Экспрессия гена аполипопротеина А-I человека в клетках млекопитающих

Перевозчиков, Андрей Петрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия гена аполипопротеина А-I человека в клетках млекопитающих
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гена аполипопротеина А-I человека в клетках млекопитающих"

Р Г Б ОД

На правах рукописи

ПЕРЕВОЗЧИКОВ Андрей Петрович

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА АПОЛИПОПРОТЕИНА А4 ЧЕЛОВЕКА В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Специальн ость 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой стспеш! доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в Отделе биохимии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор - академик РАМН, профессор Б.И. Ткаченко)

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

академик РАМН, профессор А.Н. Климов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

член-корреспондент РАМН, профессор К.П. Хансон доктор медицинских наук, профессор Е.И. Шварц доктор медицинских наук, профессор B.C. Баранов

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится 1997 г. в /У час. на

заседании Диссертационного (Совета Д 001.23.01 при НИИЭМ РАМН по адресу: г. Санкт-Петербург, 197376, ул. акад. Павлова, 12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН по адресу: г. Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

Автореферат разослан MS-^ru^- 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук

Л.В. Пучкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из самых тяжелых и опасных сердечно-сосудистых заболеваний нашего времени является атеросклероз и его клинические проявления, такие , как ишемическая болезнь сердца. Развитие атеросклероза , в свою очередь обусловливается различными факторами риска. Одним из них является низкое содержание в крови липопротеидов высокой плотпости (ЛГТВП), обладающих анти-атерогенным действием. Во многих исследованиях показано, что существует обратная зависимость между содержанием в крови ХС, связанным с ЛПВП (ХС-ЛПВП), и частотой развития атеросклероза. В работах А.Н. Климова с сотрудниками (1970, 1974) впервые было уделено внимание антиатерогенным свойствам ЛПВП и рассмотрена возможность использования ЛПВП и их главной белковой составляющей, аполипопротеина A-I (ano A-I), в лечебных целях. Этот подход стимулировал изучение возможностей регуляции экспрессии гена ano A-I in vitro и in vivo для повышения уровня ЛПВП в плазме крови человека и животных, а также предопределил создание лабораторных животных, трансгенных по этому гену. К настоящему времени усилиями ряда исследователей антиатерогенность ano A-I человека была убедительно продемонстрирована и экспериментах на трансгенных животных и были предприняты первые попытки использовать ген ano A-I в иелях предотвращения развития атерогенных нарушений путем его переноса в соматические клетки нокаутированных животных.

Вместе с тем, в ведущих научно-медицинских центрах разрабатывается принципиально новое направление в лечении тяжелых наследственных, в том числе сердечно-сосудистых, заболеваний методами ге-нотерапии. Эти методы лечения появились, а точнее продолжают появляться, в 90-е годы благодаря бурному развитию таких разделов фундаментальной биологической науки как биохимия, генетика, молекулярная и клеточная биология. Суть нового подхода к лечению заключается в подавлении или замедлении развития заболевания за счет активности доставленных (трансплантированных) в организм генетических конструкции (генов или их фрагментов).

Успех в лечении заболевания путем трансплантации генов во многом определяется выбором способа доставки и вектора экспрессии "лечащего" гена. При разработке подходов к генотерапии тех или иных заболеваний необходимо апробировать каждое звено предполагаемого подхода, то есть создать эффективные векторы экспрессии, содержащие "лечащий" ген, перенести этот ген в соответствующих векторах в культивируемые клетки млекопитающих, смоделировать на животных условия развития заболевания, используя в том числе и трансгенных животных, и, наконец, доставив нужные генетические конструкции в организм животных, у которых заболевание смодели-

ровано, добиться коррекции нарушенных функций организма, вызванных заболеванием.

Благодаря первым успехам в генотерапии тяжелого комбинированного иммунодефицита (вызванного наследственным дефектом гена аденозиндезаминазы) в США, а затем в ряде европейских стран были разработаны проекты лечения ряда других наследственных , а также онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний. Проекты по доставке in vivo "лечащего" муковисцидоз гена в легкие больных, после успешной апробации на животных, получили одобрение государственных контрольных органов США и стран Европы и осуществлены к настоящему времени на десятках пациентов. Разрабатываются способы генотерапии больных с недостаточностью а-1-антитрипсина (вызывающей эмфизему легких), с гемофилией, с опухолями головного мозга и ряда других органов и тканей.

Для лечения атеросклероза на пациентах использован направленный перенос гена рецептора липопротеинов низкой плотности (рЛПНП) в печень больных наследственной формой гиперхолестери-немии, вызванной дефектом гена рЛПНП. Этот подход стал возможен после успешных результатов по переносу гена рЛПНП животным, у которых это заболевание было генетически смоделировано.

К сожалению, до настоящего времени в России не было создано ни одного реального метода лечения больных сердечно-сосудистыми заболеваниями с помощью генотерапии. Более того, нет ни одной работы, в которой были бы достигнуты успехи в доставке "лечащих" генов в организм животных в условиях моделирующих генотерапию того или иного заболевания человека.

В настоящей работе, с учетом отмеченных выше тенденций, основное внимание уделено гену ano A-I, главного белка антиатерогенных ЛПВП человека: охарактеризованы отдельные важные участки 5!- и 3'-концевых районов регуляции экспрессии гена ano A-I человека, исследованы способы доставки гена ano A-I в соматические клетки ряда млекопитающих и экспрессия этого гена в чужеродном окружении; приводятся данные по получению трансгенных животных с целью моделирования заболеваний человека, связанных с нарушением функции ano A-I.

Цель и задачи исследований.

Цели настоящей работы - охарактеризовать новые регуляторные участки в 5' и З'-концевых районах гена ano A-I человека, исследовать способы доставки гена ano A-I в клетки млекопитающих, проанализировать экспрессию гена ano A-I человека, доставленного в соматические клетки in vitro и in vivo; получить животных, трансгенных по гену ano A-I человека.

В задачу работы входит:

1. Исследовать структурно-функциональную организацию районов регуляции экспрессии гена ano A-I человека; охарактеризовать структуру и функцию отдельных цис-элементов в 5'- и 3'- концевых участках гена ano A-I.

2. Создать ряд генетических конструкций, представляющих собой эукариотические векторы экспрессии гена ano A-I человека.

3. Доставить рядом способов ген ano A-I человека под контролем сильных нетканеспецифических промоторов в культивируемые клетки млекопитающих и проанализировать экспрессию этого гена.

4. Используя соответствующие генетические конструкции получить кроликов, трансгенных по гену ano A-I человека, содержащих его в прямой и обратной (антисмысловой) ориентациях, исследовать последствия воздействий перенесенного гена на трансгенный организм.

5. Доставить бактериальные гены-маркеры и ген ano A-I человека в клетки печени крысы и изучить условия длительной экспрессии перенесенных генов.

Основные положения, выносимые на защиту. В 5'- и З'-концевых районах гена ano A-I человека обнаружены и охарактеризованы регу-ляторные цис-элементы: Api - подобные элементы и GCC-элемент, способные участвовать в регуляции транскрипции генов млекопитающих. Идентифицмронан новый белковый фактор транскрипции, взаимодействующий с GCC-элементом.

Ген антиатерогеиного ano A-I человека, поставленный под контроль сильных нетканеспецифичных эукариогических промоторов, доставлен рядом способов в культивируемые клетки млекопитающих, где его полноценная экспрессия была подтверждена молекулярно-бпологическими и пммунохпмическими методами.

Наименее токсичным и неиммуногенным способом доставки, в виде комплекса ДНК с молекулярными конъюгатами, ген ano A-I человека был доставлен в печень лабораторного животного (крысы), где происходила его экспрессия, с секрецией новосинтезированного ano А-I в кровь.

Подтверждено предположение о продолжительной активности перенесенных в составе эукариотического вектора экспрессии гена в печени крысы, которая была достигнута благодаря частичной гепатоэк-томии.

Научно-практическая значимость работы. Теоретическое значение работы заключается: 1) в характеристике новых цис-элементов в 5'- и 3'- концевых районах регуляции экспрессии гена ano A-I человека, что значительно расширяет представления о возможностях регуляции этого гена в клетках млекопитающих; 2) в открытии факта экспрессии гена ano A-I в клетках ЦНС на ранних стадиях эмбриогенеза человека;

3) в доказательстве возможности функционирования перенесенного гена ano A-I человека с образованием полноценного белкового продукта его деятельности в клетках млекопитающих, в которых, синтеза собственного ano A-I не происходит; 4) в достижении экспрессии гена ano A-I человека в клетках печени лабораторного животного (крысы) после его доставки в печень в комплексе со специфичным для гепато-цитов молекулярным конъюгатом.

Практическая ценность работы обусловлена тем, что использованные способы доставки генов-маркеров и гена ano A-I в клетки млекопитающих выгодно отличаются от распространенного способа доставки генов в составе аденовирусов высокой избирательностью, отсутствием токсического и выраженного иммуногенного эффектов, а в отличие от нетоксичного способа доставки генов в липосомах - большей избирательностью и более высокой эффективностью доставки.

Использованный способ доставки генов в комплексе с молекулярными конъюгатами способен обеспечить продолжительную экспрессию перенесенного гена, что особенно важно для осуществления лечащего эффекта генов, переносимых с целью генотерапии.

Научная новизна работы. Обнаружены и охарактеризованы новые цис-элементы в 5' и З'-концевых районах регуляции экспрессии гена человеческого ano A-I. Впервые ген ano A-I человека был доставлен в культивируемые клетки млекопитающих в составе рекомбинантного ретровируса, показано образование полноценного белкового продукта экспрессии этого гена в инфицированных ретровирусом клетках.

Впервые было показано, что ген ano A-I способен экспрессировать-ся на ранних стадиях эмбрионального развития человека в клетках нервной системы.

Впервые получены кролики, трансгенные по гену ano A-I человека, у которых в зависимости от особенностей генетической конструкции, несущей ген ano А-1, развивалась дислипопрогеидемия или наблюдался нейрологический синдром Тенжирской болезни человека.

Впервые ген ano A-I человека был направленно доставлен в печень крысы в комплексе с молекулярным конъюгатом, при этом новосинте-зированный белок ano A-I секретировался в кровь животного.

Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации докладывались на Всесоюзной конференции по генотерапии, Киев, 1991 г., на Сессии РАМН, 1992 г., Всероссийских симпозиумах: "Клеточное ядро", Санкт-Петербург, 1993 г., "Биохимические аспекты атеросклероза", Санкт-Петербург, 1994 г., "Липиды и липопротеиды", Санкт-Петербург, 1995 г., Конференции в рамках ГНТП "Геном человека", Черноголовка, 1996, Всероссийской школе по молекулярной биологии, Репино, Санкт-Петербург, 1996, Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 1996 г.;

Международном симпозиуме по вирусологии (Intern. Congress Virol., 1993, Glasgow, Scotland).

Основное содержание работы отражено в 20 научных публикациях. Объем и структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментального раздела, включающего изложение материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения , выводов и списка литературы. Работа изложена на 250 стр. машинописного текста, иллюстрирована 46 рисунками (фотографиями), 8 таблицами. Список литературы содержит 280 ссылок на публикации отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве материала для исследования использованы: мыши - гибриды СВЛ/С57В1; Крысы - линии Wistar; Кролики- породы Шиншилла, полученные из питомника "Рапполово", РАМН, СПб;

абортивный материал плода человека (5, 9 недель), полученный из городской гинекологической больницы N 19 и клиники Института акушерства и гинекологии им. O.A. Отта, РАМН, СПб;

перевивные линии клеток: мышиные фибробласты (L- клетки, NIH/3T3), фибробласты человека (диплоидные культивируемые клетки человека) - из Института гриппа МЗ России и Института цитологии РАН, СПб; фибробласты крыс (RAT-1) - из Института молекулярной биологии РАН, Москва; мышиные фибробласты клеточных линий, пакующих ретровирус мышиной лейкемии Молони - MoMuLV (пси-2, РАЗ 17); клетки гепатомы человека (HepG2) - из Американской коллекции клеточных культур (АТСС), Национальные институты здоровья, США; клетки гепатомы крысы (НТС), клетки HeLa - из банка клеточных культур Института цитологии РАН, СПб;

бактериальные клеточные линии; Escherichia coli, К12, штаммы: НВ101, JM103, 105,109, DH5;

кДНК ano A-I человека - получена от L. Chan (Baylor College of Medicine, Houston, USA); промоторная область гена ano A-I человека -получена от В.И. Шульженко (Институт молекулярной биологии и генетики, Киев, Украина) клонированный ген белка L32 большой субъединицы рибосом мыши (rpL32), ретровирусный вектор мыши pZip-NeoSV(x) (на основе ретровируса лейкоза Молони) - получены от Н.В.Томилина (Институт цитологии РАН, СПб); в экспериментах использованы плазмиды (Pharmacia): содержащая промотор одного из

ранних генов цитоиегаловируса человека (CMV), бактериальные гены cat, lacZ, а также pSV2cat, pTKCat;

синтетические олигонуклеотиды, использованные в работе, были изготовлены В.В. Константиновым (Институт особо чистых биопрепаратов, СПб), В.М. Башковым (Институтцитологии, РАН, СПб).

Генетические конструкции создавали в соответствии с общепринятыми методами генной инженерии ( Маниатие Т. и др., 1984 г.).

Плазмиды амплифицировали, очищали ультрацентрифугированием в градиенте хлористого цезия, подвергали хроматографии на колонке типа "Elutip D" (Sigma) и использовали в экспериментах по трансфекции клеточных культур, для грансгенеза и доставки в соматические клетки животных.

Трансгенных животных получали как описано у Вайсмана Б.Л. и Голинского Г.Ф. (1985), препараты ДНК инъецировали in vitro в оплодотворенные яйцеклетки мышей и кроликов, , после чего яйцеклетки трансплантировали в матки самок-реципиентов

Получение рекомбннантных ретровирусных частиц, включая элек-тропорацию пакующих клеток ретровирусными векторами, отбор ге-нетицин - устойчивых (пео+) клонов пакующих клеток, определение титра вирусных препаратов с использованием клеток RAT-1, HeLa проводили в соответствии с ранее описанными методами ( Браун Э., Скотт М., 1989).

Трансфекцию культивируемых in vitro клеток препаратами ДНК выполняли методом Са-фосфатной преципитации. Эффективность используемых в генетических конструкциях промоторов млекопитающих и вирусов определяли Cat-тестом, выравнивая степень трансформации клеток на разных чашках Петри по активности р-галактозидазы - продукта экспрессии гена-маркера lacZ, используя в качестве хромогенно-го субстрата о-нигротрофенил-р-О-галактоплранозид (Горман К., 1988).

ДНК изолировали с помощью фенольно-дегергентной экстракции из кусочка уха 3-х недельного кролика, эмбрионов мыши, кусочков печени крысы, суспензии культивированных клеток млекопитающих.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием специфичных для бактериального гена пео праймеров (Kaleko М. et al„ 1991).

Молекулярную гибридизацию осуществляли методами ДНК-дот-гибридизации или гибридизации по Саузерну в 50% формамиде в стандартных условиях.

Цитоплазматическую РНК (цРНК) выделяли из суспензии культивированных клеток или из кусочков печени крыс фенольно-детергентным методом с применением 10 мМ ванадилрибо-нуклеозидных комплексов ( Маниатис Т. и др., 1984). Выделенную РНК денатурировали в 1 M глиоксале и анализировали методом РНК дот-блот-гибридизации или Нозерн-гибриднзации с фрагментом гена ano A-I, радиоактивно меченным 32Р (Thomas P.S., 1980).

Гибридизацию in situ проводили со срезами (4-5 мкм) тканей абортивного материала (5-9 недельные эмбрионы человека) в соответствии с Monk M.(1987). Фрагмент гена ano A-I человека (Pst I - Bgl I) - 550 пл., был очищен, помечен радиоактивно с помощью метода статистической затравки и использован в качестве зонда. Контрольные срезы перед гибридизацией были обработаны РНК-азой А в концентрации 1 мг/мл в течение 30 мин при 37°С для удаления клеточной РНК. Для оценки неспецифической ДНК-связывающей способности тканей срезы инкубировали с неденатурированным зондом.

Бактериальные гены-маркеры и ген ano A-I человека доставляли в печень крыс в виде комплексов соответствующих ДНК с конъюгатом poly(L-Lys)ASOR, вводя их в воротную вену. Конъюгат получали, используя L-полилизин - poIy(L-Lys) фирмы Sigma ( 2-50 кДа) и хромато-графи чески очищенный орозомукоид сыворотки человека, десиалиро-ванный нейроаминидазой вируса гриппа (ASOR). В качестве спейсера для образования конъюгага использовали фикол, активированный CNBr. ASOR является специфическим лигандом асиалогликопротеи-новых рецепторов клеток печени млекопитающих. Способность конъ-югата poly(L-Lys)ASOR к образованию комплексов с ДНК , а также оптимальное соотношение коньюгат:ДНК определяли методом ретардации (задержки) комплексов при электрофорезе в агарозном геле ( Wu G.Y., Wu С.H., 1987). Оптимальное соотношение ДНК и poly(L-Lys)ASOR (w/v) 1:5 в буфере: 20 мМ Hepes, pH 7.8 и 150 мМ NaCl. Спустя 30 мин после образования комплексов раствор фильтровали через нитроцеллголозную мембрану (Millipore) с диаметром пор 0,45 мкм и использовали для инъекций в воротную вену анестезированных крыс. Спустя 24 ч животных забивали и из печени выделяли ДНК. Го-могенаты печени центрифугировали при 17 тыс. об/мин, 15 мин, 4°С); в цитоплазматической фракции клеток печени определяли активность ß-галактозидазы и проводили Cat-тест. В другой серии опытов животным инъецировали комплексы конгюгатов с генетической конструкцией, содержащей ген-маркер lacZ, через 30 мин проводили частичную

(2/3) гепатоэктомию и, спустя семь недель после инъекции, определяли активность ß-галактозидазы.

Содержание ano A-I человека после процедур трансфекции в экстрактах культивированных клеток, в ростовой среде (в опытах in vitro), а также в сыворотке крови крыс после внутривенного введения комплексов ДНК с конъюгатами poIy(L-Lys)ASOR определяли с помощью методов иммунодота, иммуноблотинга (Вестерн-блотинга) и иммуноферментного (ELISA) анализа. В тех же целях клетки трансфе-цированные клетки HeLa подвергали иммуногистохимическому анализу.

.Ядерные экстракты культивируемых клеток получали как описано у Schreiber Е. eí ai. (1989). Ретардацию в геле проводили в соответствии с рекомендацией тех же авторов, используя для идентификации ДНК-белковых комплексов процедуру гель-электрофореза в 5% полиакри-лам идиом геле с последующей авторадиографией высушенных гелей.

Сауз-Вестерн - процедуру (лигандный блотинг) проводили в соответствии с Singh Н. et al. (1988).

Общий ХС , ТГ и ХС-ЛПВП в сыворотке крови определяли на автоанализаторе АА-2 (Technikon). Липопротеиды крови животных анализировали электрофорезом в ступенчатом градиенте полиакриламид-кого геля с последующей окраской Суданом IV .

Ткани трансгенных кроликов: головной и спинной мозг, спинномозговые ганглии ка уровне шейных, грудных и пояснично-крестцовых отделов спинного мозга, печень, мышцы и др. были подвергнуты морфологическому и электронно-микроскопическому анализу по общепринятой методике ( с использованием OsO¿).

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили используя банки нуклеотидных последовательностей GenBank, EMBL DNA library и пакеты программ PCGENE, DNASUN, DNASIS, FASTA.

Статистическую обработку данных проводили используя программу STATGRAPHICS.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение природных участков регуляции экспрессии гена ano A-I человека

1.1. Идентификация в 5'-концевом районе гена ano A-I человека двух цис -элементов Ар!

( Данные получены совместно с В.В. Алениным, Гос. университет, Санкт-Петербург)

С помощью компьютерного анализа в участке 5'-концевого района гена ano A-I (-2067...-1476 п.н.) были обнаружены два Ар]-подобных цис-элемента, или сайта, которые могут рассматриваться как мишени для связывания транскрипционных факторов Apl-семейства ( Рис.1). Это семейство, как известно, представлено подсемействами jun-, fos-, fra-белков, которые в виде гомо- и гетеродимеров способны связываться с элементами Api (консенсус-последовательность вида: 5'-aTGAC/GTCat-3') , расположенными в регуляторных областях многих эукариотических генов, н регулировать транскрипцию ( Vogt P., Bos Т. 1989).

обл. зшеаисера кечепн

TATA

fmmm{ , r>3.

222 -ПО -41 +1

б TRE/app

5' CAGCAGTCAC ATGAGTCT GATCrCCACT У PFl/apo

5' АТС'ГССГТТСТ CTGACTCT GAGCCACTC 3'

обл. ткапеспецнфнчлоч [штрссаш

IT........1

1 API 1

-2067 -1467

-У-

Рис.1. Схема организации 5'-концевого района гена ano A-I человека, а - Ар! - выявленные с помощью компьютерною анализа Ар! -подобные элементы; б - сиквенсы Api -подобных элементов 5-концевого района гена ano А-1.

Один из обнаруженных Api-подобных элементов (5-CTGACTCTG-3', -1793...-1785 п.н.) идентичен элементу PF1, найденному ранее в 5'-концевом (регулягорном) районе гена белка р53, являющегося опухолевым супрессором (Ginsberg D. et al., 1990). Второй обнаруженный Api-подобный элемент ( -1829...-1821 п.н., 5'-ATGAGTCTG-3') своей обратной ориентацией в значительной степени (8/9) гомологичен элементу TRE и обозначен как TRE/apo. По литературным данным такой цис - элемент способен связываться с белком - гетеродимером jun/fos с эффективностью 5-25% по сравнению с каноническим TRE (Risse G. et al., 1989).

С помощью метода ретардации в геле было показано (рис.2), что синтетические олигонуклеотидные копии элемента PFl/apo и канонического элемента - Apl/SV40 ( 5'-CTGACTAA.T-3') энхансера ранних генов вируса SV40 (Harshman K.D. et al., 1988), образуют сходные по подвижности комплексы с белками тотальных экстрактов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, с белками очищенными из этих экстрактов хроматографией на гепарин-сефарозе, и с белками ядерных экстрактов из клеток HeLa, что подтверждает существование в этих клетках соответствующих ДНК-связывающих белков. В случае использования белковых экстрактов клеток Escherichia coli (отрицательный контроль) ДНК-белковые комплексы не обнаруживаются. При этом меченая олигонуклеотидная копия элемента PFl/apo конкурентно вытесняется из комплекса с дрожжевыми белками немечеными олигонуклеотидны-ми копиями элементов PFl/apo и Apl/SV40, причем гомологичный PFl/apo является более эффективным конкурентом, чем канонический Apl/SV40. Таким образом, элемент PFl/apo по способности связывать Api-белки отличается от канонического элемента Apl/SV40 и, по-видимому, может выполнять функции элемента PF1, обнаруженного в промоторе гена белка р53. Кроме того, меченый олигонуклеотид -синтетическая копия канонического элемента Ap!/SV40 - эффективно вытесняется из ДНК-белкового комплекса (ядерный экстракт клеток HeLa) фрагментом 5'-концевого района гена ano A-I (-1915...-1447 п.н.), содержащим оба найденных Api-подобных цис-элемента.

Для проверки функциональной значимости Api-подобных элементов участка тканеспецифической репрессии 5'-концевого района гена ano A-I была создана генетическая конструкция, в которой фрагмент данного участка, содержащий Api-подобные элементы, был добавлен к промотору гена тимидинкиназы (ТК) вируса герпеса простого 1-типа (минимальный промотор), сцепленному с геном cat (pApl-TKcat).

Рис. 2. Связывание белков экстрактов клеток HeLa и дрожжей Saccharomyces cerevisiae с олигонуклеотидными копиями элементов PFli'apo и Apl/SV40. Стрелками отмечены выявленные на авторадиограммах ДНК-белковые комплексы.

1 - экстракты клеток Е. coli и PFI (отрицательный коигроль); 2 - экстракты клеток дрожжей S.cerevisiae и PFI/apo; 3 -ядерные экстракты клеток HeLa и Apl/SV40; 4 - ядерные экстракты клеток HeLa и PFI/apo.

12 3 4

Оказалось, что добавление к промотору гена ТК вируса герпеса указанного фрагмента приводит к значительному подавлению экспрессии гена cat в Cat-тесте на клетках N1H/3T3 (рис.3).

Аф

-О Хф

Рис. 3 Результаты Cat-теста функциональной значимости Api-подобных элементов 5'-кон-цевого района гена ano A-I человека. Клетки NIHOT3 были трансфецнрованы генетическими конструкциями: с мини. ; ^ ^ р j мальным промотором ¡>.'ívv;,; = 1К вируса герпеса , (pTKcat) (2, 4, 6); с до: , V"4 * , ' Оавлением к промо-л^'-,;..; *; У,Г-- тору ТК фрагмента . i , промотора гена ano А-5*' V.- *-- '■ I. содержащего Apt-Ч' ,'.>'■. . ' подобные элемен-ты ■)i, V I■ -" (pApl-TKcat) (1,3,5).

1, 2 - клетки, вырос-г < шие на среде с 0,5%

сывороткой; 3, 4 - такие же как 1, 2, но после добавления 10% сыворотки; 5, 6 - такие же как 1, 2, но после добавления 15% сыворотки. Хф - ыС-хлорамфеникол, Аф - ацетилированная форма хлорам-феникола.

f ч , N

1 2 3

По всей вероятности, в клетках NIH/3T3 с Api-подобными элементами участка 5'-кониевого района гена ano A-I взаимодействует белок-репрессор, угнетающий активность гена-маркера cat.

По литературным данным стимуляция роста ранее голодавших клеток сывороткой (резкая смена концентрации сыворотки в культу-ральной среде с 0,5 до 15%) приводит к активации в таких клетках экспрессии белков Apl ( Karin М., 1990), которые могут взаимодействовать только с классическими элементами Api (и соответственно менять уровень экспрессии cat). Однако, существенных изменений экспрессии гена cat в ответ на смену концентрации сыворотки в проведенных экспериментах не отмечалось (рис.3), что предполагает взаимодействие с исследуемыми элементами не классических факторов транскрипции Api, a Api-подобных, к которым относится фактор транскрипции PF1.

Сходные данные по репрессии гена cat в составе конструкции pApl-TKcat были получены на гепатомных клетках человека (HepG2).

1.2. Изучение участка 3' - иетранслируемогорайона гена ano А-1 человека

Компьютерным анализом в З'-концевом нетранслируемом районе гена ano А-1 человека была обнаружена последовательность вида CC(GCC)3, являющаяся потенциальным цис-элементом (GCC-элемент) и располагающаяся от стоп-кодона трансляции в положении +6...+16 п.н. (координаты от стартовой точки транскрипции: +896...+906 п.н.) перед сигналом полиаденилирования. В результате компьютерного поиска по базе данных иуклеотидных последовательностей млекопитающих (GenBank, EMBL DNA library, 1994, 1995 гг.) присутствие аналогичных GCC (и симметричных им GGC) - трнпяетных повторов было также установлено в районах регуляции экспрессии целого ряда генов млекопитающих и в том числе в промоторе гена одного из рибо-сомных белков мыши (rpL32), имевшегося в нашем распоряжении. Поскольку для исследования функциональных участков промотора имелось больше возможностей, чем для анализа З'-нетранслируемого района ( ретардация в геле, Сауз-Вестерн-блотинг, Cat-тест), то в экспериментах по изучению структурно-функциональных, свойств потенциального GCC-элемента использовали фрагменты обоих генов: ano А-1 человека и rpL32 мыши. Для исследований ДНК-белковых комплексов методом гель-ретардации использовали участок З'-концевого района гена ano А-1 человека (+789...+926 п.н.), фрагмент промотора rpL32 (-49...+90 п.н.), синтетическую копию фрагмента промотора rpL32 (-24...+11 п.н.) 5'CTTGCGCGCCGCCGCCGCCTCTTCCTTCTTCCT-CG3' (GCC-элемент подчеркнут), олигонуклеотидные копии собственно GCC/GGC-элемента (5'GAGCGGCGGCGGCGGCA3'). копии элемента, весьма близкого по последовательности, для факторов транскрипции семейства Egr 5GAGCGGCGGGGGC-GGCA3'. В качестве отрицательного контроля был использован элемент Api промотора

гена коллагеназы (5'AATTTGАСТСААТТЗ'). Консенсусные последовательности везде подчеркнуты.

Синтетическая копия GCC- элемента эффективно вытесняла соответствующие меченые фрагменты генов ano A-I человека и rpL32 мыши из комплексов с ядерными белками клеток человека и мыши (рис.4а,б).

Конкуренция фрагмента промотора rpL32 (-24...+11 п.н.) с немеченым собственным гомологом, как и следовало ожидать, была наиболее высокой, однако, немеченые олигонуклеотидные копии исследуемого GCC- элемента также в значительной мере вытесняли меченый фрагмент промотора rpL32 из ДНК-белкового комплекса (рис.4в).

Полученные данные говорят о более слабой конкуренции копии элемента Egr с указанным фрагментом промотора rpL32 (Рис.4 г), по сравнению с GCC-элементом.

Олигонуклеотидная копия элемента Api не конкурировала с меченым фрагментом промотора rpL32 (отрицательный контроль) (Рис. 4д).

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что белковый фактор транскрипции, взаимодействующий с потенциальным элементом GCC, отличается по ДНК-связываюгцим свойствам от факторов транскрипции семейства Egr, хотя возможно некоторое функциональное перекрывание элементов GCC и семейства Egr.

Для проверки указанной возможности были поставлены перекрестные эксперименты по конкуренции GCC-элемента с элементом Egr. Меченый элемент Egr образовывал при инкубации с ядерными экстрактами клеток HeLa две специфические полосы (фракции) задержки, которые не истощались при добавлении большого избытка немеченого элемента GCC. В связи с этим, отмеченное функциональное перекрывание элементов Egr и GCC, по-видимому, имеет односторонний характер.

Компьютерный поиск по банку генов млекопитающих и человека для элементов Egrl и GCC показал, что эти цис-элементы часто располагаются тандемно или частично перекрываясь в регуляторных областях многих генов, что, по-видимому, играет определенную роль в регуляции экспрессии этих генов.

а б

' ' Ir

- ' h*. f-ч f'-l

-«зК

12 3 4 5 6 7 S

«дои&к

-f-p

. г" •

IV :ti

k - * . 5 ~

1 2 3 4 5 6 7 S

1 2 3 4 5 6 7

- Ч

"K1

1 2 3 4 5

Рис. 4 Связывание белков ядерных экстрактов клеток человека (HeLa) и мыши (NIH/3T3) с фрагментами генов rpL32 мыши и ano А-1 человека, содержащими GCC-элемент. Стрелками отмечены выявляемы на авторадиограммах ДНК-белковые комплексы: К - специфические, К' - не проявляющие специфичности. В качестве радиоактивных зондов использованы: а - фрагмент (-49...+90 п.н.) гена rpL32; б - фрагмент (+786...+926 п.н.) гена ano A-I; Б, г, д - фрагмент (-24...+11 п.н.) гена rpL32.

а - 1, 3 - экстракты клеток HeLa; 2, 4-6 - экстракты клеток NI II/3T3; I -3 - без конкуренции; 4-6 - конкуренция с олигонуклеотидной копией GCC-элемента соответственно с 10-, 50-и 100-кратным молярным избытком; б - экстракты клеток HeLa; 1 -без инкубации с экстрактом, 2 - без конкуренции, 3-8 - конкуренция с олигонуклеотидной копией GCC-элемента соответственно с 10-(3, 4), 50 (5, 6) и 100-(7,8) кратным молярным избытком; в - экстракты клеток ШН/ЗТЗ; 2 - без конкуренции; 3-8 - конкуренция с олигонуклеотидной копией GCC-элемента соответственно с 10-(3, 4), 50-(5,6) и 100-(7, 8) кратным молярным избытком; г - экстракты клеток NIH/3T3; 1- без инкубации с экстрактом, 2- без конкуренции, 3-7 - конкуренция с олигонуклеотидной копией элемента Egr соответственно с 10-(3,4), 50-(5) и Ю0-(6, 7) -кратным молярным избытком; д - экстракты клеток NIH/3T3; 1 - без инкубации с экстрактом; 2 - без конкуренции; 3-5 - конкуренция с олигонуклеотидной копией Api- элемента соответственно с 10-(3,4) и 50-(5) кратным молярным избытком.

Белки, взаимодействующие с GCC-элементом, проанализированы методом лигандного блотинга (Сауз-Вестерн-блотинг). В качестве зонда для связи с ядерными белками клеток HeLa использовали либо олигонуклеотидную копию собственно GCC- элемента, либо содержащий его фрагмент промотора rpL32 . В первом случае (с элементом GCC) образовывался ДНК-белковый комплекс, обусловливающий низкую интенсивность радиоактивной полосы на автографе, тогда как во втором случае (с фрагментом промотора rpL32) образовывался ДНК-белковый комплекс, обусловливающий высокую интенсивность радиоактивной полосы. Молекулярная масса белка, способного связываться с радиоактивными ДНК-зокдами была определена как 18-20 кДа. Фрагмент промотора rpL32 образовывал также комплексы и с более высокомолекулярными ядерными белками клеток HeLa, которые, вероятно, взаимодействуют кооперативно с белком молекулярной массой 18-20 кДа при образовании специфических ДНК-белковьгх комплексов, выявляемых методом гель-ретардации.

Недавно в литературе появились сведения, полностью подтверждающие наши результаты относительно способности триплетного повтора GCC выступать в качестве цис-элемента и о взаимодействии его в клетках HeLa с ядерным белком с молекулярной массой около 20 кДа ( Deissler Н. et al., 1996). В качестве исследуемого объекта у цитируемых авторов фигурировала 5'-нетранслируемая область гена FMR-1, содержащая 17-50 трнплетных повторов GCC, наследственные дефекты которой (в виде экспансии триплетов) отвественны за синдром хрупкости Х-хромосомы ( тяжелое заболевание человека). Отличия настоящих данных от цитируемых в том, что в последнем случае в качестве цис-элемента фигурируют более протяженные повторы триплетов GCC (8 - 12-кратные триплеты), тогда как в нашем случае - это 3 - 4-х кратные триплеты, белковые взаимодействия с которыми усиливаются фланкирующими их последовательностями.

Для изучения функциональной роли GCC-элемента был использован Cat-тест на культивируемых фибробласгах мыши (NIH/3T3) (рис.5). В качестве тестовых генетических конструкций служили созданные для этих целей плазмиды prpL32cat и pGCC-TKcat. Первая конструкция содержала в составе промотора rpL32 собственный GCC-элемент, а вторая - добавленную методами генной инженерии к промотору гена ТК вируса герпеса олигонуклеотидную копию GCC - элемента. Кроме того, на основе плазмиды (pUC!9) были созданы конструкции, содержащие только олигонуклеотидные копии тандемных повторов 4-х кратного триплета GCC.

а ч

Рис. 5. Определение функциональной активности GCC-элемента в промоторе гена rpL32 мыши методом конкуренции in vivo в Cat-тесте. Клетки линии NIH/3T3 1рансфецировали Са-фосфатным методом плазмидами prpL32cat и pUCJS, содержащей различное число повторов ССС-злеиеота. Через 48 час после трансфекции й экстрактах клеток определяли Cat-активность. По оси ордииат отложены относительные единицы активности Cat ( % ацетилированных форм хлорамфеникола). I. prpL32cat; 2. prpL32cat + 6-л кратный молярный избыток GCC-элемента (а составе pUC18); 3. prpL32cat + 40-кратный молярный избыток GGC-элсмента; 4. prpL32 + 80-кратный молярный избыток GCC-элемента; 5. prpL32 + 40-кратный избьпок фрагмента (-24...-Н1 п.н.) промотораrpL32.

Мышиные клетки, трансфецированные prpL32cat, в параллельных культурах дополнительно трансфецировали плазмидами содержащими повторы GCC-триплета (функциональный Cat-тест на конкуренцию). При этом функционально активный элемент в таких плазмидах (в транс-положении) должен конкурентно связываться со значительным количеством соответствующего фактора транскрипции и тем самым ослаблять степень связывания этого фактора с аналогичным элементом ( в цис-положении) в составе промотора rpL32, сцепленного с геном cat. Результаты проведенных экспериментов полностью подтверждают функциональную активность GCC-элемента, с которым, как следует из полученных данных, в промоторе rpL32 взаимодействует белок, активирующий транскрипцию. Интересно, что тот же GCC-элемент, помещенный в цис-положение в промотор гена ТК вируса герпеса простого I типа, взаимодействует с фактором транскрипции, угнетая экспрессию Cat.

2. Создание генетических конструкций для переноса гена ano A-I человека в клетки млекопитающих

2.1. Конструирование плазмидных векторов экспрессии

Для конструирования плазмидных векторов экспрессии была использована 5'-регуляторная область (промотор/энхансер) одного из ранних генов цитомегаловируса человека - CMV (Boshart М. et al., 1985) и 5'-регуляторная область гена рибосомного белка rpL32 мыши, включающая район промотора/энхансера, первый нетранслируемый экзон и часть первого интрона - участки важные для максимальной экспрессии гена, находящегося под контролем промотора rpL32 (Atchison M.L. et al., 1989). Активность этих промоторов была проанализирована в Cat-тесте. Наряду с этими промоторами, в Cat-тесте была также исследована и активность тканеспецифического промотора гена ano A-I человека (см. таблицу).

Таблица

Определение активности ряда эукариотнческих промотороз в Cat - тсстс на культивируемых клетках млекояптающих н человека

Клеточные линии Плазмиды

pSV2cat prpL32cat pCMVcat pTKcat pApoAIcat

Фибробласты мыши 100 89,15 160,5 14,3 -

HepG2 100 - - 26,9 47,6

Примечание. Указанные ппаэмиды содержат ген cat под контролем эукариотичесхих промоторов. Активность Cat, соответствующая pSV^cat, составила 36,5±0,4 пкмолъ/мг белка на 1 мкг ДНК за I ч и была принята за 100%. pSVicat - промотор ранних генов вируса SV40; prpL32cat - промотор гена рибосомного белка L32 мыши; pCMVcat - промотор раннего гена цитомегаловируса человека; pTKcat - промотор гена тимидинкиназы вируса герпеса простого 1-го типа человека, pApoAIcnt - промотор гена ano A-I человека.

Исследования показали, что если промотор rpL32 сопоставим по активности с промоторами ранних генов вирусов, относящимся к "сильным" промоторам, то промотор гена ano A-I проявляет умеренную активность и поэтому может рассматриваться как перспективный только в комплексе с тканеспецифичньши факторами транскрипции (см. заключение).

Нетканеспецифичные промоторы CMV и rpL32 были соединены с кДНК геном ano A-I человека, содержащим на З'-конце сигнал поли-аденилирования (рис. 6а ). Для более эффективной транскрипции кДНК ano A-I к ее З'-концу в разных конструкциях добавляли либо участок терминации транскрипции гена инсулина крысы, либо соответствующий участок гена rpL32 мыши, которые кроме собственного сигнала полиаденилирования ( ро1у(А)-сайта) содержали и другие необходимые элементы терминации транскрипции и процессинга мРНК.

2.2. Конструированиеретровирусных векторов экспрессии

На рис. 66 представлена схема одного из вариантов ретровирусно-го вектора экспрессии гена ano A-I, содержащего кДНК ano A-I, под контролем промотора rpL32 и сконструированного на основе ретро-вирусного вектора pZipNeoSV(x) мыши. Исходный ретровирусный вектор был существенно преобразован. Области ori SV40 и дополнительного ori pBR322 были заменены на связку: промотор гена rpL32 -кДНК-ген ano A-I человека, такую же, что и в плазмидном векторе, представленном на рис.ба. Кроме того для удобства конструирования б векторе был удален один из сайтов EcoRI. В одном из созданных вариантов конструкции бактериальный промотор гена neo был удален, так что экспрессия структурного гена лес контролировалась только промотором левого концевого повтора провируеа (5'-LTR). Всего было создано четыре варианта ретровирусных векторов экспрессии гена ano A-I человека и основные различия между ними заключались в расположении и ориентации гена селекции (neo) по отношению к гену ano A-I, что позволяло путем сравнения эффективности экспрессии гена ano A-I в культуре тестовых клеток RAT-1 отобрать наиболее оптимальный вариант конструкции. Этот вариант (рис.66) содержит оба гена (neo и ano A-I) в одинаковой ориентации, причем ген neo за счет делении бактериального промотора непосредственно соединен с рет-ровирусным промотором 5-LTR.

Рис. 6 Генетические конструкции, содержащие ген ano A-I человека под контролем эукариотическич промоторов. Плазмидные векторы экспрессии (схемы)'

а - ген ano A-I человека под контролем проиотора раннего гена цигомега-ловируса человека (Pcmv), с З'-конца сцеплен с районом терминации транскрипции гена инсулина (ins) крысы; б - ген ano A-I человека под контролем промотора rpL32 мыши, с З'-конца сцеплен

с районом терминации транскрипции гена rpL32; в - функционально-рестриктная карта ретровирусного вектора экспрессии (на основе вектора серии pZipNco MoMLV), содержащего ген ano A-I человека под контролем промотора rpL32.

3. Перенос гена ano A-I человека в культивируемые клетки млекопитающих

3.1. Перепое гена ano A-I в культивируемые клетки млекопитающих в составе плазмидных векторов экспрессии

Способность Р-галактозидазы развивать окраску в присутствии хромогенного субстрата (X-Gal) была использована для оценки эффективности трансформации культивированных клеток млекопитающих с помощью ДНК. Эффективность трансформации (трансфекции) клеток HeLa плазмидой pCMVIacZ составляла от 0,5 до 1%.

Результаты Нозерн-гибридизации цРНК клеток HeLa после трансфекции клеток конструкцией, содержащей ген ano A-I под контролем промотора CMV, представлены на рис.7а. В составе цРНК трансфеци-рованных клеток HeLa выявляются две специфичные для ano А-1 человека фракции мРНК (приблизительно в зквимолярных соотношениях), с размерами ~ 1800 и ~900 нуклеотидов (н). РНК этих двух видов, в соответствии с использованной для трансфекции клеток конструкцией, представленной на рис. 6 а, имеют общий 5'-концевой нетранслируе-мый участок, общую рамку считывания и разные З'-концевые нетранс-лируемые участки, обусловленные либо сигналом полиаденилирова-ния области терминации транскрипции гена инсулина крысы (расчитанный размер РНК - 1800 н.) и дополнительными сайтами терминации, либо только собственным сигналом полиаденилирования гена ano A-I ( расчитанный размер РНК - 900 н). Полученные результаты подтверждают необходимость использования при конструировании вектора экспрессии полной области терминации транскрипции, а не только ро1у(А)-сайта, который недостаточно эффективен в терминации. Вместе с тем, наличие нескольких специфических для ano A-I фракций мРНК в клетках не может быть недостатком для контроля экспрессии гена ano А-1 с данной конструкции, поскольку обе фракции мРНК имеют одинаковую рамку считывания и при трансляции будут, очевидно, направлять синтез идентичных молекул белка.

На рис.7 б представлены результаты иммуногистохимического определения ano А-1 в клетках HeLa после трансфекции их плазмидным вектором экспрессии pCMVapo А-1. Новосинтезированный ano А-1 выявлялся только в трансфецированных клетках HeLa, но не в контрольных. Ano А-1 человека в экстрактах клеток HeLa обнаруживался также с помощью иммуно-дот и иммуноферментного анализов. Содержание ano А-1 в экстрактах трансфецированных клеток HeLa, по данным иммуноферментного анализа, составляло ~70 нг ano А-1 на 1 мг общего белка. Для сравнения, содержание ano А-1 в экстрактах ге-патомных клеток человека HepG2, определенное тем же методом, составляло 280-290 нг на 1 мг общего белка, а в ростовой среде - около 2,2 - 2,3 мкг на 1 мг общего клеточного белка.

4300 нВ~

1900 н е- ' ,-'• - .

- i

1 2

Рис. 7 а, б Идентификация продуктов экспрессии гена ano A-I человека в клетках

IleLa, трансфецированных плазмидным вектором экспрессии pCMVapoA-1.

а - Нозерн-гибридизацня цРНК трансфецированных клеток HcLa с кДНК ano A-I человека. В качестве зонда для гибридизации использовали меченный 32Р фрагмент кДНК ano A-I. Для определения размеров гнбридизующихся фракций использовали фракции РНК печени крыс (позиции отдельных фракций отмечены стрелками слева). 1 - цРНК нормальных клеток HeLa; 2 - цРНК трансфецированных клеток HeLa. Стрелками справа указаны размеры гнбридизующихся мРНК.;

б - Иммуногистохимическая идентификация продукта экспрессии гена ano A-I человека в трансфецированных клетках HeLa. Окрашенные клетки продуцируют ano A-I, ув. X 250. Обнаружение ano A-I осуществляли с помощью меченных пероксидазой хрена кроличьих антител к человеческому ano A-I. Хромоген-ный субстрат - диаминобенладин.

Поскольку эффективность трансформации клеток HeLa в экспериментах нами была оценена как 0,5-1%, можно полагать, что доля ano A-I в трансформированных клетках составляет приблизительно 0,35% - 0,7% всего клеточного белка. Если учесть, что ano A-I, практически, полностью (90%) секрегируегся в ростовую среду ( Erikson S.K., Fielding Р.Е., 1986; Lamon-Fava S. et a!., 1987), то из этого следует, что эффективность экспрессии гена ano A-I с созданной конструкции в ге-терологичных клетках выше эффективности экспрессии гена ano A-I, полученной при использовании других конструкций (Lamon-Fava S. et al., 1987; Шульженко В.Н. и др. 1989).

11800а

903к -V-4

•í-.f'^..

3.2. Перенос гена ano A-I в культивируемые клетки млекопитающих в составе рекомбинантиых ретровирусов

(Данные получены совместно с С.М. Серовым, Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН).

Пакующие клетки (линии клеток мыши ц-2 и РАЗ 17) были транс-фецированы описанными выше ретровирусными векторами; клоны, продуцирующие рекомбинантные ретровирусные частицы, отбирали селекцией на устойчивость к генетицину (пео+) и тестировали по инфекционной активности вируса. Как показали исследования, наибольшим титром (104 - 105) рекомбинантиых экотропных ретровирусов обладали клоны пакующих клеток, трансфецированные вектором, с тандемно расположенными и однонаправленными генами: neo (укороченный с 5'-конца) и ano A-I, соответственно под контролем ДКП (5-LTR) провируса и промотора rpL32 (см. рис. 66). Следует отметить, что эти клетки наряду с продукцией рекомбинантиых ретро-вирусных частиц обладали также способностью продуцировать человеческий ano A-I.

Клетки RAT-1 (фибробласты) и НТС (гепатома) крысы были использованы как мишени для инфицирования полученными рекомби-нантными ретровирусами. Инфицированные ретровирусом клоны клеток RAT-1, отобранные селекцией на устойчивость к генетицину (пео+), анализировали с помощью иммунодот-анализа, используя по-ликлональные антитела к ano A-I человека. ДНК клонов клеток, давших положительный ответ в иммунодот-анализе, тестировали на присутствие привнесенных конструкций методами ДНК дот-гибридизации. Вирусоспецифические последовательности по этим данным достоверно содержали клоны клеток RAT-1 (4-31, 4-33, 4-81 и др.). Одновременно, теми же рекомбинантными ретровирусами инфицировали культивируемые гепатомные клетки крысы (НТС); процедуру клонирования не проводили, а из таких клеток выделяли ДНК и анализировали ее методом ПЦР. В ДНК гепагомных клеток обнаружили последовательность, специфичную для фрагмента гена neo, входящего в состав ретровирусного вектора (амг.лификат размером 154 п.н.), что свидетельствует об успешном переносе ретровирусного вектора, в том числе и в клетки гепацитарного ряда крысы (рис.8).

Данные иммуноблотинга белков из клонов клеток RAT-1, инфицированных рекомбинантным ретровирусом, подтверждают присутствие полноразмерных белковых продуктов экспрессии гена ano A-I человека в этих клетках (рис.9). Как видно, экстракт клеток RAT-1 ( клон 433) содержит две иммунопозитивные белковые фракции, с молекулярными массами ЗОН кДа и 28±1 кДа, соответствующие пробелку и зрелой форме ano A-I.

.-•.ff&S-Ji

1 . . L

1 2 3

6 7 3

Рис. 8. Выявление методом ПЦР гена лео в ДНК крысиных гепатом-ных клеток (НТС), инфицированных рекомбина-нтным ретровирусом. Количество клеточной ДНК на пробу - 500 нг. 1-отрицательный контроль, ДНК НТС; 2 - 4 - положительный контроль: ДНК НТС + pZipNeo (соответственно 10, 100 и 100 пкг);5-8 - ДНК инфицированных клеток НТС, сформировавших монослой разной степени кои-флуентносги. Специфическая для гена neo полоса <154 II. н.) отмечена стрелкой.

» ! Рис. 9 Результаты нммуно-

блотинга белков экстрактов клеточных клонов RAT-1, полученных селекцией по пео+ после инфекции клеток реком-. билантлым ретровирусом, не-

I сущим ген ano A-I человека.

94 Ъ - : ; Для иммуноидентификации

... . -,'•„. белков применяли поликло-

69 —► . • ; J -.i нальные кроличьи антитела,

- _ специфичные к человеческому

ano A-I.

1 - контрольные RAT-1; 2 -40 ^ ••-':. клон 4-31, 3 - клон 4-83, 4- клон

.'•-" • 4-33. Стрелки слева - позиции

стандартных белков, использованных при электрофорезе в

; -30 качестве весовых маркёров.

29 V . - • ^-23 Стрелки справа указывают мо-

лекулярные массы иммуноспе-: . . ' цифичных белков.

кДа 1 2 3 .4 кДа

Лизаты клеток другого клона (4-31) содержат более высокомолекулярные фракции иммунопозитивных белков, происхождение которых в настоящее время трудно объяснить.

Полученные результаты свидетельствуют об успешном переносе гена ano A-I, находящегося под контролем нетканеспецифического промотора rpL32, в составе рекомбинантного ретровируса в фиброб-ласты крысы, и о полноценной экспрессии перенесенного гена в этих клетках, а также о возможности доставки генетических конструкций таким способом в клетки гепатомы крысы.

4. Получение животных, трансгенных по гену ano A-I человека (Данные получены совместно с Б.Л. Вайсманом и A.B. Сорокиным, Отдел эмбриологии НИИЭМ РАМН)

Для инъецирования в яйцеклетки кроликов гена ano A-I человека были созданы генетические конструкции, содержащие этот ген (в правильной или антисмысловой ориентациях) под контролем промотора гена rpL32 мыши.

Для изучения тканеслецифических свойств промотора гена rpL32 в эксперименте на трансгенных животных плазмиду prpL32cat инъецировали в оплодотворенные яйцеклетки мышей, которые затем имплантировали в матку мышей-реципиентов. Анализ активности Cat в тканях 19-дневных трансгенных эмбрионов мыши показал, что данный промотор, как и ожидалось, не проявляет заметной тканевой специфичности. Он способен работать in vivo с высокой эффективностью в эмбриональных тканях печени, мозга, сердца, легких (за время реакции ацетилировалось до 80% хлорамфеникола в расчете на 100 мкг белка растворимой фракции).

4.1. Трансгениые кролики, несущие анаписмысловой вариант гена ano A-I

После инъекции оплодотворенных яйцеклеток кроликов конструкцией с антисмысловым вариантом гена ano A-I человека и трасплан-тации яйцеклеток в матку самкам родились крольчата, у которых из кончика уха была выделена ДНК и подвергнута анализу на наличие трансгена. Анализ ДНК кроликов методом дот-блот-гибридизации выявил присутствие в некоторых препаратах ДНК последовательностей, специфичных для инъецированных в яйцеклетку плазмид (у 5 из 9 обследованных животных). Результаты гибридизации по Саузерну свидетельствуют о наличии полноразмерных плазмид в составе хромосомной ДНК трансгенных кроликов.

Таким образом, в результате инъекции в зиготы кроликов плазмид, содержащих антисмысловую форму гена ano A-I человека, способную к экспрессии, получены трансгенные кролики, содержащие, как пока-

зали подсчеты, разное число полных копий интегрированной в хромосомы экзогенной ДНК (от 1 до 40 на геном). Такие относительно высокие копийность и вероятность трансгенеза у кролика в проведенных экспериментах характерны для использовавшегося метода микроинъекций ДНК в оплодотворенные яйцеклетки (Вайсман Б.Л., Голинский Г.Ф., 1985) .

Трансгенные кролики (II-1 и II-3) в возрасте 1 месяц отличались от интактных особенно высоким содержанием общего ХС, а кролик II-2 -низким содержанием ХС-ЛПВП.

В возрасте 3-х месяцев у кроликов II-2 II-4 ХС-ЛПВП продолжал оставаться сниженным, хотя содержание общего ХС у этих кроликов по сравнению с возрастом 1 месяц также понижалось. Кролики, в геноме которых не обнаружено интегрированной экзогенной ДНК (NN 1-4,7,8; И-5,9) , имели липидные показатели, характерные для интактных животных данного возраста. Липидные показатели сыворотки кролика 1-3, в геноме которого обнаружено большое число копий вводившейся ДНК, не имели заметных отличий от нормы. Выраженная корреляция между низким содержанием ХС-ЛПВП и высоким содержанием ТГ (кролик II-2 ) вызывает определенный интерес, поскольку такая ситуация весьма характерна для нарушения функции ЛПВП при атеросклерозе.

Полученные данные свидетельствуют об экспрессии антисмысло-зоп формы (5'-фрагмеята) экзогенного гена ano A-I человека, по меньшей мере у кролика II-2, и об угнетении за счет его деятельности активности природного гена ano A-I. Это в свою очередь вызывает снижение уровня ЛПВП в крови и сдвиг в липидном обмене у трансгенных животных.

Эффективность экспрессии экзогенного антисмыслового гена, угнетающего образование ЛПВП, вероятно, может зависеть от места встраивания рекомбинантной молекулы в хромосомную ДНК и числа встроенных копий, а также строгой терминации транскрипции участка антисмыслсвого гена. Возможно, с этим и связаны различия в экспрессии антисмысловых конструкций у кроликов NN 11-1, II-2 и 1-3. Следует также учитывать наличие определенной гомологии нетранслируе-мых 5'-концевых районов генов кластера: ало A-I - ano C-III - ano А-IV, контролирующих образование ЛПВП млекопитающих, и возможное влияние антисмысловой формы гена ano A-I, а точнее его 5'-фрагмента на экспрессию всех генов этого кластера. Отмеченные особенности могут в каждом конкретном случае уникальным образом модифицировать функцию ЛПВП трансгенных животных.

Говоря об особенностях экспрессии введенной в геном кроликов конструкции с антисмысловым вариантом гена ano A-I человека, следует отметить, что продолжительность ее функционирования, по-видимому, была ограничена во времени несколькими месяцами рабо-

ты. Косвенным свидетельством в пользу этого является тот факт, что к возрасту 6-и месяцев, различия между липидными показателями крови нормальных и трансгенных кроликов нивелировались. Данные об ограниченном по времени функционировании экзогенных конструкций, доставленных в клетки организма - реципиента, известны из литературы и еще недостаточно охарактеризованы (Jahner et al., 1982; Kaleko M. et al., 1991).

4.2. Трансгепные кролики, несущие ген ano A-I человека

Конструкция, содержащая ген ano A-I человека в нормальной ориентации под контролем промотора гена rpL32 (рис. 6а), была инъецирована в оплодотворенные яйцеклетки кроликов, которые затем имплантировались в матку крольчихам-реципиентам. У двух самок родилось 7 крольчат, из которых два оказались трансгенными по результатам ДНК- гибридизации по Саузерну (кролики NN III-11 и III-12). По проведенным расчетам, трансгенные кролики содержали 5-10 копий интегрированного в хромосомы гена ano A-I человека. Результаты анализа свидетельствуют о наличии в ДНК различных тканей (мозг, легкие, селезенка, почки, печень) экзогенных последовательностей, содержащих кДНК ano A-I человека.

У обоих грансгенных кроликов уже в возрасте 3-х недель выявились выраженные нарушения двигательных функций (параличи) передних (кролик Ш-12) или передних и задних (кролик Ш-11) конечностей. Анализ лигшдного состава сыворотки крови обследованных кроликов в возрасте 1.5 месяцев не обнаружил у трансгенных животных существенных отклонений от аналогичных показателей нормальных кроликов, за исключением заметного снижения уровня ХС-ЛП8П у кролика III-12.

цРНК, выделенную из печени, мозга и почек кролика 111-12 , анализировали методом дот-гибридизации на присутствие соответствующих мРНК; для контроля использовали цРНК печени интактных кроликов и эмбриональных клеток человека. Результаты РНК-ДНК гибридизации свидетельствуют о наличии мРНК ano A-I человека в составе цРНК печени и мозга и об отсутствии ее в цРНК почек кролика Ш-12. Таким образом, в таких тканях как печень и мозг взрослого кролика, в которых экспрессия природного гена ano A-I не происходит, выявляется мРНК, специфическая для кДНК гена ano A-I человека, то есть в клетках этих тканей имеет место транскрипция чужеродного гена ano A-I. Тем не менее, иммунохимическое тестирование ano A-I человека в экстрактах клеток печени и мозга трансгенного кролика было безрезультатным, что можно объяснить особенностями использованной для трансгенеза конструкции. Продукт транскрипции трансгена ano A-I представляет собой гибрид из 5- кодирующего района гена rpL32 (нетранслируемый 1-ый экзон и 1/3 первого интрона), РНК - копии

кДНК гена ano A-I человека, содержащей часть лидерной области и открытую рамку считывания, а также 3'- нетранслируемый район мРНК rpL32.

Вследствие этого, функционирование гибридной мРНК в клетках, по-видимому, будет аналогично функционированию мРНК rpL32, которая в неделящихся клетках практически не транслируется, сохраняясь в виде мРНП, не образуя с рибосомами полисом ( Perry R. et а!., 1984). Следовательно, неделящиеся клетки таких тканей взрослого (трансгенного) кролика как печень и мозг были не способны обеспечить полноценную экспрессию гена ano A-I человека под контролем промотора rpL32, хотя в случае тех же тканей эмбриона мыши экспрессия гена-маркера под контролем промотора rpL32 происходила (см. выше).

Электронно-микроскопический анализ тканей кролика III-12 показал, что в сером веществе спинного и головного мозга имели место значительные деструктивные изменения. В частности, в пирамидных клетках всех слоев коры головного мозга, в нейронах вентральных рогов спинного мозга наблюдали деструкцию мембран эндоплазматиче-ской сети, аппарата Гольджи и митохондрий. Значительные изменения выявлены в синаптических мембранах; изменения отмечались в олиго-дендроцитах, среди которых было много погибших клеток. В мышцах передних конечностей среди атрофированных мышечных волокон часто обнаруживались дегенерирующие нервные волокна (рис.10).

Рис. 10 Электронно-микроскопический анализ препарата скелетной мышцы передней конечно-сти кролика JJI-Í2. Ув. X 30000. Справа внизу дегенерирующее нервное волокно (поперечный срез). Дан-ные получены в соавторстве с член-корр. РАМН, проф. В.А. Огеллниым

(НИИЭМ РАМН).

В то же время миелиновые оболочки белого вещества спинного и головного мозга оставались интактными. Отмеченные изменения в ЦНС не соответствуют какой-либо известной природе заболевания нервной системы кроликов и не являются результатом какой-либо инфекции. В других тканях - печень, легкие и др. патологических изменений найдено не было.

Наличие глубоко выраженных аномалий в виде параличей мышц конечностей, подкрепленное данными электронно-микроскопического анализа, связывает функционирование перенесенного гена ano A-I с клетками нервной системы в период эмбрионального развития. К настоящему времени появились литературные данные об интерференции белковых продуктов природного и экзогенного генов ano A-I в тканях трансгенных мышей и крыс ( Rubin Е.М. et al., 1991; Swanson М.Е. et al., 1992). При этом уровень экспрессии природного гена ano A-I значительно понижен, а экзогенного (человека) - весьма высок. Учитывая изложенное выше, можно предположить, что развившиеся аномалии нервной системы, включая соответствующие разделы спинного мозга трансгенных кроликов объясняются временной активностью грансгена в эмбриональных клетках нервной системы, что выражается в подавлении синтеза природного ano A-I в этих клетках и в аномальной деятельности в данный момент чужеродного ano A-I.

Различия в физико-химических свойствах, связанные с различиями в первичной структуре ano A-I кролика и человека, выявленные нами с помощью компьютерного анализа первичных нуклеотидных последовательностей генов ano A-I млекопитающих, позволяют предположить интерференцию продуктов экспрессии генов ano A-I человека и кролика на эмбриональной стадии формирования нервной системы трансгенного животного, что может привести к аномалиям в виде паралича конечностей кроликов. Однако в существующей литературе к моменту получения описанных результатов отсутствовали какие-либо данные о синтезе ano A-I в клетках нервной системы млекопитающих, включая эмбриональные стадии развития. Для выяснения этого вопроса были проведены эксперименты по гибридизации in situ кДНК ano A-I человека с РНК поперечных срезов эмбрионов кролика и эмбрионов человека. Результаты этих экспериментов свидетельствуют об экспрессии гена ano A-I в ЦНС на ранних эмбриональных стадиях развития млекопитающих (рис. И). Эти данные подкрепляют предположение о возможной интерференции продуктов экспрессии экзогенного и природного генов ano A-I в клетках формирующейся нервной системы трансгенных кроликов. Полученные в настоящей работе результаты были подтверждены сведениями о синтезе ano A-I in vitro в клетках головного мозга млекопитающих (поросят)(Моске! В. et al., 1994).

Рис. 11 Гибридизация in situ срезов 5-недель-ного эмбриона человека с кДНК ало A-I человека. Участок сре-за - нервная трубка и спинальные ганглии (ув.Х 107).

Наблюдавшийся феномен нейрогенного паралича конечностей у трансгенных кроликов можно рассматривать как моделирование ней-рологического синдрома Тенжирской болезни человека, молекулярные механизмы которого еще не известны, однако известно, что у больных этой болезнью наряду с низким содержанием плазменного ano A-I отмечаются неврологические параличи конечностей (Fredrickson D.S. et al., 1972). С другой стороны, результаты настоящего раздела работы свидетельствуют о важной и еще не изученной роли локального синтеза ano A-I в образовании нервной ткани млекопитающих.

Доставка бактериальных геиоз- маркеров и гена ano A-I в печень крыс (Данные получены совместно с М.М. [Павловским, Отдел молекулярной генетики НИИЭМ РАМН)

Доставка ДНК в комплексе с poIy(L-Lys)ASOR в клетки печени млекопитающих обусловлена тем, что на поверхности гепатоцитов находятся асиалогликошротеиновые рецепторы, специфически связывающие десиалированные глнкопротеины крови ( Cristiano R.J., Roth J.A., 1995). В качестве лиганда, связывающегося с этими рецепторами, был использован десиалированный орозомукоид (ASOR), сконъюги-рованный с поли-L-лизином - poIy(L-Lys).

Для доставки генетических конструкций в печень, крысам в воротную вену инъецировали комплексы указанного молекулярного конъю-гага с плазмидами, несущими: ген neo (представляющую собой ретро-вирусный вектор pZipNeo), бактериальные гены-маркеры lacZ, cat , а также ген ano A-I человека ( три последних гена находились под контролем промотора CMV).

Доставка в печет бактериального гена-маркера neo

У крыс, которым в виде комплекса с молекулярным конъюгатом была внутривенно инъецирована pZipNeo (по 25 мкг ДНК на крысу), в составе ДНК, изолированной из клеток печени спустя 24 час после

инъекции, выявляли методом ПЦР специфичный для гена neo фрагмент в 154 п.н., из расчета, приблизительно, одна копия гена на 20 клеточных геномов.

Полученные данные свидетельствует об успешном переносе экзогенной ДНК в клетки печени. Позитивные результаты были получены благодаря проведению двух последовательных раундов амплификации (аликвота реакционной смеси после цикла из 30 раундов амплификации была использована для проведения следующего цикла из 30 раундов).

Доставка в печет бактериального гена-маркера Cat

Активность бактериальной Cat была обнаружена в цитоплазмати-ческой фракции клеток печени животных, спустя 24 часа после внутривенной инъекции крысам по 20 мкг ДНК, содержащей ген-маркер cat под контролем промотора CMV (pCMVcat) (рис. ! 2).

Рпс.12 Определение активности Cat в экстрактах клеток печени крыс после внутривенной инъекция им генетической конструкции pCMVcat б комплексе с коиъю-гатом poly(L-Lys) ASOR. Определение Cat-активнос-ти проводили спустя 24 часа после

внутривен-ной инъекции ком-плексов. Хф - |4С-хлорамфеникол (Amersham), Аф -ацетилированные формы Хф. К - экстракт клеток печени интактной крысы (отрицательный контроль); 1-4 - экстракты клеток печени инъецированных крыс.

Вместе с тем, по результатам Cat-теста видно, что активность Cat у разных животных варьирует, что может быть связано с индивидуальными различиями в количестве асиалогликопротеиновых рецепторов на гепатоцитах (Perales J. et al., 1994) , или с различиями в концентрации малоизученных факторов, влияющих на активность Cat. Тем не менее, полученные результаты свидетельствуют об успешной экспрессии сконструированного нами вектора экспрессии гена cat in vivo в гепатоцитах крысы.

К 1 2 3 4 К

Доставка в печень бактериального гена-маркера 1ас2

[5-галактозидазная активность, выявленная в цитоплазматической фракции клеток печени спустя 24 ч после инъекции ДНК (по 2 и по 20 мкг на крысу), была прямо пропорциональна количеству инъецированной ДНК фСМУ1ас2) (рис. 13).

24 часа

7 недель

Рис.13 Определение (5-галактазндазнон активности в цитоплазматической фракции клеток печени крыс, которым инъецировали плазмидный вектор экспрессии гена pCMVlacZ в комплексе с молекулярным конъюгатом.

Образцы питоплазматических фракций клеток печени крыс тестировали спустя 24 час после инъекции соответственно 2 мкг ДНК и 20 мкг ДНК или через 7 недель после инъекции 2 мкг ДНК (с последующей частичной гепатоэктомиен) в стан-даргных условиях определения ¡3-галактозидазы, используя для реакции хромоген-ный субстрат - о-нитрофеш!л-Р-0-галактопиранозид. Время реакции 4 час. Активность представлена в условных единицах соответствующих единицам OD429HM, приведенным к 100 мкг белка цитоплазматической фракции. Значения контрольных проб не превышали фона и были везде вычтены.

Спустя 48 ч в экстрактах клеток печени активность этого бактериального фермента, практически, не обнаруживалась. Вместе с тем, у крыс, которым внутривенно инъецировали по 2 мкг ДНК с последующим проведением частичной гепатоэктомии, активность р-галактозидазы сохранялась спустя семь недель после операции и была значительно выше, чем у крыс, инъецированных тем же количеством ДНК (без гепатоэктомии), тестированных спустя 24 ч. Полученные данные подтверждают результаты предшествующих исследований с использованием бактериального гена cat под контролем промотора сывороточного альбумина (Wu С. et al., 1989), а именно, что экспрес-

сия гена-маркера cat, доставленного в печень крыс в виде комплекса с конъюгатами poly(L-Lys)ASOR, становится достаточно продолжительной (не менее 11 недель) при условии пролиферации акцептировавших эти комплексы клеток печени. Более того, эффективность экспрессии пе-ренесенного гена-маркера в случае часгичной гепатоэкто-мии оказьша-ется значительно выше на более поздних сроках после инъекции даже небольших количеств ДНК, по-видимому, благодаря попаданию зкзо-генной ДНК в ядра поделившихся гепатоцитов (Wilson J.M. et al., 1992)

Доставка в печень крысы гена ano A-I человека

Конструкцию, содержащую ген ano A-I человека (pCMVapoA-I) в количестве по 2 или 20 мкг, вводили в воротную вену крыс. Ano A-I человека обнарухшвался через 24 час в сыворотке крови только тех крыс, которым вводили по 20 мкг ДНК (рис.14). Содержание ano A-I (в мкг на мг общего белка) в экстрактах клеток печени было на порядок ниже, чем в плазме крови, что указывает на его практически полную секрецию в кровоток.

Полученные результаты свидетельствует об определенном пороговом количестве вводимого гена ano A-I для определяемых количеств секретировавшегося в кровь белкового продукта экспрессии этого гена. Количество обнаруженного в крови крыс ano A-I человека варьирует от 0,06 до 0,11 мг/дл, что, в общем, недостаточно для предполагаемой генетической коррекции пониженного при гипоальфа-липопротеидемии крыс содержания собственного ano A-I, нормальная концентрация которого в крови животных 60-80 мг/дл ( Swanson М.Е. et al., 1992). Тем не менее, мы рассматриваем использованный нами метод адресованной доставки гена ano A-I в печень крыс как весьма перспективный для предполагаемой генетической коррекции пониженного уровня ano A-I и соответственно ЛПВП в крови млекопитающих. Во-первых, потому что количество белкового продукта экспрессии доставленного в печень гена пропорционально количеству инъецированной ДНК (см. рис.13), которое может быть значительно увеличено (до нескольких миллиграмм на крысу), и во-вторых, потому что необходимую продолжительность экспрессии доставленного в ге-патоциты гена можно обеспечить активацией пролиферации клеток путем частичной геиатоэктомии (Wu С.Н. et al., 1989).

Параллельно нашим экспериментам, практически одновременно, двумя группами исследователей из США и Франции были также предприняты попытки доставки гена ano A-I человека мышам ( Deneflé P.P. et al., 1995, Kopfler W.P. et al., 1994). В этих исследованиях для доставки гена ano A-I человека мышам использовали рекомбинантные аденовирусы. В результате, в крови мышей был обнаружен ano A-I человека в концентрации до нескольких миллиграмм на децилитр. Кон-

центрация человеческого ano A-I со временем уменьшалась, практически до нулевого уровня. Основным недостатком этих экспериментов явилась возможность лишь однократной доставки гена, поскольку повторное введение частиц аденовируса, как известно, сопровождается значительным иммунным ответом у животных, кроме того, вирусные частицы в высокой концентрации оказывают определенный токсический эффект (Gerard R., Chan L., 1996). В результате, авторам не удалось достигнуть восстановления концентрации ano A-I у нокаутированных по ano A-I гену мышей (Denefle P.P. et al., 1995).

Рис. 14 Определение содержания аполипопротеина A-I человека в сыворотке крови крыс, которым инъецировали плазмидньш вектор экспрессии pCMVapo A-I в комплексе с молекулярным конъюгатом. Анализировали сыворотку крови крыс, которым было инъецировано по 2 ми ДНК и крыс, которым было инъецировано по 20 мкг ДНК. Тестирование проводили иммунофсрментныи методом, используя поликлональные антитела против очищенного ano A-I. Анализ проводили спустя 24 час после инъекции ДНК.

В ряде работ украинских авторов ( Шульженко В.И. и др. 1990, Фролькис В.В. и др. 1991а, Фролькис В.В. и др. 19916) сообщается о переносе гена ano A-I человека в составе липосом крысам и кроликам разного возраста для изучения эффекта нормализации липидного обмена, нарушенного у этих животных в результате старения. Однако, с учетом оценки данных многих исследователей о переносе генов в клетки млекопитающих в липосомах, использование этого метода без какой-либо модификации для доставки генов in vivo представляется мало эффективным (Culver K.W., 1994; Smith L.C. et al., 1995).

Учитывая все сказанное выше, для нормализации липидного обмена при гиперхолестеринеми и гипоальфа-липопротеидемии и для предупреждения развития атеросклеротических повреждений сосудов у лабораторных животных методами генотерапии могут быть предложены два способа трансплантации в печень гена ano A-I, находящегося под контролем сильного нетканеспецифического промотора. Один из этих способов осуществлен в настоящей работе in vivo - перенос гена ano A-I в виде комплексов с молекулярными конъюгагами, другой -апробирован in vitro - доставка гена ano A-I в составе рекомбинант-ных ретровирусов.

Разновидности предлагаемого способа введения ДНК в печень в комплексе с молекулярными конъгогатами предусматривают последующую после доставки гена частичную гепатоэктомию, для длительного сохранения (больше двух месяцев) введенной генетической информации в гепатоцитах. Способы переноса гена ano A-I животным в комплексе с молекулярными конъюгатами и в составе ретровирусов лишены токсического эффекта и не вызывают иммунного ответа организма (Yang Y. et al., 1994; Gerard R., Chan L., 1996 ). Кроме того, по мере надобности, инъекции гена ano A-I в комплексе с молекулярным конъюгаюм могут выполняться многократно. Таким образом, оба предлагаемых подхода выгодно отличаются от более эффективного, но токсичного и кммуногенного способа переноса генов в составе ре-комбинантных аденовирусов и нетоксичного, но малоэффективного способа доставки гена в липосомах.

По появившимся недавно сообщениям, продолжительность экспрессии генов, доставляемых в печень млекопитающих в комплексе с молекулярными конъюгатами, может быть значительно увеличена, если в качестве лиганда поверхностного рецептора гепатоци гов вместо ASQR использовать галактозу (Gal) (Perales J. С. et al., 1994). Использование молекулярного конъюгата вида poly(L-Lys)Gal обеспечивает продолжительное функционирование доставленного в печень гена в течение нескольких месяцев и без выполнения гепатоэктомии ( Perales J.C. et al., 1994; Erbacher P. et al., 1996). Проведенные в наших условиях эксперименты по переносу гена-маркера LacZ in vitro в гепатомные клетки крыс (НТС) и человека (HepG2) в виде комплекса с молекулярным конъюгатом poly(L-Lys)Gal дали положительные результаты, которые могут рассматриваться как предварительные для достижения (без частичной гепатоэктомии) продолжительной экспрессии гена ano A-I человека, доставленного in vivo в печень лабораторных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование посвящено изучению проблемы экспрессии гена ano A-I человека в клетках млекопитающих.

В участке 5'-концевого района (энхансера/промотора) гена ano A-I, ответственном за тканеспецифическую репрессию, обнаружены два цис-элемента регуляции транскрипции, относящиеся к семейству Apl-элементов: 5'-CTGACTCTG-3' и 5-ATGAGTCTG-3'. Первый из них аналогичен цис-элементу PF1, который был ранее найден в промоторе гена онкобелка р53, а второй весьма близок к каноническому цис-элементу TRE семейства элементов Api. Показана способность этого участка гена ano A-I образовывать комплексы с белками экстрактов эукариотических клеток (дрожжи, HeLa, человеческие гепатомные клетки). Элемент PFl/apo отличается по своим свойствам от канонических элементов Api тем, что взаимодействует с белками, чья экспрессия в отличии от известных факторов транскрипции Api, не активируется при стимуляции роста клеток сывороткой. Фрагмент 5'-концевого района гена ano A-I, содержащий оба Api-подобных элемента, при добавлении к минимальному промотору гена тимидинки-назы обусловливает репрессию репортерного гена cat в клетках NIH/3T3.

В З'-концевом нетранслируемом районе гена ano A-I человека обнаружен новый GC-богатый элемент (GCC)„, способный in vitro связываться с белками ядерных эксграктов клеток человека и мыши и in vivo регулировать транскрипцию генов млекопитающих. Основной белок ядерных экстрактов клеток HeLa, связывающийся с GCC/GGC -триплетами имеет молекулярную массу 18-20 кДа. В зависимости от вхождения GCC - элемента в состав того или иного промотора (гена rpL32 мыши, гена ТК вируса герпеса), или, возможно, в зависимости от его локализации по отношению к точке начала транскрипции, этот цис-элемент может различным образом влиять на регуляцию экспрессии (быть активатором или репрессором).

Результаты исследования цис-элементов и взаимодействующих с ними факторов транскрипции значительно расширяют представления о структурно-функциональной организации природных районов регуляции экспрессии гена ano A-I человека.

Обнаруженные в 5'-концевом районе гена ano A-I новые Apl-подобные цис-элементы приходятся на участок, важный для ограничения работы гена в тех клетках, где он природно не активен (Higuchi К. et al,, 1988). Решая проблему переноса дополнительных копий гена ano A-I (со своими регуляторными районами) в организм млекопитающего, можно позаботиться о расширении спектра клеток, в которых данный ген может стать функционально активным. Этого эффекта можно достигнуть вводя в клетки комплексы, состоящие из ДНК

(генов) и соответствующих транскрипционных факторов - активаторов или репрессоров (Kaneda J. et al., 1995). Весьма вероятно, что для достижения эффективной экспрессии гена ano A-I при его переносе в соматические клетки млекопитающих указанным образом, важное значение будут иметь комплексы между идентифицированны-ми в работе цис-элементами и соответствующими факторами транскрипции.

В работе были получены и апробированы векторы экспрессии гена ano A-I двух видов: плазмидные и ретровирусные, в которых ген находится под контролем активных нетканеспецифичных промоторов. Изучение экспрессии гена ano A-I под контролем промоторов CMV и rpL32 подтвердило правомерность использования последних для достижения в гетерологичных условиях высокоэффективной экспрессии, которая сравнима с уровнем экспрессии гена ano A-I в клетках при-родно синтезирующих этот белок.

Вместе с тем, в число перспективных промоторов для контроля экспрессии этого гена в таких тканях, как тонкий кишечник и печень, может быть включен и собственный тканеспецифичный промотор гена ano A-I человека. Использование этого промотора может стать, по-видимому, актуальным, для доставки "лечащих" генов в печень, поскольку появляются данные о более длительном функционировании в составе генетической конструкции тканеспецифичных клеточных промоторов по сравнении с более активными, но нетканеспеци-фичньши вирусными промоторами ( Kaleko М. et al., 1991; Rettinger S.D. et al., 1994).

Перенос in vivo гена ano A-I, обладающего антиатерогенными свойствами, должен, по-видимому, иметь стадеспецифические ограничения, то есть к его использованию следует прибегать для соматических тканей и органов взрослого организма или, по меньшей мере, в постнатальный период развития организма. К этому заключению приводят результаты исследований на трансгенных по гену ano A-I кроликах и изучения топологии экспрессии гена ario A-I в период раннего эмбрионального развития человека: поскольку в этот период высока вероятность экспрессии гена ano A-I в клетках ЦНС, любые нарушения баланса содержания ano A-I в этой ткани за счет чужеродного белка могут привести к драматическим последствиям.

При получении кроликов, трансгенных по антисмысловому варианту гена ano A-I человека, возникла проблема временных ограничений в функционировании экзогенных конструкций, содер-жащих сильный нетканеспецифичный промотор вирусного происхождения. Тем не менее, полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о перспективности предложенной модели гиперхолестеринемии на кроликах, трансгенных по гену ano A-I в антисмысловой ориентации, для

изучения молекулярных механизмов развития диелипопротеидемии и для разработки подходов к генотерапии этой патологии.

Проблема генотерапии гиперхолестерлнемии и атеросклероза млекопитающих, направленная на значительное повышение содержания в крови антиатерогенного ano A-I, по-видимому , должна решаться за счет сочетания двух способов переноса этого гена в печень: в составе рекомбинантного ретровируса и в комплексе с молекулярными конъ-югатами. Такие способы как введение гена в составе рекомбинантного аденовируса или в составе катионных липосом представляются менее перспективными, поскольку не могут обеспечить продолжительного функционирования доставленного гена и либо малоэффективны (липосомы), либо токсичны и иммуногенны (аденовирусы).

ВЫВОДЫ

1. В участке 5'-концевого района гена ano A-I человека, ответственном за тканеспецифическую репрессию, идентифицированы два функционально активных Api- подобных цис-элемента, один из которых охарактеризован как элемент PFl/apo, взаимодействующий с ядерными белками семейства Api.

2. В З'-концевом («транслируемом райгне гена ano A-I человека идентифицирован новый GCC-элемент , который проявляет свойства функционально активного цис-элемента. Охарактеризован также новый белковый фактор транскрипции (с молекулярной массой 18-20 кДа), взаимодействующий с идентифицированным GCC-элементом.

3. Ген ano A-I экспрессируется на ранних стадиях эмбрионального развития человека в клетках ЦНС.

4. Доставленный в клетки HeLa ген ano A-I человека, под контролем промотора раннего гена цитомегаловируса, направляет синтез ano A-I в количестве, сравнимом с количеством ano A-I, синтезируемом в клетках гепатомы человека HepG2.

5. Осуществлен перенос гена ano A-I человека в культивируемые клетки млекопитающих в составе рекомбинантных ретровирусов; показаны образование полноценного белкового продукта экспрессии этого гена в инфицированных ретровирусом клетках и секреция ново-синтезированного белка в ростовую среду.

6. Получены кролики, трансгенные по гену ano A-I человека, у которых, в зависимости от ориентации трансгена в генетической конструкции, развивались признаки диелипопротеидемии или выявлялся нейрологический синдром Тенжирской болезни человека.

7. Осуществлена экспрессия гена ano A-I человека в печени крысы после доставки гена в организм животного в виде комплекса ДНК с молекулярным конъюгатои. Человеческий ano A-I был обнаружен в сыворотке крови крысы.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Перевозчиков А.П., Вайсман Б.Л., Дозорцев Д.И., Сорокин A.B., Орлов C.B., Денисенко А.Д., Дыбан А.П., Климов А.Н. Создание модели - трансгенных кроликов - содержащих в геноме антисмысловые конструкции гена аполипопротеина A-I человека для генетической коррекции атерогенных нарушений липидного обмена. Биополимеры и клетка, 1990, 6, 17-24.

2. Дозорцев Д.И., Сорокин A.B., Курышев В.Ю., Перевозчиков А.П., Вайсман Б.Л. Трансгенные кролики как модель форм атеросклероза, Тезисы докл. Всесоюзн. конференции. "Новые направления в биотехнологии", Пущино, 2-4 X 1990, с. 28.

3. Воробьев Е.В., Перевозчиков А.П. Исследование экспрессии гена аполипопротеина A-I на ранних стадиях эмбриогенеза человека методом гибридизации in situ. Онтогенез, 1992, 23,469-479.

4. Перевозчиков А.П., Вайсман Б.Л., Сорокин A.B., Курышев В.Ю., Воробьев Е.В., Дозорцев Д.И., Коновалов Г.В., Отеллин В.А., Диже Э.Б., Миссюль Б.В., Насонкин И.О., Царапкина Е.В., Мальцева O.A., Климов А.Н. Исследование на трансгенных кроликах действия кДНК гена аполипопротеина A-I человека: моделирование нейрологического синдрома Тенжирской болезни человека. Молекулярная биология, 1993, 27, 1-14.

5. Кондратов A.B., Аленин В.В., Перевозчиков А.П., Возможное участие белков семейства АР-1 в регуляции тканеспецифической репрессии гена аполипопротеина A-I. Цитология, 1993, 35,79.

6. Perevozchikov A., Orlov S., Golubev D., Homology of Herpesviruses and human genes is probably involved in the formation of atherosclerotic plaques (ASP). IX Int. Congr. Virol. Glasgow, Scotland, 8-13 August, 1993, WÎ 2-4.

7. Перевозчиков А.П., Серов C.M., Насонкин И.О., Курышев В.Ю., Царапкина Е.В., Балоян Л.Н., Диже Э.Б., Мазуров В.И. Экспрессия в клетках млекопитающих гена аполипопротеина A-I человека,перенесённого в составе рекомбинантных ретровирусов. Доклады академии наук, 1994,335, 646-649.

8. Кондрашов A.B., Аленин В.В., Перевозчиков А.П. Api-элементы в участке 5'-концевого района гена человеческого аполипопротеина A-I, ответственном за тканеспецифическую репрессию этого гена. Доклады академии наук, 1994, 335,643-645.

9. Перевозчиков А.П., Орлов C.B., Кутейкин К.Б. Идентификация нового GC-элемента в промоторе гена рибосомного белка L32 мыши и З'-концевом районе гена аполипопротеина A-I человека, способного in vitro к связыванию с белками клеток мыши и человека. Доклады академии наук, 1994, 338,411-415.

10. Курышев В.Ю, Драпчинская H.JL, Царапкина Е.В., Савинова О. В., Воробьёв Е.В, Диже Э.Б., Денисенко А.Д., Перевозчиков А.П. Эффективная экспрессия гена аполипопротеина A-I, перенесённого в растущие in vitro клетки человека. Бюлл. эксп. бнол. мед., 1994, 118,479-482.

11. Перевозчиков А.П., Диже Э.Б., Курышев В.Ю., Серов С.М., На-сонкин И.О., Драпчинская Н.Л., Царапкина Е.В., Денисенко А.Д. Эффективная экспрессия гена аполипопротеина A-I (ano A-I) после его переноса в клетки млекопитающих и человека. Тезисы докл. VI Симп. биох. липидов, РАН, С-Петербург, 3-6 октября 1994, М. 1995, с.83-84.

12. Перевозчиков А.П., Парфёнова Н.С., Шавловский М.М., Диже Э.Б. Экспрессия гена аполипопротеина A-I человека и бактериальных генов-маркёров после направленного переноса содержащих их генетических конструкций в печень крысы. Тезисы докл. Симп. поев. 110 лет рожд. H.H. Аничкова, РАМН "Липопротеиды и атеросклероз", С-Петербург, 21-23 ноября 1995, СПб, с.78.

13. Орлов C.B., Кутейкин К.Б., Курышев В.Ю., Дкже Э.Б., Перевозчиков А.П. Характеристика нового GC-злемента в регуляторных районах гена аполипопротеина A-I человека и гена рибосомного белка L32 мыши. Тезисы докл. Симп. поев. 110 лет рожд. H.H. Аничкова, РАМН "Липопротеиды и атеросклероз", С-Петербург, 21-23 ноября 1995, СПб, с.74.

14. Курышев В.Ю., Кондратов A.B., Диже Э.Б., Аленин В.В., Перевозчиков А.П. Идентификация API-элементов в участке 5'-регуляторного района гена аполипопротеина A-I человека, ответственном за тканеспещ; фическую репрессию этого гена. Тезисы докл. Симп. поев. 110 лет рожд. H.H. Аничкова, РАМН "Липопротеиды и атеросклероз", С-Петербург, 21-23 ноября 1995, СПб, с.51.

15. Перевозчиков А.П., Курышев В.Ю., Арредоуани М., Парфёнова Н.С., Шавловский М.М., Суконина В.Е., Диже Э.Б., Орлов C.B., Денисенко А.Д., Гайцхоки B.C., Климов А.Н. Направленный перенос гена аполипопротеина A-I человека и бактериальных генов-маркёров в печень крысы. Материалы 5-ой конф. "Геном человека-96" РАН, 15-18 01. 1996, г. Черноголовка, М, 1996, с.81-82.

16. Golubev D.B., Perevozchikov А.Р. The role of herpes virus in etiopathogenesis of atherosclerosis. Russian Medical Journal, 1996, 1, 815.

17. Perevozchikov A.P., Orlov S.V., Kuryshev V.Yu., Dizhe E.B., Kutejkin K..B., Golubev D.B. Characterization of (GGC)n - element which is core of composite found in regulatory regions of human genes important for arteriopathy development. Abstracts. 4th Intern. Conference "AIDS,

Cancer and Related Problems", St. Petersburg, Russia, May 21-25, 1996, p. 62.

18. Perevozchikov A.P., Kuryshev V.Yu., Parfenova N.S., Shavlovski M.M., Dizhe E.B., Denisenko A.D. Delivery and expression of the human apolipoprotein A-I gene and bacterial reporter genes in a rat liver. Abstracts. 4th Intern. Conference "AIDS, Cancer and Related Problems", St. Petersburg, Russia, May 21-25, 1996, p. 144.

19. Перевозчиков А.П., Курышев В.Ю., Арредоуани M., Парфёнова Н.С., Шавловский М.М., Суконина В.Е., Диже Э.Б., Орлов С.В., Денисенко А.Д., Гайцхоки B.C., Климов А.Н. Направленный перенос гена аполипопротеина A-I человека и бактериальных генов-маркёров в печень крысы. Доклады академии наук, 1997, 352, 571-

20. Перевозчиков А.П., Диже Э.Б., Серов С.М., Курышев В.Ю., Арредоуани М., Парфёнова Н.С., Шавловский М.М., Насонкин И.О., Драпчинская Н.Л., Бондарев И.Э., Царапкина Е.В., Суконина В.Е., Денисенко А.Д., Гайцхоки B.C., Климов А.Н. Экспрессия гена аполипопротеина A-I человека, перенесённого in vitro в клетки млекопитающих и in vivo в печень крысы. Молекулярная биология, 1997, 31,215-222:

574.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ano A-I - аполипопротеин A-I

АцХф - ацетилированная форма хлорамфеникола

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДа - килодальтон

кДНК - комплементарная ДНК

ЛПВП - липопротеиды высокой плотности

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

мг - миллиграмм

мкг - микрограмм

мРНК - информационная РНК

мРНП - комплекс белков с мРНК

н. - нуклеотид

нг - нанограмм

п.н. - пара нуклеотидов

рЛПНП - рецептор ЛПНП

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТГ - триглицериды

ТК - тимидинкиназа

ХС - холестерин

ХС-ЛПВП - ХС, связанный с ЛПВП

Хф - хлорамфеникол

ЦНС - центральная нервная система

цРНК- цитоплазматическая РНК

ASOR - десиалированный орозомукоид

CMV - цитомегаловирус человека

Gal - галактоза

poly(L-Lys) - полп-Ь-лизин

rpL32 - рибосомный белок L32

ПЕРЕВОЗЧИКОВ А.П. Экспрессия гена аполипопротеина A-I человека в клетках млекопитающих: автореф. дисс. док. биол. Наук: 03.00.04. СПб, 1997-40 с.

Сдано в набор 14.03.97. Подписано к печати 17.03.97. Объем 2,75 усл. п. л. Формат 90x84/24. Гарнитура тайме. Печать - ризогр. Тираж 100 экз. Заказ № 245. Отдел оперативной полиграфии и информации НИИХ СПбГУ, СПб, Университетский пр.2.

Информация о работе

Перевозчиков, Андрей Петрович
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1997
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Экспрессия гена аполипопротеина А-I человека в клетках млекопитающих ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гена аполипопротеина А-I человека в клетках млекопитающих"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия гена аполипопротеина А-I человека в клетках млекопитающих
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия