост каллусов, связанный первоначально с

Таблица 1

Влияние хитоолигосахаридов (0,1 мг/л) на митотический индекс и размер клеток каллусов пшеницы

Варианты Число митозов на 1000 клеток Размер клеток, условные единицы

7 дней 14 дней 7 дней 14 дней

Среда МС без2,4-Д и кинетина 5,0 ± 0,4 3,2 + 0,3 7,4 ±0,1 7,5 ±0,1

То же + ХОС 3,4 ± 0,3 7,8 ± 0,4 8,5 ±0,1 9,8 ±0,1

увеличением размеров клеток, а по мере культивирования - с усилением их митотической активности.

Хорошо известна зависимость индукции деления клеток и каллусообразования от присутствия в питательной среде фитогормонов ауксинов и цитокининов [Бутенко, 1984]. Триггером, определяющим переход клетки, подготовленной действием ауксина, к делению, можно считать кинетин [Кулаева, 1973; Кулаева, 1982]. Ввиду отсутствия в среде экзогенных ауксинов и цитокининов мы предположили, что ХОС влияли на содержание эндогенных фитогормонов в каллусах, вероятно, повышая их уровень.

Как видно в таблице 2 наибольшее содержание ИУК было в каллусах, растущих на среде МС без регуляторов роста (2,4-Д и кинетина), а цитокининов - на полной среде МС. В каллусах, культивируемых на среде с ХОС, содержание обоих фитогормонов было самым низким. На 10-й день культивирования каллусы не отлетались между собой по содержанию ИУК. 11ри этом содержание цитокининов в каллусах, растущих на среде с ХОС, было почти в 3 раза выше, чем в остальных. Интересно, что на 10-й день культивирования на среде МС с регуляторами роста, содержание цитокининов в каллусах падало в три раза по сравнению с 5 днем.

Таблица 2

Влияние хитоолигосахаридов (0,1 мг/л) на содержание ИУК и цитокининов в каллусах пшеницы

Варианты 5 дней 10 дней

ИУК, мкг/г ЦК, нг/г ИУК, мкг/г ЦК, нг/г

Среда МС с 1,5+0,1 94,0±9,0 2,4±0,2 35,0±10,0

регуляторами роста

Среда МС без 2,4±0,4 34,0±2,0 2,9±0,2 37,0±6,0

регуляторов роста

Среда МС без регуляторов роста + ХОС 1,0+0,1 27,0+2,0 2,2±0,1 92,0+10,0

Таким образом, стимуляция хитоолигосахаридами роста каллусов на среде МС без регуляторов роста была связана с повышением эндогенных стимуляторов роста в растительных тканях под влиянием препарата.

В связи с полученными результатами мы исследовали также характер изменения содержания эндогенных фитогормонов ИУК, цитокининов и АБК в 4-суточных интактных проростках пшеницы под влиянием ХОС. Для этого проростки помещали корнями на 1% сахарозу, содержащую ХОС в тех же концентрациях, что и в опытах с каллусами пшеницы (1000, 10 и 0,1 мг/л). Контрольные проростки росли на 1% сахарозе.

Как указывалось, высокие концентрации ХОС (1000 мг/л) ингибировапи рост растений, как при обработке семян, так и при помещении 4-суточных проростков на среду с препаратом. Оказалось, что в высокой концентрации (1000 мг/л) эти углеводы вызывали к 9 ч опыта значительное повышение содержания АБК (рис. 3). Под влиянием меньших концентраций уровень этого гормона незначительно колебался относительно контрольного. Под действием самой низкой из исследованных концентрации ХОС уровень ИУК в проростках постепенно возрастал в течение 4,5 ч опыта до 150% от уровня контрольных

ш-

в; Ч О

^ 160-

н о

£

* 100-<

80-

-

- 120

107

7777.

1

0 1000 мг/л □ 10 мг/л ■ 0,1 мг/л

85

У7.

I

86

78

160-1

2 ч.

4,5 ч.

9 ч.

Время

Рис. 3. Влияние хитоолигосахаридов (1000, 10 и 0,1 мг/л) на содержание свободных фитогормонов в проростках пшеницы. Контроль — 100%.

растений, а к концу опыта снижался. Обработка растений ХОС в концентрации 10 мг/л в течение первой половины опыта существенно не влияла на содержание в них ауксина, а в конце опыта вызывала снижение содержания этого фитогормона. Под влиянием высокой концентрации ХОС (1000 мг/л) уменьшение содержания ИУК в проростках на 50% от уровня контроля наблюдалось к 4,5 часам опыта, а к концу опыта приближался к контрольному уровню. Как видно на рис. 3 через 2 ч после обработки растений препаратом в концентрации 1000 и 10 мг/л содержание цитокининов увеличивалось почти в 2 раза в сравнении с контрольными растениями. Действие низкой концентрации ХОС также приводило к накоплению цитокининов, но позже - к 4,5 ч. опыта. Затем уровень цитокининов в проростках, обработанных ХОС в концентрациях 1000 и 0,1 мг/л, снижался, приближаясь к уровню контроля, а в концентрации 10 мг/л был почти на 50 % ниже.

Несмотря на увеличение уровня цитокининов в проростках пшеницы под действием ХОС, активация роста растений под влиянием олигосахаридов не наблюдалась. Одной из причин этого может быть различная чувствительность тканей и органов растений пшеницы к действию хитоолигосахаридов или к изменению баланса эндогенных фитогормонов под влиянием ХОС. С другой стороны, ХОС, вероятно, воспринимаются в первую очередь как элиситоры, стимулирующие защитные реакции растений, характерные для стрессовых ситуаций. Поэтому, возможно, вначале развивается ответ, связанный с реализацией защитных механизмов, индуцированных элиситором, а затем, при наступлении более благоприятных условий или в результате адаптации к действию экзогенных ксенобиотических сигналов может стимулироваться рост и развитие растений.

Судя по литературным данным одной из таких быстрых защитных реакций является продукция активных форм кислорода (АФК), например Н202.

300-1

&

ж 250j о м н о

v=>

С!4-

200-

л SU

о 2

fS 150-

U га

U

1004-// —т-5

10

10мг/л

1 мг/л Рис- Изменение светимости среды инкубирования проростков под влиянием обработки растений хитоолиго-сахаридами. Контроль - 100%. -т Время, Слева указаны

20 МИН- лгглп

концентрации ХОС.

Кроме того, в последнее время Н2О2 отводится роль сигнальной молекулы, способной системно индуцировать эксперессию генов, кодирующих синтез защитных белков [Low, Merida, 1996]. Поэтому значительный интерес представляет исследование влияния хитоолигосахаридов на продукцию АФК растениями пшеницы. Однако подобные исследования с использованием в качестве модельных объектов злаковых растений немногочисленны.

В качестве объекта исследований мы выбрали интактные проростки пшеницы, поскольку в отличие от изолированных клеток или органов растений, которые, как правило, используются для определения продукции АФК, именно целое растение представляет наиболее адекватную модель в исследованиях.

Оказалось, что добавление ХОС в среду инкубирования корней проростков индуцировало увеличение светимости среды по сравнению с контролем (буфер) (рис. 4). Сам препарат ХОС вызывал неспецифическое увеличение светимости буфера только при концентрации более 10 мг/л.

Известно, что на окислительное свечение люминола кроме перекиси водорода способны влиять другие вещества, например, фенолы [Diaz et al., 1998]. Для того чтобы подтвердить, что корни проростков пшеницы в ответ на обработку хитоолигосахаридами выделяют в среду именно Н2О2, мы провели

следующий эксперимент. После добавления ХОС аликвоту среды из чашки Петри с проростками отбирали в пробирку и делили на 2 части. К одной части добавляли активную каталазу (конечная концентрация 10 ед./мл, Serva), а к другой - инактивированный фермент (обработка 5 мин при 100°С) и через равные промежутки времени оценивали изменение светимости. Светимость аликвоты резко уменьшалась в присутствии активной каталазы и не изменялась при добавлении инактивированного фермента. Т. о., можно заключить, что корни проростков выделяли в среду Н202. Поскольку вспышка хемилюминесценции, выраженная в условных единицах, была прямо пропорциональна содержанию перекиси водорода (график зависимости светимости от концентрации Н202 в среде приведен в диссертации), в дальнейшем в опытах концентрацию Н202 в среде выражали непосредственно в условных единицах, так же как, например, это сделали Levine с сотр. [1994].

Известно, что накопление АФК может происходить в ответ на неспецифический стресс [Пескин, 1998]. Поэтому мы сравнивали действие ХОС :.. и К-ацетил-О-глгокозамина на продукцию перекиси водорода проростками пшеницы. Оказалось, что добавление в среду GlcNAC (100 мг/л) не оказывало какого-либо значительного влияния на продукцию Н202 (рис. 5).

По литературным данным накопление Н202 может происходить благодаря превращению супероксиданиона (02") супероксиддисмутазой. Известно, что блокатором дисмутации является диэтилдитиокарбамат натрия (ДТК). Для того чтобы выявить возможные механизмы образования Н202 в проростках пшеницы в среду к корням растений вносили ДТК (1 мМ), затем через 10 мин добавляли ХОС и определяли концентрацию Н202 в среде. На рис.6 видно, что ДТК подавлял продукцию Н202 проростками пшеницы, что

Ä 7-к

i6

i* 5 о

а А X 4

О

* 3 21

20

40

60

Время, мин

Рис. 5. Влияние ХОС и мономеров хитина на продукцию перекиси водорода проростками пшеницы. К - контроль (буфер).

о 7

ХОС

(1 мг/л)

ДТК+

ХОС (1 мг/л)

Время, 15 мин.

Рис. 6. Ингибирование продукции перекиси водорода, вызванной обработкой проростков пшеницы хитоолиго-сахаридами, под влиянием ДТК.

предполагает участие супероксиданиона в образовании перекиси водорода в цанной системе.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что обработка растений хитоолигосахаридами уже в течение нескольких минут индуцирует эбразование Н202 проростками. Скорость индукции зависит от концентрации

ХОС в среде. В наших исследованиях минимальная концентрация ХОС, которая еще вызывала образование Н202 в течение 10 мин, была 0,01 мг/л.

Судя ио литературным данным, альтернативным источником образования Н202 в растениях может быть окисление щавелевой кислоты (ЩК) оксалатоксидазой: (СООН)2 +02 2С02 + Н2О2 (Азарашвили и др., 1996). Образующаяся при этом Н2О2 с участием эндогенной пероксидазы может включаться в окисление фенольных субстратов. Таким образом, активность окисления фенолов может являться показателем активности окислительного распада ЩК и образования Н202 с участием оксалатоксидазы. С использованием а-нафтола и ЩК Dumas с соавт. [1994] провели качественную реакцию на присутствие оксалатоксидазы на поверхности корней проростков ячменя. Заменив а-нафтол на растворимый фенольный субстрат ортофенилендиамин (ОФД), мы поставили количествешшй метод оценки активности окисления фенольных соединений с участием оксалатоксидазы, Щ1< и пероксидазы в интактных проростках пшеницы. Для этого в среду с проростками (0,0 IM KCl) вносили ОФД и инициировали реакцию добавленное 0,025М ЩК. Затем через определенные промежутки времени в аликвотах средь спектрофотометрически оценивали степень окисления ОФД. Оказалось, чт< анализируемая реакция является специфичной и чувствительной к присутствии ЩК (табл. 3). Для того чтобы выявить, стимулирует ли обработка проростко ХОС окислительный распад ЩК, был поставлен отдельный опыт. В контрол проростки 10 мин. находились на среде с 0,01 M KCl, в опыте на - среде с 0,0 M KCl + ХОС (1 мг/л). Затем среды удаляли и вносили раствор ЩК. Через 1 мин. концентрация ЩК в среде с проростками, предварительно обработанным хитоолигосахаридами, составила 49% от исходной, тогда как в среде проростками не обработанными ХОС - 64% (утилизацию щавелевой кислоты среде определяли КМпО^титровапием. Данные в диссертации).

Таблица 3

Активность окисления ОФД проростками пшеницы в присутствии щавелевой кислоты (ед/г сыр. массы)

Вариант Время после инициации реакции, мин

2 • 4 6 8

(Среда+ОФД) + ЩК 16,3±1,2 17,3±0,9 19,3±1,1 24,0±1,2

(Среда+ОФД) + ЯК* 11,3±0,7 10,3±0,7 11,7±1,0 11,0±0,8

(Среда+ОФД)+ АК* 10,0±0,6 9,7±0,6 10,3±0,9 10,7±09

(Среда+Н20) +ОФД 12,0±1,0 11,0±0,8 11,0±0,8 10,0±0,6

(Среда+Н20) + ЩК 9,7±0,8 9,7±0,7 9,3±0,6 10,0±0,7

* - Вместо ЩК добавляли янтарную кислоту (ЯК) или аспарагиновую (АК).

Таким образом, обработка растений хитоолигосахаридами увеличивала активность окислительного распада ЩК в среде с проростками и одновременно индуцировала окисление ОФД на поверхности корней, что согласуется с активацией оксалатоксидазы в растениях пшеницы при патогенезе [Hurkmann, Tanaka, 1996] и усилением лигнификации тканей в листьях пшеницы при обработке хитином [Pearce, Ride, 1983].

Согласно гипотезе Албершейма [Alberscheim et al., 1975], основными потенциальными участниками, определяющими развитие реакций устойчивости/восприимчивости растений к болезням, являются белковые рецепторы, связывающие специфические углеводсодержащие молекулы патогенов. Среди таких белков особое внимание многих авторов уделяется растительным лектинам. Поэтому мы исследовали влияние обработки растений хитоолигосахаридами, как специфическими лигандами лектина пшеницы, на количественный уровень АЗП в проростках.

0 100 мг/л □ 10 мг/л ■ 1 мг/л

1 сут.

2сут.

3 сут.

Возраст проростков

Рис. 7. Влияние обработки семян хитоолигосахаридами (100, 10 и 1 мг/л) на содержание АЗП в проростках пшеницы. Контроль -100%.

Как видно, на рис. 7 замачивание семян 12 ч в растворе ХОС в концентрации 100 мг/л вызывало повышение уровня АЗП в суточных проростках на 50% в сравнении с контролем. Сходным образом на 2-суточные проростки влияла обработка семян более низкими концентрациями ХОС, но эффект был слабее. Через 3 суток наблюдалась тенденция снижения содержания АЗП в опытных проростках по сравнению с контрольными.

При помещении 4-суточных проростков пшеницы на среду с ХОС наблюдалась другая картина. Обработка проростков ХОС в концентрации 100 мг/л через 12 ч снижала содержания АЗП в растениях па 60% в сравнении с контролем. В то же время, обработка растений ХОС в концентрациях 10 мг/л стимулировала накопление лектина в среднем на 30% в сравнении с контролем. Низкая концентрация (1 мг/л) не влияла на уровень лектина в растениях.

Снижение содержания лектина в проростках под влиянием ХОС (100 мг/л) могло быть вызвано выделением АЗП корнями растений в среду. Так, Г^Ыипс! с соавт. [1985] показали, что обработка растений пшеницы

Таблица 4

Влияние ХОС на содержание АЗП в проростках пшеницы и выход лектина в среду

Варианты АЗП, мкг/г сыр. массы Концентрация АЗП в среде, нг/мл

Контроль (1% сахароза) 192+30 18,5±3,4

ХОС, 10 мг/л 165±25 19,8±4,2

ХОС, 1000 мг/л 68±9 112,0±13,1

4-суточные проростки 10 мин. выдерживали на 1%-ной сахарозе или на %-ной сахарозе + ХОС. Затем корни промывали, и проростки помещали на %-ный раствор сахарозы. Через 30 мин. определяли содержание АЗП в >астениях и среде.

:итоолигосахаридами (10 ООО мг/л) способствовала выходу значительного голичества лектина из корней. Как показано в табл. 4 уже 10-минутной >бработки растений хитоолигосахаридами в концентрации на порядок меньше (ем у указанных авторов, было достаточно для значительного снижения уровня \ЗП в проростках и выделения лектина в среду.

Результаты наших исследований влияния ХОС на растения и каллусы тшешщы ярко иллюстрируют тот факт, что появляющиеся в процессе ззаимодействия растительной клетки с атакующим её хитинсодержащим |)итопатогенным грибом хитоолигосахариды могут существенно влиять на метаболизм растения. Однако для понимания объективной картины процессов, происходящих при этом взаимодействии, не стоит упускать из виду роль этих сигнальных молекул по отношению к организму самого патогена. Известно, что :реди фитопатогенов поражающих пшеницу одними из распространенных являются Bipolaris sorokiniana, вызывающий корневую гниль и Tilletia caries -возбудитель твердой головни. В связи с этим интересно было определить влияние хитоолигосахаридов на рост культуры этих фитопатогенных грибов.

il

II

Рис. в Подавление poma 10-дневной культуры гриба В, sorokiniana лигоилшисахаридамн. 1 - мни роль. 2 - ХОС 10 mki/mji, 3 - ХОС 60 мкг-мл.

i полииа

Влияние хитоолш оеахаридов tía прорастание спор гриба Т. caries

Вариаиi

Кон i роль 0,001 мг/мл

0.0] MI /мл : 0,1 МГ/МЛ

Количество Количество Длина

проросших спор, "Л ¡ споридий, % . промицелия. ед.

33,1±1,7 33.610.2 41.512.0

4.3+1.1

11,6г0,9 27.611.7

13.0±1,1

¡ ,4+0.7

ó.7l0,5

8,6+0,7

6,8+0.5 3.9+0,4

На рас. 8 видно, чго н концентрации 0.01 mi/мл и выше хитоолигосахариды существенно подавляли рост 10 дневной колонии гриба В. sorokiniana. Меньшие концентрации препарата не оказывали влияния па диаметр колоний этого гриба.

11ри анализе влияния ХОС на рост гриба Т. caries, вызывающею существенные потери урожая и качества зерна, выяснилось, что ХОС в концентрации 0,1 мг/мл почти на порядок ингибировали прорастание спор патогена, образование споридий п уменьшали размер промицелия в два pa.¡a. Однако при этом следует отметить, что более низкие концентрации ХОС.' наоборот оказывали стимулирующее действие на вышеперечисленные

гоказатели (табл. 5).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что шияние хитоолигосахаридов на рост и развитие фитопатогенных грибов носит ^однозначный характер и определяется видом гриба и концентрацией [репарата.

* * *

Продукция АФК в растениях пшеницы под действием ХОС согласуется : известной активностью этих молекул как элиситоров, повышающих остойчивость растений к патогенам [Mehdy, 1994; Low, Merida 1996 ], и может шть отнесена к одной из самых быстрых ответных реакций растений. Однако шсокая реакционная способность АФК делает их чрезвычайно токсичными 1ля биологических систем на всех уровнях. Поэтому в организмах существует лногоуровневая антиоксидантная защитная система, призванная предохранять слетку от повреждений АФК [Пескин, 1998].

Согласно исследованию Лешема с соавт. [Leshem et al., 1981; Leshem, 1984] к системе защиты растительной клетки от гиперпродукции АФК можно этнести цитокинины. Интересно, что эти авторы показали способность дитокишшов взаимодействовать с супероксидным анионом с образованием гетоксичных соединений. Кроме того, считается, что цитокинины 1ред отвращают накопление АФК посредством подавления активности ферментов, приводящих к их продукции, а также активации синтеза шзкомолекулярных утилизаторов АФК [Leshem 1984; Barciszewski et al., 1999]. В связи с этим повышение уровня цитокининов в растениях пшеницы в ответ на экзогенную обработку хитоолигосахаридами можно рассматривать как один in возможных механизмов защиты клетки от вторичного повреждающего агента в виде АФК.

Накопление цитокиншюв в растениях пшеницы под влиянием ХОС, вероятно, играет также важную роль в регуляции процессов, связанных с активацией роста и развития клеток в чувствительных к цитокииинам или ХОС тканях растений, как, например, в каллусах пшеницы, растущих на среде МС, не содержащей регуляторов роста. Это согласуется с данными некоторых авторов о стимуляции роста и развития растений хитином, хитозаном и их производными. Вероятно, таким образом, могут быть связаны между собой реакции, развивающиеся в растениях пшеницы в ответ на действие хитоолигосахаридов, сопряженные, с одной стороны, с элиситорной, а с другой - рострегулирующей активностью этих молекул.

ВЫВОДЫ

1. Получен очищенный препарат водорастворимых хитоолигосахаридов со средней степенью адетилирования 65% и молекулярной массой от 5 до 10 кД обработкой хитина концентрировашюй серной кислотой и многократным переосажденисм продуктов гидролиза в ацетоне и этаноле.

2. Показано, что ХОС в низких концентрациях (0,1 мкг/мл) многократно стимулируют рост каллусов пшеницы на среде Мурасиге и Скута, не содержащей экзогенных регуляторов роста и обладают активностью, подобной фитогормонам. Стимуляция роста каллусов происходит как вследствие увеличения размеров клеток, так и усиления их митотической активности.

3. Выявлено, что интенсивный рост каллусов пшеницы на среде с хитоолигосахаридами связан с увеличением в растительных тканях свободных эндогенных цитокининов и ИУК.

4. ХОС вызывают существенное изменение баланса эндогенных фитогормонов в проростках пшеницы. К характерному ответу растений на действие хитоолигосахаридов относится увеличение содержания цитокининов. Характер изменения ИУК и АБК в проростках пшеницы определяется концентрацией и временем действия препарата.

5. К быстрым защитным реакциям растений пшеницы в ответ на бработку хитоолигосахаридами относится интенсификация образования ерекиси водорода, а также активация окисления фенольных соединений с частием оксалатоксидазы, щавелевой кислоты и пероксидазы.

6. Показано, что образование перекиси водорода в проростках пшеницы од влиянием хитоолигосахаридов может происходить в результате ревращения супероксиднош аниона, а также окислительного распада щвелевой кислоты с участием фермента оксалатоксидазы.

7. Выявлено, что ХОС в концентрации более 0,1 мг/мл обладают унгистатической активностью по отношению к фитопатогенным грибам В. jrokiniana и Т. caries. Это позволяет утверждать, что известное свойство »тина и его производных повышать устойчивость растений к болезням, вязано как с активацией защитных реакций растений при их обработке итоолигосахаридами, так и ингибированием роста фитопатогенных грибов, увствительных к действию этих соединений.

8. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что итоолигосахариды в низких концентрациях (10-0,01 мг/л) обладают высокой иологической активностью по отношению к растениям пшеницы, к одним из гачимых проявлении которой можно отнести быструю продукцию активных орм кислорода, а также существенное изменение баланса эндогенных итогормонов в растениях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ахметова И. Э., Юсупова З.Р., Хайруллин P.M. Исследование острегулирующей активности хитосахаридов // Тезисы докладов 3-го ■негодного симпозиума "Физико-химические основы физиологии растений и иотехнология. Москва, 27-28 июня 1997 г. С.94.

2. Khairullin R.M., Jusupova Z.R., Maksimov I.V., Akhmetova I.E., Isaev R.F. he direct and WGA-enchanced coupling of wheat peroxidase to chitin // Eur. J. of

Cell Biology. 1997. V.74. Suppl. 46.

3. Khairullin R.M., Akhmetova I.E., Jusupova Z.R., Maksimov I.V. Influence of chitin oligomers on anionic pcrioxidase induction // Bulgarian J. of Planl Physiology. 1998. Special Issue. P. 213.

4. Ахметова И.Э., Муллагалиев И.Р., Ахметов P.P., Хайруллин P.M. Получение биологически активных олигомеров хитина // Итоги научны* исследований биологического факультета Башгосуниверситета за 1997 г. Уфа БГУ, 1998. С.68-72.

5. Ахметова И.Э., Хайруллин P.M., Сурина О.Б., Влияние хитоолигосахаридов (ХОС) на индукцию и рост каллусов пшеницы // Тезись докладов 5-ой международной конференции «Регуляторы роста и развитш растений». Москва, МСХА, 29 июня-1 шоля 1999 г. 4.1. С. 303.

6. Хайруллин P.M., Ахметова И.Э., Сурина О.Б., Ганиев P.M. Механизмь рострегулирующего действия хитоолигосахаридов (ХОС): влияние на рост v развитие пшеницы и некоторых фитопатогенных грибов // Там же, с. 348.

7. Хайруллин P.M., Ахметова И.Э., Сурина О.Б., Шакирова Ф.М Механизмы рострегулирующего действия хитоолигосахаридов (ХОС) изменение баланса фитогормонов в растениях пшеницы // Там же, с. 349.

11. P.M. Хайруллин, P.M. Ганиев, А.З. Салахов, И.Э. Ахметова, И.В Максимов. И.В. Перспективы использования экологически-безопасны) соедиснний хитина и хитозана для защиты пшеницы от болезней // Экологи) промышленных регионов на рубеже XXI века. Магнитогорск, 1999. С.22-25.

8. P.M. Хайруллин, А.З. Салахов, P.M. Ганиев, И.Э. Ахметова, И.В Максимов. Проблемы экологически безопасного производств; сельскохозяйственной продукции в промышленных регионах и некоторые пуп их решения // Там же, с. 25-28.

9. Ахметова И.Э., Хайруллин P.M., Юсупова З.Р., Сурина О.Б., Трошин; Н.Б. Исследование биологической активности хитоолигосахаридов // Итоп научных исследований биологического факультета Башгосуниверситета за 199! г. Уфа: БГУ, 1999. С.43-48.

10. Ахметова И.Э., Хайруллин P.M. Продукция перекиси водорода [роростками пшеницы под действием хитоолигосахаридов // Там же, с. 48-53.

11. Хайруллин P.M., Ахметова И.Э., Сурина О.Б., Трошина Н.Б. Влияние :ито о л и го с ах ар идо в на уровень цитокининов в проростках и каллусах [шсшгцы ИIV съезд ОФРР. Международная конференция. Москва, 4-9 октября, 999. С.525.

Индира Эмсльевна Ахметова

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ ХИТООЛИГОСАХАРИДОВ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Отпечатано в типографии издательства БИРО. 450005, Уфа, ул. Мингажева, 120. Лиц. № Б 848151 МПиМИРБ от 15.05.98.

Подписано в печать 05.04.2000. Бумага писчая. Формат 60x80 1/16. Компьютерный набор. Гарнитура Тайме. Отпечатано на ризографе. Тираж 100 экз. Заказ 071.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ахметова, Индира Эмельевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. Физиологические особенности формирования защитных реакций растений против фитопатогенов (обзор литературы).

1.1. Общая характеристика взаимоотношений растений и фитопатогенных грибов.

1.2. Детерминантная фаза взаимоотношений растения и патогена. Роль элиситоров.

1.3. Роль активных форм кислорода в защитных реакциях растений при патогенезе.

1.4. Ответные реакции растений на воздействие хитоолигосахаридных элиситоров.

1.5. Растительные лектины и их предполагаемые функции.

1.6. Актуальность изучения биологической активности хитоолигосахаридов для выявления функций лектинов злаковых растений.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объект исследований.

2.2. Растительный материал.

2.2.1. Выращивание проростков пшеницы.

2.2.2. Получение отрезков колеоптилей.

2.2.3. Получение и культивирование каллусной ткани.

2.3. Фиксация растительного материала.

2.4. Получение хитоолигосахаридов.

2.5. Методы определения физико-химических и биологическихойств хитоолигосахаридов.

2.5.1. Определениеепени ацетилирования хитоолигосахаридов.

2.5.2. Определение молекулярной массы хитоолигосахаридов.

2.5.3. Подавление гемагглютинации эритроцитов лектином пшеницы.

2.6. Скрининг хитоолигосахаридов на фунгицидную активность.

2.7. Измерение продукции перекиси водорода.

2.8. Определение активности окисления фенольныхединений проростками пшеницыучастием оксалатоксидазы.

2.9. Количественный анализ щавелевой килоты.

2.10. Цитологические исследования.

2.11. Непрямой твердофазный конкурентный иммуноферментный43 анализ.

2.11.1. Определение количественногодержания фитогормонов.

2.11.2. Определения количественногодержания лектина.

2.12. Статистическая обработка результатов. 4 5 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.46 3.1 Оценкаособа получения хитоолигосахаридов и их основные физико-химическиеойства.46 3.2. Исследование физиологической активности хитоолигосахаридов на растениях пшеницы.

3.2.1. Влияние хитоолигосахаридов на рост интактных растений пшеницы.

3.2.2. Влияние ХОС на рост каллусов пшеницы.

3.2.3. Влияние ХОС на баланс эндогенных фитогормонов в растениях пшеницы.

3.2.4. Быстрая продукция перекиси водорода растениями пшеницы в ответ на действие ХОС.

3.2.5. Влияние ХОС на активность окисления фенольных соединений растениями пшеницы. Окисление щавелевой

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиологические особенности формирования защитных реакций пшеницы при действии хитоолигосахаридов"

Актуальность проблемы. Проблема повышения устойчивости сельскохозяйственных культур к грибным болезням является одной из актуальных для растениеводства. Её решению в значительной степени способствует познание механизмов естественной и индуцированной устойчивости растений к болезням. Считается, что развитие защитных реакций растений против фитопатогенных грибов во многом может определяться взаимодействием растительной клетки с сигнальными молекулами (элиситорами), в том числе и углеводной природы, образующимися в результате деградации растительными гидролазами клеточных стенок фитопатогенных грибов [Albersheim et al., 1983]. К одним из таких элиситоров относятся хитоолигосахариды (ХОС), представляющие олигомерные фрагменты клеточных стенок хитинсодержащих грибов. В последнее время ХОС широко изучаются в связи с их способностью индуцировать защитные реакции растений (активацию синтеза PR-белков, накопление фитоалексинов, синтез лигнина и т.д. [Максимов и др. 1997; Vander et al. 1998]). В то же время, ХОС относятся к нетрадиционным регуляторам роста растений, выделенным в класс олигосахаринов [Озерецковская, Роменская, 1996; Creelman, Mullet, 1997]. Известно, что в пшенице и других видах злаковых растений содержатся белки-лектины, способные к специфическому взаимодействию с хитином и его производными [Peumans, Stinissen, 1983]. Можно полагать, что благодаря свойству аффинного взаимодействия с хитином эти белки способны принимать участие в регуляции ответа растений на действие хитоолигосахаридов. К сожалению, в этом аспекте биологическая активность хитоолигосахаридов по отношению к злаковым растениям остается недостаточно изученной, также, как, и механизмы рост-регулирующей активности этих соединений.

Цель работы заключалась в изучении особенностей развития защитных реакций пшеницы в ответ на действие хитоолигосахаридов, как наиболее вероятных элиситорных молекул хитинсодержащих фитопатогенных грибов.

Для этого решались следующие задачи:

- получить препарат водорастворимых хитоолигосахаридов, близких по структуре к хитину;

- изучить влияние препарата на рост и развитие интактных растений и каллусных культур пшеницы;

- исследовать ранние ответные реакции пшеницы при обработке растений хитоолигосахаридами;

- определить влияние ХОС на баланс эндогенных фитогормонов в пшенице; установить характер количественных изменений уровня хитинспецифичного агглютинина зародыша пшеницы (АЗП) в растениях при обработке хитоолигосахаридами;

- изучить влияние ХОС на рост и развитие некоторых фитопатогенных грибов.

Научная новизна. Впервые исследовано влияние хитоолигосахаридов на содержание в растениях пшеницы свободных эндогенных фитогормонов - абсцизовой (АБК), индолилуксусной (ИУК) кислот и цитокининов. Выявлено, что в ответ на экзогенную обработку хитоолигосахаридами наиболее быстрым и характерным изменением баланса фитогормонов в растениях является повышение уровня цитокининов. Методом хемилюминесцентного анализа впервые показана быстрая (5-10 мин) продукция перекиси водорода (Н202) интактными проростками пшеницы под действием низких концентраций (10 нг/мл) хитоолигосахаридов. Показано, что одним из источников быстрого 7 образования Н202 может быть окисление щавелевой кислоты эндогенной оксалатоксидазой.

Практическая значимость. Предложена модификация способа получения водорастворимых хитоолигосахаридов и одновременного фракционирования их по массе многократным осаждением в ацетоне из водного раствора, исключающая использование длительной колоночной хроматографии. Полученный препарат состоит из смеси хитин-хитозановых олигомеров со средней степенью ацетилирования (СА) 65% и молекулярной массой 5-10 кД. Предложен метод хемилюминесцентного анализа продукции Н2О2 интактными растениями пшеницы с использованием нового прибора XJI-003. Показано, что ХОС в концентрации более ОД мг/мл подавляют рост фитопатогенных грибов пшеницы Bipolaris sorokiniana (Sacc. Shoem) и Tilletia caries (DC.) Tul., что может быть использовано в создании новых препаратов для защиты растений.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ахметова, Индира Эмельевна

ВЫВОДЫ

1. Получен очищенный препарат водорастворимых хитоолигосахаридов со средней степенью ацетилирования 65% и молекулярной массой от 5 до 10 кД обработкой хитина концентрированной серной кислотой и многократным переосаждением продуктов гидролиза в ацетоне и этаноле.

2. Показано, что ХОС в низких концентрациях (0,1 мкг/мл) многократно стимулируют рост каллусов пшеницы на среде Мурасиге и Скуга, не содержащей экзогенных регуляторов роста и обладают активностью, подобной фитогормонам. Стимуляция роста каллусов происходит как вследствие увеличения размеров клеток, так и усиления их митотической активности.

3. Выявлено, что интенсивный рост каллусов пшеницы на среде с хитоолигосахаридами связан с увеличением в растительных тканях свободных эндогенных цитокининов и ИУК.

4. ХОС вызывают существенное изменение баланса эндогенных фитогормонов в проростках пшеницы. К характерному ответу растений на действие хитоолигосахаридов относится увеличение содержания цитокининов. Характер изменения ИУК и АБК в проростках пшеницы определяется концентрацией и временем действия препарата.

5. К быстрым защитным реакциям растений пшеницы в ответ на обработку хитоолигосахаридами относится интенсификация образования перекиси водорода, а также активация окисления фенольных соединений с участием оксалатоксидазы, щавелевой кислоты и пероксидазы.

6. Показано, что образование перекиси водорода в проростках пшеницы под влиянием хитоолигосахаридов может происходить в результате превращения супероксидного аниона, а также окислительного распада щавелевой кислоты с участием фермента оксалатоксидазы.

103

7. Выявлено, что ХОС в концентрации более 0,1 мг/мл обладают фунгистатической активностью по отношению к фитопатогенным грибам В. sorokiniana и Т. caries. Это позволяет утверждать, что известное свойство хитина и его производных повышать устойчивость растений к болезням, связано как с активацией защитных реакций растений при их обработке хитоолигосахаридами, так и ингибированием роста фитопатогенных грибов, чувствительных к действию этих соединений.

8. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что хитоолигосахариды в низких концентрациях (10-0,01 мг/л) обладают высокой биологической активностью по отношению к растениям пшеницы, к одним из значимых проявлении которой можно отнести быструю продукцию активных форм кислорода, а также существенное изменение баланса эндогенных фитогормонов в растениях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно работам Roby и др. [1987], Inui и др. [1991], Yamada с соавт. [1993], Vander и др. [1998] существует определенная зависимость между структурой ХОС и их биологической активностью, что позволило некоторым авторам предположить наличие специфических сайтов связывания этих сигнальных молекул в плазмалемме или клеточной стенке некоторых злаковых растений [Yamada et al. 1997].

Ранее основная роль в рецепции углеводных сигналов фитопатогенов отводилась лектинам [Albersheim et al., 1975]. Особенно привлекательной молекулой в пшенице в связи со способностью специфического взаимодействия с хитоолигосахаридами выглядел агглютинин зародыша пшеницы, поскольку было показано, что АЗП подавляет рост мицелия различных хитинсодержащих грибов in vitro [Mirelman et al. 1975; Лахтин, Яковлева, 1987], а также накапливается в растениях при инфицировании проростков грибными патогенами [Ямалеев и др., 1988; Шакирова и др., 1990; Хайруллин и др., 1993].

Результаты наших исследований показали, что ХОС вызывают повышение уровня АЗП в проростках пшеницы при обработке семян. При введении высоких концентраций ХОС (100 мг/л) в среду культивирования проростков пшеницы наблюдается выход лектина в окружающую среду, с чем, вероятно, связано падение его уровня в растениях при действии высоких концентраций ХОС. Обработка растений более низкими концентрациями ХОС (10 и 1 мг/л) повышает количественный уровень этого белка в проростках. При этом не наблюдается существенного повышения уровня лектина в окружающей среде. Следует отметить при этом, что в целом увеличение уровня лектина при обработке растений ХОС составляет около 50% от уровня контроля, что гораздо меньше, чем, например, при действии таких абиотических стрессовых факторов как гипертермия [Саштие е1 а1., 1990] или засоление [Шакирова и др., 1993].

Хорошо известно, что синтез АЗП контролируется фитогормоном АБК [Саштие е1 а1. 1989], известным как гормон стресса [Кефели, 1994]. При действии многих стрессовых факторов на растения пшеницы накопление лектина действительно наблюдается на фоне повышения концентрации АБК в растениях, или следует за ним, что еще раз демонстрирует участие АБК в регуляции уровня АЗП в растениях пшеницы [Шакирова, 1999].

Анализ влияния ХОС на баланс эндогенных фитогормонов в проростках пшеницы показал, что наиболее быстрым и характерным откликом растений на обработку ХОС является увеличение уровня цитокининов. Известно, что цитокинины рассматриваются как антагонисты АБК в регуляции роста и развития растений, а также в регуляции активности некоторых белков и ферментов [ВагшвгелУБк! е1 а1., 1999]. Таким образом, это согласуется с тем, что хотя АЗП и накапливается в растениях пшеницы под действием хитоолигосахаридов, это накопление не столь значительно, как при действии указанных выше стрессов.

Эти данные позволяют предположить, что при действии хитоолигосахаридных сигналов на растения пшеницы наиболее быстрый или значительный по уровню активации ответ, возможно, связан не столько активацией лектинов, сколько с функционированием других белков и ферментов. Как свидетельствуют полученные результаты, эти ответные реакции могут включать, в первую очередь, гиперпродукцию активных форм кислорода и развитие, так называемого, окислительного стресса - состояния резко нарушенного окислительно-восстановительного статуса клетки, когда активные формы кислорода не могут адекватно блокироваться антиоксидантной защитной системой [Саприн, Калинина,

1999]. Так, мы выявили, что ХОС в очень низких концентрациях (0,1 мг/л) способны уже в течение 5-10 минут многократно повышать продукцию перекиси водорода интактными проростками пшеницы.

С одной стороны, продукция в растениях пшеницы активных форм кислорода под действием ХОС не противоречит известной активности этих углеводных молекул как элиситоров, повышающих в конечном итоге устойчивость растений к патогенам. При этом АФК обладают прямым микробицидным действием на фитопатоген и могут служить так же сигналами для изменения метаболизма самого растения, включая экспрессиию генов, кодирующих синтез защитных белков [Mehdy, 1994; Low, Merida, 1996 ].

С другой стороны, высокая реакционная способность АФК вызывать повреждения макромолекул белков, нуклеиновых кислот и липидов делает их чрезвычайно токсичными для биологических систем на всех уровнях -от молекулярно-клеточного до организменного [Меныцикова и др., 1994]. Таким образом, при гиперпродукции АФК могут повреждаться и собственные клеточные структуры растения, что согласуется, например, с известной гипотезой Мелехова [1985; 1986] о необходимости защиты организма от возможного саморазрушения клетки при действии стрессовых факторов. Согласно гипотезе этого автора, в защите растений от самоповреждений при стрессах ведущую роль играет АБК, как ингибитор роста и активного метаболизма растительной клетки.

В живых организмах существует многоуровневая антиоксидантная защитная система, призванная предохранять клетку от повреждений, вызванных накоплением АФК [Пескин, 1998]. К системе защиты клетки от гиперпродукции АФК относятся антиокислительные ферменты и многочисленные низкомолекулярные антиоксиданты, к которым, согласно исследованиям Лешема и др. [Leshem et al., 1981; Leshem, 1984] можно отнести и фитогормоны, препятствующие старению - цитокинины. Интересно, что эти авторы показали способность цитокининов взаимодействовать с супероксидным анионом с образованием нетоксичных соединений. Кроме того, считается, что цитокинины предотвращают накопление АФК посредством подавления активности ферментов, приводящих к их продукции, а также активацией синтеза низкомолекулярных утилизаторов АФК [ЬезЬеш 1984; Ваппзге'^узк! е1 а1., 1999].

В связи с этим выявленное нами повышение уровня цитокининов в растениях пшеницы в ответ на экзогенную обработку хитоолигосахаридами можно рассматривать как один из возможных механизмов защиты клетки от вторичного повреждающего агента в виде АФК. Таким образом, анализируя гипотезу Мелехова о регуляции абсцизовой кислотой метаболизма растений в условиях стресса, становится удивительным, что разные по характеру действия фитогормоны - АБК и цитокинины в целом могут выполнять одинаковые по физиологической значимости функции в растениях, связанные с защитой клетки от самоповреждения.

Накопление цитокининов в растениях пшеницы под влиянием ХОС, вероятно, играет также важную роль в регуляции процессов, связанных с активацией роста и развития клеток в чувствительных к цитокининам или ХОС тканях растений, как, например, в каллусах пшеницы. Выявленная нами стимуляция хитоолигосахаридами роста каллусов пшеницы на среде МС, не содержащей 2,4-Д и кинетина, согласуется с данными многих авторов о стимуляции роста и развития растений хитином, хитозаном и их производными. Вероятно, таким образом, могут быть связаны между собой

101 реакции, развивающиеся в растениях пшеницы в ответ на действие хитоолигосахаридов, связанные, с одной стороны, с элиситорной, а с другой - рострегулирующей активностью этих молекул.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ахметова, Индира Эмельевна, Уфа

1. Аверьянов A.A. Активные формы кислорода и иммунитет растений // Успехи современной биологии. 1991. Т. 111, вып. 5. С. 722-738.

2. Андреев JT.H., Талиева М.Н. Физиологические аспекты иммунитета растений // Облигатный паразитизм. Цитофизиологические аспекты. М.: Наука, 1991. С. 5-12.

3. Андреева В.А. Фермент пероксидаза. М.: Наука, 1988. 129 с.

4. Азаришвилли Т.С., Евтодиенко В.Ю., Кудзина Л.Ю. Выделение, очистка и кинетические свойства оксалатоксидазы (ЕС 1.2.3.4.) из листьев свеклы // Физиология раст. 1996. Т.43, N.2. С. 196-200.

5. Бабко А.К., Пятницкий И.В. Количественный анализ. М.: Высшая школа, 1968.495 с.

6. Безрукова М.В. Гормональная регуляция содержания лектина пшеницы в стрессовых условиях. Дисс. канд. биол. наук. Уфа, 1997. 167 с.

7. Бутенко Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений. В сб. Гормональная регуляция онтогенеза растений. М.: Наука, 1984. С. 16-32.

8. Вавилов Н.И. Иммунитет растений к инфекционным заболеваниям. М.: Наука, 1986. 520 с.

9. Васюкова Н. И., Озерецковская О.Л. Биохимические механизмы специализации фитопатогенов к растению-хозяину. В кн. Защита растений (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М., 1991. Т.7. С. 1-196.

10. Ильинская Л.И., Озерецковская О.Л. Биохимические механизмы индуцированной устойчивости растений. Там же, с. 1-196.

11. Горбачева JI.A., Дударева H.A., Салганик Р.И. Молекулярные механизмы устойчивости растений к патогену // Успехи совр. биологии. 1991. Т.111, вып.1. С. 122-136.

12. Дьяков Ю.Т. Молекулярно-генетические основы взаимоотношения растений с грибными и бактериальными инфекциями растений // Успехи совр. генетики. 1994. Т. 19. С. 25-48.

13. Запромётов H.H. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. 272 с.

14. Кефели В.И. Физиологические основы конструирования габитуса растений. М.: Наука, 1994. 269 с.

15. Королев Н.П. Функции лектинов в клетках // Итоги науки и техники. Сер. Общие проблемы физико-химической биологии. М.: ВИНИТИ, 1984. Т.1. 351 с.

16. Коту сов В.В., Семак H.H., Щеглов С.Ю. Взаимодействие лектина пшеницы со свободноживущими азотфиксирующими микроорганизмами // Докл. АН. СССР. 1984. Т.274, N.3. С. 751-754.

17. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. и др. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых антител // Физиология растений. 1986. Т.ЗЗ, Вып.6. С. 1221-1227.

18. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко H.H. и др. Иммуноферментная тест-система для определения цитокининов // Физиология раст. 1990. Т.37, вып. 1. С. 193-199.

19. Кулаева О. Н. Цитоконины, их структура и функция. М.: Наука, 1973. С. 25-28.

20. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РЖ и белка // XXXXI Тимирязевское чтение М.: Наука, 1982. 82 с.

21. Лахтин В.М. Лектины в исследовании белков и углеводов // Итоги науки и техники. Серия Биотехнология. -М.: ВИНИТИ, 1987. 288 с.

22. Лахтин В.М., Яковлева З.М. Связывание лектина из зародышей пшеницы с поверхностью мицелия и спор Helminthosporium sativum // Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1987. №5. С. 792-795.

23. Луцик М.Д., Панасюк E.H., Луцик А.Д. Лектины. Львов: Вища школа, Изд-во при Львов, ун-те, 1981. 256 с.

24. Любимова Н.В., Лахтин В.М., Бинюкова В.И., Шувалова Е.П. Структурно-функциональные изменения цитоплазматической мембраны растительной клетки, индуцированные раневым стрессом // Прикл. биохимия и микробиол. 1988. Т.24, Вып. 1. С. 110-117.

25. Макарова Р.В. Регуляторы роста в модельных системах. // Итоги науки и техники. Физиология растений. М.: ВИНИТИ, 1990. Т.7. С. 125-153.

26. Максимов В.И., Мосин В.А. Простой метод обнаружения и выделения олигосахаридов, фрагментов хитозана после ионообменной хроматографии // Изв. АН СССР. Сер. Химическая. 1969. №11. С.2579-2581.

27. Максимов В.И., Смирнова Ю.В. Сернокислотно-ферментативная переработка хитина//Биотехнология. 1993. № 10. С. 26-30.

28. Максимов В.И., Родомаи В.Е., Лупцевич В.Г. Фитоактивные хитиновые соединения // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т.ЗЗ, №4. С. 355-362.

29. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., Шергин С.М. Биохимия окислительного стресса. Оксиданты и антиоксид анты. Новосибирск, 1994. 203 с.

30. Метлицкий Л.В., Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л. Индукторно-супрессорная гипотеза фитоиммунитета // Ж. Общей биологии. 1986. Т. XLVII, №6. С. 748-758.

31. Муллагалиев И.Р., Галиаскарова Г.Г., Монаков Ю.Б. О деструкции хитозана под действием перекиси водорода // Докл. АН СССР. 1995. Т. 345, №2. С. 199-204.

32. Озерецковская О.Л., Роменская И.Г. Олигосохараины как регуляторные молекулы растений. // Физиология растений. 1996. Т. 43, №5. С. 743752.

33. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. 536 с.

34. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1974. 288 с.

35. Переход Е.А., Чаленко Г.И., Герасимов Н.Г., и др. Хитозан регулятор фитофтороустойчивости картофеля // Докл. АН СССР. 1997. Т. 355, №1. С. 120-122.

36. Переход Е.А., Чаленко Г.И., Васюкова Н.И. Иммуномодулирующая активность олигосахаринов хитина и ксилоглюкана // 4-ый Съезд Общества физиологов растений России. Международная конференция. Москва 4-9 октября, 1999. С. 236.

37. Пескин A.B. О регуляторной роли активных форм кислорода // Биохимия. 1998. Т.63, вып. 9. С. 1307-1308.

38. Плиска Е.А., Нудьга Л.А., Данилов С.Н. Хитин и его химические превращения // Успехи химии. 1977. Т. XLVI, № 8. С. 1470-1487.

39. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: Изд-во ЛГУ, 1982. 248 с.

40. Родченко О.П., Маричева Э.А., Акимова Г.П. Адаптация растущих клеток корня к пониженным температурам. Новосибирск. Изд-во "Наука". Сибирское отделение. 1988. 149с.

41. Салтыкова Е.С. Адаптивное действие хитоолигосахаридов на Apis Mellifera L. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. С-Петербург Пушкин, 2000 г. 25 с.

42. Тихонович И.А. и Проворов H.A. Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции. СПб.: Наука, 1998. 194 с.

43. Тютерев С.Л., Якубчик М.С., Тарлаковский С.А., Выцкий В.А. Хитозан -биологически активное экологически безопасное средство, повышающее устойчивость растений к болезням. Всерос. НИИ защиты растений. С.-Петербург, 1994. 44 с.

44. Усуи Т. Способ получения высококачественных N-ацетилолигосахаридов // Патент Японии. 1989. №228491.

45. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. М.: Наука, 1983. 248 с.

46. Хайруллин P.M., Шакирова Ф.М., Безрукова М.В., Ямалеев A.M. Изменение содержания лектина, абсцизовой и индолилуксусной кислот в растениях пшеницы, инфицированных Septoria nodorum

47. Berk. // Физиол. и биохимия культурных растений. 1993. Т. 25, №2. С. 138-144.

48. Чиков С.Н., Сургучева H.A., Гамзадзе А.И, и др. Сравнительная эффективность производных хитозана при подавлении вирусной инфекции растений // Докл. АН СССР. 1998. Т. 360. С. 271-273.

49. Чулкина В.А. Корневые гнили хлебных злаков. Новосибирск: Наука, Сибирское отд-ние, 1985. 189 с.

50. Шакирова Ф.М., Безрукова М.В., Хайруллин P.M., Ямалеев A.M. Увеличение уровня лектина в проростках пшеницы под влиянием солевого стресса // Изв. РАН Сер. Биологическая. 1993. №1. С. 142145.

51. Шакирова Ф.М. 1999. Участие фитогормонов и лектина пшеницы в ответе растений на стрессовые воздействия. Дисс. доктора биол. наук. Уфа. 1999. 275 с.

52. Шамб У., Сеттерфильд Ч., Вентворе Р. Перекись водорода. М.: изд-во Иностранной литературы, 1958. 578 с.

53. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Дегтярев C.B. и др.: Сельскохозяйственная биотехнология. М.: Высш. шк., 1998. 416 с.

54. Ямалеев A.M., Мелентьев А.И., Ямалеева A.A. О значении лектинов в защитной реакции растений пшеницы к пыльной головне // С.-х. биология. 1988. №5. С. 43-44.

55. Adam A., Farkas T., Somlyai G. et al. Consequence of 02" generation during a bacterial induced hypersensitive reaction in tobacco: deterioration of membrane lipids // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1989. V. 34. P. 13-26.

56. Albersheim P., Darvil A.G. McNeil M. et al. Oligosaccharines, naturally occuring carbohydrates with biological regulatory functions. In Structure and Function of Plant Genomes ed. Ciferri Dure III. N.-Y.: Plenum, 1983. P. 293-312.

57. Albersheim P., Darvil A. G., Augur C., et al. Oligosaccharines -Oligosaccharide regulatory molecules // Accounts Chemical Research. 1992. V. 25.N.2.P. 77-83.

58. Allen A.K., Neuberger A., Sharon N. The purification, composition, and specificity of wheat germ agglutinin // Biochem. J. 1973. V.131. P. 155162.

59. Allen N.S., Bennet M.N., Cox D.N. Effects of Nod-factors on alfalfa root hair Ca2+ and H4" currents and on cytoskeletal behavior // Advances in molecular genetics of plant-microbe interactions. Dordreht. 1994. P. 107114.

60. Anai T., Nakai., Mityata M. Isolation and characterization of an auxin-binding protein gene from radish, and its expression in insect cells // Physiologia Plantarum. V.101, N.3. P.606-611.

61. Anderson A.J., Rogers K., Tepper C.S., et al. Timing of molecular events following elecitor treatment of plant cells // Physiol. Mol Plant Pathol. 1991. V.38. P. 1-13.

62. Apostol I., Heinstein P.F., Low P.S. Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells. Role in defense and signal transduction // Plant Physiol. 1989. V.90. P. 109-116.

63. Auh Ch.-K., Murphy T.M. Plasma membrane redox enzyme is involved in the synthesis of O2" and H2C>2 by Phytopthora elicitor-stimulated Rose cells. // Plant Physiol. 1995. V.107. P. 1241-1247.

64. Barciszewski J., Rattan S.I.S, Siboska G., Clark B.F.C. Kinetin — 45 years on // Plant Science. 1999. V.148. P. 37-45.

65. Bakkers J., Semino C.E., Stroband H., et al. An important developmental role for oligosaccharides during early embryogenesis of cyprinid fish // Proc. Natl. Acad, of Sci. USA 1997. V.94, N.15. P. 7982-7988.

66. Baron C., Zambryski P.C. The plant response in pathogenesis, symbiosis, and wounding: variations on a common theme // Annu. Rev. Genet. 1995. V. 29. P. 107-129.

67. Becker J.W., Cunnigham B.A., Hemperly J.J. Structural subclasses of lectins from Leguminous plants // Chemical Taxonomy, Molecular Biology, and Function of Plant Lectins. Eds. Goldstein I.J. & Etzler M. N.-Y.: Alan R. Liss, INC., 1983. P.31-46.

68. Benhamou N., Asselin A. Attempted localization of a substrate for chitinases in plant cells reveals abundant N-acetyl-D-glucosamine residues in secondary walls // Biology of the cell. 1989. V. 67. P. 341-350.

69. Bohlool B.B., Schmidt E.L. Lectins: A possible basis for specificity in Rhizobium-legume root nodule symbiosis // Science. 1974. Y.185. P. 269-271.

70. Brisson L.F., Tenhaken R., Lamb C. Function of oxidative cross-linking of cell wall structural proteins in plant disease resistance // The Plant Cell. 1994. V.6. P. 1702-1703.

71. Broekaert W.F., Van Parijs J., Leyns F. et al. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties // Science. 1989. V.245 P. 1100-1102.

72. Bushnell W.R., Rowell J.B. Suppressors of defense reactions: a model for the roles in specificity // Phytopathology. 1981. V. 71. P. 1012-1014.

73. Cammue B.P.A., Broekaert W.F., Kellens J.T.C. et al. Stress-induced accumulation of wheat germ agglutinin and abscisic acid in roots of wheat seedlings // Plant Physiol. 1989. V. 91, N.3. P. 1432-1435.

74. Chobot V., Jemenak J., Opletal L. Phytotherapeutic aspects of diseases of the circulatory system. 4. Chitin and chitosan // Ceska Slov Farm. 1995. V. 44, N. 4. P. 190-195.

75. Chrispeels M.J., Raikhel N.V. Lectins, Lectins genes, and their role in plant defense // The Plant Cell. 1991. Y.3. P. 1-9.

76. Cohn J., Day R.B., Stacey G. Legume nodule organogenesis // Trends in Plant Science. 1998. V. 3.P. 105-110.

77. Creelman R.A., Mullet J.E. Oligosaccharides, brassinolides, and jasmonates: nontraditional regulators of plant growth, development, and gene expression//Plant Cell. 1997. V.9. P. 1211-1223.

78. Dangl J.L., Dietrich R.A., Richberg M.H. Death do not have no mercy: cell death programs in plant-microbe interactions // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1793-1807.

79. Diaz A., Sanches F., Gozales Garsia J. Phenol Derivatives as enchancers and inhibitors of luminol-H202-horseradish peroxidase chemiluminiscence // J. Biolumin. Chemilumin. 1998. V. 13 P. 75-84

80. Dumas B., Freyssinet G., Pallet K. Tissue-specific expression of germin-like oxalate oxidase development and fungal infection of barley seedlings // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 1091-1096.

81. Ehrhardt D.W., Atkinson E.M., Long S.R. Depolarization of alfalfa root hair membrane potential by Rhizobium meliloti Nod-factors // Science. 1992. V. 256. P. 998-1000.

82. Etzler M.E. Distribution and function of plant lectins // The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. Ed.: Liener I. Orlando: Academic Press, 1986. P. 371-435.

83. Felix G., Grosskopf D.G., Regenass M., Boiler T. Rapid changes of protein phosphorilation are involved in transduction of the elicitor signal in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 8831-8834.

84. Felle H.H., Kondorosi E., Kondorasi A. et al. Nod signal-induced plasma membrane potential changes in alfalfa root hairs are differently sensitive to structural modifications of the lipooligosaccharide // Plant J. 1995. V. 7. P. 939-947.

85. Forman H.J., Thomas M.J. Oxidant production and bactericidal activity of phagocytes // Ann. Revs. Physiol. 1986. V. 48. P. 669-680.

86. Gagne F., Blaise C. Evaluation of industrial wastewater quality with a chemiluminiscent peroxidase activity assay // Environ. Toxicol. Water Qual. 1997. V. 12. P. 315-320.

87. Goldstein I., Hammarstorm S., Sundblad G. Precipitation and carbohydrate-binding specificity studies on wheat germ agglutinin // Biochem. et Biophys. Acta. 1975. V. 405, N.l. P. 53-61.

88. Han L.K., Kimura Y., Okuda H. Reduction in fat storage during chitin-chitosan treatment in mice fed high-fat diet // Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 1999. V. 23, N.2. P. 174-183.

89. Howard R.J., Ferrari M.A., Roach D.H. et al. Penetration of hard substances by a fungus employing enomorous turgor pressures // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 11281-11284.

90. Hoch H.C., Staples R.C., Whitehead B. et al. Signals for growth orientation and cell differentiation by surface topography in Uromyces // Science. 1987. V.235.P. 1659-1662.

91. Hammond-Kosack K.E., Jones J.D.G. Resistance gene-dependant plant defense responses // Plant Cell. 1996.V. 8. P. 1773-1791.

92. Heath M.C. The absence of active defence mechanisms in compatible host-pathogen interactions. In active defense mechanisms in plants. Ed Wood R.K.S. New-York: Plenum Press, 1982. P. 143-156.

93. Hirano Sh. Production and application of chitin and chitosan in Japan // Proceedings from the 4-th International Conference on chitin and chitosan held in Trondheim, Aug. 22-24, 1988.

94. Hirano Sh., Hayashi M., Murae K., et al. Chitosan and derivatives as activators of plant cells in tissues and seeds // Appl. Bioactive Polymeric Materials. N.Y.: Plenum Publ. Corp., 1989. P. 45-59.

95. Hurkman W.J., Tanaka C.K. Germin gene expression is induced in wheat leaves by powdery mildew infection // Plant Physiol. 1996. V.l 1. P. 735-739.

96. Hadwiger L.A., Chiang C., Victory S., Horovitz D. The molecular biology of chitosan in Plant-Pathogen interaction and its application in agriculture //

97. Jackson A.O., Taylor C.B. Plant-microbe interactions: life and death at the interface // The Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1651-1668.1.play J.A., Linn S. DNA damage and oxygen radical toxicity // Science. 1988. V. 240. P. 1302-1309.

98. Keen N.T. Gene-for-gene complementation in plant-pathogen interactions // Annu. Rev. Genet. 1990. V. 24. P. 447-463.

99. Keppler L.D., Baker C.J. O" initiated lipid peroxidation in a bacteria-induced hypersensitive reaction in tobacco cell suspensions. Phytopatholology. 1989. V. 79. P. 555-562

100. Kolattukudy P.E. Enzymatic penetration of the plant cuticle by fungal pathogens // Annu. Rev. Phytophol. 1985. V. 23. P. 223-250.

101. Kombrink E., Somssich I.E. Defense responses of plants to pathogens. In Advances in botanical research. Andrews J.H. and Tommerup I.C. eds. London: Academic Press, 1995. V. 21. P. 1-34.

102. Marchesi V.T. Wheat germ (Triticum aestivum) agglutinin // Methods in ensimology. Ed. Ginsberg V. N.-Y.: Academic Press, 1972. V.28, Pt. B. P. 354-356.

103. Mehdy M.C. Active oxygen species in plant defense against pathogens // Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 467-472.

104. Mendgen K., Deising H. Infection structures of fungal plant pathogens a cytological and physiological evaluation // New Phytol. 1993. V. 124. P. 192-213.

105. Mirelman D., Galun E., Sharon N., Lotan R. Inhibition of fungal growth by wheat germ agglutinin//Nature. 1975. V.256, N.5516. P. 414-416.

106. Mishkind M., Kieegstra K., Palevitz A. Distribution of wheat germ agglutinin in young wheat plants // Plant Physiol. 1980. V. 66, N.5. P. 950-955.

107. Miskind M., Raikhel N.V., Palevitz B.A., Keegstra K. Immunocytochemical localization of wheat germ agglutinin in wheat // J. Cell Biol. 1982. V. 92, 3. P. 753-764.

108. Mishkind M.L., Palevitz B.A., Raikhel N.V., Keegstra K. Localisation of wheat germ agglutinin-like lectins in various species of the Gramineae // Science. 1983. V. 220, N. 4603. P. 1290-1292.

109. Miura T. Muraoka S., Ogiso T. Oxidative damage of bovine serum albumin induced by hydroxyl radical generating systems of xantine oxidase+EDTA-Fe3+ and ascorbate+EDTA-Fe3+ // Chem.-Biol. Interact. 1992. V.85 P. 243-254.

110. More F., Doussiere J., Vignais P.V. The superoxide-generating oxidase of phagocytic cells: physiologycal, molecular and pathological aspects // Eur. J. Biochem. 1991. V. 201. P. 523-546.

111. Murashige T., Scoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco cultures // Physiol. Plant 1962. V. 15, N. 3. P. 473-497.

112. Muzzarelli R.A. Chitin. Pergamon press, 1977. 344 pp.

113. Nagata Y., Burger M.M. Wheat Germ Agglutinin. Molecular characteristics and specifity for sugar binding // J. Biol. Chem. 1974. V. 249. P. 3116-3122.

114. Natsu S., Saito N., Kosaki H., et al. Stimulation of phenilalanine ammonia-lyase activity and lignification in rice calluses treated with chitin and chitosan and their derivatives. // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. V. 58, N.3. P. 552-553.

115. Nespouls C., Huet J.C., Pernollet J-C. Structure-function relationships of a and (3 elicitins signal proteins involved in the plant-Phytophthora interaction // Planta. 1992. V. 186. P. 551-557.

116. Odier A. Memoire sur la composition chimique des parties cornees des insectes // Mem. Soc. Hist. Nat. Paris, 1923. V. 1. P. 29-42.

117. Okamoto Y., Shibasaki K., Minami S. et al. Evaluation of chitin and citosan on open wound healing in dogs // J. Vet. Med. Sci. 1995. V. 57, N. 5, P. 851855.

118. Osbourn A.E. Preformed antimicrobial compounds and defense against fungal attack//The Plant Cell. V. 8. P. 1821-1831.

119. Parker J.E., Hahlbrock K., Scheel D. Different cell-wall components from Phytophthora megasperma f.sp. glucinea elicit phytoalexin production in soybean and parsley // Planta. 1988. V. 176. P. 75-82.

120. Pearce R.B., Ride J.P. Specifity of infection of the lignification response in wounding wheat leaves // Physiol. Plant Pathol. 1982. V. 16, N.2. P. 197204.

121. Peng M., Kuc J. Peroxidase-generated hydrogen peroxide as a source of antifungal activityin vitro and on tobacco leaf disks // Phytopathology. 1992. V. 82. P. 696-699.

122. Peumans W J. Biochemistry, cell biology, physiology, biosynthesis and function of Gramineae lectins // Proefschrift Leuven: Katholike Univ., Lab. Voor Pflatenbiochemie, 1984. 211 p.

123. Peumans W.J., Van Damme EJ.M. Lectins as plant defense proteins // Plant Physiol. 1995. V. 109. P. 347-352.

124. Prodczacy J.J., Wei R. Reduction of iodonitroterasolium violet by superoxide radicals // Biochem. and Biophys. Res. Comm. 1988. V. 150. P. 12941301.

125. Roby D., Gabelle A., Toppan A. Chitin oligomers as elicitors of chitinase activity in melon plants // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V. 143, N.3. P. 885-882.

126. Rohrig H., Schimdt J., Walden R. et al. Growth of tobacco protoplasts stimulated by synthetic lipo-chitooligosaccharides (LCO) // Science. 1995. V. 269. P. 841-843.

127. Rudiger H. Structure and function of plant lectins. // Glicosciences. Status and perspectives. Eds.: H-J. Gabius, S. Gabius. Wienhein: Chapman & Hall,, 1997. 631 p.

128. Ryals J.A., Neuenschwander U.H., Willits M.G. et al. Systemic acquired resistance. Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1809-1819.

129. Saokyszyn V.M., Thomas C.E., Reif D.W. et al. Release of iron from ferritin and its role on oxygen radicals toxicities // Drug Metab. Rev. 1988. V.19. P. 283-303.

130. Scandalios J.G. Oxygen stress and superoxide dismutases // Plant physiol. 1993.1. V. 101. P. 7-12.

131. Shibuya N., Kaku H., Kushitsu K., Maliarik M.J. Identification of novel high-binding site for N-acetylchitooligosaccharides elicitor in the membrane fraction of suspension-cultured rice cells // FEBS Lett. 1993. V. 329. P.75-78.

132. Schultze M., Kondorosi E., Ratet P. et al. Cell and molecular biology of Rhizobium-plant interactions //Int. Rev. Cytol. 1994. V. 156. P. 1-75.

133. Skoog F.A. Aspects of growth factor interaction in morphogenesis of tobacco tissue cultures. // Les cultures de tissue deplantes. Paris: CNRS. 1971. P. 115.

134. Sutherland M. W. The generation of oxygen radicals during host plant responses to infection // Phisiol Mol Plant Pathol. 1991. V. 9. P. 79-93.

135. Tabary F., Balandreau J., Bourrillon R. Purification of the rice embryo lectin and its binding to nitrogen-fixing bacteria from the rhizosphere of rice // Biochem. And Biophys. Res. Com. 1984. V. 119, N.2. P. 549-555.

136. Tracey M.V. Chitin // In: Moderne Methoden der Pflanzenanlyse. Oxford, New York, 1955. V. 2. S. 264-274.

137. Turner R.H., Lierner I.E. The use of glutaraldehyde-treated erythrocytes for assaying the agglutinating activity of lectins // Anal. Biochem. 1975. V. 68.N.2. P. 651-653.

138. Umekawa H., Kondoh K., Fujinara M., et al. Interaction of Tora-mame (Phaseolus vulgaris) lectin with indole derivatives // Agric. Biol. Chem. 1990. V. 54, N.12. P. 3295-3299.

139. Van den Ackerveken G.F., VanKan J.A., De Wit P.J. Molecular analysis of the avirulence gene avr9 of the fungal tomato pathogen Cladosporium filvum fully supports the gene-for-gene hypothesis // Plant J. 1992. V. 2. P. 359366.

140. Vander P., Varum K.M., Domard A. et al. Comparison of the ability of partially N-Acetilated chitosans and chitooligosaccharides to elicit resistance in wheat leaves // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 1353-1359.

141. Van Parijs J., Broekaert W.F., Goldstein I.J., Peumans W.J. Hevein: an antifungal protein from rubber tree latex // Planta. 1991. V. 182. P. 258264.

142. Vera-Estrella R., Blumwald E., Higgins V.J. Effect of specific elicitors of Cladosporium fulvum on tomato suspension cells // Plant Phisiol. 1992. V. 99. P. 1208-1215.

143. Vretblad P. Purification of lectins by biospecific affinity chromatography // Biochem. etBiophys. Acta. 1976. V. 434, N. 1. P. 169-176.

144. Viard M-P., Sankary F., Milat M-L. et al. Phosphorilated proteins are involved in tobacco cell early responses to cryptogein. See Ref. 40a., 1993. P. 165.

145. Walton J.D. Host-selective Toxins: Agents of Compatibility. // The Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1723-1733.

146. Waldmuller T., Cosio E.G., Grisenbach H., Ebel J. Release of highly elicitor-active glucans by germin zoospores of Phytophthora megasperma f. sp. //Planta. 1992. V. 188. P. 498-505.

147. Webster J. Introduction to Fungi. Cambridge: Cambridge University Press, 1980. P.201-220.

148. Weiner M.L. Adv. Chitin and Chitosan. London, N.-Y.: Elsevier Appl. Sei., 1992. P. 663-670.

149. Weisfeldt M.L., Zweier J.L., Flaherty J.T. Oxigen-derived free radicals and myocardial ischemic injury // Heart Dis. 1988. N. 3. P. 60-72.

150. Wright C.S., Gavalanes F., Peterson D.L. Primary structure of wheat germ agglutinin isolectin. Peptide order deduced from X-ray structure // Biochemistry. 1984. V. 23, N. 2. P. 280-287.122

151. Wu G., Shortt B.J., Lawrence E.B., et al. Activation of host defense mechanisms by elevated production of H2O2 in transgenic plants // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 427-435.

152. Wu G., Shortt B.J., Lawrence E.B., et al. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H202-generating glucose oxidase in transgenic potato plants. // The Plant Cell. 1995. V. 7. P. 1357-1368.

153. Yamada A., Shibuya N., Kodama O., et al. Induction of phytoalexin formation in suspension-cultured rice cells by N-acetyl-chitooligosaccharides // Biosci. Biotch. Biochem. 1993. V. 53, N. 3. P. 405-409.

154. Yong-Woo Cho, Yong-Nam Cho, Sang-Hun Chung, et al. Water-soluble chitin as a wound healing accelerator // Biomaterials. 1999. V. 20. P. 21392145.

155. Zhou F., Zhang Z., Gregersen P.L., et al. Molecular characterization of the oxalateoxidase involved in the response of barley to the powdery mildew fungus // Plant Physiol. 1998. V. 117. P. 33-41.