Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аккумуляция полиаминов и выделение этилена у растений Mesembryanthemum crystallinum L. при гипертермии и засолении

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дам Бать Зыонг, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ДАМ БАТЬ ЗЫОНГ

АККУМУЛЯЦИЯ ПОЛИАМИНОВ И ВЫДЕЛЕНИЕ ЭТИЛЕНА У РАСТЕНИЙ MESEMBR YANTHEMUM CR YSTALLINUM L. ПРИ ГИПЕРТЕРМИИ И ЗАСОЛЕНИИ.

Специальность 03.00.12. - «физиология растений»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ — докт. биол. наук,

Н.И. Шевякова, — канд. биол.наук, В.Ю. Ракитин.

Москва— 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................ 5

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР...................................................................................9

1.1 Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам среды..........................................................9

1.2 Биологическая роль полиаминов....................................................14

1.3 Роль полиаминов в адаптации растений к стрессам . 20

1.4 Химические свойства полиаминов..............................................27

1.5 Биосинтез и катаболизм полиаминов................................................29

1.6 Регуляция активности ферментов биосинтеза полиаминов в норме и при стрессе..........................................................32

1.7 Гены биосинтеза полиаминов............................................................................37

1.8 Полиамины и этилен.....................................................................39

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................43

2.1 Объект исследования..................................................................................43

2.2 Условия выращивания хрустальной травки в почвенной культуре........................................................................................................................44

2.3 Условия выращивания хрустальной травки в водной культуре..............................................................................................................46

2.4 Условия проведения опытов..................................................................50

2.5 Определение содержания свободных полиаминов ... 52

2.6 Определение интенсивности выделения этилена............54

2.7 Определение свободных аминокислот........................................55

2.8 Определение содержания ионов в тканях растений и почвенном субстрате........................................................................................................57

2.9 Определение содержания свободного пролина....................58

2.10 Определение активности ФЕП-карбоксилазы........................59

2.11 Математическая обработка данных........................................................59

ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..........................................................61

3.1 Содержание полиаминов в различных органах растений

хрустальной травки............................................................^

3.2 Влияние теплового шока на содержание полиаминов и

выделение этилена у хрустальной травки......................................^

3.2.1 Действие ТШ (47°С, 2 часа) на надземную часть хрустальной травки....................................................................................^

3.2.1.1 Содержание свободных аминокислот....................................69

3.2.1.2 Содержание полиаминов и выделение этилена..................74

3.2.2 Действие ТШ (40°С, 2 часа) на корневую систему хрустальной травки....................................................................................79

3.3 Содержание аминокислот, полиаминов и выделение этилена у хрустальной травки при действии №С1 .... 86

3.3.1 Содержание свободных аминокислот....................................88

3.3.2 Содержание полиаминов и выделение этилена..................92

3.4 Последовательное действие ТШ и засоления на аккумуляцию полиаминов и выделения этилена в 100 онтогенезе листа хрустальной травки...................

ГЛАВА 4 ЗАКЛЮЧЕНИЯ И ВЫВОДЫ............................................................................105

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................110

Список сократительных слов.

АБК - Абсцизовая кислота АДК - Аргинин декарбоксилаза

АЦК - 1-аминоциклопропан-1-карбоксиловая кислота

АЦС - 1 -аминоциклопропансинтаза

АЦО - 1-аминоциклопропаноксидаза

ДАП - Диаминопропан

ДО - Диаминоксидаза

Кад — Кадаверин

ФЕПКаза - Фосфоэнольпируваткарбоксилаза

ВЭЖХ - Высокоэффективная жидкостная хроматография

ЛДК - Лизин декарбоксилаза

ОДК - Орнитин декарбоксилаза

ПА - Полиамины

ПАПТ - путресцин аминопропилтрансфераза

ПО - Полиаминоксидаза

Пут — Путресцина

СДС - Спермидинсинтаза

СНС - Сперминсинтаза

Спд — Спермидин

Спм — Спермин

ЦДК - Цитруллин декарбоксилаза

САМ- Crassulanceae Acid Metabolism

SAM - S-аденозилметионин

БАМДК - S-аденозилметионин декарбоксилаза

DFMA - Difluormethinearginine

DFMO - Difluormethineornithine

ПЛФ - Пиридоксан фосфат

ВВЕДЕНИЕ

Полиамины путресцинового ряда: путресцин, спермидин и спермин найдены у многих видов растений. Кадаверин находят в основном у представителей бобовых. Полиамины присутствуют во всех компартментах и органеллах растительной клетки, включая ядро, митохондрии и пластиды, что свидетельствует о причастности этих биологически активных соединений к фундаментальным процессам, определяющим жизнедеятельность растений (Waiden et al., 1997).

Большой интерес вызывает участие полиаминов в стресс-реакциях и адаптации растений к экстремальным условиям среды. Недавно показана положительная роль повышенного содержания полиаминов в развитии стресс-устойчивости трансгенных клеток моркови (Minocha, 1998).

Полиамины в растениях, подвергнутых воздействию экстремальных факторов (солевой и осмотический стресс, гипертермия, засуха и др.), могут выполнять не только защитную функцию, но и выступать в качестве регуляторов физиологических процессов. Обнаружение рецепторных и транспортных белков, высоко специфичных для полиаминов, позволяет предположить их участие в сигнальных системах растительной клетки (Tassoni et al., 1996, 1998).

Согласно исследованиям Галстона (Galston, Kaur Sawhney, 1995), у растений в условиях стресса в регуляцию биосинтеза полиаминов может активно вмешиваться "стрессорный" этилен. Для биосинтеза этилена и полиаминов путресцинового ряда используется общий предшественник S-аденозилметионин (SAM), что может явиться одной из причин их конкурентных отношении. С другой стороны, у растении в экстремальных условиях отношения между этиленом и полиаминами могут развиваться на основе их регуляторного взаимовлияния на протекание последовательных звеньев их биосинтеза (Altman, 1989; Tiburcio et al., 1993). Таким образом,

этилен и полиамины могут составить в растениях своеобразный регуляторный блок, в основе которого лежит взаимодействие этих биологически активных соединений. Функционирование данного регуляторного блока может иметь прямое отношение к процессам адаптации растений в экстремальных условиях (Galston, Kaur Sawhney, 1995; Waiden et al., 1997).

Несмотря на интенсивные исследования биологической роли полиаминов в адаптации растений к экстремальным условиям, практически отсутствует характеристика качественного состава и количественного содержания полиаминов и их взаимосвязи с этиленом у представителей галофитов, в том числе у Mesembryanthemum crystallinum L. (хрустальная травка). Благодаря стресс-индуцированному переключению Сз - типа фотосинтеза на САМ - одной из эффективных водосберегающих стратегий адаптации (Winter et al., 1978; Bohnert et al., 1988, 1994), хрустальная травка является удобной моделью для исследования адаптационных механизмов. Актуальным вопросом является участие полиаминов и этилена в адаптации хрустальной травки к засолению и сопутствующим экстремальным факторам, в частности к гипертермии.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы является исследование участия полиаминов и этилена, а также их взаимодействия в адаптации растений хрустальной травки к высокой температуре, засолению и их последовательному действию.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определить качественный состав и количественное содержание свободных полиаминов в различных органах хрустальной травки.

2. Установить характер изменений в содержании полиаминов и выделении этилена при тепловом шоке (ТШ), засолении NaCl и их последовательном действии.

3. Исследовать влияние экзогенного и эндогенного этилена на содержание полиаминов.

4. Исследовать передвижение полиаминов по растению, в том числе при локальном действии ТШ на надземную часть или корни, и исходя из этого, выяснить возможное участие полиаминов в передаче стрессорного сигнала.

Научная новизна. Впервые проведена оценка качественного состава и количественного содержания полиаминов в различных органах растений хрустальной травки. При этом было выявлено доминирование содержания спермидина над путресцином, присутствие редко встречающегося у растений кадаверина, повышенное содержание всех полиаминов в корнях. Было показано ингибирующее действие этилена на аккумуляцию спермидина. Впервые установлена активация накопления кадаверина в молодых листьях при обработке растений экзогенным этиленом и его транзитная аккумуляция сразу после действия на растения ТШ (47°С, 2 ч), следующая за интенсивным выделением этилена листьями. Обнаружена способность кадаверина к дальнему транспорту из подвергнутых ТШ органов (листьев или корней) в другие части растения. Впервые показано, что переходу растений на САМ в условиях засоления (критерий - индукция ФЕПКазы) предшествует транзитная аккумуляция в листьях путресцина и спермидина и снижение выделения этилена. Впервые установлена аккумуляция спермина в листьях в условиях долговременного засоления.

Практическая значимость. Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов университетов и вузов страны.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международном симпозиуме «Stress and Inorganic Nitrogen Assimilation and the 2— Fohs- Biostress Symposium» (Москва, 1996), на международном симпозиуме по стрессу (Польша, 1997), на «5~ International Symposium

Inorganic Nitrogen Assimilation and the 3~ Fohs-Biostress Symposium». (Portugal, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 и сдана в печать 1 работа.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, включает 3 таблиц, 38 рисунков; библиография содержит 208 названий, в т. ч. 171 на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным

факторам среды

Растения в процессе роста и развития часто испытывают воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды, таких как высокая или низкая температура, засуха, заселённость почвы, избыточное увлажнение, недостаток кислорода и др. На воздействие стрессоров различной природы растения отвечают изменением проницаемости и заряда клеточных мембран, баланса ионов, изменением метаболизма (Тома, 1984; Александров, 1985; Полевой, 1989; Карнаухова, 1993; Косулина и др., 1993). В зависимости от интенсивности и природы действующего отрицательного фактора, биологических особенностей самого растения ответная реакция на стрессор может привести к внезапному повреждению и гибели организма или она будет индуцировать способность адаптироваться к неблагоприятным условиям произрастания.

Решающим фактором при выборе стратегии адаптации является время, предоставляемое организму для ответа на изменяющиеся условия существования. В зависимости от этого фактора различают три главных типа адаптаций (Кузнецов, 1992):

1. Генетические или эволюционные адаптации. Они формируются в ходе эволюционного процесса, связаны с изменениями наследственного материала и являются наиболее оптимальными для выживания в экстремальных условиях обитания.

2. Адаптации, формирующиеся в ходе онтогенетического развития, осуществляются на фенотипическом уровне, не передаются по наследству и обусловлены изменениями в дифференцированной

экспрессии генома.

3. Адаптации, обеспечивающие кратковременное выживание организма в условиях внезапного действия повреждающих факторов высокой интенсивности. В основе подобных адаптивных реакций лежит функционирование систем шокового ответа таких, как например, белки теплового шока.

Механизмы устойчивости, формирующиеся в результате первого типа адаптаций, функционируют как конститутивные системы, тогда как механизмы устойчивости, являющиеся конечным результатом реализации двух последних адаптивных стратегий, функционируют как индуцибельные. При этом, помимо клеточных механизмов устойчивости, на обоих этапах адаптационного процесса у растений функционируют также системы устойчивости организменного уровня регуляции (Кузнецов и др., 1990; Керимов и др., 1993; Шевякова и др., 1998).

Таким образом, ответ организма на действие экстремальных факторов реализуется в виде двух последовательных стадий — стрессорной реакции и специализированной адаптации (Селье, 1976; Кузнецов, 1992). Если первичная (стрессорная) реакция направлена на предотвращение интенсивного повреждения клеток, то специализированная адаптация обеспечивает жизнедеятельность организма на фоне постоянного действия экстремального фактора. В основе долговременной адаптации лежит новообразование отсутствовавших ранее макромолекул и формирование механизмов специализированной устойчивости (Кузнецов и др., 1990).

Ответная реакция растений на неблагоприятные воздействия протекает с высокой скоростью и характеризуется аккумуляцией стресс-гормонов (АБК, этилен), которые контролируют адаптацию к абиотическим стрессам, включая модификацию экспрессии большого числа генов на транскрипционном уровне (Merlot and Girandat., 1997; Voesenek et al., 1997). В стрессорных условиях, как правило, "блокируются" основные пути

метаболизма и физиологические процессы (рост) с тем, чтобы использовать освобождающуюся энергию, восстановительные эквиваленты и субстраты для стресс-индуцированного биосинтеза соединений с защитной и адаптивной функцией: осмопротекторы, стресс-белки и др...(Кузнецов., Рощупкин., 1994; Yeo, 1998).

Ключевым моментом ответной реакции на стрессор является эффективность мобилизации адаптивных систем, направленных на выживание растений.

В последнее время большое внимание уделяется исследованию молекулярных механизмов быстрой и строго направленной передачи стрессорного сигнала с помощью так называемой сигнальной системы, функционирование которой происходит в несколько этапов: рецепция первичного внешнего сигнала, его трансформация во внутриклеточный стимул и последовательная передача его к эффекторным системам клеток, тканей, органов (Hong et al., 1997).

Пусковые механизмы адаптации у живых организмов активно разрабатываются на различных модельных системах: животных, бактериях, дрожжах и растениях. Становится все более очевидным, что у растений подобно другим организмам, при действии стрессорных сигналов различной природы важнейшим компонентом сигнальной системы являются гормональные факторы.

Для растительного организма к таким гормональным факторам относят АБК и этилен. Оба биологически активных соединения контролируют важнейшие физиологические процессы: прорастание семян, рост и развитие растений, образование семян и период покоя.

Начиная с 60-х годов внимание исследователей было привлечено к тому, что АБК и этилен принимают участие также в адаптации растений к абиотическим стрессам: засухе, засолению и др. (Zeevart and Creelman, 1988; Girandat et al., 1994). Было обнаружено, что действие эндогенной АБК как в

вегетативных тканях, так и в репродуктивных органах (семена) включает модификацию экспрессии многих существенных ддя адаптации генов на транскрипционном уровне (Merlot and Girandat., 1997).

В настоящее время изолированы многочисленные растительные гены, экспрессия которых индуцировалась АБК и различными стрессами (осмотическим, низкотемпературным и др). Для понимания молекулярных механизмов передачи стрессорного сигнала по растению важно, что кодируемые этими генами белки и полипептиды (протеинкиназы, фосфатазы, RAB-17 и др,) функционируют как мембран-связанные рецепторы и цитоплазматические переносчики в сигнальной системе растений (Hong et al., 1997).

Тем не менее, знание о молекулярных механизмах, которые функционируют в сигнальных системах у растений при стрессах еще недостаточны, хотя адаптивный физиологический и молекулярный ответ на главный абиотический стресс - изменение в осмотическом потенциале, давно и интенсивно изучаются (Skriver and Mundy, 1990; Trewavas and Jones, 1991; Bray, 1994 и др).

Все более становится очевидным, что в сигнальную систему включается процесс фосфорилирования белков. Некоторые полипептиды, индуцируемые АБК и осмотическим стрессом, такие как RAB-17 у кукурузы (Plana et al., 1991), дегидрин у томатов (Godoy et al., 1994) аккумулируются в фосфорилированной форме. Идентифированы специфические протеинкиназы, которые катализируют фосфорилирование этих белков (Hong et al., 1997). В свою очередь некоторые протеинкиназы, функционирующие как рецепторы стрессорных сигналов, кодируются кальций-зависимыми генами (Hwang, Goodman, 1995; Mizoguchi et al., 1996).

В настоящее время кальций-зависимые протеинкиназы рассматриваются как один из новых классов сигнальных систем у растений (Weiljie, Aalim, 1997). У некоторых растений (факультативный галофит

Me