Анализ антигенной структуры Helicobacter pylori и разработка тест-системы для неинвазивной диагностики хеликобактериоза

Вахрамеева, Мария Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ антигенной структуры Helicobacter pylori и разработка тест-системы для неинвазивной диагностики хеликобактериоза
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ антигенной структуры Helicobacter pylori и разработка тест-системы для неинвазивной диагностики хеликобактериоза"

На правах рукописи

Вахрамеева Мария Сергеевна

АНАЛИЗ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ HELICOBACTER PYLORI И РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЕЛИКОБАКТЕРИОЗА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА-2004

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ю. А. Белая

доктор биологических наук И. С. Мещерякова

доктор медицинских наук, профессор В. А. Малов

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского МЗ РФ

Защита диссертации состоится » апреля 2004 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.01 в Государственном Учреждении Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ имени Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан « О » марта 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Е. В. Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Открытый два десятилетия назад новый возбудитель инфекционных болезней - Helicobacter pylori (H. pylori) (В. J. Marshall, J. R. Warren, 1983 г.) является одним из самых распространенных возбудителей инфекционных заболеваний среди населения планеты, в том числе и в нашей стране. Установлена его этиологическая роль в патогенезе хронического гастрита и дуоденита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофического гастрита, MALT-лимфомы и рака желудка. Накопленные за короткий срок данные по патогенезу, иммунитету и терапии инфекции, вызванной Н. pylori, стали возможны благодаря разработанным в последние годы высокотехнологичным методам диагностики этой инфекции (Аруин Л. И., 1999, 2004 г.г.; Григорьев П. Я., Яковенко Э. Г., 1998 г.; Ивашкин В. Т., Мегро Ф., Лапина Т. Л., 1999 г.; Исаков В. А., 2003 г.; Кишкун А. А. с соавт., 2001 г.; Bell D. E. et al., 1987 г.; FiguraN., 1996 г.; Graham D. et al., 1987 г.).

В настоящее время существует большой набор диагностических методов (бактериологический, гистологический, «уреазный» тест, полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющих с достаточно высокой степенью чувствительности и специфичности выявлять наличие Н. pylori в биоптатах желудка при заболеваниях верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Однако, эти методы сложны в постановке, требуют специального оборудования, длительного времени для получения ответа. Более того, для взятия материала необходимо предварительное проведение эзофагогастродуоденоскопии с последующей биопсией, и потому они не могут быть использованы многократно у одного и того же больного. Широкое распространение получили серологические методы (иммуноферментный анализ, иммуноблотинг), в том числе, неинвазивные, быстро выполнимые, основанные на латекс-агглютинации или твердофазном ИФА. Определение наличия антител к Н. pylori мало информативно, в особенности у детей до 10 лет, так как не позволяет дифференцировать факт инфицирования в прошлом от наличия Н. pylori в настоящий момент и не подходит для оценки эффективности эрадикационной терапии, поскольку достоверное снижение титра антител происходит только спустя несколько месяцев после окончания терапии. ПЦР может быть использована и для неинвазивной диагностики, материалом при этом являются не только биоптаты, но и зубной налет, смывы ротовой полости, копрофильтрат. Применение ПЦР для исследования биологического материала часто затруднено наличием в нем ингибиторов реакции, кроме того этот метод не доступен большинству практических медицинских учреждений it клиник.

Одной из важных задач здравоохранения в перспективе является интенсификация научных исследований и разработка новых ускоренных методов идентификации возбудителей инфекционных заболеваний (Онищенко Г. Г., 2003 г.).

С 1983 г. по рекомендации экспертов ВОЗ в перечень экспресс-систем включена реакция коагглютинации (РКА) при условии применения стандартных образцов диагностических препаратов.

К настоящему времени разработаны, апробированы и находятся на разных этапах внедрения в практику наборы тест-систем для РКА по выявлению в биологическом материале (копрофильтрат, слюна, сыворотка крови) больных кишечными инфекциями О-антигенов Shigella flexneii 2a, 6; S. sonnei; Salmonella серогрупп В, Ci, Сз, Д, Е; Yersinia pseudotuberculosis I и Ш сероваров, Yersinia enterocolitica 0:3; 0:9; 0:7,8: 0:6,30 и 0:4,33; Campylobacter; Escherichia coli 0:157 и др. (Белая Ю. А. с соавт., 1981, 1990, 2001,2003 гг.).

Неинвазивные методы определения антигенов Н. pylori в биологическом материале с помощью РКА до начала наших исследований отсутствовали. Между тем, многие вопросы хеликобактериоза, как и во всякой новой проблеме, остаются пока недостаточно исследованными. К ним относятся вопросы, связанные с изучением антигенной структуры возбудителя, выяснение закономерностей циркуляции их в организме и создание тест-систем для быстрой неинвазивной диагностики и оценки эффективности антибактериальной терапии.

Актуальность выбранной темы и своевременность ее разработки позволяет сформулировать цель и задачи нашей работы.

Дель работы. Изучение антигенного состава Н. pylori, закономерностей циркуляции патогенетически значимых антигенов в организме человека и разработка тест-систем для неинвазивной антигенодиагностики хеликобактерной инфекции. Задачи работы.

1. Изучить антигенный состав Н. pylori, в том числе методом иммуноэлектрофореза в агаровом геле.

2. Выделить О-антигены и высокомолекулярные белки Н. pylori, являющиеся специфическими патогенетически значимыми маркерами этих бактерий, и получить антисыворотки к ним.

3. Изучить закономерности циркуляции антигенов Н. pylori в организме при инфекциях, ассоциированных с этим возбудителем.

4. Разработать и испытать тест-системы для выявления специфических О-ангигена и высокомолекулярных белков Н. pylori в различных модификациях реакции коагтлютинации при заболеваниях желудочно-кишечного тракта.

5. Изучить частоту встречаемости антигенов Н. pylori и других возбудителей кишечных инфекций при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. Научная новизна.

- Получены новые данные об антигенной структуре Н. pylori. При исследованиях методом иммуноэлектрофореза в агаре установлено, что Н. pylori имеет сложный состав белковых и полисахаридных антигенов. Среди них обнаружены и охарактеризованы: термостабильный О-антиген с компонентами анодной и катодной подвижности и специфический относительно термолабильный кислый полисахаридный антиген, который по своим свойствам может быть отнесен к группе К-антигенов. Установлено, что иммунофореграммы Н. pylori и Campylobacter относятся к одному иммунофоретипу, однако, полисахаридные О- и К-антигены этих возбудителей четко отличаются по своей специфичности.

- Показано, что О-антиген Н. pylori у больных с диагнозом «острая кишечная инфекция» обнаруживался в среднем у 33,2%, антигены сальмонелл выявлялись в 28,8% случаев, антигены иерсиний у 15,1% больных, шигелл и кампилобактеров -соответственно в 5,8 и 5,1% случаев.

- Специфический О-антиген Н. pylori у больных с верифицированным этиологическим диагнозом определялся с высокой частотой (65-83%), у больных с диагнозом острая кишечная инфекция неясной этиологии (ОКИНЭ) - в 29% случаев. Установлена высокая частота одновременного выявления антигенов Н. pylori и О-антигенов других возбудителей кишечных инфекций (55-76%), при этом Н. pylori обнаруживался в ассоциации с двумя антигенами (30%), чаще с маркерами сальмонелл и иерсиний, или тремя (13,1%) антигенами.

- Впервые в ходе проспективных многолетних исследований на добровольцах (7 человек) прослежена частота встречаемости антигенов Н. pylori, показано, что наличие и количество выделяемого со слюной и калом антигена находится в сильной степени корреляции с выраженностью инфекционного процесса.

наблюдается увеличение титров этих белков Н. pylori, в период реконвалесценции при успещной терапии уровень их снижается, в период ремиссии они не выявляются.

Практическая значимость работы.

- Дополнительно к разработанным ранее в лаборатории диагностикумам 16-ти наименований (Ю. А. Белая с соавт.) для определения маркеров возбудителей основных кишечных инфекций впервые разработана специфическая и чувствительная тест-система для определения О-антигена Н. pylori в биологических жидкостях организма (слюна, копрофильтрат, кровь) с помощью реакции коагглютинации на стекле. На основе результатов работы подготовлено «Наставление по применению реакции коагглютинации для неинвазивной экспресс-диагностики хеликобактерной инфекции» (ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, 2003 г.).

- Сконструированы диагностикумы для выявления О-антигенов-маркеров возбудителей кишечных инфекций 15 нозологических групп, в том числе Н. pylori, в высокочувствительном варианте - реакции коагглютинации на планшетах. Показана принципиальная возможность и целесообразность использования этого метода для мультианализа с целью этиологической и дифференциальной диагностики кишечных инфекций в течение 24 часов полуколичественным способом выявления антигенов возбудителей в биологических жидкостях больных.

- Разработан диагностикум для реакции коагглютинации на планшете с целью выявления в биологическом материале больных комплекса высокомолекулярных белков (ВМБ) с молекулярной массой 90 кДа и выше. Реакция коагглютинации с ВМБ-диагностикумом позволяет выявлять белковые антигены-маркеры цитотоксинпродуцирующих штаммов Н. pylori в кале и слюне больных при размножении возбудителя и, таким образом, верифицировать не только инфицированность Н. pylori, но и способность штамма продуцировать токсины. Этот метод позволяет в более ранние сроки оценивать эффективность эрадикационной терапии.

Способ получения диагностикума для выявления антигенов Н. pylori в реакции коагглютинации на стекле защищен патентом № 2186394 от 31 января 2001 г. Дальнейшие расширенные клинические испытания диагностикумов для выявления О-антигенов и высокомолекулярных белков, являющихся маркерами цитотоксинпродуцирующих штаммов Н. pylori, непосредственно в биологическом материале от больных в РКА позволят определить возможности использования их для скрининга лиц и определения инфицирования Н. pylori, а также для оценки эффективности антибактериальной терапии.

Апробация работы. Работа апробирована на совместной научной конференции группы иммунологии энтеральных инфекций и лаборатории естественного иммунитета ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН 6 февраля 2003 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах, содержит 15 таблиц, 17 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (3 главы), собственных исследований (4 главы), заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 171 источник, включая 74 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

За период с 1999 по 2002 г. был обследован 1491 больной острыми кишечными инфекциями, среди которых было 50,5% мужчин и 49,5% женщин, дети до 14 лет составляли 28%. В возрастной структуре заболевших преобладали лица от 26 ло 50 лет (47,3%).

Материалы и методы. Исследование антигенной структуры Helicobacter pylori, получение антигенов этого микроорганизма, антисывороток к ним и хеликобактерных тест-систем проводили с использованием типовых штаммов Helicobacter pylori: ATCC №700392, штамм. №26625, NCTC №11637, NCTC №11639. Для определения специфичности разработанных хеликобактерных тест-систем использовали также штаммы и выделенные из них липополисахариды (ЛПС) других возбудителей кишечных инфекций: Campylobacter lari, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni наиболее часто встречающихся сероваров; KlebsieUa; Shigella flexneri 2a, б (newcastle), Shigella sonnei; Salmonella основных В, Ci, C2, D, E серогрупп; Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica (табл. 1). Культуру бактерий Н. pylori выращивали на Columbia agar с добавлением 5% лошадиной крови или 5% крови доноров в микроаэрофильных условиях (5% кислорода, 15% углекислого газа, 80% азота) с использованием GAS PACK при 37° С в течение 3-5 суток.

Получение полного комплекса растворимых антигенов Н. pylori проводили путем многократного замораживания и оттаивания по Грассе. Аналогичным образом выделяли антигены из других бактерий возбудителей кишечных инфекций.

Выделение О-антигена (липополисахарида) проводили методом экстракции горячим фенолом по Westphal О., Yahn J. [1965].

Получение высокомолекулярных белков (ВМБ) Н. pylori осуществляли по оригинальной методике. Развивающиеся куриные эмбрионы 9-ти дневного возраста заражали в желточный мешок 3-х суточной культурой Н. pylori штамм NCTC №11637

(vac+ cag4) в дозе 6 млрд. мкр. кл./мл по оптическому стандарту и продолжали инкубировать при 37° С в течение 2-х суток. Гомогенат погибших эмбрионов вместе с белком и желтком (эмбриональный гомогенат - ЭГ) содержал полный набор антигенов размножившегося микроорганизма, в том числе высокомолекулярных белков Н. pylori.

Антисыворотки против О-антигенов и ВМБ Н. pylori получали путем 5-ти кратной иммунизации кроликов гретой (100° С, 30 мин.) культурой Н. pylori или высокомолекулярными белками Н. pylori соответственно. Иммуноэлектрофо-ретический анализ (ИЭФ) проводили по методике Грабаря и Вильямса [1953] в модификации Л. А. Зильбера иГ.А. Абелева [1962]. Иммуноблот проводили согласно Towbin et al. [1979] на аппарате фирмы BioRad (Austria) совместно с д. м. н. Ю. Ф. Белым.

Реакцию коагтлютинации на стекле для выявления О-антигенов маркеров кишечных инфекций проводили согласно описанию проведения и учета РКА, изложенному в методических рекомендациях «Реакция коагтлютинации при кишечных инфекционных заболеваниях», утвержденных МЗ СССР 28.11.1990 г. и методических указаниях «Постановка реакции коагтлютинации для экспресс-диагностики сальмонеллезов животных, обнаружения сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды», утвержденных Департаментом Ветеринарии МСХ России 15.02.1995 г. Материалом для исследования служили копрофильтрат (фекалии, разведенные 1:5 фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и неразведенная слюна, которые прогревали при 100° С в течение 20 минут и осветляли центрифугированием при 2000 об./мин. в течение 15 мин. На предметное стекло, расчерченное на сектора, наносили по 1-й капле исследуемого материала и по капле диагностикума, после осторожного перемешивания оставляли на 30-60 мин. при 37° С во влажной камере. В качестве контроля служили: исследуемый материал + ФСБ, исследуемый материал + 1% взвесь клеток Staphylococcus aureus Cowan I (отрицательные контроли); ЛПС в разведении 10"2 мг/мл + гомологичный диагностикум (положительный контроль). Результаты РКА оценивали по четырехкрестной шкале. Положительной считали реакцию агглютинации суспензии стафилококков с оценкой на 2+ и выше.

Определение высокомолекулярных белков Н. pylori в РКА на планшетах. В 2-х рядах иммунологических 96-луночных планшетов с U-образным дном титровали последовательно четырехкратно до разведения 1:4096 исследуемый нативный (негретый) материал (неразведенная слюна, копрофильтрат (1:5) или сыворотка крови (1:50). Затем в верхний ряд лунок вносили диагностикум, в нижний ряд - взвесь несенсибилизированного стафилококка. Учет реакции осуществляли через 18 часов по

сопоставлению максимального титра положительной реакции на 4+ («зонтик» на дне лунки) в верхнем ряду лунок с максимальным титром положительной реакции во втором ряду. Разница в титрах первого и второго ряда лунок в 4 и более раз считалась положительной реакцией.

Статистическая обработка данных выполнена по программе «Excel-2000» и «Primer Biostatistics Version 4.03» с вычислением % выявления показателей в анализируемых группах, средней арифметической и достоверности различий непараметрических показателей по x2 [В. И. Сергиенко, И. Б. Бондарева, 2001].

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Разработка методов диагностики инфекционных заболеваний, в том числе ассоциированных с Helicobacter pylori, путем определения специфических антигенов возбудителя, предполагает в первую очередь исследование антигенной структуры возбудителей, определение и выделение антигенов, которые можно использовать в качестве специфических маркеров возбудителей, получение антисывороток к ним и, наконец, разработка на их основе тест-систем, определение их качества (специфичности и чувствительности) в модельных опытах. Заключительным этапом является апробация методов на клиническом материале.

Иммунофоретический анализ антигенного состава Н. pylori. В результате иммунофоретического исследования в агаре антигеного состава установлено, что Н. pylori имеет несколько (не менее 8) поверхностных и глубинных растворимых антигенов (рис. 1), среди которых определяются специфические полисахаридные антигены, образующие 3 линии преципитации: 1) специфический О-антиген с высокой молекулярной массой и отрицательным зарядом, медленно движущийся в электрическом поле в анодной зоне иммунофореграммы; 2) катодный компонент О-антигена, очевидно относящийся к R-антигену; З) специфический антиген в анодной зоне иммунофореграммы, имеющий большую, чем О-антиген в этой зоне электрофоретическую и диффузионную подвижность, свидетельствующую о его относительно меньшей молекулярной массе и кислой природе, который может быть отнесен к полисахаридным К-антигенам. Остальные антигены Н. pylori имеют белковую природу, разрушаются при 100° С в течение 30 минут и в большинстве своем не являются специфическими для Н. pylori.

При микроскопическом исследовании нами было установлено, что популяция штаммов Н. pylori, состоящая преимущественно из палочковидных форм, имеет полноценную антигенную структуру К+О+, популяция же штаммов, представленных в основном кокковыми формами, содержит меньшее количество К- и О-антигенов и

находится в R-форме. Различное содержание К- и О-антигенов в разных штаммах Н. pylori, а также К- и О-антител в сыворотках крови кроликов, зависящее, очевидно, от индивидуальных особенностей животных, необходимо учитывать при разработке диагностических препаратов.

J_ Os о».

Рис 1. Иммуноэлектрофореграммы антигенов Н. pylori.

В центральных лунках: лизаты бактерий штаммов № 26695 (1), № 11637 (3), № 11639 (4); ЛПС штамма № 26695 (2); проявлены сывороткой против культуры штамма №11637.

Проведен сравнительный анализ иммунофоретипов Н. pylori и антигенного состава других возбудителей кишечных инфекций (шигелл, сальмонелл, иерсиний, эшерихий, кампилобактеров, цитробактеров). Установлено, что иммунофореграммы Н. pylori и Campylobacter относятся к одному иммунофоретипу, однако их полисахаридные О- и К-антигены четко отличаются по своей специфичности (рис. 2).

I S. flexneri 2-5 Salmonella Citrobacter Y. enterocolitica

п ---ixz^ E. coli OH9:K69 (B) S. dysenteriae 1

ш S. sonnci S

IV S. flexneri 6 (Newcastle) S. boydii 1-15 E. coU 08:K87 (B) Campylobacter jejuni, coli, lari Helicobacter pylori

V Salmonella typhy E. coli 0101:K30

Рис 2. Иммунофоретипы специфических антигенов возбудителей кишечных инфекций. По данным Белой Ю. А., 1970 г.; Петрухина В. Г., 1975 г.; Нгуен Зуй Хо, 1977 г.; Степановой Л. К., 1980 г.

Дальнейшие исследования позволят получить данные об иммунохимической природе К-антигена Н. pylori и его роли в патогенезе и иммуном ответе при заболеваниях, ассоциированных с этим микроорганизмом.

Получение диагностикумов для определения О-антигена Н. pylori в реакции коагглютинации на стекле. На основе кроличьих антисывороток к гретым культурам Н. pylori АТСС 700392 и его ЛПС, а также Н. pylori NCTC 11637 были приготовлены диагностикумы для PICA на стекле. Особое внимание было уделено определению специфичности хеликобактерных сывороток и приготовленных на их основе диагностикумов. Диагностикумы были испытаны в первую очередь с ЛПС Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Campylobacter coli разных сероваров. Как видно из табл. 1, хеликобактерные диагностикумы не реагируют с ЛПС изученных видов сероваров других возбудителей кишечных инфекций, и следовательно, не имеют с их «К»- и О- антигенами перекрестных связей.

Хеликобактерные антигены разных штаммов были испытаны также с ранее разработанными диагностикумами для определения маркеров наиболее распространенных возбудителей кишечных инфекций (табл. 2). Во всех случаях реакция коагглютинации была отрицательной. Это свидетельствует о высокой специфичности хеликобактерных диагностикумов для РКА.

Реакцию коагглютинации на стекле можно проводить в полуколичественном варианте при разведении исследуемого материала. Чтобы не делать последовательных разведений исследуемого материала, можно воспользоваться шкалой, разработанной нами в специальных опытах постановки и учета РКА с двукратно разведенными ЛПС и оценкой реакции по 4-х крестовой системе (табл. 3). Так, если РКА оценивается на ±, это означает, что антиген Н. pylori может быть обнаружен в разведении биоматериала до 1:5, то есть титр антигена Н. pylori равен 5; если РКА оценивается на +, то титр антигена составляет 1:10 и так далее.

В специальных исследованиях при сопоставлении результатов определения Н. pylori у больных язвенной болезнью 12-перстной кишки с помощью быстрого уреазного теста и микроскопии биоптатов установлено, что РКА с титром специфических антигенов Н. pylori с оценкой на «±» считается слабоположительной; «+» - положительной; «2+» и более - резко положительной реакцией. Чувствительность РКА диагностикумов для определения О-антигена составляла 10-2-10-3 мг/мл по ЛПС и лиофилизированным лизатам культур Н. pylori соответственно.

Таблица 1

Специфичность диагностикумов для выявления антигенов Н. pylori _в реакции коагтлютинации_

Культура бактерий, штамм

Антиген

Хсликобактериые диагносттсумы

131,

159,

Helicobacter pylori ATCC №700392 Helicobacter pylori ATCC №700392 Helicobacter pylori ATCC №700392 Helicobacter pylori NCTC №11637 Helicobacter pylori NCTC №11637 Helicobacter pylori NCTC №11639 Helicobacter pylori NCTC №11639

ЛПС люат бактерий культ, бактерий лизат бактерий культ, бактерий лнзат бактерий культ, бактерий

Campylobacter jeuni L1 Campylobacter jeuni L 2 Campylobacter jeuni L 4 Campylobacter jeuni L 6 Campylobacter jeuni L 7 Campylobacter jeuni L 5 Campylobacter coli L 8 Campylobacter coli L 20 Campylobacter lari L 35 Campylobacter lari L 73

ЛПС ЛПС ЛПС JIHC ЛПС ЛПС ЛПС ЛПС

лпс

Jinc

Shigella ilexneri №516 Shigella sonnei №478 Shigella newcastle №1221

JIHC ЛНС ЛПС

Salmonella typhimurium №415 Salmonella choleraesuis Salmonella enteritidis Salmonella muenchen №605 Salmonella london Salmonella anatum №201

ЛПС JIHC ЛПС ЛПС ЛПС ЛПС

Y. pseudotuberculosis I c. №59 Y. pseudotuberculosis Ш c. №188 Y. enterocolitica 0:3 c. №5503 Y. enterocolitica 0:9 c. №915 Y. enterocolitica 0:7,8 c. №5512 Y. enterocolitica 0:4,33 c. №10767 Y. enterocolitica 0:6,30 c. №5511

ЛПС ЛПС ЛПС ЛПС ЛПС ЛПС

лпс

Echerichia coli О 157

ЛПС

Legionella pneumophila №2128

лизат бактерий

Ps. aeruginosa №4027

лизат бактерий

Ю. pneumoniae №62204 ■

лизат бактерий

Метод был исытан в качестве быстрого неинвазивного теста при диагностике хеликобактериоза у больных язвенной болезнью 12-перстной кишки и неязвенной диспепсией в сопоставлении с «быстрым» уреазным тестом и бактериоскопией биоптатов. Установлена его высокая чувствительность (91%), которая не уступает уреазному тесту (91%) и микроскопии биоптатов (82%) (р>0.05).

Как следует из полученных данных, диагностикум для выявления О-антигена Н. pylori в РКА на стекле обладает высокой специфичностью и достаточной чувствительностью. По своей чувствительности РКА превосходит преципитационные методы и сопоставима с иммуноферментным анализом.

Таблица 2

Специфичность диагностикумов, используемых для выявления маркеров возбудителей кишечных инфекций в РКА с культурами Н. pylori

AHaraocTHKyMU ana buhbjkhhii O-urrareHt Культуры H. pylori Контроль диагностикумов (без антигена)

26695 11637 11639

Shigella flexneri 2a -

Shigella flexneri 1b --

Shigella sonnet -

Shigella 6 (newcastle) -

Campylobacter (DOJiBBajieHTHtiii) *

Salmonella ceporpynnti B -

Salmonella ceporpynnu Cj -

Salmonella ceporpynnti Cj -

Salmonella ceporpynnu fl -

Salmonella ceporpynnu E -

Yersinia pseudotuberculosis I ccponapa -

Yersinia pseudotuberculosis III cepoBapa -

Yersinia enterocolitica 0:3 ceponapa -

Yersinia enterocolitica 0:9 ceposapa -

Yersinia enterocolitica 0:7,8 ceposapa -

Yersinia enterocolitica 0:4,33 cepoBapa -

Yersinia enterocolitica 0:6,50 ceposapa -

Echerichia coli O 1S7 -

H. pylori ATCC №26695 + t + -

H. pylori NCTCJift 11637 + + * -

H. pylori NCTC №11639 4- + + -

*) микробная масса Н. pylori (30 млрд микр. тел/мл), прогретая при 100°С в течение 20 минут, в разведении 1:10.

Таблица3

Соответствие результатов визуального учета РКА с определением _титра ЛДС в исследуемом материале_

Интенсивность РКА с биоматериалом Соответствующие разведения ЛПС (из исходного 1 мг/мл)

0 5 10 20 40-60 80 и > "

± +

+ +

2+ +

3+ +

4+ +

*) обратные значения титров.

Закономерности циркуляции О-антигена Н. pylori при инфекционном процессе, вызванном этим возбудителем. Впервые были исследованы закономерности циркуляции О-антигена Н. pylori в динамике инфекционного процесса. В ходе проспективных исследований по выявлению антигенов Н. pylori и других возбудителей кишечных инфекций в группе практически здоровых 7 добровольцев у одного из них удалось проследить в динамике возникновение острого гастрита с характерными клиническими проявлениями - тошнотой, изжогой, болями в области желудка и тонкого кишечника, головной болью, подъемом температуры до 38°. У этого больного исследовали циркуляцию О-антигена Н. pylori до заболевания, в момент инфицирования, острого периода инфекционного процесса и в периоды ранней и поздней реконвалесценции. Изучено в общей сложности за 6 месяцев исследований 974 пробы фекалий и слюны. Антиген Н. pylori у этого практически здорового человека до инфицирования не определялся (рис. 3). Специфический антиген был обнаружен первоначально в течение 2-х суток, затем выявлялся в незначительном количестве на протяжении 2-х недель. С появлением клинических симптомов заболевания и на протяжении всего острого периода маркер Н. pylori обнаруживался в высоких титрах постоянно. Это продолжалось и после прекращения клинических проявлений заболевания в течение 2-х недель. В периоде реконвалесценции на протяжении одного месяца наблюдались кратковременные диспепсические явления, сопровождавшиеся небольшими подъемами уровня антигена в супернатантах фекалий и/или слюне. В течение второго месяца реконвалесценции антиген Н. pylori обнаруживался периодически в низких титрах при отсутствии клинических проявлений заболевания. Полное освобождение организма от Н. pylori наступило через 4 месяца после начала заболевания. Применение хеликобактерного диагностикума, таким образом, позволило провести динамическое наблюдение и получить данные об особенностях циркуляции антигена Н. pylori в организме в различные периоды заболевания и определить полноту освобождения организма от возбудителя. Полученные данные свидетельствуют о высокой информативности метода определения антигена-маркера возбудителя хеликобактериоза для объективной оценки клинического течения заболевания: в наиболее тяжелый период инфекционного процесса отмечается наибольший подъем уровня антигена в биологических жидкостях, свидетельствующий, очевидно, о размножении возбудителя в организме. Несмотря на последующее уменьшение клинических проявлений болезни антиген Н. pylori еще в течение некоторого времени продолжал выделяться из организма. Каждое вновь возникающее обострение сопровождалось подъемом уровня антигена. Отсутствие антигена после прекращения

клинических проявлений заболевания в исследуемых пробах свидетельствует о прекращении размножения возбудителя.

Таким образом, использование хеликобактерного диагностикума для РКА позволило провести длительное динамическое наблюдение на наличие маркера Н. pylori при инфекционном процессе, установить тесную корреляцию частоты и уровня выявления антигена Н. pylori с клиническими проявлениями заболевания и определить время прекращения размножения возбудителя в организме.

Рис. 3. Циркуляция антигенов Helicobacter pylori при инфекционном процессе.

Обозначения: - - уровень О-антигена Н. pylori в динамике;

■ - клинические проявления заболевания.

Частота встречаемости антигена Н. pylori при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. Реакцию коагтлютинации на стекле ставили не только на выявление ЛПС Н. pylori, но способом мультианализа - с одновременным определением О-антигенов основных возбудителей кишечных инфекций - шигелл Флекснера 1в, 2а, 6, шигелл Зонне; сальмонелл серогрупп В, Ci, Сг, Д, Е; иерсиний псевдотуберкулеза I и Ш сероваров, иерсиний энтероколитика 0:3; 0.9; 0:7,8; 0:4,33; 0.6,30; кампилобактеров (поливалентный диагностикум); эшерихий 0157. Диагностикумы были разработаны и изготовлены в ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН. Показано, что О-антиген Н. pylori при клиническом диагнозе кишечной инфекции обнаруживался в среднем у одной трети больных (33,2%). При этом сальмонеллезные антигены выявлены в 28,8% случаев, иерсиниозные у 15,1% больных.

Шигеллезные и кампилобактериозные антигены обнаружены соответственно в 5,8 и 5,1% случаев (табл. 4).

Таблица 4

Частота выявления антигенов Н. pylori и других возбудителей кишечных инфекций в биологическом материале больных кишечными заболеваниями при

различных клинических диагнозах (1999-2002 гг.)

Направляющий клииико-эпидемиологический диагноз и число больных, п Число больных с положительной реакцией на наличие антигенов возбудителей, %

Н. pylori п=492 1 шигеялы п=96 2 сальмонеллы п=432 3 кампило-бактеры п=77 4 иерсинии п=118 5

А: Хеликобактериоз, п=150 24,6х' 1,3 10,4 0 3,9

Б: Дизентерия, п=19 36,6 7,7 7,7 15,4 30,8

В: Сальмонеллез, п=73 32,0 0 34,0 0 0

Г: Кампилобактериоз, п=23 47,8 11,1 33,3 11,1 11,1

Д: Иерсиниоз, п=517 25,9 4,6 13,4 5,5 19,3

Е: КИНЭ, п=709 30,9 8,0 41,3 6,0 15,4

Ж: Всего, п=1491 33,2 5,8 28,8 5,1 15,1

3: Здоровые (контроль) (Вологда) п=223 15 5,8 4,4 2,7 4,0

^достоверные различия по X в группах: А(-А3 %2=10,259, р=0,001; А.1-Г1 Х2=4,243, р=0,039; 1>Г4 х^б.862, р=0,009; Äi-&x2=4,590, р=0,032.

При анализе частоты выявления антигена Н. pylori в группах больных, диагноз которых был поставлен не только на основании клинических симптомов заболевания, но и подтвержден выявлением маркеров соответствующих возбудителей в РКА (347 человек), маркер Н. pylori выявлялся в разных этиологических группах от 65% до 83% (иерсиниоз, сальмонеллез, кампилобактериоз, шигеллез), в среднем в 74% случаев (табл. 5). Как видно из таблицы, примерно в одной трети случаев (29%) он обнаруживался в достаточно высоких титрах в группе больных, у которых антигены других патогенных возбудителей кишечных инфекций не были обнаружены (ОКИНЭ). Важно отметить, что Н. pylori часто (в среднем в 74% случаев) выявлялся вместе с антигенами других возбудителей кишечных инфекций установленной этиологии: в виде двух антигенов в 30% случаев, трех антигенов - 13,1%, четырех антигенов - 6,1%, 5-6 антигенов 1,3 - 0,9% соответственно. Поскольку клиническая картина кишечных инфекций различной этиологии часто бывает сходной, а при хеликобактериозе и кампилобактериозе патогномоничные симптомы отсутствуют, представляется необходимым проводить мультианализ, чтобы исследовать, по-возможности, полный

спектр маркеров возбудителей наиболее распространенных кишечных инфекций, учитывая при этом также высокую частоту смешанного инфицирования.

Таблица5

Выявление антигенов Н. pylori у больных острыми кишечными инфекциями _с установленной этиологией___

Группа больных с диагнозом к> Частота выявления антигенов H.pylori в титрах 1:10 и выше 0) % Средний титр антигенов Н. pyloriххх) Частота выявления антигенов Н.ру1оп (%) из числа положительных реакций в титрах:

jXK) 10 20 40 80 160 и выше

шигеллез, п=23 83 66,4 13 5 18 36 13 4

сальмонелле?, п=47 72 40,2 10 5 33 26 15 4

иерсиниоз, п=63 65 53,1 16 14 14 10 12 12

кампило-бактериоз, п=31 77 81,8 4 12 16 32 24 8

Всего: п=164 74 60,4 10,7 9 20,2 26 16 7

ОКИНЭ, п=181 29 32,6 13 30 28 21 8 0

Итого: п=345 56,6

Обозначения: х> - поданным клинических наблюдений и

иммунологического (РКА) исследования; ^ - из общего числа обследованных больных в группе; ш) - обратные значения титров.

На основании проведенных исследований было сделано заключение, что использование РКА с широким набором диагностикумов является оптимальным подходом для этиологической и дифференциальной диагностики кишечных заболеваний. Разработанный нами метод позволяет на 3-х предметных стеклах в течение 2-х часов установить этиологический и дифференциальный диагноз основных кишечных инфекций 16-ти нозологических форм, в том числе инфекции Н. pylori, a также возможность микст-инфекций.

В дополнение к имеющимся данным литературы о высокой частоте обнаружения Н. pylori при дисбиозах, вызванных условно-патогенными бактериями (О. Г. Лазаренко с соавт., 2000, П. Я. Григорьев с соавт., 1997. С. Н. Давыдова с соавт., 1999, А. А. Ильченко, 2000, М. Квина, 1999), а также вирусо -грибковыми ассоциациями (М. Л. Черницкая, 2000 г.), нами впервые установлено, что антиген Н. pylori в подавляющем числе случаев выявляется в ассоциации с антигенами тех или

иных патогенных микроорганизмов - шигеллами, сальмонеллами, иерсиниями, кампилобактерами.

Мультианализ в реакции коагглютинации на планшетах. Нами были сконструированы диагностикумы для выявления антигенов различных возбудителей кишечных инфекций, в том числе Н. pylori, в высокочувствительном варианте РКА на планшетах. Показана принципиальная возможность и целесообразность использования их для мультианализа с целью этиологической и дифференциальной диагностики. Чувствительность РКА. на планшетах на 1-3 порядка превышает таковую для РКА на стекле и достигает 10-5 - 10-6 мг/мл по гомологичному ЛПС. Учет реакции через 1 сутки. Важно отметить, что метод РКА на планшете может быть использован для полуколичественного выявления О-антигенов возбудителей кишечных инфекций в биологических жидкостях больных.

Разработка тест-системы для выявления патогенетически значимых высокомолекулярных белков Н. pylori. Одной из основных задач наших исследований являлась разработка тест-системы для выявления в биологических жидкостях больных антигенов высокомолекулярных белков Н. pylori, поскольку протеины с молекулярной массой 120-140 кДа являются высокоспецифическими антигенами-маркерами цитотоксинпродуцирующих штаммов Н. pylori (J. L. Telford et al, 1994, Z. Xiang et al., 1998).

Мы исходили из положения, что наличие в геноме возбудителя Н. pylori генов vac А и cag А, контролирующих синтез соответствующих высокомолекулярных белков, и определение этих генов в культуре и биологическом материале еще не достаточно для заключения об этиологической и патогенетической роли К pylori в возникновении инфекционного процесса. Необходимо выявление способности Н. pylori экспрессировать соответствующие белки в организме. Известно, что патогенные микроорганизмы, выращенные на искусственных питательных средах, не проявляют полностью свои потенциальные возможности метаболизма, и, лишь попадая в организм чувствительного хозяина, они приобретают способность образовывать капсулу, экспрессировать токсины, изменять антигенные и иммуногенные свойства (Домарадский И. В., 2000). Известно, что геном Н. pylori обладает выраженной пластичностью. Мы предположили, что в чувствительном организме продукция патогенетически значимых антигенов может быть значительно более выраженной и полной. Важно при этом и их количественные отношения, свойственные клинически выраженной инфекции Н. pylori. Исходя из этих предпосылок, нами был использован оригинальный способ получения материала, содержащего комплекс

высокомолекулярных белков Н. pylori. В ранее проведенных исследованих было показано (Белая Ю. А., Белая О. Ф, 2001), что 9-ти дневные куриные эмбрионы являются чувствительной моделью для размножения и токсического действия К pylori Нами были получены гомогенаты куриных эмбрионов, зараженных культурой Н. pylori 11637 и погибших в течение 2-х суток, сыворотки против них, и на их основе изготовлены диагностикумы. После внутрижелточного заражения 9-ти дневных развивающихся куриных эмбрионов живой культурой Н. pylori штамма NCTC 11637, содержащего vac А и cag А гены, происходит размножение и гибель эмбриона в течение 2-х суток. При исследовании белкового профиля гомогената этих эмбрионов (рис. 4А) обнаруживаются четко выраженные высокомолекулярные белки (ВМБ), являющиеся, несомненно, продуктом жизнедеятельности Н. pylori в благоприятных условиях (богатая питательная среда, содержащая гемин эритроцитов, необходимая для размножения температура, влажность и микроаэрофильные условия). При иммунизации кроликов гомогенатом зараженных эмбрионов образуются антитела преимущественно к высокомолекулярным высокоиммуногенным белкам, что видно при постановке иммуноблота (рис. 4Б) На основе этой сыворотки был получен JgG антительный диагностикум для РКА, который способен выявлять высокомолекулярные белки Н. pylori в биологических жидкостях. Специфичность диагностикума к ВМБ Н pylori обусловлена их высокой иммуногенностью и способностью белка А стафилококка Cowan I избирательно соединяться с JgG антителами иммунной сыворотки.

Рис 4. Белковый профиль (А) и иммуноблотинг (Б) антигенов Н. pylori. 2, 3 - эмбриональная жидкость 9-ти дневного куриного эмбриона, зараженного культурой Н pylori штамма NCTC 11637 в дозе 10 0 и 5.0 мкл,

а - сыворотка против эмбрионального гомогената; б - сыворотка против агаровой культуры Н. pylori штамма NCTC 11637;

I - группа протеинов с молекулярной массой 90-120 кД, II - 43-67 кД, Ш -14-33 кД.

м 1 2 з г г г г

14 !■

а Б *

Получение диагностикума для определения высокомолекулярных белков Н. pylori в РКА на планшетах. На основе сывороток к гомогенату эмбрионов, зараженного культурой Н. pylori штамма NCTC 11637 (ЭГ37), изготовлен диагностикум для реакции коагглютинации на планшете. Оптимальным разведением сыворотки являлось 1:2000 (рис. 5). Этот диагностикум выявлял в исследуемом материале (ЭГ37) высокомолекулярные белки до разведения 1:800, что свидетельствовало о его достаточно высокой чувствительности.

Рис 5. Схема подбора оптимального разведения сыворотки для изготовления ВМБ-диагностикума.

Обозначения к рисунку:

Разведения тест-антигена: 1 - 1:16; 2 - 1:64; 3 - 1:256; 4 - 1:1024; 5 - 1:4096; 6 -1:16384; 7 - 1:65536; Ki - первый контроль (диагностикум + ФСБ).

Диагностикумы: I - диагностикум с конечным разведением сыворотки 1:500; П -1:1000; Ш - 1:1500; IV - 1:2000; V - 1:3000; К2 - второй контроль (тест-антиген + ФСБ).

Специфичность хеликобактерного ВМБ-диагностикума была испытана с биологическим материалом (слюна, кал) больных с хроническим гастритом и язвой двенадцатиперстной кишки в период обострения и ремиссии. При положительной реакции коагглютинации на стекле на О-антиген Н. pylori в этих пробах выявлялась положительная РКА на планшетах с ВМБ-диагностикумом. При отсутствии О-антигена Н. pylori реакция коагглютинации с ВМБ-диагностикумом отсутствовала. Пробы кала от больных шигеллезом, сальмонеллезом, иерсиниозом, кампилобактериозом, диагноз которых был поставлен на основе клинических данных и положительной РКА на термостабильные О-антигены соответствующих возбудителей, во всех случаях не содержали ВМБ Н. pylori. В желточной жидкости некоторых куриных яиц обнаруживался О-антиген Н. pylori. Однако, в желтке этих яиц реакция на ВМБ Н. pylori была отрицательной. Это, вероятно, можно объяснить отсутствием

условий для размножения бактерий и экспрессии токсинов. Представленные в табл. б данные свидетельствуют о специфичности Н. pyloгi-ВМБ-диагностикума

Таблица 6

Специфичность Н. pylori-ВМБ диагностикума_

Материал для исследования Число РКА на стекле с О- РКАсВМБ-

проб диагностикумом диагностикумом

Н. pylori Н. pylori

Хоонический гастрит.

ЯБДК:

кал1' 135 + +

слюна4 120 + +

кал™' 95 _

слк»нап) 71 - -

ОКИ. кал:

шигеллез 102 - -

сальмонелл ез 132 - -

иерсиниоз 135 - -

кампилобактериоз 45 - -

желток куоиного яйца 5 + -

желток ктоиного яйца 7 - -

Обозначения: 4 период обострения;хх) период ремиссии.

Выявление высокомолекулярных белков Н. pylori у больных хроническим хеликобактериозом. Разработанный нами диагностикум для определения высокомолекулярных белков Н. pylori был применен при систематических продолжительных (в течение 3-х лет) проспективных исследованиях у двух больных с хроническим хеликобактерным гастритом и язвенной болезнью 12-перстной кишки. Одновременно в пробах определяли О-антиген Н. pylori в РКА на стекле, как показатель инфицирования Н. pylori. В общей сложности от первого больного исследовано за этот период 200 проб слюны и 274 пробы кала. Установлено, что в период обострения заболевания у больного наблюдался значительный подъем титров высокомолекулярных белков Н. pylori, тогда как в период реконвалесценции уровень этих белков снижался и практически не выявлялся в период ремиссии (рис. 6)

Второй больной, оперированный по поводу язвы желудка и страдающий периодическими обострениями неязвенного гастрита, был исследован на наличие О-антигена и высокомолекулярных белков в пробах слюны (73) и копрофильтрата (42). Повышенный уровень высокомолекулярных белков Н. pylori отмечался в период обострения и снижался в период ремиссии (рис. 7).

Период обострения.

'ям. lo М - 80-40 -I« - JO-lO" 4-5-0-0.

Tim* То 1024 — 226 -

64-80-

40-16- 10-I». 4- 5

Период ремиссии.

..nilii'll

imrft ,»л...... ■farrin,"":. H'fl

11111111

1 У S 7 • 11 13 15 17 19 21 ZJ 25 17 дни

Рис. 6. Выявление О-антигена и ВМБ Н. pylori у больного неязвенной диспепсией в пробах кала и слюны реакцией коагглютинации.

Обозначения-

#—# - уровень О-ангигена Н pylori в РКА в кале на стекле, О-О - уровень О-антигена Н. pylori в РКА в слюне на стекле, ¡im I - уровень ВМБ Н pylori в РКА в кале и слюне на планшете, То - титр О-антигена II pylori в РКА на стекле, Твмб • титр ВМБ в РКА на планшете

март ' апрель

Рис 7. Выявление уровня О- н ВМБ-антигенов Н. pylori у больного, оперированного по поводу язвы двенадцатиперстной кишки, в пробах кала и слюны реакцией коагглютинации. Обозначения те же, что и на рис. б.

Определение высокомолекулярных белков П. pylori у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки при разной эффективности антихеликобактерной терапии. Разработанный ВМБ-диагностикум был апробирован на 3-х больных язвенной болезнью 12-перстной кишки в период обострения, до начала лечения, в течение всего курса лечения и в различные сроки после него.

Показано, что в период обострения до лечения у всех больных отмечался высокий уровень ВМБ-антигена в слюне и/или кале, который коррелировал с увеличением титров О-антигена возбудителя. В период лечения при эффективной эрадикационной терапии уровень О- и ВМБ-антигенов снижался (рис. 9), при неэффективной терапии оставался на высоком уровне (рис. 8).

Как видно их этих данных, реакция коагглютинации с ВМБ-диагностикумом позволяет выявлять подъем уровня патогенетически значимых антигенов в период обострения, верифицировать инфицированность Н. pylori, дает возможность уже в процессе лечения оценивать эффективность антихеликобактерной терапии.

Таким образом, показана принципиальная возможность получения и использования разработанного нами диагностикума для выявления высокомолекулярных белков Н. pylori в биологическом материале больных, инфицированным этим микроорганизмом. Дальнейшие расширенные исследования с использованием ВМБ диагностикума для неинвазивного метода выявления высокомолекулярных белков, являющихся специфическими маркерами цитотоксинпродуцирующих штаммов Н. pylori, позволит получить новые фактические данные о роли их в патогенезе, иммунитете и терапии заболеваний, ассоциированным с этим возбудителем.

Применение диагностикумов для выявления в РКА 0-антигенов и высокомолекулярных белков, являющихся маркерами цитотоксин-продуцирующих штаммов Н. pylori, непосредственно в биологическом материале от больных открывает широкие возможности для скрининга лиц, инфицированных Н. pylori, наблюдения за ними в ходе заболевания, обострения и в период ремиссии, для ранней диагностики с целью своевременного назначения этиотропной терапии, объективной оценки тяжести течения и исхода заболевания, оценки полноты санации, определения бессимптомного бактерионосительства, оценки и эффективности антибактериальной терапии, в том числе для выявления смешанного инфицирования.

Обладая специфичностью и высокой чувствительностью, не уступающей (при постановке на стекле) чувствительности других иммунологических методов (например, ИФА) или значительно превосходящей ее (в модификации на планшете на 1-3 порядка), РКА имеет ряд преимуществ - это простота постановки и учета, доступность для малооснащенных лабораторий, быстрота получения ответа и рентабельность производства. Поэтому эта реакция может найти широкое применение в различных областях научных и прикладных исследований проблемы хеликобактериоза.

Рис 9. Антигены Н. pylori у больного К. язвой двенадцатиперстной кишки до лечения и в различные сроки после начала терапии (пример эффективной терапии Н. pylori).

Обозначения те же, что и на рис. 6.

ВЫВОДЫ

1. Проведен иммунофоретический анализ полного состава растворимых полисахаридных и белковых антигенов Н. pylori, определена их электрофоретическая и диффузионная подвижность, иммунологическая специфичность. Впервые наряду с О-антигеном выявлен специфический поверхностный относительно термолабильный полисахаридный антиген кислой природы, который по своим характеристикам может быть отнесен к К-антигенам Н. pylori.

2. Разработан простой метод определения специфических полисахаридных антигенов Н. pylori в биологическом материале (кал, слюна, сыворотка крови) с помощью реакции коагглютинации (с чувствительностью 10-3 мг/мл по ЛПС на стекле и 10'5 мг/мл на иммунологических планшетах) для быстрой (2-24 ч ) неинвазивной диагностики инфекции Н. pylori, не уступающий по чувствительности методам микроскопии биоптатов и быстрого уреазного теста.

3. Разработан и апробирован полуколичественный специфический и чувствительный метод определения высокомолекулярных белков Н. pylori в кале, слюне, сыворотке крови с использованием варианта реакции коагтлютинации на планшетах для быстрой (24 ч) неинвазивной диагностики активного инфекционного процесса, вызванного токсигенными штаммами Н. pylori

4. Впервые в ходе длительных систематических обследований добровольцев определены закономерности циркуляции в организме специфических антигенов Н. pylori, и установлена корреляция выраженности клинических проявлений заболевания с обнаружением антигенов Н. pylori в слюне и/или кале. Антигены возбудителя появляются в слюне и/или кале кратковременно в течение 1-2 суток после заражения, не выявляются в инкубационном периоде (1-2 недели), обнаруживаются постоянно и в больших количествах в слюне и кале с первых дней клинических симптомов заболевания, на протяжении всего острого периода инфекционного процесса, и в течение 1-2 недель периода ранней реконвалесценции. В более поздние сроки периода реконвалесценции антигены обнаруживаются не постоянно или в низких титрах при периодических обострениях, полностью исчезая в период стойкой ремиссии.

5. Установлена высокая (от 65% до 83%) частота обнаружения антигенов Н. pylori при острых бактериальных кишечных инфекциях (шигеллезе, сальмонеллезе, иерсиниозе). Впервые показано, что антигены-маркеры Н pylori более чем в половине случаев выявляются в ассоциации с одним или реже несколькими антигенами других возбудителей кишечных инфекций -чаще с маркерами сальмонелл и иерсиний, реже с антигенами шигелл и кампилобактеров.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Белая Ю. А, Петрухин В. Г., Белая О. Ф., Вахрамеева М. С, Жуховицкий В. Г., Ручкина И. Н. Особенности антигенного состава и иммуногенные свойства Helicobacter pylori // Ж. клин. лаб. диагн. -1999. - № 11. - с. 12-13.

2. Белая Ю. А., Евдокимов В. В., Белая О. Ф., Петрухин В. Г., Вахрамеева М. С. Helicobacter pylori и смешанные инфекции // Мат. науч. конф. «Клинические перспективы в инфектологии». - С.-Петербург. - 2001. - с. 27.

3. Белая Ю. А., Белая О. Ф., Петрухин В. Г., Вахрамеева М. С. Helicobacter pylori: эффективный метод антигенодиагностики // Мат. конф. «Национальные дни лабораторной медицины России». - Москва. - 2001, № 9, - с. 38.

4. Белая О. Ф., Герасимова И. Е., Лиенко А. Б., Каншина Н. Н., Чернова М. Е., Набокова М. Ю., Микерин С. М., Вахрамеева М. С. Оценка эффективности терапии ОКИ по элиминации антигенов возбудителя // Мат. межд. конф. «Клиническое исследование лекарственных средств». -Москва. - 2001, - с. 15.

5. Вахрамеева М. С, Белая О. Ф., Петрухин В. Г., Белая Ю. А. Выявление Helicobacter pylori реакцией коагглютинации при кишечных заболеваниях и в пищевых продуктах // Мат. науч. конф. «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». - Новосибирск. - 2002. -с. 236.

6. Белая Ю. А., Белая О. Ф., Евдокимов В. В., Вахрамеева М. С, Петрухин В. Г. Антигенодиагностика болезней, ассоциированных с Helicobacter pylori // Мат Vin Съезда микробиологов, эпидемиологов, паразитологов. - Москва. - 2002, т. 3.-С.229.

7. Белая Ю. А., Вахрамеева М. С, Белый Ю. Ф., Белая О. Ф., Петрухин В. Г. «Способ получения тест-системы для выявления цитотоксинассоциированных белков Helicobacter pylori в биологическом материале инфицированных лиц реакцией коагглютинации» // Патент по заявке № 200212 7480 от 15.10.2002.

8. Белая Ю. А., Петрухин В. Г., Вахрамеева М. С. Летальное действие Helicobacter pylori на модели развивающихся куриных эмбрионов // Мат. конф. «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клиническо-лабораторное обеспечение инфектологии». -Москва. - 2003. - с. 24.

9. Белая Ю. А., Белая О. Ф., Евдокимов В. В., Вахрамеева М. С, Петрухин В. Г. Неинвазивные методы иммунодиагностики при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки // Мат. конф. «Инфекционные и паразитарные

болезни в современном обществе. Клиническо-лабораторное обеспечение инфектологии». - Москва. - 2003. - с. 23. 10. Белая Ю. А., Петрухин В. Г., Вахрамеева М. С, Рубцов И. В., Белая О. Ф. Диагностикум для определения О-антигена V. сМегае реакцией коагглютинации // Мат. конф. «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клиническо-лабораторное обеспечение инфектологии». - Москва. - 2003. - с. 20.

Типография ООО «Телер» 127299 Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД № 00595

Подписано в печать 03 03.2004 г. Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. Бумага «Снегурочка» 1,2 л. Заказ № 147

'Ii

-г с

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Вахрамеева, Мария Сергеевна

Введение

Обзор литературы

Глава 1. Некоторые данные о биологических и эпидемиологических особенностях Helicobacter pylori

Глава 2. Антигены Helicobacter pylori и их роль в патогенезе и иммунитете

2.1. Антигеныый состав Helicobacter pylori

2.1.1. Токсины Helicobacter pylori

2.1.2. О-антиген Helicobacter pylori, химическая структура, серотипы

2.2. Роль антигенов Helicobacter pylori в патогенезе и иммунитете

Глава 3. Современная диагностика инфекций, ассоциированных с Helicobacter pylori

Собственные исследования

Глава 4. Материалы и методы исследования

Глава 5. Иммуноэлектрофоретический анализ антигенного состава Helicobacter pylori

Глава 6. Разработка и применение тест-систем для определения О-антигена-маркера Helicobacter pylori

6.1. Тест-система для реакции коагглютинации на стекле

6.2. Закономерности циркуляции О-антигена Helicobacter pylori при инфекционном процессе

6.3. Частота выявления антигена Helicobacter pylori при кишечных инфекциях

6.4. Высокочувствительный способ выявления О-антигена Helicobacter pylori в биологическом материале в реакции коагглютинации на иммунологических планшетах

6.5. Мультианализ кишечных инфекций на планшетах

Глава 7. Разработка тест-системы для выявления патогенетически значимых высокомолекулярных белков Helicobacter pylori

7.1. Конструирование диагностикума для выявления высокомолекулярных белков Helicobacter pylori в реакции коагглютинации на планшетах

7.2. Определение высокомолекулярных белков Helicobacter pylori в биологических жидкостях больных и здоровых лиц

7.2.1. Выявление высокомолекулярных антигенов Helicobacter pylori у больных в ходе проспективных исследований

7.2.2. Использование диагностикума для определения высокомолекулярных белков Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ антигенной структуры Helicobacter pylori и разработка тест-системы для неинвазивной диагностики хеликобактериоза"

Helicobacter pylori (H. pylori) - грамотрицательная микроаэрофильная подвижная палочка, открытая 20 лет назад (JR. Warren, B.J. Marshall, 1983 год), произвела революцию в микробиологии, гастроэнтерологии и онкологии. Хеликобактериоз явился объектом широких исследований в разных направлениях. За короткий срок был получен ряд важнейших фактических данных. К настоящему времени известно, что 5060% населения планеты инфицировано Н. pylori [3, 9, 38, 105, 149]. Установлена несомненная связь Н. pylori с хроническим гастритом и дуоденитом, язвенной болезнью желудка (ЯБЖ) и двенадцатиперстной кишки (ЯБДК), атрофическим гастритом, а также MALT-лимфомой желудка. Была показана роль инфекции Н. pylori в развитии рака желудка. В 1994 году экспертами Международного Агентства по исследованию рака (IARC) этот возбудитель был причислен к канцерогенам 1 класса (безусловным канцерогенам) [5, 6, 8, 10, 22, 32, 36, 43, 75, 84, 97, 121, 75, 140, 143]. Предполагается участие микроорганизма в развитии гепатомы [103, 106]. Проводятся интенсивные исследования по выявлению роли Н. pylori при атеросклерозе сосудов сердца и мозга и, следовательно, в возникновении инфарктов и инсультов, а также при других негастроинтестинальных проявлениях хеликобактериоза [11а, 53].

К настоящему времени с использованием современных высокотехнологичных методов исследований получены важные научные данные, касающиеся биологии и генетики Н. pylori [34, 40, 41, 44, 46, 56], патогенеза и иммуногенеза [22, 27, 31, 32, 37, 50, 89], диагностики и терапии вызываемых им заболеваний [11, 17, 19, 24, 26, 28, 54]. Расшифрован полный геном Н. pylori [906, 153а], показано значение апоптоза [2, 3, 5, 49, 60, 63, 66] и аутоиммунных реакциий [53, 86, 89] при хеликобактериозе в последовательном развитии: воспаление - атрофические процессы - злокачественная перестройка клеток эпителия [5, 6, 8, 9, 10, 22, 24, 25, 26, 29, 32, 49, 50, 66, 91, 98, 105, 137, 141, 145]. Разработаны диагностические методы [28, 33, 35, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 57, 62, 64, 65, 72, 73, 105, 118, 119, 123, 126, 128, 135, 138, 151, 155] и схемы эффективной эрадикационной терапии [27, 28, 30, 48, 82, 122]. Результаты этих работ отражены в ряде обзоров и монографий [2, 3, 24, 28а, 29, 39, 53, 121, 124а, 127].

В настоящее время можно с полным основанием говорить о появлении нового раздела гастроэнтерологии - хеликобактериологии. Однако, как и во всякой новой проблеме, в хеликобактериологии пока больше вопросов, чем ответов. Нет единого мнения о том, является ли Н. pylori абсолютным патогеном или условно патогенным микроорганизмом, симбионтом [5, 22, 31, 32]. Недостаточно данных для того, чтобы отнести Н. pylori к антропонозам [88, 149].

Весьма важным является вопрос о том, как установленная в настоящее время высокая пластичность генома Н. pylori [31, 39, 41] отражается на экспрессии антигенов в чувствительном организме по сравнению с таковой в окружающей среде и при культивировании на искусственных питательных средах. Не известны закономерности циркуляции антигенов Н. pylori в организме больных, здоровых и бессимптомных носителей. Практически не изучен вопрос о микст-инфекциях, ассоциированных с Н. pylori.

Ключевым вопросом в этих и других мало изученных разделах хеликобактериоза является отсутствие быстрых, чувствительных и простых диагностических методов, необходимых для скрининга, длительного мониторирования и многократных неинвазивных исследований, которые позволили бы определять не только наличие Н. pylori в организме, но и его способность экспрессировать факторы патогенности, обусловливающие развитие и исход заболевания. Необходимы также неинвазивные методы оценки эффективности антихеликобактерной эрадикационной терапии.

Накопленные к настоящему времени данные литературы и многолетний опыт работы лаборатории иммунологии энтеральных инфекций ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН по изучению антигенной структуры возбудителей и антигенодиагностики кишечных инфекций [12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 23] позволяют определить основные патогенетически значимые антигены Н. pylori, которые могут быть использованы в качестве маркеров этих бактерий. Методом выбора в настоящем исследовании явилась реакция коагглютинации (РКА) в двух основных модификациях для определения термостабильного специфического антигена липополисахарида (ЛПС) и термолабильных высокомолекулярных белков (ВМБ) Н. pylori.

Цель работы

Изучение антигенного состава Н. pylori, закономерностей циркуляции патогенетически значимых антигенов в организме человека и разработка тест-систем для неинвазивной антигенодиагностики хеликобактерной инфекции.

Задачи работы

1. Изучить антигенный состав Н. pylori, в том числе методом иммуноэлектрофореза в агаровом геле.

4. Разработать и испытать тест-системы для выявления специфических О-антигена и высокомолекулярных белков Н. pylori в различных модификациях реакции коагглютинации при заболеваниях желудочно-кишечного тракта.

5. Изучить частоту встречаемости антигенов Н. pylori и других возбудителей кишечных инфекций при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. Научная новизна

- Впервые определена динамика наличия высокомолекулярных белков, являющихся маркерами цитотоксинпродуцирующих штаммов Н. pylori, непосредственно в кале и слюне больных хроническим гастритом и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки. Установлено, что в период обострения заболевания наблюдается увеличение титров этих белков Н. pylori, в период реконвалесценции при успещной терапии уровень их снижается, в период ремиссии они не выявляются.

Практическая значимость работы

- Дополнительно к разработанным ранее в лаборатории диагностикумам 16-ти наименований для определения маркеров возбудителей основных кишечных инфекций впервые разработана специфическая и чувствительная тест-система для определения О-антигена Н. pylori в биологических жидкостях организма (слюна, копрофильтрат, кровь) с помощью реакции коагглютинации на стекле. На основе результатов работы утверждено «Наставление по применению реакции коагглютинации для неинвазивной экспресс-диагностики хеликобактерной инфекции» (ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, 2003 г.).

- Разработан диагностикум для реакции коагглютинации на планшете с целью выявления в биологическом материале больных комплекса высокомолекулярных белков с молекулярной массой 90 кД и выше. Реакция коагглютинации с ВМБ-диагностикумом позволяет выявлять белковые антигены-маркеры цитотоксинпродуцирующих штаммов Н. pylori в кале и слюне больных при размножении возбудителя и, таким образом, верифицировать не только инфицированность Н. pylori, но и способность штамма продуцировать токсины. Этот метод позволяет в более ранние сроки оценивать эффективность эрадикационной терапии.

Способ получения диагностикума для выявления антигенов Н. pylori в реакции коагглютинации на стекле и планшетах защищены патентами. Дальнейшие расширенные клинические испытания диагностикумов для выявления О-антигенов и высокомолекулярных белков, являющихся маркерами цитотоксинпродуцирующих штаммов Н. pylori, непосредственно в биологическом материале от больных в РКА позволят определить возможности использования их для скрининга лиц и определения инфицирования Н. pylori, а также для оценки эффективности антибактериальной терапии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы представлены некоторые фактические данные о биологии Н. pylori, эпидемиологические особенности возбудителя. Основной акцент сделан на анализе накопленных к настоящему времени данных об антигенах Н. pylori и современных методах диагностики хеликобактериоза.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Вахрамеева, Мария Сергеевна

выводы

2. Разработан простой метод определения специфических полисахаридных антигенов Н. pylori в биологическом материале (кал, слюна, сыворотка крови) с помощью реакции коагглютинации (с чувствительностью 10"3 мг/мл по ЛПС на стекле и 10"5 мг/мл на иммунологических планшетах) для быстрой (2-24 ч.) неинвазивной диагностики инфекции Н. pylori, не уступающий по чувствительности методам микроскопии биоптатов и быстрого уреазного теста.

3. Разработан и апробирован полуколичественный специфический и чувствительный метод определения высокомолекулярных белков Н. pylori в кале, слюне, сыворотке крови с использованием варианта реакции коагглютинации на планшетах для быстрой (24 ч.) неинвазивной диагностики активного инфекционного процесса, вызванного токсигенными штаммами Н. pylori.

5. Установлена высокая (от 65% до 83%) частота обнаружения антигенов Н. pylori при острых бактериальных кишечных инфекциях (шигеллезе, сальмонеллезе, иерсиниозе). Впервые показано, что антигены-маркеры Н. pylori более чем в половине случаев выявляются в ассоциации с одним или реже несколькими антигенами других возбудителей кишечных инфекций -чаще с маркерами сальмонелл и иерсиний, реже с антигенами шигелл и кампилобактеров.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Выражаю глубокую благодарность старшему научному сотруднику кандидату биологических наук В. Г. Петрухину за помощь и постоянную поддержку в работе по получению и изучению антигенов Н. pylori; доктору медицинских наук руководителю лаборатории молекулярных основ патогенности Ю. Ф. Белому за консультации и участие в исследованиях белкового профиля, в том числе высокомолекулярных белков Н. pylori; В. Г. Жуховицкому за любезно предоставленные культуры Н. pylori; старшему научному сотруднику кандидату биологических наук лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов Л. Н. Нестеренко в определении vac А и cag А генов у использованных в работе штаммов Н. pylori. Огромную сердечную благодарность научному руководителю диссертации доктору медицинских наук профессору Ю. А. Белой за руководство, организацию, постоянную и неоценимую помощь и внимание при проведении и оформлении настоящей работы, а также дирекции ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН за предоставленную возможность выполнения диссертации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На VIII Всероссийском съезде эпидемиологов и микробиологов, посвященном анализу эпидемиологической обстановки в Российской Федерации и основным направлениям деятельности по ее стабилизации, было отмечено, что за период с 1997 по 2001 год выявлено от 534 до 811 тысяч случаев заболевания ОКИНЭ, удельный вес которых составил 57 - 67% от всех кишечных инфекций. Одной из причин этого положения являются серьезные недостатки в лабораторной диагностике кишечных инфекций. Официальной статистикой среди кишечных инфекций хеликобактериоз пока не учитывается.

Helicobacter pylori относится к числу «новых» и, следовательно, молодых возбудителей, открытие которого 20 лет назад (Marshall, 1983) вызвало в последующем буквально революцию в научном мире и бурный интерес исследователей самых разных специальностей. Поскольку была установлена связь с хроническим гастритом и дуоденитом, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофическим гастритом, MALT-лимфомой и саркомой желудка, в 1994 г. ВОЗ признала Н. pylori канцерогеном 1 класса.

В короткий срок с помощью современных методов были сделаны важные открытия в области генетики и молекулярной биологии возбудителя, результатом которых явилась расшифровка полного генома Н. pylori [906, 153а]; открытие островка патогенности, насчитывающего более 40 генов, ответственных за контроль факторов патогенности [2, 3, 5, 22, 32, 141, 145], механизмов патогенеза и иммуногенеза, в том числе роли апоптоза [59, 60, 2, 3]; разработка методов диагностики [11, 28, 29, 33, 40, 41, 43а, 44, 45, 46, 52, 54, 56, 62, 64, 65, 78, 105, 118, 119, 123, 125а, 126, 128, 151, 155].

Однако, как и во всякой новой проблеме, многие вопросы хеликобактериоза остаются пока мало исследованными или трактуются неоднозначно. Ключевыми вопросами являются изучение антигенной структуры Н. pylori и разработка методов антигенодиагностики на основе выявления патогенетически значимых специфических антигенов; закономерностей циркуляции их в организме; связь с тяжестью клинических проявлений заболевания, прогноз исхода заболевания и оценка эффективности эрадикационной терапии. На первый план этих исследований выступает разработка неинвазивных, быстрых, специфических, чувствительных, сравнительно простых и экономичных методов выявления антигенов в качестве маркеров Н. pylori непосредственно в биологических жидкостях человека; методов, позволяющих проводить простой и безопасный предэндоскопический скрининг, длительное мониторирование, оценку эрадикационной терапии. Существующие в настоящее время методы диагностики, в том числе относящиеся к «золотому стандарту» -бактериологический, гистологический, а также уреазные дыхательные тесты и генодиагностика, достаточно сложны, требуют продолжительного времени для получения ответа, дорогостоящего оборудования и реактивов, а главное -предварительной эзофагогастродуоденоскопии, что ограничивает их многократное использование в широкой повседневной практике.

Цель работы

Задачи работы

1. Изучить антигенный состав Н. pylori, в том числе методом иммуноэлектрофореза в агаровом геле.

5. Изучить частоту встречаемости антигенов Н. pylori и других возбудителей кишечных инфекций при заболеваниях желудочно-кишечного тракта.

В результате настоящих исследований впервые получены новые данные об антигенной структуре Н. pylori методом иммуноэлектрофореза в агаре. Установлено, что Н. pylori имеет сложный состав белковых и полисахаридных антигенов. Определено положение на иммунофореграмме термостабильного О-антигена с компонентами анодной и катодной подвижности, а также впервые показано наличие кислого полисахаридного относительно термолабильного антигена, который по своим свойствам может быть отнесен к группе К-антигенов.

Впервые проведен сравнительный анализ иммунофоретипов Н. pylori и антигенного состава других возбудителей кишечных инфекций (шигелл, сальмонелл, иерсиний, эшерихий, кампилобактеров, цитробактеров). Установлено, что иммунофореграммы Н. pylori и Campylobacter относятся к одному иммунофоретипу, однако их полисахаридные О- и К-антигены четко отличаются по своей специфичности. Дальнейшие исследования позволят получить данные об иммунохимической природе К-антигена Н. pylori и его роли в патогенезе и иммунитете заболеваний, ассоциированных с этим микроорганизмом.

Дополнительно к разработанным ранее в лаборатории диагностикумам 19-ти наименований для выявления маркеров возбудителей основных кишечных инфекций в реакции коагглютинации на стекле впервые разработана тест-система для определения О-антигена Н. pylori в биологических жидкостях организма (слюна, копрофильтрат, кровь). Она обладает достаточно высокой чувствительностью (1 - 10 мкг/мл ЛПС) и специфичностью (не реагирует с ЛПС Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari разных сероваров, а также Shigella, Salmonella, Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica, Esherichia). Реакция ставится и учитывается в течение 2 часов, не требует сложного оборудования и дорогостоящих реактивов. Способ получения диагностикума для выявления антигенов Н. pylori в реакции коагглютинации на стекле защищен патентом № 2186394 от 31 января 2001 г. Результаты этого исследования опубликованы [17, 19].

Метод был использован в качестве быстрого неинвазивного метода диагностики хеликобактериоза при язвенной болезни 12-перстной кишки в сопоставлении с «быстрым» уреазным тестом и бактериоскопией биоптатов [17, 34, 35]. Установлено, что его высокая чувствительность (91%) и специфичность (100%) не уступают таковым уреазного теста (91%) и микроскопии биоптатов (82%). В группе больных с неязвенной диспепсией эти три теста выявляли Н. pylori соответственно в 60, 91 и 67% случаев. Тест на О-антиген Н. pylori был использован для исследования в процессе лечения. Было установлено, что метод определения маркеров Н. pylori может быть использован для предэндоскопического скрининга, мониторирования и оценки эрадикационной терапии.

В течение 3 лет (1999 - 2001 гг.) обследован 1491 больной кишечными инфекциями, из которых дети до 14 лет составляли 28%, группа с наибольшей обращаемостью по поводу кишечных инфекций была в возрасте от 26 до 50 лет и составляла 47%. Реакцию коагглютинации на стекле ставили не только на липополисахарид Н. pylori, но способом мультианализа - с одновременным определением О-антигенов возбудителей других наиболее часто встречающихся кишечных инфекций, к которым относятся шигеллы Флекснера 2а, 1в, 6, Зонне; сальмонеллы основных серогрупп В, Ci, С2, Д, Е; иерсинии псевдотуберкулеза I и III сероваров, иерсинии энтероколитика 0:3, 0:9, 0:7,8; кампилобактеры; эшерихии 0157. Диагностикумы были разработаны и изготовлены в ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН [13, 14, 15, 18, 20, 23]. Показано, что О-антиген Н. pylori при клиническом диагнозе кишечной инфекции обнаруживался в среднем у одной трети больных (33,2%). При этом сальмонеллезные антигены выявлены в 28,8% случаев, иерсиниозные у 15,1% больных. Шигеллезные и кампилобактериозные антигены обнаружены соответственно в 5,8 и 5,1% случаев. При анализе частоты выявления антигена Н. pylori в группах больных, клинический диагноз которым подтвержден выявлением маркеров соответствующих возбудителей в реакции коагглютинации (347 человек), маркер Н. pylori выявлялся в разных этиологических группах до 65 - 83% (иерсиниоз, сальмонеллез, кампилобактериоз, шигеллез).

Важно отметить, что антиген Н. pylori выявлялся в качестве единственного маркера лишь в 24% случаев. Чаще он обнаруживался а ассоциации с антигенами других патогенных бактерий: в виде двух антигенов - в 30% случаев, трех - 13,1%, четырех - 6,1%, 5-6 антигенов в 1,3-0,9% соответственно. Поскольку клиническая картина кишечных инфекций различной этиологии часто бывает сходной, а при хеликобактериозе, также как и при кампилобактериозе, патогномоничные симптомы могут отсутствовать, представляется необходимым проводить мультианализ, исследовать, по-возможности, наиболее полный спектр маркеров возбудителей кишечных инфекций, учитывая при этом также высокую частоту ассоциаций возбудителей. На основании проведенных исследований было сделано заключение, что использование РКА с широким набором диагностикумов является оптимальным методом этиологической и дифференциальной диагностики кишечных заболеваний.

В дополнение к имеющимся данным литературы о высокой частоте обнаружения Н. pylori при дисбиозах, вызванных условно-патогенными бактериями [30, 55] и вирусо-бактериально-грибковыми ассоциациями, нами впервые с помощью РКА установлено, что Н. pylori в подавляющем числе случаев выявляется с теми или иными патогенными микроорганизмами - шигеллами, сальмонеллами, иерсиниями.

Впервые нами были исследованы закономерности циркуляции О-антигена Н. pylori в динамике инфекционного процесса Определение О-антигена Н. pylori в РКА на стекле проводили в пробах слюны и кала в процессе проспективных исследований в течение 3-6 лет на 7 добровольцах В ходе этих исследований у одного человека возник инфекционный процесс, ассоциированный с Н. pylori. Поскольку этот доброволец исследовался постоянно до инфицирования Н. pylori и в течение двух лет после него, мы имели возможность проследить циркуляцию антигена Н. pylori с момента заражения и на различных этапах инфекционного процесса: в продромальном периоде, в ходе острого периода самого заболевания и в периоды реконвалесценции.

Показано, что О-антиген Н. pylori отсутствовал до заболевания. Впервые он был обнаружен кратковременно в начале продромального периода, затем исчезал на несколько дней. С появлением первых клинических симптомов и в особенности в разгаре заболевания, характеризовавшегося тошнотой, изжогой, болями в области желудка и тонкого кишечника, головной болью, подъемом температуры до 38° С, О-антиген Н. pylori обнаруживался постоянно в кале или слюне и на высоком уровне. Высокий уровень О-антигена держался также в период ранней реконвалесценции в течение 1 - 2 недель, когда клинические проявления заболевания практически отсутствовали, затем, периодически снижаясь, выявлялся еще на протяжении 1 - 2,5 месяцев, после чего наступала стойкая длительная санация организма.

Таким образом, применение хеликобактерного диагностикума для РКА позволило провести длительное динамическое наблюдение на наличие маркера Н. pylori при инфекционном процессе и определить время наступления санации организма от возбудителя.

Простой достаточно чувствительный и специфический метод антигенодиагностики с помощью РКА на стекле представляется весьма перспективным экспрессным скрининговым методом этиологической и дифференциальной диагностики кишечных инфекций, в том числе ассоциированных с Н. pylori. Он позволяет проводить длительное безопасное мониторирование и определять эффективность проводимой терапии.

При оценке полученных данных с точки зрения диагностической ценности определения антигена-маркера Н. pylori в реакции коагглютинации было сделано заключение, что наличие и количество выделяемого со слюной и калом антигена находится в корреляции с выраженностью инфекционного процесса. При отсутствии клинических симптомов заболевания антиген Н. pylori, как правило, не выявляется. Обнаружение его в низких титрах без клинических симптомов свидетельствует о факте инфицирования этим микроорганизмом. Высокие титры антигена (1:20 - 1:60 и выше), обусловленные, очевидно, размножением возбудителя в организме, сопровождающиеся клиническими проявлениями, характеризуют текущий инфекционный процесс. Снижение количества антигена при улучшении клиники свидетельствует об эффективности терапии Наконец, исчезновение антигена в биологических жидкостях при повторных исследованиях говорит о санации организма от возбудителя.

Нами были сконструированы диагностикумы для выявления антигенов различных возбудителей кишечных инфекций, в том числе Н. pylori, в высокочувствительном варианте РКА на планшетах. Показана принципиальная возможность и целесообразность использования их для мультианализа с целью этиологической и дифференциальной диагностики. Чувствительность РКА на планшетах на 1-3 порядка превышает таковую для РКА на стекле и достигает 10'5 -10"6 мг/мл по гомологичному ЛПС. Важно отметить, что метод РКА на планшете может быть использован для полуколичественного выявления О-антигенов возбудителей кишечных инфекций в биологических жидкостях больных.

Одной из основных задач наших исследований являлась разработка тест-системы для выявления в биологических жидкостях больных антигенов высокомолекулярных белков Н. pylori с помощью реакции коагглютинации на планшетах, поскольку известно, что протеины с молекулярной массой 120-140 кД являются высокоспецифическими антигенами-маркерами цитотоксинпродуцирующих штаммов Н. pylori [152, 157].

Мы предположили, что в чувствительном организме продукция патогенетически значимых антигенов может быть значительно более выраженной и полной. Важно при этом и их относительные количественные отношения, свойственные клинически выраженной инфекции Н. pylori.

Исходя из этих предпосылок, нами был использован оригинальный способ получения материала, содержащего комплекс высокомолекулярных белков Н. pylori.

В ранее проведенных исследованих было показано, что 9-ти дневные куриные эмбрионы являются чувствительной моделью для размножения и токсического действия Н pylori [16] Гомогенаты куриных эмбрионов, зараженных культурой Н pylori и погибших в результате развившейся инфекции и интоксикации, и были использованы для получения сывороток против патогенетически значимых высокомолекулярных белков, содержащихся, как показали наши исследования, в этих гомогенатах

На основе полученных к нему кроличьих антисывороток был сконструирован диагностикум для реакции коагглютинации на планшете с целью выявления в биологическом материале больных комплекса высокомолекулярных белков с молекулярной массой 90 кД и выше Полученный нами диагностикум обладал высокой чувствительностью (1 800 с ВМБ) и специфичностью Он реагировал только со слюной и калом 225 больных хроническим гастритом, ассоциированным с Н pylori, и не давал положительной реакции с пробами кала и слюны у 166 больных хроническим гастритом, не имевших маркера (О-антигена) Н pylori, а также с калом больных кишечными инфекциями шигеллезом (102 человека), сальмонеллезом (132 человека), иерсиниозом (135 человек), кампилобактериозом (45 человек), не инфицированных Н pylori.

Разработанный ВМБ-диагностикум был применен при систематических продолжительных (в течение 3-х лет) проспективных исследованиях у двух больных с хеликобактерным гастритом и язвенной болезнью 12-перстной кишки У первого больного было исследовано за этот период 200 проб слюны и 274 пробы кала Одновременно в пробах определяли О-антиген Н pylori в РКА на стекле, как показатель инфицирования Н pylori Установлено, что в период обострения заболевания у первого больного наблюдался подъем титров высокомолекулярных белков Н pylori, в период реконвалесценции уровень этих белков снижался и практически не выявлялся в период ремиссии

Второй больной, оперированный по поводу язвы желудка и страдающий периодическими обострениями неязвенного гастрита, был исследован на наличие О- и антигенов высокомолекулярных белков в пробах слюны (73) и копрофильтрата (42) Повышенный уровень высокомолекулярных белков Н pylori отмечался в период обострения и снижался в период ремиссии

Разработанный ВМБ-диагностикум был апробирован на 3-х больных язвенной болезнью 12-перстной кишки в период обострения до начала лечения, в течение всего курса лечения и в различные сроки после него Показано, что в период обострения до лечения у всех больных отмечался высокий уровень ВМБ-антигена в слюне и/или кале, который коррелировал с наличием О-антигена возбудителя. В период лечения при эффективной эрадикационной терапии уровень О- и ВМБ-антигенов снижался, при неэффективной терапии оставался на высоком уровне.

Реакция коагглютинации с ВМБ-диагностикумом позволяет выявлять подъем уровня патогенетически значимых антигенов в период обострения, верифицировать инфицированность Н. pylori, дает возможность уже в ранние сроки оценивать эффективность эрадикационной терапии.

Показана, таким образом, принципиальная возможность получения и использования разработанного нами диагностикума для выявления высокомолекулярных белков Н. pylori в биологическом материале больных, инфицированным этим микроорганизмом.

Дальнейшие расширенные исследования с использованием этого диагностикума в качестве неинвазивного метода выявления высокомолекулярных белков, являющихся специфическими маркерами цитотоксинпродуцирующих штаммов Н. pylori, позволит получить новые фактические данные о роли их в патогенезе, иммунитете и терапии заболеваний, ассоциированным с этим возбудителем.

В заключение можно сказать, что применение диагностикумов для выявления О-антигенов и высокомолекулярных белков, являющихся маркерами цитотоксинпродуцирующих штаммов Н. pylori, непосредственно в биологическом материале от больных в РКА открывает широкие возможности для скрининга лиц, инфицированных Н. pylori, мониторирования в ходе заболевания, обострения и в период ремиссии, для ранней диагностики с целью своевременного назначения этиотропной терапии, объективной оценки тяжести течения и исхода заболевания, оценки полноты санации, определения бессимптомного бактерионосительства, оценки и эффективности антибактериальной терапии, наконец, выявления микст-инфекций.

Обладая специфичностью и высокой чувствительностью, не уступающей (при постановке на стекле) чувствительности других иммунологических методов (например, ИФА) или значительно превосходящей ее (в модификации на планшете на 1-3 порядка), РКА вместе с тем имеет ряд преимуществ - это простота постановки и учета, доступность для малооснащенных лабораторий, быстрота получения ответа. Она может найти широкое применение в различных областях научных и прикладных исследований хеликобактериоза.

Многие важные вопросы проблемы хеликобактериоза остаются нерешенными. До настоящего времени нет единого мнения, является ли Н. pylori абсолютным патогеном или комменсалом.

Среди важнейших научных проблем инфектологии хеликобактериоза: изучение патогенности возбудителя этой социально обусловленной инфекции, создание и внедрение в практику новых методов идентификации патогенов во внешней среде, исследование роли инфекционных агентов в этиологии и патогенезе соматических болезней, изучение закономерностей их распространения и разработка методов профилактики, предлагаемые в настоящее время методы антигенодиагностики заболеваний, ассоциированных с Н. pylori, реакцией коагглютинации, могут занять достойное место.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Вахрамеева, Мария Сергеевна, Москва

1. Аббасова С Г, Кушлинский Н Е, Степанова Ю М, Костанян И А Растворимый Fas-антиген в сыворотке крови больных хроническим гастритом и раком желудка//Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт -1999 -т IX №5-С 24-26

2. Аруин Л И Апоптоз в механизме поражений желудка М Триада-Х, 1999 - С 54-62

3. Аруин Л И, Григорьев П Я , Исаков В А, Яковенко Э П Хронический гастрит Амстердам 1993 - т IX № 4 - С 362

4. Аруин Л И Заживление гастродуоденальных язв и Helicobacter pylori Материалы XIII международной сессии «Helicobacter pylori сегодня» М , 1999 - С 18-23

5. Аруин Л И Helicobacter pylori в этиологии и патогенезе язвенной болезни Мат 7-ой сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori Н -Новгород ,1998 С 48-55

6. Аруин Л И Рак желудка // Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт1999 т IX № 1 -С 72-78

7. Баженов Л Г, Бондаренко В М, Лыкова Е А, Огай Д К Изучение антагонистического действия лактобацилл на Helicobacter pylori // Ж микробиол -1997 -№3 С 83-91

8. Барановский А Ю , Гооз И , Симаненков В И , и др Уточнение механизмов формирования неблагоприятного течения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, асоциированной с геликобактериозом//Рос гастроэнтерол журн -1997 №2 -С 16-26

9. Баранская Е К История открытия Helicobacter pylori // Рос журн Гастроэнтерол , гепатол , колопрокт 1999 - т IX № 4 - С 61-78

10. Баранская Е К , Ивашкин В Т Клинический спектр предраковой патологии желудка //Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт -2002 т XII № 3 - С 7-14

11. Белая Ю. А., Белая О. Ф. Получение дизентерийных и сальмонеллезных диагностикумов для реакции коагглютинации в лиофилизированном виде и разработка рапид-системы // Лаб. дело,- 1982. № 2. - С. 486-488.

12. Белая Ю. А., Белая О. Ф., Быстрова С. М. и др. Способ получения диагностикума для выявления термостабильного антигена Campylobacter в реакции коагглютинации // Патент № 2086984 от 10.08.1987. Бюлл. № 22.

13. Белая Ю. А., Белая О. Ф., Петрухин В. Г. Набор сальмонеллезных диагностикумов серогрупп В, Ci, С2, Д, Е для реакции коагглютинации. Наставление по применению. Департамент ветеринарии МСХ РФ. М., 2002. - 28 с.

14. Белая Ю. А., Белая О. Ф. Реакция коагглютинация. Сигнальный метод диагностики кишечных зооантропонозов, контроля продуктов питания, кормов, объектов окружающей среды. М.: ISB № 5-94385-001-5. - 2001. - 51с.

15. Белая Ю. А., Евдокимов В. В. Неинвазивный способ выявления Helicobacter pylori при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки // Патент № 2193203 от 18.04.2002. Бюлл. №32.

16. Белая Ю. А., Быстрова С. М., Белая О. Ф. и др. Комиссионные испытания сальмонеллезных диагностикумов для реакции коагглютинации // Ветеринария. 1996. - № 9. - С. 22-27.

17. Белая Ю. А., Белая О. Ф., Петрухин В. Г. Способ получения диагностикума для выявления антигенов Helicobacter pylori в реакции коагглютинации // Патент № 2186394 от 31.01.2001.

18. Белая Ю. А., Ценева Г. А., Быстрова С. М. и др. Способ получения диагностикумов псевдоткберкулезных для реакции коагглютинации // АС № 1540491. -М., 1989.

19. Белая О. Ф., Черкасов В. Л., Белая Ю. А. и др. Реакция коагглютинации при кишечных инфекционных заболеваниях // Методические рекомендации, утвержденные МЗ СССР.-28.11.1990. -№ 10-11/143.

20. Бондаренко В. М., Нижевич А. А., Мавзютов А. Р. и др. Гастродуоденальная патология, ассоциированная с Helicobacter pylori // Ж. микробиол. 1995. - № 2,- С. 110112.

21. Быстрова С. М. Диагностикумы для ускоренного выявления специфического антигена возбудителей кишечных инфекций методом коагглютинации: Автореферат дисс.канд.биол.наук. М., 1991. - 19 с.

22. Генодиагностика в современной медицине: Тез. докл. Третья всеросс. науч,-практ. конф. М., 2000. - С. 295-301.

23. Гинцбург A. JI. Современные направления в генодиагностике. Генодиагностика в современной медицине: Тез. докл. Третья всеросс. науч.-практ. конф. М., 2000. - С. 2.

24. Говорун В. М., Момыналиев К. Т., Смирнова О. В. с соавт. Современные подходы к молекулярной диагностике и типированию клинических изолятов Helicobacter pylori в России // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопрокт. 2002. -т. XII. № 3. - С. 57-65.

25. Грацианская А. Н., Татаринов П. А., Карпина Л. М., Сахнин В. И. Патогенез, диагностика и лечение Helicobacter pylori инфекции // Детская больница. 2001. - № 1-С.39-43.

26. Григорьев П. Я., Жуховицкий В. Г., Яковенко Э. П., Яковенко А. В. Методы диагностики пилорического хеликобактериоза и ассоциированных с ним болезней // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопрокт. 1998. - т. VIII. № 4. - С. 6-9.

27. Давыдова С. Н., Васюра А. А., Боброва В. И., Москаленко В. Ф. и др. Чувствительность клинических изоляторов Helicobacter pylori и ассоциированной микрофлоры к противомикробным и противоязвенным препаратам // Ж. микробиол. -1999. -№3. С. 81-82.

28. Домарадский И. В. Вопросы патогенности Helicobacter pylori: Материалы IX тематической сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. Саратов.: МНИИЭиМ им. Габричевского, 2000. - С. 45-53.

29. Домарадский И. В., Исаков В. A. Helicobacter pylori и его роль в патологии // Ж. микробиол. 2000. - № 4. - С. 113-117.

30. Дудик Т. В., Соловьева Н. А., Жуховицкий В. Г. с соавт. Методы выявления Helicobacter pylori // Рос. гастроэнтерол. журн. 2001. - № 2. - С. 77-89.

31. Евдокимов В. В., Белая Ю. А., Петрухова В. И. Реакция коагглютинации в диагностике и лечении язвенной болезни двенадцатиперстной кишки // Эспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2002. - № 1. - С. 4-5.

32. Ивашкин В Т Современная гастроэнтерология и предопухолевые заболевания пищеварительной системы // Рос журн гастроэнтерол, гепатол, колопрокт 2002 - т XII № 3 - С 4-7

33. Ивашкин В Т , Лапина Т Л Роль молекул адгезии в патогенезе инфекции Helicobacter pylori // Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт 1997 -т VII № 6 - С 32-37

34. Ивашкин В Т, Лапина Т Л Гастроэнтерология XXI века // Русский медицинский журнал -2000-т 8, №7(118) С 697-703

35. Ивашкин В Т , Мегро Ф , Лапина Т Л Helicobacter pylori революция в гастроэнтерологии М Триада-Х, 1999 255 с

36. Ивашкин В Т , Никитина Е И , Степанов Е В и др Основы лазерного 13С-уреазного дыхательного теста и практика клинического применения М Триада-Х, 1999 С 131-138

37. Ильченко А А Хеликобактериоз Проблемы диагностики Тез XXVI научн сессии М ЦНИИ гастроэнтерологии, 2000 - С 65-66

38. Ильченко А А Язвенная болезнь и Helicobacter pylori Проблемы диагностики и лечения // Рос гастроэнтерол журн 2000 - №3 - С 22-31

39. Исаков В А Скрининг рака желудка проблемы и перспективы // Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт 2002 - т XII №3 - С 27-3143а Исаков В А, Домарадский И В Хеликобактериоз // М Медпрактика -2003 -411 с

40. Исаков В А, Дурова О М, Кудрявцева Л В Количественная ИФА антигенов Helicobacter pylori в кале новый метод диагностики инфекции и контроля за эрадикацией Мат V Росс гастроэнтерол недели - М , 2000 - С 24-26

41. Исаков В А, Златкина А Р , Кудрявцева Л В , Терещенко С Г Быстрый серологический тест для определения Helicobacter pylori предварительные результаты для сравнения//Рос гастроэнтерол журн 1997 - №4 - С 63-64

42. Исаков В А, Судакова О В , Селиверстова Т Р с соавт Использование непрямого иммуноферментного анализа для определения эрадикации Helicobacter pylori при язвенной болезни // Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт 2000 -т X №2 - С 11-14

43. Капрельянц А С Покоящиеся формы бактерий возможный источник дремлющих инфекций Мат VII Росс национ конгресса «Человек и лекарство» - М , 2000 - С 13-21

44. Квина М Маастрихские рекомендации о лечении неязвенной диспепсии применимы ли они в странах с высокой частотой распространения инфекции Helicobacter pylori -М Триада-Х, 1999 С 202-211

45. Коган Е А Молекулярно-генетические основы канцерогенеза // Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт 2002 - т XII №3 - С 32-36

46. Кононов А В Местный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter pylori -М Триада-Х, 1999 С 29-46

47. Конорев М Р Антитела-ферменты при Helicobacter pylori-ассоциированной инфеции // Ж микробиол -2000 №1 -С 75-79

48. Корниенко Е А, Милейко В Е Гелик-тест неинвазивный метод диагностики хеликобактериоза // Рос журн гастроэнтерол , гепатол, колопрокт -1998 -т VIII №6 - С 34-38

49. Корсунский А А , Щербаков П JI, Исаков В А Хеликобактериоз и болезни органов пищеварения у детей -М Медпрактика-М, 2002 168 с

50. Кишкун А А Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции Helicobacter pylori // Лабораторная медицина 2000 - №3 - С 37-44

51. Лазаренко О Г, Баширова Д К, Хуснутдинова И В Дисбактериоз кишечника у больных с хеликобактерной инфекцией Мат науч -практич конфер «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» М , - 2000 - С 66-67

52. Лапина Т Л Основные принципы диагностики Helicobacter pylori М Триада-Х, 1999 - С 107-117

53. Логинов А С , Ильченко А А, Мукамолова Г В и др Сравнительная эффективность различных методов обнаружения Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью//Рос гастроэнтерол журн 1998 -№3 - С 3-11

54. Ломов С Ю Роль факторов патогенности в механизме хеликобактерных поражений желудка//Ж микробиол 1997 - №6 - С 108-111

55. Мартынов Е А Молекулярные механизмы апоптоза // Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт 1999 -т IX № 4 - С 75-83

56. Маянский А. М., Маянский Н. А., Абаджиди М. А., Заславская М. И. Апоптоз: начало будущего // Ж. микробиол. 1997. - № 2. - С. 88-94.

57. Мельникова В. А., Арзуманян Н. О. Helicobacter pylori при желудочно-кишечных заболеваниях и у здоровых лиц // Ж. микробиол. 2000. - №6. - С. 108-112.

58. Митрохина Т. В., Елагин JI В., Хлебников Е. П. и др. Роль факторов иммунитета и хеликобактериоз у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки до и после ваготомии // Рос. гастроэнтерол. журн. 1996. - №2. - С. 3-7

59. Морозов И. А. Цитологическая диагностика инфекции Helicobacter pylori в желудке // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопрокт. 2000. - т. X. № 2. - С. 7-10.

60. Пиманов С. И. Эзофагит, гастрит и язвенная болезнь. М.: Мед. книга, 2000.378 с.

61. Пиняева Е. Г., Салмова В. С., Синчихин К. П. Профилактика хеликобактерной инфекции в семье: Тез. Конгресс педиатров России. М., 1999. -С.369.

62. Покровский В. И., Поздеев О. К. Медицинская микробиология. М.: Гэотар-медицина, 1999. - С. 459-462.

63. Покровский В. И., Смагулов К. 3., Машилов В. П., и др. Состояние и перспективы совершенствования диагностики острых кишечных инфекций на догоспитальном этапе // Ж. микробиол. 1993. - № 1. - С. 88-92.

64. Поташов Л. В., Морозов В. П. Диагностика хеликобактерной инфекции у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки // Ж. микробиол. -1996. -№ 6. С. 11-13.

65. Рекомендации по диагностике Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью и методам их лечения // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктологии. 1999. - т. VIII. № 1. - С. 105-107.

66. Решетников О. В., Курилович С. A., Granberg С., Haiva V.-M. Распространенность хеликобактериоза в некоторых регионах Сибири по данным серологических исследований // Ж. микробиол. 2000. - № 3. - С. 32-34.

67. Роккас Ф. Инфекция Helicobacter pylori как фактор риска рака желудка: современные доказательства//Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопрокт. -2002. -т. XII. № 3. С. 66-70.

68. Рубцов М. А., Петров И. В., Рубцова Н. И., Перкин Э. М. Барьерная реакция покровного эпителия слизистой оболочки при дуоденальной язве и пилорическом хеликобактериозе //Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопрокт. 1998. - т. VII. № 6. - С. 38-41.

69. Секачева М. И. Роль бактериальных токсинов и инвазивных бактерий в патогенезе болезней желудочно-кишечного тракта // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопрокт. 2000. - т. X. № 5. - С. 16-21.

70. Ситкин С. И. Неизвестное об известном Helicobacter pylori // Гедеон Рихтер в СНГ. 2000. - № 3. - С. 41-43.

71. Смагина Н. В. Особенности иммунитета у больных с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori // Ж. микробиол. -2000. № 2. - С. 57-60.

72. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Современные представления об особенностях организации и функционировании иммунной системы желудочно-кишечного тракта // Рос. гастроэнтерол. журн. 1997. - № 2,- С. 3-15.

73. Харченко Н В К вопросу об этиологии, классификации и показаниям к эрадикации Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью // Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт -2001 №2 - С 15-21

74. Хомерини С Г, Хомерини Н М Helicobacter pylori участник окислительного стресса в слизистой оболочке желудка // Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт - 2000 - № 2 - С 91-93

75. Хуснутдинов Ш М Helicobacter pylori и рак желудка Мат VIII сессии Росс группы по изучению Helicobacter pylori -М, 1999 С 76-83

76. Черкашена Е А, Зорченко Н В , Юр В Г Клинико-иммунологическая оценка хеликобактериоза и ее прогностическое значение // Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт 1998 - т VIII № 5 - С 125-127

77. Шевченко Ю JI, Онищенко Г Г Микроорганизмы и человек Некоторые их взаимососуществования на современном этапе // Ж микробиол -2001 № 2 - С 94-104

78. Щербаков П Л Эпидемиология инфекции Helicobacter pylori // Рос журн гастроэнтерол , гепатол , колопрокт 1999 - т IX № 2 - С 8-11

79. Allaker LP et al Prevalence of Helicobacter pylori at oral and gastrointestinal sites in children evidence for possible oral-to-oral transmission // J Med Microbiol 2002 -Vol 51 (4) -P 312-317

80. Aim R A , Lind L , Moir D T Genomic-sequence comparison of two unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori // Nature 1999 - Vol 397 (6715) -P 176-180

81. Andersen L , Norgaard A, Bennedren M Клеточный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter pylori -М Триада-X, 1999 С 46-54

82. Andersen L Р , Espersen F , Souckows А, Sedlackowa М et al Isolation and preliminary evaluation of a low-molecular-mass antigen preparation for improved detection of

83. Helicobacter pylori immunoglobulin G antibodies // Clin and diagnostic laboratory Imm -1995.-N3 -P 156-159

84. Appelmelk В J , Simoons I, Negrini R et al Potential role of molecular mimicry between Helicobacter pylori lipopolysaccharide and wost blood group antigens in autoimmunity // Inf and Imm 1996 -N10 - P 2031-2040

85. Appelmelk J В, Martin L S, Monteiro M A et al Phase variation in Helicobacter pylori lipopolysaccharide due to changes in the lengths of poly (C) tracts in a3-fucosyltransferase genes//Inf and Imm 1999 - P 5361-5366

86. Blazer M J et al Helicobacter pylori strains are created equal should all be aliminaited//Lancet 1997 - Vol 349 -P 1020-1022

87. Blazer M J Intrastrain differences in Helicobacter pylori- a keg question in mucosal damage? // Annals of Medicine 1995 - Vol 27 -P 559-563

88. Censini S , Lanle С , Xiang Z et al Cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes tyre I-specific and disease-associated virulence factors // Proc Natl Acad Sci 1996 - Vol 93 - P 14648-14653

89. Crepin В, Valverde V Presentation of PLATELIA Helicobacter pylori // Laborama Nechical Review 1999 -N6 -P 9

90. Czajkowsky DM, Iwamoto H, Cover TL The vacuolating toxin from Helicobacter pylori forms hexameric pores in lipid bilayers at low pH // Proc Natl Acad Sci -1999.-Vol 96 -P 2001-2006

91. Datta et al Estimation of vacuolating cytotoxin secreted by different strains of Helicobacter pylori using bead enzyme-linked immunosorbent assay and its correlation with bacterial genotype//Indian J Med Res -2001 Vol 114 -P 192-198

92. Doig P, Fox YG Characterisation of proteins in the other membrane preparetion of a murine pathogen, Helicobacter bilis // Inf and Imm 2001 - Vol 69(5) -P. 3502-3506

93. Dore M P , Realdi G, Mura D et al Helicobacter infection in patients with HCV-related chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma // Dig Dis Sci 2002 -Vol 47(7) -P 1638-1643

94. Fallone С. A. A review of the possible determinants of clinical outcome in Helicobacter pylori infection // Can. J. Microbiol. 1998. - Vol. 44 (3). - P. 201-210.

95. Fauchere J. L. Bacteriological characterictics and diagnosis of Helicobacter pylori // Laborama Nechical Review. 1999. - N 6. - P. 4-8.

96. Fagoonee S., Pellicano R., Rizzetto M. et al. The journy from hepatitis to hepatocellular carcinoma. Bridgin role of Helicobacter species // Ranminevra Med. 2001. -Vol. - 43 (4). - P. 279-282.

97. Fox J. G., Chien С. C., Dewhirst F. E. Helicobacter canadensis sp.nov. isolated from humans with diarrhea as an example of an emerging pathogen // J. of Clin. Microb. -2000.-N38. P. 2546-2549.

98. Geis G., Leying H., Suerbaum S. And Opferkuch W. Unusual fatty acid substitution in lipid and lipopolysaccharides of Helicobacter pylori // J. of Clin. Microb. -1990. -N 5. P. 930-932.

99. GrefF. M. Ятрогенный путь передачи инфекции Helicobacter pylori и стерилизация эндоскопического оборудования. М.: Триада-Х,1999. С. 21-28.

100. Grimley С. Е. Helicobacter pylori-associeted antibodies in patients with duodenal ulcer, gastric and oesophageal adenocarcenoma and normal mucosa // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 1999. - Vol. 11 (5). - P. 503-509.

101. Harris R. A., Owens D. K., Witherell H. et al. Helicobacter pylori and gastric cancer: what are the benefits of screening only for the CagA phenotype of Helicobacter pylori?//Helicobacter. 1999. - Vol. 4, N2. - P. 69-76.

102. Hausson L. E. Risk of stomach cancer in patient with peptic ulcer desease // J. Surg. -2000. Vol. 24. - P. 315-320.

103. Heneghan M. A., McCarthy C. F., Moran A. P. Relationship of blood group determinants on Helicobacter pylori lipopolysaccharide with host lewis phenotyre and inflammatory response // Inf. and Imm. 2000. - N 2. - P. 937-941.

104. Hirschi A. M. Helicobacter pylori: virulence factors, resistance and diagnosis // Wien. Med. Wochenschr. 2002. - Vol. 152 (5-6). - P. 123-127.

105. Iamaoka Y., Kodama Т., Gutierrer O. et al. Relationship between Helicobacter pylori ice A, cag A and vac A status and clinical outcome: studies in four different countries // J. of Clin. Microb. 1999. - N 7. - P. 2274-2279.

106. Kaji T et al Adherense of Helicobacter pylori to gastric epithelial cells and mucosal inflammation//J Lab Clin Med -2002 Vol 139, N4 -P 244-250

107. Khanna B, Cutler A, Israel NR Use caution with serological testing for Helicobacter pylori infection in children // J of Inf Desease 1998 - N 178 - P 460-465

108. Kornilovs'ka I, Nilsson I, Wadstrom T Immunogenic proteins of Helicobacter pullorum, Helicobacter bilis, Helicobacter hepaticus identified by two-dimensional gel electrophoresis and immunobloting // Proteomics 2002 - Vol 2(6) - P 775-783

109. Kornin J D Managment of Helicobacter pylori associated gastriontestinal disease//Laborama Nechical Review - 1999 -N6 - P 10-14

110. Laheij R J , Witteman E M , Bloembergen P et al Short-term follow-up by serology of patient gwen antibiotic treatment for Helicobacter pylori infection // Inf And Imm.- 1995 -N 1 -P 94-98

111. Laheij R J , Straatman H Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits a review// J of Clin Microb 1998 -N10 - P 2803-2809

112. Makristathis A, Pasching E, Schutrek, Wimmer M et al Detection of Helicobacter pylori in stool specimens by PCR and antigen enzyme immunoassay // J of Clin Microb 1998 - Vol 36, N 9 - P 2772-2774

113. Marshall В Helicobacter pylori 20 years on // Clin Med 2002 - Vol 2 (2) -P 147-152

114. Meyer F., Wilson K.T., James S.P. Modulation of cytokine responses by products of Helicobacter pylori // Inf. and Imm. 2000. - Vol. 68. - P. 6265-6272.

115. Mitchell H.M., Hazell S.L., Kolesnikow T. et al. Antigen recognition during progression from acute to chronic infection with a cag A positive strain of Helicobacter pylori // Inf. and Imm. - 1996. - N 4. - P. 1166-1172.

116. Miyaji H., Azuma Т., Ito S. et. al. Helicobacter pylori infection occurs via close contact with infected individuals in early childhood // J. Gastroenterol. Hepatol. 2000. -Vol. 15. - P. 257-262.

117. Moran A. P. The role of lipopolysaccharide in Helicobacter pylori pathogenesis // Aliment. Pharmacol. Ther. 1996. - N 10. - P. 39-50.

118. Moran A. P., Lindner В., Walsh E. J. Structural characherization of the lipid A component of Helicobacter pylori rough and smooth form lipopolysaccharides // J. Bacteriol. 1997. - N 10. - P. 6453-6463.

119. Nilsson I., Lindgren S., Ericson S., Wadstrom T. Serum antibodies to Helicobacter hepaticus and Helicobacter pylori in patients with chronic liver desease // Gut. -2000. Vol. 46(3). - P. 410-413.

120. Nilsson I., Ljungh A., Aleljung P., Wadstrom T. Immunoblot assay for serodiagnosis of Helicobacter pylori infections // J. of Clin. Microb. 1997. - N 2 . - P. 427432.

121. Pagliaccia C., Bernard M. et al. The m2 form of the Helicobacter pylori cytotoxin has cell tyre-specific vacuolating activity // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - Vol. 95. -P. 10212-10217.

122. Pajares Garcia J. M. Уреазный дыхательный тест с мочевиной, меченной 13С. Испанский опыт. М.: Триада-Х, 1999. - С. 122-130.

123. Palli D. et al. Helicobacter pylori infection, anti-cag A antibodies and peptic uicer: a case-control study in Italy // Aliment. Pharmacol. Ther. 2002. - Vol. 16 (5). - P. 1015-1020.

124. Parkin D M. Global cancer statistics in the year 2000 // Lancet oncol. 2001. -Vol. 2. - P. 533-543.

125. Peitz U Malfertheiner P Helicobacter pylori infection // Karger Gazette -1999 N 63 - P 2-4

126. Periz Periz G I, Hopkins J A, Blaser J M Lipopolysaccharide structures in Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, and Vibrio Cholerae are immunologically related to Campylobacter//Inf and Imm - 1986 -N 1 - P 204-208

127. Portnoi L M , Kasantseva I A, Isakov V A Gastric cancer screening in selected population of Moscow region retrospective evaluation // Europ Radiol 1999 -Vol 9, N4 - P 701-705

128. Sakagami T , Vella J , Dixon M F et al The endotoxin of Helicobacter pylori is a modulator of host-dependent gastritis // Inf and Imm 1997 - N 8 - Aug, P 33103316

129. Salama S M , Wefiian J N , Shiro-Koulla S , Mbakop A Value of whole-cell antigen extracts for serological detection of Helicobacter pylori // J of Clin Microb 1993 -N 12 -P 3331-3332

130. Shahamat M , Paszko-Kolva G, Mai U E H Selected cryopreservatives for long term storage of Helicobacter pylori at low temperatures//J Clin Pathol 1992 -N45 - P 735-736

131. She F F Virulence and potential pathogenicity of coccoid Helicobacter pylori induced by antibiotics//World J Gastroenterol -2001 Vol 7(2) -P 254-258

132. Shimoyama T , Tominaga Y, Sakagami T , Fukuda Y Epidemiological study for infection with Helicobacter pylori in Japan compared with that USA, Europe and Asian Pacibicaren//Nippon Rinsho 1999 - Vol 57(1) -P 11-16

133. Singh R К Prospective analysis of the association of infection with Cag A bearing strains of Helicobacter pylori and coronary heart disease // Heart 2002 - Vol 88 (1) -P 43-46

134. Talley J N, Newell G D , Ormand E J Serodiagnosis of Helicobacter pylori comparison of enzyme-linked immunosorbent assay // J of Clin Microb -1991 -N8 P 1635-1639

135. Telford J L , Ghiara P , Dell'Orco M et al Gene structure of the Helicobacter pylori cytotoxin and evidence of its key role in gastric disease // J Exp Med 1994 - Vol 179 -P 1653-1658

136. Wadstrom T , Hirmo S , Pantzar M et al Helicobacter pylori adaptation and interaction with the host // Microbial Ecology in Health and Disease 1998 - Vol 10, N 2 -P 118

137. Westblom T U, Madan E, Gudipati S, Midkiff В R Diagnosis of Helicobacter pylori infection in adult and pediatric patients by using pyloriset, a rapid latex agglietination test // J of Clin Microbiology 1992 -N1 -P 96-98

138. Whiting J L , Hallisey M T , Fielding J M et al Screening for gastric cancer by Helicobacter pylori serology a retrospective study // Brit J Surg 1998 - Vol 85, N 3 -P 408-411

139. Yamaoka Y, Kodama T, Gutierres O, Kim JG Relatioship between Helicobacter pylori ice A, cag A, and Vac A status and clinical outcome studies in four different countries//J of Clin Micropb 1999 -N7 -P 2274-2279

140. Yang G Relation between infection of Cag A-positive Helicobacter pylori and upper gastrointestinal diseases // Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2001 - Vol 81 (11) - P 648650

141. Yokota S -I, Amanj К -I, Hayashi S , Fujii N Low antigenicity of the polysaccharide region of Helicobacter pylori lipopolysaccharides derived from tumors of patients with gastric cancer//Inf and Imm 1997 -N9 -P 3509-3512

142. Yokota S -I, Amano К -I, Shibata Y et al Two distinct antigenis types of the polisaccharide chains of Helicobacter pylori lipopolysaccharides characterized by reactivity with sera from human with natural infection // Inf and Imm 2000 - N1 -P 151-159

143. Сергиенко В И, Бондарева И Б Математическая статистика в клинических исследованиях -М Росмэн, 2001 -225 с

Информация о работе

Вахрамеева, Мария Сергеевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Анализ антигенной структуры Helicobacter pylori и разработка тест-системы для неинвазивной диагностики хеликобактериоза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Анализ антигенной структуры Helicobacter pylori и разработка тест-системы для неинвазивной диагностики хеликобактериоза - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы