Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологическая разработка некролитической мази и ее исследования

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологическая разработка некролитической мази и ее исследования"

На правах рукописи

Берниковский Владислав Владиславович

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА НЕКРОЛИТИЧЕСКОЙ МАЗИ И ЕЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11111П1111111111

ООЗ 174442

Краснодар - 2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Степанова Элеонора Федоровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ермолова Любовь Степановна доктор биологических наук, профессор Бугаёва Любовь Ивановна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Московская государственная

академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Защита состоится «6» ноября 2007 г. в 14"" часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.09 при Кубанском государственном аграрном университете (350044, Краснодар, ул. Калинина, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного аграрного университета.

Автореферат разослан « 2007 г. и размещен на сайте

www.kubagro.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент { /. / Н.В.Чернышёва

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Одним из серьезных вопросов современной хирургии является лечение ран с большим содержанием некротических тканей, которые плохо удаляются в процессе традиционной обработки Для решения этой проблемы используют различные средства, но главным образом - протеолитические ферменты Известны лекарственные препараты, представляющие собой нативные протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, террилитин и др), наносимые на некротические ткани в виде присыпок или водных растворов, которыми смачивают текстильные подложки Протеазы, оказывая протеолитическое действие, способствуют очищению ран, а также оказывают противовоспалительное, фибринолитическое и противоотечное действие (Машковский МД, 1998) Однако непосредственное введение нативных протеолитических ферментов в рану приводит к их быстрой инактивации, что делает энзимотерапию малоэффективной Кроме того, растворимые протеазы, попадая в кровь, могут вызывать побочные эффекты (например, аллергические и пирогенные реакции) (Давиденко ТИ с соавт, 1993) Используемые же в данном случае волокнистые перевязочные материалы в силу низкой дренирующей способности не обеспечивают удаления из раны продуктов некролиза и требуют частых перевязок (Сахаров И Ю с соавт, 1994)

В последнее время в клинической практике широко применяли импортную мазь «Ируксол» производства "Ркуа <3 <1" (Республика Хорватия), содержащую клостридиопептидазу А, сопутствующие протеазы и антибиотик хлорамфеникол в липофильной безводной мазевой основе Мазь оказывала комбинированное некролитическое действие на нежизнеспособные ткани и обеспечивала выраженный антибактериальный эффект

Однако недостатком использования мазей на липофильных основах, к которым относится и мазь «Ируксол», является их гидрофобность, в связи с чем в первой фазе раневого процесса при обильном увлажнении раны данные мази не смешиваются с раневым экссудатом, и тем более не поглощают раневое

отделяемое Вследствие этого ухудшаются возможности очищения раны от гноя и некротических масс, что задерживает процессы регенерации Мази на гидрофобных основах нарушают отток из раны Липофильные основы не обеспечивают достаточного высвобождения протеолитических ферментов и антибактериальных средств из композиции и не способствуют их пенетрации (Левагина ГН с соавт, 2000, Даценко БМ с соавт, 1989) Поэтому вопрос лечения гнойных ран нельзя считать решенным

Таким образом, является актуальным создание нового ферментного препарата, предназначенного для очищения раневых поверхностей от некротических тканей, а также содержащего антисептик для предотвращения развития раневой инфекции

Цель и задачи исследования.

Целью работы является создание ферментсодержащего раноочищающего средства в виде гидрофильной мази, изучение его технологических свойств, разработка биотехнологической схемы производства и норм качества Задачи исследования

1 Произвести выбор оптимальной лекарственной формы и составить схему биотехнологических исследований

2 Провести биотехнологические исследования по выбору оптимального состава раноочищающего средства

3 Провести необходимые испытания in vitro для подтверждения целесообразности разработанного состава

4 Составить эффективную технологическую схему производства предлагаемого раноочищающего средства

5 Разработать нормы и методы оценки его качества, установить срок годности

6 Выполнить предварительные исследования по определению влияния на антимикробное действие разработанной мази иммобилизованной протеазы

7 Провести предварительные фармакологические исследования по определению влияния разработанной мази на процесс ранозаживления

Научная новизна.

Предложена оптимизированная схема биотехнологических исследований иммобилизованных протеолитических ферментов,« позволяющая осуществлять выбор носителя с минимальными затратами

Произведено изучение ряда основ-носителей, наиболее часто используемых в мягких лекарственных формах для терапии ран С учетом установленных величин осмотической активности даны рекомендации по их применению в соответствующих лекарственных препаратах, предназначенных для лечения ран

Предложен состав раноочищающей мази с условным названием «Пиолит» Обоснованы показатели и нормы качества разработанной мази В условиях ускоренного старения установлен срок годности - 12 месяцев

В опытах на животных показано положительное влияние разработанной мази на общую динамику заживления ран

Теоретическая и практическая значимость.

Полученный экспериментальный материал послужил экспериментально-теоретическим обоснованием для создания комбинированной раноочищающей мази под условным названием «Пиолит», предназначенной для наружного применения, на гиперосмолярной гидрофильной основе, сочетающей в своем составе протеолитический фермент (трипсин) и антимикробный агент (хлоргексидина биглюконат) Проведены биотехнологические исследования разработанной мази, а также предложена технологическая схема производства Даны соответствующие рекомендации по выпуску разработанной мази в условиях промышленного производства в виде ТУ и ТИ на ветеринарный препарат

Внедрение результатов исследований в практику.

Получены акт технологической апробации и акт апробации методик стандартизации разработанной мази с условным названием «Пиолит» на базе производственного участка и отдела контроля качества ЗАО «Центрально-Европейская фармацевтическая компания» (г Москва) соответственно

Получен акт о результатах испытаний разработанной раноочищающей мази с условным названием «Пиолит» на базе Ставропольской городской станции по борьбе с болезнями животных

На разработанную мазь составлена нормативная документация в виде ТУ на ветеринарное средство, утвержденных ООО НПО «Константа» (г Ставрополь)

Положения, выносимые на защиту:

• Разработанная схема биотехнологических исследований позволяет производить выбор оптимального носителя для иммобилизуемой протеазы с меньшими трудовыми затратами,

• Предлагается оптимальный состав раноочищающей мази «Пиолит» с иммобилизованным трипсином и технологическая схема ее производства,

• Характеристика и оценка биотехнологических свойств мази «Пиолит», разработка норм качества, установление сроков ее годности, предварительная оценка антимикробного и фармакологического действия

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на ежегодных научных региональных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (2005-2006 гг, г Пятигорск), IV научно-практической конференции молодых ученых и студентов юга России «Медицинская наука и здравоохранение» (апрель 2006 г, г Анапа), межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы фармации» (26 апреля 2007 г , г Владикавказ) Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 работ В научных изданиях, входящих в перечень ВАК, опубликованы 3 работы

Связь задач исследования с планом НИР учреждения, где выполнялась диссертация.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорская ГФА Росздрава № госрегистрации 01 20 0215436

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы и 3 глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы и приложений Работа содержит 14 таблиц и 29 рисунков Список литературы включает 144 источника, из них 18 на иностранных языках

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Биотехнологические исследования по выбору носителя и иммобилизации трипсина

В качестве метода иммобилизации был использован метод включения, так как этот метод позволяет связать 100% используемого фермента, не требуя специальных реагентов или особых технологических операций

Первым этапом исследований стал выбор соответствующего носителя для иммобилизации трипсина С этой целью был рассмотрен ряд гидрофильных основ, традиционно используемых в технологии мягких лекарственных форм (таблица 1)

Все приведенные в таблице 1 композиции согласно данным литературы хорошо зарекомендовали себя в качестве основ для мазей, применяемых в терапии ран

Проведенные исследования осмотической активности, как одного из важнейших свойств основ, обеспечивающего удаление раневого содержимого, позволили отобрать для дальнейших исследований композицию, представляющую собой сплав ПЭО 400 и 1500 в соотношении 8 2, основу-

гидрогель карбопола с добавкой осмотически активного компонента - ПЭО 400 и гель альгината натрия с глицерином

Таблица 1 - Составы основ, предлагаемые для получения раноочищающей мази

Компонент Основа №

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ПЭО 400 60,0 80,0 80,0 90,0 50,0

ПЭО 1500 40,0 20,0

ПЭГ-115 (ПЭО 4000) 20,0 10,0 50,0

Карбопол 2,0 2,0

Натрия апьгинат 8,0

Хитозан 5,0 5,0 4,0

ПВС 6,0 3,0

Пропилен-гликоль 20,0

Триэтанол-амин 2,0 2,0

Глицерин 15,0 20,0 10,0 10,0

Натрия тетраборат 0,5 0,5

Вода очищенная До 100,0 До 100,0 До 100,0 До 100,0 До 100,0 До 100,0 До 100,0 До 100,0

Указанные основы использовались для дальнейших исследований, для которых была составлена блок-схема изучения биотехнологических свойств (рисунок 1)

Рисунок 1 — Типовая схема исследования свойств иммобилизованной протеазы, предназначенной для очищения ран (составлено по работам в научной печати)

Как видно из рисунка 1, исследование свойств иммобилизованной протеазы включает в себя 4 типовых этапа Наиболее часто проводится

8

сравнительное определение протеолитической активности в оптимальных условиях, на основании чего и осуществляется выбор носителя для иммобилизации Более полный исследования вкЛючают также определение температурного и рН-оптимума и определение устойчивости иммобилизованного фермента при инкубировании при повышенной температуре (термостабильность) Данные трудоемкие исследования нами предлагается свести к упрощенному виду - к определению активности в оптимальных условиях и активности и устойчивости в условиях, моделирующих рану (рисунок 2)

Рисунок 2 - Оптимизированная схема изучения свойств иммобилизованной протеазы, предназначенной для очищения ран

Дальнейшие исследования проводились в соответствии с составленной оптимизированной схемой

Для первичного сопоставления основ была определена протеолитическая активность получаемых при введении трипсина композиций и рассчитан процент сохранения активности для каждой из основ Композиции, полученные при смешивании нативного трипсина и носителя, растворяли в фосфатном буферном растворе с соответствующей величиной рН От полученных растворов отбирали пробы, используемые для определения протеолитической активности Результаты представлены в таблице 2

Как следует из представленных в таблице 2 данных, при включении трипсина в выбранные основы наибольший процент сохранения активности соответствует сплаву полиэтиленоксидов За ним следует гель натрия альгината

и наименьший процент сохранения активности зафиксирован при использовании комбинированной основы карбопола с ПЭО 400

Таблица 2

Результаты включения трипсина в выбранные основы

Носитель Протеолитическая активность (М±т), ПЕ/г композиции % сохранения активности Метрологические характеристики

Сплав ПЭО 400 и ПЭО 1500 (8 2) 2,1 ±0,067 85,4 5=0,0635 5Г = 0,0259 е = ±3,2%

Гидрогель натрия альгината с глицерином 1,7±0,060 69,1 5 = 0,0568 5Г = 0,0232 е = ±3,56%

Гидрогель карбопола с ПЭО 400 1,6±0,045 65,0 5 = 0,0432 5Г =0,0176 8 = ±2,82%

Примечание Приведены усредненные данные 6 определений при Р=95%

Далее была проверена протеолитическая активность иммобилизованного трипсина в условиях, близких к условиям раневого содержимого Так как рН раневого содержимого составляет около 5-6 единиц, в качестве среды инкубирования, моделирующей условия раны, был взят фосфатный буферный раствор с усредненным значением рН, равным 5,5 единицы

Активность в условиях раны определяли аналогично определению активности при оптимальном значении рН Рассчитывались такие показатели, как активность на 1 г носителя, % сохранения активности по отношению к нативному ферменту и к активности данной иммобилизованной формы в оптимальных условиях Данные представлены в таблице 3

Как следует из данных, приведенных в таблице 3, при смещении рН в кислую сторону активность иммобилизованного трипсина менее всего изменяется при использовании в качестве носителя гидрогеля натрия альгината с глицерином

Таблица 3 - Результаты сравнительного определения активности иммобилизованных препаратов трипсина при рН 5,5__

Носитель Протеолитическая активность (М±т), ПЕ/г композиции % сохранения активности относительно нативного трипсина % сохранения активности от активности композиции в оптимальных условиях Метрологические характеристики

Сплав ПЭО 400 и ПЭО 1500 (8 2) 1,24±0,050 215,7 59,0 5=0,0479 5Г =0,0196 е = ±4,05%

Гидрогель натрия апьгината с глицерином 1,18±0,045 205,3 69,4 5=0,0426 5Г =0,0176 £ = ±3,80%

Гидрогель карбопола с ПЭО 400 0,87±0,030 151,4 54,4 5=0,0283 5^ =0,0115 е = ±3,41 %

Примечание Приведены усредненные данные 6 определений при Р=95%

Однако в абсолютных единицах наибольшая активность у композиции трипсин - сплав ПЭО При использовании всех трех носителей протеолитическая активность композиций при рН 5,5 значительно превышает таковую для нативного фермента Таким образом, включение трипсина в исследуемые носители хоть и приводило к некоторому снижению активности фермента в оптимальных условиях (рН 8,0, 37°С), однако оказывало стабилизирующее воздействие на трипсин при кислых значениях рН, приближенных к значениям рН раневого содержимого

Важным свойством иммобилизованного ферментного препарата является способность проявлять высокую активность в течение значительного времени В связи с этим была проверена устойчивость иммобилизованных препаратов при рН 5,5 и 37°С в течение 4 часов (рисунок 3)

ПА, ПЕ/г фермента

О 60 120 180 240 I мин

Рисунок 3 - Сравнительная динамика активности иммобилизованных форм трипсина (рН 5,5; Т = 37°С~; активность указана в абсолютных единицах)

Через 4 часа инкубации в буферном растворе активность иммобилизованных препаратов колебалась от 58,3% до 75% от максимально проявленной при инкубации. Как видно из рисунка, кривые активности имели различный характер в зависимости от используемого носителя. Так, для альгината натрия и сплава ПЭО характер изменения активности в течение инкубирования был схожим, максимум протеолитической активности достигался через 60 минут после начала инкубирования и в дальнейшем снижался, достигая на 240 минуту эксперимента величины около 75% от максимальной активности.

Резкое падение активности трипсина, иммобилизованного в геле карбопола, может объясняться тем, что взаимодействие трипсина с полиэлектролитами кислотного характера сопровождается ускоренной автолитической денатурацией иммобилизованного фермента. Причем для жесткоцепного полиэлектролита - альгиновой кислоты - этот эффект менее выражен из-за не столь благоприятных условий для электростатического взаимодействия, чем в случае присутствия гибкоцепных сополимеров синтетических кислот.

Сопоставление результатов эксперимента, выраженных в абсолютных единицах, показывает, что наибольшая протеолитическая активность была у

композиции с использованием в качестве носителя сплава ПЭО На основании проведенных исследований был выбран носитель для иммобилизации трипсина - мазевая основа, представляющая собой сплав ПЭО 400 и ПЭО 1500 в соотношении 8 2

Изучение вопроса дозировок иммобилизованных форм протеаз, описанных в литературе, показало, что выбор количества вводимого фермента осуществлялся эмпирически и не обосновывался с точки зрения оптимального фармакологического действия При этом величина протеолитической активности описанных иммобилизованных форм колебалась от 0,1 ПЕ/г до 160 ПЕ/г Исходя из этого, в качестве «прототипа» разрабатываемой мази нами была выбрана мазь асперазы 2%, являвшаяся зарегистрированным лекарственным препаратом, но в настоящий момент не выпускающаяся Таким образом, величина активности разрабатываемой мази была установлена на уровне 3 ПЕ/г мази

Для обеспечения антимикробного действия в качестве одного из компонентов был выбран хлоргексидина биглюконат При этом основывались как на доступности данного антимикробного вещества, так и на ряде сведений о его высокой эффективности и отсутствии негативного влияния на активность протеаз При выборе дозировки хлоргексидина биглюконата в разрабатываемой мази остановились на концентрации 0,2%, так как использование этой концентрации позволяло вводить в мазь всего 1% раствора хлоргексидина биглюконата 20%-го, а известно, что введение в полиэтиленоксидные основы небольших количеств воды (не более 2% от общей массы) повышает прочность этих основ Кроме того, такая дозировка данного антимикробного вещества уже применялась для создания мазей

Таким образом, был предложен состав раноочищающей мази с условным названием «Пиолит»

Трипсина ^ э для получения активности 3 ПЕ/г Раствора хлоргексидина биглюконата 20% - 1 мл Сплава ПЭО 400 - ПЭО 1500 (8 2) - до 100,0

Проведенные исследования показали, что введение хлоргексидина биглюконата в раноочищающую мазь в количестве 0,2% оказывало незначительное влияние на стабильность величины протеолитической активности при инкубировании. При инкубировании образца иммобилизованного трипсина, содержащего хлоргексидина биглюконат, наблюдалось несколько более быстрое снижение протеолитической активности по сравнению с образцом, не содержавшим хлоргексидина биглюконата. Это может объясняться тем, что положительно заряженные молекулы, к которым относится основание хлоргексидина, в кислой среде способны образовывать с молекулами ферментов полиэлектролитные комплексы, повышая при этом активность ферментов. Повышение протеолитической активности ведет и к некоторому ускорению автолиза, что может объяснять более быстрое снижение активности иммобилизованного трипсина в присутствии хлоргексидина биглюконата.

Процесс взаимодействия основы и трипсина был исследован нами при помощи метода нефелометрии (рисунок 4).

33.0 32,5 32,0

£

£

§ 31,5

I

31,0 30.5 30.0

о

Рисунок 4 - Зависимость мутности полимерной композиции от содержания трипсина и полиэтиленоксидной основы (содержание основы - 1%)

Нарастание мутности свидетельствует о межмолекулярной реакции, протекающей с образованием интерполимерных комплексов.

2. Разработка технологической схемы и норм качества мази «Пиолит»

В результате проведенных исследований нами была предложена общая технологическая схема производства, включающая базовые биотехнологические этапы (рисунок 5)

Рисунок 5 - Технологическая схема производства раноочищающей мази с иммобилизованным трипсином (Кт и Км — контроль технический и микробиологический, соответственно)

Основным этапом указанной технологической схемы является стадия ТП 3 - Получение раноочищающей мази, заключающаяся в том, что отвешенное количество полиэтиленоксидов загружают в мазевой котел с мешалкой и паровой рубашкой, в котором производится сплавление компонентов мазевой основы В полученную мазевую основу при

перемешивании вносят раствор хлоргексидина биглюконата Полученную композицию (основа с хлоргексидина биглюконатом) стерилизуют В стерильной композиции методом включения иммобилизуется трипсин Параллельно технологическим операциям осуществляется технический и микробиологический контроль

Разработку норм качества полученной мази проводили в соответствии с требованиями ОСТ 91500 05 001-00 «Стандарты качества лекарственных средств Основные положения», в котором указаны следующие показатели качества описание, подлинность, рН водного извлечения, стерильность, количественное определение

Установленные нормы качества приведены в таблице 4

Таблица 4 - Нормы качества разработанной раноочищающей мази

Показатель качества Требования Разработанная раноочищающая мазь

Внешний вид Однородная масса вязкой консистенции Соответствует

Цвет Белый Соответствует

Запах Отсутствует Соответствует

Водородный показатель (рН) 10% водного раствора 5,0-6,0 Соответствует

Стерильность Стерильна Соответствует

Подлинность - Хлоргексидина биглюконат - Трипсин Положительная Положительная Соответствует Соответствует

Количественное определение - Хлоргексидина биглюконат, %, не менее - Трипсин (протеолитическая активность), ПЕ/г, не менее 0,2 2,7 Соответствует Соответствует

Одним из важных показателей мази является способность сохранять свои свойства в процессе хранения С целью установления срока годности разработанная мазь была подвергнута испытаниям в соответствии с положениями «Временной инструкции по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре» Хранение вели при температуре, рекомендованной для мазей (+40°С) Анализ проводили с

периодичностью 23 дня, что соответствует 6 месяцам хранения в

рекомендованных условиях (не выше +10°С), по разработанным ранее

методикам качественного и количественного определения Результаты представлены в таблице 5

Таблица 5 - Результаты определения сроков годности разработанной раноочищающей мази_

Критерии Сроки хранения, сут

23 46 69 92

Органолептическ ие свойства Однородная мазеобразная масса белого цвета без запаха Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует

Водородный показатель (рН) 10% водного раствора 5,54 5,36 5,41 5,29

Подлинность - Хлоргексидина биглюконат - Трипсин Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует

Количественное определение - Хлоргексидина биглюконат, % 0,2 0,2 0,2 0,2

- Трипсин (протеолитическая активность), ПЕ/г 2,85 2,76 2,65 2,44

Как видно из данных, приведенных в таблице, срок годности мази при хранении в условиях ускоренных испытаний (+40°С) составил 46 суток, что соответствует 12 месяцам хранения в рекомендованных условиях (не выше +10°С), так как при хранении более указанного срока препарат не соответствует норме по показателю «Протеолитическая активность»

3. Исследования антимикробного действия и фармакологической активности мази «Пиолит»

Необходимость проведения микробиологических исследований была продиктована тем, что трипсин, как белок, является потенциальным

питательным субстратом для микроорганизмов и, теоретически, может снижать антимикробное действие, оказываемое другим компонентом мази хлоргексидина биглюконатом. Работа проводилась на кафедре биохимии и микробиологии Пятигорской государственной фармацевтической академии.1 Использованные культуры микроорганизмов перечислены в таблице 6. Таблица 6 - Использованные тест-культуры микроорганизмов

№ Тест-культура

п./п.

1 Staphylococcus aureus 209-Р

2 Staphylococcus aureus (Макаров)

3 Staphylococcus aureus "Type"

4 Staphylococcus epidermidis Wood-46

5 Escherichia coli 675

6 Bacillus subtilis L2

Исследования проводились методом лунок, изложенным в Государственной Фармакопее (ГФ XI, выпуск 2, раздел «Методы микробиологического контроля лекарственных средств»). Результаты представлены на рисунке 6.

Рисунок 6 - Результаты сравнительной оценки антимикробного действия мазей «Левомеколь» и «Пиолит», а также чистой основы и ее комбинаций с действующими веществами.

Примечание: 1 - Staphylococcus aureus 209-Р, 2 - Staphylococcus aureus (Макаров), 3 - Staphylococcus aureus "Type", 4 - Staphylococcus epidermidis Wood-46, 5 - Escherichia coli 675, 6 - Bacillus subtilis L2.

1 Выражаем свою благодарность за помощь в проведении данного фрагмента исследований старшему преподавателю курса микробиологии кафедры биохимии и микробиологии ГОУ ВПО Пятигорская ГФА Росшрава П.В. Постниковой.

Результаты сравнительных микробиологических исследований по определению антимикробного действия хлоргексидина биглюконата в мази на фоне трипсина показали, что последний не оказывал влияния на антибактериальную активность антисептика, что позволяет предположить отсутствие фармацевтического взаимодействия этих компонентов.

Влияние на процесс ранозаживления изучали на белых крысах с помощью традиционной модели искусственного термического ожога. Животные с индуцированным ожогом были разделены на 4 группы: I группа -контроль - лечение физиологическим раствором; 2 группа - стандарт - лечение препаратом сравнения; 3 группа - лечение разработанной мазью; 4 группа -лечение чистой мазевой основой.

В качестве препарата сравнения была выбрана мазь «Левомеколь». Критериями выбора послужили: доступность данного лекарственного препарата, сходство мазевой основы и показаний к применению. Так же проводилось сравнение относительно чистой основы, так как имелись сведения о том, что ПЭО-основы без добавления лекарственных веществ могут использоваться для лечения ран. Измерение площади ожоговых ран проводили весовым методом. В графическом виде сравнительная динамика контракции ран представлена на рисунке 7.

И Контроль СЗ Левомеколь ЕЗ Мазь а Основа

Рисунок 7 - Влияние разработанной раноочищающей мази и чистой мазевой основы на репаративную регенерацию кожи в сравнении с препаратом сравнения (мазью «Левомеколь») и контролем (физиологическим раствором) при модели термического ожога

Наиболее заметны различия в динамике заживления ран были в период до десятых суток эксперимента В этот период в группе, получавшей разработанную раноочищающую мазь, происходило более быстрое отторжение струпа и образование грануляционной ткани В дальнейшем препарат сравнения - «Левомеколь» - по темпам сокращения площади ран догонял исследуемый препарат, по-видимому, за счет входящего в его состав метилурацила Во всех случаях отличие от контроля было достоверным

ВЫВОДЫ

1 На основании комплекса экспериментально-теоретических исследований разработана оригинальная мазь «Пиолит», содержащая иммобилизованный фермент и антисептик широкого спектра действия Разработаны основные критерии ее оценки осмотическая активность, некролитический и антимикробный эффект Составлена оптимизированая схема биотехнологических исследований иммобилизованных протеаз, позволяющая произвести выбор оптимального носителя

2 Установлен и обоснован оптимальный состав раноочищающей композиции носитель для иммобилизации протеазы - основа-сплав полиэтиленоксидов ПЭО 400 и ПЭО 1500 (8 2), иммобилизуемый фермент - трипсин (до активности 3 ПЕ/г мази), антимикробный компонент — хлоргексидина биглюконат (0,2%)

3 Проведены биотехнологические и биофармацевтические испытания in vitro, показавшие полную совместимость компонентов мази Исследованы структурно-механические свойства мази, и доказано, что введение действующих веществ приводит к снижению общей вязкости системы (мази) и ускоряет процесс восстановления структуры Нефелометрическая оценка процесса взаимодействия основы и трипсина в водных растворах подтвердила наличие взаимодействия между трипсином и основой и образования межмолекулярных комплексов

4 Разработана технологическая схема производства предлагаемой

раноочищающей мази с включением биотехнологических этапов, даны рекомендации по стадиям технологического процесса

5 Выработаны нормы качества для предлагаемой мази Изотермическим способом установлен срок годности при температуре хранения не выше + 10°С он составляет 12 месяцев

6 Установлено, что разработанная мазь обеспечивает выраженный антимикробный эффект, и наличие иммобилизованного трипсина не оказывает влияния на уровень антимикробного воздействия

7 Исследование динамики ранозаживления экспериментального ожога показало, что использование разработанной мази увеличивает темпы контракции по сравнению с препаратом сравнения (мазью «Левомеколь») до 10 суток эксперимента Исследование раневой поверхности в ходе эксперимента показало, что при использовании разработанной мази полное отторжение струпа происходит на 8 сутки, для препарата сравнения - на 12 сутки

8 Выполненные экспериментальные исследования позволили разработать и утвердить нормативную документацию на предложенную мазь — ТУ и ТИ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 С целью лечения гнойно-некротических ран рекомендуется внедрить в медицинскую практику разработанную мазь «Пиолит»

2 Технологическая схема и техническая документация на мазь «Пиолит» могут быть использованы для производства препарата в условиях предприятий фармацевтической промышленности

3 Материалы диссертационной работы могут быть использованы в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций и ведении лабораторных занятий по курсу биотехнологии

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Берниковский, В В Использование иммобилизованных протеолитических ферментов в хирургии / В В Берниковский // Итоговая (межвузовская) научная конференция студентов и молодых ученых Тез докл (13, 18-21 апр 2005, Ставрополь) - Ставрополь Изд-во СтГМА, 2005 -С 671-672

2 Берниковский, В В Иммобилизованные протеазы для очищения ран полимеры-носители и методы иммобилизации / В В Берниковский, Э Ф Степанова, И В Тихонов // Университетская наука Взгляд в будущее Сб тр науч конф КГМУ и сессии Центрально-Черноземного науч центра РАМН В 2-х томах (71, февр 2006, Курск) - Курск КГМУ , 2006 -Т2 -С 153-154

3 Берниковский, В В Исследование осмотической активности некоторых гидрофильных основ / В В Верниковский, Э Ф Степанова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции Сб науч тр /Пятигорск ГФА - Пятигорск, 2006 -Вып 61 -С 78-80

4 Верниковский, В В Биофармацевтические исследования по разработке раноочищающих мазей с протеолитическими ферментами / В В Верниковский // Известия высш учеб заведений Сев -Кавк регион Естественные науки Спецвыпуск Фармакология - 2006 - С 31 -33

5 Верниковский, В В Иммобилизация трипсина в некоторых мазевых основах / В В Верниковский, Э Ф Степанова // Вестник новых мед технологий — 2006 - Т 13, №4 - С 130-132

6 Верниковский, В В Изучение высвобождения хлоргексидина биглюконата из гидрофильной основы с высокой осмотической активностью / В В Верниковский, Э Ф Степанова // Вестник ВГУ, Серия Химия Биология Фармация -2006 - №2 - С 217-218

7 Верниковский, В В Разработка и вапидация методики количественного определения хлоргексидина биглюконата в раноочищающей мази / В В Верникоский // Научное обозрение - 2007 - №2 - С 39-41

8 Верниковский, В В Исследование антимикробной активности

раноочищающей мази, содержащей иммобилизованный трипсин^ и хлоргексидина биглюконат / В В Берниковский, Н В Постникова // Научное обозрение -2007 -№2 - С'42-44 ' ' 9 Берниковский, В В -Реологические исследования мази с иммобилизованным трипсином / В В Берниковский // Актуальные проблемы фармации сб статей межрегион науч конф - Владикавказ СОГУ, 2007 - С 11-12

Берниковский Владислав Владиславович

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА НЕКРОЛИТИЧЕСКОЙ МАЗИ И ЕЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано к печати «_»_2007 г. Формат 60х84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж_экз. Заказ №_.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Верниковский, Владислав Владиславович

Введение.

Глава 1. Современное состояние исследований лекарственных форм с иммобилизованными протеолитическими ферментами, предназначенных для биологического очищения ран.

1.1 Протеолитические ферменты: краткая характеристика.

1.2 Использование протеолитических ферментов в терапии раневого процесса.И

1.3 Иммобилизованные протеолитические ферменты, применяемые для местного лечения гнойно-некротических процессов.

1.3.1 Источники получения протеолитических ферментов.

1.3.2 Лекарственные формы иммобилизованных препаратов протеолитических ферментов.

1.3.3 Методы иммобилизации, используемые в раноочищающих средствах с протеолитическими ферментами.

1.3.4 Определение активности иммобилизованных протеолитических ферментов и единицы ее измерения.

1.3.5 Комбинирование протеолитических ферментов с лекарственными веществами других групп.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологическая разработка некролитической мази и ее исследования"

Актуальность темы.

Одним из серьезных вопросов современной хирургии является лечение ран с большим содержанием некротических тканей, которые плохо удаляются в процессе традиционной обработки. Для решения этой проблемы используют различные средства, но главным образом - протеолитические ферменты. Известны лекарственные препараты, представляющие собой нативные протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, террилитин и др.), наносимые на некротические ткани в виде присыпок или водных растворов, которыми смачивают текстильные подложки. Протеазы, оказывая протеолитическое действие, способствуют очищению ран, а также оказывают противовоспалительное, фиб-ринолитическое и противоотечное действие (Машковский М.Д., 1998). Однако непосредственное введение нативных протеолитических ферментов в рану приводит к их быстрой инактивации, что делает энзимотерапию малоэффективной. Кроме того, растворимые протеазы, попадая в кровь, могут вызывать побочные эффекты (например, аллергические и пирогенные реакции) (Давиденко Т.И. с соавт., 1993). Используемые же в данном случае волокнистые перевязочные материалы в силу низкой дренирующей способности не обеспечивают удаления из раны продуктов некролиза и требуют частых перевязок (Сахаров И.Ю. с соавт., 1994).

В последнее время в клинической практике широко применяли импортную мазь «Ируксол» производства "Pliva d.d." (Республика Хорватия), содержащую клостридиопептидазу А, сопутствующие протеазы и антибиотик хло-рамфеникол в липофильной безводной мазевой основе. Мазь оказывала комбинированное некролитическое действие на нежизнеспособные ткани и обеспечивала выраженный антибактериальный эффект.

Однако недостатком использования мазей на липофильных основах, к которым относится и мазь «Ируксол», является их гидрофобность, в связи с чем в первой фазе раневого процесса при обильном увлажнении раны данные мази не смешиваются с раневым экссудатом, и тем более не поглощают раневое отделяемое. Вследствие этого ухудшаются возможности очищения раны от гноя и некротических масс, что задерживает процессы регенерации. Мази на гидрофобных основах нарушают отток из раны. Липофильные основы не обеспечивают достаточного высвобождения протеолитических ферментов и антибактериальных средств из композиции и не способствуют их пенетрации (Левагина Г.Н. с соавт., 2000; Даценко Б.М. с соавт., 1989). Поэтому вопрос лечения гнойных ран нельзя считать решенным.

Таким образом, является актуальным создание нового ферментного препарата, предназначенного для очищения раневых поверхностей от некротических тканей, а также содержащего антисептик для предотвращения развития раневой инфекции.

Цель и задачи исследования.

Целью работы является создание ферментсодержащего раноочищающего средства в виде гидрофильной мази, изучение его технологических свойств, разработка биотехнологической схемы производства и норм качества. Задачи исследования:

1. Произвести выбор оптимальной лекарственной формы и составить схему биотехнологических исследований.

2. Провести биотехнологические исследования по выбору оптимального состава раноочищающего средства.

3. Провести необходимые испытания in vitro для подтверждения целесообразности разработанного состава.

4. Составить эффективную технологическую схему производства предлагаемого раноочищающего средства.

5. Разработать нормы и методы оценки его качества, установить срок годности.

6. Выполнить предварительные исследования по определению влияния на антимикробное действие разработанной мази иммобилизованной протеазы.

7. Провести предварительные фармакологические исследования по определению влияния разработанной мази на процесс ранозаживления.

Научная новизна.

Предложена оптимизированная схема биотехнологических исследований иммобилизованных протеолитических ферментов, позволяющая осуществлять выбор носителя с минимальными затратами.

Произведено изучение ряда основ-носителей, наиболее часто используемых в мягких лекарственных формах для терапии ран. С учетом установленных величин осмотической активности даны рекомендации по их применению в соответствующих лекарственных препаратах, предназначенных для лечения ран.

Предложен состав раноочищающей мази с условным названием «Пио-лит». Обоснованы показатели и нормы качества разработанной мази. В условиях ускоренного старения установлен срок годности - 12 месяцев.

В опытах на животных показано положительное влияние разработанной мази на общую динамику заживления ран.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученный экспериментальный материал послужил экспериментально-теоретическим обоснованием для создания комбинированной раноочищающей мази под условным названием «Пиолит», предназначенной для наружного применения, на гиперосмолярной гидрофильной основе, сочетающей в своем составе протеолитический фермент (трипсин) и антимикробный агент (хлоргексидина биглюконат). Проведены биотехнологические исследования разработанной мази, а также предложена технологическая схема производства. Даны соответствующие рекомендации по выпуску разработанной мази в условиях промышленного производства в виде ТУ и ТИ на ветеринарный препарат.

Внедрение результатов исследований в практику.

Получены акт технологической апробации и акт апробации методик стандартизации разработанной мази с условным названием «Пиолит» на базе производственного участка и отдела контроля качества ЗАО «Центрально-Европейская фармацевтическая компания» (г. Москва) соответственно.

Получен акт о результатах испытаний разработанной раноочищающей мази с условным названием «Пиолит» на базе Ставропольской городской станции по борьбе с болезнями животных.

На разработанную мазь составлена нормативная документация в виде ТУ на ветеринарное средство, утвержденных ООО НПО «Константа» (г. Ставрополь).

Положения, выносимые на защиту:

• Разработанная схема биотехнологических исследований позволяет производить выбор оптимального носителя для иммобилизуемой протеазы с меньшими трудовыми затратами;

• Предлагается оптимальный состав раноочищающей мази «Пиолит» с иммобилизованным трипсином и технологическая схема ее производства;

• Характеристика и оценка биотехнологических свойств мази «Пиолит», разработка норм качества, установление сроков ее годности, предварительная оценка антимикробного и фармакологического действия.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на ежегодных научных региональных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (2005-2006 гг., г. Пятигорск), IV научно-практической конференции молодых ученых и студентов юга России «Медицинская наука и здравоохранение» (апрель 2006 г., г. Анапа), межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы фармации» (26 апреля 2007 г., г. Владикавказ). Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 работ. В научных изданиях, входящих в перечень ВАК, опубликованы 3 работы.

Связь задач исследования с планом НИР учреждения, где выполнялась диссертация.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорская ГФА Росздрава № госрегистрации 01.20.0215436.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы и 3 глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы и приложений. Работа содержит 14 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 144 источника, из них 18 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Верниковский, Владислав Владиславович

Общие выводы

1. На основании комплекса экспериментально-теоретических исследований разработана оригинальная мазь «Пиолит», содержащая иммобилизованный фермент и антисептик широкого спектра действия. Разработаны основные критерии ее оценки: осмотическая активность, некролитический и антимикробный эффект. Составлена оптимизированая схема биотехнологических исследований иммобилизованных протеаз, позволяющая произвести выбор оптимального носителя.

2. Установлен и обоснован оптимальный состав раноочищающей композиции: носитель для иммобилизации протеазы - основа-сплав полиэтиленоксидов ПЭО 400 и ПЭО 1500 (8:2), иммобилизуемый фермент - трипсин (до активности 3 ПЕ/г мази), антимикробный компонент - хлоргексидина биглюконат (0,2%).

3. Проведены биотехнологические и биофармацевтические испытания in vitro, показавшие полную совместимость компонентов мази. Исследованы структурно-механические свойства мази, и доказано, что введение действующих веществ приводит к снижению общей вязкости системы (мази) и ускоряет процесс восстановления структуры. Нефелометрическая оценка процесса взаимодействия основы и трипсина в водных растворах подтвердила наличие взаимодействия между трипсином и основой и образования межмолекулярных комплексов.

4. Разработана технологическая схема производства предлагаемой раноочищающей мази с включением биотехнологических этапов, даны рекомендации по стадиям технологического процесса.

5. Выработаны нормы качества для предлагаемой мази. Изотермическим способом установлен срок годности: при температуре хранения не выше +10°С он составляет 12 месяцев.

6. Установлено, что разработанная мазь обеспечивает выраженный антимикробный эффект, и наличие иммобилизованного трипсина не оказывает влияния на уровень антимикробного воздействия.

7. Исследование динамики ранозаживления экспериментального ожога показало, что использование разработанной мази увеличивает темпы контракции по сравнению с препаратом сравнения (мазью «Левомеколь») до 10 суток эксперимента. Исследование раневой поверхности в ходе эксперимента показало, что при использовании разработанной мази полное отторжение струпа происходит на 8 сутки, для препарата сравнения - на 12 сутки.

8. Выполненные экспериментальные исследования позволили разработать и утвердить нормативную документацию на предложенную мазь - ТУ и ТИ.

Практические предложения

1. С целью лечения гнойно-некротических ран рекомендуется внедрить в медицинскую практику разработанную мазь «Пиолит».

2. Технологическая схема и техническая документация на мазь «Пиолит» могут быть использованы для производства препарата в условиях предприятий фармацевтической и биологической промышленности.

3. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций и ведении лабораторных занятий по курсу биотехнологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Верниковский, Владислав Владиславович, Пятигорск

1. Абаев, Ю.К. Экспериментальное обоснование применения многофункциональной повязки: автореф. дис. . канд. мед. наук / Ю.К. Абаев. - JL, 1991. -23 с.

2. Адамян, А.А. Современные перевязочные средства для местного лечения ран / А.А. Адамян, С.В. Добыт // Новая аптека. Аптечный ассортимент. -2005.-№9.-С. 37-39.

3. Алексеев, К.В. Изучение осмотической активности гелей на основе редкос-шитого акрилового сополимера / К.В. Алексеев, O.JI. Бондаренко // Фармация. 1989. - Т.38, №1. - С. 22-25.

4. Алексеев, Р.И. Руководство по вычислению и обработке результатов количественного анализа / Р.И. Алексеев, Ю.И. Коровин. М.: Атомиздат, 1972. -72 с.

5. Алексеева, И.В. Разработка лекарственных форм для лечения ран / И.В. Алексеева // Фармация. 2003. - №2. - С. 43-45.

6. Алехин, С.А. Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях / С.А. Алехин, В.А. Липатов // Актуальные проблемы медицины и фармации: мат. 66-й науч. конф. студентов и молодых ученых. -Курск, 2001.-С. 57-59.

7. Алиновская, В.А. Сорбционная иммобилизация протеолитических ферментов на целлюлозе, окисленной оксидом азота (IV) / В.А. Алиновская, Т.Л. Юркштович, Ф.Н. Капуцкий // Коллоидный журнал. 1989. - Т.51, №6. -С. 1169-1172.

8. Алюшин, М.Т. Синтетические полимеры в отечественной фармацевтической практике / М.Т. Алюшин, А.И. Артемьев, Ю.Г. Тракман. М.: Медицина, 1974.- 153 с.

9. Андреенко, Г.В. Фибринолиз: биохимия, физиология, патология. / Г.В. Анд-реенко. М.: Из-во МГУ. - 1979. - 351 с.

10. Ю.Андрунь, П.К. Влияние папаина на рост тканевой микрофлоры и ее чувствительность к антибиотикам / П.К. Андрунь, В.М. Удод, Б.А. Исмагамбетова // Здравоохр. Казахстана. -1985. №11.- С. 66-67.

11. Ар куша, А. А. Исследование структурно-механических свойств мазей с целью определения оптимума консистенции: автореф. дис. . канд. фармац. наук: 15.00.01 /Аркуша А.А.-Харьков, 1982.-23 с.

12. Аспераза энзиматический препарат для очищения ран / В.Т. Чернобай и др. // Хим.-фармац. журн. - 1991. - Т.25, №1. - С. 86-87.

13. Астраханова, М.М. Применение современных методов анализа для оценки качества мягких лекарственных форм / М.М. Астраханова, К.В. Алексеев // Фармация. 1993. - №6. - С. 55-59.

14. Афиногенов, Г.Е. Антимикробные полимеры / Г.Е. Афиногенов, Е.Ф. Пана-нин. СПб.: Изд-во «Гиппократ», 1993. - 263 с.

15. Аюпова, Г.П. Исследование фармацевтической доступности хлоргексидина из гидрофильных гелей / Г.П. Аюпова, Д.В. Иксанова // Приоритеты фармацевтической науки и практики: материалы заоч. междунар. конф. 31 окт. 2005 г. М.: Изд-во РУДИ, 2006. - 367 с.

16. Багирова, B.J1. Мази. Современный взгляд на лекарственную форму 7 J1.A. Багирова, Н.Б. Демина, Н.А. Кулинченко // Фармация. 2002. - Т.5, №2.-С. 24-26.

17. Безуглая, Е.П. Исследование высвобождения некоторых лекарственных веществ из различных основ для мазей и суппозиториев / Е.П. Безуглая и др. // Фармаком. 1999. - №1. - С. 26-29.

18. Белов, А.А. Методы определения протеолитической активности в промышленных образцах препаратов иммобилизованных протеиназ /А.А. Белов, Т.Е. Игнатюк, В.В. Рыльцев // Хим.-фармац. журн. 1992. - Т.26, №11/12. -С. 101-103.

19. Биорассасывающиеся лекарственные препараты пролонгированного типа действия для местного и имплантационного применения в медицине / В.А.

20. Аминовская и др. // Человек и лекарство: тез. докл. 12 Рос. нац. конгр. 1822 апр. 2005 г. М, 2005. - С. 632.

21. Биотехнология: учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 7: Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин и др.-М.: Высш. шк., 1987.- 159 с.

22. Блатун, JT.A. Возможности современных мазей в лечении гнойных ран, пролежней, трофических язв / JT.A. Блатун // Фармацевтический вестник. -2002.-С. 18.

23. Богданов, Б. Консервативное местное лечение глубоких ожогов / Б. Богданов // Возможности ферментативного очищения и лечения ран (с особым вниманием к мази ируксол). Загреб, 1978. - С. 31-40.

24. Веремеенко, К.Н. Клинико-биохимическое обоснование применения терри-литина при JIOP-заболеваниях / К.Н. Веремеенко, Г.Ф. Карпенко, B.C. Черный // Журнал ушных, носовых и горловых болезней. 1980. - №3. - С. 4650.

25. Верниковский, В.В. Биофармацевтические исследования по разработке раноочищающих мазей с протеолитическими ферментами / В.В. Берниковский // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. Спецвыпуск. Фармакология. -2006.-С. 31-32.

26. Волокнистые материалы с комбинированным ферментативным действием: получение и свойства / Т.Н. Юданова и др. // Хим. технология. 2000. -№7.-С. 38-41.

27. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре И-42-2-82. М., 1983.

28. ВФС 42-3160-98 «Раствор хлоргексидина биглюконата 0,05%». Введ. 1998. - 13.05. - М.: МЗ РФ, 1998. - 5 с.

29. Глянцев, С.П. Сравнительное изучение активности протеолитических ферментов, применяемых для очищения гнойных ран / С.П. Глянцев, Т.В. Саввина, Т.Л. Заец // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1996. - Т. 121, №6. -С. 716-720.

30. Головкин, В.А. Лекарственные средства для наружной терапии воспалений мочеполовых органов. / В.А. Головкин, А.В. Головкин, В.В. Головкин. Запорожье: ЗГМУ. - 2003. - 152 с.

31. Горбунов, О.М. Активное лечение гнойных послеоперационных ран / О.М. Горбунов, А.Я. Коровин // Местное лечение ран: Мат. Всесоюз. конф. -М., 1991.-С. 15-16.

32. ГОСТ 20264.2-88. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности. Введ. 1989. - 01.01. - М.: Изд-во стандартов, 1988. -12 с.

33. ГОСТ 29188.2-91 Метод определения водородного показателя рН. Введ. 1993. - 01.01. - М.: Изд-во стандартов, 1992. - 3 с.

34. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.

35. Государственный реестр лекарственных средств. Т.1. Официальное издание (по состоянию на 31 марта 2001 г.). М.: Издательская фирма Некоммерческая организация «Фонд фармацевтической информации», 2001. - 1277 с.

36. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Агропромиздат, 1987. - 335 с.

37. Грядунова, Г.П. Технология мазей, содержащих фенкарол и исследование их реологических свойств / Г.П. Грядунова, А.Е. Добротворский, Д.В. Пархоменко // Фармация. 1989. - Т. 39, № 4. - С. 15-18.

38. Гунько, В.А. Изучение осмотической активности некоторых мазевых основ / В.А. Гунько, А.А. Гунько, Н.М. Мушенко // Хим.-фармац. журн. 1982. -Т. 16, №3. - С. 89-91.

39. Гурьева, И.В. Возможности местного лечения диабетических поражений стоп / И.В. Гурьева // Русский медицинский журнал. 2002. - Т. 10, №11. -С. 509-513.

40. Давиденко, Т.И. Иммобилизация протеазы Bacillus mesentericus на силохро-мах / Т.И. Давиденко, А. В. Чуенко, А.А. Бондарчук // Химия природ, соединений. 1980. - № 1.-С. 104-109.

41. Давиденко, Т.И. Иммобилизация щелочной протеазы на полисахаридах микробного происхождения / Т.И. Давиденко // Хим.-фармац. журн. 1999. -Т.ЗЗ, № 9. - С. 27-29.

42. Даценко, Б.М. Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению лекарственных препаратов для местного лечения гнойных ран (МЗ СССР Фармакологический Комитет). / Б.М. Даценко, С.В. Бирюкова, Т.И. Тамм. М.: 1989. - 46 с.

43. Дихтярев, С.И. Ферменты и антиферменты / С.И. Дихтярев, Н.Ф. Маслова // В кн.: Технология и стандартизация лекарств: сб. науч. тр. Т.2. - Харьков: ИГ «РИРЕГ». - 2000. - 784 с.

44. Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки: пер. с англ. / Т. Дэвени, Я. Гер-гей. М.: Мир, 1976.-368 с.

45. Изучение протеолитического действия асперазы / Н.Ф, Маслова и др. // Хим.-фармац. журн. 1983. - №4. - С. 429-432.

46. Иммобилизация модифицированного химотрипсина в структуре пленок из триацетата целлюлозы / Н.Р. Кильдеева и др. // Биохимия. 1980. - Т.45, №3. - С. 569-574.

47. Иммобилизация протеолитических ферментов на углеродной ткани АУВМ «ДНЕПР»-МН / Е.В. Севастьянова и др. // Хим.-фармац. журн. 1992. -Т.26, №6. - С. 40-42.

48. Иммобилизация трипсина на полисахаридах при интенсивном механическом воздействии / А.Н. Зеленецкий и др. // Изв. АН. Серия химическая. 2003. - №9. - С. 1963-1967.

49. Иммобилизация ферментов в структуре волокон и пленок / А.Д. Вирник и др. // Антибиотики и мед. биотехнология. 1986. - Т.31, №2. - С. 117-122.

50. Иммобилизованная эластотераза / Т.И. Давиденко и др. // Фармаком -1993. -№12.-С. 5-11.

51. Исследование взаимодействия трипсина с линейными поликарбоновыми кислотами / О.А. Миргородская и др. // Биоорган, химия. 1976. - Т.2, №12. -С. 1695-1696.

52. Исследования аминокислотного состава сфагнума бурого / Н.А. Буркина и др. // Химия растительного сырья. 2000. - №1. - С. 81-83.

53. Каплан, А.В. Гнойная травматология костей и суставов / А.В. Каплан, Н.Е. Махсон, В.М. Мельникова. М.: Медицина, 1985. - 384 с.

54. Кирюхин, Ю.Н. Влияние натуральных и синтетических вспомогательных веществ на реологические свойства мазевых основ / Ю.Н. Кирюхин, Р.Г. Заславская, Л.И. Драник // Фармация. 1984. - Т. 33, № 6. - С. 15-17.

55. Климова, О.А. Препараты коллагенолитических протеаз беспозвоночных: биохимические аспекты медицинского и косметологического применения / О.А. Климова, В.Ю. Чеботарев // Бюл. эксперим. биол. и медицины. -2000. Т. 130, №7. - С. 70-75.

56. Клиническое применение иммобилизованных ферментов в хирургии. Состояние и перспективы (обзор) / П.И. Толстых и др. // Хирургия. 1985. -№9.-С. 129-136.

57. Коваленко, Г.А. Иммобилизованные протеолитические ферменты для наружного применения / Г.А. Коваленко // Хим.-фармац. журн. 1998. - Т.32, №4.-С. 41-44.

58. Количественное определение аминокислот в пыльце (обножке) / И.В. Духанина и др. // Хим.-фармац. журн. 2006. - Т.40, №2. - С. 22-23.

59. Комиссарова, A.JI. Изучение механизма образования и стабильности комплексов а-химотрипсина с альгиновой кислотой / A.JI. Комиссарова, М.М. Фельдштейн, B.C. Якубович // Хим.-фармац. журн. 1981. - Т.5, №1. -С. 56-60.

60. Королюк, A.M. Микробиологические аспекты течения современной посттравматической инфекции / A.M. Королюк, В.А. Попов, В.Д. Вадиков // Тез. XVIII съезда эпидемиол., микробиол., паразитол. М., 1989. - Т.1. -С. 175-176.

61. Кравченко, И.А. Лечебные пластыри с иммобилизованными протеолитическими ферментами / И.А. Кравченко, Т.И. Давиденко // Фармаком. 1993. -№10-11.-С.46-52.

62. Красильников, А.П. Справочник по антисептике / А.П. Красильников. -Минск: Вышэйшая школа, 1995. 367 с.

63. Кузин, М.И. Раны и раневая инфекция / М.И. Кузин, Б.М. Костюченок, В.А. Карлов. М.: Медицина, 1981.

64. Куликов, Л.И. Сочетанное применение пролонгированной энзимотерапии и хирургических методов при лечении длительно незаживающих ран: автореф. дис. . канд. мед. наук / Л.И. Куликов. Омск, 1984. - 29 с.

65. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов / В.А. Куркин. Самара: ООО «Офорт», ГОУВПО «СамГМУ», 2004. -1180 с.

66. Лечебное действие мази Морикрол / Г.Н. Руденская и др. // Вестн. моек, ун-та. Сер. 2. Химия. 2000. - Т.41, №6. - С. 414-416.

67. Макаров, К.А. Иммобилизация медицинских ферментов и антисептиков на поверхности пленочных материалов / К.А. Макаров, Г.П. Терещенко, А.П. Башкович // Применение новых биополимерных материалов в медицине.-Л., 1979.

68. Макарьин, В.Е. Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и полимерных имплантантов / В.Е. Макарьин, Б.С. Турсу-нов.-М., 1992.-С. 115-116.

69. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. / М.Д. Машковский. -13-е изд., новое Харьков: Торсинг, 1998. - Т.2 - 592 с.

70. Механосорбционное получение композиций высокодисперсного кремнезема с трипсином и катионными ПАВ / И.И. Геращенко и др. // Хим.-фармац. журн. 2001. - Т.35, № 2, С. 16-17.

71. Морфологическая оценка воздействия коллагеназы камчатского краба Paralithodes camtschatica на раневой процесс в эксперименте / А.А. Адамян и др. // Бюл. эксперим. биол. и медицины. 1992. - Т. 112, №12. - С. 660663.

72. Морфологическая оценка воздействия коллагеназы камчатского краба Paralithodes camtschatica на термический ожог в эксперименте / Н.А. Маркович и др. // Бюл. экспер. биол. и медицины. 1996. - Т. 122, № 7. - С. 97100.

73. Морфологический анализ обработки протеазами поврежденных нервов / О.С. Сотников и др. // Бюл. эксперим. биол. и медицины. 1995. - №4. -С. 439-442.

74. Муронец, В.И. Иммобилизованные олигомерные ферменты / В.И. Муронец, Н.К. Наградова. -М.: Наука, 1984. 208 с.

75. Мухин, В.А. Протеолиз и протеолитические ферменты в тканях морских беспозвоночных / В.А. Мухин, В.Ю. Новиков. Мурманск: Изд-во ПИНРО, 2002.-118 с.

76. Мухин, В.А. Ферментативные белковые гидролизаты тканей морских гидро-бионтов: получение свойства и практическое использование / В.А. Мухин, В.Ю. Новиков. Мурманск: Изд-во ПИНРО, 2001. - 97 с.

77. Оценка воздействия мази, содержащей коллагеназу камчатского краба, на инфицированную рану в эксперименте / JI.C. Сандахчиев и др. // Бюл. экс-перим. биол. и медицины. 1997. - Т. 124, №10. - С. 421-424.

78. Пат. 1814764 Российская Федерация, МПК А61К31/557, А61К47/48 Способ получения средства для лечения гнойно-некротических ран / Ю.М. Гафуров и др. (РФ). №4848928/14; заявл. 20.04.1994; опубл. 20.03.1995.

79. Пат. 2014086 Российская Федерация, МПК A61L15/12 Средство для удаления некротических тканей / И.Ю. Сахаров и др. (РФ). №5002616/14; заявл. 19.09.1991; опубл. 15.06.1994.

80. Пат. 2076697 Российская Федерация, МПК А61К9/06, А61К38/43, А61К47:30, А61К47:10, А61К31:71 Мазь «Лингезин» / Э.З. Каган и др. (РФ). №93000551/14; заявл. 05.01.1993; опубл. 10.04.1997.

81. Пат. 2149644 Российская Федерация, МПК А61К38/48 Способ лечения заболеваний, сопровождающихся образованием гноя и/или некротических тканей / О.А. Климова, В.Ю. Чеботарев (РФ). №97120399/14; заявл. 28.11.1997; опубл. 27.05.2000.

82. Пат. 2150936 Российская Федерация, МПК А61К9/06, А61К38/48, А61Р17/02 Композиция для лечения гнойно-некротических ран (варианты) / Г.Н. Левагина и др. (РФ). №97120950/14; заявл. 16.12.1997; опубл. 20.06.2000.

83. Перцев, И.М. Многокомпонентные мази на гидрофильной основе / И.М. Перцев, Б.М. Даценко, В.Г. Гунько // Фармация. 1990. - Т.39, №5. -С. 73-77.

84. Петрова, И.С. Определение протеолитической активности ферментных препаратов микробиологического происхождения / И.С. Петрова, М.М. Винцю-гонайте // Прикл. биохимия и микробиолог. 1966. - Т.2, №3. - С. 322-327.

85. Полимеры в фармации / под ред. А.И. Тенцовой, М.Т. Алюшина. М.: Медицина, 1985. - 256 с.

86. Получение и применение ферментов, витаминов, аминокислот, премиксов: Обзор информ. / Л.Л. Люджус и др. М., 1986.

87. Получение и свойства полимерных композиций, содержащих лизоцим и протеазу С / Т.Н. Юданова и др. // Антибиотики и химиотерапия 2003. -Т.48, № 4. - С. 7-10.

88. Полыгалина, Г.В. Определение активности ферментов. Справочник. / Г.В. Полыгалина, B.C. Чередниченко, Л.В. Римарева. М.: ДеЛи принт, 2003.-375 с.

89. Практикум по биологической химии / под ред. А.С. Вечера. 2-е изд., пере-раб. и доп. - Минск: Вышэйшая школа. - 1976. - 288 с.

90. Применение иммобилизованных ферментов протеолиза и их ингибиторов в хирургии / В.К. Гостищев и др. // Вест. хир. 1982. - №9. - С. 89-93.

91. Разработка полимерных пленок, содержащих иммобилизованную протеазу и диоксидин / Г. Пуоджюнене и др. // Хим.-фармац. журн. Т.39, №1. - 2005. -С. 34-36.

92. Разработка технологии мази иммобилизованной протеазы / Г. Пуоджюнене и др. // Хим.-фармац. журн. 2003. - Т.37, № 10. - С. 23-26.

93. Рациональное применение мазей / J1.B. Деримедведь и др. // Провизор. -2002. -№1.- С. 20-22.

94. Решетников, В.И. Методология разработки лекарственных форм с иммунобиологической и адсорбционной активностью: дис. . д-ра фармац. наук. / В.И. Решетников Пермь, 2005. - 406 с.

95. Свойства протеазы "С" в комплексе с полигексаметиленгуанидином / Т.Н. Юданова и др. // Хим.-фармац. журн. 2003. - Т.37, № 12. - С. 41-44.

96. Сиголаева, JI.B. Влияние температурного коллапса матрицы на активность иммобилизованного а-химотрипсина / J1.B. Сиголаева, H.J1. Еремеев, Н.Ф. Казанская // Биотехнология. 1993. - №5. - С. 36-39.

97. Совместная иммобилизация литических и протеолитических ферментов / А.В. Чуенко и др. // Химия природ, соединений. 1990. - №4. - С. 528-532.

98. Стручков, Ю.В. Лечение гнойных ран / Ю.В. Стручков // Хирургия. -1982.-№8.-С. 12-15.

99. Текстильные материалы медицинского назначения с комбинированным биологическим действием: получение и свойства / И.Ф. Скокова и др. // Текстильная химия. 1998. - Т. 13, №1. - С. 96-102.

100. Тенцова, А.И. Современные аспекты исследования и производства мазей / А.И. Тенцова, В.М. Грецкий М.: Медицина, 1980. - 192 с.

101. Терапевтические системы иммобилизованного трипсина новые высокоэффективные средства в лечении гнойных ран и трофических язв / П.И. Толстых и др. // Фарматека. - 2004. - № 16. - С. 12-16.

102. Технология мягких лекарственных форм: учеб. пособие / под ред. проф. Л.Г. Марченко. СПб.: СпецЛит, 2004. - 174 с.

103. Токсикологическое изучение коллагеназы камчатского краба / С.П. Глянцева и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1995. - №4. - С. 390393.

104. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты: пер. с англ. / М. Тривен. М.: Мир, 1983.-213 с.

105. Тюкавкина, Н.А. Биоорганическая химия: учебник для вузов / Н.А. Тю-кавкина, Ю.И. Барсуков. 4-е изд., стереотип. - М.: Дрофа, 2005. - 542 с.

106. Федеральное руководство по использованию лекарственных средств (формулярная система). Выпуск VIII. М.: «ЭХО», 2007. - 1008 с.

107. Физико-химические свойства трипсина, ковалентно связанного с водорастворимыми поликарбоновыми кислотами / Г.П. Иванова и др. // Биоорган. химия. 1977. - Т.З, №1. - С. 127-132.

108. Фисенко, В.П. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / В.П. Фисенко. М., 2000. -С. 114-119.

109. Чакрабарти, Р. Фибринолиз: Современные фундаментальные и клинические концепции / Р. Чакрабарти. М., 1982. - 235 с.

110. Шарма, X. Ферментативное очищение ран с особым уклоном на механизм действия коллагеназы (ируксол) / X. Шарма // Возможности ферментативного очищения и лечения ран (с особым вниманием к мази ируксол). Загреб. - 1978.-С. 7-15.

111. Шатерников, В.А. Определение активности трипсина / В.А. Шатерников, В.И. Плохой, Э.П. Цыганов // Фармация. 1976. - №2. - С. 36-38.

112. Шрамм, Г. Основы практической реологии и реометрии: пер. с англ. / Г. Шрамм. М.: КолосС, 2003. - 312 с.

113. Элементы экспериментальной фармакологии / под ред. J1.H. Сернова,

114. B.В Гацура. М., 2000. - 351 с.

115. Юданова, Т.Н. Исследование свойств ферментсодержащих волокнистых материалов медицинского назначения / Т.Н. Юданова, Н.Ф. Скокова, А.Д. Вирник // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 1992. - Т.35, вып. 9.1. C. 95-99.

116. Юнкеров, В.И. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований / В.И. Юнкеров, С.Г. Григорьев. СПб.: ВМедА, 2002. -266 с.

117. Якубке, Х.-Д. Аминокислоты, пептиды, белки: пер. с нем. / Х.-Д. Якубке, X. Ешкайт. М.: Мир, 1985. - 456 с.

118. Яремчук, А.Я. Клинико-морфологическая характеристика гнойных ран при лечении ируксолом / А.Я. Яремчук, А.К. Мендель, Н.И. Карабан // Клин, медицина. -1982. Т.60, №6. - С. 100-103.

119. Некректомн у обпечених / J1.0. Клименко и др. // I зЧзд xipypriB Украши: тез. доп. Льв1в: Свгг. -1994. - С. 221.

120. Appel, W. In: Bergmeyer H.U. (ed.): Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, Vol. I, pp. 1098-1104.

121. Bergmeyer, H.U., Gawehn, K. and Grassl, M., in Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer, H.U. (ed.), v. 1, 2nd Ed., pp. 515-516, Academic Press, Inc., New York, NY (1974).

122. Cooney, D.A. Enzymes Therapeutic in Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd ed. / D.A. Cooney, G. Stergis, H.N. Jayaram vol. 9. - pp. 225-240.

123. EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit, in Fluorescence Microplate Assay, 7th Ed., pp. 55-56., Molecular Probes, Inc., Eugene, OR (2002).

124. Isolation and characterization of proteinase and collagenase from CI. histolyti-cum / Mandl, I. et al. // J. Clin. Invest. 1953. - №32. - p. 1323.

125. Krowczynski L.S. // Farm. Pol. 1984. - vol. 40, №1. - P. 21-26.

126. Krowczynski, L. Metody analityczne stosowane w badaniach biofarma-ceutycznych / L. Krowczynski, H. Krasowaka // Biul. Inform. Inst, przem. pharm. 1975. - T.23, №3. - S. 284-293.

127. Researches on immobilization of papaine / Shui De-xin et al. // Chim. J. Chin. Univ. 1991. - vol. 12, №3. - pp. 423-425.

128. Shui De-xin Study of trypsin's immobilization and properties of immobilized trypsin / Shui De-xin, Chen Tian, Jiang Yong-ming //Chin. Biochem. J. 1991. -vol. 7, №5.-pp. 555-559.

129. Study of immobilization of papaine on chitosane / Jiang Yong-ming et al. // Chin. Bichem. J. 1993. - vol. 9, №4. - pp. 470-474.

130. US Patent 4613502, I.C. A61K 037/48; A61K 037/547 Proteolytic, dry bio-polymeric composition for treatment of wounds, and method of using same / Turkova J. (Cesky Brod, CS), Stamberg J. (Prague, CS). № 679118; 06.12.84. -2 pp.

131. US Patent 5112608, I.C. A61K 037/547 Use of protease nexin-I to mediate wound healing / Scott R.W. (Sunnyvale, CA), Berg R.A. (Lambertville, NJ). -№505442; 05.04.90. 4 pp.

132. US Patent 5196196, I.C. A61K 037/547, A61L 015/00, A61F 013/00, C12N 011/14 Use of protease nexin-I in wound dressings / Scott R.W. (Sunnyvale, CA), Berg R.A. (Lambertville, NJ). № 821989; 16.01.92. - 4 pp.

133. US Patent 6074664, I.C. A61L 015/38 Medicament form for the delivery of collagenase to wounds and process for the preparation thereof / Roreger M. (Neu-wied, DE), Einig H. (Neustadt, DE). №875723; 17.11.97. - 3 pp.

134. Van Wart, H.E. A continuous spectrophotometric assay for Clostridium histo-lyticum collagenase / H.E. Van Wart, D.R. Steinbrink // Anal. Biochem. 1981. -vol. 113. - pp. 356-365.

135. Wunsch, E. Determination of collagenase / E. Wiinsch, H.G. Heinrich // Hoppc-Seyler's Z. Physic Chem. 1963. - vol. 333. - pp. 149-151.

136. Zhuang Pin Spin labeling and kinetic studies of a membrane-immobilized proteolytic enzyme / Zhuang Pin, Butterfield D. Allan // Biotechnol. Progr. 1992. -vol. 8, №3,-pp. 204-210.