Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.)
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.)"
На правах рукописи
■У4-1""
МАРЕНКОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИСЛАВОВНА
ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ У ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА (МсоЫапа шЬасит Ь.)
Генетика - 03.00.15
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск 2005
Работа выполнена в лаборатории гетерозиса растений Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.
Научный руководитель: доктор биологических наук
Елена Викторовна Дейнеко Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Илья Кузьмич Захаров Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
доктор биологических наук Ирина Васильевна Голденкова Институт обшей генетики им. Н.И. Вавилова, г. Москва
Ведущее учреждение: Саикт-Петербурский государственный университет
Защита состоится 25 мая 2005 г. на утреннем заседании Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011 01) при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу 630090, г Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10.
Факс: (3832) 33-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.
Автореферат разослан /9 апреля 2005 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета | _ —— ^ _
доктор биологических наук ----с А.Д. Груздев
Введение
Актуальность темы. Бурное развитие генетической инженерии и биотехноло-ши, разработка методов переноса генетического материала в растительную клетку позволило модифицировать геном многих видов растений. Трансгенные растения представляют собой яркий пример преодолении физических, эволюционных и генетических барьеров, которые изолируют геномы различных организмов (Miki, McHugh, 2004). К настоящему времени накоплены экспериментальные данные о нестабильности экспрессии чужеродной генетической информации в растительном 1еноме, связанные, главным образом, с инактивацией и изменениями в экспрессии гетерологичных генов CFlaveL 1994; Matzke, Matzke, 1995; Matzke et al, 2000). На трансгенных растениях табака, риса и Arabtdopsis thahana получены модельные линии, позволяющие изучать данный феномен (Kilby et al., 1992; Matzke et al, 1994a; Voucheret et a!., 1994; Davies et al, 1997; Mittelsten Shejd et al, 1998; Fu et al.,
2000). Матцке с соавт на трансгенном табаке исследовали свойства и структуру трансгенного H локуса, который включает серию аллелей Аллели со сложной структурой Г-ДНК (с дупликациями, векторными последовательностями) способны вызывать процесс транс-инактивации других чужеродных генов под управлением NOS промотора в геноме гибридов (Matzke et al, 1989, 1994а; Jakowitsch et al, 1999). Достаточно хорошо исследован мультикопийный локус 271, способный вызывать замолкание экспрессии трансгенов, находящихся под управлением 35S промотора ВМЦК у трансгенных растений табака (Vaucheret et al, 1994; Park et al,
1996). Именно на трансгенных растениях петунии и томата в 1990 году впервые был описан феномен косупрессии - координированного подавления экспрессии трансгенов и гомологичных им хозяйских генов, связанного с посттранскрипционным разрушением мРНК в цитоплазме (Napoli et al., 1990; Van der Krol et al., 1990; Smith et al, 1990). Данное явление в настоящее время обнаружено у нематоды Caenorhabditis elegans (Fire et al, 1998), Drosophila melanogaster (Misquitta et al., 1999; Pal-Bhadra et al, 2002), Trypanosome brucei (Ngo et al, 1998), Paramecium (Ruiz et al, 1998), млекопитающих (Wianny et al, 2000) и получило название РНК интерференция.
Сходный феномен инактивации множественных копий генов в ядерном геноме в настоящее время активно исследуется у низших грибов Nenrnspnra crassa (Selker,
1997), Ascoholus immenus (Rhounim et al, 1992), ('oprmus cmereus (Freedman, Puk-kila, 1993), Magnoporte grisea (Ikeda et al, 2002) и Podoipora anserine (Graia et al,
2001). Показано, что интеграция множественных тандемных копий гена white в геном Drosophtla melanogaster приводила к нарушению стабильности экспрессии трансгена, что проявлялось либо как мозаицизм, либо как отсутствие ожидаемого фенотипа (Dorer, Henikoff, 1997) Авторами была установлена отрицательная корреляция между числом встроенных копий трансгена и стабильностью его экспрессии. Взаимосвязь между числом копий гена и уровнем его экспрессии обнаружена и для ряда собственных растительных генов (Todd, Vodkin, 1996; Luff et al, 1999). Так ген patl-pai4 A thahana линии Wassilewskija, организованный в виде инвертированного повтора, подавляет экспрессию трех гомологичных однокопийных генов pail, pai2, pat3 линии Colombia при объединении их в геноме гибридов (Luff et al,
1999).
Таким образом, в связи с интенсивным развитием генетической инженерии и биотехнологии растений проблема инактивации экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях представляется весьма актуальной Важность данных исследований очевидна, так как усилия многих исследователей по реконструкции генома растений могут не привести к желаемым результатам. Исследования феномена инактивации экспрессии чужеродных генов в геноме трансгенных растений вносят существенный вклад и в решение фундаментальных задач - выявлены новые механизмы регуляции экспрессии растительных генов и устойчивости к вирусам, ТЭ, основанных на гомологии нуклеотидной последовательности (Fagard, Vaucheret, 2001; Vance, Vaucheret, 2001; Matzke, Matzke, 2004). Однако, несмотря на очевидный прогресс данного научного направления, остается еще много неясных вопросов. Поэтому изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансформантов и их потомков, у гибридов от различных видов скрещиваний, получение новых модельных систем на трансгенных растениях представляется чрезвычайно актуальным.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L) в поколениях от самоопыления и гибридах от различных типов скрещиваний Для достижения поставленной дели было необходимо решить следующие задачи:
1. Провести гибридологический анализ стабильности экспрессии маркерного гена nptll у трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК в ядерном геноме.
2 Проанализировать стабильность наследования гена nptll у трансгенных растений табака с множественными событиями интеграции Т-ДНК.
3. Выделить модельные линии трансгенных растений табака, содержащих в составе области Т-ДНК прямые или инвертированные повторы гена uidA, с нестабильным характером экспрессии маркерных генов.
4. Провести гибридологический анализ наследования мозаичного характера проявления экспрессии гена nptll в трансгенных растениях габака модельной линии Nu 21.
Научная новизна и практическая ценность. Для изучения наследования и стабильности экспрессии чужеродных генов были выделены модельные линии трансгенных растений табака' 1) грансгенные растения с одиночными и множественными вставками Т-ДНК; 2) трансформанты, имеющие в геноме Т-ДНК инсер-цшо с дупликацией гена uidA и одной копией гена nptll; 3) трансгенное растение табака Nu 21 с мозаичным характером проявления экспрессии маркерного гена nptll В исследовании представлены различные варианты организации инсерций Т-ДНК, при этом, использование маркерных генов позволило на больших выборках проследить особенности их наследования в поколениях и гибридах трансгенных растений. Проведен гибридологический анализ характера наследования маркерного гена nptll в поколениях от самоопыления исходных трансформантов, а так же гибридов от различных видов скрещиваний. Установлено, что частота инактивации гомологичных трансгенов существенно возрастает в геноме гибридных растений. Впервые показано, что наличие дупликации гена uidA в составе Т-ДНК ипсерции оказывает существенное влияние на стабильность экспрессии рядом расположенного другого маркерного гена nptll, при этом инактивированное состояние по гену
uidA влияло на стабильноегъ экспрессии гена ^¿//преимущественно в гемизиготе. Впервые проведен гибридологический анализ наследования мозаичного характера экспрессии маркерного гена nptll у потомков (Т1-Т4) и гибридов от скрещиваний с диким типом трансгенных растений табака. Отобраны гибридные комбинации и потомки от самоопыления, представляющие несомненный интерес для дальнейшего более детального изучения молекулярно-i енетических механизмов инактивации экспрессии трансгенов.
Апробация работы Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах' международной конференции, посвященной памяти академика А. А. Баева (Москва, 1996 г.); German-Russian Cooperation in Biotechnology. Workshop IV (Russia, St -Peterburg, 1996 г); международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997 г.); международной конференции «Новые направления биотехнологии» (Москва, 1998 г.); International Congress «Plant Biotechnology and in vitro biology in the 21st century» (Jerusalem, Israel, 1998 г.); всероссийском симпозиуме «Изучение генома и генетическая трансформация растений» (Иркутск, 1999 г.); II съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000 г.); конференции молодых ученых, посвященной 100-летию со дня рождения М.А. Лаврентьева (Новосибирск, 2000 г.); международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва-Минск, 2001 г.); 1-м международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002 г.); 8-й международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003 i.); HI съезде ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004 г); международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004 г.); а также в качестве устных докладов на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН (2001, 2004 гг ).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (276 наименований). Работа изложена на 172 страницах, включает 29 рисунков и 26 габлиц в тексте диссертационной работы.
По теме диссертации опубликовано 7 работ в российских и международных рецензируемых журналах.
Материалы и методы
Исходным материалом для проведения исследований послужили трансгенные растения табака, полученные на основе линии SRI Nicotiana tabacum L. (семена любезно предоставлены доктором Р. Менделем, Институт генетики и растительных ресурсов (IPR), Гатерслебен, Германия). Трансформанты получали методом агро-бактериальной трансформации листовых дисков по стандартной методике (Дрей-пер и др., 1991) с использованием штамма A tumefaciens С58С1 Rif* (PGV 2260) (Deblaere et al, 1987) (штамм был предоставлен д б.н. М.И. Ривкиным). Для гране-формации табака были использованы различные типы генетических конструкций, сконструированных в секторе генной инженерии растений ИЦиГ СО РАН д.б.н. М И Ривкиным, к.б.н. А В Кочетовым, к б.н. М.В Пилюгиным, Е А. Трифоновой, В В. Лукашевой (1991-1995 гг.). Растения под номерами Nu 41, Nu 44, Nu 45, Nu
48, № 49, Ки 411, 43, 44, 45, 410, 412, 78, 714, Ыи 21 были выделены из популяции трансгенных растений табака, полученных ранее (Дейнеко и др., 1999)
Исходные трансгенные растения были обозначены как То (траисформант), растения, полученные от самоопыления исходного трансформанта, соответственно обозначены Т| (первое поколение), Т2 (второе поколение) и т д.
Исследовали стабильность экспрессии маркерного гена пргЯ (обеспечивающего устойчивость трансформантов к антибиотику канамицину) и репортерного гена шс1А (кодирующего фермент р-глюкуронидазу). Стабильность экспрессии гена прШ оценивалась по соотношению канамицин-устойчивых (Кпт4) и канамицин-неустойчивых (Кт~) потомков на среде с добавлением антибиотика канамицина (200 мг/л). Стабильная экспрессия трансгена проявлялась в наследовании согласно законам Менделя как доминантной мутации при полном доминировании У растений с нестабильной экспрессией анализируемого гена в поколениях наблюдали отклонения от менделевского расщепления, мозаичносгь в проявлении Ктп-устойчивого фенотипа на уровне соматических тканей (чередование белых и зеленых секторов на листьях) и полную потерю устойчивости к антибиотику. Соответствие фактического расщепления теоретическому оценивали по критерию достоверность рагшчий между группами от скрещиваний растений Т| по стабильности экспрессии гена пр!11 оценивали по формуле Фишера (Урбах, 1964).
Скрещивание трансгенных растений проводили в 2-3 повторностях для одного и того же варианта с предварительным удалением пыльников и изоляцией цветков на материнском растении. В ходе гибридологического анализа моноинсерционных трансгенных растений № 41, N1144, № 45, № 48, № 49, №411 были проанализированы первое и второе поколения от самоопыления исходных трансформантов и гибриды Б], Рг от скрещиваний гомозиготных по трансгену растений Т]. При анализе стабильности экспрессии гена прШ у трансгенных растений табака с множественными инсерциями Т-ДНК (под номерами 43, 44, 45, 410, 412, 78, 714) было проанализировано первое и второе поколения от самоопыления и гибриды от скрещивания потомков Т| между собой по циклической схеме Для гибридологического анализа стабильности экспрессии гена прО! у трансгенных растений с уникальными и повторенными последовательностями гена иШ (в прямой и обратной ориентацией) в структуре Т-ДНК были проанализированы первое и второе поколения от самоопыления исходных трансформантов и были выполнены следующие типы скрещиваний: с нетрансгенным табаком; скрещивания исходных трансформантов между собой и скрещивания растений первого поколения Были выполнены три варианта гибридизации исходных трансформантов- 1) скрещивания между собой контрольных растений табака с одной копией гена ии1А (121 х 121), 2) скрещивания между собой растений с прямой дупликацией гена иШ (16 * 16), 3) скрещивания между контрольными растениями и растениями с дупликацией (16 * 121) Для проведения скрещиваний гемизиготных и гомозиготных по трансгену растений первого поколения были отобраны потомки трансформантов 16.40, 16.53 и 121.94. Ген мШ в трех типах инсерций был обозначен как А, В и С Трансген в гемизиготном состоянии, например у потомков 16 40, обозначен А*а (звездочкой помечено инактивированное состояние трансгена), в гомозиготном - А*А*. Ил-серция Т-ДНК с дупликацией гена мШ в растениях Т, 16.40 - А*аЪЬсс, в потомках Т] растения 16 53 - ааВЬсс, инсерция в контрольных растениях Т; 121 94 с одной копией гена шйЛ - аяЬЬСс Гибридологический анализ наследования фенотипа мозаичной экспрессии маркерного гена прШ у трансгенных растений модельной
включал анализ первого, второго, третьего и четвертого поколений от самоопыления исходного трансгенного растения и гибридов Fi от анализирующего прямого и обратного скрещиваний растений первого и второго поколений с нетрансгенными растениями табака.
Определение активности фермента NPT1I в экстрактах из листьев табака проводилось по стандартной методике (Herrera-Estrella el al., 1988). Флуориметрическое определение активности p-глюкуронидазы проводилось по методике (Дрейпер и др., 1991) Выделение геномной ДНК из листьев табака проводилось с помощью ЦТАБ-буфера (Rogers, Bendich, 1985). Саузерн блот-гибридизация ЕсоШ и HináWl-гидролизатов ДНК трансгенных растений проводили на нейлоновых фильтрах f («Hybond-N+», «Amersham», Англия) по методу Саузерна с модификациями
(Дрейпер и corp., 1991). В качестве зонда использовали ПЦР продукт на последовательность гена nptll. Выделение тотальной РНК из листьев табака осуществлялось по стандартному протоколу (Nagy et al., 1988) с использованием растворов, обработанных ОД % диэтилпирокарбонатом. Точечный нозерн-блотгинг проводили но (Дрейпер и др., 1991) В качестве зонда использовали ПЦР продукт на последовательность гена uidA. Мечение ДНК (a-32P)dATP («Amersham», Англия) проводили согласно инструкции производителя набора «Мечение ДНК (рендомпрайм)» фирмы «Силекс М» (г. Москва).
Для подтверждения наличия прямого тандемного повтора гена uidA в структуре Т-ДНК у трансгенных растений был использован метод ПЦР. Использовали прай-меры на ген uidA. Праймеры были подобраны к.б.н. M.JI. Филипенко (ИХБиФМ СО РАН).
Результаты и обсуждение
1. Стабильность экспрессии маркерного гена nptll у гибридов от скрещивания трансгенных растений табака с одной и множественными инсерциями Т-ДНК
Известно, что одним из условий инактивации трансгенов является наличие множественных инсерций в геноме трансгенного растения. Проанализирована стабильность экспрессии маркерного гена nptll у гибридов от скрещивания между собой растений первого поколения (ТО от самоопыления двух случайных выборок исходных трансформантов с одной (шесть растений) и множественными инсерциями Т-ДНК (семь растений).
Показано, что в Ti и T¡ поколениях от самоопыления исходных трансформантов в обеих выборках выявлялась стабильная экспрессия маркерного гена nptll. При гибридизации между собой растений Tj с несколькими чужеродными инсерциями отклонения от менделевского расщепления, вызванные инактивацией маркерного гена, выявлялись уже в Fi в 14,3 % случаев (из 42 прямых и обратных скрещиваний). При скрещиваниях гомозиготных моноинсерционных растений табака Ti отклонения от ожидаемого дигибриднош расщепления отмечались только в F2 в девяти гибридных комбинациях (в 18 % из 50 прямых и обратных скрещиваний). Данные гибридологического анализа для нескольких гибридных вариантов трансгенных растений с одной инсерцией Т-ДНК были подтверждены Саузерн блот-гибридизацией геномных ДНК (рис. 1). Таким образом, не зависимо от числа встроенных Т-ДНК, проведение скрещиваний трансгенных растений может увеличивать вероятность нарушений стабильности экспрессии перенесенных генов у гибридов. Эти данные важно учитывать при селекционной доработке трансгенных растений.
Рис 1. Саузерн блот-гибридизация ЕсоК\-гидролизатов геномной ДНК из листьев трансгенных растений Т] и гибридов Р). 1-4 растения Т1 Nu 49, N11 44, N1145, N11411; 5-7 гибриды Р1 Ии 45 х Ш 411(2), № 44 х N1149(1), Ни 49 х N1144(1)
2. Влияние наличия дупликации в структуре Т-ДНК на стабильность экспрессии маркерных генов nptIJ и uidA в трансгенных растениях табака
Известно, что процесс инактивации экспрессии перенесенных генов может затрагивать как один (Meza et al, 2001; Kohli et al, 1999), так и все гены, расположенные в области чужеродной инсерции (Gong et al, 2002; Sallaud et al, 2003) Частота инактивации может существенно возрастать, если в состав генетической конструкции включены тандемные копии генов, как в прямой, так и в обратной ориентации (Wang, Waterhouse, 2000; Ma, Mitra, 2002) Поэтому в задачу исследования входило проследить влияние наличия дуплицированных фрагментов в структуре Т-ДНК на стабильность экспрессии двух маркерных генов- uidA и nptll, как у исходных трансформантов, так и у потомков от самоопыления и гибридов от различных типов скрещиваний трансгенных растений табака.
2.1. Сравнительный анализ стабильности экспрессии гена nptll в первом и втором поколениях от самоопыления трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и с дупликациями данного гена в составе Т-области)
Результаты по анализу первого поколения от самоопыления трех групп независимо полученных трансформантов представлены в табл. 1. Были выделены два варианта экспрессии маркерного гена: стабильный и нестабильный Существенное снижение доли стабильной экспрессии маркерного гена nptll до 20 % в первом поколении происходило только у трансгенных растений с обратной дупликацией гена uidA Это было связано с достоверным, по сравнению с контролем, увеличением до 61,3 % числа трансформантов, у которых в первом поколении с различной частотой выявлялись потомки-мозаики по экспрессии гена nptll. Для растений с прямым тандемным повтором достоверных отличий с контрольной группой растений выявлено не было. Поэтому представляло интерес выяснить, будет ли стабильная экспрессия маркерного гена у данных растений сохраняться во втором поколении от самоопыления Для этого из групп растений с уникальной последовательностью гена uidA (контрольные растения) и прямым тандемом гена uidA (опытная группа) случайным образом было отобрано по семь растений. Наличие дупликации гена uidA в прямой ориентации в области Т-ДНК подтверждалось методом ПЦР (рис. 2)
Для каждого номера из двух групп трансформантов табака с одной и двумя копиями гена uidA в составе Т-ДНК на селективной среде были отобраны от 10 до 27
Таблица 1. Характер экспрессии маркерного гена прШ в потомстве от самоопыления трех групп исходных трансгенных растений табака (в %)
Характер экспрессии гена прШ Номер трансгенного растения
121 (контроль) 16 (с прямой дупликацией гена шс!А) 10 (с обратной дупликацией гена иША)
Стабильный уровень экспрессии 65,0 62,6 20,0
Нестабильный уровень экспрессии Отклонения от менделев-ского расщепления 7,2 8,1 16,0
Полная потеря экспрессии 1,0 3,0 2,7
Мозаичный фенотип 26,8 26,3 61,3*
Всего проанализировано трансформантов 97 99 75
* Имеется достоверное различие по сравнению с контролем, х2ы 005 = 3,841 (с!.£ = 1).
растений Ть В контрольной группе растений с одной копией гена шсЫ в области Т-ДНК у всех проанализированных потомков Тг расщепление на канамицине соответствовало ожидаемому моногибридному, что свидетельствовало о стабильном уровне экспрессии гена прШ У трансформантов с дупликацией по гену ииМ стабильное наследование гена прШ отмечено только у одного растения, в то время как у остальных шести растений в Т? выявлены отклонения, вызванные инактивацией экспрессии маркерного гена и появление мозаичных потомков, я
прШ
шК
гф)П Ш МА
Р
! Я |"§. 2
1
В а
-и. ИМ
— 51*«!,
иа
гщиы
1Ш
1Ж
Рис. 2. ПЦР-анализ исходных трансгенных растений табака с прямой дупликацией гена и1<М в структуре Т-ДНК. Обозначения:
а - схема расположения праймеров на кодирующую последовательность гена шсИ 011811 и СШЯ; б - электрофореграмма продукта ПЦР.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что в опытной группе растений, у которых ген прШ находится в соседстве с дупликацией гена ш<М, среди потомков Т, (в случае инвертированной дупликации) и в Т2 (в случае прямой дупликации) происходило нарушение экспрессии прШ гена, тогда как в контрольной группе растений наблюдалась стабильная экспрессия маркерного гена
2.2. Анализ активности фермента ß-глюкуронидазы в двух группах трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и прямой дупликацией данного гена)
Данные количественного флуориметрического анализа экспрессии гена uidA у исходных трансформантов и потомков первого поколения от самоопыления представлены в виде диаграммы на рис. 3. Уровень экспрессии репортерного гена варьировал среди исходных независимо полученных трансформантов в обеих группах растений с одной и двумя копиями гена uidA Отмечался достоверно более высокий уровень активности анализируемого фермента у растений, у которых ген uidA был представлен в виде двух копий. Только у одного растения из данной i
группы (16.40) наблюдалось значительное снижение количества фермента ß-глюкуронидазы у потомков Ть которое согласно точковому Нозерн-блоттингу (рис. 4) коррелировало с уменьшением количества мРНК, транскрибируемой с гена mdA и указывало на процесс инактивации экспрессии репортерного гена.
В литературе описаны как факты инактивации (Wang, Waterhouse, 2000; Ma, Mitra, 2002), так и стабильной экспрессии генов, представленных в виде тандемных повторов (Conceizro et al, 1994; Lichtenberg et al., 2002). Известао, что даже встраивание гена uidA в один и тот же район хромосомы с помощью сисгемы СгеПох рекомбинации может вести к вариабельности экспрессии между исходными трансформантами (Day et al, 2000). В нашей работе получены как данные о стабильной экспрессии репортерного гена, представленного в виде дупликации, у независимо полученных исходных трансформантах и их потомства Т., так и возможность снижения уровня экспрессии фермента ß-глюкуронидазы уже в первом поколении от самоопыления.
2.3. Анализ стабильности экспрессии гена nptllу гибридов F¡ от различных типов скрещиваний трансгенных растений табака
Необходимо отметить, что инактивирование трансгенов наблюдается не юлько при наличии тандемных повторов в структуре чужеродной инсерции, но и при различных типах скрещиваний трансгенных растений (Mittelsten Scheid et al, 1991; Cherdshewasart et al, 1993; Van Houdt et al, 2000). В связи с этим, представляло интерес смоделировать нестабильный уровень экспрессии маркерного гена nptll посредством скрещиваний трансформантов с дупликацией в области Т-ДНК.
Стабильность экспрессии гена nptll у гибридов or анализирующего скрещивания исходных трансформантов с нетрансгенными растениями табака. При гибридизации контрольных растений с нетрансгенным табаком во всех 12 проанализированных скрещиваниях (прямых и обратных) отмечалось расщепление 1Кт+:1Кт\ что подтверждало наличие одной встройки Т-ДНК в ядерном геноме исходных трансформантов и свидетельствовало о стабильности экспрессии гена nptll В анализирующем скрещивании исходных трансформантов с двумя копиями гена uidA в области чужеродной инсерции с нетрансгенными растениями табака отклонения от ожидаемого расщепления в сторону инактивации экспрессии маркерного гена наблюдалось в 28,6 % (из 14 прямых и обратных скрещиваний). Таким образом, в опытной группе растений, у которых ген nptll находится в соседстве с дупликацией гена uidA, среди потомков Fi от скрещивания с диким типом происходило нарушение экспрессии гена nptll.
ю а
8 ---- ----- _
х
121 9 121 49 121 54 121 63 121 71 121 84 121 94
16 22 18 36 1640 16 48 16 53 16 74 16 83
Рис. 3. Активность р-глюкуронидачы у трансгенных растений табака (То и Т,):
а) с одной копией гена (контроль);
б) с двумя копиями гена в составе Т-ДНК инсерции Обозначения:
ПТо - исходные трансгенные растения;
Т, - первое поколение от самоопыления То-растений.
' контроль
I отриц. полож 12 3 4
»
0,5 мкг мРНК , . Рис. 4. Точечный Нозери-
блотпяг тотальной мРНК трансгенных растений Т, с имИ-зондом.
0,1 мкг мРНК 0,05 мкг мРНК
Стабильность экспрессии I ена прШ у гибридов при скрещивании исходных травсформантов между собой. Обобщенные данные (в %) расщеплений в полученных от скрещиваний трансгенных растений То с одной (растения №121) и двумя копиями (растения №16) гена шс1А в структуре Т-ДНК, представлены в табл. 2.
Таблица 2. Расщепление по устойчивости к канамицину в Р, при скрещивании между собой исходных трансформантов табака
Расщепления в Р. 121 х 121 16 X 16 16 х 121
Отклонения от менде- Расщепление по дигиб-ридному типу 4,0% - 0,3%
левского расщепления Инактивация экспрессии гена прШ 1,6% 35,7% *2= 48,306* 10,3% Х2 = 9,439*
Согласно Менделю 94,4 % 64,3 % 89,4 %
Общее количество скрещиваний 126 126 291
Появление мозаичных растений 7,9 % 51,6% Х2= 57,420* 25.1 % Х2= 16,220*
* Достоверное отличие по сравнению с контролем, /_2510,05 ~ 3,841 (с1 Г = 1), нулевая гипотеза - достоверных отличий между группами нет
У гибридов контрольной группы маркерный ген наследовался, как правило, стабильно. Из 126 прямых и обратных комбинаций скрещиваний только в семи случаях наблюдались отклонения от менделевского расщепления, что составило 5,5 % от общего числа проанализированных вариантов и в 7,9 % появлялись мозаичные растения. Анализ гибридов Р| от скрещивания трансгенных растений табака с тандемным повтором гена шс1А в прямой ориентации показал достоверное увеличение до 35,7 % доли растений с отклонениями от менделевского расщепления в сторону инактивации экспрессии маркерного гена. Также достоверно увеличилась частота появления в Р) мозаичных потомков до 51,6 %. При скрещиваниях между собой контрольной группы растений и растений с прямой дупликацией гена шсЫ в 10,3 % случаев отмечены отклонения от ожидаемого расщепления и в 25,1 % случаев появляются растения-мозаики.
Таким образом, сравнительный анализ расщеплений в Рь полученных от различных типов скрещиваний трансформантов показывает, что наличие дупликации гена т<1А в составе Т-ДНК оказывало существенное влияние на стабильность экспрессии рядом расположенного маркерного гена прШ.
Стабильность экспрессии гена прШ у гибридов при различных типах скрещиваний растений первого поколения. Среди исследуемых растений наибольший интерес для дальнейшего гибридологического анализа стабильности экспрессии маркерного гена прШ представляло растение 16.40, потомки Т] которого характеризовались низким уровнем экспрессии гена шсМ (рис. 3). В табл. 3 приведены обобщенные результаты при различных типах скрещиваний растений первого поколения При скрещиваниях трансгенных растений с генотипом А*аЬЬсс (16.40) с растениями ааВЬсс (16.53) и ааЬЬСс (121.94) в Р| вместо теоретически ожидаемого расщепления ЗКш+ 1Кт", в около 60 % скрещиваний наблюдались отклонения от расщепления в сторону инактивации гена прШ (2Кт+ТКтп"
или 1Кт+:1Кт~) и появление мозаичных потомков (45,5 % и 38,8 % соответственно). Скрещивание же растений Т| ааВЬсс (16.53) с высоким уровнем экспрессии гена шйА с контрольными растениями П ааЬЬСс (121 94) вызывало лишь небольшой процент нарушений (2,2 %). Это позволило сделать вывод, что скрещивания с растениями Т] 16.40, характеризующимися низким уровнем экспрессии (5-глюкуронидазы, приводило к резкому нарушению экспрессии гена прШ у гибридов. При данных типах скрещиваний у потомков Б] возникают три варианта генотипов по трансгенным локусам (гибриды гемизиготные по двум инсерциям Т-ДНК и гемизиготы по одной из родительских инсерций). Для того чтобы выявить, с каким генотипом происходит инактивация маркерного гена, были I проведены дополнительные скрещивания.
При скрещиваниях растений А*А*ЬЬсс (16.40; гомозиготы), с растениями ааВЬсс (16.53; гемизиготы), в Р[ частота отклонений от ожидаемого расщепления составила 75,0 % Нестабильность экспрессии гена пр111 у гибридов характеризовалась появлением Кт-неустойчивых потомков и мозаиков (табл. 3). В обратной комбинации, где скрещивали растения А*аЪЬсс (16 40; гемизиготы) с ааВВсс (16 53; гомозиготы), в гибридаом потомстве частота отклонений была достоверно меньше - 5,9 % (по формуле Фишера р ~ 0,001, при ряоо5 = 0,01 (с1.Г = 1)). При данных скрещиваниях получаются только два генотипа, один из которых является одинаковым в обоих направлениях скрещиваний и включает по одной инсерции от каждого родителя А*аВЬсс, в то время как генотипы гемизиготных потомков отличаются В первом скрещивании получается гемизигота с инактивированным геном иШ А*аЬЬсс. а во втором - с нормально экспрессирующимся ааВЬсс. Следовательно, это сравнение позволяет предположить, что в первом скрещивании именно у ряда растений Рь гемизиготных по инактивированному трансгену происходил процесс инактивации экспрессии маркерного гена прШ Такую же картину мы наблюдали при скрещивании Т| 16.40 с контрольными растениями Т; 121.94 (табл 3) В зависимости от направления скрещивания наблюдалась инактивация экспрессии гена прШ у части гибридных растений Р| Данного явления не наблюдалось, если в качестве контроля по такой же схеме скрещивали растения Т1 16.53 и Т1 121.94. Во всех проанализированных комбинациях наследование маркерного гена прШ было стабильное (табл. 3).
Таким образом, выполненный гибридологический анализ позволяет сделать вывод, что инактивированное состояние по гену шс1А влияет на стабильность экспрессии рядом расположенного гена пр!Л преимущественно в гемизиготе. В гибридах, где происходит комбинация с другим трансгеном, нормально экспресси-рующим ген шйА явление инактивации экспрессии гена прШ не наблюдалось или регистрировалось лишь в небольшом проценте случаев Следовательно, можно предположить, что активная копия гена шЛ4. при объединении в геноме гибридов с другой неаллельной инактивированной дупликацией гена шс1А, вызывает процесс транс-активации экспрессии репортерного гена, что в свою очередь способствует стабильной экспрессии рядом расположенного маркерного гена прШ. В гемизигот-ном же состоянии инактивированный ген шс1А оказывает супрессирующее действие на экспрессию гена прШ
Известно, что вероятность инактивации экспрессии перенесенных генов может значительно увеличиваться (до 100 %) при транс-инактивации, когда в растительном геноме объединяют посредством двойной трансформации или скрещиваний чужеродную инсерцию с активным геном с инактивированным гомологичным ге-
Таблица 3. Схема скрещиваний трансгенных растений 16.40, 16.53, 121.94 (ТО теми- и гомозиготных по Т-ДНК инсерции
Р 916 ааВЬсс ааЬЬСс ааВВсс ааЬЬСС
61,4% отклонений, 45,5 % появление мозаи-ков 61,2 % отклонений, 38,8 % появление мозаиков 5,9 % отклонений 2,5 % отклонений
А*аЬЬсс Гц А*аВЬсс А*аЬЬсс ааВЬсс ааЬЬсс (44 скрещивания) Р,: А*аЬЬСс А*аЬЬсс ааЬЬСс ааЬЬсс (49 скрещиваний) Р,: А*аВЬсс ааВЬсс (17 скрещиваний) Е^ А*аЬЬСс ааЬЬСс (40 скрещиваний)
ааВЬсс 2,2% отклонений Е^ ааВЬСс ааВЬсс ааЬЬСс аа ЬЬсс (46 скрещиваний) нет нарушений (32 скрещивания)
А*А*ЬЬсс 75 % отклонений, 75 % появление мозаиков Г1: А*аВЬсс А*аЬЬсс (8 скрещиваний) 33,3 % отклонений, 33,3 % появление мозаиков Е): А*аЬЬСс А*аЬЬсс (9 скрещиваний)
ааВВсс нет нарушений (14 скрещиваний)
Примечание. Инсерция Т-ДНК в растениях Т| 16.40 - А*аЬЬсс, 16.53 - ааВЬсс, 121.94 ааЬЬСс. Скрещивания проводились по циклической схеме в 1-2 повтор-ностях, % отклонений от теоретически ожидаемого расщепления подсчитан 01 общего числа проанализированых расщеплений, указанных в скобках.
л
ном (Майке е! а1, 19946; 2000). Однако, в нашем исследовании выполненный гибридологический анализ показал, что скрещивания растений Т| с инактивиро-ванным дунлицированным геном иШ с растениями Т|, включающими одну или две активные копии гена т<1А, может способствовать восстановлению экспрессии гена пр1П в гибридах, в отличие от нарушений стабильной экспрессии данного маркерного гена в растениях гемизиготных по инахтивированному гену т<1А.
Итак, наблюдаемый высокий процент потомков с нестабильным уровнем экспрессии гена прШ у трансформантов с инвертированным тандемным повтором в структуре Т-ДНК в первом поколении от самоопыления, а также у растений с прямым тандем-
ным повтором во втором поколении и у гибридов от различных типов скрещиваний наводит на мысль, что наличие дупликаций в составе Т-ДНК оказывает определенное влитие на реализацию механизмов инаюгивирования чужеродных генов Гибридологический анализ потомков от различных типов скрещиваний растений Ti позволил выявить, что в гибридах гемизиготных по инактивированной дупликации гена uidA происходило нарушение экспрессии рядом расположенного другого маркерного гена nptll.
3. Мозаичный характер проявления экспрессии гена nptll
в трансгенных растениях табака модельной линии Nu 21
Транс!енное растение [абака Nu 21 представляет собой уникальную модель для изучения мозаичного характера экспрессии маркерного 1ена nptll на уровне соматических тканей. Данное растение привлекло к себе внимание необычным фенотипом потомков первого поколения, выращенных на среде с канамицином. 4-6-недельные растения имели ярко выраженную пятнистую окраску листьев, чередование белых и зеленых секторов. Частота появления мозаично окрашенных растений в Т] составила порядка 100 % Возникновение таких белых пятен на листьях связано с тем, что в них отсутствует экспрессия перенесенного маркерного гена nptll На представленной авторадиограмме видно, что в зеленой части листа активность фермента NPTII in situ была высокая, а в белой - минимальная (рис. 5)
Рис. 5. Авторадиограмма активности фермента NPTII in situ в листовых пластинках трансгенных растений табака:
1 - трансгенное растение табака (положительный конгроль), 2 - нетрансген-ные растения табака (отрицательный контроль), 3 - зеленая часть листьев мозаичных потомков Ть 4 - белая часть листьев мозаичных потомков Ti
Фенотип мозаичной экспрессии гена nptll наследовался при самоопылении исходного трансформанта в первом, втором, третьем и четвертом поколениях и при скрещиваниях с нетрансгенными растениями табака растений Ti и Т2. Частота появления мозаичных потомков в поколениях от самоопыления и в гибридах Fj варьировала в широких пределах, как среди индивидуальных растений, так и между разными семенными коробочками у одного и того же растения. По сравнению со 100 % проявления признака мозаицизма в Ti; в Т2 и Т3 и в гибридах от скрещивания с диким типом с различной частотой выявлялись зеленые растения. По данному признаку можно было выделить три группы: рас!ения с низкой частотой проявления мозаицизма (0-21,8 %); растения с высокой частотой появления мозачных потомков (63,1-100 %) и растения с промежуточным типом, частота появления растений мо-заиков варьировала в широких пределах от 0 до 100 % Важно отметить, что даже если в Т2 для дальнейшего анализа были отобраны зеленые растения, то в Тз и F; они
1 2 3 4
опять давали высокий процент появления потомков с мозаичной экспрессией гена прШ на уровне саматических тканей.
Саузерн блот-гибридизация геномной ДНК 9 растений первого и 11 второго поколений показала наличие двух фрагментов длиной порядка 4 и 5 т гт.н , что указывает на присутствие не менее двух инсерций Т-ДНК в растительном геноме (рис. 6). Следовательно, если предположить, что исходное растение содержит две вставки Т-ДНК в разных сайтах генома, то в последующих поколениях должна происходить их сегрегация и должны вьпцепляться растения с одной инсерцией трансгена, ожидаемое расщепление в этом случае должно быть 15Кт^ТКт\ т е. соответствовать дигибридному. Однако данного типа расщепления никогда не регистрировалось Следовательно, можно предположить, что если инсерции расположены в ф разных сайтах, то функционально активной является только одна вставка, либо две инсерции расположены близко к друг другу и наследуются в одной группе сцепления.
ПН ' _ *
') г 3 4 5 в 7 8 в 10 11 1213
6555
6142 * _____Т
3676*- ■ ~ X Г" ~ *
Рис. 6. Саузерн блот-гибридизация геномной ДНК из трансгенных растений табака первого (слева) и второго (справа) поколений от самоопыления трансформанта Nu 21 с 32Р-меченным фрагментом гена nptll. Геномная ДНК порезана ферментом ЕсоШ. п.н. - пар нуклеотидов.
Введение мозаичных растений табака в культуру in vitro приводило к восстановлению экспрессии маркерного гена. При этом при самоопылении зеленых растений-регенерантов у потомков снова происходило восстановление мозаичного характера проявления экспрессии гена nptll. Таким образом, несмотря на восстановление экспрессии гена в культуре in vitro, при проведении растения через половой цикл наблюдалась реверсия к исходному состоянию, то есть к восстановлению нестабильного характера экспрессии гена nptll Это указывает на существование двух мета-стабильных состояний трансгена: активного и неактивного. Известно, что одним из механизмов, обеспечивающим изменения в активности генов, является метилирование нуклеотидной последовательности ДНК. При добавлении в культуральную среду 5-азацитидина (100 цМ/мл), являющимся ингибитором метилирования ДНК, наблюдалась реактивация экспрессии маркерного гена (табл. 4). Добавление 5-азацитидина приводило к достоверному увеличению числа Km-устойчивых потомков в 4,5-16 раз. Явление реактивации экспрессии гена nptll также регистрировалось у растений Т2 Nu 21/6 после тепловой обработки 4-6-дневных проростков (один раз в день при 38 °С 3 часа 3-кратно).
Таким образом, модельная линия Nu 21 характеризуется мозаичным характером экспрессии маркерного гена nptll, который проявляется на определенной стадии развития растений и наследуется в поколениях от самоопыления, и у гибридов от скрещиваний с диким типом. Особенности в организации структуры инсерции Т-
п в
S5S5 1 S $ 4 8 9 7 9 9 6442 * ___
367« * - — -
ДНК и местоположения в растительном геноме, по-видимому, вызвали проявление мозаицизма по экспрессии гена прШ у растений модельной линии >1и 21. Существование двух метастабильных состояния трансгена на уровне соматических тканей: активного и неактивного, вероятно, было связано с модификацией ДНК - метилированием цитозина в последовательности гена пр(11.
Таблица 4, Расщепление по устойчивости к канамицину во втором поколении от самоопыления растения № 21/6 при выращивании на среде с 5-азацитидином
Номер Кт Кт Расщепление V2 % мозаиков
коробочки фактическое теоретическое X
X контроль 5-азацитидин 63" 61" 109 99 0,6 1 0,6-1 1 1 М 12,302 9,025 100 100
Различия не достоверны, х2 ~ 0,559
2 контроль 5-азацитидин 47" 110м 209 278 0,2 1 0,4:1 - - 100 100
Различия достоверны, у2=13,525*
3 контроль 5-азацитидин 28" 162" 576 212 0,05:1 0,8:1 1:1 6,684 100 100
Различия достоверны Х^-220,730*
4 контроль 5-азацитидин 15" 105" 316 156 0,05:1 0,7 1 1:1 9,966 100 100
Различия достоверны, х2=115,067*
* нулевая гипотеза - различий нет, %2Я0,05 ~ 3,841 = 1), м мозаичные растения; процент растений мозаиков подсчитан от общего числа Кт+ растений
Выводы
1. Чужеродные гены в новом генетическом окружении стабильно наследовались в поколениях Т| и Т2, получаемых при самоопылении исходных трансформантов как с одной, так и множественными инсерциями Т-ДНК Нестабильность экспрессии маркерного гена выявлялась у гибридов от скрещиваний трансформантов между собой. Показано, что у трансформантов со множественными инсерциями отклонения от ожидаемых расщеплений выявлялись уже среди гибридов тогда как у моноинсерционных трансгенных растений нестабильность в проявлении гена пр;11 обнаруживалась только среди потомков р2. Трансформанты с одной инсерцией трансгена предпочтительны для дальнейшей селекционной доработки исходного материала.
2. Установлено, что присутствие дупликации (гена ш<М) в составе Т-ДНК инсер-ции значительно снижало стабильность экспрессии рядом расположенного маркерного гена (прИТ). Наличие дупликации в инвертированием виде вызывало резкое снижение стабильности экспрессии гена прШ (до 20%) в потомст-
ве первого поколения от самоопыления исходных трансформантов, в то время как в случае прямой дупликации нарушения стабильности экспрессии маркерного гена отмечались у потомков лишь во втором поколении от самоопыления трансгенных растений.
3 Наличие прямой дупликации гена uidA в области Т-ДНК существенно снижало стабильность экспрессии близлежащего гена nptll у гибридов от различных типов скрещиваний исходных трансформантов (с нетрансгенными растениями табака, между исходными трансформантами).
4. На основании гибридологического анализа впервые установлено, что нарушение экспрессии гена nptll происходило у гибридов, гемизиготных по инакти-вированной прямой дупликации гена uidA.
5. Установлено, что нестабильный уровень экспрессии перенесенных генов может проявляться в виде мозаичной экспрессии на уровне соматических тканей. Выделена модельная линия Nu 21 с мозаичным характером проявления экспрессии маркерного гена nptll Показано наследование данного фенотипа (в Т1-Т4 и у гибридов Fi от анализирующего скрещивания). Существование двух метастабильных состояния трансгена на уровне соматических тканей: активного и неактивного, вероятно, было связано с модификацией ДНК - метилированием цитозина в последовательности гена nptll.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Deineko Е , Zagorskaya А , Filipenko Е., Tilipenko М., Novoselya Т., Kochetov А., Komarova М., Shumnyi V. Instability of nptll gene expression in the progeny of transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum L. and N plumbaginifolia L.) // Biotechnology and biotechnological equipment. 1996. N 4. P. 89-92.
Дейнеко E.B., Новоселя T.B., Загорская A.A., Филипенко E.A , Шумный B.K. Стабильность экспрессии гена nptll в популяции трансгенных растений табака // ДАН. 1999. Т. 369. С. 420-423.
Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum I.) с множественными ин-серциями Т-ДНК // Генетика. 2000. Т. 36, № 3. С. 427-430.
Дейнеко Е В., Новоселя Т.В., Загорская A.A., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000 Т. 47, № 3. С. 394-399
Дейнеко Е.В, Новоселя Т.В., Загорская A.A., Филипенко Е.А., Пухначева Н.В., Шумный В.К. Инактивирование чужеродных генов в геноме трансгенных растений // Изучение генома и генетическая трансформация растений Новосибирск: Наука, 2001. С. 132-142.
Novoselia T.V., Deineko E.V., Filipenko E.A., Shumnyi V.K. Expression stability of marker gene nptll in transgenic plants Nicotiana tohacum L. with single T-DNA insertion // Biotechnology and biotechnological equipment. 2001 .V. 15, N 2. P. 3-7.
Новоееля T.B., Дейнеко E.B. Моделирование нестабильной экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2002. Т. 49, № 3. С. 437-443.
Подписано к печати 11.04.2005
Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ л. 1. Уч. изд. л. 0,7
Тираж 100 экз. Заказ 56
Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.
р-6507
РНБ Русский фонд
2006-4 420]
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маренкова, Татьяна Владиславовна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1 Получение трансгенных растений: общие сведения.
1.2 Наследование чужеродных генов и вариабельность их экспрессии у трансгенных растений.
1.3 Инактивация чужеродных генов в растительном геноме.
1.4 Молекулярно-генетические механизмы инактивации чужеродной ДНК в ядерном геноме трансгенных растений.
1.4.1 Структура и местоположение экзогенной ДНК в растительном геноме.
1.4.2 Замолкание экспрессии трансгена и модификация ДНК.
1.4.3 Мутации растительных генов, влияющих на процесс инактивации экспрессии чужеродной ДНК.
1.5 Примеры инактивации экспрессии множественных копий собственных растительных генов.
1.6 Инактивация экспрессии множественных копий генов у грибов-аскомицетов.
1.7 Использование феномена инактивации экспрессии множественных копий генов для целенаправленного выключения экспрессии растительных генов.
1.8 Стратегия предотвращения инактивации целевых генов в трансформированных растениях.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1 Получение транс генных растений табака.
2.2 Типы генетических конструкций.
2.3 Гибридологический анализ трансгенных растений табака.
2.4 Определение активности неомицинфосфотрансферазы II in situ.
2.5 Флуориметрическое определение активности p-глюкуронидазы в листьях трансгенных растений табака.
2.6 Выделение геномной ДНК из листьев табака.
2.7 Саузерн блот гибридизация геномной ДНК трансгенных растений табака.
2.8 Выделение РНК из растительной ткани и точечный Нозерн блотгинг.
2.9 Подтверждение наличия дупликаций в области инсерции Т-ДНК с помощью метода ПЦР.
2.10 Проверка исходных трансформантов на присутствие в растительном геноме векторных последовательностей с помощью метода ПЦР.
2.11 Электрофоретический анализ ДНК.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 Стабильность экспрессии маркерного гена nptll у гибридов от скрещивания трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК.
3.2 Анализ стабильности наследования гена nptll у трансгенных растений табака со множественными инсерциями Т-ДНК.
3.3 Моделирование влияния дупликации в структуре Т-ДНК на стабильность экспрессии маркерных генов nptll и uidA в трансгенных растениях табака.
3.3.1 Сравнительный анализ стабильности экспрессии гена nptll в первом и втором поколениях от самоопыления трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и с дупликациями данного гена в составе Т-области).
3.3.2 Анализ активности ферментов (З-глюкуронидазы и NPTII в двух группах трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и прямой дупликацией данного гена).
3.3.3 Анализ стабильности экспрессии гена nptll у гибридов Fj от различных типов скрещиваний.
3.3.4 Встраивание векторных последовательностей в растительный геном исходных трансгенных растений табака.
3.4 Мозаичный характер проявления экспрессии гена nptll в трансгенных растениях табака модельной линии Nu 21.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.)"
За последнее десятилетие в ведущих биотехнологических центрах мира интенсивно ведутся работы по модификации ядерного генома высших растений с применением методов генной инженерии. При создании трансгенных растений и их внедрении в сельское хозяйство как коммерческих культур наиболее важным моментом является достижение высокого и стабильного уровня экспрессии перенесенных целевых генов как среди исходных трансформантов и их потомков от самоопыления, так и у гибридов от их скрещивания. Исследования стабильности экспрессии и наследования чужеродной ДНК в геноме трансгенных растений показали, что, как правило, они наследуются по классическим законам Менделя как доминантные мутации (Potrykus et al., 1985; Budar et al, 1986). Однако уже через несколько лет после получения первых трансформантов исследователи столкнулись с явлением вариабельности экспрессии чужеродных генов и феноменом неменделевского наследования, связанного с потерей экспрессии ("замолканием") трансгенов (Potrykus et al., 1985; Budar et al, 1986; Deroles, Gardner, 1988). С начала 1990-х годов и до настоящего времени продолжается активное исследование феномена инактивации и изменений в экспрессии перенесенных генов у генетически модифицированных растений (Matzke et al., 1989, 2000, 2004; Mittelsten Scheid et al, 1991; Vance, Vaucheret, 2001).
Частота инактивации гетерологичных генов в первом поколении от самоопыления исходных трансформантов, полученных с помощью агробактериальной трансформации, может составлять немногим более половины случаев по данным разных исследований (г dar et al., 1986; Deroles, Gardner, 1988; Meza et al, 2001; Sallaud et al, 2001V В данную группу в основном входят трансформанты с множественны. инсерциями чужеродной ДНК, интегрированными в один или несколько районов растительного генома. Однако известны случаи потери экспрессии триис с >в в последующих поколениях при самоопылении моноинсерционных растений (Cherdshewasart et al., 1993; Metz et al, 1997; Дейнеко и др., 1998; McCabe et al, 1999; Fu et al, 2000; Vain et al, 2002; Sallaud et al, 2003) и у гибридов от их скрещиваний (Cherdshewasart et al., 1993; Schmulling, Rohrig, 1995; Charrier et al, 2000). Частота инактивации может существенно возрастать, если в состав генетической конструкции включены тандемные копии генов, как в прямой, так и в обратной ориентации (Wang, Waterhouse, 2000; Ma, Mitra, 2002).
Непредсказуемые изменения в стабильности экспрессии трансгенов как среди потомков от самоопыления, так и у гибридов от скрещиваний трансгенных растений, нежелательны с коммерческой точки зрения и такие трансформанты необходимо выбраковывать в дальнейшей селекционной работе. Однако трансгенные растения с нестабильным уровнем экспрессии чужеродных генов представляют несомненный интерес в качестве моделей для исследования причин и механизмов инактивации экспрессии рекомбинантных генов, что вносит существенный вклад в понимание молекулярно-генетических механизмов регуляции экспрессии растительных генов (Fagard, Vaucheret, 2000; Matzke et al, 2000) и способов защиты растительного генома от амплификации транспозонных элементов, вирусов и вироидов (Vance, Vaucheret, 2001).
Актуальность проблемы.
Бурное развитие генетической инженерии и биотехнологии, разработка методов переноса генетического материала в растительную клетку позволило модифицировать геном многих видов растений. Трансгенные растения представляют собой яркий пример преодоления физических, эволюционных и генетических барьеров, которые изолируют геномы различных организмов (Miki, McHugh, 2004). К настоящему времени накоплены экспериментальные данные о нестабильности экспрессии чужеродной генетической информации в растительном геноме, связанные, главным образом, с инактивацией и изменениями в экспрессии гетерологичных генов (Flavel, 1994; Matzke, Matzke, 1995; Matzke el al, 2000). На трансгенных растениях табака, риса и Arabidopsis thaliana получены модельные линии, позволяющие изучать данный феномен (Kilby et al, 1992; Matzke et al, 1994a; Voucheret et al., 1994; Davies et al, 1997; Mittelsten Sheid et al, 1998; Fu et al, 2000). Матзцке с соавт. на трансгенном табаке исследовали свойства и структуру трансгенного Н локуса, который включает серию аллелей. Аллели со сложной структурой Т-ДНК (с дупликациями, векторными последовательностями) способны вызывать процесс гранс-инактивации других чужеродных генов под управлением NOS промотора нопалинсинтазы A. tumeficeins в геноме гибридов (Matzke et al, 1989, 1994а; Jakowitsch et al., 1999). Достаточно хорошо исследован мультикопийный локус 271, способный вызывать замолкание экспрессии трансгенов, находящихся под управлением 35S промотора ВМЦК у трансгенных растений табака (Vaucheret et al., 1994; Park et al, 1996). Именно на трансгенных растениях петунии и томата в 1990 году впервые был описан феномен ко-супрессии - координированного подавления экспрессии трансгенов и гомологичных им хозяйских генов, связанного с посттранскрипционным разрушением мРНК в цитоплазме (Napoli et al., 1990; Van der Krol et al, 1990; Smith et al., 1990). Данное явление в настоящее время обнаружено у нематоды Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998), Drosophila melanogaster (Misquitta et al., 1999; Pal-Bhadra et al, 2002), Trypanosome brucei (Ngo et al., 1998), Paramecium (Ruiz et al, 1998), млекопитающих (Wianny et al., 2000) и получило название РНК интерференция.
На основе феномена инактивации экспрессии трансгенов разработаны рекомендации для создания различных генетических конструкций, как обеспечивающих достаточно высокий уровень экспрессии гетерологичного белка в трансформантах, так и целенаправленно вызывающих инактивацию экспрессии определенных растительных генов (Wesley et al., 2001; Gossele et al, 2002; Stoutjesdijk et al, 2002; Brummel et al, 2003).
Сходный феномен инактивации множественных копий генов в ядерном геноме в настоящее время активно исследуется у низших грибов Neurospora crassa (Selker, 1997), Ascobolus immerses (Rhounim et al., 1992), Coprinus cinereus (Freedman, Pukkila, 1993), Magnoporte grisea (Ikeda et al., 2002) и Podospora anserine (Graia et al, 2001). Показано, что интеграция множественных тандемных копий гена white в геном Drosophila melanogaster приводила к нарушению стабильности экспрессии трансгена, что проявлялось либо как мозаицизм, либо как отсутствие ожидаемого фенотипа (Dorer, Henikoff, 1997). Авторами была установлена отрицательная корреляция между числом встроенных копий трансгена и стабильностью его экспрессии. Взаимосвязь между числом копий гена и уровнем его экспрессии обнаружена и для ряда собственных растительных генов (Todd, Vodkin, 1996; Luffed al, 1999). Так ген pail-pai4 A. thaliana линии Wassilewskija, организованный в виде инвертированного повтора, подавляет экспрессию трех гомологичных однокопийных генов pail, pai2, pai3 линии Colombia при объединении их в геноме гибридов (Luff et al, 1999).
Таким образом, в связи с интенсивным развитием генетической инженерии и биотехнологии растений проблема инактивации экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях представляется весьма актуальной. Важность данных исследований очевидна, так как усилия многих исследователей по реконструкции генома растений могут не привести к желаемым результатам. Исследования феномена инактивации экспрессии чужеродных генов в геноме трансгенных растений вносят существенный вклад и в решение фундаментальных задач - выявлены новые механизмы регуляции экспрессии растительных генов и устойчивости к вирусам, ТЭ, основанные на гомологии нуклеотидной последовательности (Fagard, Vaucheret, 2001; Vance, Vaucheret, 2001; Matzke, Matzke, 2004). Однако, несмотря на очевидный прогресс данного научного направления, остается еще много неясных вопросов. Поэтому изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансформантов и их потомков, у гибридов от различных видов скрещиваний, получение новых модельных систем на трансгенных растениях представляется чрезвычайно актуальным.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования являлось изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) в поколениях от самоопыления и гибридах от различных типов скрещиваний. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Провести гибридологический анализ стабильности экспрессии маркерного гена nptll у трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК в ядерном геноме.
2. Проанализировать стабильность наследования гена nptll у трансгенных растений табака с множественными событиями интеграции Т-ДНК.
3. Выделить модельные линии трансгенных растений табака, содержащих в составе области Т-ДНК прямые или инвертированные повторы гена uidA, с нестабильным характером экспрессии маркерных генов.
4. Провести гибридологический анализ наследования мозаичного характера проявления экспрессии гена nptll в трансгенных растениях табака модельной линии Nu 21.
Научная новизна и практическая ценность.
Для изучения наследования и стабильности экспрессии чужеродных генов были выделены модельные линии трансгенных растений табака: 1) трансгенные растения с одиночными и множественными вставками Т-ДНК; 2) трансформанты, имеющие в геноме Т-ДНК инсерцию с дупликацией гена uidA и одной копией гена nptll; 3) трансгенное растение табака Nu 21 с мозаичным характером проявления экспрессии маркерного гена nptll. В исследовании представлены различные варианты организации инсерций Т-ДНК, при этом, использование маркерных генов позволило на больших выборках проследить особенности их наследования в поколениях и гибридах трансгенных растений. Проведен гибридологический анализ характера наследования маркерного гена nptll в поколениях от самоопыления исходных трансформантов, а так же гибридов от различных видов скрещиваний. Установлено, что частота инактивации гомологичных трансгенов существенно возрастает в геноме гибридных растений. Впервые показано, что наличие дупликации гена uidA в составе Т-ДНК инсерции оказывает существенное влияние на стабильность экспрессии рядом расположенного другого маркерного гена nptll, при этом инактивированное состояние по гену uidA влияло на стабильность экспрессии гена nptll преимущественно в гемизиготе. Впервые проведен гибридологический анализ наследования мозаичного характера экспрессии маркерного гена nptll у потомков (Tj-Т4) и гибридов от скрещиваний с диким типом трансгенных растений табака. Отобраны гибридные комбинации и потомки от самоопыления, представляющие несомненный интерес для дальнейшего более детального изучения молекулярно-генетических механизмов инактивации экспрессии трансгенов.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах: международной конференции, посвященной памяти академика А.А. Баева. Москва, 20-22 мая 1996 г.; German-Russian Cooperation in Biotechnology. Workshop IV. Russia. St.-Peterburg, October 10-13, 1996 г.; международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». Москва, 1997 г.; международной конференции «Новые направления биотехнологии». Москва, 27-29 апреля 1998 г.; International Congress «Plant Biotechnology and in vitro biology in the 21st century». Jerusalem, Israel, June 14-19, 1998 г.; всероссийском симпозиуме "Изучение генома и генетическая трансформация растений". Иркутск, 23-27 августа 1999 г.; II съезде Всесоюзного Общества Генетиков и Селекционеров (ВОГИС). Санкт-Петербург, 1-5 февраля 2000 г.; конференции молодых ученых, посвященной 100-летию со дня рождения М.А. Лаврентьева. Новосибирск, 4-6 декабря 2000 г.; международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», Москва (18-21 ноября) - Минск (22-24 ноября), 2001 г.; 1-м международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва, 14-18 октября 2002 г.; 8-й международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Саратов, 9-13 сентября 2003 г.); III съезде ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». Москва, 6-12 июня 2004 г.; международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск, 24-26 ноября 2004 г. Материалы диссертационной работы представлялись в устных докладах на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2001, 2004 гг.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей.
Deineko Е., Zagorskaya A., Filipenko Е., Filipenko М., Novoselya Т., Kochetov А., Komarova М., Shumnyi V. Instability of nptll gene expression in the progeny of transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum L. and N. plumbaginifolia L.) // Biotechnology and biotechnological equipment. 1996. N. 4. P. 89-92.
Дейнеко E.B., Новоселя T.B., Загорская A.A., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll в популяции трансгенных растений табака // ДАН. 1999. Т. 369. С. 420-423.
Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (.Nicotiana tabacum L.) с множественными инсерциями Т-ДНК // Генетика. 2000. Т. 36. 27-430.
Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская .л. Филипенко Е.А., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии чужеродных ген, трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47. №. 3. С. 394
Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская , . Филипенко Е.А., Пухначева Н.В., Шумный В.К. Инактивирование чужеродных генов в геноме трансгенных растений // Изучение генома и генетическая трансформация растений. Новосибирск: Наука, 2001. С. 132-142.
Novoselia T.V., Deineko E.V., Filipenko E.A., Shumnyi V.K. Expression stability of marker gene nptll in transgenic plants Nicotiana tobacum L. with single T-DNA insertion 11 Biotechnology and biotechnological equipment. 2001. V.15. N.2. P. 3-7.
Новосел я T.B., Дейнеко E.B. Моделирование нестабильной экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2002. Т. 49. № 3. С. 437443.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (276 наименований). Работа изложена на 172 страницах, включает 29 рисунков и 26 таблиц в тексте диссертационной работы.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Маренкова, Татьяна Владиславовна
ВЫВОДЫ
1. Чужеродные гены в новом генетическом окружении стабильно наследовались в поколениях Tj и Т2, получаемых при самоопылении исходных трансформантов как с одной, так и множественными инсерциями Т-ДНК. Нестабильность экспрессии маркерного гена выявлялась у гибридов от скрещиваний трансформантов между собой. Показано, что у трансформантов со множественными инсерциями отклонения от ожидаемых расщеплений выявлялись уже среди гибридов Fb тогда как у моноинсерционных трансгенных растений нестабильность в проявлении гена nptll обнаруживалась только среди потомков F2. Трансформанты с одной инсерцией трансгена предпочтительны для дальнейшей селекционной доработки исходного материала.
2. Установлено, что присутствие дупликации (гена uidA) в составе Т-ДНК инсерции значительно снижало стабильность экспрессии рядом расположенного маркерного гена {nptll). Наличие дупликации в инвертированном виде вызывало резкое снижение стабильности экспрессии гена nptll (до 20%) в потомстве первого поколения от самоопыления исходных трансформантов, в то время как в случае прямой дупликации нарушения стабильности экспрессии маркерного гена отмечались у потомков лишь во втором поколении от самоопыления трансгенных растений.
3. Наличие прямой дупликации гена uidA в области Т-ДНК существенно снижало стабильность экспрессии близлежащего гена nptll у гибридов от различных типов скрещиваний исходных трансформантов (с нетрансгенными растениями табака, между исходными трансформантами).
4. На основании гибридологического анализа впервые установлено, что нарушение экспрессии гена nptll происходило у гибридов, гемизиготных по инактивированной прямой дупликации гена uidA.
5. Установлено, что нестабильный уровень экспрессии перенесенных генов может проявляться в виде мозаичной экспрессии на уровне соматических тканей. Выделена модельная линия Nu 21 с мозаичным характером проявления экспрессии маркерного гена nptll. Показано наследование данного фенотипа (в Т!-Т4 и у гибридов F] от анализирующего скрещивания). Существование двух метастабильных состояния трансгена на уровне соматических тканей: активного и неактивного, вероятно, было связано с модификацией ДНК - метилированием цитозина в последовательности гена nptll.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маренкова, Татьяна Владиславовна, Новосибирск
1. Дрейпер Д., Скотт Р., Армитидж Ф. и др. Генная инженерия растений: лабораторное руководство. М.: Мир, 1991. 408 с.
2. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филипенко Е.А. и др. Нестабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) при инбридинге //Генетика. 1998. Т. 34. № 9. С. 1212-1219.
3. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская А.А. и др. Стабильность экспрессии гена nptll в популяции трансгенных растений табака // ДАН. 1999. Т. 369. С. 420-423.
4. Ежова Т.А., Лебедева О.В., Огаркова О.А. и др. Arabidopsis thaliana модельный объект генетики растений. М: Макс пресс, 2003. 219 с.
5. Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики. М: Мир, 1985. С. 70-71.
6. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В. Моделирование нестабильной экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2002. Т. 49. № 3. С. 437443.
7. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака {Nicotiana tabacum L.) с множественными инсерциями Т-ДНК // Генетика. 2000. Т. 36. № 3. С. 427-430.
8. Урбах В.Ю. Биометрические методы. М: Наука, 1964. 415 с.
9. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. Саратов: Издательство «Слово», 2001. 256 с.
10. Albert Н., Dale Е.С., Lee Е., Ow D.W. Site-specific integration of DNA into wild-type and mutant lox sites placed in the plant genome // Plant J. 1995. V.7. P. 649-659.
11. Allen G.C., Hall G. Jr., Michalowski S. et al. High-level transgene expression in plant cells: effects of a strong scaffold attachment region from tobacco // Plant Cell. 1996. V.8.P. 899-913.
12. Allen G.C., Spiker S., Thompson W.F. Use of matrix attachment regions (MARs) to minimize transgene silencing // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 361-376.
13. Alonso J.M., Stepanova A.N., Leisse T.J. et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana // Science. 2003. V. 301. P. 653-657.
14. Amedeo P., Habu Y., Afsar K. et al. Disruption of the plant gene MOM releases transcriptional silencing of methylated genes //Nature. 2000. V. 405. P. 203-206.
15. Ascenzi R., Ulker В., Todd J.J. et al. Analysis of trans-silencing interactions using transcriptional silencers of varying strength and targets with and without flanking nuclear matrix attachment regions // Transgenic Res. 2003. V. 12. P. 305-318.
16. Assaad F.F., Singer E.R. Somatic and germinal recombination of a direct repeat in Arabidopsis II Genetics. 1992. V. 132. P. 553-566.
17. Assaad F.F., Tucker K.L., Singer E.R. Epigenetic repeat-induced silencing (RIGS) in Arabidopsis II Plant Mol. Biol. 1993. V. 22. P. 1067-1085.
18. Beaujean A., Sangwan R.S., Hodges M., Sangwan-Norreel B.S. Effect of ploidy and homozygosity on transgene expression in primary tobacco transformants and their androgenetic progenies // Mol. Gen. Genet. 1998. V. 260. P. 362-371.
19. Balandin Т., Castresana C. Silencing of a beta-l,3-glucanase transgene is overcome during seed formation // Plant Mol. Biol. 1997. V. 34. P. 125-137.
20. Bateman A. The SGS3 protein involved in PTGS finds a family // BMC
21. Bioinformatics. 2002. V. 3. P. 21-24.
22. Baulcombe D.C. Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing // Curr. Opin. Plant Biol. 1999. V. 2. P. 109-113.
23. Boerjan W., Bauw G., Van Montagu M., Inze D. Distinct phenotypes generated by overexpression and suppression of S-adenosyl-L-methionine synthetase reveal developmental patterns of gene silencing in tobacco // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 14011414.
24. Bohmert K., Camus I., Bellini C. et al. AGOl defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development // The EMBO J. 1998. V. 17. P. 170-180.
25. Bollmann J., Carpenter R., Coen E.S. Allelic interactions at the nivea locus of Antirrhinum II Plant Cell. 1991. V. 3. P. 1327-1336.
26. Bhat S.R., Srinivasan S. Molecular and genetic analyses of transgenic plants: consideration and approaches // Plant Science. 2002. V. 163. P. 673-681.
27. Brink R.A. Paramutation // Annual Review of Genetics. 1973. Y. 7. P. 129-152.
28. Brzeski J., Jerzmanowski A. Deficient in DNA methylation 1 (DDM1) defines a novel family of chromatin-remodeling factors // The J. of Biological Chemistry. 2003. V. 278. P. 823-828.
29. Braun R. The future of GM crops // Science. 2003. V. 300. P. 61-62.
30. Brummell D.A., Balint-Kurti P.J., Harpster M.H. et al. Inverted repeat of a heterologous 3'-untranslated region for high-efficiency, high-throughput gene silencing // Plant J. 2003. V. 33. P. 793-800.
31. Budar F., Thia-toong L., Van Montagu M., Hernalsteens J.-P. Agrobacterium mediated gene transfer results mainly in transgenic plants transmitting T-DNA as a single Mendilian factor // Genetics. 1986. V. 114. P. 303-313.
32. Bucherna N., Okkels F.T., Palmgren C. Developmental timing of transgene expression is dosage dependent // Physiologia Plantarum. 1999. V. 107. P. 90-97.
33. Butaye K.M., Goderis I.J., Wouters P.F. et al. Stable high-level transgene expression in Arabidopsis thaliana using gene silencing mutants and matrix attachment regions // Plant J. 2004. V. 39. P. 440-449.
34. Cao X., Jacobsen S.E. Locus-specific control of asymmetric and CpNpG methylation by the DRM and CMT3 methyltransferase genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 16491-16498.
35. Charrier В., Scollan C., Ross S. et al. Co-silencing of homologous transgenes in tobacco // Mol. Breeding. 2000. V. 6. P. 407-419.
36. Cherdshewasart W., Gharti-Chhetri G.B., Saul M.W. et al. Expression instability and genetic disorders in transgenic Nicotiana plumbaginifolia L. plants // Transgenic Research. 1993. V. 2. P. 307-320.
37. Chen S., Jin W., Wang M. et al. Distribution and characterization of over 1000 T-DNA tags in rice genome // Plant J. 2003. Y. 36. P. 105-113.
38. Chilton M.D., Que Q. Targeted integration of T-DNA into the tobacco genome at double-stranded breaks: new insights on the mechanism of T-DNA integration // Plant Physiol. 2003. V. 133. P. 956-965.
39. Christou P. Genetic-transformation of crop plants using microprojectile bombardment //Plant J. 1992. V. 2. P. 275-281.
40. Citovsky V., Wong M.L., Zarnbryski P. Cooperative interaction of Agrobacterium VirE2 protein with single-stranded DNA: implications for the T-DNA transfer process // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 1193-1197.
41. Citovsky V., Zupan J., Warnick D., Zarnbryski P. Nuclear localization of Agrobacterium VirE2 protein in plant cells // Science. 1992. V. 256. P. 1802-1805.
42. Conceizro A.S., Van Vliet A., Krebbers E. Unexpectedly higher expression levels of a chimeric 2S albumin seed protein transgene from a tandem array construct // Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. P. 1001-1005.
43. Coen E.S., Carpenter R. A semi-dominant allele, niv-525, acts in trans to inhibit expression of its wild-type homologue in Antirrhinum majus II The EMBO J. 1988. V. 7. P. 877-883.
44. Crossway A., Oakes J.V., Irine J.M. et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 202. P. 179-185.
45. Dalmay Т., Hamilton A., Rudd S. et al. An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus // Cell. 2000. V. 101. P. 543-553.
46. Dalmay Т., Horsefield R., Braunstein Т.Н., Baulcombe D.C. SDE3 encodes an RNA helicase required for post-transcriptional gene silencing in Arabidopsis II The EMBO J. 2001. V. 20. P. 2069-2078.
47. Day C.D., Lee E., Kobayashi J. et al. Transgene integration into the same chromosome location can produce alleles that express at a predictable level, or alleles that are differentially silenced // Genes Dev. 2000. V. 14. P. 2869-2880.
48. De Buck S., Jacobs A., Van Montagu M., Depicker A. The DNA sequences of T-DNA junctions suggest that complex T-DNA loci are formed by a recombination process resembling T-DNA integration // Plant J. 1999. V. 20. P. 295-304.
49. De Borne F., Vincentz M., Chupeau Y., Vaucheret H. Co-supression of nitrate reductase host genes and transgenes in transgenic tobacco plants // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 243. P. 613-621.
50. DeBlock M., Herrera-Estrella L., Van Montagu M. et al. Expression of foreign genes in regenerated plants and their progeny // The EMBO J. 1984. V. 3. P. 1681-1689.
51. De Carvalho F., Gheysen G., Kushnir S. et al. Suppression of beta-l,3-glucanase transgene expression in homozygous plants // The EMBO J. 1992. V. 11. P. 25952602.
52. Deineko E., Zagorskaya A., Filipenko E. et al. Instability of nptll gene expression in the progeny of transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum L. and N. plumbaginifolia L.) // Biotechnology and biotechnological equipment. 1996. N. 4. P. 89-92.
53. Davies G.J., Sheikh M.A., Ratcliffe O.J. et al. Genetics of homology-dependent gene silencing in Arabidopsis: a role for methylation // The Plant J. 1997. V.12. P. 791-804.
54. Deblaere R., Reynaerts J., Hofte H. et al. Vectors for cloning in plant cells // Meth. Enzymol. 1987. V. 153. P. 277-291.
55. Deroles S.C., Gardner R.C. Expression and inheritance of kanamicin resistance in large number of transgenic petunias generated by Agrobacterium-mediated transformation // Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P. 355-364.
56. De Carvalho F., Frendo P., Inze D. et al. Co-suppression of beta-l,3-glucanase genes in Nicotiana tabacum II Cur. Top Microbiol. Immunol. 1995. V. 197. P. 91-103.
57. Dehio C., Schell J. Stable expression of a single-copy rolA gene in transgenic Arabidopsis thaliana plants allows an exhaustive mutagenic analysis of the transgene-associated phenotype // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 241. P. 359-366.
58. Dehio C., Schell J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible gene silencing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91.P. 5538-5542.
59. De Neve M., De Buck S., Jacobs A. et al. T-DNA integration patterns in co-transformed plant cells suggest that T-DNA repeats originate from co-integration of separate T-DNAs // Plant J. 1997. V. 11. P. 15-29.
60. Deshayes A., Herrera-Estrella L., Caboche M. Liposome-mediated transformation of tobacco mesophyll protoplasts by an Escherichia coli plasmid // The EMBO J. 1985. V.4.P. 2731-2737.
61. Dorer D.R., Henikoff S. Transgene repeat arrays interact with distant heterochromatin and cause silencing in с is and trans И Genetics. 1997. V. 147. P. 1181-1190.
62. De Wilde С., Van Houdt H., De Buck S. et al. Plants as bioreactors for protein production: avoiding the problem of transgene silencing // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 347-359.
63. Dobie K., Mehtali M., McClenaghan M., Lathe R. Variegated gene expression in mice // Trends in Genetics. 1997. V.13. P. 127-130.
64. Dumas F., Duckely M., Pelczar P. et al. An Agrobacterium VirE2 channel for transferred-DNA transport into plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 485-490.
65. Ebinuma P., Sugita K., Matsunaga E. et al. Systems for the removal of a selection marker and their combination with a positive marker // Plant Cell Rep. 2001. V. 20. P. 383-392.
66. Elmayan Т., Balzergue S., Beon F. et al. Arabidopsis mutants impaired in cosupression // The Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1747-1757.
67. Fagard M., Vaucheret H. (Traris)gene silencing in plants: how many mechanisms? // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. V. 51. P. 167-194.
68. Faugeron G., Rhounim L., Rossignol J.L. How does the cell count the number of ectopic copies of a gene in the premeiotic inactivation process acting in Ascobolus immerses? // Genetics. 1990. V. 124. P. 585-591.
69. Fire A., Xu S., Montgomery M.K. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans //Nature. 1998. V. 391. P. 806-811.
70. Finnegan E.J., Kovac K.A. Plant DNA methyltransferases // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 189-201.
71. Finnegan E.J., Peacock W.J., Dennis E.S. Reduced DNA methylation in Arabidopsis thaliana results in abnormal plant development // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 8449-8454.
72. Flavell R.B. Inactivation of gene expression in plants as a consequence of specific sequence duplication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 3490-3496.
73. Forsbach A., Schubert D., Lechtenberg B. et al. Comprehensive characterization of single-copy T-DNA insertions in the Arabidopsis thaliana genome // Plant Mol. Biol. 2003. V. 52. P. 161-176.
74. Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B. et al. Expression of bacterial genes in plant cells //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 4803-4807.
75. Freedman Т., Pukkila P.J. De novo methylation of repeated sequences in Coprinus cinereus // Genetics. 1993. V. 135. P. 357-366.
76. Fromm M., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 5824-5828.
77. Furner I.J., Sheikh M.A., Collett C.E. Gene silencing and homology-dependent gene silencing in Arabidopsis: genetic modifiers and DNA methylation // Genetics. 1998. V. 149. P.651-662.
78. Fu X., Kohli A., Twyman R.M., Christon P. Alternative silencing effects involve distinct types of non-spreading cytosine methylation at a three-gene, single-copy transgenic locus in rice // Mol. Gen. Genet. 2000. V. 263. P. 106-118.
79. Gelvin S.B. The introduction and expression of transgenes in plants // Curr. Opin. in Biotechnology. 1998. V. 9. P. 227-232.
80. Gelvin S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "Gene-Jockeying" tool // Microbiol, and Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. P. 16-37.
81. Gendrel A.V., Lippman Z., Yordan C. et al. Dependence of heterochromatic histone H3 methylation patterns on the Arabidopsis gene DDM1 II Science. 2002. V. 297. P. 1871-1873.
82. Gheysen G., Villarroel R., Van Montagu M. Illegitimate recombination in plants: a model for T-DNA integration // Genes Dev. 1991. V. 5. P. 287-297.
83. Glazov E., Phillips K., Budziszewski G.J. et al. A gene encoding an RNase D exonuclease-like protein is required for post-transcriptional silencing in Arabidopsis 11 Plant J. 2003. V. 35. P. 342-349.
84. Gong Z., Morales-Ruiz Т., Ariza R.R. et al. ROS1, a repressor of transcriptional gene silencing in Arabodopsis, encodes a DNA glycosylase/lyase // Cell. 2002. V. 111. P. 803-814.
85. Gossele V., Fache I., Meulewaeter F. et al SVISS a novel transient gene silencing system for gene function discovery and validation in tobacco plants // Plant J. 2002. V. 32. P. 859-866.
86. Graia F., Lespinet O., Rimbault B. et al Genome quality control: RIP (repeat-induced point mutation) comes to Podospora II Molecular Microbiology. 2001. V. 40. P. 586595.
87. Gruenbaum Y., Naveh-Many Т., Cedar H., Razin A. Sequence specificity of methylation in higher plant DNA // Nature. 1981. V. 292. P. 860-862.
88. Halfhill M.D., Millwood R.J., Rufty T.W. et al Spatial and temporal patterns of green fluorescent protein (GFP) fluorescence during leaf development in transgenic oilseed rape, Brassica napus L. // Plant Cell Rep. 2003. V. 22. P. 338-343.
89. Halpin C., Barakate A., Askari B.M. et al Enabling technologies for manipulating multiple genes on complex pathways // Plant Mol. Biol. 2001. V. 47. P. 295-310.
90. Hart C.M., Fischer N., Neuhaus J-M., Meins F. Regulated inactivation of homologous gene expression in transgenic Nicotiana sylvestris plants containing a defense-related tobacco chitinase gene // Mol. Gen. Genet. 1992. V. 235. P. 179-188.
91. Herberl-Bors E., Charvat В., Thompson D. et al. Genetic analysis of T-DNA insertions into the tobacco genome // Plant Cell Reports. 1988. V. 7. P. 571-574.
92. Herrera-Estrella L., Teeri Т.Н., Simpson J. Use of reporter genes to study gene expression in plant cells // Plant Mol. Biol. Manual Bl. Ed.: Gelvin S.B., Schilperoort R.A. Kluwer Academic Publishers. 1988. P. 1-22.
93. Hirochika H., Okamoto H., Kakutani T. Silencing of retrotransposons in Arabidopsis and reactivation by the ddml mutation // The Plant Cell. 2000. V. 12. P. 357-368.
94. Hobbs S.L.A., Kpodar P., DeLong С. M. O. The effect of T-DNA copy number, position and methylation on reporter gene expression in tobacco transformants // Plant Mol. Biol. 1990. V. 15. P. 851-864.
95. Holliday R. The inheritance of epigenetic defects // Science. 1987. V. 238. P.163-170.
96. Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G. et al. Inheritance of functional foreign genes in plants // Science. 1984. V. 223. P. 496-498.
97. Howard E.A., Zupan J.R., Citovsky V., Zambiyski P.C. The VirD2 protein of A. tumefaciens contains a C-termirial bipartite nuclear localization signal: implications for nuclear uptake of DNA in plant cells // Cell. 1992. V. 68. P. 109-118.
98. Iglesias V.A., Moscone E.A., Papp I. et al. Molecular and cytogenetic analyses of stably and unstably expressed transgene loci in tobacco // The Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1251-1264.
99. Ikeda K., Nakayashiki H., Kataoka T. et al. Repeat-induced point mutation (RIP) in Magnoporte grisea: implications for its sexual cycle in the natural field context // Molecular Microbiology. 2002. V. 45. P. 1355-1364.
100. Ingelbrecht I., Van Houdt H., Van Montagu M., Depicker A. Posttranscriptional silencing of reporter transgenes in tobacco correlates with DNA methylation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 10502-10506.
101. Jacobsen S.E., Sakai H, Finnegan E.J. et al. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis II Curr. Biol. 2000. V.10. P. 179-186.
102. Jakowitsch J., Papp I., Moscone E.A. et al. Molecular and cytogenetic characterization of a transgene locus that induces silencing and methylation of homologous promoters in trans // The Plant J. 1999. V.17. P. 131-140.
103. Jedelloh J.A., Bender J., Richards E.J. The DNA methylation locus Ddml is required for maintenance of gene silencing in Arabidopsis II Genes and Development. 1998. V. 12. P. 1714-1725.
104. Jedelloh J.A., Stokes T.L., Richards E.J. Maintenance of genomic methylation requires a SWI2/SNf2-like protein // Nat. Genet. 1999. V. 22. P. 94-96.
105. Jones J.D.G., Gilbert D.E., Grady K.L., Jorgensen R.A. T-DNA structure and gene expression in petunia plants transformed by Agrobacterium tumefaciens C58 derivatives // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 207. P. 478-485.
106. Jones P.A. Altering gene expression with 5-azacytidine // Cell. 1985. V. 40. P. 485486.
107. Jones C.G., Scothern G.P., Lycett G.W., Tucker G.A. The effect of chimeric transgene architecture on co-ordinate gene silencing // Planta. 1998. V. 204. P. 499-505.
108. Jorgensen R., Snyder C., Jones J.D.G. T-DNA is organized predominantly in inverted repeat structures in plants transformed with Agrobacterium tumefaciens C58 derivatives // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 207. P. 471-477.
109. Jorgensen R.A. Cosupression, flower color patterns, and metastable gene expression states // Science. 1995. V. 268. P. 686-691.
110. Jorgensen R.A., Cluster P.D., English J. et al Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences // Plant Mol. Biol. 1996. V. 31. P. 957973.
111. Joyce S.M., Cassels A., Jain M. Stress and aberrant phenotypes in vitro culture // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2003. V. 74. P. 103-121.
112. Kaeppler S., Kaeppler H., Rhee Y. Epigentic aspects of somaclonal variation in plants // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 17-188.
113. Kakutani Т., Jeddeloh J.A., Flowers S.K. et al Developmental abnormalities and epimutations associated with DNA hypomethylations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 12406-12411.
114. Kass S.U., Pruss D., Wolffe A.P. How does DNA methylation repress transcription? // Trends in Genetics. 1997. V. 13. P. 444-449.
115. Kohli A., Gahakwa D., Vain P. et al Transgene expression in rice engineered through particle bombardment: molecular factors controlling stable expression and transgene silencing // Planta. 1999. V. 208. P. 88-97.
116. Kilby N.J., Leyser H.M.O., Furner IJ. Promoter methylation and progressive transgene inactivation in Arabidopsis II Plant Mol. Biol. 1992. V. 20. P. 103-112.
117. Kjemtrup S., Sampson K.S., Peele C.G. et al Gene silencing from plant DNA carried by a geminivirus // Plant J. 1998. V. 14. P. 91-100.
118. Kloti A., He X., Potrykus I. et al Tissue-specific silencing of a transgene in rice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 10881-10886.
119. Koncz C., Martini N., Mayerhofer R. et al High-frequency T-DNA-mediated gene tagging in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 8467-8471.
120. Kovarik A., Van Houdt H., Holy A., Depicker A. Drug-induced hypomethylation of a posttranscritionally silenced transgene locus of tobacco leads to partial release of silencing // FEBS letters. 2000. V. 467. P. 47-51.
121. Kunz С., Schob H., Stam M. et al. Developmantally regulated silencing and reactivation of tobacco chitinase transgene expression // Plant J. 1996. V. 10. P. 437450.
122. Kumagai M.H., Donson J., Della-Cioppa G. et al. Cytoplasmic inhibition of carotenoid biosynthesis with virus-derived RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 1679-1683.
123. Kumar S, Fladung M. Transgene repeats in aspen: molecular characterization suggests simultaneous integration of independent T-DNAs into receptive hotspots in the host genome // Mol. Gen. Genet. 2000 a. V. 264. P. 20-28.
124. Kumar S., Fladung M. Determination of transgenic repeat formation and promoter • methylation in transgenic plants // Biotechniques. 2000 б. V. 28. P. 1128-1137.
125. Kumar S., Fladung M. Gene stability in transgenic aspen (Populus). II. Molecular characterization of variable expression of transgene in wild and hybrid aspen // Planta. 2001. V. 213. P. 731-740.
126. Kumpatla S.P., Hall T.C. Longevity of 5-azacytidine-mediated gene expression and re-establishment of silencing in transgenic rice // Plant Mol. Biol. 1998. V. 38. P. 11131122.
127. Kumpatla S.P, Chandrasekharan I.L., Iyer L.M. et al. Genome intruder scanning and Ф modulation systems and transgene silencing // Trends in Plant Science. 1998. V. 3. P.97.104.
128. Langridge W.H., Fitzgerald К J., Koncz C. et al. Dual promoter of Agrobacterium tumefaciens mannopine synthase genes is regulated by plant growth hormones // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P.3219-3223.
129. Lebel E.G., Masson J., Bogucki A., Paszkowski J. Stress-induced intrachromosomal recombination in plant somatic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 422-426.
130. Lechtenberg В., Schubert D., Forsbach A. et al. Neither inverted repeat T-DNA configurations nor arrangements of tandemly repeated transgenes are sufficient to trigger transgene silencing // Plant J. 2003 V. 34. P. 507-517.
131. Linn F., Heidmann I., Saedler H., Meyer P. Epigenetic changes in the expression of the maize Al gene in Petunia hybrida: role of numbers of integrated copies and state of methylation //Mol. Gen. Genet. 1990. V. 222. P. 329-336.
132. Luff В., Pawlowski L., Bender J. An inverted repeat triggers cytosine methylation of identical sequences in Arabidopsis II Molecular Cell. 1999. V. 3. P. 505-511.
133. Lyznik L.A., Hirayama L., Rao K.V. et al. Heat-inducible expression of FLP gene in maize cells // Plant J. 1995. V.8. P. 177-186.
134. Ma C., Mitra A. Intrinsic direct repeats generate consistent post-transcriptional gene silencing in tobacco // Plant J. 2002. V. 31. P.37-49.
135. Matzke M., Primig M., Trnovsky J., Matzke A. Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed plants // The EMBO J. 1989. V. 8. P. 643-649.
136. Matzke M. A., Matzke A.J.M. Gene interactions and epigenetic variation in transgenic plants // Developmental Genetics. 1990. V. 11. P. 214-223.
137. Matzke M. A., Matzke A.J.M. Differential inactivation and methylation of a transgene in plants by two suppressor loci containing homologous sequences // Plant Mol. Biol. 1991. V. 16. P. 821-830.
138. Matzke M.A., Neuhuber F., Matzke A.J.M. A variety of epistatic interactions can occur between partially homologous transgene loci brought together by sexual crossing II Mol. Gen. Genet. 1993. V. 236. P. 379-386.
139. Matzke A.J.M., Neuhuber F., Park Y-D et al. Homology-dependent gene silencing in transgenic plants: epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes// Mol. Gen. Genet. 1994 a. V. 244. P. 219-229.
140. Matzke M. A., Matzke A.J.M., Mittelsten Scheid O. Inactivation of repeated genes -DNA-DNA interection? // 1994 b. Paszkowsky J., ed., Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer, Dordrecht. The Netherlands. P. 271-307.
141. Matzke M.A., Matzke A.J.M. How and Why Do Plants Inactivate Homologous (Trans) genes // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 679-685.
142. Matzke M.A., Matzke M.J., Eggleston W.B. Paramutation and transgene silencing: a common response to invasive DNA? // Trends in plant science. 1996. V.l. P. 382-388.
143. Matzke A. J., Matzke M.A. Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes // Curr. Opin. Plant Biol. 1998. V.l. P. 142-148.
144. Matzke M.A., Mette M.F., Matzke A.J.M. Transgene silencing by the host genome defense: implications for the evolution of epigenetic control mechanisms in plants and vertebrates // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 401-415.
145. Matzke M.A, Mette M.F., Jakowitsch J. et al. A test for transvection in plants: DNA pairing may lead to trans-activation or silencing of complex heteroalleles in tabacco // Genetics. 2001. V. 158. P. 451-461.
146. Matzke M.A., Matzke A.J. Planting the seeds of a new paradigm // PLoS Biol. 2004. V. 2. P. 582-586.
147. Mannerlof M., Terming P. Variability of gene expression in transgenic tobacco // Euphytica. 1997. V. 98. P. 133-139.
148. Meng L., Bregitzer P., Zhang S., Lemaux P.G. Methylation of the exon/intron region in the Ubil promoter complex correlates with transgene silencing in barley // Plant Mol. Biol. 2003. V. 53. P. 327-340.
149. Maqbool S.B., Christou P. Multiple traits of a agronomic importance in transgenic indica rice plants: analysis of transgene integration patterns, expression levels and stability // Molecular Breeding. 1999. V. 5. P. 471-480.
150. Mayerhofer R., Koncz-Kalman Z., Nawrath C. et al. T-DNA integration: a mode of illegitimate recombination in plants // The EMBO J. 1991. V. 10. P. 697-704.
151. Mazodier P., Cossart P., Giraud E., Gasser F. Completion of the nucleotide sequence of the central region of Tn5 confirms the presence of three resistance genes // Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 195-205.
152. McCabe M., Mohapatra U.B., Debnath S.C. et al. Integration, expression and inheritance of two linked T-DNA marker genes in transgenic lettuce // Molecular Breeding. 1999. V. 5. P. 329-344.
153. Meins F. Jr. RNA degradation and models for post-transcriptional gene-silencing // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 261-273.
154. Mette M.F., van der Winden J., Matzke M. A., Matzke A.J.M. Production of aberrant promoter transcripts contributes to methylation and silencing of unlinked promoters in trans // The EMBO J. 1999. V. 18. P. 89-100.
155. Mette M.F., Aufsatz W., van der Winden J. et al. Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA // The EMBO J. 2000. V. 19. P. 5194-5201.
156. Metz P.L.J., Jacobsen E., Stiekema W.J. Occasional loss of expression of phosphinothricin tolerance in sexual offspring of transgenic oilseed rape (Brassica napus L.) // Euphitica. 1997. V. 98. P. 189-196.
157. Meyer P., Linn F., Heidmann I. et al. Endogenous and environmental factors influence 35S promoter methylation of a maize Al gene construct in transgenic petunia and its colour phenotype // Mol. Gen. Genet. 1992. V. 231. P. 345-352.
158. Meyer P., Heidmann I., Niedenhof I. Differences in DNA-methylation are associated with a paramutation phenomenon in transgenic petunia // The Plant Journal. 1993. V. 4. P. 89-100.
159. Meyer P., Niedenhof I., ten Lohuis M. Evidence for cytosine methylation of nonsymmetrical sequences in transgenic Petunia hybrida II The EMBO J. 1994. V. 13. P. 2084-2088.
160. Meyer P., Heidmann I. Epigenetic variants of a transgenic petunia line show # hypermethylation in transgene DNA: an indication for specific recognition of foreign
161. DNA in transgenic plants // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 243. P. 390-399.
162. Meyer P. Understanding and controlling transgene expression // TIBTECH. 1995. V. 13. P. 332-337.
163. Meyer P. Transcriptional transgene silencing and chromatin components // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 221-234.
164. Meza Т., Kamfjord D., Hakelien A-M. et al. The frequency of silencing in Arabidopsis thaliana varies highly between progeny of siblings and can be influenced by
165. Ф environmental factors // Transgenic Research. 2001. V. 10. P. 3-67.
166. Miki В., McHugh S. Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety // J. of Biotechnology. 2004. V. 107. P. 193-232.
167. Misquitta L., Paterson B.M. Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 1451-1456.
168. Mittelsten Scheid O., Paszkowsky J., Potrykus I. Reversible inactivation of a transgene in Arabidopsis thaliana II Mol. Gen. Genet. 1991. V. 228. P. 104-112.
169. Mittelsten Scheid О., Afsar К., Paszkowsky J. Gene inactivation in Arabidopsis thaliana is not accompanied by an accumulation of repeat-induced point mutations 11 Mol. Gen. Genet. 1994. V. 244. P. 325-330.
170. Mittelsten Scheid O., Afsar K., Paszkowsky J. Release of epigenetic gene silencing by trans-acting mutations in Arabidopsis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 632-637.
171. Mittelsten Scheid O., Paszkowsky J. Transcriptional gene silencing mutants // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 235-241.
172. Mittelsten Scheid O., Probst A.V., Afsar K., Paszkowsky J. Two regulatory levels of transcriptional gene silencing in Arabidopsis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 13659-13662.
173. Miura A., Yonebayashi S., Watanabe K. et al. Mobilization of transposons by a mutation abolishing full DNA methylation in Arabidopsis II Nature. 2001. V. 411. P. 212-214.
174. Mlynarova L., Hricova A., Loonen A., Nap J.P. The presence of a chromatin boundary appears to shield a transgene in tobacco from RNA silencing // Plant Cell. 2003. V.15. P. 2203-2217.
175. Morel J.B., Vaucheret H. Post-transcriptional gene silencing mutants // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 275-284.
176. Morel J.B., Mourrain P., Beclin C., Vaucheret H. DNA methylation and chromatin structure affect transcriptional and post-transcriptional transgene silencing in Arabidopsis II Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 1591-1594.
177. Morel J.B., Godon C., Mourrain P. et al. Fertile hypomorphic ARGONAUTE (agol) mutants impaired in post-transcriptional gene silencing and virus resistance // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 629-639.
178. Morino K., Olsen O.A., Shimamoto K. Silencing of an aleurone-specific gene in transgenic rice is caused by a rearranged transgene // Plant J. 1999. V. 17. P. 275-285.
179. Mourrain P., Beclin C., Elmavan T. et al. Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance // Cell. 2000. V. 101. P.533-542.
180. Mueller F., Gilbert J., Davenport G. et al. Homology-dependent resistance: transgenic virus resistance in plants related to homology-dependent gene silencing // Plant J. 1995. V. 7. P. 1001-1013.
181. Murfett J., Wang X.J., Hagen G., Guilfoyle TJ. Identification of Arabidopsis histone deacetylase HDA6 mutants that affect transgene expression // Plant Cell. 2001. V. 13. P. 1047-1061.
182. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Phisiol. Plant. 1962. V. 15. P.473-493.
183. Nacry P., Camilleri C., Courtail B. et al. Major chromosomal rearrangements induced by T-DNA transformation in Arabidopsis II Genetics. 1998. V.149. P. 641-650.
184. Nagy F., Kay S.A., Chua N.-H. Analysis of gene expression in transgenic plants // Plant Mol. Biol. Manual B4. Ed.: Gelvin S.B., Schilperoort R.A. Kluwer Academic Publishers. 1988. P. 1-29.
185. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans // Plant Cell. 1990. V.2. P. 279-289.
186. Neuhuber F., Park Y-D, Matzke A.J.M., Matzke M.A. Susceptibility of transgene loci to homology-dependent gene silencing // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 244. № 3. P. 230241.
187. Ngo H., Tschudi C., Gull K., Ullu E. Double-stranded RNA induces mRNA degradation in Trypanosoma brucei I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 14687-14692.
188. Novoselia T.V., Deineko E.V., Filipenko E.A., Shumnyi V.K. Expression stability of marker gene nptll in transgenic plants Nicotiana tobacum L. with single T-DNA insertion // Biotechnology and biotechnological equipment. 2001. V.15. N.2. P. 3-7.
189. Okamoto H., Hirochika H. Silencing of transposable elements in plants // TRENDS in Plant Science. 2001. V. 6. P. 527-533.
190. Opsahl M.L., McClenaghan M., Springbett A., et al. Multiple effects of genetic background on variegated transgene expression in mice // Genetics. 2002. V. 160. P. 1107-1112.
191. Palauqui J-C., Vaucheret H. Field trial analysis of nitrate reductase co-suppression: a comparative study of 38 combinations of transgene loci // Plant Mol. Biol. 1995. V. 29. P. 149-159.
192. Palauqui J.C., Elmayan Т., De Borne F.D. et al. Frequencies, timing, and spatial patterns of co-suppression of nitrate reductase and nitrite reductase in transgenic tobacco plants//Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 1447-1456.
193. Palauqui J-C., Elmayan Т., Pollien J.M., Vaucheret H. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions // The EMBO J. 1997. V. 16. P. 4738-4745.
194. Palauqui J.C., Vaucheret H. Transgenes are dispensable for the RNA degradation step of cosuppression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 9675-9680.
195. Pal-Bhadra M., Bhadra U., Birchler J.A. RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila II Mol Cell. 2002. V. 9. P. 315-327.
196. Park Y.-D., Papp I., Moscone E.A. et al. Gene silencing mediated by promoter homology occurs at the level of transcription and results in meiotically heritable alterations in methylation and gene activity // The Plant J. 1996. V. 9. P. 183-194.
197. Pawlowski W.P., Torbert K.A., Rines H.W., Somers D.A. Irregular patterns of transgene silencing in allohexaploid oat // Plant Mol. Biol. 1998. V. 38. P. 597-607.
198. Poethig S. Genetic mosaics and cell lineage analysis in plants // Trends in Genetics. 1989. V. 5. P. 273-277.
199. Potrykus I., Paszkowski J., Saul M. et al. Molecular and general genetics of a hybrid foreign gene introduced into tobacco by direct gene transfer // Mol. Gen. Genet. 1985. V. 199. P. 169-177.
200. Probst A.V., Fagard M., Proux F. et al. Arabidopsis histone deacetylase HDA6 is required for maintenance of transcriptional gene silencing and determines nuclear organization of rDNA repeats // Plant Cell. 2004. V. 16. P. 1021-1034
201. Prols F., Meyer P. The methylation patterns of chromosomal integration regions influence gene activity of transferred DNA in Petunia hybrida II Plant J. 1992. V. 2. P. 465-475.
202. Puchta H. Towards the ideal GMP: homologous recombination and marker gene excision // J. Plant Physiol. 2003. V.l60. P. 743-754.
203. Qin H., von Arnim A.G. Epigenetic history of an Arabidopsis trans-silencer locus and a text for relay of trans-silencing activity // BMS Plant Biology. 2002. V.2. P. 11-34.
204. Ratcliff F., Martin-Hernandez A.M., Baulcombe D.C. Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing //Plant J. 2001. V. 25. P. 237-245.
205. Reiss В., Schubert I., Kopchen K. et al. RecA stimulates sister chromatid exchange and the fidelity of double-strand break repair, but not gene targeting, in plants transformed by Agrobacterium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 33583363.
206. Romano N., Macino G. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences // Mol. Microbiol. 1992. V. 6. P. 3343-3353.
207. Rossi L., Hohn В., Tinland B. Integration of complete transferred DNA units is dependent on the activity of virulence E2 protein of Agrobacterium tumefaciens II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 126-130.
208. Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Mol. Biology. 1985. V.5. P. 69-76.
209. Rhounim L., Rossignol J.-L., Faugeron G. Epimutation of repeated genes in Ascobolus immersus II The EMBO J. 1992. V. 11. P. 4451-4457.
210. Rommens C.M., Humara J.M., Ye J. et al. Crop improvement through modification of the plant's own genome II Plant Physiol. 2004. V. 135. P. 421-431.
211. Ronemus M.J., Galbiati M., Ticknor C. et al. Demythylation-induced developmental pleiotropy in Arabidopsis II Science. 1996. V. 273. P. 654-657.
212. Rossignol J.L., Faugeron G. MIP: an epigenetic gene silencing process in Ascobolus immersus II Curr. Top Microbiol. Immunol. 1995. V. 197. P. 179-191.
213. Richards E.J. DNA methylation and plant development // Trends in Genetics. 1997. V. 13. P. 319-323.
214. Ruiz M.T., Voinnet O., Baulcombe D.C. Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing II Plant Cell. 1998. V. 10. P. 937-946.
215. Ruiz F., Vayssie L., Klotz C. et al. Homology-dependent gene silencing in Paramecium И Mol. Biol. Cell. 1998. V. 9. P. 931-943.
216. Sallaud C., Meynard D., van Boxtel J. et al. Highly efficient production and characterization of T-DNA plants for rice (Oryza sativa L.) functional genomics // Theor. Appl. Genet. 2003. V. 106. P. 1396-1408.
217. Sallaud C., Gay C., Larmande P. et al. High throughput T-DNA insertion mutagenesis in rice: a first step towards in silica reverse genetics // Plant J. 2004. V. 39. P. 450-464.
218. Salomon S., Puchta H. Capture of genomic and T-DNA sequences during double-strand break repair in somatic plant cells // The EMBO J. 1998. V. 17. P. 6086-6095.
219. Schmulling Т., Rohrig H. Gene silencing in transgenic tobacco hybrids: frequency of the event and visualization of somatic inactivation pattern // Mol. Gen. Genet. 1995. V. 249. P. 375-390.
220. Selker E.U. Premeiotic instability of repeated sequences in Neurospora crassa II Annu. Rev. Genet. 1990. V. 24. P. 579-613.
221. Selker E.U. Epigenetic phenomena in filamentous fungi: useful paradigms or repeat-induced confusion? // Trends Genet. 1997. V. 13. P. 296-301.
222. Selker E.U., Garrett P.W. DNA sequence duplications trigger gene inactivation in Neurospora crassa И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 6870-6874.
223. Seymour G.B., Fray R.G., Hill P., Tucker G.A. Down-regulation of two nonhomologous endogenous tomato genes with a single chimeric sense gene construct // Plant Mol. Biol. 1993. V. 23. P. 1-9.
224. Singer M.J., Selker E.U. Genetic and epigenetic inactivation of repetitive sequences in Neurospora crassa: RIP, DNA methylation, and quelling // Curr. Top Microbiol. Immunol. 1995. V. 197. P. 165-177.
225. Singer Т., Yordan C., Martienssen R.A. Robertson's Mutator transposons in A. thaliana are regulated by the chromatin-remodeling gene decrease in DNA methylation (Ddml) // Genes and Development. 2001. V. 15. P. 591-602.
226. Smith C.J., Watson C.F., Bird C.R. et al. Expression of a truncated tomato polygalacturonase gene inhibits expression of the endogenous gene in transgenic plants // Mol. Gen. Genet. 1990. V. 224. P. 477-481.
227. Smith H.A., Swaney S.L., Parks T.D. et al. Transgenic plant virus resistance mediated by untranslatable sense RNAs: expression, regulation, and fate of nonessential RNAs // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 1441-1453.
228. Soppe W.J., Jasencakova Z., Houben A. et al. DNA methylation controls histone H3 lysine 9 methylation and heterochromatin assembly in Arabidopsis II The EMBO J. 2002. V. 21. P. 6549-6559.
229. Srivastava V., Anderson O.D., Ow D.W. Single-copy transgenic wheat generated through the resolution of complex integration patterns // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 11117-11121.
230. Srivastava V., Ow D.W. Single -copy primary transformants of maize obtained through the co-introduction of a recombinase-expressing construct // Plant Mol. Biol. 2001. V. 46. P. 561-566.
231. Steimer A., Amedeo P., Afsar K. et al. Endogenous targets of transcriptional gene silencing in Arabidopsis II Plant Cell. 2000. V. 12. P. 1165-1178.
232. Stoutjesdijk P.A., Singh S.P., Liu Q. et al. RNA-mediated targeting of the Arabidopsis FAD2 gene gives highly efficient and stable silencing // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 1723-1731.
233. Svitashev S.K., Pawlowski W.P., Makarevitch I. et al. Complex transgene locus structures implicate multiple mechanisms for plant transgene rearrangement // Plant J. 2002. V. 32. P. 433-445.
234. Szabados L., Kovacs I., Oberschall A. et al. Distribution of 1000 sequenced T-DNA tags in the Arabidopsis genome // Plant J. 2000. V. 32. P. 233-242.
235. Tanzer M.M., Thompson W.F., Law M.D. et al. Characterization of post-transcriptionally suppressed transgene expression that confers resistance to tobacco etch virus infection in tobacco // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1411-1423.
236. Ten Lohuis M., Muller A., Heidmann I. et al. A repetitive DNA fragment carrying a hot spot for de novo DNA methylation enhances expression variegation in tobacco and petunia // The Plant J. 1995. V. 8. P. 919-932.
237. Thierry D., Vaucheret H. Sequence homology requirements for transcriptional silencing of 35S transgenes and post transcriptional silencing of nitrite reductase (trans)genes by the tobacco 271 locus // Plant Mol. Biol. 1996. V. 32. P. 1075-1083.
238. Tinland В., Hohn В., Puchta H. Agrobacterium tumefaciens transfers single-stranded transferred DNA (T-DNA) into the plant cell nucleus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 8000-8004.
239. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes // Trends in Plant Science. 1996. V. l.P. 178-183.
240. Todd J.J., Vodkin L.O. Duplications that suppress and deletions that restore expression from a chalcone synthase multigene family // The Plant Cell. 1996. V. 8. P. 687-699.
241. Ulian E.C., Magill J.M., Smith R.H. Expression and inheritance pattern of two foreign genes in petunia // Theor. Appl. Genet. 1994. V. 88. P. 433-440.
242. Vance V., Vaucheret H. RNA silencing in plants-defense and counterdefense // Science. 2001. V. 292. P. 2277-2280.
243. Van Blokland R., ten Lohuis M., Meyer P. Condensation of chromatin in transcriptional regions of an inactivated plant transgene: evidence for an active role of transcription in gene silencing // Mol. Gen. Genet. 1997. V. 257. P. 1-13.
244. Van Houdt H., Kovarik A., Van Montagu M., Depicker A. Cross-talk between posttranscriptionally silenced neomycin phosphotransferase II transgenes // FEBS Letters. 2000. V. 467. P. 41-46.
245. Vaucheret H. Promoter-dependent trans-inactivation in transgenic tobacco plants: kinetic aspects of gene silencing and gene reactivation // C.R. Acad. Sci. Paris. 1994. V.316. P.310-323.
246. Vaucheret H., Palauqui J.C., Elmayan Т., Moffatt B. Molecular and genetic analysis of nitrite reductase co-suppression in transgenic tobacco plants // Mol. Gen. Genet. 1995. V. 248. P. 311-317.
247. Vaucheret H., Nussaume L., Palauqui J.C. et al. A transcriptionally active state is required for post-transcriptional silencing (cosupression) of nitrate reductase host genes and transgenes // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1495-1504.
248. Vaucheret H., Elmayan Т., Thierry D. et al. Flank matrix attachment regions (MARs) from chicken, bean, yeast or tobacco do not prevent homology-dependent trans-silencing in transgenic tobacco plants // Mol. Gen. Genet. 1998. V. 259. P. 388-392.
249. Vaucheret H., Fagard M. Transcriptional gene silencing in plants: targets, inducers and regulators // Trends in genetics. 2001. V. 17. P. 29-35.
250. Vaucheret H., Beclin C., Fagard M. Post-transcriptional gene silencing in plants // J Cell Sci. 2001. V. 114. P. 3083-3091.
251. Vedova C.B.D., Cone K.C. Paramutation: the chromatin connection // The Plant Cell. 2004. V. 16. P. 1358-1364.
252. Voinnet O., Vain P., Angell S., Baulcombe D.C. Systemic spread of sequence-specific transgene RNA degradation in plants is initiated by localized introduction of ectopic promoterless DNA // Cell. 1998. V. 95. P. 177-187.
253. Vongs A., Kakutani Т., Martienssen R.A., Richards E.J. Arabidopsis thaliana DNA methylation mutants // Science. 1993. V. 260. P. 1926-1928.
254. Walter C., Broer I., Hillemann D., Puhler A. High frequency, heat treatment-induced inactivation of the phosphinothricin resistance gene in transgenic single cell suspension cultures of Medicago sativa II Mol. Gen. Genet. 1992. V. 235. P. 189-196.
255. Wang M-B., Waterhouse P.M. High-efficiency of a ^-glucuronidase gene in rice is correlated with repetitive transgene structure but is independent of DNA methylation // Plant Mol. Biol. 2000. V.43. P. 67-82.
256. Wassenegger M., Heimes S., Riedel L., Sanger H. RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants // Cell. 1994. V. 76. P. 567-576.
257. Wesley S.V., Helliwell C.A., Smith N.A. e/ al. Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants // Plant J. 2001. V. 27. P. 581-590.
258. Wianny F., Zernicka-Goetz M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development//Nat. Cell Biol. 2000. V. 2. P. 70-75.
259. Windels P., De Buck S., Van Bockstaele E. et al. T-DNA integration in Arabidopsis chromosomes. Presence and origin of filler DNA sequences // Plant Physiol. 2003. V. 133. P. 2061-2068.
260. Ye F., Singer E.R. RIGS (repeat-induced gene silencing) in Arabidopsis is not • transcriptional and alters chromatin configuration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996.1. V.93.P. 10881-10886.
261. Yoo B.-C., Kragler F., Varkonyi-Gasic E. et al. A systemic small RNA signaling system in plants // The Plant Cell. 2004. V. 16. P. 1979-2000.
262. Yu H., Kumar P.P. Post-transcriptional gene silencing in plants by RNA // Plant Cell Rep. 2003. V. 22. P. 167-174.
263. Zambryski P., Joos H., Genetello C. et al. Ti-plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity // The
264. Ф EMBO J. 1983. V. 2. P. 2143-2150.
265. Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B. et al. The bases of crown gall tumorgenesis // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 3885-3895.
266. Ziemienowicz A., Tinland В., Bryant J. et al. Plant enzymes but not Agrobacterium VirD2 mediate T-DNA ligation in vitro II Mol. Cell Biol. 2000. V. 20. P. 6317-6322.
267. Zupan J., Muth T.R., Draper O., Zambryski P. The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights // Plant J. 2000. V. 23. P. 11-28.Ш
-
Маренкова, Татьяна Владиславовна
-
кандидата биологических наук
-
Новосибирск, 2005
-
ВАК 03.00.15
- Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений
- Конструирование трансгенных растений Nicotiana tabacum, экспрессирующих ген дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis
- Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) и моркови (Daucus carota L.)
- Конститутивная и индуцибельная экспрессия генов экспансинов в трансгенных растениях табака
- Трансгенез PVYntn-CP геном белка оболочки Y вируса картофеля для создания вирусоустойчивых растений
