Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние стероидных гормонов и их комплексов с аполипопротеином А-1 на структуру ДНК

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние стероидных гормонов и их комплексов с аполипопротеином А-1 на структуру ДНК"

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ Павел Александрович

ВЛИЯНИЕ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С АПОЛИПОПРОТЕИНОМ A-I НА СТРУКТУРУ ДНК

03.00.04 - биохимия

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск2004

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (Новосибирск)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, академик РАМН Л^. Панин кандидат химических наук О.И. Гимаутдинова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.П. Мертвецов

кандидатхимическихнаук Е.Л. Черноловская

Ведущая организация:

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ

Защита состоится «_»_2004 года в_часов на

заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

вета

Г.С. Русских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Изучение адаптационных механизмов эукариот, включая человека, на разных уровнях структурной организации, в том числе, клеточном и молекулярном, является одной из актуальных задач современной биологии и медицины. Несомненно, ключом к пониманию важнейших приспособительных реакций организма на действие экстремальных факторов является регуляция экспрессии генов. Эндокринно-метаболичёские взаимоотношения, которые складываются в различных органах и тканях, имеют особое значение для понимания интегративных процессов целостного организма. Именно от них зависит развитие адаптивных или дизадаптивных реакций при действии на организм чрезвычайных раздражителей. В настоящее время хорошо изучены молекулярные механизмы действия некоторых стероидных (Мертвецов Н.П., 1990,1996) и бел ково-пептидных (Мертвецов Н.П., 1999) гормонов на экспрессию отдельных генов. В частности, хорошо известен рецептор-опосредованный механизм глюкокортикоидной индукции ферментов глюконеогенеза (Мертвецов Н.П. и др., 1978). В то же время влияние различных метаболитов и дериватов стероидных гормонов на геном клетки изучено недостаточно.

Классическим представлением в биохимии стероидных гормонов до сих пор считается отсутствие какой бы то ни было биологической активности у тетрагид-рокортизола - метаболита глюкокортикоидного гормона кортизола.

В нашем Институте (НИИ Биохимии СО РАМН) было открыто явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в условиях регенерации (Панин Л. Е. и др., 1987). В результате проведенных исследований были получены ранее неизвестные данные о кооперативном действии глюкокортикоидов и липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в регуляции экспрессии генов по механизму, принципиально отличающемуся от механизма глюкокортикоидной индукции (Панин Л. Е. и др., 1992). На основании полученных экспериментальных фактов было сделано предположение, что комплекс аполипопротеина A-I (апоА-I) с тетрагидрокортизолом (ТГК) может служить индуктором транскрипции генов, оказывая влияние на структуру ДНК в составе хроматина и инициируя начало процесса транскрипции (Панин Л. Е., 1997). В настоящее время можно считать доказанным, что липопроте-ины плазмы крови оказывают выраженное регуляторное влияние на различные типы клеток организма (Панин Л.Е., 1987,Handwerger S., 1989,Favre G., 1993). Показано регуляторное воздействие основного белкового компонента липопро-теинов высокой плотности - аполипопротеина A-I на экспрессию некоторых генов (Handwerger S., 1995,1998).

Данная работа имеет отношение к изучению молекулярных механизмов регенерации. Процессы внутриклеточной регенерации относятся к фундаментальным явлениям. Они связаны с регуляцией экспрессии генов и синтезом огромного количества белков. Эти процессы в клетке протекают непрерывно и направлены на поддержание гомеостаза организма в целом. Молекулярные меха-

Актуальность темы

низмы их очень сложны и не изучены до сих пор. Они включают образование биологически активного комплексов стероидный гормон - аполипопротеин А-I, которое протекает в резидентных макрофагах. Затем осуществляется перенос данного комплекса в ядра соматических клеток, где и происходит его взаимодействие с депротеинизированными участками ДНК. В данной работе наиболее подробно изучался последний этап: взаимодействие различных стероидных гормонов, их метаболитов и комплексов с аполипопротеином A-I с эукариотичес-кой ДНК. Большую важность представляло определение сайтов взаимодействия и их распределение в эукариотической ДНК, изменения её структуры в сайтах взаимодействия с комплексом. Решение этих вопросов позволяет нам приблизиться к пониманию молекулярных механизмов индукции синтеза белков при регенерации и пролиферации клеток.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение механизма действия некоторых стероидных гормонов (кортизола, тетрагидрокортизола, андростерона, дегидро-эпиандростерона, и дегидроэпиандростерон-сульфата), а также их предшественника - холестерина на вторичную структуру ДНК крыс и роль в этом механизме таких белков как аполипопротеин A-I и аполипопротеин Е.

Для достижения данной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Изучить воздействие кортизола, тетрагидрокортизола, андростерона, де-гидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата и холестерина на структуруДНК.

2) Изучить воздействие стероидных гормонов в присутствии апоА-I и апоЕ на структуру нативной ДНК крыс с использованием ферментативных методов анализа.

3) Оценить 1гуклеотидную специфичность в области взаимодействия комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол с ДНК.

Научная новизна

Впервые подробно исследовано воздействие ряда стероидных гормонов коры надпочечников и половых желез (андрогенов) на структуру ДНК. Показано, что взаимодействие стероидных гормонов с эукариотической ДНК приводит к образованию дополнительных одноцепочечных участков. Число таких участков значительно увеличивается при действии некоторых гормонов (тетрагидрокорти-зол, дегидроэпиандростерон, и дегидроэпиандростерон-сульфат) в составе комплекса с аполипопротеином A-I. Даны оценки нуклеотидной специфичности и характера распределения по геному одноцепочечных участков, образующихся под действием комплекса апоА-1-гормон. Впервые обнаружены последовательности, регулярно распределенные по геному, специфично взаимодействующие с восстановленной формой кортизола - тетрагидрокортизолом в присутствии аполипопротеина A-I. Высказывается предположение, что такие последовательности могут играть важную роль в регуляции экспрессии генов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Получены новые данные, вносящие существенный вклад в современные представления о молекулярных механизмах физиологической регенерации и проли-

ферации клеток при участии резидентных макрофагов органов и тканей. Они могут быть использованы при обосновании новых методов коррекции и лечения дегенеративно-деструктивных процессов в органах и тканях. Показано, что биологической активностью обладают не только известные нам гормоны, но и их метаболиты. Важным подходом в усилении регенераторных процессов в тканях может стать активация резидентных макрофагов, роль которых в настоящее время ещё не учитывается в лечении этих форм патологии. Рассмотренные подходы и полученные нами результаты чрезвычайно важны для анализа молекулярных механизмов взаимодействия в системе макрофаг - опухолевая клетка. Это позволит, как мы надеемся, найти новые решения в лечении онкозаболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Взаимодействие ряда стероидных гормонов: кортизола, тетрагидрокорти-зола, андростерона, дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата с ДНК приводит к образованию одноцепочечных участков.

2) Воздействие стероидных гормонов тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата на ДНК существенно усиливается в присутствии апоА-1.

3) Воздействие тетрагидрокортизола и дегидроэпиандростерон-сульфата в составе комплекса с апоА-I приводит к образованию одноцепочечных участков в последовательностях ДНК вида (GCC/CGG)n.

4) Последовательности ДНК, способные взаимодействовать с комплексом апоА-1-тетрагидрокортизол с образованием одноцепочечных участков представлены в геноме в количестве, не меньшем, чем 2 на 100 т.п.о.

5) Последовательность ДНК, способная взаимодействовать с комплексом апоА-1-тетрагидрокортизол с образованием одноцепочечных участков, присутствует в повторяющемся элементе генома размером около 5,5 т.п.о.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации отражены в 5 публикациях и были представлены на международном конгрессе "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека " Феодосия (Украина) 2003 г., доложены на конференции молодых учёных "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" Новосибирск, 2000 г., на ученом совете и семинарах Института Биохимии СО РАМН.

Структура и объём работы: диссертация изложена на 133 страницах, включая 17 рисунков и 9 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (134 ссылки).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Используемые реактивы:

В работе использованы следующие реактивы и материалы. Бромид калия, 2-меркаптоэтанол, формамид ("Мегск", Германия), Tween-20, PEG, SDS, акрила-мид, бисакриламид, тетрагидрокортизол (ТГК), кортизол (К), андростерон, де-гидроэпиандростерон, дегидроэпиандростерон-сульфат (ДЭАС-сульфат), холестерин ("Serva", США), трис-HCl, глицин, мочевина, S1 нуклеаза, проназа, ку-

масси R-250, о-фенилендиамин, пероксидаза хрена, Stains-all, козьи антитела к IgG кролика ("Sigma", США), сефадекс G-15 ("Pharmacia", Швеция), агароза ("Chemapol", Чехия), фрагмент Кленова("Сибэнзим", Новосибирск), 6-звенные статистические праймеры (НИБХСО РАН), кроличьи поликлональные антитела к апо A-I (НИИБХ СО РАМН). ДНК фага А. и ее рестриктиые фрагменты Hind III ("Медиген", Новосибирск).

[а-32Р]-АТР с удельной активностью 50-103 Ки/ммоль(НИБХСО РАН).

Остальные реагенты были отечественного производства квалификации ос.ч. или х.ч.

Основные использованные методы:

1) Выделение аполипопротеинов из крови крыс с помощью изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе KBr (Hatch F.T. et al., 1968) и электрофореза в ПААГ (Laemmli U.K. et al., 1970) с некоторыми собственными модификациями.

2) Выделение ДНК из печени крыс (Blin N., Stafford D., 1976, Karlinsey J. et al., 1989).

3) Электрофорез ДНК и белков (Маниатис Т. и др., 1984).

4) Иммуноферментный анализ (Поляков Л.М. и др., 1991).

5) Дот- и блот-гибридизация ДНК по Саузерну (Southern Е.М., 1975).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ,

Влияние стероидных гормонов и их комплексов с апоА-1 на вторичную структуру нативной ДНК

Известно, что в нативной ДНК присутствуют одноцепочечные участки (Ро-маненко Е.Б. и др., 1998). Нами было показано, что обработка ДНК стероидами - кортизолом и тетрагидрокортизолом, андростероном, дегидроэпиандростеро-ном, дегидроэпиандростерон-сульфатом приводит к появлению дополнительных Sl-нуклеазочувствительных участков на ДНК. Это подтверждает данные, полученные ранее при использовании метода флуоресцентных зондов (Панин Л.Е., Гимаутдинова О.И. и др, 1998). В цитируемой работе не было замечено различия в характере и степени воздействия К и ТГК на ДНК, т.к. в обоих случаях наблюдалось дозозависимое появление однонитевых участков с одинаковым плато концентрационых кривых. Надо отметить, что непосредственное взаимодействие ДНК со стероидными гормонами мало описано в литературе. Известна работа японских эндокринологов (Seraj M.J., et al., 1996), в которой обнаружено связывание различных гормонов, в том числе, кортикостероидов, их предшественника - холестерина и гормональных метаболитов с ДНК in vitro, но вывод авторов о ковалентном связывании гормонов с ДНК вызывает сомнение. Скорее можно говорить об образовании нековалентных аддуктов.

В работе (Панин Л.Е. и др., 2002) показано стимулирующее действие комплексов гормонов тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата с аполипопротеином A-I на биосинтез белка в гепатоцитах, чего не наблюдалось для комплекса апоА-1-кортизол. Это отличие может быть связано с необходимостью окси-группы в положении 3 А-кольца для связывания комплекса с ДНК в регуляторных районах (рис. 1).

Рис I. Некоторые стероидные гормоны и холестерин

Следует отметить, что предшественник всех стероидных гормонов в организме эукариот - холестерин не вызывает образования дополнительных Sl-нуклеа-зочувствительных участков на ДНК. По-видимому, наличие оксиацетоновой или кето-группы при атоме С-17 D-кольца и гидрокси-группы в положении 3 А-коль-ца в кортикостероидах имеет решающее значение для воздействия на вторичную структуру ДНК, хотя холестерин тоже способен связываться с ней, как показано в работе (Seraj M.J., et al., 1996).

Таким образом, мы впервые обнаружили воздействие ряда стероидных гормонов на вторичную структуру нативной ДНК, приводящее к образованию S1-нуклеазочувствительных участков.

Особенности взаимодействия стероидных гормонов с ДНК в присутствии аполипопротеинов А и Е

Как было показано ранее, комплекс апоА-1-стероид сохраняется в интервале рН 5-8, и может содержать от 1 до 3 молекул лиганда на 1 молекулу белка (Панин Л.Е. и др., 1992). Мы исследовали комплексы с различными молярными соотношениями белок-тетрагидрокортизол: 3 молекулы белка - 1 молекула гормона (Панин Л.Е. и др, 1998), 1:1,1:2,1:3 и обнаружили, что комплексы всех указанных составов вызывают появление Sl-нуклеазочувствительных участков на ДНК, однако максимальным эффектом обладал комплекс состава 1 молекула белка-2 молекулы гормона (рис. 2). Комплексы, в состав которых входил кортизол, не вызывали увеличения количества Sl-нуклеазочувствительных участков на ДНК. Для комплексов апоА-1-стероид (андростерон, дегидроэпиандростерон, дегидро-эпиандростерон-сульфат, состава 1 белок-2 гормона) количество образовавшихся под их воздействием S1 -нуклеазочувствительных участков оказалось сравнимым с таковым для комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол аналогичного состава. В работе (Панин Л.Е. и др., 2002) показано, что комплексы апоА-I -тетрагидро-кортизол (андростерон, дегидроэпиандростерон, дегидроэпиандростерон-суль-фат, состава 1 белок - 2 гормона) вызывают увеличение биосинтеза белка в культивируемых гепатоцитах. Тетрагидрокортизол увеличивал биосинтез белка в 1,6 раза, дегидроэпиандростерон-сульфат- в 2,2 раза по сравнению с действием только гормона. По-видимому, комплекс состава 1 белок-2 гормона обладает оптимальной конформацией для максимального воздействия на структуру ДНК. Скорее всего указанная эффективность взаимодействия неодинакова для разных гормонов, и для изучения данного аспекта необходимы эксперименты на модельных ДНК. Мы же в настоящем исследовании предприняли попытку оценить некоторые, самые общие характеристики такого взаимодействия на ДНК крыс.

Так как ранее связывание ДНК с комплексом гормон-апоА-I проводили в буфере с рН 7.5 (Панин Л.Е. и др, 1998), а для действия Sl-нуклеазы оптимальным является рН 5 (Маниатис Т. и др., 1984), в настоящей работе использовали и тот, и другой буфер. При замене буфера картина расщепления Sl-нуклеазой после обработки ДНК комплексами гормон-апоА-I или его отдельными компонентами принципиально не менялась. Ранее было показано, что комплекс гор-мон-апоА-I сохраняется в интервале рН 5-8 (Панин Л.Е. и др., 1992). Это может указывать по нашему мнению на малый вклад электростатических взаимодей-

ствий и предпочтительность гидрофобных взаимодействий как в комплексе гормон-белок, так и при связывании последнего (а также его компонентов) с ДНК. Возможно, что при этом взаимодействии важную роль играют также водородные связи. В свою очередь такой вывод позволяет предполагать, что связывание с ДНК происходит преимущественно по малой бороздке, где основную роль играют гидрофобные взаимодействия.

Рис. 2. Злектрофоретическое разделение ДНК, обработанной комплексом ano А-1-ТГК и SlHyiaieajoü, в ¡% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием 1 - ДНК, 2 - ДНК + SI; 3 -б - ДНК + [апоА-1-ТГК] + SI, от I мопекулы комплекса на 5 тпн до 5 молекул на I тпн ; 7 - ДНК + [anoA-I-K] + SI, 5 мочекул комплекса на 1 тпн; 8 -ДНК + anoA-¡ + S1, 5 молекул белка на I тпн; 9 - ДНК + апоА-I без SI нуклеазы, 5 молекул белка на I тпн , 10 - ДНК А, 11 - ДНК A HmdlII

Эксперименты по оценке воздействия на вторичную структуру ДНК комплекса с тетрагидрокортизолом были проведены и для другого аполипопротеина -апоЕ. Было показано, что данный комплекс не способствует образованию S1-нуклеазочувствительных участков в нативной ДНК печени крыс. Т. е. свойство влиять на вторичную структуру ДНК является специфичным для апоА-I, и не характерно для другого аполипопротеина, входящего в состав ЛПВП, в данном случае - апоЕ.

1 23456789 10 11

Рис 3 Электрофореграмма ДНК обработанной комплексом апоА1-ТГК и 57 нуклеазой (0,35 ЕА/мл) в 0,5% агароз-ном геле

1) контрольная ДНК

2) ДНК + 5/ нуклеаза

3) ДНК + комплекс апоА1-ТГК (I м-ла к-са на I тпо) +5/ нуклеаза

4) ДНК + комплекс апоА1-ТГК (10 м-л к-са на 1 т п о) + 5/ нуклеаза

5) ДНК + комплекс апоА1-ТГК (50 м-л к-са иа I тпо) +31 нуклеаза

6) ДНК А НтШП

Значительное увеличение количества SI-ну клеазочувстви-тельных участков в нативной ДНК под воздействием комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол видно из результатов электрофореза препаратов ДНК в 1% агарозном геле (рис. 2, дорожки 3-6). С повышением концентрации комплекса апо A-I -ТГК в образцах заметно накапливаются фрагменты размером от 15 до 0.5 т.п.н.. При дальнейшем увеличении концентрации этого комплекса выше 2,6*10"6 М существенно ингибируется действие S1 нуклеазы (рис. 3). По-видимому, однонитевые участки защищаются избытком комплекса от действия фермента, что согласуется с полученными ранее результатами по связыванию однонитевых синтетических ДНК с аполипопротеином A-I (Гимаутдинова О.И. и др., 1998). В эксперименте с использованием денатурированной ДНК показано практически полное ингиби-рование S1 нуклеазы при концентрациях комплекса от З'Ю-6 М и выше. Комплекс апо A-I с невосстановленной формой гормона - кортизолом увеличивает незначительно количество Sl-нуклеазочувствительных участков (рис. 2, дорожка 7). Обработка ДНК одним апоА-I также не приводит к изменению распределения и количества однонитевых фрагментов, что видно на дор.8 рис. 2.

В то же время исследуемые нами гормоны в составе комплексов с апоА-1 резко отличаются по действию на ДНК от кортизола, а именно: восстановленная форма гормона - тетрагидрокортизол, андростерон, дегидроэпиандростерон, дегидроэпиандростерон-сульфат в комплексе с апоА-1 приводят к появлению существенного количества однонитевых участков. Последние регистрировались нами ранее методом флуоресцентных зондов (Панин Л.Е. и др, 1998). Широкий спектр размеров расщепленных нуклеазой фрагментов (от 15 до 0.5 т.п.о.) свидетельствует о нерегулярном распределении эффективных сайтов взаимодействия в геноме крыс. Сканирование прозрачности дорожек в негативах электрофорег-рамм, с последующей калибровкой количества ДНК по маркеру, позволяет оценить относительное количество разрушаемых 81 нуклеазой участков ДНК. В случае специфического воздействия, т.е. эффективного дозозависимого влияния ТГК-апоА-1, расщеплению подвергается ~5% исходной ДНК, за вычетом контролей. Из этого следует, что ~2 расщепляемых 81 нуклеазой сайта связывания комплекса приходятся на 100 т.п.о. ДНК.

Влияние структурных особенностей ДНК на ферментативный гидролиз

На рис. 4 представлена электрофореграмма ДНК в 0.5% агарозном геле после взаимодействия с комплексом апо А-1-ТГК (белок/гормон=1:2) и нуклеазой 81 (8 ед/мл в реакционной смеси). Видно, что в присутствии комплекса апоА-1-ТГК образуются фрагменты ДНК размером около 5.5 т.п.о. Комплекс апоА-1 с кортизолом также вызывает образование фрагмента размером 5,5 т.п.о. Вероятно, образование 81-нуклеазочувствительного сайта в данном случае определяется конформацией комплекса и/или протонированием кетогруппы в положении 3 А-кольца стероида при кислом рН. Фрагмент размером в 6 т.п.о. (рис. 4) присутствует во всех реакционных смесях, подвергшихся гидролизу 81 нуклеазой, его количество составляет в среднем 1% от всей ДНК. Появление фрагмента в 5,5 т.п.о. (0,5% от всей ДНК) не вызывает уменьшения количества фрагмента размером 6 т.п.о., т.е. они представляют собой два независимых высококопий-ных повтора, составляющих в целом около 1.5% ДНК. Во многих повторяющихся генах описаны 81 -нуклеазочувствительные участки, встречающиеся в том числе и в промоторной области, однако копийность наиболее частых из них, например, генов рибосомальных РНК, не превышает нескольких сотен на геном. Копийность же обнаруженных нами фрагментов размером 6 и 5,5 т.п.о. составляет ~5000 и ~2500, соответственно, на геном. Рассуждая о возможной природе обнаруженных нами фрагментов, следует учитывать, что апоА-1-иммунореактив-ность обнаруживается в ядрах гепатоцитов, в том числе, в составе ядерного матрикса (Панин Л.Е. и др., 1992). В то же время известен ряд белков ядерного матрикса, способных специфически связывать сателлитную ДНК (Енукашвили Н.И. и др., 1999), некоторые структурные особенности которой позволяют предполагать её повышенную чувствительность к 81 нуклеазе (Лобов И.Б., Подгорная О.И., 1999). Связь участков хромосомной ДНК гиперчувствительных к 81 нуклеазе с ядерным матриксом была показана в работах (Светлова Е.Ю. и др., 1997). Общее количество участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу составляет в эукариотическом геноме не более 10 000, что соответствует примерно

1% генома (Boulikas Т., 1995). Т. о., если фрагменты в 5,5 и 6 т.п.о. относятся к сателлитной ДНК, можно думать, что некоторая часть Sl-нуклеазочувствитель-ных участков образуется под влиянием исследуемого нами комплекса в районах прикрепления сателлитной ДНК к ядерному матриксу. Такое предположение нуждается, конечно, в дальнейшем экспериментальном исследовании.

Оценка нуклеотидной специфичности сайтов взаимодействия комплекса стероидный гормон - апоА-1 с ДНК

GC-богатая последовательность была выбрана исходя из литературных данных (Перевозчиков А.П. и др., 1994) и собственного поиска некоторых нуклео-тидных последовательностей в геномных банках данных. Это (GCC/ CGG)n последовательность, которая, возможно, является консенсусом для участков взаимодействия комплекса апоА-1-ТГК с регуляторными элементами многих генов. Последовательность является регуляторной для гена белка апоА-1 и находится в 3'-концевой части нетранслируемого района гена апоА-1 человека (Перевозчиков А.П., 1997). Последовательности вида (GCC/CGG)n были обнаружены в про-моторной части гена топоизомеразы 2В и гена рибосомного белка L32, которые являются генами "домашнего хозяйства". Предположение о воздействии комплекса ТГК-апоА-! именно на такие гены и их индукция согласуется с данными работы (Рашп L.E. et а!., 2002), где показана активация ядрышковой ДНК и обра-

зование полирибосом под влиянием этого комплекса. Кроме того известно, что GCC-элементы способны связываться с ядерными белками. (Перевозчиков АЛ. и др., 1994). Для того, чтобы проверить высказанное выше предположение, нами была исследована конкурентная способность олигонуклеотида CC(GCC)3 связываться с комплексом апоА-1-ТГК в присутствии ДНК и влиять на последующую реакцию расщепления S1 нуклеазой.

Было показано, что при увеличении концентрации олигонуклеотида CC(GCC)3 количество расщепленных S1 нуклеазой фрагментов ДНК уменьшается.

В отличие от CC(GCC)3> АТ-богатый олигонуклеотид не проявлял способности вытеснять ДНК из комплекса с апоА-I и ТГК.

С целью исследования молекулярных механизмов связывания аполипопроте-ина A-I с участками ДНК определенной нуклеотидной последовательности, мы провели эксперименты с использованием метода гель-ретардации. Для этого белок апоА-I и его комплекс с гормонами (кортизол, ТГК) инкубировали с GC-богатым олигонуклеотидом ON1 и АТ-богатым ON2 при комнатной температуре. Реакционную смесь разделяли в 15% или 20% ПААГ в неденатурирующих условиях, чтобы сохранялся аддукт ON-белок-гормон.

Из рис. 5 видно, что после добавления ON1 окрашиванием Кумасси выявляется белковая полоса с большей электрофоретической подвижностью, чем у исходного апоА-I (дор. 4-6). С другой стороны, при окрашивании всех компонентов в геле красителем Stains all было видно, что подобная полоса отсутствует в дорожке с исходным олигонуклеотидом, аэлектрофоретическая подвижность белка существенно больше в присутствии ON1. Исходя из этого можно сделать вывод о том, что ON1 образует комплекс с апоА-I, причем этот комплекс обладает несколько большей электрофоретической подвижностью, чем исходный белок апоА-I, по-видимому, за счет отрицательных зарядов связанного олигонуклеотида.

Для того, чтобы оценить характер связывания апоА-1-ТГК с олигонуклеотидом ON 1, к реакционной смеси добавляли диссоциирующий агент - мочевину. Видно (рис. 5, дор. 7), что после ее добавления не происходит полной диссоциации комплекса. Это может указывать на участие электростатических взаимодействий в процессе комплексообразования НК - белок, т.к. известно, что гидрофобные взаимодействия разрушаются денатурирующими агентами, такими, как мочевина.

Для оценки нуклеотидной специфичности расщепляемых S1 нуклеазой участков взаимодействия комплекса апоА-I - гормон (ТГК, ДЭАС-сульфат) с ДНК был проведен эксперимент с использованием метода Саузерн-гибридизации. ДНК инкубировали с комплексом апоА-I - гормон, затем обрабатывали S1 нуклеазой и разделяли электрофорезом в агарозном геле. Фрагменты ДНК от 20 до 5 т.п.о. переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с радиоактивно меченным олигонуклеотидом Радиоавтографы сканировали на ска-

нере «Кора» (Новосибирск) и денситометрировали с помощью программы «Bandscan». На рис. 6 представлены данные денситометрирования радиоавтографов. Уменьшение сигнала от СС(ССС)$-зонда в случае ДНК, обработанной комплексами апоА-1-тетрагидрокортизол и апоА-I -дегидроэпиандростерон-суль-

фат и SI нуклеазой по сравнению с контролем (ДНК, обработанная только S1 нуклеазой) составило ~1,5 раза. То, что не все участки, содержащие (GCC/CGG)n повторы, расплетаются под действием комплекса, возможно, обьясняется их неодинаковой доступностью для него. Не исключено, что механизм образования одноцепочечных участков под действием комплекса апоА-1-стероид на на-тивной ДНК заключается не только в расплетении её цепей под действием комплекса, но и во взаимодействии его с одноцепочечными петлями палиндромов, которые могут образовываться в районах вида (GCC/CGG)n под действием на-

пряжений в молекуле ДНК (Wang Z.Y. et al., 1993). Наличие открытых последовательностей в ДНК хроматина и возможность их аффинной модификации производными олигонуклеотидов были показаны в работе (Chemolovskaya E.L. et al., 1992). Ингибирование экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости (mdrl) в различных культурах клеток с помощью конъюгатов олигонуклеотидов, комплементарных участкам промотора, было продемонстрировано в работе (Chernolovskaya E.L. et al., 2001). Это доказывает важность таких участков ДНК для регуляции экспрессии генов.

В литературе описаны S1- нуклеазочувствительные участки в промоторных районах некоторых генов (Santra M. et al., 1994, Wang Z.Y. et al., 1993, McKeon C. et al., 1984). Известно также, что промоторы многих генов общего метаболизма являются GC- богатыми (Holmquist G., 1988). Нами был предпринят поиск по компьютерным базам данных последовательностей вида (GCC/CGG)n. Оказалось, что данные последовательности встречаются во всех структурах генома: экзо-нах, интронах, 5'- и З'-нетранслируемых районах и довольно часто в промоторных районах. Это немаловажно для понимания функции исследуемого нами комплекса, учитывая, что промоторные районы многих конститутивно экспрес-сирующихся генов свободны от нуклеосомной укладки. Участок промоторного района одного из таких генов-топоизомеразы 2В, содержащий GGC-район был проанализирован с помощью программы TRANSFAC (рис. 7).

GenBank, locus HSU82759, accession U82759, NID gl778587

Homo sapiens topoisomerase II beta gene

671-gaggtgacgc aGGCGGCGGC GGCGGCGGCt ctgtttattg-710 =======(14.00) AP-1,ATF-3,ATF,c-Fos

===========(20.00) Spl

==========(18.00) EGR2

=========(18.00) WT1 -KTS,WT1 I-KTS

====---(14.00) CUP R03133

=========(18.00) WTl-KTS,WT1 I-KTS

==========(18.00) EGR2

===========(20.00) Spl

=======(14.00) CUP

==========(18.00) EGR2

=====---===(20.00) Spl

=========(18.00)WTl-KTS

=======(14.00) CUP

Рис. 7. Факторы транскрипции, способные связываться с промоторной областью гена топоизомеразы 2В, содержащей GGC-noemop

Как можно видеть из рис. 7, GGC-район перекрывается с сайтами связывания ряда факторов транскрипции, что свидетельствует о его значимости для регуляции экспресии данного гена.

В результате проделанной работы можно прийти к заключению, что выбранный нами ферментативный метод анализа ДНК, подвергавшейся воздействию

стероидов или их комплексов с аполипопротеином A-I, с использованием нукле-азы S1 оказался достаточно чувствительным и адекватным. Появление ~2 S1-нуклеазочувствительных участков на 100 т.п.о. указывает на множественность точек, в которых изменяется вторичная структура ДНК под влиянием комплекса ТГК-апоА-1.

Ранее в работах Панина Л.Е. с соавторами (2002) было показано усиление биосинтеза белка в культуре гепатоцитов под действием этого комплекса. Методом малоуглового рентгеновского рассеяния было обнаружено высококооперативное дозозависимое связывание РНК-полимеразы с ДНК, обработанной комплексом ТГК-апоА-I (Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., 2002). Кроме того, известно, что действие некоторых транскрипционных факторов заключается в каком-либо изменении структуры ДНК (Вингендер Э., 1997). Сопоставление перечисленных фактов с полученными нами данными позволяет сделать вывод о действии комплекса ТГК-апоА-I (и, возможно, ДЭАС-сульфат-апоА-I), подобного действию фактора транскрипции.

Применение ферментативного анализа структуры ДНК и методов гибридизации позволило исследовать нуклеотидную специфичность воздействия комплекса стероидный гормон-аполипопротеин A-I. В подобранных нами оптимальных условиях воздействия комплекса на ДНК была выявлена предпочтительность его взаимодействия с GC-богатыми последовательностями, характерными для многих регуляторных районов генома. Часто встречающиеся повторы вида GCC/CGG присутствуют в промоторных областях некоторых генов, например, топоизомеразы 2В, рРНК, рибосомного белка L32 (Орлов СВ., 1999). Взаимодействие комплекса с такими участками ДНК может объяснить активацию яд-рышковой ДНК и синтеза полирибосом под влиянием комплекса ТГК-апоА-I в гепатоцитах, что показано в работе (Panin L.E., Maksimov V.F. et al., 2002).

Кроме нерегулярно распределенных по геному участков взаимодействия комплекса ТГК-апоА-I в ДНК были выявлены регулярно распределенные высококо-пийные структурные элементы. Среди всех Sl-нуклеазочувствительных сайтов они находятся в небольшом количестве, около 5000 (6 т.п.о.) и 2500 (5,5 т.п.о.) на геном крыс. Один вид этих элементов ДНК размером 6 т.п.о. обнаруживается независимо от присутствия комплекса. Другой, размером 5.5 т.п.о. появляется при расщеплении S1 нуклеазой ДНК, обработанной комплексом ТГК-апоА-I и составляет около 0.5% от всей ДНК.

Таким образом, обнаруженная в нашей работе сайт-специфичность действия комплекса ТГК-апоА-I дополнительно свидетельствует в пользу его роли, подобной роли транскрипционного фактора.

ВЫВОДЫ

1. Стероидные гормоны, такие, как кортизол, тетрагидрокортизол, андросте-рон, дегидроэпиандростерон и дегидроэпиандростерон-сульфат, воздействуют на вторичную структуру ДНК, что впервые показано методом ферментативного анализа. Предшественник стероидных гормонов - холестерин не оказывает влияния на структуру ДНК.

2. Комплекс аполипопротеин А-1-тетрагидрокортизол воздействует на ДНК печени взрослых крыс, что приводит к появлению дополнительных Sl-нуклеазо-чувствительных участков в количестве не менее 2 на 100 т.п.о. Показано, что это воздействие специфическое и дозозависимое.

3. Комплексы тетрагидрокортизол-апоА-1 и дегидроэпиандростерон-сульфат - апоА-I связываются с нуклеотидными последовательностями вида(ССС/ССО)п в составе нативной ДНК, что приводит к появлению в них одноцепочечных участков.

4. Выялены Sl-нуклеазочувствительные участки, регулярно распределенные по геному в составе высококопийных структурных элементов, после расщепления которых образуются фрагменты ДНК размером около 6 т.п.о.

5. Впервые обнаружены сайты связывания комплекса тетрагидрокортизол-апоА-I, в составе регулярно распределенных по геному структурных элементов ДНК, при расщеплении которых S1нуклеазой образуются фрагменты ДНК размером около 5.5 т.п.о.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Акимжанова М.В., Гимаутдинова О.И., Кузнецов П.А Специфические сайты связывания комплекса аполипопротеин А-1-тетрагидрокортизол на эукарио-тической ДНК. Бюллетень СО РАМН, 2000, №2(96), с 29-32.

2. Кузнецов П.А., Гимаутдинова О.И., Акимжанова М.В. Изменения вторичной структуры ДНК эукариот вблизи сайтов связывания комплекса тетрагидро -кортизол-аполипопротеин A-I. Бюллетень СО РАМН, 2000, №2(96), с. 71-73.

3. Гимаутдинова О.И., Панин Л.Е., Кузнецов П.А., Еттянова- Акимжанова М.В. Специфические изменения вторичной структуры ДНК эукариот под влиянием комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I. Молекулярная биология, 2002, том 36, №1, с. 103-105.

4. Панин Л.Е., Гимаутдинова О.И., Кузнецов П.А., Акимжанова М.В., Тузиков Ф.В. Влияние комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I на вторичную структуру эукариотической ДНК и её взаимодействие с РНК-полимеразой. Биохимия, 2002, том 67, вып.7, с. 953-958.

5. Гимаутдинова О.И., Кузнецов П.А., Панин Л.Е. Инициация транскрипции с участием комплекса тетрагидрокортизол — аполипопротеин A-I. Тезисы международного конгресса "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека " Феодосия (Украина), июнь 8-19,2003 г., с. 48-49.

Фомат 60484'/,6. Тираж 100. Усл. печ.л. 1,0. Заказ № 27.

Отпечатано в тип. СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2/12

о*

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецов, Павел Александрович

Оглавление Список сокращений Введение

Актуальность темы Цели и задачи исследования Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы Основные положения, выносимые на защиту Апробация работы и публикации Обзор литературы

Липопротеины Аполипопротеины Стероидные гормоны Взаимодействие аполипопротеинов и стероидных гормонов Факторы транскрипции в регуляции экспрессии генов

Описание базы данных ТИА^РАС Описание базы данных ТИШ} Заключение Материалы и методы

Использованные реактивы и материалы

Основные использованные растворы

Использованное оборудование

Выделение липопротеинов высокой плотности

Делипидирование

Разделение белков электрофорезом

Электроэлюция

Гель-фильтрация белков

Иммуно-ферментный анализ

Выделение ДНК

Выделение ДНК с использованием проназы 51 Выделение ДНК с использованием гуанидин тиоцианата 52 Анализ выделенной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле

Ферментативный анализ ДНК 53 Ферментативный анализ влияния холестерина и стероидных гормонов на структуру ДНК

Получение комплекса апоЛП-стероид

Взаимодействие комплекса апоЛП-стероид с ДНК

Гидролиз 81-нуклеазой 55 Конкурентное ингибирование взаимодействия комплекса апоА-1 с ДНК

Сканирование фотопленок и радиоавтографов 56 Копирование оц. участков ДНК с использованием фрагмента Кленова 56 Анализ связывания олигонуклеотидов с апоАи с комплексом апоА-1-гормон 57 Оценка нуклеотидной специфичности взаимодействия комплексов апоА-1-ТГК, апоА-1-ДЭАС-сульфат с ДНК

Результаты

Анализ выделенных препаратов

81 -нуклеазочувствительные участки в ДНК

Взаимодействие ДНК со стероидами 65 Взаимодействие ДНК с комплексом аполипопротеин-стероид

Влияние структурных особенностей ДНК на гидролиз 81 -нуклеазой

Количество 81 -нуклеазочувствительных участков в ДНК

Взаимодействие комплекса апоА-1-гормон с олигонуклеотидами

Копирование ДНК фрагментом Кленова

Оценка нуклеотидной специфичности связывания комплекса апоА-1-гормон с ДНК

Обсуждение результатов

Взаимодействие ДНК с комплексом аполипопротеин А-1-стероиды

Повторяющиеся структуры ДНК, расщепляемые Б1-нуклеазой

Количество 81 -нуклеазочувствительных участков в ДНК

Нуклеотидная специфичность участков ДНК, взаимодействующих с комплексом апоА-1-гормон

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние стероидных гормонов и их комплексов с аполипопротеином А-1 на структуру ДНК"

Изучение адаптационных механизмов эукариот, включая человека, на разных уровнях структурной организации, в том числе, клеточном и молекулярном, является одной из актуальных задач современной биологии и медицины. Несомненно, ключом к пониманию важнейших приспособительных реакций организма на действие экстремальных факторов является регуляция экспрессии генов. Эндокринно— метаболические взаимоотношения, которые складываются в различных органах и тканях, имеют особое значение для понимания интегративных процессов целостного организма. Именно от них зависит развитие адаптивных или дизадаптивных реакций при действии на организм чрезвычайных раздражителей (Панин Л. Е., 1983, Меерсон Ф.З, Пшенникова М.Г., 1988). В настоящее время хорошо изучены молекулярные механизмы действия некоторых стероидных (Мертвецов Н.П., 1990, 1986) и белково-пептидных (Мертвецов Н.П., 1999) гормонов на экспрессию отдельных генов. В частности, хорошо известен рецептор-опосредованный механизм глюкокортикоидной индукции ферментов глюконеогенеза и катаболизма аминокислот (Мертвецов Н.П., 1978). В то же время влияние различных метаболитов и дериватов стероидных гормонов на геном клетки изучено недостаточно.

Классическим представлением в биохимии стероидных гормонов до сих пор считается отсутствие какой бы то ни было биологической активности у тетрагидрокортизола - метаболита глюкокортикоидного гормона кортизола.

В нашем институте (НИИ Биохимии СО РАМН) было открыто явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в условиях регенерации (Панин Л.

Е. и др., 1987). В результате проведенных исследований были получены ранее неизвестные данные о кооперативном действии глюкокортикоидов и липопротеинов высокой плотности (ЛГТВП) в регуляции экспрессии генов по механизму, принципиально отличающемуся от механизма глюкокортикоидной индукции (Панин Л. Е. и др., 1992). На основании полученных экспериментальных фактов было сделано предположение, что комплекс аполипопротеина A-I (апоА-1) с тетрагидрокортизолом (ТГК) может служить индуктором транскрипции генов, оказывая влияние на структуру ДНК в составе хроматина и инициируя начало процесса транскрипции (Панин Л. Е., 1997). В настоящее время можно считать доказанным, что липопротеины плазмы крови оказывают выраженное регуляторное влияние на различные типы клеток организма (Панин Л.Е., 1987, Handwerger S., 1989, Favre G., 1993). Показано регуляторное воздействие основного белкового компонента липопротеинов высокой плотности - аполипопротеина A-I на экспрессию некоторых генов (Handwerger S., 1995, 1998).

Актуальность темыДанная работа имеет отношение к изучению молекулярных механизмов регенерации. Процессы внутриклеточной регенерации относятся к фундаментальным явлениям. Они связаны с регуляцией экспрессии генов и синтезом огромного количества белков. Эти процессы в клетке протекают непрерывно и направлены на поддержание структурного гомеостаза организма в целом. Молекулярные механизмы их очень сложны и не изучены до сих пор. Они включают образование биологически активного комплекса стероидный гормон - аполипопротеин A-I, которое протекает в резидентных макрофагах. Затем осуществляется перенос данного комплекса в ядра соматических клеток, где и происходит еговзаимодействие с депротеинизированными участками ДНК. В данной работе изучался последний этап: взаимодействие различных стероидных гормонов, их метаболитов и комплексов с аполипопротеином A-I с эукариотической ДНК. Большую важность представляло определение сайтов взаимодействия и их распределение в эукариотической ДНК, изменения её структуры в сайтах взаимодействия с комплексом. Решение этих вопросов позволяет нам приблизиться к пониманию молекулярных механизмов индукции синтеза белков при регенерации и пролиферации клеток.

Цели и задачи исследованияЦелью настоящей работы являлось изучение механизма действия некоторых стероидных гормонов (кортизола, тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона, и дегидроэпиандростерон-сульфата), а также их предшественника - холестерина на вторичную структуру ДНК крыс и роль в этом механизме таких белков как аполипопротеин A-I и аполипопротеин Е.

Для достижения данной цели необходимо было решить следующие задачи:1) Изучить воздействие кортизола, тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата и холестерина на структуру ДНК.

2) Изучить воздействие стероидных гормонов в присутствии апоА-I и апоЕ на структуру нативной ДНК крыс с использованием ферментативных методов анализа.

3) Оценить нуклеотидную специфичность в области взаимодействия комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол с ДНК.*Научная новизнаВпервые подробно исследовано воздействие ряда стероидных гормонов коры надпочечников и половых желез (андрогенов) на структуру ДНК. Показано, что взаимодействие стероидных гормонов с эукариотической ДНК приводит к образованию дополнительныхЩодноцепочечных участков. Число таких участков значительно увеличивается при действии некоторых гормонов (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон, и дегидроэпиандростерон-сульфат) в составе комплекса с аполипопротеином A-I. Даны оценки нуклеотидной специфичности и характера распределения по геному одноцепочечных участков, образующихся под действием комплекса апоА-1-гормон. Впервые обнаружены последовательности, регулярно распределенные по геному, % специфично взаимодействующие с восстановленной формой Kopra3oná -тетрагидрокортизолом в присутствии аполипопротеина A-I. Высказывается предположение, что такие последовательности могут играть важную роль в регуляции экспрессии генов.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Получены новые данные, вносящие существенный вклад в щ современные представления о молекулярных механизмах физиологической регенерации и пролиферации клеток при участии резидентных макрофагов органов и тканей. Они могут быть использованы при обосновании новых методов коррекции и лечения дегенеративно-деструктивных процессов в органах и тканях. Показано, что биологической активностью обладают не только известные нам гормоны, но и их метаболиты. Важным подходом в усилении регенераторных процессов в тканях может стать активация ^ резидентных макрофагов, роль которых в настоящее время ещё неучитывается в лечении этих форм патологии. Рассмотренные подходы и полученные нами результаты чрезвычайно важны для анализа молекулярных механизмов взаимодействия в системе макрофаг — опухолевая клетка. Это позволит, как мы надеемся, найти новые решения в лечении онкозаболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту1) Взаимодействие ряда стероидных гормонов - кортизола, тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата с ДНК приводит к образованию одноцепочечных участков.

2) Воздействие стероидных гормонов тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата на ДНК существенно усиливается в присутствии апоА-1.

3) Воздействие тетрагидрокортизола и дегидроэпиандростерон-сульфата в составе комплекса с апоА-1 приводит к образованию одноцепочечных участков в последовательностях вида (ОСС/СОО)п.

4) Последовательности ДНК, способные взаимодействовать с комплексом апоА-1-гормон с образованием одноцепочечных участков представлены в геноме в количестве не меньшем, чем 2 на 100 т.п.о.

5) Последовательность ДНК, способная взаимодействовать с комплексом апоА-1-гормон с образованием одноцепочечных участков, присутствует в повторяющемся элементе генома размером около 5,5 т.п.о.

Апробация работы и публикацииМатериалы диссертации отражены в 5 публикациях и были представлены на международном конгрессе "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека " Феодосия (Украина) 2003 г., доложены на конференции молодых учёных "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" Новосибирск, 2000 г., на ученом совете и семинарах Института Биохимии СО РАМН.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кузнецов, Павел Александрович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проделанной работы можно прийти к заключению, что ^ выбранный нами ферментативный метод анализа ДНК, подвергавшейся воздействию стероидов или их комплексов с аполипопротеином A-I, с использованием нуклеазы S1 оказался достаточно чувствительным и адекватным. Появление не менее, чем 2 S1-нуклеазочувствительных участков в расчете на 100 т.п.о. указывает на множественность точек, в которых инициируются изменения вторичной структуры ДНК под влиянием комплекса ТГК-апоА-1. & Ранее в работах Панина Л.Е. с соавторами было показано усиление

биосинтеза белка в культуре гепатоцитов под действием этого комплекса. Методом малоуглового рентгеновского рассеяния было показано высококооперативное дозозависимое связывание РНК-полимеразы с ДНК, обработанной комплексом ТГК-апоА-I (Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., 2002). Кроме того, известно, что действие некоторых транскрипционных факторов заключается в каком-либо изменении структуры ДНК (Вингендер Э., 1997). Сопоставление перечисленных фактов с полученными нами Ф данными позволяет сделать вывод о действии комплекса ТГК-апоА-I (и, возможно, ДЭАС-сульфат-апоА-I), подобного действию фактора транскрипции.

Применение ферментативного анализа структуры ДНК и методов гибридизации позволило исследовать нуклеотидную специфичность воздействия комплекса стероидный гормон-аполипопротеин A-I. В подобранных нами оптимальных условиях воздействия комплекса на ДНК была выявлена предпочтительность его взаимодействия с GC-богатыми

последовательностями, характерными для многих регуляторных районов геномов. Часто встречающиеся повторы вида GCC/CGG присутствуют в промоторных областях некоторых генов, например, топоизомеразы 2В, рРНК, рибосомного белка L32 (Орлов C.B., 1999). Взаимодействие комплекса с такими участками ДНК может объяснить активацию ядрышковой ДНК и синтеза полирибосом под влиянием комплекса ТГК-

апоА-I в гепатоцитах, что показано в работе (Panin L.E., Maksimov V.F. et al., 2002).

Кроме нерегулярно распределенных по геному участков взаимодействия комплекса ТГК-апоА-I в ДНК были выявлены регулярно распределенные высококопийные структурные элементы. Среди всех S1-нуклеазочувствительных сайтов они находятся в небольшом количестве, около 5000 (6 т.п.о.) и 2500 (5,5 т.п.о.) на геном крыс. Один вид этих

♦ элементов ДНК размером 6 т.п.о. обнаруживается независимо от присутствия комплекса. Другой, размером 5,5 т.п.о. появляется при расщеплении S1 нуклеазой ДНК, обработанной комплексом ТГК-апоА-I и составляет около 0,5% от всей ДНК.

Таким образом, обнаруженная в нашей работе сайт-специфичность действия комплекса ТГК-апоА-I дополнительно свидетельствует в пользу его роли, подобной роли транскрипционного фактора.

выводы

Стероидные гормоны, такие, как кортизол, тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон и дегидроэпиандростерон-сульфат,

воздействуют на вторичную структуру ДНК, что впервые показано методом ферментативного анализа. Предшественник стероидных гормонов - холестерин не оказывает влияния на структуру ДНК. Комплекс аполипопротеин A-I - тетрагидрокортизол воздействует на ДНК взрослых крыс, что приводит к появлению дополнительных S1-нуклеазочувствительных участков в количестве не менее 2 на 100 т.п.о. Показано, что это воздействие специфическое и дозозависимое. Комплексы тетрагидрокортизол - апоА-I и дегидроэпиандростерон — сульфат - апоА-I связываются с нуклеотидными последовательностями вида (GCC/CGG)n в составе нативной ДНК, что приводит к появлению в них одноцепочечных участков.

Выявлены S1-нуклеазочувствительные участки, регулярно распределенные по геному в составе высококопийных структурных элементов, после расщепления которых образуются фрагменты ДНК размером около 6 т.п.о.

Впервые обнаружены сайты связывания комплекса тетрагидрокортизол - апоА-I, в составе регулярно распределенных по геному структурных элементов ДНК, при расщеплении которых S1 нуклеазой образуются фрагменты ДНК размером около 5.5 т.п.о.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецов, Павел Александрович, Новосибирск

1. Вингендер Э. Классификация транскрипционных факторов эукариот // Молеклярная биология. - 1997. - Т.31, №4. - С. 584-600.

2. Гимаутдинова О. И., Номоконова Н. Ю. Макарова Е. К. Взаимодействие аполипопротеина A-I с эукариотическими и синтетическими ДНК // Бюлл. СО РАМН. - 1998. - Т. 89. - С. 30-32.

3. Енукашвили Н.И., Лобов И.Б., Подгорная О.И., Ядерный матрикс человека содержит белковый комплекс, специфически связывающий альфа-сателлитную ДНК in vitro // Биохимия. — 1999. — Т. 64, вып. 4. - С. 564-573.

4. Иванова Н. Г., Поляков Л. М., Панин Л. Е. Взаимодействие липопротеинов сыворотки со стероидными гормонами. // Укр. Биохим. Журн. - 1991. -Т. 63.-С. 103-105.

5. Кель О.В., Кель А.Э., Ромащенко А.Г., Вингендер Э., Колчанов H.A. Молек. биол., 1997, т.31, с.601-615.

6. Куницын В.Г. Структурные фазовые переходы в мембранах эритроцитов, липопротеинах и макромолекулах, докт. диссер., Новосибирск, 2002. * -С. 205-215.

7. Лобов И.Б., Подгорная О.И. Роль белков ядерного матрикса в формировании гетерохроматина // Цитология. - 1999. - Т. 41, №7. - С. 562-573.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии.

9. Мертвецов Н.П. и др. Выделение из полирибосом печени крыс матричной ф РНК, кодирующей индуцируемый гидрокортизоном изоферменттирозинаминотрансферазы // Молекулярная биология. — 1978. - Т. 12. -С. 806-813.

10. Мертвецов Н.П. Исследование белково-пептидных гормонов методамигенной инженерии. - Новосибирск: Наука, 1999. - 176 с. Мертвецов Н.П. Регуляция экспрессии генов стероидными гормонами. - Новосибирск: Наука, 1990. - 264 с.

11. Мертвецов Н.П. Чесноков В. Н., Блинова Н. Н. Влияние гидрокортизона на свойства полирибосом печени крыс, метаболизм и матричную активность полисомной поли(А)-содержащей РНК // Биохимия. -1978.-Т. 43.-С. 919-929.

12. Нго Т. Т., Ленхоффа Г. М., ред. Иммунно-ферментный анализ. - М: Мир, 1988.-446 с.

13. Орлов С.В., Дише Е.Б., Кутейкин К.В., Куришев В.И. Перевозчиков А.П. Функциональная активность GCC-элемекта входящего в состкв регуляторных районов ряда генов млекопитающих // Доклады Академии Наук. - 1999. - том 366, №2. - С. 262-5.

14. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985.-С. 152.

15. Панин Л. Е. Роль кооперативного эффекта липопротеинов и гормонов в регуляции лизосомального аппарата клеток // Вопр. Мед. Хим. - 1987. - Т. 33. - С. 96-102.

16. Панин Л.Е. Функциональная роль тетрагидропроизводных стероидных гормонов // Эндокринные механизмы регуляции функции в норме и патологии. - Новосибирск, 1997. - С. 117-118.

17. Панин Л.Е., Биушкина Н.Г., Поляков Л.М. Количественная характеристика взаимодействия липопротеинов сыворотки крови со стероидными гормонами // Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. - 1992. - Т. 112. - С. 34-36.

18. Панин Л.Е., Гимаутдинова О.И., Поляков Л.М., Наякшина Т.Н. Особенности взаимодействия кортизола, тетрагидрокортизола и их комплексов с аполипопротеином A-I с эукариотической ДНК // Молекулярная биология. - 1998. - Т. 32. - С. 447-451.

19. Панин Л.Е., Лукашев В.А., Гимаутдинова О.И. Антигенная мимикрия ВИЧ-1 как следствие структурного сходства белков gpl20 и аполипопротеина A-I // Иммунология. - 1999. - №2. - С. 13-15.

20. Панин Л.Е., Поляков Л.М., Усынин И.Ф., Кузьменко А.П., Потеряева О.Н. Иммунохимическая идентификация аполипопротеина A-I в хроматине ядер гепатоцитов крыс // Биополимеры и клетка. - 1992. - Т. 8. - С. 44-49.

21. Панин Л.Е., Соколова М.В., Усынин И.Ф. Влияние резидентных макрофагов на биосинтез белка в печени в условиях репаративной регенерации после частичной гепатэктомии // Патол. Физиол. Экспер. Терапия. - 1991. - №1. - С. 20-22.

22. Панин Л.Е., Соколова М.В., Усынин И.Ф. Изменение скорости биосинтеза белка в паренхимных клетках печени при стимуляции системы мононуклеарных фагоцитов // Цитология. - 1990. - №5. - С. 528-532.

23. Панин Л.Е., Тузиков Ф.Б., Харьковский A.B., Усынин И.Ф. Влияние комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I на синтез белка в гепатоцитах и на вторичную структуру эукариотической ДНК // Молекулярная биология. - 1999. - Т. 33. - С. 1-6.

24. Панин Л.Е., Хощенко О.М. Усынин И.Ф. Роль аполипопротеина A-I в реализации анаболического действия стероидных гормонов // Проблемы эндокринологии. - 2002, №6. - С.45-48.

25. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса. — Новосибирск: Наука, 1983.-233 с.

26. Панин Л.Е. Хощенко О.М. Роль резидентных макрофагов в регуляциибиосинтеза ДНК и белка в клетках асцитной гепатомы мышей линии А // Вопросы онкологии. - 2003. - Т. 49. Вып. 4. - С. 472-475.

27. Панин Л.Е. Явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей // Бюллетень СО РАМН. - 1998. - №3(89). - С. 11-23.

28. Панин Л.Е., Свечникова И.Г., Маянская H.H., Роль плазменных липопротеидов как модуляторов специфического гормональногоэффекта гидрокортизона // Вопр. Мед. Химии. - 1990. - том 36, вып. 3. - С. 60-62.

29. Паташинский А.З., Шумило Б.И. // Тезисы докл. на симпозиуме "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках", Пущино, 1985.-С. 3-4.

30. Перевозчиков А. П. Экспрессия гена аполипопротеина A-I человека в клетках млекопитающих. // Автореф. докт. диссерт. С.-П., 1997.

31. Перевозчиков А.П., Орлов C.B., Кутейкин К.В. Связывание GCC-элементов с ядерными белками // Доклады академии наук. - 1994. - Т. 38. - С. 411-415.

32. Поляков Л.М., Панин Л.Е. Аполипопротеин Е: структура и функции // Успехи совр. Биол. - 1998. - Т. 118. - С. 743-753.

33. Поляков Л.М., Потеряева О.Н., Панин Л.Е. Определение аполипопротеина A-I методом иммуноферментного анализа // Вопросы мед. Химии. -1991.-Т. 37.-С. 89-92.

34. Потапенко А.И., Обухова Л.К. Дефекты вторичной структуры ДНК, опознаваемые нуклеазой S1, и их возможная роль в старении соматических клеток млекопитающих // Изв. акад. наук, биол. серия. -№6. - С. 940-943.

35. Розен В. Б., Смирнов А. Н. Рецепторы и стероидные гормоны. - М.: Изд-во МГУ, 1981.-312 с.

36. Романенко Е. Б., Демиденко 3. Н., Ваюшин Б. Ф. РНК-полимеразная, ДНК-полимеразная, ДНК-метилтрансферазная и сфингомиелазная активность в ядрах печени крыс различного возраста // Биохимия. -1998.-Т. 63.-С. 194-199.

37. Светлова Е.Ю., Разин C.B., Филипский Я. Картирование участков гиперчувствительности к нуклеазе S1 в III хромосоме дрожжей saccharomyces cerevisiae // Доклады Академии Наук. - 1997. - том 353, №6. - С. 831-833.

38. Светлова Е.Ю., Разин С.В., Филипский Я. Определение участков гиперчувствительности к нуклеазе S1 в дрожжевой искуственной хромосоме, включающей домен Р-глобиновых генов человека // Доклады Академии Наук. - 1997. - том 353, №4. - С. 562-564.

39. Усынин И.Ф. Роль макрофагов в регуляции метаболических процессов в печени при функциональном напряжении организма // Докт. диссер. Новосибирск, 1999.

40. Холодова Ю.Д., Чаяло П.П. Липопротеины крови. - Киев: Наук. Думка, 1990.-208 с.

41. Худолий Г.А., Обухова Л.К., Акифьев А.П. Изменение чувствительности ДНК к нуклеазе S1 в процессе старения и после воздействия геропротектором в эксперименте // Докл. АН СССР. — 1980. — Т. 254. -С. 507-509.

42. Bashirova А.А., Markelov M.L., Shlykova T.V., Levshenkova E.V., Alibaeva R.A., Frolova E.I. The human RIL gene: mapping to human chromosome 5q31.1, genomic organization and alternative transcripts // Gene. -1998. -V. 210,N. 2.-P. 239-45.

43. Beato M., Chalepakis G., Schauer M., Slater E. P. DNA regulatory elements for steroid hormones // J. Steroid Biochem. - 1989. - V. 32. - P. 737-747.

44. Bjorklund S., Kim Y.-J. Mediator of Transcriptional Regulation // Trends Biochem. Sci. - 1996. - V.21, Iss 9. - P. 335-337.

45. Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes // Nucleic Acids Research. - 1976. - V. 3, N. 9. — P. 2303-8.

46. Boulikas, T. Chromatin domains and prediction of MAR sequences // International Review of Cytology. - 1995. V. 162. - P. 279-388.

47. Brestnick E.H., Dalman F.C., Sanchez E.R., Pratt W.B. Evidence that the 90-kDa heat shock protein is necessary for the steroid binding conformationof the L cell glucocorticoid receptor. // J. Biol. Chem. - 1989. - V. 264. - P. 4992-7.

48. Brunvand M.W., Schmidt A., Siebenlist U. Nuclear factors interacting with the mitogen-responsive regulatory region of the interleukin-2 gene // J. Biol. Chem. - 1988. - V.263, N. 35. - P. 18904-18910.

49. Budarf M. Blackburn E. S1 nuclease sensitivity of a double-stranded telomeric DNA sequence // Nucleic Acids Research. - 1987. - V. 15, N. 15. - P. 6273-92

50. Chernolovskaya E.L., Kobets N.D., Borissov R.G., Abramova T.V., Vlassov V.V. Affinity modification of human chromatin with reactive derivatives of oligonucleotides // Febs Letters. - 1992. - V. 303. - P. 269-71.

51. Chernolovskaya E.L., Koshkin A.A., Vlassov V.V. Interaction of LNA oligonucleotides with mdrl promoter // Nucleosides, Nucleotides '& Nucleic Acids. - 2001. - V. 20. - P. 847-50.

52. Chetsanga C.J., Rushlow K., Boyd V.T. Caffeine enhancement of digestion of DNA by nuclease SI // Mutation Research. - 1976. - V. 34, N. 1. - P. 1120

53. Cho Y., Gorina S., Jeffrey P.D., Pavletich N.P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations // Science. - 1994. - V. 265, N. 5170. - P. 346-355.

54. Collins J.M., Glock M.S., Chu A.K. Nuclease SI sensitive sites in parental deoxyribonucleic acid of cold- and temperature-sensitive mammalian cells //Biochemistry. - 1982. - V. 21. - P. 3414-3419.

55. Denis M., Wikstrom A.G., Gustafsson J.-A. The molybdate-stabilized nonactivated glucocorticoid receptor contains a dimer of Mr 90,000 non-hormone-binding protein // J. Biol. Chem. - 1987. - V.262, N24. - P. 11803-11806.

56. Dynan W.S. Modularity in promoters and enhancers // Cell. — 1989. - V. 58, N.l. -P. 1-4.

57. Encio I.J., Detera-Wadleigh S.D. The genomic structure of the human glucocorticoid receptor // J. Biol. Chem. - 1991. - V. 266. - P. 7182-7188

58. Fatyol K., Illes K., Diamond D.C., Janish C., Szalay A.A., Mer22-relatedsequence elements form pericentric repetitive DNA families in primates // Molecular & General Genetics. - 2000. - V. 262, N. 6. - P. 931-9

59. Favre G.,Tazi K.A., LeGaillard F., Bennis F., Hachem H., Soula G. High density lipoprotein3 binding sites are related to DNA biosynthesis in the adenocarcinoma cell line A549 // Journal of Lipid Research. - 1993. - V. 34,N. 7.-P. 1093-106.

60. Ferrari S., Harley V.R., Pontiggia A., Goodfellow P.N., Lovell-Badge R., Bianchi M.E. SRY, like HMG1, recognizes sharp angles in DNA // EMBO J. - 1992. - V.l 1, N12. - P.4497-4506.

61. Freedman L.P., Luisi B.F., Korszun Z.R., Basavappa R., Sigler P. B., Yamamoto K.R. The function and structure of the metal coordination sites within the glucocorticoid receptor DNA binding domain. // Nature. 1988. - V. 334. -P. 543-546.

62. Ghosh G., van Duyne G., Ghosh S., Sigler P.B. Structure of NF-Kappa-B P50 Homodimer Bound to a Kappa-B Site // Nature. - 1995. - V.373, Iss 6512. -P.303-310.

63. Gopalakrishnan, L. Scarpulla, R.C. Structure, expression, and chromosomalassignment of the human gene encoding nuclear respiratory factor 1 // The Journal of Biological Chemistry. - 1995. - V. 270, N. 30. - P. 18019-25.

64. Gordon J.I., Smith O.P., Andy R., Alpers D.H. The primary translation product of rat intestinal apolipoprotein A-I mRNA is an unusual preproprotein // J Biol Chem. - 1982. - V. 257. - P. 971-8.

65. Grant C.E., Kurz E.U., Cole S.P.C., Deeley R.G. Analysis of the intron-exon organization of the human multidrug-resistance protein gene (MRP) and alternative splicing of its mRNA // Genomics. - 1997. - Vol. 45. - N. 2. -P. 368-379.

66. Handwerger S., Myers S., Richards R., Richardson B., Turzai L., Moeykins C., Meyer T., Anantharamahiah G. M. Apolipoprotein A-I stimulates placental lactogen expression by human trophoblast cells. // Endocrinology. - 1995. -V. 136. - P. 5555-60.

67. Hatch F. T., Less R. S. Practical methods for plasma lipoprotein analysis. // Adv. Lipid Res. - 1968. - V. 6. - P. 2-68.

68. Holmquist G. DNA sequences in G-bands and R-bands // Chromosomes and Chromatin.- Boca Raton: C. R. C. Rress, 1988.-Vol. 2,- P. 75-121.

69. Jain J., McCaffrey P.G., Miner Z., Kerppola T.K., Lambert J.N., Verdine G.L., Curran T., Rao A. The T-cell transcription factor NFATp is a substrate forcalcineurin and interacts with Fos and Jun // Nature. - 1993. - v.365, N. 6444. - P. 352-355.

70. Kaiser K., Meisterrernst M. The Human General Cofactors // Trends Biochem.

71. Kim J.L., Nikolov D.B., Burley S.K. Co-crystal structure of TBP recognizing the minor groove of a TATA element // Nature. - 1993. - v.365, N6446. -P.520-527.

72. Kim Y., Geiger J.H., Hahn S. Sigler P.B. Crystal structure of a yeast

73. TBP/TATA-box complex //Nature. - 1993. - v.365, N6446. - p.512-520. Knezetic J.A., Felsenfeld G. Mechanism of developmental regulation of alpha pi, the chicken embryonic alpha-globin gene // Mol. Cell. Biol. - 1993. - v. 13, N.8. - p. 4632-4639.

74. Kosaka T., Miyata A., Ihara H., Hara S., Sugimoto T., Takeda O., Takahashi E., Tanabe T. Characterization of the human gene (PTGS2) encoding prostaglandin-endoperoxide synthase 2 // European Journal of Biochemistry. - 1994.-V. 221, N.3.-P. 889-97.

75. Kroeker W.D., Kowalski D. Gene-sized pieces produced by digestion of linear duplex DNA with mung bean nuclease // Biochemistry. — 1978. - V. 17, N. 16.-P. 3236-43.

76. Mangelsford D.J., Thummel C., Beato M., Herrlich P., Schutz G., Umesono K., Blumberg B., Kastner P., Mark M., Chambon P., Evans R.M. The Nuclear

77. Receptor Superfamily - The 2nd Decade // Cell. - 1995. - v.83, Iss.6. -P.835-839.

78. McKeon C., Schmidt A., deCrombrugghe B. A sequence conserved in both the chicken and mouse alpha 2(1) collagen promoter contains sites sensitive to SI nuclease // The Journal of Biological Chemistry. - 1984. - V. 259, N. 10, P. 6636-40.

79. McMahon S.B., Monroe J.G. A Ternary Complex Factor-Dependent Mechanism Mediates Induction of Egr-1 Through Selective Serum Response Elements Following Antigen Receptor Cross-Linking in B-Lymphocytes // Mol. Cell. Biol. - 1995. - v.15, N2. - p.1086-1093.

80. Miltenberger R.J., Sukow K.A., Farnham P.J. An E-Box-Mediated Increase in CAD Transcription at the G(l)/S-Phase Boundary Is Suppressed by Inhibitory C-myc Mutants // Mol. Cell. Biol. - 1995. - v. 15, Iss 5. - p. 2527-2535.

81. Muller C.W., Rey F.A., Sodeoka M., Verdine G.L., Harrison S.C. Structure of the NF-Kappa-B P50 Homodimer Bound to DNA // Nature. - 1995. -v.373, Iss 6512. -p.311-317.

82. Muller C.W. Harrison S.C. The Structure of the NF-kappa-B P50-DNA-Complex- A Starting Point for Anayzing the Rel Family // Febs Letters. -1995.-Vol 369, Iss l.-p. 113-117.

83. Nikolov D.B., Hu S.-H., Lin J., Gasch A., Hoffmann A., Horikoshi M., Chua N.-H., Roeder R.G., Burley S.K. Crystal structure of TFIID TATA-box binding protein // Nature. - 1992. - v.360, N6399. - p.40-46.

84. Panin L.E., Maksimov V. F., Usynin I.F., Korostyshevskaya I.M. Activation of nucleolar DNA expression in hepatocytes by glucocorticoids and high density lipoproteins // J. Steroid Biochem. and Mol. Biol. - 2002. - V. 81. -p. 69-76.

85. Panin L.E., Maksimov V. F., Usynin I.F., Korostyshevskaya I.M. Activation of nucleolar DNA expression in hepatocytes by glucocorticoids and high density lipoproteins // J. Steroid Biochem. and Mol. Biol. - 2002. - V. 81. -p. 69-76.

86. Panin L.E., Tuzikov F.V., Gimautdinova O.I. Tetrahydrocortisol-apolipoprotein A-I complex specifically interacts with eucaryotic DNA and GCC elements of genes // Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology. -2003. - V. 87. - P. 309-318.

87. Perez-Castro A.V., Wilson J., Altherr M.R. Genomic organization of the human fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) gene and comparative sequence analysis with the mouse Fgfr3 gene // Genomics. — 1997. —V. 41, N. 1,P. 10-6.

88. Pratt W. B. The role of heat shock proteins in regulating the function, folding, and trafficking of the glucocorticoid receptor // J. Biol. Chem. - 1993. - V. 268.-P. 21455-21458.

89. Quandt K., Freeh K., Karas H., Wingender E., Werner T. Matind and Matinspector - New Fast and Versatile Tools for Detection of Consensus Matches in Nucleotide Sequence Data // Nucleic Acids Research. - 1995. - Vol 23, Iss 23. - p. 4878-4884.

90. Ray A., Hannink M., Ray B.K. Concerted participation of NF-KB and C/EBP heteromer in lipopolysaccharide induction of serum amyloid A gene expression in liver // Journal of Biological Chemistry. - 1995. - v.270, N.13. - p.7365-7374.

91. Reddy M.V. Nuclease SI-mediated enhancement of the 32P-postlabeling assay for aromatic carcinogen-DNA adducts // Carcinogenesis. - 1991. - V.12, №9. -P. 1745-8.

92. Rhodes S.J., DiMattia G.E., Rosenfeld M.G. Transcriptional mechanisms in anterior pituitary cell differentiation // Current Opin. In genetics and Development. - 1994. - v.4, N5. - p.709-717.

93. Roeder R.G. The Role of General Initiation-Factors in Transcription by RNA-Polymerase-II // Trends Biochem. Sci. - 1996. - v.249, Iss 9. - p.327-335.

94. Segrest J.P., Jones M.K., Klon A.E., Sheldahl C.J., Hellinger M., De Loof H., Harvey S.C. A Detailed Molecular Belt Model for Apolipoprotein A-I in Discoidal High Density Lipoprotein // J Biol Chem. - 1999. - Vol. 274, Issue 45.-P. 31755-31758.

95. Seraj M.J., Umemoto A., Tanaka M., Kajikawa A., Hamada K., Monden Y. DNA adduct formation by hormonal steroids in vitro. // Mutat. Res. -1996. - V. 370. P. 49-59.

96. Shaw J.P., Utz P.J., Durand D.B., Toole J.J., Emmel E.A., Crabtree G.R. Identification of a putative regulator of early T cell activation genes // Science. - 1988. - v.241, N4862. - p. 202-205.

97. Sheridan, R.B. Huang, P.C. Single strand breakage and repair in eukaryotic DNA as assayed by SI nuclease // Nucleic Acids Research. - 1977. - V. 4, N. 2.-P. 299-318.

98. Southern, E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // Journal of Molecular Biology. - 1975. -V. 98, N. 3, P. 503-17.

99. Steger D.J., Hecht J.H., Mellon P.L. GATA-binding proteins regulate the human gonadotropin alpha-subunit gene in the placenta and pitutary gland II Mol. Cell. Biol. - 1994. - v.14, N8. - p.5592-5602.

100. Suelter C. H. A practical guide to enzymology. // Biochemistry: A series of monographs. 1985. P. 441-447.

101. Takimoto, Y. Li, W.Y. Wang, Z.Y. Tong, B.D. Deuel, T.F. Nucleotide sequence of the 5' region of the human platelet-derived growth factor A-chain gene // Hiroshima Journal of Medical Sciences. - 1993. - V. 42, N. 1. - P. 4752

102. Tuzikov F.V., Panin L.E., Tuzikova N.A., Polyakov L.M. Application of the small-angle X-ray scattering technique for estimating structural changes in high density lipoproteins. // Membr. And Cell. Biol. - 1996. - V. 10. - P. 75-82.

103. Verrijzer C.P., Tjian R. Tafs Mediate Transcriptional Activation and Promoter Selectivity // Trends Biochem. Sci. - 1996. - Vol. 21, Iss 9. - p.338-342.

104. Vogt, V.M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae // European Journal of Biochemistry. — 1973. - V. 33,N. l.-P. 192-200.

105. Werner M.H., Ruth J.R., Gronenborn A.M., Clore G.M. Molecular-Basis of Human 46X,Y Sex Reversal Revealed from the 3-Dimensional Solution Structure of the Human Sry-DNA Complex // Cell. - 1995. - v.81, N.5. -p.705-714.

106. Wingender E. Gene regulation in eukaryotes. - Germany: VCH, 1993, 430 p.

107. Wingender E., Dietze P., Karas H., Knuppel R. TRANSFAC: a database on transcription factors and their DNA binding sites // Nucleic Acids Res. -1996. - v.24, N1. - p.238-241.

108. Zhu Q.S., Heisterkamp N., Groffen J. Unique organization of the human BCR gene promoter // Nucleic Acids Research. -1990. - V. 18, N. 23. - P. 7119-25.