Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ассиметричные соматические гибриды между отдаленными видами семейства пасленовых

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Ассиметричные соматические гибриды между отдаленными видами семейства пасленовых"

АКАДЕМИЯ НЛУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи

ЗУБКО Елена Ивановка

(16У-2

УДК 575. 224+576. 5

АСИММЕТРИЧНЫЕ СОМАТИЧЕСКИЕ ГИБРИДЫ ЫЕВДУ ОТДАЛЕННЫМИ ВИДАМИ СЕМЕЙСТВА ПАСЛЕНОВЫХ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иккск - 1992

Работа выполнена в отделе цитофиэиологии и клеточной инженерии Института клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины.

Научный руководитель - академик АН Украины, доктор биологических

наук, профессор ГЛЕБА Ю. |й

Официальные оппоненты - доктор биологических наук ' ШИЛОВА А. а доктор биологических наук МАЛОТА С. 0.

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной биотехнологии

Защита состоится ¿гс^/ьеиЛ— 1992 г. в

*^час на заседании специализированного совета К 006.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических "наук в Институте генетики и цитологии АН Беларуси по адресу:220734, г.Минск, ул.Скоршш, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа. , •

Автореферат разослан " ^ " 1092 г...

Ученый секретарь

'1

специализированного совета К 006.02.01. , кандидат био- )

логических наук Е. В. Лобанок

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За 20 лет развития клеточной инженерии высших растений, основанной на слиянии изолированных протопластов, в этой области достигнуты значительные успехи: во многих отношениях -усовершенствована сама методология соматической гибридизации; у целого ряда культурных растений получены отдаленные гибриды, некоторые из них вовлечены в селекционные программы; установлены новые закономерности в функционировании ядерных и цитоплазматических генов у соматических гибридов {Глеба, Оытиик, 1934; Глеба, Зубко, 1988; Сидоров, 1Ö90). Однако имеется целый ряд нерешенных проблем, касающихся методологических и Фундаментальных аспектов клеточной инженерии. Наиболее важные из них связаны с: 1) преодолением морфогенетического несовершенства отдаленных соматических гибридов; 2) индукцией крайне асимметричных ядерных гибридов; 3) недостаточной изученностью генетической и молекулярно-биологической основы некоторых новых признаков, прежде всего возникающих в связи с перекосом и реконструкцией генов цитоплазмы; 4) непредсказуемым характером экспрессии генетического материала б гибридных клетках.

На данном этапе любой положительный вклад в решение упомянутых проблем мог бы обогатить возможности соматической гибриди-вации растений как технологии и, в частности, способствовать ее превращению в биотехнологическую отрасль.

На основании анализа литературных данных, оценки конкретных научных программ института и некоторых прогнозов мы сформулировали проект, который сочетает в себе возможность решения ряда теоретических и прикладных задач на единой экспериментальной основе. В связи о этим нами разработана схема, предполагающая конструирование отдаленных неполовых гибридов между видами, являвшимися, с одной стороны, модельными объектами (Nicottana tabacum), ас другой - объектами, имеющими-важное значение для фармакологической промышленности как сырье 'для производства тро-, Пановых алкалоидов (Hyoscyanus nlgot-, Н. aureus, Atropa belladonna, Scopolia carniolica).

Цель И задачи исследования. В настоящем исследовании предполагалось осуществление синтетического подхода, основанного на использовании методов мутагенеза, генетической трансформации и соматической гибридизации, - для создания межтрибных асимметричных гибридов и дальнейшего исследования их генетической конституции и морфофункциональкых особенностей.

Предусмотрено решение.следующих задач:

- о _

1) получение маркерных линий растений с помощью радиационного мутагенеза и генетической трансформации;

2} использование мутантных (Nícotiana tabacum L. , Solanum tuberosum L.), трансгенных (Atropa belladonna LJ, а также pa— тений дикого типа (Hycscyanus ni ge г L., H. aureus L., Atropa belladonna L., Scopol i a earn i ol lea J acq.) для конструирования асимметричных гибридов с помощью слияния протопластов; • 3) биохимический, цитологический и молекулярно-биологичеекк] анализ гибридных форм;

4) испытания б условиях открытого грунта о целью изучения морфофункциональных особенностей и наследования некоторых новых признаков у траксгеномных растений.

Научная новизна. Впервые показано восстановление пролифера ттаного и морфогенетического потенциала "гамма-проростков" in vitro, и продемонстрирована высокая-эффективность зтого подход для экспериментального мутагенеза растений.

Впервые сконструированы высокоасимметричные соматические гибриды и "гамма-гибриды" в комбинациях И i со tí ana tahecum Atropa belladonna, N. tab&cum + Hvoscyaitus niger, N. tabacurn + H. aureus, N. tabacum + Scopol ia cai'niol i ca. A. belladonna'. + Solanum tuberosum.

Впервые показан перенос небольшой части видсспецифической донорной ДНК мезду видами, относящимися к различным трибам (№ tabacum + A. belladonna).

Впервые получено плодовитое потомство от гибридных растений с крайней степенью редукции цветковых органов (пыльников и венчика) и показано, что они представляют собой новый морфологический тип цитоплааматической мужской стерильности.

Нрактиче^сая ценность. Предлохэиная нами технология индукции мутаций, основанная на восстановлении жизнеспособности "гамма-проростков" in vitro, позволяет значительно (в 3-10 раз) повысить предельные дозы гамма-облучения, применяемые в практике радиационного мутагенеза, и таким образом существенно" увеличит! частоту и, видимо, разнообразие мутаций.

рллуцированчые и изученные в генетическом отношении мутант -ные растения табака могут представлять специальный практически; интерес как маркерный материал для дальнейших клеточно-инжэнер-ньк экспериментов.

Полученные гибридные растения представляют собой зкачитель-

ныл интэрес для физиологических, биохимических, генетических, молекулярно-бпологических и биотехнслогичес-ких исследований. гса-саюшихся: эффективности фотосинтеза t в связи с переносом и -экспрессией ренетического материала пластид и митохондрий); особенностей процессов дыхания (в связи с переносом и реконструкцией митохондриона); наследования новыч признаков, явиешихся ревуль-татом отдаленной гибридизации (включая новые типы морфологии листа и цветка); экспрессии, наследования, сегрегации и возможной рекомбинации видоспецифического генного материала доноров у гибридных растений; качественных и количественных изменений биосинтеза вторичных метаболитов (в частности, тронаковых алкалоидов). и др.

Апробация рзботы. Материалы диссертационной работы докледы-вались и обсуждались на VII Международном конгрессе "Культура клеток и тканей растений" (Амстердам, Нидерланды, 1930), I Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущи-но, 1991),а также на научных семинарах отдела патофизиологии и клеточной инженерии Института клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины.

Публикации. Основные результаты диссертации отражены в дести печатных работах, список которых приводится в койне автореферата.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения , глав "Обзор литературы", "Материалы и методы исследований", "Экспериментальная часть", "Обсуждение порученных результатов", выводов и списка использованной литературы, включающего 165 названий, из которых 130 - иностранные. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 25 рисунков, включаших 57 фотографий.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЙ

Растительный материал, использованный'з работе. '

1) семена Nicotiana tabacum L., сорт Лехия, полученные после Самоопыления;

2) асептические растения N. tabacum 1„. андрогенетичес-ких гаплоидных линий 773-4р-4 и 773- 4р- Z (лкбеьно предоставлены Г. В. Неманом, Всесоюзный НИИ табака и махорки, г. Краснадар!;

3) асептические растения двойного мутанта N. tatacum L. DSR А15, сочетающего пластомные мутации хлорофиллдэфектностн и ус-

уойчивости к стрептомицину (Svab, Mal i pa, 1985);

4iасептические растения ядерного,хлорофиллдефектного мутанта ti, tabacum L. , линия ФМ, полученная наш в результате облучения протопластов гаплоидного табака линии 773-4р-4 в дозе 20 Грей;

5)мутантные растения N. tabacum L. , линия R-lOOal, полученная нами после облучения семян табака (сорт Лехия) в дозе 1000 Грай.

6) клеточная линия Solanum tuberosum L. (2003 ), полученная, нами из "гамма"-проростков , после облучения семян в дозе 200 Грей;

7)асептические растения Atroppa belladonna L. , дикий тип, происходят из семян красавки (Берлин, ФРГ);

8)асептические растения Scopol i a carniollca Jacq., дикий тип, происходят из семян сиополии ( Ротердам, Нидерланды);

9)асептические растения белены чеонсй, получены из семян Hyoscyams ni ge г L. , (Марбург, ФРГ);

. 10)асептические растения Atropa belladonna L. , линия 100-01 полученная нами после облучения семян красавки в дозе 1000 Грей;

11)асептические растения Atropa belladonna L. , линия-A4, полу ченная наш после трансформации красавки Agrobacterlum rhlzoger.es, штамм A4;

.12) асептические растения Hyoscyams aureus L. , дикий тип происходят на семяк (Марбург, ФРГ);

13)асептические растения ¡lyoscyairüs albas L, дикий тип, происходят из семян (Марбург, ФРГ);

Протопласты выделяли из асептически выращиваемых растений по методикам, разработанным в Институте клеточкой биологии и генетической инженерии с незначительными изменениями (Сидоров и др. , 1685; Зубко И др. , 1991). __

Слияние протопластов проводили в пробирке по модифицированной методике Мекцеля (Ivfenczel et al. , 1Q81, Зубко и др. ,1991).

Гамма-облучение протопластов донорных видов в дозах 200 и 300 Грей проводили на установке "Исследователь", используя в качестве источника облучения Со60 с удельной активностью 10 Грей/.vnH.

Продукты слияния культивировали на среде SW (Sidorov et al. , 1987).

Поскольку среди партнеров по слияниям всегда были протопласты хлорофиллдефектной линии табака, гибридные колонии идентифицировали по восстановлению у них способности к биосинтезу хло-

рофилла

для индукции морфогенеза использовались главным образок; среды Дж. Шгпарда (Shepard, 1.980, Сидоров и др., 1985). Регенерированные побеги укореняли на среде НС без фитогормснсв.

Мутагенез семян и протопластов проводили с использованием гамма-облучения.

Цитологический и биохимический анализы проводили г.о -методикам, применяемым в Институте клеточной биологии и генетической инженерии (Биохимический анализ в клеточной биолог;-,к растений -Киев^ -1988. -Препринт/АН УССР, Институт ботаники: вЗ. 1 j;

Влот-гибридизацию по Саузерну проводили согласно общепринятой методике (Маниатие, 1964 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение маркерных линий растений. Поскольку для опытов по соматической гибридизации необходимы генетические маркеры, первой налей задачей было получение маркерных мутантов и трансгенных растений.

1.1. Радиационный мутагенез.' Для облучения использованы семена табака, красар га; if картофеля, а также протопласты табака гаплоидной линии. Гамма-облучение семян вызывает главным образом геномные мутации. Частота мутирования пропорциональна дезе облучения, однако, при повышении Дозы наблюдают так называемый эффект максимума, т.е. снижение частоты мутаций за счет гибели проростков, накопивших много летальных мутаций (СоЭДер, 1969; Гродзинский, 1983). Эффект максимума обусловливает различные предельные дозы для разных видов растений. Б этом состоит основное' ограниченна для повышения частоты мутагенеза, а, следовательно, для получения новых, редких мутаятбв. Ham: исследования показали, что, в определенных условиях асептической культуры. га.чыа-проростки могут быть "спасены" и восстановлены до клеточных линий или растений (Зубко и др., 1990).

За счет восстановления жизнеспособности гамма-проростйов in vitro значительно повышается верхний предел применяемых доа облучения и, следовательно, возрастает частота к, по-видимому, диапазон мутагенеза. В частности, возникает значительно больше ци-топлазыатических мутантов.

Из семян, облученных в дозах, полностью подавляющих развитие в почве, в-культуре in vitro образуется значительное коли-

- б -

честЕО растений (для удобства будем'называть их гамма-растениями). Практически все укорененные in vitro гамма-растения способны к дальнейшему развитию в почве. Многие из них мутантные, что выражается в пестролнстиости и стерильности. Частота проявления мутаций у гамма-растений значительно выше, чем у растений, облученных в 'дозах, максимально допустимых для почвенных условий (табл. 1).

Таблица 1. Выживаемость гамма-облученных семян в почве и асептической культуре (%.).

Лова облучения (Грей)

Объект контроль 100 250 500 1000 5000

пкпкпкпкпк ПК

Nicottapa

tabacum 95 98 86 93 30 82 0 47 0 0

Solanum

tuberosum 92 94 0 26 0 .14

п - почва; к - асептическая культура.

При работе с небольшой выборкой восстановленных гамма-проростков (около 10Q) удалось индуцировать ряд пестролистных растений, отличающихся по степени пестролистности и окраске секторов. ГЬоле их самоопыления у потомства первого поколения также проявлялась пестролистность, что свидетельствует о цитоплазмати-ческом контроле хлорофиллдефектности этих мутантов. Одно пестролистное растение (R-100) оказалось сложной химерой, при черенковании которой выщепшшсь растения с разной окраской: желтой, светло-зеленой, белой и зеленой (последние представляют собой дикий, тип). Белые растения (RIOOal) использованы в дальнейших опытах.

После облучения семян картофеля в дозе 200 Грей получены кадлусные мутантные линии с конститутивным биосинтезом антоциа-нов (Зубко и др. , 1ÖS0). Одна из них использована нами для соматической гибридизации с красавкой (см. ниже).

В другой серии опытов по мутагенезу протопласты гаплоидной

линии табака 773-4р-4 подвергали облучению в доге 20 Грей и культивировали до получения протоклонов. Среди них отобраны хло-рофиллдеФектные линии (ЗуСко и др..1991). Один из мутантов - Ш (типа альбина) - использован в работе.

1.2. Комплементационный анализ мутантов. fe подвергли мутанты R100?.1. и комплементационному анализу на основе слияния протопластов - с целью установления генетического контроля кх , хлорофиллдефектности. что немаловажно для трактовки опытов по соматической гибридизации. Этот подход успешно применяется, когда нет возможности, провести классический генетический анализ (Глеба, Сытник, 19В4; Сидоров и др., 1987.). В качестве тестера нами использован пластомньЯ хлорофиллдефектный мутант табака,' линия DSR Al5. Факт комплементации при слиянии протопластов СМ и DSR Al5 (частота 3,6 %) свидетельствует о геномном контроле хлорофиллдефектности у ÎM. Отрицательный комплементационный тест после слияния с протопластами мутанта DSR А15 доказывает плас-тсмную природу мутанта RlOOal.

1.3. Трансформация красавки с помощью Agrobacterium rht zöge nés. Из "бооодатых корней", индуцированных после кокуль-тивирования листовой ткани красавки с 4. rhizogenes, штамм A4, регенерированы трансгенные растения, обладавшие характерными признаками синдрома "бородатого корня" (гофрированная листовая пластинка, укороченные междоузлия, очень хорошо развитая корневая система).

2. Конструирование отдаленных асимметричных гибридов.

Свою работу по соматической гибридизации мы планировали таким образом, чтобы: 1) сконструировать ряд асимметрических гибридов, характеризующихся как можно более широким диапазоном генетического разнообразия; 2) иметь возможность генетического и юлекулярно-биологического изучения этого разнообразия; S) на основе использования альтернативных гибридных признаков создать модели, .позволявшие исследовать на генетико-молекулярном уровне некоторые вопросы биологии развития и экспрессии генов; 4) выяс- -нить зозможные пути дальнейшего использования полученных гибридов в биотехнологических разработках.

Прежде всего, мы исходили из предположения, что примс-иение различных вариантов разбалансирования генома могет повлечь за собой значительные сдвиги в генет.г^ской конституции /иСр'/Т.в. Поэтому в опыты вовлечены мутан'аше "гамма-;астеп::п", пелученккн

после восстановления гамма-проростков in ?itro. С другой стороны, в части опытов донорные протопласты (А belladonna' и Я aureus) также подвергали 'f облучению непосредственно перед слиянием, что традиционно практикуется для асимметризации гибридов. В-третьих, в одном из опитов использовали донорные растения красавки, предварительно трансформированные A. vhi zogems. Некоторая функциональная разбалансированность этих растений выражается в иаыененки экспрессии генов (синдром "бородатого корня"), нарушении гормонального баланса и наличии в их генома интегрированной чужеродной т-ДНК. В-четвертых, в одном из опытов (красавка + гартофель) использована неморфогенная линия картофеля с нарушенной регуляцией биосинтеза антоцианоз, что выражается в конституционном сверхсинтезе этих пигментов. Таким образом, в опытах применены линии растений, геном которых ь той или иной степени был подвергнут определенной генетической разбалансировке, так как изначально предполагалось, что это приведет к расширению спектра изменчивости гибридов. Дополнительным источником разнообразия был также выбор достаточно различающихся видов растений из разных родов. Схема комбинаций по слиянию включала следующие пары родительских видов: Л', tabacum + А. belíadonna, N. tabacuя +fí. niцвг , N. tabacum + iL aureus, N. tabacum + H. albus, N. tabacum S. carnlol i es, A. belladonna+S: tuberosum.

2.1. Гибриды табак+красавка. E данной комбинации видов проведено две серки экспериментов:

1) N. tabacum RIOOal + А.. belladonna 100-01 ("гамыа-расте- . ния" красавки, восстановленные после облучения семян в дозе 10СК Грей; протопласты перед слиянием не облучали);

2) N. tabacum RIOOal + A. belladonna A4 (линия красавки, , трансформированная Agrobaetsrium rhízogenes; протопласты ее об. 1 хучали перед слиянием в дозе 200 Грей).

В первом эксперименте было отобрано 14 зеленых гибридных колоний (протопласты красавки неспособны к делению на применяемой среде.). Три из них были неспособны к регенерации стеблей. Из il регенерировавших линий три образовали полностью функциональные растения (I группа растений), стебли остальных 8 оказались неспособными к укоренению (П группа растений). Обе группы гибридов демонстрируют выраженную вариабельность по фенотипу. Гибриды первой группы (Rab2-1, Rab4, Rabil) в течение двух сезонов зыоажиБапксь в почву и были доведены до цветения. В полевых уело-

виях эти гибриды отличаются между собой. Различия в первую очередь касаются строения листовой пластинки и цветка Гибрид Rab4 напоминает табак с нормальным строением цветка, однако при этом образуется очень .мало пыльцы. При самоопылении этой линии нам не удалось получить семян. Гибриды Rabil имеют измененные листовые пластинки, листья темно-зеленого цвета, жесткие, форма отличается от таковой табака. Растения этой линии выщ&пляют фенотипичес-ки различные формы как в культуре in vitro, так и б полевых условиях . Темно-зеленые растения (сублиния Rabllm) отличается мясистой консистенцией листьев, верхушки которых слегка рассечены. Растения не цветут. В культуре in vitro у этой линии на среде MJ, лишенкой фитогормонов, можно часто наблюдать зеленеющие корни (признак красавки). Гибриды сублинии Rabll-2 (регенеранты из того же клона) морфологически походят на табак, нормально цветут и при самоопылении завязывают немного семян. Растения серии Rab2-1 имеют измененное строение цветка в котором пыльники частично превращены в лепестки. При опылении цветков пыльцой N. tabacum завязывались семена. Шслв поверхносной стерилизации их всхожесть in у i tro составляла около 3 %. Гибриды II группы также фенотипически отличаются между собой.

Онтологически у гибридов I группы показано наличие единичных хромосом красавки (1 - 3), отличающихся малыми размерами по сравнению <: хромосомами табака.

Для выявления возможных причин стерильности одного из гибридов I группы (Rab4); который имел нормальные цветки, но оказался стерильным при самоопылении, исследовали его мейоз. Наиболее неожиданным результатом было обнаружение транслокационных колец, в образование которых вовлечены практически все хромосомы в метафазе I. Для "гамма-растений" табака подобные структуры не обнаружены. Появление хромосомных колец, описанных для некоторых видов Oenothera, Rhoeo discolor И др., связывают с реципрокными транслокациями (Суонсон и др.ч19б9). Обнаружено также забегание хромосом," образование мультивалентов и множественных мостов. По-видймому, эти особенности мейоэа отражают повышенную транслокационную активность, а также несбалансированность генома изучаемых гибридов.

Изучение активности эстераэ, амилаз и аепартаташнотрансфе-раз показало наличие только отдельных полос донора у гибридов I

группы, преимущественно гибриды содержат неизмененный спектр ферментов, характерный для табака. У двух гибридов обнаружена новые полосы амилазы, не свойственные для родительских форм. Гибриды II группы характеризуются суммарным набором изофермэнтоз зстеразы по отношению к обоим родителям. Наборы амилаз у них соответствуют таковым у табака.

Таш* образом, анализы морфологии, хромосом и множественных молекулярных форм ферментов, показывают, что все изученные гибриды являются асимметричными в разной степени.

Блот-гибридизадаей по Саузерку с применением в качестве зонда плазмиды pHRS 60.1 (содержит кластерированный повтор ДНК табака в плазмиде pUClQ) установлено, что рб'С-компонент этой плазмиды гибридизуется с геномной ДНК красавки и coi.ce» не гибридизует-ся с ДНК табака Для гибрида Rab2-1 показан перенос видосг.ецифи-чесюэй ДНК красавки, гибридизуюшейся с плазмидой pUClQ (рис.1).

• Качественные и количественные различия обнаружены также в спектрах белков теплового шока. В спектре белков линии Rab-5 присутствуют полосы, не свойственные ни одному из родителей. Они могут быть либо результатом экспрессии совершенно новых белков (на рекомбинантной основе), либо следствием дерепрессии определенных генов в гибридном геноме.

рестрикция хлДНК свидетельствует о том, что гибридные растения наследуют пластиды А. belladonna.

Результаты блот-гибридизационного анализа мт-ДНК с применением в качестве зонда последовательности генов цитохромсксидазы • согласуются с выводом о том, что мт-ДНК изучаемых гибридов происходит от табака, хотя рестрикционные спектры ее свидетельствуют о наличии перестроек (рис. 2.).

Во втором эксперименте было отобрано 16 гибридных клонов, отличающихся между собой по регенерационкой способности. К настоящему времени растения регенерированы у 8 линий.

Растения двух из них оказались фертильными в полевых условиях, хотя завязывают немного семян (несколько десятков на коробочку) . Четыре линии характеризуется несколько замедленным ростом в куль'сре in vitro и измененной формой листа (заостренной листовой пластинкой). Две гибридные линии (5R20-3 и 20-4) образует корни, способные к автономному росту на средах, лишенных фито-горыонов. Интересно, что фенотипически эти две линии гибридных "бородатых-корней" резко отличаются особенностями своего разви-

m®

-a.4 -1.9

-1.0

. 1 2 3 4 6

Рис. 1. Авторадиоавтограф ДНК-ДНК гибридизации Eco RI-фрагментов геномной ДНК гибридов о плазмидой pUC 19, специфически гибридиэ ушейся с ядерной ДНК красавки: 1 - N. tabacum, 2 - Al belladonna, 3-5 - гибриды N. taba-curo +■ A. belladoma.

1 2 3 4 5

Рис. 2. Авторадиоавтограф ДНК-ДНК гибридизации Bam HI-фрагментов митохондриальной ДНК с фрагментами гена цитох-ромоксидазы (оох I): 1,2,3 -гибриды N. tabacum +■ A. belladonna, 4 - A.belladonna, 5 -N. tabacum.

' Рис. 3. Авторадиоавтограф ДНК-ДНК гибридизации Bam HI-^ фрагментов митохондриальной

ДНК с фрагментами гена цй-v, тохромоксидазы (сох I): 1 -И. tafcacum, 2 - Н. nicer, 3,4 две фенотипически различные сублинии гибридного клона Rhn-1 (N. tabacum + Н. nlger), 5 - гибрид Rhn-3 (та ке ^ комбинация), б - Drhn-5x -

12 3 4 5 в (гибрид Rhn-1 + N. tabacum

DSR А15).

О

тия, несмотря на то, что являются выражением признаков донора с одним и тем кз генотипом. Среди растений этих линий есть формы, наследующие "синдром бородатого корня" - гофрированные листья, присущие донорному генотипу красавки. У трех линий имеет место синтез антоцианов в листьях - признак, кодируемый геномом красавки.

Результаты биохимического анализа указывают на .гибридную природу полученных линий. Б частности, спектры изоферментов зс-тераэ у проанализированных гибридов значительно отличаются от • таковых табака и содержат некоторые полосы активности, свойственные красавке. В то же время, эти гибриды обнаруживают спектр активности аспартатаминотрансфераз, идентичный спектру табака. .Спектры БТШ, определенные для гибридных линий 5R20-3 и 20-4 отличаются от наборов БТШ у гибридов группы Rab наличием дополнительной полосы от красавки. Эти данные указывает на асимметричную природу полученных гибридов.

2.2. Гибриды N. tabacum + Н. Шуе г. У 3 гибридов (Rhnl, Rhn2, RIin3), полученых в этой комбинации, особенно выражен фено-типический контраст в строении и окраске листовой пластинки и морфологии цветковых структур по сравнению с гибридами других комбинаций. Растения отличаются загнутостью листовых краев к верху и пожелтением молодых листьев. Листовые пластинки узкие, а Черешки как таковые отсутствует, ибо листовая пластинка, постепенно сужаясь, доходит практически до стебля, будучи морфологически промежуточной между черешковым и. сидячим типом. Это пос- . леднее обстоятельство интересно в свяеи с тем, что у родительской формы табака черешковый тип листа. Отношение длины листоьой пластинки к ширине у гибридов Rhn составляет около 3, тогда как для табака оно равно 1.7. Растения гибридных линий Rhnl и ЙппЗ -невысокого роста, сильно кустятся, у них цветки веленой окраски, с полной редукцией,венчика и пыльников, имеют нестолько сросшихся пестиков (от 2 до 8), Растения Rhn2 имеют цветки типа табака, но лишенные окраски, часть пыльников преобразована в лепестки. При опылении растений Rhn2 пыльцой табака дикого типа нам удалось получлть жизнеспособные семена Fl.

Анализы множественных молекулярных форм ферментов у данной серии гибридов показали лишь незначительные изменения в спектрах активности эстераа, которые выражаются в наличии отдельных полос, не характерных для табака.

Методом блот-гибридизации по Сауэерну с радисактивномечен-ной плаамидной ДНК, содержащей кодирующий участок рибосомальной ДНК из Citrus limn в качестве зонда, показано наличие у гибридов лишь видоспецифических полос табака.

Рестрикционный анализ пластидной ДНК, проведенный с использованием рестриктаз Hind HI и Ват Ш, показал, что все они наследуют пластиды Н. nies г.

С помощью рестрикционного анализа . и блот-гибридизации с примененением в качестве зонда последовательности гена цитохро-моксидазы (СОХ 1), клонированной в плазмиде pBR 322, доказано, что mi-ДНК гибридов Rhn-1, Rhn-2 и Rhn-З происходит от Н. niger, хотя частично реконструирована (рис. 3). Интересно, что рестрик-ционные спектры Rhnl и Rhnl-2 существенно отличаются, хотя эти гибриды являются растениями одного и того же клона (сублиния Rhnl-2 выделилась как обладающая новым фенотипом при вегетативном размножении линии Rhnl). Отсюда следует, что перестройки мт-ДНК могут иметь место не только в процессе образования гибридных клеток и их первых делений, но и на уровне взрослых гибридных растений.

С целью изучения наследования формы цветка и листа у гибрида Rhnl, мы перенесли его цитоплазму с помощью " гамма-слияния" в пластсмный хлорофиллдефектный мутант табака DSR-A15. По-край-ней мере, некоторые из регенерированных цибридов наследует морфологию листа и цветков типа Rhnl. Это свидетельствует о том, что г.истиллоидные цветки и синдром пожелтения листьев являются результатом переноса цитоплазмы.

2.3. Гибриды N. tabacum + S. carnloltca. В данной комбинации отобрано 7 гибридных клонов, один из которых неморфогенный, хотя и характеризуется активным ростом. Остальные б линий доведены до функциональных растений. В полевых условиях они обнаруживают . значительное разнообразие морфологии листьев и цветков. Гибриды линии Rsc6 значительно ниже растений летальных линий и отличаются как от табака, так и других гибридов данной комбинации по морфологии листовой пластинки. У них узкие и мелкие листья. У одрой линии (Rsc4) обнаружен '''махровый" тип цветка, в котором все пыльники превращены в лепестки (петаллоидный тип). Гибриды Rscl, Rsc3, Rsc6, Rsc7 имеют цветки без лепестков и тычинок, наподобие тех, что описаны у гибридов табак + Селена (см. выше),

Хромосомные наборы гибридов Rsc отличается количественно (у Rscl - 48-50 хромосом, у Rsc6 - БО-57). Одна линия - шксоплоид:,

Анализ множественных молекулярных форм эстеразы и амилазы обнаружил спектры изоферментов, идентичные таковым у табака.

Изучение рДНК методом блот-гибридизации по Саузерну показало наличие у гибридов лишь видоспецифических полос табака.

Анализ белков тилакоидных мембран хлоропластов (проведен совместно с JL Ковлер) показал наличке у не;соторых гибридов белка, характерного для скополии, по отсутствующего у других гибридов с хлоропластами скополии, что может свидетельствовать о ядерном наследовании данного белка, поскольку известно, что часть белков тилакоидных мембран кодируется геномом.

Все растения Rsc наследует пластиды донорного вида S. carniolica, что подтверждено анализом хл-ДНК после гидролиза рестриктавой Ваш HI.

Блот-гибридизацией мт-ДНК гибридов 1, 4 и 6 при использовании в качестве зонда последовательности COXL показано, что данный участок мт-ДНК гибридов происходит от табакз. Это неожиданный факт наряду с наличием цветков типа табака у гибридов Rhn-2 (табак + черная Селена)" позволяет предположить, что синдром "зеленого цветка" контролируется не всей митохондриальной ДНК белены или скополии, а лишь ее определенной частью, которая может быть рекомбинирована с мт-ДНК реципиента, но не обнаруживаться с помощью используемых зондов.

После опыления гибридов Rsc пыльцой табака дикого типа оказалось, . что "зеленый цветок" является фертильным по материнской линии, т.е. дает жизнеспособные семена. Шскольку предыдущими опытами показано цитоплазматическое наследование "зеленого цветка" (см. стр.13), можно заключить, что данный признак является формой цитоплазматической мужской стерильности и может наследоваться независимо от признака "желтого листа" ( по-крайнеП мере, при.соматической гибридизации).

2.4. Гибриды N. tabacum + И. aureus. В настоящее время из 33 гибридных клонов получено 15 морфологически функциональных растений. Некоторые из них были высажены в поле и доведены до стадии цветения. Они походят на табак. Цветки имеют крупный пестик, рыльце пестика - 3-4 лопастное. Пыльники частично преобра-аованы в лепестки, некоторые из них нормальные и содержат незна- . чительное количество пыльцы. Среди полевых растений есть фер-тилъные самоопыляющееся линии, другие линии, опыляемые табаком также образуют семена. Изоферментные спектры амилаз и аспартата-

минотрансфераз у проанализированных линий - .типа табака. Полосы активности эстерзз отличаются от табачных, у некоторых линий обнаружены полосы, свойственные для И. aureus.

2.5. Гибриды A. belladonna + S. tuberosum Система селекции в данном случае основывалась на физиологической комплементации -мезофильные протопласты красавки не делились, а используемая каллусная линия картофеля не способна к морфогенезу и характеризуется сверхсинтегом антоциандв. Последнее обстоятельство позволило визуально установить, что именно гибридные клетки, сочетавшие зеленую (хлорофилл) и розово-фиолетовую (антоциан) окраску, имели преимущество в скорости образования микрокслоний. В целом гибриды (13 линий) яохожи на красавку, однако между ними имеются фенотипические различия. Растения цветут, однако плодов не образуют. Только у одной линии завязались плоды после самоопыления.

Количество хрс!мосом у некоторых линий соответствует ' около-тетраплоидному набору, некоторые линии анеуплоидные (от 30 до 100 и более хромосом).

Все проанализированные линии имеют измененный спектр активности эсгераз; некоторые из них содержат одну полосу, свойственную для картофеля и две новые.

Полученные наш ядерные гибридные линии, таким образом, представляют собой в разной степени асимметричные формы, содержащие наряду с геномом табака также небольшую чагть ядерного генетического материала красавки, черной и желтой белены, скопо-лии, а также асимметричные гибриды, сочетающие геном красавки с небольшим количеством ядерного материала картофеля.

ВЫВОДЫ

1. Предложена эффективная технология радиационного мутагенеза, основанная на восстановлении жизнеспособности гамма-проростков .mi vitro и позволяющая, использование более высоких доз облучения. '

2. Получен ряд новых пигментных и дефектных в отношении морфогенеза мутантов табака; представляющих интерес для использования их в качестве генетических маркеров при соматической гибридизации.

3. Сконструированы Фертильные высокоасимметричные соматические гибриды и "гамма-гибриды" в комбинациях отдаленных видов:

Nicotiana tabacum + Atropa belladonna, Nicotiana tabacum + Hyoscyarrus niger, Nicotiana tabacun, + Hyoscyams aureus, Nicotiana tabacum + Scopol ta carniolica, Atropa belladonna + Solanum tuberosum.

4. С помошыо цитогенетического, биохимического и молекуляр-но-биологического анализов показано, что полученные, гибриды обладают широким диапазоном генетического разнообразия. Среди них - асимметричные ядерные гибриды и гибриды, реконструированные по цитоплазме.

5. В отдаленных комбинациях Nicotiana tabacum Hyoscyanvs niger, Nicotlana tabacum + Scopol la carniolica показано возникновение новых морфологических типов листа и цветка. Последние представляют собой функциональный тип мужской стерильности; от растений с данным типом стерильности после возвратных скрещиваний получеио жизнеспособное потомство.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1). Зуб ко М. К., Зубко Е. И-, Глеба Ю. Ю. Восстановление жизнеспособности гамма- проростков in vitro //Докл. АН СССР. -1990. -Т. 313. -N2. -С. 453-457.

2). Zubko М.. Zubko Е., Gleba Y. Restoration of gamma-seedling's viability In vitro : potentials for mutagenesis // Abstracts Vllth International Congress on Plant Tissue and Cell Culture.-Amsterdam, June 24-29, 1990 -P. 170.

3). Зубко Ы. К., Зубко E. И., Капранов Ф. Е Индукция хлорофил-лдефектных мутантов табака - маркеров для клеточной инженерии // Бионолимеры и клетка.-1991. -Т. 7. -N4;. -С.72-80.

4). Зубко Е. И., Зубко U. К , Глеба Ю, Kl Трансгеномные растения в семействе пасленовых // Тезисы 1-го Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений -Пудино, 20-22 ноября 1091. -С. 63,162.

5).Пацковский КХЕ,. Гайдук Е В. i Веселовский 0. Е , Зубко Е. И., Пастернак Т.П. .Юркевич JLR , Ыашталер С. Г., ГЪтопальский А. И. Обнаружение pUCl9-гомологичных повторяющихся последовательностей в геноме некоторых видов высших растений //Биополимеры и клетка. -1992 (в печати).

6). Зубко Е. И. , Зубко И. К , Пацковский в Е . Латыпов С. А., Глеба Ю.Ю. Асимметричные неполовые гибриды между отдаленными видами семейства пасленовых //Цитология и генетика.-1992.-Т. 26.-N1., С. 33-38. ■ '

г , .л '■