Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия и импорт ДНК-топоизомеразы типа II Drosophila Melanogaster в хлоропласте трансгенных растений Nicotiana Tabacum

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия и импорт ДНК-топоизомеразы типа II Drosophila Melanogaster в хлоропласте трансгенных растений Nicotiana Tabacum"

АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ , Інститут клітинної біології та генетично! Інженерії

На правах рукопису УДК 577.21+677;152.5

Стороженко , Сергій Володимирович

ЖШРЕСІП ІД ІМПОРТ ДНК-ГОПОІЗОШМЗИ ТИПУ II ШНКОРНіи МЕиШОбАБШ* В ХЛОРОПЛАСТИ ТРАІЮГЕННИХ РОСЛИН НІСОТІАНА ТАВАСІШ.

03.00.25 - "клітинна біологія"

Автореферат дисертації на вдобуття вченого ступеня ' кандидата біологічних наук ’

Київ - 1993

Роботу виконано у відділі митові пології та клітинної інженерії! Інституту клітинної біології та генетичної інженерії АН України.

Науковий керівник - академік АН України Ю.Ю. Глеба

Офіційні опоненти: - доктор біологічних наук С.М. Храпунов

доктор біологічних наук Б.О. Лввенко

Провідна.організація - інститут молекулярної біології та генетики АН Ук-лаїнл • . . "

Захист відбудеться //? 1894 р» о ^¿/ гол на

засіванні спеціалізованої ради IK0t.ta.6l інституту клітинної біології та генетичної інженері І за адресои: £52143, Київ-і4І,

ру/і. Заболотного, І4в.

с

а дисертаціє» ноша ознайомитися в бібліотеці інституту.

Автореферат розіслано “/Я“ ^ 1994 р.

вчений секретар спеціалізованої ради»

канйща* б і «логічнії* наук

Л.В. МалишееД

Актуальність проблеми. ДНК-топоізомеоази - це особлива група Ферментів, які шляхом уведення доохланцюгових (топоізомерази типу II) або одноланцюгових (топоізомерази типу І ) розривів здатні індукувати в молекулах ДНК топологічні переходи, такі як суперс-Ліралізація-релаксація, катинування-декатенування, завузлен-ня-розвузлання. Як правило, такі переходи є результатом розв’язання топологічних проблем, що виникають при всіх природніх процесах клітинного метаболізму ДНК, шо потребують розплетений ланцюгів. Отже, ДНК-топоізомерази беруть, участь у процесах реплікації, транскрипції, транспозиції, рекомбінації та деяких інших (Vosberg, 1985). Крім того, ДНК-топоізомерази самі здатні індукувати незаконну рекомбінацію in vitro та In vivo (Ikeda, 1989). З іншого боку, вони підвищують стабільність геному за допомогою релаксації негативних cynepsMtKie (Wang, 1990). Не дивлячись на те, ШО властивості ДНК-топоізомераз досить добре вивчені In vitro, роль цих ферментів 1n vivo зараз вивчається, і дослідникам ще дуже далеко до повного II розуміння. Це особливо стосується питань участі ДНК-топоізомераз у регуляції експресії генів за допомогою змінення ТОПОЛОГІЇ ДНК.

Тому, отримання трансгенних організмів, в яких експресується додаткова чужирідна топоііомераза, с важливим та актуальним завданням. Порушення балансу топоізонераз може призвести до порушень в експресії генів, ініціації подій незаконної рекомбінації, результатом якої е виникнення лелецій і перебудов у молекулі ДНК. У аа’зку а цим, роеЛМни являють собою модельні системи особливого типу, тону шо крім геному та мітрхондріому, їх клітини містять і Пластон. Основним підходом, який використовують для ^чінення генетичного апарату хлоропластів, є генетична трансформація. Проте, існує ряд проблем, які роблять пряму генетичну трансформацію процедурою надто складною та малоефективною. ’

Не менш важливий, але Простішим та більш ефективним підходом ‘до змінений генетичного апарату Хлоропластів с та1 звана ‘білкова трансформація“ цих органел. ивй метод дозволяє уводити в хлоропласти нб гени, а продукти їх експресії » використанням прирог.ньої системи імпорту білків у хлоропласти. Якщо такими білками будуть ДНК-модифікуючі білки, такі як рестриктази та відповідні їм метм-лаіи, зворотні транскрклтази, рвкомбіназк, ДМК-топоїзомераїм та інші, то можна чекати виникнення змін гвнвпниого апарату хлоропласт і S баз прямої трансформації.

- г -

_ ДНК-топоізомерази с ферменти, які, з точки зору використання їх у ролі чужирідних ДНК-модифікуючих білків, викликають безперечний інтерес завдяки притаманним їм вже згаданим вище властивостям. Отже, отримання трансгенних рослин, які Імпортують у строму хлоропластів ДНК-топоізомеразу XI дрозофіли, е намаганням, з одного боку, використати цей фермент для впливу на генетичну систему хлоропластів, з другого боку, створити модельну систему для вивчення властивостей ДНК-топоІзомераз in vivo.

Крім того, такою модельною системою можуть бути і трансгенні рослини з потужною конститутивною експресією гену чужирідної ДНК-топоізомерази. 0 цьому випадку, фермент, що експресується, буде діяти на генетичну систему ядра.

Мета та зевдання роботи. Метою Шеї роботи Суло вивчення експресії ДНК-топоізомерази типу II дрозофіли в трансгенних рос- ' линах Nicotiana tabacum 1 дослідження імпорту топоізомерази II дрозофіли в строму хлоропластів трансгенних рослин тютюну.

. До конкретних завданнь роботи входило;

1. Розробка та створення конструкції для конститутивної експресії гену ДНК-топоізомерази типу II в клітинах вищих рослин.

2. Розробка та створення конструкції для експресії та імпорту in vivo ДНК-топоізомерази II дрозофіли в строму хлоропластів.

Зі Трансформація рослин тютюну створеними конструкціями та селекція трансгенних рослин. 0

4. Молекулярно-біологічний аналіз селектованих транс-Формантіе з метою доведення їх трансгонності, експресії

уведених конструкцій та Імпорту продукту експресії в хлороплас-™- . ' ■

по трансгенні рослини тютюну, що експресують ген ДНК-топоізомерази типу II дрозофіли під контролем конститутивного промотора. Вперше отримано трансгенні рослини тютюну, що Імпортують ДНК-то-поізомьразу типу її дрозофіли в строму хлоропластів. Вперше поквапно, шо трансгенні рослини тюгюну, які експрісують та імпортують Пнк-топоїзомеразу II дрозофіли в хлоропласти, характеризуються певчими аномаліями в будові квіток.

Розроблено пару універсальних праймерів 1 підібрано умови для ампліфікації за допомогою полімеразної ланцюгової реакції госліпевності 35S промотора вірусу мозаїки цвітної капусти, шо проводити швидкий та високочутливий1аналіз практично

- З -

будь-яких трансгвнних рослин, шо містять у геномі Збв промотор.

- Отримані трансгенні рослини являють собою цікаві модельні системи для вивчення ролі ДНК-топоізомерази II в регуляції експресії Генів, процесів рекомбінації та підтримання стабільності геному, для дослідження різних аспектів імпорту білків у хлоропласти та ядра виших рослин.

Результати роботи використовуються при читанні спецкурсу » молекулярної біології та генетичної інженерії рослин на кафедрі клітинної біології та генетичної інженерії Київської^ університету. '

Апробація роботи. Результати роботи подавались на 6-му Європейському конгресі з біотехнології (Флоренція, червень 1993), на II Російському симпозіумі "Нові напрями біотехнології рослин" (Пушино, Травень 1993), на Конференції з генетики соматичних клітин у культурі (Москва, листопад 1993), 'а також на наукових семінарах відділу цитофізюлогії та клітинної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії АН України.

Структура та об’єм роботи. Дисертація включає 5 себе вступ, -огляд літератури, матеріали та методи« результати та обговорення, закличну Нас Ину, висновки те список літератури, шо містить 280 бібліографічних посилань, 284 з яких іноземні. Роботу викладено на 137 сторінках мішинопйсу, робота вклвчае іб малюнків, серед яких 16 фотографій.

Матеріали Та натояй.

Плазміда рвРе-І, шо Несе ген ЛНК-топоізомврази її ярозоф.яи була люб’язна надана др. Хсієхом (США), рОзвТпаоЗ, шо містить поелідеаніеть транзитнега пептиду гену малої еубодиниш рибуло-зб-і.б-бібфосфаткарбоксилазй гороху, подарована др. 0йН Монтагв (бельгій). '

аля кланувйння вййериетйоува/іи штам Є. соН JMí01. Для Т-ранііФорМіиії рослин брали штаМ А. і:иіг^ае1еп« С58СІ (рНР90). Об'єктом транефорнаїіїї був тєпій N. tabacun вИ-1.

При створенні конструкцій виидристоаували рвстрикта'и та ЙНК-мййи0ікуюЧі фйрненти фірни “Ферментас" (Литва).

визначення первинної структури пнк проводили за методом евн-герй (бапдег вЬ аі., ч?) з використанням Т7-попімврвзй (секвв-на з и і і

Тра«сФооМчііІю рослин провозили зА нвгопом листових аясг.іе

. . • - * -(Йогеch et al., 1965). селекцію трансформантle вели не середовищі

з канаміцином у иониентраиіі 100 - 200 мг/л. .

Наявність продукту експресії гену nptll у трансгенних рослинах -визначали за допомогою відповідних поліклональних антитіл за метолом ELISA з використанням набору NPTII ELISA Kit фірми "5-Pr1me - З-Prime, Inc.“ (США).

• Ампліфікацію DHK ln vitro происіили за допомогою ПНК-амплІ-Фікатора ААГ-66 (НВО "Прогрес“, Україна).

Сумарну рослинну ДНК виділяли ¿в стандартною методико*) (Hurray and Thompson, 1980), сумарну РНК - за методом, що запропонував Кірк (Klrk et al., 1985).

Саузерн- і нозерн-блот-гібридизації вели на нейлонових Фільтрах за Мьтоликою, яку запропонували Чач та Гілберт (Chuchand Gilbert, 1984). Оля зондів Фрагменти ДНК мітили **Р за допомогою набору Random Primed DNA Labelling Kit (“Boehrlnger Mannheim’, ФРН). '

Ядерні та хлоррпластиі білкові екстракти готували за методиками. які викладено у Дрейпера та інш. (1991). Білки фракціонували за допомого» диск-електрофореза у 8Х поліакріламідному гелі в пі ісутності додеиилсульфату натрію (LaemmH, 1970).

Вестерн-блотинг проводили за методикою, яку було описано раніше (Burnette, 1981).

r.

Результати та обговорення.

1. Створення конструкцій для експресії то імпорту ПНК-топоі-зомерази II дрозофіли в хлоропласти тютютну.

Для експресії топоізомерази типу II дрозофіли використовували відповідну кДНК, клоновану у складі плазміди р0Рс-1. За допомогою пакету програм М GENE було побудовано детальну рестрикиї ft-ну карту гену з метою пошуку сайтів,', зручних для клонування. Часткову рестрикційну карту гену показано на мал.іА. єдиним зручним сайом для вирізання'гену с сайт ВатНІ, розташований на 84 нуклеотида нижче стартового АТс.-кодону гену. Цей сайт використовували для вирізання структурної частини гену з боку 5’-кінця та BamHI-саЯт полілінкера г з З'-кіния.

Вищезгаданий ВатНІ-Фрагмент структурного гену клонували у РлшНі-сайті касети експресії PRT103. Цей вектор містить послідовності 35S промотора вірусу мозаїки цвітної капусти та термінатора анскрипиїї того ж вірусу, що розділені поліііінкером з рядом

унікальних сайтів рестрикції. У складі МсоІ-сайту вектор нас стартовий ATG-кодон, оточений консенсусною послідовністю зв’язування малої субчастки еукаріотично'і рибосоми (Kozak, 1986). При клонуеанні Фрагмента гену в ВатНІ-сайтІ вектора рамі<и зчитування , АТС-кодону вектора та гену зпівпадють. Отже, отримана послідовність гібридного білка маг транслюватися із стартового кодону вектора. Отримана іаким чином плазміда pt2t03 містить неповний Ген ДНК-топоізомерази типу XX дрозофіли під контролем J5G промотора вірусу мозаїки цвітної капусти та фланкована на З’-кінці сигналом поліаденілювання того * вірусу.

Для уведення касети експресії а рослину використали бінарний вектор рВіпІЗ (Sevan, 1984), у складі якого по сайту НніаІІІ кло-нували ген з регуляторними елементами, вирізаний j плізміди pt2103 по тому * сайту. Рестрикційну карту плазміди pBim9/t2l03, яку було отримано, зображено на мал,1Б.

Як відомо, для імпорту практично любого білка в стоому хлоропластів необхідна 1 достатня наявність на M-кінці білка специфічного хлоропластного транзитного пептиду. Для конструювання гібридного білка ми використали транзитний пептид гену rbcS-ЗА малої субодиниці рибулозо-1,5-бісфосфаткарбоксилази гороху. Послідовність, що кодує транзитний пептид гену і частиною 5'-нет-ранслеемої області, було вирізано з плазміди p0seTneo2 ivan den Broek at al., 1985) no сайтах Hlndlll та BairM та клоновамо по тих самих сайтах у полілінкері Фагмійного вектора pUCHS.

Структурну частину гену flHK-Топоізомерази II дрозофіли вирізали по сайту Ватні, як і в попередньому випадку. Далі, використовуючи Фрагмент Кланова і 5'- виступаючі кінці фрагмента добудовували до тупих і літували з вектором pChTl, який було оброблено Smal ta лу*но» фосфатазо» з Уммусу теляти, при такому иломувінні рамки зчитування транлиного пвптипу та гену найть ітвпаоати. Для перевірки иьго виділяли однолвйцогоау форму отриманої рвдом-вінантмої Фвгйіой pChti, та місив ї'сйнання ^визитного пвптиау * лоейійооніет» гену секйвнували за методом Свн#*»ра. .

йіій установленим гену гібридного білка пій контроль ,3^3 промотора використали касету експреси рйТІОЬ НА відміну »id к.всвги рЯТЮЗ, у иьйму Bektooi власний стартовий койон війвуТ' й, І б ■Цьому випадку трансляція вувв починатися » Atd-кОвЬну ласліпов-кості, Ud кбйуе гіОриййий білок. 0**<too”p«Ti<5l розвалювали

4 pMkt*j«6 ЁсоПХ, з «і йопоивго« феягнйн** клєйоіі, ^овуй^умлк

(polyllnkor

PUC1B)

Мал.1. A - часткова рвстрикиійна карта вставки плазміои pGFc-І, що містить кДНК топої»омерази типу II ярозофіли., Б -

- рвстрикиїйна карта плазміви p81n19/t2i03. В - рвстрикційна карга плазміди pB1n19/Chtn01. Н*- Hlndlll, Е - EcoRI, 8 * ВагаНІ, К -

Копі, 5h “ fipt'I. БІ - Sail, 9e - S»tl. Мориии по«*<жутмик<?м пок«->e»tc посмаоамст». хлсосплвстмого го»ипит«ого п«пті*ву. .

- 7 - " ' ■ . ..

в'-виступаючі кінці до тупих і обробляли лужно» фосфатазо»?. Послідовність гібридного білка вирізали з ллазміди рсіаг ік> ся(»так НІпсІІИ і 8юаІ та аналогічно добудовували б’-виступаючий кінець до тупого. Потім проводили літування вектора і посцдрвнсісті. гІС~ ридного білка. Отримана в результаті літування плдзміда рСЬ^Юі' містила ген гібридного білка під контролем ЗВЗ промотори., фланкований з З'-кінця послідовністю термінатора вірусу мозац'-і цалтної капусти. ; ' . ' ■

Нарешті, послідовність, іцо кодує гібридний .61 лрк ,• разо« » контролюючими елементами вирізали по сайту. Н1 псі 11' ї ь плаЬкчди1 рС№2101 та клонували по тому ж сайту у складі';'бІнармої о- еміторц рЗІШЗ. Карту плазміди рВ1п19/СЬйгіп( зобрЗжечё.на ¡на\. їв.) '

2. Трансформація рослин ■ - тютюну Плазміди рВІп19/12103 та рВІп19/СИЦі6і мобілі >ог а ни а штам (іГРобактерій за допомогою трибатькіаского зхрещуванмя-. І** «ломів, стійких до канаміцину та ріфампіцину, виділяли-плазміал та перевіряли за допомогою рзстрикиійнбгр аналізу, (дані. >Ге наметні).

Отриманими штамами агробактерій інфікували листові лиски тютюну, Селектували 39 клоню, що стійкі до канаміцину в копионтра-ції 100 - 200 мкг/мл після трансформації рВ1.п19/і2ЮЗ та 53 ~ у

випадку трансформації рЗіп1Э/СИЬ2101. Як позитивний контроль використовували трансформацій за допомого» того ж самого штиму аг-робактерій, шо містить немодифікований вектор рВІп!9.

Із отриманих стійких до канаміцину клонів, регенерували диференційовані рослини та висадкувпли в грунт для культивування та подальшого аналізу. .

3. Докази трансгенності солзнтованих після трансформації рослин титону. 1

Через те що конструкції, Якими трансформували рослини, Містять маркерний ген прИІ, першим етапом аналізу рослин, вкі, як ми припустили, е грансгенними, було визначення & них вмісту продукту експресії гану за.допомогою поліклональниц антитіл. Повільним чином ми відібрали по декілька клонів, триманих після Трансформації конструкціями. Э відібраних клоніа ¿ияіяяли білковий екстракт і проводили реакцій ЄИЗА з яигигі,-аин г>роти неоміиинфосфотрансферази. В результаті виявилося, що усі ї клочів, :як1 отримано після трансформації гВ<Ш9/ї2!0І, та псі і у,•¡пий, ха

отримано після тоансформації pB1n19/Cht2101, містять неоміцинфос-фотрансферазу II, У контрольних нетрансформоааних рослин суттєвої реакції з антитілами виявлено не було. Ill лані свідчать про наявність експресії уволеного гену nptll в усіх лініях рослин, шо проаналізовано.

Оскільки ампліфікація ПНК 1л vitro за допомогою полімеразної ланцюгової реакиїї (ПЛР) с відносно простим І надзвичайно чутливим методом, ми вирішили використати його для аналізу отриманих трансформант Is. Оскільки в наших конструкціях, а Також у більшості Інших генно-Інженерних конструкцій використовують 35S Промотор вірусу мозаїки цвітної капусти, ми вирішили підібрати пару прай-мерів для ампліфікації частини Послідовності промотора. Це дозволяє, по-перше, проаналізувати трансгенні рослини, які отримано' після трансформації як однією, ток 1 іншою конструкціями, з використанням лише однієї пари праймерів, по-друге, ці праймери можна використовувати 1 в усіх інших випадках, якшо уведені гени містять 36S промотор В результаті аналізу послідовності промотора для праймеріо було обрано такі послідовності довжиною в 21 нуклеотид! •

« 5’-TCATTGCGATAAAGGAAAGGC-3' - ПОЗИЦІЇ -372 -393,

, 5’-TTGCGAAGGATAGTGGGATTG-3’ ПОЗИЦІЇ -200 -227 по "+’ - Лан- ' июгу промотора. При такому підборі затравок довжина продукту ампліфікації складає 189 п.н.

Или проведення аналізу з відібраних клонів виділяли сумарну СМК 1 проводили реакцію ампліфікації.

Результати аналізу трансгенних рослин за допомого» ампліфікації показано на мал.2А. Як видно э малинка, у випадку аналізу • трансформантів, отриманих після трансформації конструкціє» рВіп19/Ь2ІОЗ, лише дві (19 1 23) з п'яти проаналізованих'стійких до нанаміиину ліній дають Фрагмент очікуваного розміру після проведений реакції ампліфікації. Відсутня також І ампліфікація В«К контрольної нетрансформованої рослини. Із отриманих результатів можна зробити висновок, що, не диблячись на експресі» гену nptll, три із отриманих ліній не вмішують послідовність 353 промоторе, отже, T-DHK інтегрувала не повністю у склад геному, або випадіння послідовності промотора трапилося після інтеграції в результаті подій незаконної рекомбінації. Очевидно, иі лінії не с особливо цікавими з точки зору мети даної роботи, оскільки еони наперед не експресують уведений ген топоїзомерчзи. Проте, Факт нестабіль-

Б

!І»

З»»

_____5.15

;____4,27

_____3.53

.2.03 -1,90 -1.50 -1.33

Мал.2. Результати електрофоретичного аналізу продуктів ампліфікації ЯНК трансформованих ростім тптвну. А - конструкцією р81п19/£2103, 1,2,3,4,5 - СНК клонів 2,15,19,21,23,'Відповіано, в

- ОНК нетрансформованої рослини; Є - конструкцією рв1п19/СЬі2101,

1 - ЯНК нвтрамсфорноааної1 рослини, 2,3,4,5 - ЯНК клонів 42, 201 , 207, 203, відповідно.

Май.З- Результати Саузврн-бяотммг-гібридизації НіпсІПІ-перо-оару сумарної ПИК яініЛ т»тюну, трансформованих рВ1пі З/СгагіОІ, З посліповніст» хлорелластиого транзитного пептипу. 1 - анк нот-ракс^ормовмої рослими; 2,3,4,5 - лінії 42, 201, 207, 203, відпо-оівно.

'/

12 3 4 3 0

«**• «а» т»

«а®

___4.27

____здз

*_ауса -—сзо

----*,88

____5,її

«Я* | 212

! 5,15

4.27

і __3,53

«Я? =2ЯЗ —1.50

£5

—ДО і—І.ХЗ

мал.4. Блоттині—гібридизація за саузвриом сумарної ОНК ліній тютюну, які отримано після тргис^ормаміі раїшз/ггіоз, з 4,7т.п.н. ВатНі-ч>рагмвнтом гему ШК-топоізомвразсі II дрозофіли. А

- ПНК обробляли рвстриктазо» їИтгіЦЇІ. і - ОЙК трансформованої рослини, 2,3,4,5,в - ОНК ліній 2,15,21,19,23, вІатюв 1 ямо. Стрілко» позначено 5,5 т.п.н. фрагмент, «о «Істяп перенесений ген а регуляторними елементами. Б - ЯНК обробляли р«стр»жтвзою ЄевЯІ. 1

- ПНК нетрансформованої рослини, 2,3,4,5,в - лінії 2,15,13.21,23, відповідно. Стрілками позначено 3,2г.п.н. і 2,1т.л.и 9р*т*мт*і уведеного гену.

. - 10 -пості чужирідних генів у складі геному потребує особливого вивчення. Оскільки, в нашону випадку в рослини уводився ген, експресія якого може впливати на процеси рекомбінації, то можна припустити, що експресія уведеного чужирідного гену топоізомарози II ноже призводити до нестабільності самого гену у складі геномної ДНК. -

У випадку аналізу рослин, отриманих внаслідок.трансформації плазмідою рВІп19/СГа2101, геномна ЛНК усіх чотирьох клонів містить шукану послідовність 353 промотора (мал.25)

Для того шоб перевірити, чи містять отримані трансформанти повнорозмірн^й ген топоізомерази, проводили блотинг-гібридизацію виділеної з них сумарної ДНК з специфічними зондами.

Сумарну рослинну ДНК трансформантіа рВІп|9А2103 розщеплювали рестриктазою НіпйІІІ, фракціонували електрофорезом у агарозному гелі, переносили на нейлонові Фільтри та гібридизували з міченим 4,7 т.п. н. ВагеНІ-фрагментом плазміди рвЯс-!, що містить структурний ген топоізомерази. Результати блотинг-гібридиіації за Саузерном наведені на мал.4А. Цікаво відзначити, що у всіх п'яти клонах присутній гібридизаційний сигнал, шо відпооід&є фрагменту розміром приблизно б т.п.н., цо стосується і контрольної нетране-Формованої рослини. Ми припустили, шо даний сигнал с результатом Гібридизації зонду з власним геном рослинної ДНК-топоізомерази типу 1!, тому що, як відомо, всі клоноаані гени топоізомораз типу

II відзначаються значним сіупенам гомології (Иааз, 1987)> Два клони - 19 1 23 , проте, містять палаткову смугу гібридизації, що відповідає фрагменту необхідної довжини - 6,6 т.п.н. Для того щоб переконатися, що ця смуга дійсно відповідає шуканому фрагменту, рослинну ДНК розщеплювали рестрнктазоп ЕсойІ та піддавали гібридизації в аналогічних укооах (мал.45). На доріжках, цю відповідають 23 і 19 клонам видно фрагменти розмірам« 3,2 т.п.н. те 2,1 т.п.н., які с наслідком розщеплення уведеного гону ростриктазою Есойї. а інших клонах і контролі дані сигнали відсутні. Відсутність сигналів свідчить про повна випадіння гену топоізомерази, який уводили, разом » регуляторними елементами. Ш бані повністю відповідають результатам ПАР-аналізу. ' і в цьому випадку, на всіх поріжках видно сигнали, «¡о еіеповідавть власній рослинній послідовності, яка гібридизується а зондом.

Для аналізу рослин, отриманих в результаті трансформації конструкції-« рВІп19/СпїгіОІ, сумарну ДНК, іио йІЩляли з иих лі-

- 11 - . ній, розщеплювали ендонуклеазою рестрикції Ніпйііг, фракціонували за допомого» електрофорезу о 0,7* агарові, переносили иа Фільтри 1 гібридизували з міненим зондом. В данному випадку, як зонд використовували фрагмент 300 л.н., вирізаний з пяазміди рсигі, який містить послідовність транзитного поптиду. Результати гібридизації подані на мал.З. На доріжках, які відповідають ЛЯК трансген-них ліній, видно чіткі смуги необхідного розміру <5,8т.п.н.), в той же час як у контролі сигнал відсутній. Отриманий результат підтверджує трансгенну природу отриманих рослин, причому ген, ио уводили, не зазнав ніяких перебудов 1 делоцій під час або після трансформації.

4. Аналіз експресії уведених генів.

Для вивчення експресії на рівні транскрипції, з 19 1 23 клонів (конструкція рВ1п19/ї2103), що містять ген топоізомерази її дрозофіли під контролем 35в промотора, виділяли сумарну РНК. РНК потім розділяли за допомогою електрофорезу в агарозі в денатуруючих умовах, переносили на Фільтри і гібридизували з тим самим зондом, ио 1 у випадку блотииг-гібридизації за Саузерном. Результати нозерн-блотинга показані на мал.5А. Гібридизаційні сигнали • на доріжках, шо відповідають 19 и 23 клонам, по розміру відповідають очікуваному розміру мРНК - 4,7 т.н. РНК нетрансформованої рослини з зондом но гібридизується.

У зз’зку з цим доречно розглянути вищезгаданий факт, що стосується геномної послідовності, яка гібридизується з зондом. Якшо припустити, що ця послідовність є власним геном ДНК-топоІзомерази типу II, то в результаті його експресії маЬ існувати відповідна мРНК. ия РНК буде гібридизуватися з зондом краще, ніж ДНК, внаслідок більшої стабільності РНК-ДНК гібридів. В нашому випадку така гібридизація не спостерігається, що може відбуватися завдяки або дуже низькому рівню експресії, або взагалі відсутності такої. Можна припустити, що ген експресується на дуже низькому рівні, хоча, така слабка експресія здається малоімовірною. Крім того, виявлена послідовність може бути псевдогеном. У будь-якому випадку, наведений Факт здасться'цікавим і, на наш погляд, потребує більші детального вивчення. >

Аналогічний аналіз проводили і з лініями, отриманими після трансформації конструкціє» рВ1п19/СЬІ2101. Як зонд використовували той самий 4,7 т.п.н. Вамні-фрагмонт гену. Результати гібриди-

12 3 .12 3 4 8

—19

'____І.»

Мал.5. Результати нозерм-Слотинг-гібридизашV сумарної РНК траисгвнмих ліній тютютну, » 4,7т.п.н. ВагоНІ-фрагментом гену

їор2. А - трансформація рв1п19А2103, 1 - РНК нетрансформованої

рослини; 2,3 - РНК ліній 19,23, відповідно. 6 - трансформація

рВ1гИ9/СЬЬ2і(Н. 1 - РНК метраисформоваиої рослини; 2,3,4,5 - РНК

ЛініЛ 42, 201,207,206, ВІДПОВІДНО.

■ 2 3 .-2 *

: і Мл ^ '______212

••> 1 т- >

—**2 їі. і.

• — ’ •& • <.___па

.•■Л;____*»в . .ц; '—-974

> B7.it ■ "• ____66.2,

. ; —66,2 '.і.. ' ______________________________________________57л

515 , .■■■■._ . !Ч • ^

ЯУ '-пЧія 40(0 •

■■ .■; і &

- ' , ■’ V

. Нал. в. Результати імуно-блотингу війкових Екстрактів транс» гвнних рослин тютюну а поліклокальними антитілами лрьти ОНК-топо-иомврази типу ЇХ лрозофіАи. А - ямрні екстракти трансфорнантів рВІпі9/Ч2103. 1 - нотрансформодеиа рослина; 2.3 - 19 1 23 клони,

відповідно. б - хпоропластні акстракти траисфориаитіь Рвіпі9/спг2101. 1,2 -клон 201 і 207» віпповівно! [ і - 19 клон (трансформацій р8Іні9/«ЮЗ); 4 - натранефорноаана «ослина.

. - ІЗ - ,

зації показані намал.бБ. Тільки дві лінії - 201 и 207 експресу-ють уееаений ген, юо виявляється в появі смуги гіСрилизаиН розміром 6,0 т^м., яка віаповіоає поанорозмірній мРНХ. У двох інших лініях експресія практично не виявляється, принаймні, на рівні чутливості метову.

Останнім етапом аналізу експресії уведеного чужирідного гену с ідентифікація війкового продукту експресії. Пля цього вуло використано метод імуновлотингу.

З 19 1 23 клонів (pB1n19/t2103) виділяли ядра, лізували їх,

1 ядерний вілкоаий екстракт фракціонували за допомого» денатуруючого виек-електрофорезу в поліакріламіяному гелі. Потім, білки переносили на нітроцелюлозні фільтри та обробляли препаратом по-ліклональних антитіл кроля проти ЛНК-топоізомерази типу II дрозофіли. Для детекції комплексів антиген-антитіло використовували другі антитіла Проти іммуноглобулінів кроля, шо коні+зговані з пе~ роксидазою хріну. Результати аналізу показані на мал.бА. На всіх трьох доріжках видно цілком ідентичні смуги, серед цих смуг присутня 1 смуга з молекулярною масою порядку 100 кПа, шо відпоьідає молекулярній масі чужирідної топоізомерази, яка експресується. Така смуга с і на доріжці, іцо відповідає ядерним білкам контрольної нетрансформовано!'рослини. імовірно, шо ця смуга єрезульта-том зв’язування антитіл з власною ПНК-топоізомеразою II тютюну. В цьому випадку, не виявляється можливим відрізнити власний Фермент від чужирідного 1 необхідно скористатися іншим методом фракціонування білків, наприклад, методом двомірного електрофорезу. Отриманий результат можна пояснити 1 тим, шо уведений ген не транслюється, або продукт трансляції не потрапляє в1ядро. Оскільки, вектор рПТІОЗ, на основі якого зроблено конструкцію, оптимізовано для трансляції, а тваринні сигнали для імпорту в ядро спрацьовують у рослинах, то ми оважаємо більш імовірним наше перше припущення про близькість молекулярних мас чужирідного та власного ферментів.

Достатньо »итенсивні смуги з більш низькою молекулярною масою, скоріше за все, є результатом неспецифічної реакції антитіл з рослинними білками. ••

Для перевірки, чи імпортується ДНК-топоізомераза II дрозофіли в хлоропласти трансгенних рослин тютюну, отриманих після трансформації pBln19/Cht2101, із листків клонів 201 1 207 виділяли хлоропласти, обробляли їх трипсином, потім лізували. Отриманий

білковий екстракт піддавали вестерн-блот-аналізу в тих самих умовах, як і у випадку з трансформантами peinl9/t2lO^. Результати вестерн-блотингу показано на кал.бБ. На доріжках, що відповідають фракціонованим хлоропластним білкам трансгенних клонів видно смуг" масою порядку 160 кАа, які відповідають ПНК-топоізомеразі IX дрозофіли. У хлоропластних білкових лізатах контрольної нетранс-Формованої рослини та 23 клону (pBin19/t2103) такі відсутні. Отриманий результат однозначно говорить про те, що уведений химерний гой не тільки експресується, але продукт експресії імпортується в хлоропл.літи. Попередня обробка хлоропластів трипси»ом повністю виключає можливість зв’язування попередника а рецептором зовнішньої мембрани без наступного імпорту всередину хлоропласта»

, S. Фенотип отриманих трансгенних рослин. '

Фенотип трансгенних рослин вивчався після висаджування їх у грунт на протязі всього періоду вегетації. Як після трансформації конструкцією pBin19/t2l03, так і після трансформації рвілі9, ;ht2l0l трансгенгіі рослини Мали Фенотип, який нічим не відрізнявся від Фенотипу вихідних рослин« Проте, цвітіння транс-Формантів pB1nt9/t2103 настало приблизно на місяць пізніше, у по-* рівнянні з контрольними рослинами і трансформантами pBintQ. крім того, квітки трансформантів pBinl9/t2103 мали злегка деформовані пелюстки та вкорочену маточку, було в логічним зв’язати ці фототипічні зміни з експресією уведеного гену топоізомерпзм, Але ДЛЯ цього необхідно перевірити успадкування цих взнай, во на вховйть в мету цієї роботи. ■

Ніякіх аномальних векш у розвитку ta ueiflfml росдйн-транс-Формантів paini9/Cht2l0l т не вийьмли. Проте» деякі квітки »¡донів 201 і 207 моли са?вктні тичинки, у котрих з Пйляка розейга» лася,пелюстка. Кількість таких тМчинеА у к&ітці екяаваю еіа 1 Об

з. і квіток із 26-ми ке і t ол клону 201 иаяй таку ознаку і S iS 31-ої квітки клону 407 ійко* иедм с&Фектмі тйчинКй. У коєної & 62 квіток контрольної нетрансформоеанної рослини, 37 квіток ТрансФорманту p&fntft» Є7 квіток клонів-трансфориайїіа pBtrt19/t21Ö3 такі структури н» виникали.. Хоче приведені дані йа е статистично достовірним*^ можна стверджувати, що e^+икмеимй йефбкТйих тичинок якимось чином пов'йзано і iMrtötJtOfi чу*иріпнвї іМК-топоізоНеразН'

II у хлороплайі-йі

- 15 -

^ ВИСНОВКИ* J

.. 1. На основі вектора р81п19 створено конструкцію для експресії ДНК-топоізомерази типу XI дрозофіли в клітинах рослин, що

містить структурний ген ферменту під контролем 35S промотора вірусу мозаїки цвітної капусти. . "

. 2. На основі вектра рВіп19 з використанням послідовності

хлоропластного транзит зго пептиду малої субояиниці риб, ло-Э0-1,5-бісфосфаткарбоксилази гороху створено конструкцій для експресії та імпорту ПНК-топоізомерази II дрозофіли в хлоропласти виших рослин. •

3. Отримано трансгенні рослини Nlcot-fana tabacum, що експре-сують ЯНК-топоізомеразу II дрозофіли. Експресію уведеного гену доведено на рівні транскрипції. Квітки трансгенних рослин характеризуються деякими фенотипічними відмінностями вія таких у контрольних нетрансформованих рослин.

4. Отримано трансгенні рослини тютюну, що імпортують ЯНК-то-поізомеразу типу II дрозофіли о хлоропласти. Експресію химерного гену показано на рівні транскрипції, білковий продукт ідентифіковано в хлоропластах трансгенних рослин.

5. імпорт топоізомерази II дрозофіли в хлоропласти тютюну • пов’язаний з виникненням аномалій у розвитку тичинок квіток трансгенйх рослин.

6. У геномі Nicotlana tabacum виявлено послідовність, шо

гібридизується з геном ПНК-топоізомерази типу II ЛРОЗОфіЛИ. Ця ПОСЛІДОВНІСТЬ, можливо, є геном або псевдогеном рослинної ДНК-ТО-поізомерази типу II. .

7. Разроблено умови та підібрано пару зручних праймерів яля ампліфікації in vitro послідовності 35S промотора вірусу мозаїки цвітної капусти, шо дозволяє проводити швидкий і високочутливий скринінг трансгенних рослин, які трансформовано будь-якою конструкцією! з 3SS промотором..

Список робіт, що опубліковано'по темі дисертації.

1. Стороженко C.B., Шиша E.H., і леба й.Ю. Траисфсрмаїия рослин Nlcotiana tabacum геном ПНК-топоізомерази it., типу Drosophila malanogastor // Біополімери 1 к; тина.-1993.-9, И 1.-C.82-87.

2. Стороженко C.B. Аналіз трансгенних рослин за допомогою ПЛР: пара універсальних праймерів для ампіфікації послідовності

35S промотора П Біополімери і клітина.-1994.-10, N 1.-C.65-68.

. 3. Стороженко C.В., Шиша Є.Н., Глеба В.Ю. Получение и анализ

трансгенных растений Nlcotlana tabacua, экспрессирующих ген днк-топоиэомеразы II типа Droaophila melanogaeter // II РоссиАс-кий симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Тез. докл.(Пущино, 1993г),-Пущино, 1983.-С.63. .

4. Стороженко С.В., Шиша E.H., Глеба U.U. Io vivo импорт ДНК-топоиэомеразы II типа DroeopMla melanogaster а хлоропласти Nlcotlana tabacum // Конференция по генетике соматических клеток в культуре. Тез. і жл. (Черноголовка, 1993).- Москва, 1993,- С.73.

5. Стороженко С.В., Шиша Е.Н., Глеба №.О. Импорт ДНК-Топои-'

зомераэы II' типа Drosophila melanogaatsr в хлоропласты трамсген-ных растений Nlcotlana tabacum // Цитология и генетика.-1994.-гв, N3.-(b печати). . '

в. Storozhenko 8.V., Shieha E.N.. Rudenko Ü.N., Oleba Yu.Yu. Transformation' of plant Nlcotlana tabacua with a eene codtng for DNA topoieomeraee II type from Drosophila «elanogaeter // 6-th Europeat Congress on Biotechnology. Abstract booke (Florence, l993).-F1orence, 1993.-IV.-P.»79.