Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I на копирование ДНК эукариот

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I на копирование ДНК эукариот"

На правах рукописи

Базалук Виталина Витальевна

ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСОВ СТЕРОИДНЫЙ ГОРМОН-АИОЛИПОПРОТЕИН А-1 НА КОПИРОВАНИЕ ДНК ЭУКАРИОТ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.01.04 - биохимия 03.01.03 - молекулярная биология

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Панин Лез Евгеньевич

доктор биологических наук Гимаутдинова Ольга Ивановна

2 5 МЕН 2010

Новосибирск -2010

/г

004618836

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН, г. Новосибирск

Научные руководители:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Панин Лев Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Гнмаутдииова Ольга Ивановна

доктор медицинских наук Вавнлни Валентин Андреевич

доктор биологических наук Карпенко Лариса Ивановна

Ведущая организация: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится «_» декабря_2010 г.

в _часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Учреждении Российской

Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН

Автореферат разослан «_

» ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г,С. Русских

Общая характеристика работы

Актуальность темы. К настоящему времени известно, что метилирование ДНК, катализируемое ДНК-метилтрансферазами, осуществляется в первые минуты после репликации, т.е. пострепликативно. Это эпигенетическое событие, т.к. нуклеотидная последовательность ДНК при этом не меняется (Baylin S.B., et al., 1998). И хотя метилирование азотистых оснований является стабильной и наследуемой модификацией, оно обратимо под воздействием деметилирующих агентов или ферментов и, тем самым, принципиально отличается от мутаций ДНК. В общебиологическом плане феномен метилирования ДНК является элементом системы распознавания «свой-чужой». Существует класс белков, которые специфическим образом связываются с метилированными участками ДНК, делая их недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, по-видимому, и для полимераз (Sarraf S.A. et al., 2004; Gebhard С. et al., 2010). Получено много прямых экспериментальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации эукариотических промоторов, а, следовательно, и в регуляции активности генов (Wang G. et al., 2003; Pulukuri S.M. and Rao J.S., 2006).

Общей чертой генома человека является то, что in vivo значительная доля цитозиновых остатков ДНК метилирована, т.е. находится в форме 5-метилдезоксицитидина, который зачастую входит в CpG-«ocTpoBKH». СрО-«островки» локализованы преимущественно в 5'-участках структурных генов: в регуляторных последовательностях, промоторах, последовательностях первого экзона (Baylin, et al., 1998; Turker, et al., 1999). В неметилированном состоянии CpG-«островки» поддерживаются в клетках зародышевой линии и нормальных соматических клетках тканей. Исключение составляют Срй-«островки» в генах, подвергнутых импринтингу, в генах инактивированных Х-хромосом, а также в повторяющихся элементах генома LINE и SINE (например, Alu), где они значительно метилированы (Li Е. et al., 1993).

Одним из наиболее ранних проявлений трансформации, часто еще до появления сформированной опухоли, является снижение числа модифицированных оснований ДНК (Pogribny I.P. et al., 1995). Причины деметилирования генома и конкретные механизмы, обусловливающие его канцерогенный эффект, до сих пор остаются невыясненными. Однако ясно, что тотальное деметилирование может кардинально повлиять на структуру хроматина, степень его конденсации, расписание репликации (Bhattacharya, S.K. et al., 1999).

Регенерация печени после частичной гепатэктомии является хорошо разработанной моделью in vivo для изучения пролиферации клеток, включая репликацию и последующие процессы вплоть до регенерации органа (Панин Л.Е., Маянская H.H., 1987; Michalopoulos G.K. and DeFrances MC., 1997; W. de Graaf et al., 2008). В настоящее время внимание подавляющего большинства исследователей обращено на механизмы регуляции транскрипции, обусловленные статусом метилирования генома, а его влияние на репликацию ДНК остается в тени.

В Институте биохимии СО РАМН ранее было открыто явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в процессе регенерации, в котором принципиальную роль играли стероидные гормоны и липопротеины высокой плотности 3 подкласса (ЛПВПз) (Панин Л.Е., Усынин И.Ф., Поляков Л.М., Харьковский A.B., 1994; 1999). Показано, что функцию переносчика стероидных гормонов в ядра клеток в данном механизме выполняет аполипопротеин A-I (АпоА-1) (Панин Л.Е. и др., 1992). Образование биологически активного комплекса стероидный гормон-АпоА-I протекает в резидентных макрофагах. Затем осуществляется перенос данного комплекса в ядра соматических клеток, где он взаимодействует с ДНК с последующим усилением экспрессии генов и/или репликации ДНК. Молекулярные механизмы данных явлений во многом еще не раскрыты. К ним следует отнести механизмы регуляции копирования ДНК и роль метилирования азотистых оснований в расписании репликации с участием комплексов стероидный гормон-АпоА-I. Особенности гормональной индукции процессов репликации, пролиферации важны для понимания физиологической регенерации тканей и особенно актуальны для понимания возможности ингибирования роста опухолей.

В связи с этим в данной работе мы исследовали влияние комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I на процесс копирования ДНК крысы и человека и особенности копирования ДНК в регенерирующей печени крыс Вистар в разные интервалы времени после частичной гепатэктомии.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования являлось изучение молекулярных механизмов действия комплексов стероидный гормон (тетрагидрокортизол, кортизол, андростерон)-аполипопротеин A-I на процесс копирования ДНК крысы и человека в зависимости от статуса метилирования.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выделить белковый экстракт из ядер клеток печени крыс с активными иолимеразами.

2. Исследовать влияние комплексов стероидный гормон-АпоА-I на копирование ДНК in

vitro.

3. Оценить влияние метилирования ДНК крысы и человека на взаимодействие с комплексом стероидный гормон-АпоА-1.

4. Изучить влияние метилирования олигонуклетидных дуплексов 5'-АзСС(ССС)з*5'-GG(CGG)3T3 на взаимодействие с комплексами стероидный гормон-АпоА-1.

5. Изучить копирование ДНК с участием комплексов стероидный гормон-АпоА-1 (стероидный гормон - ТГК или кортизол) в зависимости от статуса метилирования на модели гепатэктомированных крыс.

Научная новизна работы

Впервые показана способность комплексов стероид-АпоА-I (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон, андростерон) in vitro выполнять роль, подобную роли факторов, изменяющих структуру ДНК в процессах репликации. Комплексы стероид-АпоА-1 (тетрагидрокортизол, андростерон) регулируют реакцию копирования ДНК крысы и человека, катализируемую как фрагментом Кленова из Е. cotí, так и ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток крысы.

Впервые показана зависимость реакции копирования ДНК крысы от статуса ее метилирования. Деметилированная ДНК менее способна к репликации в регенерирующей печени крыс. В клетках регенерирующей печени крыс через 1,5 суток после гепатэктомии ДНК копировалась так же, как и в контроле, т.е. до гепатэктомии. В обоих случаях происходила активация копирования под влиянием комплекса тетрагидрокортизол (ТГК)-АпоА-1, но не кортизол-АпоА-I. Через 3 суток после частичной резекции печени реакция копирования ДНК ингибировалась.

Определено, что модельный сайт связывания комплексов АпоА-1-стероид олигонуклеотидный дуплекс 5'-A3CC(GCC)3«5'-GG(CGG)3T3 длиной 14 пар нуклеотидов с двумя сайтами рестрикции для рестриктазы Fsp4HI имеет длину, критическую для действия этого фермента и ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. Показано, что комплекс АпоА-1-ТГК защищает олигонуклеотидный дуплекс 5'-A3CC(GCC)3*5'-GG(CGG)3T3 независимо от степени его метилирования от действия ферментов ДНКазы I и рестриктазы Fsp4HI, способствуя в то же время «расплетению» неметилированного дуплекса в отсутствие этих ферментов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Данные, представленные в нашей работе, вносят существенный вклад в понимание молекулярных механизмов репликации ДНК и пролиферации клеток с участием метаболитов стероидных гормонов и аполипопротеина A-I. Доказанное влияние статуса метилирования ДНК на ее копирование является новым вкладом в представления о механизмах и расписании репликации.

Определение критической длины сайта связывания ДНК с комплексом стероидный гормон-аполипопротеин A-I - модельным олигонуклеотидом, для его взаимодействия с ферментами рестрикции и особенности их взаимодействия дополняют современные представления о структурно-функциональной организации генома эукариот.

Полученные данные раскрывают новые особенности механизмов репликации, их роли в пролиферации клеток, в том числе, в опухолях, в которых обнаружено изменение статуса метилирования ДНК. Эти результаты могут быть использованы при обосновании новых методов

коррекции и лечения как пролиферативных, так и дегенеративно-деструктивных процессов в органах и тканях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Процесс копирования ДНК крысы зависит от статуса ее метилирования.

2. Копирование изолированной ДНК in vitro с измененной под влиянием комплекса АпоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) вторичной структурой катализируется как фрагментом Кленова, так и ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток крысы. Комплекс АпоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) способен регулировать процесс копирования, активируя его на 22-27 % или полностью подавляя копирование ДНК в зависимости от его концентрации.

3. Комплекс АпоА-1-ТГК защищает олягонуклеотидный дуплекс 5'-АзСС(ССС)з*5'-GG(CGG)3T3 независимо от степени его метилирования от действия ДНКазы I и рестриктазы Fsp4HI, способствуя в то же время «расплетению» дуплекса в отсутствие этих ферментов. Длина 14 пар нуклеотидов с двумя сайтами рестрикции для рестриктазы Fsp4HI является критической для действия этого фермента и ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI.

4. Деметилированная ДНК менее способна к репликации в регенерирующей печени крыс.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации изложены в 9 публикациях, из них 4 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК. Работы были представлены на VI Конгрессе «Наука о человеке» в Томске в 2005 г., на конференции студентов и молодых ученых «Авиценна» (Новосибирск, 2007 г.), на конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009), доложены на ученом совете НИИ биохимии СО РАМН.

Структура и объем работы: диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, включая 3 таблицы и 44 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературных источников содержит 185 ссылок, включая 30 отечественных.

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выделение белкового экстракта из ядер клеток печени крысы (БЯЭ) и хроматина по (Dignam J. D. et al., 1983) с модификациями.

2. Выделение нативной ДНК из печени крысы линии Вистар и крови человека (здоровые добровольцы) по методу (Karlinsey J. et al., 1989).

3. Введение 32Р-метки в олигонуклеотиды и ДНК (Маниатис Т. и др. 1984).

4. Титрование растворов олигонуклеотидов, комплементарных олигонуклеотидных дуплексов и ДНК комплексами стероидный гормон-АпоА-I (Гимаутдинова О.И. и др., 1998).

5. Ферментативный анализ структуры олигонуклеотидов, ДНК и их продуктов с применением нуклеазы S1 (Vogt V.M., 1973), ДНКазы I (Sambrook J., et al., 1989), ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI и рестриктазы Fsp4HI (Zingg J. M., Jones P. A., 1997; Власова T. И. и др., 1996).

6. Реакция копирования на матрицах ДНК крысы, человека и хроматина in vitro.

1. Электрофорез олигонуклеотидов, ДНК в агарозном и полиакриламидном гелях.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Полное описание результатов приведено в диссертации, в автореферат вынесены результаты, определяющие теоретическую и практическую значимость, а также новизну исследования.

Копирование ДНК, катализируемое фрагментом Кленова и ДНК-полимеразами БЯЭ

Нами было исследовано копирование нативной ДНК in vitro, катализируемое фрагментом Кленова, в присутствии 6-звенных праймеров со статистически случайной последовательностью нуклеотидов. Известно, что фрагмент Кленова представляет собой функциональную субъединицу фермента ДНК-полимеразы I E.coli (Маниатис, 1984).

Как было установлено ранее (Гнмаутдинова О.И., Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., 1998, 1999, 2000, 2003), комплекс тетрагидрокортизол-аполипопротеин АпоА-1 (ТГК-АпоА-I) воздействует на вторичную структуру нативной ДНК, способствуя появлению однонитевых участков. Связь комплекса с ДНК достаточно прочная (Касс. = 106М"'). Однако, он так и остается связанным с этими одноцепочечными участками. При избытке комплекса (более 50 молекул АпоА-I на 1 т.п.н. ДНК) фрагмент Кленова не может вытеснить его из аддукта АпоА-1-ТГК-ДНК. Тетрагидрокортизол также связывается с ДНК, что согласуется с литературными данными (Seraj М. et al., 1996), и способствует появлению некоторого количества однонитевых участков (Кузнецов П.А., 2004). Но ТГК не препятствует копированию ДНК, поэтому количество новосинтезированных фрагментов длиной около 20 N больше, чем в других случаях.

Для изучения воздействия АпоА-I и стероидных гормонов на реакцию копирования ДНК in vitro мы также использовали ДНК-зависимые ДНК-полимеразы, содержащиеся в белковом экстракте из ядер клеток эукариот. Эффективность реакции копирования ДНК, катализируемую с помощью белкового экстракта ядер клеток печени крыс сравнивали с таковой для фирменного препарата фрагмента Кленова.

ДНК титровали возрастающими количествами комплексов стероид-АпоА-I (стероид: ТГК, | андростерон - АС). Дальнейшее изучение условий копирования ДНК в присутствии комплексов стероид-АпоА-I показало, что активация копирования осуществляется в присутствии ТГК и АС в небольшом интервале концентраций их комплекса с белком. При мольном соотношении ДНК/комплекс АпоА-1-стероид (ТГК, АС), равном 1:50, синтезируется на 22-27% больше копий ДНК, чем в отсутствие комплекса (рис. 1 и табл. 1).

К подобному результату приводят как фрагмент Кленова, так и ДНК-полимеразы БЯЭ (табл. 1). При дальнейшем повышении концентрации комплекса АпоА-1-стероид наблюдали ингибирование реакции копирования до полного ее прекращения (рис. 1, дор. 3, дор. 4, соответственно; табл. 1). Это можно объяснить связыванием избытка комплекса АпоА-1-стероид (ТГК, АС) с теми последовательностями ДНК, на которых осуществлялось копирование, и неспособностью ДНК-полимеразы конкурировать за эти участки. Следует отметить, что комплекс кортизол-АпоА-I не приводит к подобному эффекту. Число Р32-копий ДНК несколько даже снижается при добавлении этого комплекса в реакционную среду копирования по сравнению с контролем и затем практически не меняется при увеличении концентрации комплекса кортизол-АпоА-1.

12 3 4

} Копии ДНК

ХС

BP

а[Р32]с1СТР

Рис. 1. Копирование ДНК в присутствии комплекса АпоА-1-ТГК. Радиоавтограф после электрофоретического разделения в 20% ПААГ с мочевиной. ХС - ксилен цианол, ВР -бромфеноловый краситель, маркеры размера ДНК.

1. ДНК, контроль

2. ДНК + комплекс, 1:50, моль/моль

3. ДНК + комплекс, 1:100

4. ДНК + комплекс, 1:200

Радиоавтографы мембран сканировали в проходящем видимом свете. Результаты денситометрии выражали безразмерной величиной среднего (из нескольких опытов) коэффициента поглощения света (кпогл. = 1ПоглДо), пропорционального радиоактивности 32Р-зонда.

| 1логл. - световой поток, поглощенный фотографическим почернением на рентгеновской пленке; Ь - световой поток, падающий на пленку.

Таблица 1. Синтез ДНК крысы в присутствии комплексов стероид-АпоА-1, катализируемый

1

В данной работе проводили аналогичные эксперименты по копированию ДНК человека. На рис. 2 представлены результаты сканирования радиоавтографов продуктов копирования ДНК человека, катализируемого фрагментом Кленова в присутствии комплекса ТГК - Ano A-I. Достоверно (п = 8, р* < 0,05) отличаются от контроля (копирование ДНК без комплекса, 1-й столбец) значения при соотношении 8 и 32 комплекса на 1000 пар нуклеотидов ДНК (соответственно 2-й и 4-й столбцы). Но при соотношении 16 комплексов на 1000 пар нуклеотидов ДНК (3-й столбец) уже возникает ингибирование копирования ДНК избытком комплекса, который начинает конкурировать с ДНК-полимеразой за места связывания.

I 1

Рис. 2. Копирование ДНК человека с помощью фрагмента Кленова в присутствии комплекса ТГК - Апо А-1 (среднее ± стандартное отклонение). Обозначения столбцов: 1 -копирование ДНК в отсутствие комплекса; 2, 3, и 4 - соответственно 8, 16 и 32 комплекса на 1000 п. н. ДНК. п = 8, *р < 0,05 по отношению к контролю.

фрагментом Кленова или ДНК-полимеразами БЯЭ.

ДНК/комплекс стероид-АпоА-1 Р^-копии ДНК, относительное кол-во (средний коэффициент поглощения)

фрагмент Кленова Полимеразы БЯЭ

ТГК-АпоАТ АС-АпоА-1 ТГК-АпоА-1

Без комплекса 0.34±0.02 0.27+0.01 0.30+0.02

1:50, моль/моль 0.42*±0.02 0.33*±0.02 0.38*±0.02

1:100 0.25+0.01 0.21+0.01 -

1:200 0 0 0

п=8, Р*<0.05

■в-

0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1

а. О

0,05

0

Таким образом, активация копирования происходит при малых концентрациях комплекса, до 8 комплексов на 1000 пар нуклеотидов ДНК. Дальнейшее увеличение его содержания приводит к ингибированию синтеза de novo (3-й столбец) вплоть до почти полного подавления (4-й столбец). Поэтому мы можем говорить о регулировании процесса копирования ДНК человека комплексом ТГК-АпоА-I, по крайней мере, in vitro, что подтверждает результаты, полученные при исследовании копирования ДНК другого эукариота - крысы Вистар.

Поскольку ранее было показано, что комплексы стероид-АпоА-I (ТГК, АС, дегидроэпиандростерон - ДЭА и дегидроэпиандростерон-сульфат - ДЭАС) способны влиять на вторичную структуру ДНК, вызывая появление однонитевых Sl-нуклеазочувствительных участков в сайтах связывания (Гимаутдинова О.И, Панин Л.Е., 1998; Панин Л.Е., Тузиков Ф.В. и др., 1999, 2000, 2002) можно утверждать, что именно в этих сайтах инициируется копирование ДНК de novo.

Анализ наших данных по воздействию комплекса стероидный гормон-АпоА-I на вторичную структуру ДНК вместе с литературными данными по активации этим комплексом синтеза ДНК, РНК и белка в гепатоцитах печени крысы (Панин и др., 1999, 2002, 2005), позволил сделать предположение об участии комплекса стероидный гормон-АпоА-I в индукции пролиферации клеток (Гимаутдинова О.И., 2007). Как известно, в процессе митоза происходит репликация ДНК эукариот, катализируемая ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами, и образование ДНК-копий с матрицы.

Из табл. 1 видно, как в гетерологичной (ДНК крысы - ДНК-полимеразы E.coli), так и в гомологичной (ДНК крысы - ДНК-полимеразы крысы) системе происходит активация копирования ДНК в присутствии определенной концентрации комплекса (1 моль ДНК/50 моль белка в составе комплекса), достаточной для образования максимального количества внутренних однонитевых участков. Отсюда можно сделать вывод, что их образование способствует активации реакции копирования, катализируемой как фрагментом Кленова, так и гомологичными ДНК-полимеразами.

Из полученных данных сделан вывод, что комплексы стероид-АпоА-I активируют реакцию копирования ДНК крысы (стероид: ТГК, АС) и человека (стероид - ТГК) на внутренних однонитевых участках, образующихся под влиянием этих комплексов, как в гомологичной (ДНК крысы/ДНК-полимераза крысы), так и в гетерологичной (ДНК крысы или человека/ДНК-полимераза E.coli) системах. Степень активации копирования составляет 22-27% при 50-кратном молярном избытке комплекса по отношению к ДНК. Дальнейшее увеличение концентрации комплекса приводит к подавлению реакции копирования, катализируемой как фрагментом Кленова, так и ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток печени крысы.

Копирование ДНК проводили и в составе хроматина в присутствии тетрагидрокортизола и его комплекса с АпоА-1 с помощью фрагмента Кленова и ДНК-зависимых ДНК-полимераз, содержащихся в БЯЭ. Изучение влияния комплекса стероидный гормон-АпоА-I на синтез ДНК при использовании хроматина в качестве матрицы показало, что при значительном увеличении концентрации комплекса ТГК-АпоА-1 (1:100, моль ДНК/моль белка) наступает полное ингибирование копирования ДНК. Соотношения от 0,2 до 1 молекул АпоА-1 (в составе комплекса) на 1 т.п.н. ДНК приводили к активации на 10-15% реакции копирования.

Процессы копирования ДНК, исследованные в представленных результатах, можно обобщить в следующей схеме.

ТГК-АпоА-1

£

ДНК

ТГК-АпоА-1 СО(ССО)з

изб. ТГК-АпаАЛ

ТГК-АпоА-1 СС(ССС)з

Связывание комплекса ТГК-АпоА-1 с ССС/ССС-участками ДНК

Изменение вторичной структуры ДНК: локальное «плавление» -> одноцепочечные участки

Ингибирование копирования при 100-кратном мольном избытке комплекса ТГК-АпоА-1

Комплекс белков

репликации, ДНК-полимеразы

копии ДНК

воссвсь

копии

Активация копирования в ДНК сайтах, измененных под влиянием комплекса ТГК-АпоА-1

Рис. 3. Схема дозозависимого влияния комплекса ТГК-АпоА-1 на копирование ДНК.

Влияние метилирования па взаимодействие олигонуклеотидов, их комплементарных дуплексов и ДНК с комплексом ТГК-АпоА-1

В данной работе для метилирования дуплексов комплементарных дезоксирибоолигонуклеотидов использовали ДНК-метилтрансферазу М.Рзр4Ш - фермента, катализирующего метилирование азотистых оснований в ОСЫОС/ОСМСС-участках в составе двудепочечной ДНК (1е11зс11 А., 2002). Для подтверждения факта метилирования ДНК или олигонуклеотидных дуплексов использовали рестриктазу Рзр4Н1 - фермент, расщепляющий ДНК , по неметилированным остаткам цитозинов в вС-содержащих сайтах.

В наших экспериментах не всегда происходило эффективное расщепление рестриктазой Рзр4Н1 (рис. 4, дор. 3), из чего можно сделать вывод, что длина 14 п.н. является критической для | работы данного фермента и ДНК-метилтрансферазы, что неудивительно, т.к. эти ферменты катализируют реакции на высокомолекулярной ДНК (1еИзсЬ А., 2002). На рис. 4 видно, что метилированный олигонуклеотидный дуплекс не расщепляется рестриктазой (дор. 1).

тетраплексы ХС

дуплекс ВР

Фрагменты рестрикции

[у-32Р]-АТР

Рис. 4. Радиоавтограф электрофореграммы 32Р-олигонуклеотидного дуплекса (Д) после инкубации с ДНК-метилтрансферазой М.Рзр4Н1 и рестриктазой Рзр4Н1.

1. Д + М.Рзр4Н1 + Рзр4Н1

2. Д + М.р5р4Н1

3. Д + р8р4Ш

4.Д

5. Г2ТЗ

6. метка [у-32Р]-АТР

Нам удалось выявить некоторые закономерности взаимодействия такого олигонуклеотида -модели сайта связывания ДНК, с комплексом ТГК-АпоА-1 и ферментами.

На рис. 5 представлены результаты метилирования дуплекса Г1АЗ-Г2ТЗ размером 14 п.н. с помощью фермента М.р8р4Н1, предназначенного для полимерной ДНК. После обработки дуплекса ДНКазой I (дор. 4) происходит его расщепление. Метилирование оснований в дуплексе ПАЗ-Г2ТЗ уменьшает действие ДНКазы I, т.к. видно, что остается больше негидролизованного дуплекса (дор. 6 и 7) по сравнению с неметилированным (дор. 8 и 9). Комплекс ТГК-АпоА-1 связывается с дуплексом после метилирования его оснований, т.к. на рис. 5 видно, что он защищает метилированный дуплекс от гидролиза ДНКазой I даже в большей степени, чем неметилированный (сравн, дор. 6, 7 и дор. 8, 9). Видно, что комплекс ТГК-АпоА-1 воздействуя на дуплекс, приводит к появлению одноцепочечных олигонуклеотидов (дор. 13, 15). На

. - '

. в ' ■ . ■ - >

12 : ■ Ж. В ' ■

■ . *«

метилированный дуплекс воздействие комплекса выражено в меньшей степени (сравн. дор. 13 и дор. 15). В то же время комплекс АпоА-1 с кортизолом такого эффекта не оказывает совсем (дор. 14, 16).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

ХС

^ 1Р ^Р

ВР

ХС

ВР

Рис. 5. Радиоавтограф 15% ПААГ после разделения электрофорезом олигонуклеотидов ПАЗ, Г2ТЗ и их комплементарного дуплекса, инкубированных с метилтрансферазой М.р5р4Н1, комплексом стероидный гормон-АпоА-1 (где стероид ТГК или кортизол) и ДНКазой I.

1. ПАЗ

2. Г2ТЗ

3.Д;

4. Д + ДНКаза I;

5. Г2ТЗ

6. Д+ М.Рзр4Н1 + К-АпоА-1 + ДНК аза 1

7. Д+ М.Рзр4Н1 + ТГК-АпоА-1 + ДНКаза I

8. Д + К-АпоА-1 + ДНКаза I

9. Д + ТГК-АпоА-1 + ДНКаза I

Ю. Д

11. ПАЗ

12. Д

13. Д + ТГК-АпоА-1

14. Д + К-АпоА-1

15. Д+ М.р8р4Н1 + ТГК-АпоА-1

16. Д+ М.Гзр4Н1 + К-АпоА-1

Таким образом, метилирование азотистых оснований в олигонуклеотидах ПАЗ и Г2ТЗ, входящих в состав дуплекса Г1АЗ*Г2ТЗ или высокомолекулярной нативной ДНК, не препятствует его связыванию с комплексом ТГК-АпоА-1 (рис. 5, дор.12, 13).

Для изучения влияния комплекса ТГК-АпоА-1 на вторичную структуру метилированной ДНК проводили опыты по их взаимодействию и последующему гидролизу нуклеазой 51. В качестве контроля использовали неметилированную ДНК.

На рис. 6 видно, что комплекс ТГК-АпоА-1 вызывает появление 81-нуклеазочувствительных участков на ДНК (дор. 3-5). В то же время метилированная ДНК в присутствии комплекса защищена от гидролиза нуклеазой Э1 (дор. 6-9).

Результаты, представленные на рис. 6, подтверждают ранее полученные данные о воздействии комплекса на вторичную структуру ДНК (сравн. дор. 2 и 3), вследствие которого образуются дополнительные одноцепочечные Б1-нуклеазочувствительные участки (дор. 3, 4); они

защищаются комплексом при увеличении его концентрации от действия Э1 нуклеазы (сравн. дор. 3-5). Видно, что метил-ДНК существенно меньше подвержена действию нуклеазы Б1, чем неметилированная (сравн. дор. 2 и дор. 6) и в присутствии комплекса и в его отсутствие (сравн. дор. 3 и дор. 7; дор. 4 и дор. 8).

123 456 78 9 10

Рис. 6. Влияние комплекса ТГК-АпоА-I на гидролиз метилированной ДНК крысы : иуклеазой S1. М.ДНК - ДНК, метилированная с помощью метилтрансферазы M.Fsp4Hl.

1. ДНК крысы

2. ДНК + Sl

3. ДНК + комплекс (1:0,2) + S1

4. ДНК + комплекс (1:1) + S1

5. ДНК + комплекс (1:2) + S1

6.М.ДНК + Sl

7. М.ДНК + комплекс (1.0,2) + S1

8. М.ДНК + комплекс (1:1) + S1

9. М.ДНК + комплекс (1:2) + S1

10. ДНК X/Hind III

Влияние метилирования азотистых оснований на копирование ДНК

Из литературных данных известно, что в эукариотических клетках степень метилирования ДНК часто коррелирует со степенью экспрессии гена (Гвоздев В.А., 1996; Wang G. et al., 2003), но влияние на копирование выражается только в отдалении репликации ДНК по времени (Bhattacharya, S.K. et al., 1999). Известно, что метилируется, в основном, цитозин, находящийся после гуанозина, образуя 5-метилцитозин (Jeltsch А., 2002), часто включенный в, так называемые, CpG-«ocTpoBKH». СрО-«островки» локализованы преимущественно в 5'-участках регуляторных последовательностях генов (Baylin, et al., 1998).

Нами было исследовано копирование in vitro дополнительно метилированных ДНК крысы и человека с использованием фрагмента Кленова и 6-звенных праймеров со статистически случайной последовательностью нуклеотидов.

На рис. 7 представлены результаты влияния дополнительного метилирования, производимого ДНК-метилтрансферазой M.Fsp4HI, на копирование ДНК человека в присутствии

комплекса ТГК-АпоА-1. Реакцию копирования в этом эксперименте проводили с помощью фрагмента Кленова.

- хс

- ВР

Рис. 7. Радиоавтограф 10% ПААГ после электрофоретического разделения копированной в присутствии комплекса АпоА-1-ТГК дополнительно метилированной ДНК человека (М.ДНК).

1. ДНК + фрагмент Кленова, контроль

2. М.ДНК + фрагмент Кленова, контроль

3. М.ДНК + комплекс (ДНК/комплекс равно 1 т.п.н.: 0,2) + фрагмент Кленова

4. М.ДНК + комплекс (1:1) + фрагмент Кленова

5. М.ДНК + комплекс (1:2) + фрагмент Кленова

6. ДНК + фрагмент Кленова + Р$р4Н1

7. М.ДНК + фрагмент Кленова + Рзр4Н1

8. М.ДНК + комплекс (1:0,2) + фрагмент Кленова+р8р4Н1

9. М.ДНК + комплекс (1:1) + фрагмент Кленова + Рзр4Н1

10. М.ДНК + комплекс (1:2) + фрагмент Кленова + рБр4Н1

На рис. 7 видно, что на дополнительно метилированной ДНК человека копирование идет слабее (дор. 2) по сравнению с контрольной (дор. 1). Так же, как и при копировании контрольной (неметилированной) ДНК (табл. 1, рис. 1), происходит активация копирования комплексом в небольшом интервале концентраций 0,2-1 комплекс на 1 т.п.н. Максимальное количество Р^2-копий отмечается при соотношении 1 комплекс на 1 т.п.н. ДНК (рис. 7, дор. 4, 9). При повышении избытка комплекса АпоА-1-ТГК до 2 комплексов на 1 т.п.н. уже наблюдается ингибирование реакции копирования (дор. 5, 10). На радиоавтографах видны только достаточно длинные (50 N и больше) фрагменты копий ДНК в небольшом количестве (рис. 7, дор. 5, 10).

При копировании метилированной ДНК крысы наблюдается схожая картина.

Этот эксперимент проводили, чтобы оценить действие рестриктазы на довольно короткие ДНК размером от 16 п.н. В геле выделяли участок, содержащий Р32-копии ДНК размером от 16 до 100 п.н., т.к. на этом участке сохраняется прямо пропорциональная зависимость количества ДНК от оптической плотности радиоавтографа. Количество ДНК нормировалось на низкомолекулярный маркер, меченный Р32 (олигонуклеотидный дуплекс, 23 п.н.). Из табл. 2 видно, что метилированная ДНК копируется слабее (№ 5), чем исходная (№ 1) на (14±2)%, но в то же время некоторая активация комплексом ТГК-АпоА1 происходит (№ 7). Очевидно, здесь наблюдается только незначительная активация копирования комплексом неметилированной ДНК (№ 3), т.к. основные более длинные продукты копирования длиннее 100 п.н. находятся вблизи и в «карманах» 15% ПААГ. Рестриктаза, по-видимому, «разрезает» часть копированных фрагментов неметилированной ДНК (№ 1-4), что и должно происходить, но в присутствии комплекса гидролиз копий от 16 п.н. до 100 п.н. идет более эффективно (№ 2-4), чем в его отсутствие (№ 1). Возможно,

в копиях много сайтов рестрикции, т.е. последовательностей вида СС ЫСС/йСЫСС, что подтверждает ранее полученные результаты по воздействию комплекса АпоА-1-ТГК именно на сайты такого рода (Панин Л.Е. и др., 2007). «Разрезание» коротких фрагментов закономерно приводит к их значительному укорочению и утрате в выбранной области наблюдения.

Таблица 2. Относительные количества новосинтезированных 32Р-фрагментов ДНК крысы, определенные при сканировании радиоавтографов с помощью программы Вапс18сап. После реакции копирования проводили гидролиз рестриктазой Рзр4Н1. Количество комплекса ТГК-АпоА-1 рассчитано на 1 т.п.н. ДНК.

№ Реакционные смеси Кол-во 32Р-копий

1 ДНК + фрагмент Кленова (95±2)%

2 ДНК + комплекс (1:0.2) + фрагмент Кленова (88±2)%

3 ДНК + комплекс (1:1) + фрагмент Кленова (105±2)%

4 ДНК + комплекс (1:2) + фрагмент Кленова (94±2)%

5 метил-ДНК + фрагмент Кленова (81±2)%

6 метил-ДНК + комплекс (1:0.2) + фрагмент Кленова (83+2)%

7 метил-ДНК + комплекс (1:1) + фрагмент Кленова (86+2)%

8 метил-ДНК + комплекс (1:2) + фрагмент Кленова (55+3)%

Таким образом, обнаружено влияние статуса метилирования ДНК на ее копирование. Изолированная ДНК крысы и человека, дополнительно метилированная ДНК-метилтрансферазой, в меньшей степени копируется, чем исходная.

Копирование ДНК из печени гепатэктомнрованных крыс

Регенерация печени после частичной гепатэктомии является хорошо разработанной моделью ш vivo для изучения пролиферации клеток и регенерации тканей (W. de Graaf et al., 2008). В связи с этим мы исследовали копирование в регенерирующей печени крысы Вистар в разные промежутки времени после частичной резекции.

Из рис. 8 видно, что комплекс ТГК+АпоА-I стимулирует копирование длинных фрагментов (дор. 3 и дор. 4) в контрольных образцах ДНК; комплекс кортизола с АпоА-I не только не активирует копирование, но и несколько подавляет его (сравн. дор. 3 и дор. 5). В ДНК, изолированной из печени крысы после 3 суток регенерации, стимулирования копирования комплексом ТГК+АпоА-I нет (дор. 8) и сама реакция копирования идет существенно менее активно (дор. 7), чем на контрольной ДНК, т.е. до частичной резекции печени (дор. 3).

Рис. 8. Копирование ДНК крысы на 3 сутки (ДНК 2э) после частичной резекции в присутствии комплексов ТГК-АпоА-I и кортизол-АпоА-I. ДНК/комплекс = 1 т.п.н. : 1.

5% ПААГ окрашен бромистым этидием. ДНК крысы - ДНК из печени крысы, изолированная сразу после гепатэктомии; ДНК крысы 2э - ДНК, изолированная из печени крысы после ее регенерации в течение 3 суток.

1. ДНКЯ. + ДНК VHind III

2. ДНК крысы

3. ДНК + фрагмент Кленова

4. ДНК+ ТГК-АпоА-I + фрагмент Кленова

5. ДНК + К-АпоА-1 + фрагмент Кленова

6. ДНК крысы 2э

7. ДНК 2э + фрагмент Кленова

8. ДНК 2э + ТГК-АпоА-1+ фрагмент Кленова

Дальнейшие исследования по копированию ДНК из печени крысы после частичной резекции проводили, используя метку a[P32]dCTP.

На рис. 9. можно увидеть, что на ДНК крысы через 1,5 суток после частичной резекции печени идет копирование и коротких, и длинных фрагментов ДНК при участии комплекса ТГК-АпоА-1 (рис. 9, дор. 8). На ДНК на 3 сутки после гепатэктомии так же, как и в предыдущем эксперименте (рис. 8) активация копирования комплексом слабая и образуются de novo только небольшие фрагменты ДНК (рис. 9, дор. 2). Комплекс кортизол-АпоА-I ингибирует копирование ДНК через 1,5 суток после частичной резекции печени (сравн. дор. 8 и дор. 9) и ДНК через 3 суток регенерации (сравн. дор. I и дор. 3).

Т.о. на ДНК через 1,5 суток после частичной резекции печени идет копирование подобно контрольной ДНК (до регенерации печени), т.е. происходит активация копирования ТГК в комплексе с АпоА-I и не происходит в комплексе с кортизолом. На ДНК через 3 суток после гепатэктомии ингибируется копирование как в присутствии комплексов ТГК (кортизол)-АпоА-1, так и в их отсутствие.

На рис. 9 можно увидеть, что через 1,5 суток после частичной резекции печени на ДНК при участии комплекса ТГК-АпоА-I идет копирование и коротких, и длинных фрагментов (рис. 9, дор. 8). На ДНК через 3 суток после частичной гепатэктомии так же, как и в предыдущем эксперименте (рис. 8) активация копирования слабая и образуются только небольшие фрагменты ДНК, либо совсем активация не происходит (рис. 9, дор. 2, рис. 8, дор. 7 и дор. 8). Комплекс кортизол-АпоА-1 ингибирует копирование (рис. 9, дор. 3, дор. 6 и дор. 9).

123456789

Рис. 9. Копирование ДНК гепатэктомированной крысы в присутствии комплексов ТГК-АпоА-1 и кортизол-АпоА-1. Радиоавтограф после электрофоретического разделения ДНК в 10% ПААГ. ДНК крысы к - ДНК из печени крысы сразу после гепатэктомии;

ДНК крысы 1э - ДНК из печени крысы через 1,5 суток после частичной резекции;

ДНК крысы 2э - ДНК крысы после регенерации печени в течение 3 суток.

ДНК/комплекс = 1 т.п.н. : 1. Метка - а[Р32]с1СТР.

1. ДНК крысы 2э + фрагмент Кленова

2. ДНК 2э + ТГК-АпоА-1 + фрагмент Кленова

3. ДНК 2э + К-АпоА-1 + фрагмент Кленова

4. ДНК крысы к + фрагмент Кленова

5. ДНК к + ТГК-АпоА-1 + фрагмент Кленова

6. ДНК к + К-АпоА-1 + фрагмент Кленова

7. ДНК крысы 1э + фрагмент Кленова

8. ДНК 1э + ТГК-АпоА-1 + фрагмент Кленова

9. ДНК 1э + К-АпоА-1 + фрагмент Кленова

Для подтверждения результата по активации копирования ДНК, изолированной из печени крысы через 1,5 суток после резекции, провели эксперименты с увеличением времени синтеза. На рис. 10 видно, что активация копирования ДНК комплексом ТГК-АпоА-1 стала еще более заметной (дор. 2 сравн. с дор. 1), в то время как комплекс кортизол-АпоА-1 так же, как и в предыдущем эксперименте подавлял копирование (рис. 10, дор. 3 сравн. с дор. 1).

1 2 3

Рис. 10. Копирование ДНК крысы после частичной гепатэктомии через 1,5 суток в присутствии комплексов ТГК-АпоА-1 и кортизол-АпоА-1. Радиоавтограф после ВР электрофоретического разделения в 10% ПААГ.

1. ДНК + фрагмент Клепова

2. ДНК + ТГК-АпоА-1 + фрагмент Кленова

3. ДНК + К-АпоА-1 + фрагмент Кленова

Таким образом, на ДНК через 1,5 суток после гепатэктомии идет копирование как в контрольной ДНК (до частичной резекции печени), т.е. происходит активация копирования ТГК в комплексе с АпоА-I и не происходит с кортизолом. На ДНК через 3 суток регенерации печени ингибируется копирование и в присутствии комплексов ТГК (кортизол)-АпоА-1, и в их отсутствие.

По-видимому, через 1,5 суток после частичной гепатэктомии есть структуры ДНК, обеспечивающие репликацию, а через 3 суток они утрачиваются. Ранее было показано, что на 3-й сутки после частичной гепатэктомии происходит деметилирование оснований в большей степени, чем через 1,5 суток. Можно думать, что это обеспечивает активацию процессов транскрипции, но не копирования ДНК.

Возможно, метилирование ДНК в области промоторов определяет выключение генов, в то время как деметилирование оснований ингибирует репликацию. Следует отметить, что дополнительное метилирование ДНК (гиперметилирование) по другим участкам генома также способно ингибировать реакцию копирования, по крайней мере, in vitro.

Так как показано связывание с комплексами стероидный гормон (тетрагидрокортизол, андростерон)-аполипопротеин A-I и высокомолекулярной ДНК, и олигонуклеотидных дуплексов (моделей сайтов связывания с указанными комплексами), метилированных ДНК-метилтрансферазой, можно сделать вывод о способности этих комплексов в разной степени влиять на процесс репликации в зависимости от статуса метилирования ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Копирование ДНК in vitro с измененной под влиянием комплекса АпоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) вторичной структурой катализируется и фрагментом Кленова, и ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток крысы. При мольном соотношении ДНК/комплекс аполипопротеин A-I-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон), равном 1:50, синтезируется на 22-27 % больше копий ДНК, чем в отсутствие комплекса. 100-кратный мольный избыток комплекса АпоА-1-стероид подавляет копирование ДНК.

2. Показана способность in vitro комплексов АпоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) выполнять роль, подобную роли факторов, изменяющих структуру ДНК в процессах активации репликации.

3. Олигонуклеотидный дуплекс Г1АЗ-Г2ТЗ (5"-A3CC(GCC)3»5'-GG(CGG)3T3) длиной 14 пар нуклеотидов с двумя сайтами рестрикции для рестриктазы Fsp4Hl имеет критическую длину для действия этого фермента и ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI.

4. Показано, что комплекс АпоА-1-ТГК защищает олигонуклеотидный дуплекс Г1АЗ*Г2ТЗ независимо от степени метилирования от действия ДНКазы I и рестриктазы Fsp4HI, способствуя в то же время «расплетению» неметилированного дуплекса в отсутствие этих ферментов.

5. ДНК из печени через 1,5 суток после гепатэктомии копируется подобно контрольной ДНК (до частичной резекции печени), т.е. происходит активация копирования

тетрагидрокортизолом в комплексе с АпоА-1 и не происходит с кортизолом. На ДНК через 3 суток после гепатэктомии ингибируется копирование как в присутствии комплексов ТГК(кортизол)-АпоА-1, так и в их отсутствие. Деметилированная ДНК менее способна к репликации в клетках регенерирующей печени крыс.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Базалук В В.. Величко Е.Ю., Гимаутдинова О.И., Кузнецов П.А., Панин Л.Е. Инициация копирования ДНК при участии стероидных гормонов и аполипопротеина A-I // VI Конгресс «Наука о человеке»,- Томск, 2005.- С. 21.

2. Gimautdinova O.I., Panin L.E., Bazaluk V.V.. Velichko E.Ju., Kuznetsov P.A. The initiation mechanism of DNA copy with the participation of steroid hormons and apolipoprotein A-I // Intern. Symp. "Molecular mechanisms of cell function regulation".- Russia, Tjumen, 2005.- P. 77-78.

3. Гимаутдинова О.И., Величко Е.Ю., Базалук B.B. Функциональная роль GCC/GGC последовательностей при воздействии на ДНК метаболитов стероидных гормонов в комплексе с anoAI // Бюллетень СО РАМН, 2007, № 5, С. 3 8-40.

4. Гимаутдинова О.И., Панин Л.Е., Базалук В.В., Кузнецов П.А. Влияние комплекса стероид-аполипопротеин A-I на копирование ДНК // Бюллетень СО РАМН.-2007.-№5.-С. 41-44.

5. Панин Л.Е., Гимаутдинова О.И., Кузнецов П.А., Величко Е.Ю., Базалук В.В. Структура сайтов взаимодействия ДНК эукариот с комплексами стероидный гормон-аполипопротеин A-I // Молек. биол,- 2007,- Т. 41, № 4,- С. 647-653.

6. Базалук В.В. Активность ДНК-полимераз из экстракта ядер клеток печени в присутствии метаболитов стероидных гормонов и ano A-I // Материалы конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна».-Новосибирск, 2007.-С. 472-473.

7. Базалук В.В. Влияние вторичной структуры ДНК на ее копирование при участии комплекса стероид-anoAI // Материалы международного молодежного научного форума «Ломоносов-2009», секция «биохимия», МГУ, Москва, 2009; http.y/www.lomonosov-msu.ni/archive/Lomonosov 2009/biochem-2009.pdf

8. Гимаутдинова О.И., Панин Л.Е., Кузнецов П.А. Базалук В,В. Роль аддуктов (GCC/CGG)-стероидный гормон-anoAI в транскрипции и копировании ДНК // Тезисы конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» Новосибирск, 2009, с. 56-57.

9. Гимаутдинова О.И., Базалук В.В.. Кузнецов П.А., Клейменова Н.И. Влияние первичной и вторичной структуры ДНК на связывание с комплексом тетрагидрокортизол-апоА1; роль образовавшихся аддуктов в транскрипции и копировании // Бюллетень СО РАМН, 2010, т. 30, №2, с. 23-27.

Список сокращений и обозначений

АпоА-1 - аполипопротеин A-I; АС - андростерон;

БЯЭ - белковый экстракт из ядер клеток печени крыс Вистар; BP - бромфеноловый синий; Д - дуплекс; К - кортизол;

ЛПВП - липопротеины высокой плотности; М.ДНК - дополнительно метилированная ДНК ПААГ - полиакриламидный гель; ТГК - тетрагидрокортизол; ХС - ксиленцианол;

Fsp4HI - эндонуклеаза рестрикции с сайтом узнавания GCANGC«CGNACG;

M.Fsp4HI - ДНК-метилтрансфераза из Flavobacterium species 4HI;

N - любой нуклеотид;

SAM - 5-аденозил-Ь-метионин.

Соискатель В.В. Базалук

Подписано к печати 22 ноября 2010г. Тираж 100 экз. Заказ № 060. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

/

I

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Базалук, Виталина Витальевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Взаимодействие ДНК со стероидными гормонами и АпоА-1.

1.2. Копирование Д НК.

1.2.1. Репликация.

1.2.2. Ферменты репликации.

1.3. Метилирование.

1.3.1. Общие сведения.

1.3.2. Метилирование ДНК во время эмбриогенеза.

1.3.3. Метилирование генома млекопитающих.

1.3.4. Этапы метилирования генома-.

1.3.5. ДНК-метилтрансферазы.

1.3.6. Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина.

1.3.7. Связь метилирования ДНК с регуляцией экспрессии генов.

1.3.8. Нарушения метилирования ДНК при старении клеток и канцерогенезе.

1.4. Гепатэктомия. Регенерация тканей. Пролиферация клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I на копирование ДНК эукариот"

К настоящему времени известно, что метилирование ДНК, катализируемое ДНК-метилтрансферазами, осуществляется в первые минуты после репликации, т.е. пострепликативно. Это эпигенетическое событие, т.к. нуклеотидная последовательность ДНК при этом не меняется (Baylin S.В., et al., 1998). И хотя метилирование азотистых оснований является стабильной и наследуемой модификацией, оно обратимо под воздействием деметилирующих агентов или ферментов и, тем самым, принципиально отличается от мутаций ДНК. В общебиологическом плане феномен метилирования ДНК является элементом системы распознавания «свой-чужой». Существует класс белков, которые специфическим образом связываются с метилированными участками ДНК, делая их недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, по-видимому, и для полимераз (Sarraf S.A. et al., 2004; Gebhard С. et al., 2010). Получено много прямых экспериментальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации эукариотических промоторов, а, следовательно, и в регуляции активности генов (Wang G. et al., 2003; Pulukuri S.M. and Rao J.S., 2006).

Общей чертой генома человека является то, что in vivo значительная доля цитозиновых остатков ДНК метилирована, т.е. находится в форме 5-метилдезоксицитидина, который зачастую входит в CpG-«ocTpoBKH». CpG-«островки» локализованы преимущественно в 5'-участках структурных генов: в регуляторных последовательностях, промоторах, последовательностях первого экзона (Baylin, et al., 1998; Turker, et al., 1999). В неметилированном состоянии СрО-«островки» поддерживаются в клетках зародышевой линии и нормальных соматических клетках тканей. Исключение составляют СрО-«островки» в генах, подвергнутых импринтингу, в генах инактивированных Х-хромосом, а также в повторяющихся элементах генома LINE и SINE (например, Alu), где они значительно метилированы (Li Е. et al., 1993).

Одним из наиболее ранних проявлений трансформации, часто еще до появления сформированной опухоли, является снижение числа модифицированных оснований ДНК (Pogribny I.P. et al., 1995). Причины деметилирования генома и конкретные механизмы, обусловливающие его канцерогенный эффект, до сих пор остаются невыясненными. Однако» ясно; что тотальное деметилирование может кардинально повлиять на структуру хроматина, степень его конденсации, расписание репликации (Bhattacharya, S.K.etal., 1999).

Регенерация печени после частичной гепатэктомии является хорошо разработанной моделью гп vivo для изучения пролиферации клеток, включая репликацию и последующие процессы вплоть до регенерации органа (Панин JI.E., Маянская Н.Н., 1987; Michalopoulos G.K. and DeFrances М.С., 1997; W. de Graaf et al., 2008). В настоящее время внимание подавляющего большинства исследователей обращено на механизмы регуляции транскрипции, обусловленные статусом метилирования генома, а его влияние на репликацию ДНК остается в тени.

В Институте биохимии СО РАМН ранее было открыто явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в процессе регенерации, в котором принципиальную роль играли стероидные гормоны и липопротеины высокой плотности 3 подкласса (Л1ШП3) (Панин JI.E., Усынин И.Ф., Поляков JI.M., Харьковский А.В., 1994; 1999). Показано, что функцию» переносчика стероидных гормонов в ядра клеток в данном механизме выполняет аполипопротеин A-I (АпоА-I) (Панин JI.E. и др., 1992). Образование биологически активного комплекса стероидный гормон-АпоА-I протекает в резидентных макрофагах. Затем осуществляется перенос данного комплекса в ядра соматических клеток, где он взаимодействует с ДНК с последующим усилением экспрессии генов и/или репликации ДНК. Молекулярные механизмы данных явлений во многом еще не раскрыты. К ним следует отнести механизмы регуляции копирования ДНК и роль метилирования азотистых оснований в расписании репликации с участием комплексов стероидный гормон-АпоА-1. Особенности гормональной индукции процессов репликации, пролиферации важны для понимания физиологической регенерации тканей и особенно актуальны для понимания возможности ингибирования роста опухолей.

В связи с этим в данной работе мы исследовали влияние комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I на процесс копирования ДНК крысы и человека и особенности копирования ДНК в регенерирующей печени крыс Вистар в разные интервалы времени после частичной гепатэктомии.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Базалук, Виталина Витальевна

выводы

1. Копирование ДНК in vitro с измененной под влиянием комплекса АпоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) вторичной структурой катализируется и фрагментом Кленова, и ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток крысы. При мольном- соотношении ДНК/комплекс аполипопротеин A-I-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон), равном 1:50, синтезируется! на 22-27 % больше копий ДНК, чем в отсутствие комплекса. 100-кратный; мольный избыток комплекса АпоА-1-стероид подавляет копирование ДНК.

2. Показана способность in vitro комплексов АпоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) выполнять . роль, подобную роли факторов, изменяющих структуру ДНК в процессах активации репликации:

3. Олигонуклеотидный дуплекс Г1АЗ-Г2ТЗ (5'-Л3СС(ОСС)з*5л-GG(CGG)3T3) длиной 14 пар нуклеотидов с двумя сайтами рестрикции для рестриктазы Fsp4HI имеет критическую длину для действия этого- фермента и ДЬЖ-метилтрансферазы M.Fsp4HT. .

4. Показано, что комплекс АпоА-I-TFK защищает олигонуклеотидный дуплекс Г1АЗ*Г2ТЗ независимо от степени; метилирования от действия ДНКазы I и рестриктазы Fsp4HI, способствуя в то же время «расплетению» неметилированного дуплекса,в отсутствие этих ферментов.

5. ДНК из печени через 1,5 суток после гепатэктомии копируется подобно контрольной ДНК (до частичной резекции печени), т.е. происходит активация копирования тетрагидрокортизолом в комплексе с АпоА-Г и не происходит с кортизолом. 11а ДНК через 3 суток после гепатэктомии ингибируется копирование как в присутствии комплексов TFK (кортизол)-АпоА-I, так и в их отсутствие. Деметилированная ДНК менее способна к репликации в клетках регенерирующей печени крыс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучен молекулярный механизм действия комплексов стероидный гормон (тетрагидрокортизол, кортизол, андростерон)-аполипопротеин А-1 на процесс копирования ДНК крысы и человека. Он заключается в активации реакции копирования в сайтах локального плавления ДНК, стимулированного комплексами ТГК(АС)-АпоА-1, но не кортизол-АпоА-1. В зависимости от концентрации комплексов ТГК(АС)-АпоА-1 происходит регуляция реакции копирования, катализируемая как фрагментом Кленова, так и эукариотическими ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток печени крыс. Максимум продуктов копирования обнаруживается при соотношении 1 комплекс на 1 т.п.н. ДНК, при избытке выше 2 комплексов на 1 т.п.н. наступает ингибирование копирования до полного ее подавления при 5-кратном избытке. Копирование изолированной ДНК крысы активируется комплексами ТГК(АС)-АпоА-1 в большей степени, чем в составе хроматина.

Обнаружено влияние статуса метилирования ДНК на ее копирование. Изолированная ДНК, дополнительно метилированная ДНК-метилтрансферазой, в меньшей степени копируется, чем исходная. В то же время ДНК через 1,5 суток частичной гепатэктомии копируется подобно контрольной ДНК (до резекции печени), т.е. происходит активация копирования комплексом ТГК-АпоА-1 и не происходит с кортизолом. На ДНК через 3 суток регенерации печени ингибируется копирование и в присутствии комплексов ТГК (кортизол)-АпоА-1, и в их отсутствие. По-видимому, через 1,5 суток после гепатэктомии есть структуры ДНК, обеспечивающие репликацию, а через 3 суток они отсутствуют. В нашей лаборатории было показано, что на 3-й сутки происходит более полное

131 деметилирование оснований, чем через 1,5 суток после резекции печени." Можно думать, это деметилирование оснований обеспечивает активацию процессов транскрипции, но не копирования ДНК.

Возможно, метилирование ДНК в области промоторов не только выключает экспрессию генов, но и деметилирование оснований на этих же участках ингибирует репликацию in vivo. Следует отметить, что дополнительное метилирование ДНК по другим участкам генома также способно ингибировать реакцию копирования, по крайней мере, in vitro.

Так как показано связывание с комплексами стероидный гормон (тетрагидрокортизол, андростерон)-аполипопротеин A-I и высокомолекулярной ДНК, и олигонуклеотидных дуплексов (моделей сайтов связывания с указанными комплексами), метилированных с помощью ДНК-метилтрансферазы, можно сделать вывод о способности этих комплексов в разной степени влиять на процесс репликации в зависимости от статуса метилирования ДНК. Гиперметилирование оснований, как и наиболее полное их деметилирование существенно уменьшает активность копирования ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Базалук, Виталина Витальевна, Новосибирск

1. . Альперович Б .И., Орлов А;В., Киселёва Ю.В. Криодеструкция как метод лечения цирроза печени // Анналы хир. гепатол. — 2005. Т. 10. - С. 26 -31. ': . ■ ; > ' • •., ?. •

2. ВанюшищБ.Ф;. Метилирование ДНК и эпигенетика-// Генетикам 2006.-Т.42.-С. 1186-1199.

3. Виленская E.F., Лапиков PI.А. Особенности регуляции экспрессии гена аполипопротеина A-I в онтогенезе! мыши // IV Междун. Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. — 2007.

4. Воробьев Е.В., Перевозчиков А.П. Исследование экспрессии гена аполипопротеина A-I на ранних стадиях эмбриогенеза человека методом гибридизации in situ // Онтогенез. 1992. - Т. 23. - С. 469 - 479:

5. Гимаутдинова О.И., Номоконова Н.Ю., Макарова E.H. Взаимодействие4 аполипопротеина: A-L с эукариотическими и синтетическими ДРЖ. // Бюлл. СО РАМН. 1998.- № 3.- е. 30 - 32.

6. Гимаутдинова О.И., Панин Л.Е. Влияние аполипопротеина A-I в комплексе с тетрагидрокортизолом на вторичную структуру нативной ДНК. // Бюлл СО РАМН! Í998'.-;№;3v- С. 32 - 351

7. Гимаутдинова 0:И1, Панин Л:Е., Кузнецов П.А., Еттянова-Акимжанова М.В. Специфические изменения вторичной структуры, ДНК эукариот под влиянием комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I // Молек. биол. 2002. - Т. 36. - С. 103 - 105.

8. Голенченко BíA., Силаева CiA. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков (матричные биосинтезы) / Основы молекулярной генетики.-М., 2006;

9. Кузнецов П.А., Гимаутдинова О.И., Акимжанова М.В. Изменения вторичной структуры ДНК эукариот вблизи сайтов связывания , комплекса.тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I // Бюлл. СО РАМН.- 2000.- №2.- С. 71-73.

10. Лихтенштейн A.B., Киселева Н.П. Метилирование ДНК и канцерогенез //Биохимия.-2001.-Т. 66.-С. 293-317.

11. Максимов В.Ф:, Коростышевская И.М. Изменение ультраструктуры ядер геиатоцитов при-перфузии печени,разными, классами липопротеинов в присутствии глюкокортикоидов // Бюл. СО РАМН.- 1998.- Т. 89.- С. 47-51.

12. Манукьян Г.В., Ерамишанцев А.К., Сухих Г.Т., Маркарян А.Ш. Внутриорганная аллотрансплантация стволовых и прогениторных клеток при лечении больных циррозом печени и портальной гипертензией // Анналы хир. гепатол. —2007. Т. 12. — С. 31—38.

13. Могиленко Д.А. Регуляция экспрессии гена аполипопротеина A-I человека в клетках моноцитарно-макрофагального ряда при действии фактора некроза*опухоли альфа // Дисс. на соиск.уч.степени канд.биол.наук. СПб.- 2010.-105 с.

14. Оловников- А.М. Иммунный • ответ и процесс маргинотомии в лимфоидных клетках. //Вестник АМН СССР.- 1972.- Т. 12.- С. 85-87.

15. Панин Л.Е., Поляков Л.М., Усынин И.Ф., Суменкова Д.В., Князев P.A. Влияние кортикостероидов в комплексе с аполипопротеином A-I на биосинтез белка в культуре гепатоцитов // Проблемы эндокринологии.- 2009. -Т.З.-С. 45-47.

16. Панин Л.Е., Суменкова Д.В., Князев P.A., Поляков Л.М. Взаимодействие аполипопротеинов A-I и Е в регуляции биосинтеза ДНК, РНК и белка в культуре гепатоцитов крыс // Бюллетень эксп. биологии и медицины. 2007. - Т. 12. - С. 629 - 632.

17. Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., Тузикова H.A., Гимаутдинова О.И., Поляков Л.М. Взаимодействие эукариотической ДНК с аполипопротеином A-I и его комплексами с глюкокортикоидами // Биофизика. 2000.- Т. 45. - С. 611 -619.

18. Панин Л.Е., Усынин И.Ф., Харьковский А.В., Трубицина О.М: Роль клеток Купфера в регуляции биосинтеза белка в гепатоцитах // Вопр. мед. хим.- 1994.-Т. 40:-G. 6-8. :

19. Перевозчиков А;П. Стеролы и их транспорт в развитии, животных // Онтогенез. — 2008. — Т. 39. — С. 165—189.

20. Пышкин С.А., Димов П.Г., Пирогова И.Ю., Батанов А.Н! Стимуляция регенерации в лечений хронических гепатитов й циррозов печени // Анналы хир. гепатол. 2004; - Т. 9.-С. 60-69.

21. Aissani В., Bernard! G. CpG islands: features and distribution in genomes of vertebrates //Gene. -1991.- V.106. -P. 173-183.

22. Antequera F., Bird A. Number of CpG islands and? genes in human and? mouse // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1993;-V. 90.-P. 11995-11999.

23. Asahina K., Teramoto K., Teraoka H. Embryonic stem cells: hepatic differentiation and regenerative medicine for the treatment of liver disease // Curr. Stem Сё11 Res. Ther. 2006: - V. 1. ~P: .1394 56i

24. Ashmore J., Morgan D. In: Adrenal cortex. / A.B. Eisensteiri, Ed. Boston.-. 1967.-p. 249.

25. Ashwell S. and Zabludoff S. Cell Cycle Checkpoints: Preventing an Identity Crisis // Clinical Cancer Research:-2008.-V. 14.-P. 4032-4035:

26. Barbour L., Ball Lindsay G., Zhang K. and Xiao W. DNA Damage Checkpoints Are Involved in Postreplication Repair // Genetics.-2006.-V. 174.-P. 1789-1800.

27. Been M.D. and Champoux J.J. DNA breakage and closure by rat liver type ltopoisomerase-.Separationofthehalf-reactionsbyusingasingle-strandedDNA substrate // Proc: Natl; Acadi Sci. USA 1981r V. 78 — P.,2883-2887.

28. Biälek G., Grosse F. An error-correcting : proofreading: exonuclease-polymerase that copurifies with DNA-polymerase-a-primase //J: Biol: Chem. 1993:- V. 268.- P. 6024-6033.

29. Bjorkchem I., Meaney S. Brain Cholesterol: long secret life behind a barrier // Arterioscler. Thromb: Vase: Biol:-— 20041— V. 24.— P: 806-815. .

30. Bockhorn M., Goralski M., Prokofiev D. et all VEGF is important for early liver regeneration after partial hepatectomy // J; Surg: .Res; 2007. - V. 138! — P. 291-299. ■ . ' v •.■■.'•'.- .

31. Boyes J., Bird A. Repression of genes by DNA methylation depends upon CpG density and promoter strength: evidance for involvement of a methyl-CpG binding protein.//EMBO J.- 1992.- V. 11.-P. 327-333.

32. Burgers P, Koonin E, Bruford E et al. Eukaryotic DNA polymerases: proposal for a revised nomenclature // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 43487 -43490.

33. Chen S., de Vries M.A., and Bell S.P. Orc6 is required4for dynamic recruitment of Cdtl during repeated Mcm2-7 loading // Genes Dev.-2007.-V. 21.-P. 2897-2907.

34. Choudhuri T., Subhash C. Verma, Ke Lan, Murakami M., and Erie S. Robertson: The ATM/ATR Signaling Effector Chk2 Is Targeted by Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen 3C To Release the G2/M Cell Cycle Block // J. of Virology.-2007.-V. 81.-P. 6718-6730.

35. Chuang R.Y., Chretien L., Dai J., Kelly T.J. Purification and characterization of the Schizosaccharomyces pombe origin recognition complex: interaction with origin DNA and Cdcl8 protein // J. Biol. Chem.-2002.-V. 277.-P. 16920-16927.

36. Columbano A., Simbula M., Pibiri M. et al. Triiodothyronine stimulates hepatocyte proliferation in two models of impaired liver regeneration // Cell Prolif. 2008. - V. 41. - P. 521-531.

37. Conchillo M., Prieto J., Quiroga J. Insulin-like growth factor I (IGF-I) and liver cirrhosis // Rev. Esp. Enferm. Dig. 2007. - V. 99. - P. 156-164.

38. Dulic V., Lees E., Reed S.I. Association of humane cyclin E with a periodic Gl-S phase protein kinase. // Science.-1992.- V. 257--P. 1958-1961.

39. Dunham I. Genomics the new rock.ahd roll? // Trends Genet:-2000.-V. l 6.-p. 456-461. . . ;

40. Elpek G.O., Gokhan G.A., Bozova S. Thrombospondin-1 expression correlates, with angiogenesis in experimental« cirrhosis 7/ World J. Gastroenterol. — 2008. V. 14. - P. 2213-2217.

41. FaustoN., Campbell J.S., Riehle K.J. Liver regenerationV/Hepatology. — 2006.-V. 43.-P. 45-53. •

42. FederleyRlG.y,Romano L J. DNApolymerase:stracturalhomology,. conformational dynamics, and the effects of carcinogenic DNAadducts H.h Nucleic Acids (on line).-2010.- pii: 457176. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/208479477dopt

43. Feng W, Collingwood D, Boeck ME, Fox LA, Alvino GM, Fangman WL, Raghuraman MR, . et al: Genomic mapping of single-stranded DNA in hydroxyurea-challenged yeasts identifies origins of replication // Nat Cell Biol.-2006.-V. 8.-P.148-155.

44. Friedberg E.G., Walker G.C., Siede W., Wood. R.D., Sehultz R.A., and; Ellenberger T. DNA Repair and Mutagenesis / Washington, D.C.: ASM Press.-2006.- 1118 pp.

45. Friess E., von Bardeleben U., Wiedemann K., Lauer C. and Holsboer F. Effects of pulsatile Cortisol infusion on sleep-EEG and nocturnal growth hormone release in healthy men//J. Sleep Res.- 1994.-V. 3.-P. 73-79:

46. Friess E., Wiedemann K.,, Steiger A., Holsboer F. The hypotHalamic-pituitary-adrenocortical system and sleep in man // Adv. Neuroimmunol- 1995. -V.5.-P. 111-125.

47. Fuller P.J., Chu S., Fikret S., and Burger. H.G. Molecular pathogenesis of granulosa cellitumours.// Mol; Cell.Endocrinol. 2002. - V. 191. - P. 89-96. '

48. Furnus C.C., Inda A.M., Andrini L.B. et al. Chronobiology of the proliferative events related to angiogenesis in mice liver regeneration after partial hepatectomy // Cell Biol. Int. 2003. - V. 27. - P. 383-386.

49. Furushima D. K., Bradlow H. L. Hellman L., Zumoff B., Gallagher T. F. Metabolic transformation of hydrocortisone-4-C in normal man // J. Biol. Chem. -I960.- V. 255.- P. 2246-2252.

50. Gardiner-Garden M., Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes. // J. Mol. Biol.- 1987.- V. 196.- P.261-282.

51. Gnainsky Y., Spira G., Paizi M. et al. Involvement of the tyrosine phosphatase early gene of liver regeneration (PRL-1) in cell cycle and in liver regeneration and fibrosis effect of halofuginone // Cell Tissue Res. 2006. - V. 324.-P. 385-394.

52. Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C. Mutations In The P53 Tumor Suppressor Gene: Clues To Cancer Etiology And Molecular Pathogenesis. // Cancer Res., 1994 - V. 54. - P. 4855-4878.

53. Halazonetis T.D., Gorgoulis V.G., Bartek J. An Oncogene-Induced DNA Damage Model for Cancer Development // Science.-2008.-V. 319.-P. 1352 1355.

54. Halligan B. D., Davis J. L., Edwards K. A., and Liu L. F. Intra-and intermolecular strand transfer by HeLa DNA topoisomerase I. // J. Biol. Chem. — 1982 V. 257. - P. 3995—4000.

55. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer // Cell.-2000.-V. 100.-P. 57-70.

56. Heo J., Factor V.M., Uren T. et al. Hepatic precursors derived from murine embryonic stem cells contribute to regeneration of injured liver // Hepatology. -2006. V. 44. - P. 1478-1486.

57. Herman J.G. and Baylin S.B. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics // Trends Genet. 2000. - V. 16. - P. 168-174.

58. Holliday R. and Ho T. Gene silencing'in mammalian cells by uptake of 5-methyl deoxycytidine-5'~triphosphate-// Somat. Cell Mol. Genet.-199l.-V. 17.-P. 537-542.

59. Hortelano S., Zeini M., Casado M., et al. Animal models for the-study of liver regeneration: role of nitric oxide and prostaglandins // Front. Biosci. 2007. -V. 1.-P. 13-21.

60. Hotchkiss R.D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography J.Biol.Chem. 1948. - V. 175: - P. 315 -322.

61. Jaenisch R., Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how. the genome-integrates intrinsic and environmental signals //Nat. Genet. 2003.-V. 80. Suppl.-P: 245-254.

62. Jeltsch A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and. molecular enzymology of DNA methyltransferases // Chembiochem. 2002. - V. 3.- P. 274293.

63. Jeon S.H., Chae B.C., Kim H.A. et al. Mechanisms underlying TGF-betal-induced expression of VEGF and Flk-1 in mouse macrophages and their implications for angiogenesis // J. Leukoc. Biol. 2007. — V. 81. - P. 557-566.

64. Kaufman M.H. and Richardson L. 3D reconstruction of the vessels that.enter the right atrium of the mouse heart at Theiler Stage 20 // Clin. Anat.- 2005.-V. 18.-P. 27-38.

65. King S. R., Manna P. R. An essential component in steroid synthesis, the steroidogenic,acute regulatory protein, is expressed.in discrete regions of the brain // J. Neurosci. — 2002. — V. 2T. — P. 10613—10620.

66. Koff A., Gross F., Fisher A., Schumacher J., Phillipe M., Roberts J.M. Gyclin E, a new class of human cyclin that can activate the cdc2/CDC28 kinase. // Cell, 1991 -V. 66; - P. 1217-1228. •

67. Krings G., BastiaD. Molecular architecture of a eukaryoticDNAreplication terminus-terminator; protein complex // Mol. Gell; Biol.-2006.-V. 26.-P. 8061,8074; ■■'•'■■.•.■'. •• v .

68. Kumar M., Sarin S.K. Is cirrhosis of the liver reversible? // Indian J. Pediatr. 2007. - V. 74. - P. 393- 399.

69. Kunkel T.A., Soni A. Mutagenesis by transient misalignment // J. Biol. Chem.-1988.-V. 263 .-P. 14784-14789.

70. Lander E.Si, Linton L.M., Birren B. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature.- 2001.-V. 409.-P. 860-921. .

71. Langer H., May A.B., Daub K. et al. Adherent platelets recruit and induce differentation of murine embryonic endothelial progenitor cells to mature endothelial cells in vitro // Circ. Res. 2006. - V. 98. - P. e2-el0.

72. Lautt W.W., Macedo M.P. Nitric oxide and the hepatic circulation // Nitric oxide and the regulation of the peripheral circulation / Eds. P.J. Kadowitz, D.B: McNamara. Boston: Birkhauser.v 2000. —P; 243-258;

73. Lee IT., Cusick R.A., Browne F. et al. Local delivery of basic fibroblast growth factor increases both angiogenesis and engraftmeht of hepatocytes in tissue-engineered polymer devices // Transplantation. 2002. - V. 73. - P. 15891593! ■ .

74. Lei H. Oh S.P., Okano Ml, Juttermann R., Goss K.A., Jaenisch R., and Li E. De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells //Development.- 1996.-V. 122.-P. 3195-3205.

75. Li E., Beard C., Forster A.C., Bestor T.H., Jaenisch R. DNA methylation, . genomic imprinting, and mammalian development// Cold Spring Harbor Sympos.

76. Quant. Biol.-1993.-V.58.- P: 297-305.

77. Liu Y., Zhang H., Veeraraghavan J. et al. Saccharomyces cerevisiae flap eudonuclease 1 uses flap equilibration to maintain triplet repeat slability // Mol. Celh Biol.-2004.-V. 24.-P. 4049-4064.

78. Luedde T., Trautwein C. Intracellular survival pathways in the liver // Liver Int. 2006. - V. 26; - P: 1163-1174.

79. Lysy P.A., Gampard D., Smets F. et al. Stems cells for liver tissue repair: current knowledge and perspectives // World J. Gastroenterol. 2008. - V. 14. — P. 864-875.

80. Makhlouf M.M., Awad A., Zakhari A.A. et al. Vascular endothelial growth factor level in chronic liver diseases // J. Egypt. Soc. Parasitol. 2002. - V. 32. -P. 907-921.

81. Michalopoulos G.K. and DeFrances M.C. Liver Regeneration // Science.-1997.-V. 276.- P. 60-66.

82. Mizuno Si, Nakamura T. Hepatocyte growth factor: a regenerative drug for acute hepatitis and liver cirrhosis // Regen. Med. 2007. - V. 2. - P. 161-170.

83. Mizzen, C.A., and Allis, C.D. Linking histone acetylation to transcriptional regulation // Cell. Mol. Life Sei. 1998. - V. 54. - P. 6-20.

84. Moore K. A. and Lemischka I.R. Stem Cells and Their Niches // Science.-2006.- V. 311.-P. 1880-1885.

85. Norio P. DNA replication: the unbearable lightness of origins // EMBO reports.-2006.-V. 7.-P. 779-781.

86. Novo E., Cannito S., Zamara E. et al. Proangiogenic cytokines as hypoxia-dependent factors stimulating migration of human hepatic stellate cells // Am. J. Pathol.-2007.-V. 170.-P. 1942-1953.

87. Nussey S., Whitehead S. Is the defect in pro-hormone processing in Type 2 diabetes mellitus restricted to the beta cell? // Endocrinology, BIOS Scientific Publishers Ltd.- 2001.-V. 18.-P. 17-21.

88. Oertel M., Shafritz D:A. Stem cells, cell transplantation and liver repopulation // Biochim. Biophys. Acta. 2008. - V. 1782. - P. 61-74.

89. Okano Mf, Bell D.W., Haber D.A., Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for, de novo'methylation and mammalian development // Cell.-1999i-V. 99:- P. 247-257.

90. Okano M., Xie S., Li E. Cloning and characterization of a family of novel mammalian-DNA (cytosine-5) methyltransferases // Nature Genet.-1998.-V. 19:-P.219-220.

91. Panin L.E., Kunitsyn V.G., and Poliakov L.M. Mechanisms of interaction DNA regulatory cis-elements of CC(GCC)5 type//Biofizika.-2008.-V.53.-P. 42-47.

92. Panin L.E., Tuzikov F.V., Gimautdinova O.I. Tetrahydrocortisol-apolipoprotein A-I complex specifically interacts with eukaryotic DNA- andv GCC elements of genes // J. Steroid Biochemt and Mol. Biol.- 2003.- V. 87.- P. 309^318.

93. Pascher E., Chari S., Sturm G. Expression of mRNA for ovarian^ steroid-stimulating factor (apolipoprotein A-I and- apolipoprotein A-I-like protein)1 in human granulose cells // Exp. Clin. Endocrinol. Diabet. — 1997. — V. 105. — PI 122—124.

94. Pena L.R., Hill D.B., McClain C.J. Treatment with glutathione precursor decreases cytokine activity // JPEN. J. Parenter. Enteral Nutr. 1999. - V. 23. — P. 1-6.

95. Petrov V.M. and Karam J.D. Diversity of Structure and Function of DNA Polymerase (gp43) of T4-Related Bacteriophages // Biochemistry (Moscow).-2004.-V. 69.-P. 1213-1489.

96. Plump A. S., Erickson S. K., Wei Weng. Apolipoprotein A-L is required for cholesteryl ester accumulation in steroidogenic cellsand for normal adrenal steroid production // J. Glim Invest. — 1996. — V. 97. - P. 2660-2671. :

97. Pogribny ItP^ Basnakian A.G;, MillenBlL, Lopatina^N;G:, Poirier L.A., and; James S.J. Breaks in Genomic DNA and within the p53 Gene Are Associated with Hypomethylation in Livers of Folate/methyl-deficient Rats// Cancer Res.-1995.-V. 55.-P. 1894- 1901.

98. Raghuraman M.K., Winzeler E.A., Collingwood D:, Hunt S., Wodicka L., Conway A., Lockhart D.J:,, et al. Replication' dynamics of the yeast genome // Science.-2001.-V. 294.-P. 115-121. , :

99. Ross M.A., Sander C.M., Kleeb T.B. et al. Spatiotemporal' expression on angiogenesis growth factor receptors during the revascularization' of regenerating rat liver // Hepatology. 2001; - V: 34. - P. 1135-1148.

100. Rougier N., Bourc'his D., Gomes D.M., Niveleau A., Plachot M., Paldi A., and Viegas-Pequignot E. Chromosome methylation^ patterns during mammalian: preimplantation development // Genes & Dev.-1998.rV. 12.-P: 2108-2113.•s