Участие пролина в регуляции уровня полиаминов и функционирования антиоксидантных ферментов у растений Salvia officinalis L. при действии УФ-В облучения

Шашукова, Антонина Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие пролина в регуляции уровня полиаминов и функционирования антиоксидантных ферментов у растений Salvia officinalis L. при действии УФ-В облучения
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие пролина в регуляции уровня полиаминов и функционирования антиоксидантных ферментов у растений Salvia officinalis L. при действии УФ-В облучения"

□D3488131

На правах рукописи

JUMf^

ШАШУКОВА Антонина Васильевна

УЧАСТИЕ ПРОЛИНА В РЕГУЛЯЦИИ УРОВНЯ ПОЛИАМИНОВ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ У РАСТЕНИЙ SALVIA OFFICINALIS L. ПРИ ДЕЙСТВИИ УФ-В ОБЛУЧЕНИЯ

03.00.12. - Физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009

Москва-2009

003488131

Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Радюкина Наталия Львовна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кондратьев Михаил Николаевич

доктор биологических наук, профессор Хрянин Виктор Николаевич

Ведущая организация: Главный богапический сад им. Н.В. Цицина РАН

Защита диссертации состоится «22» декабря 2009 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (495) 977-80-18, e-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Автореферат разослан « f3 » ноября 2009 г.

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Действие абиотических стрессоров вызывает снижение продуктивности культурных и уменьшите биоразпообразия дикорастущих растении. Исследование клеточных и молекулярных механизмов, позволяющих растениям адаптироваться к действию неблагоприятных факторов внешней среды, является одной из фундаментальных проблем биологии в целом и физиологии растений в частности. Формирование адаптационного ответа растительного организма на действие абиотических стрессоров происходит в результате множественных метаболических изменений (Bouchereau et al., 1999; Zhu, 2001; Kavi Kishor et al., 2005; Kuznetsov, Shevyakova, 1999; 2007). Учитывая многообразие и сложность метаболических путей, ответственных за адаптацию растений, следует ожидать, что их регуляция является координированной. Для изучения такого типа регуляции особый интерес могут представлять пути метаболизма низкомолекулярных антиоксидантов - пролина и полиаминоп.

В норме гомеостаз пролина и полиаминов у растений поддерживается сбалансированной системой их биосинтеза и деградации. Чаще всего, общим предшественником в их биосинтезе является глутамат. Глутамат превращается в пролин в результате протекания двух последовательных реакций, ключевым ферментом которых является Д'-пирролин-5-карбоксилатсинтетаза. В биосинтезе полиамшов глутамат служит более отдаленным предшественником, превращающимся сначала в орнитин или аргинин. Образовавшиеся аминокислоты являются прямыми субстратами двух ферментов (оршггиндекарбоксилазы или аршшшдекарбоксилазы), катализирующих биосинтез путресцина (Пут) -родоначальника высокомолекулярных полиаминов (спермвдина (Спд) и спермина (Спм)). Несмотря на тесную взаимосвязь путей синтеза пролина и полиаминов, вопрос о возможности координированной регуляции метаболизма этих низкомолекулярных соединений, особенно в «рессорных условиях, остается дискуссионным.

облучения, несмотря на то, что одним из ответов растений на УФ-В является интенсивная аккумуляция полиаминов, прежде всего Пут (Ракитин и др., 2009). Кроме того, основным повреждающим эффектом УФ-В облучения является образование активных форм кислорода (АФК), для нейтрализации которых растения используют низкомолекулярные соединения (в том числе, пролин и полиамины), а также специальные ферменты-антиоксиданты (Jenkins, 2009). В связи с тем, что пролин, полиамины и антиоксидантные ферменты являются компонентами одной антиоксидантной защитной системы, изменение внутриклеточного уровня пролина, возможно, модифицирует не только содержание и спектр полиаминов в клетке, но и функционирование антиоксидантных ферментов.

В последние годы появились сведения о том, что стресс-зависимое изменение эндогенного содержания пролина, может участвовать в регуляции активностей антиоксидантных ферментов в растениях (Ozturk, Demir, 2002; Радюкина и др., 2008). Однако эти данные носят противоречивый характер и конкретные механизмы взаимодействия пролина с антиоксидантными ферментами до сих пор не ясны.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось выяснение участия пролина в регуляции уровня полиаминов и функционирования ферментов антиоксидантной системы Salvia officinalis L. при УФ-В облучении. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние различных доз УФ-В облучения на растения S. officinalis.

2. Изучить функционирование компонентов антиоксидантной защитной системы S. officinalis при УФ-В облучении.

3. Изучить действие УФ-В облучения на содержание и спектр свободных и конъюгированных полиаминов.

4. Исследовать влияние экзогенного пролина на содержание полиаминов и функционирование ферментов антиоксидантной защитной системы S. officinalis при УФ-В облучении.

форм полиамидов. Установлено, что пролил принимает участие в регуляции функционирования антиоксидантных ферментов при действии УФ-В облучения. Впервые показано, что пролил стабилизирует активность супероксидцисмутазы (СОД), вызывая появление дополнительных изоформ Fe-СОД и замедляя изменения в экспрессии генов, кодирующих изоформы СОД, а также снимает гаггибирующий эффект УФ-В облучения на активность каталазы и ингибирует активность гваякол-зависимых пероксидаз. Впервые определены пуклеотидные последовательности центральных частей генов, кодирующих изоформы СОД в растениях шалфея, и показана их 80-93% идентичность с последовательностями генов-ортологов других видов растепий.

Практическая значимость. Полученные в работе экспериментальные данные по изменению содержания пролина, полиаминов семейства Пут и активностей антиоксидантных ферментов у S. officinalis в условиях УФ-В облучения и при действии экзогенного пролина имеют существенное значение для понимания механизмов координированной регуляции антиоксидантов при адаптации растений к окислительному стрессу (ОС) и могут использоваться в разработке технологии создания трансгенпых растепий с повышенной устойчивостью к ультрафиолету. Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на 11-й Международной Пущипской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007); 12-й Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008): годичном собрании общества физиологов растений России и Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008); годичном собрании общества физиологов растений России и Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего севера» (Апатиты, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из которых 1 статья в рецензируемом журнале.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных

результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, включая 2 таблицы, 40 рисунков; библиография содержит 272 названия, из которых 248 на иностранном языке.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования - растения шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.) из семейства Lamiaceae; семена получены из коллекции Сибирского ботанического сада (г. Новосибирск). Шалфей лекарственный, выбранный в качестве объекта исследования, отличался низким хак конститутивным, так и стресс-индуцируемым уровнем пролина, что делало сопоставимым эндогенные уровни пролина и полиаминов в клетке и, как следствие, возможным изучение влияния экзогенного пролина на уровень полиаминов в нормальных и стрессорных условиях.

Растения выращивали в условиях водной культуры в камере фитотрона при 12-часовом световом периоде и мощности освещения 37,6 Вт/м2 люминесцентных ламп Philips (F36W/54). Температура воздуха - 23±1°С/15±1°С, относительная влажность воздуха - 55/70% день/ночь.

Условия проведения опытов. При обработке УФ-В растения переносили в камеру с ультрафиолетовыми лампами и облучали в течение 10, 20, 30 мин (дозы облучения равнялись 12,25; 24,5; 36,75 кДж/м2 соответственно). Экзогенный пролин вносили в питательную среду до конечной концентрации 5 мМ одновременно с обработкой УФ-В радиацией. Пробы листьев и корней растений отбирали через 6, 12, 24, 30, 36, 48 ч после начала эксперимента, фиксировали жидким азотом и хранили при - 70°С до проведения анализов.

Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли методом, описанным Heath and Packer (1968), который основан на образовании окрашенного комплекса МДА с тиобарбитуровой кислотой. Содержание Н202 определяли по методу Brennan and Frenkel (1977).

Содержание свободного пролина измеряли по методу Bates с соавт. (1973). Полиамины определяли в виде их дансильных производных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Flores, Galston, 1982).

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли спектрофотометрически по методу Beauchamp and Fridovich (1971). Активность пролиндегидрогеназы

(ПДГ) определяли спеетрофотометричсским методом по изменению концентрации восстановленного НАД (Mattioni et al., 1997). Определение активности каталазы проводили по методу Maehly and Chance (1954). Активность гваякол-зависимой пероксидазы определяли по методу Ridge and Osdom (1971).

Оценку уровня экспрессии генов СОД проводит методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Тотальную РНК выделяли из растительного материала кислым фенол-хлороформом (Krapp et al., 1993). Очистку от примссей ДНК, синтез кДНК осуществляли с использованием ферментов и реактивов фирмы «Fermentas» по протоколу производителя. Результаты ПЦР оценивали методом электрофореза нуклеиновых кислот в 1% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Обработку полученных фореграмм экспрессии генов СОД проводили с помощью программы GelPro. Специфические праймеры для проведения ПЦР генов СОД шалфея конструировали с помощью филогенетических дендрограмм кДНК последовательностей соответствующих генов родственных видов с использованием базы данных Национальной медицинской библиотеки (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) в среде Vector NTI 9.0.0.

Разделение изоформ СОД проводили при помощи нативного электрофореза фракции белков в 12%-ном ПАА-геле по методу Laemmli (1970). Для окрашивания гелевых пластин использовали методику Beauchamp and Fridovich (1971).

Эксперименты были проведены в 3-х кратной биологической повторности. Результаты обрабатывали общепринятыми методами статистики (Зайцев, 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние УФ-В облучения на растения шалфея.

Влияние УФ-В облучения на рост растений шалфея. УФ-В радиация в зависимости от дозы облучения оказывала негативное влияние на рост растений или вызывала их гибель. В ходе проведенных исследований было установлено, что доза облучения 36,75 кДж/м2 (30 мин) являлась летальной для растений шалфея, которые гибли на пятый день после облучения; 20-ти минутное облучение (24,5 кДж/м2) вызывало торможение роста (на 60%) и появление некрозов. Доза облучения 12,5 кДж/м2 (10 мин) тормозила рост растений в меньшей степени (на 40%) и оказалась более умеренной для растений шалфея.

Развитие ОС в растениях S. officinalis при действии УФ-В радиации. Одним из основных повреждающих эффектов УФ-В облучения на растения является образование АФК. Развитие ОС при УФ-В радиации у растений оценивали по изменению содержания перекиси водорода - продукта свободно-радикальных реакций, и малонового диальдегида (МДА) - индикатора перекисного окисления липидов мембран.

УФ-В облучение вызывало увеличение содержания перекиси водорода в листьях больше, чем в корнях (рис. 1А). Увеличение уровня перекиси водорода могло быть связано и с известной сигнальной ролью Н2О2, которая наряду с другими АФК является вторичным мессенджером (Xiong, Zhu, 2002; Jenkins, 2009).

При действии УФ-В облучения повышался также уровень перекисного повреждения липидов мембран и как следствие образование МДА. В листьях уровень МДА, как и ожидалось, был существенно выше, чем в корнях, что связано с селективностью действия стресс-фактора (рис. 1Б). Облучение растений в течение 20 и 30 мин приводило к более сильному развитию ОС, о чем свидетельствовало двукратное повышение содержания МДА в листьях по сравнению с растениями, облученными в течение 10 мин.

0,045 а 0,04 -j I 0,035 S 0,03 | 0.025 i t 0,02 1 0,015 -

I 0,01

0,005 0

в листья □ корни

«йа

sfe

Б.

и листья т

□ корни т

jjg ' Y

—

контроль УФ-В УФ-В УФ-В 10 мин 20 мин 30 мин

Рис. 1. Влияние различных доз УФ-В облучения на содержание перекиси водорода (А) и содержание МДА (Б).

Продемонстрировано, что УФ-В радиация вызывает развитие ОС в растении, доза облучения влияет на степень развития повреждений окислительного характера, и гиперпродукция АФК наблюдается в органах, непосредственно подверженных действию радиации.

Поскольку при 10-ти минутном облучении растения шалфея испытывали наименьшие повреждения, то для дальнейших исследований была выбрана экспозиция растений под УФ-В в течение 10 мин.

Влияние УФ-В облучения на эндогенное содержание пролина. Для нейтрализации активных радикалов растения используют высокомолекулярные ферменты и низкомолекулярные антиокевданты, в том числе пролин и полиамины (На et al., 1998). Прежде чем исследовать взаимодействие этих метаболитов в условиях УФ-В облучения, важным представлялось изучить, как влияет УФ-В радиация на их эндогенное содержание в растениях шалфея.

Изучение содержания пролина в органах шалфея показало, что его конститутивный уровень был достаточно низким как в листьях (0,2 мкмоль/г сырой массы), так и в корнях (0,35 мкмоль/г сырой массы). УФ-В радиация вызывала увеличение уровня пролина в 2 раза через 36 ч после облучения, как в надземных, так и в подземных органах (рис. 2). Из полученных результатов следует, что внутриклеточный уровень пролина растений шалфея в стрессорных условиях не достигал максимальных концентраций, найденных у многих видов растений (Радююша и др., 2007).

-1-г-

12 24 36 Время после облучения, ч

Рис. 2. Эпдогешюе содержание пролина в органах шалфея при УФ-В облучении.

Влияние УФ-В облучения на содержание и спектр свободных и конъюгированных полиаминов. У растений разных таксономических групп показана стресс-индуцирусмая аккумуляция полиашшов в условиях УФ-В радиации (Прудникова, 2006; Иванов, 2008; Ракитин и др., 2009). В нашем исследования в листьях общее содержание свободных полиашшов повышалось в 3 раза через сутки после облучения (рис. 3). Через 36 ч возрастала доля нерастворимых конъюгатов, а через 48 ч - доля растворимых конъюгатов.

о а

1200 1000 800 600 -400 -200

12 24 36 Время после облучения, ч

Ш нерастворимые конъюгаты УЛ растворимые конъюгаты ■ свободные полиамины

Рис. 3. Общее содержание полиаминов (Пут, Спд, Спм) в листьях при УФ-В облучении.

Исследование спектра полиаминов в листьях показало, что больший вклад в изменение общего содержания полиаминов в условиях УФ-В радиации вносил Пут в свободной форме, содержание Спд и Спм практически не изменялось (рис. 4).

1000

1000 1

Содержание спермидина

1000 -г

800 -

600

400 -

0 12 24 36 Время после облучения, ч

Содержание спермина

0 12 24 36 Время после облучения, ч

■ нерастворимые конъюгаты ¡й растворимые конъюгаты

■ свободные полиамины

Рис. 4. Спектр полиаминов в листьях при УФ-В облучении.

В корнях повышение общего содержания полиаминов наблюдалось только через 48 ч после действия облучения. Увеличение содержания полиаминов в корнях определялось, прежде всего, повышением доли растворимых конъюгатов (рис. 5).

в нерастворимые конъюгаты ?? растворимые конъюгаты ■ свободные нолиамины

Рис. 5. Общее содержание полиаминов (Пут, Спд, Спм) в корнях при УФ-В облучении.

12 24 36 Время после облучения, ч

Основной вклад в изменение общего содержания полиаминов вносил Пут, его содержание к 48 ч возросло в 2 раза (рис. 6).

¡600 1

Содержание спермидина

О 12 24 36 48 Время после облучения, ч

я 1600 !

« 1200

800

Содержание спермина

К нерастворимые конъюгаты V/. растворимые конъюгаты ■ свободные полиамины

Рис. 6. Спектр полиаминов в корнях при УФ-В облучении.

В корнях содержание растворимых конъюгатов Спд и Спм незначительно возросло к 48 ч, доля Спд в корнях была больше, чем в листьях (рис. 4; 6).

Образование конъюгированных форм полиаминов в стрессовых условиях могло способствовать повышению эффективности антиоксидантной системы защиты, поскольку конъюгаты полиаминов с фепольными соединениями имеют более высокие константы связывания с активными радикалами, чем свободные полиамины (Вогэ е! а1„ 1989).

Анализ полученных результатов показал, что аккумуляция полиаминов в растениях шалфея при действии УФ-В облучения является органоспецифичной. В листьях она начиналась раньше и обусловлена повышением содержания свободных полиаминов; в корнях наблюдалось более медленное повышение уровня полиаминов, которое осуществлялось преимущественно за счет фракции растворимых конъюгатов полиаминов. Основной вклад в изменения общего содержания полиамипов вносил Пут.

УФ-В облучение приводило к повышению содержания низкомолекулярных антиоксидантов: пролина и полиаминов, но изменения в содержании и спектре полиаминов предшествовали аккумуляции пролина, которая была незначительной.

Влияние экзогенного пролина на содержание и спектр полиаминов и функционирование антиоксидантных ферментов в нормальных условиях и при

УФ-В облучении.

Влияние экзогенного пролина и совместного действия УФ-В облучения и экзогенного пролина на эндогенное содержание пролина. Для проверки предположения об участии пролина в регуляции уровня полиаминов в условиях УФ-В радиации экзогенный пролин добавляли в питательную среду, что приводило к изменению его эндогенного уровня в растениях шалфея. При добавлении пролина (5 мМ), его эндогенное содержание в корнях достигло 9 мкмоль/г сырой биомассы через 12 ч после начала эксперимента, что почти в 30 раз превышало его конститутивный уровень (рис. 7). Через 36 ч экспозиции растений на среде с экзогенным пролином наблюдалось падение его эндогенного уровня в корнях (рис. 7), что могло быть следствием увеличения активности ПДГ, ключевого фермента, регулирующего уровень пролина. Активность ПДГ в листьях не обнаружена. В ответ на добавление экзогенного пролина в культуральную среду его эндогенный уровень в листьях

кратковременно возрастал, достигая 10-кратного превышения контрольных значений через 24 ч экспозиции (рис. 7).

14 -1

Рис. 7. Содержание эндогенного пролила при добавлении экзогенного пролина (пунктир) и при совместном действии УФ-В облучения и пролина (сплошные линии).

Кратковременное облучение растений УФ-В на фоне экзогенного пролила не влияло на поглощение его корнями из питательной среды, но инициировало интенсивную транзиторную аккумуляцию пролина в листьях после 24 ч и несколько увеличивало активность ПДГ в корнях в конце эксперимента, что сопровождалось спижением в них внутриклеточной концентрации пролина (рис. 7).

Влияние экзогенного пролина на эндогенное содержание полиаминов в необлученных растениях. Внесение экзогенного пролина в среду могло повлиять на содержание и спектр полиаминов в отсутствие УФ-В облучения. Было установлено, что поступление пролина из питательной среды в растение не приводило к изменению содержания свободного Пут, Спд и Спм в листьях необлученных растений. Содержание конъюгатов полиаминов в листьях при искусственном увеличении содержания пролина не изменялось. Возможно, в отсутствие стресса эндогенный уровень полиаминов у шалфея вполне достаточен для осуществления их регуляторных функций в клетках и не индуцируется при обработке экзогенным пролином.

В корнях в отличие от листьев поступление пролина из питательной среды вызвало резкое транзиторное увеличение свободного Пут в 4,5 раза (1088 пмоль/г сырой массы) через 24 ч после облучения, с последующим снижением его содержания. Изменения в содержании свободных Спд и Спм отмечены не бьши.

- -В - корень • +ПР°ЛНН

УФ-В+пролин

Время после облучения, ч

Экзогенный пролин ингибировал накопление коньюгированных форм всех исследованных видов полиаминов в корнях.

Полученные данные свидетельствуют не только об усилении синтеза Пут в ответ на необычно высокую для растений шалфея концентрацию пролина в корнях, но и указывают на прооксидантную роль экзогенного пролина. Прооксидантные свойства пролина в данных исследованиях можно объяснить его спонтанной окислительной деградацией, прежде всего, в аиопласте корня с образованием АФК, индуцирущих активность СОД, а затем при поступлении пролина в митохондрии его деградацию катализировала ПДГ, локализованная в этой органелле. Повышение в корнях окислительного статуса индуцировало биосинтез Пут, который мог выполнять антиоксидантную функцию (Уе е1 а1., 1997).

Совместное влияние экзогенного пролина и УФ-В облучения на эндогенное содержание полиаминов. Установлено, что при совместном действии облучения УФ-В и экзогенного пролина в листьях накопление свободных полиаминов к 48 ч было значительно усилено по сравнению только с УФ-В (рис. 8).

О 12 24 36 48

Время после облучения, ч

Общее содержание

нерастворимых

конъюгатов

И УФ-В

В УФ-В+пролин

£■ 600 -

-а

Рис. 8. Общее содержание разных форм полиаминов в листьях шалфея при добавлении экзогенного пролина в условиях УФ-В облучения по сравнению с действием только УФ-В облучения.

При этом увеличилось также содержание растворимых конъюгатов и не изменилось содержание нерастворимых конъюгатов (рис. 8).

По сравнению с действием экзогенного пролина на необлученные растения, где изменения в уровне полиаминов не наблюдались, совместное действие пролина на фоне УФ-В сопровождалось увеличением содержания всех трех полиаминов, но, в основном, определялось увеличением содержания Пут.

В корнях экзогенный пролин на фоне облучения растений УФ-В дополнительно стимулировал образование свободных полиаминов и растворимых конъюгатов (рис. 9). Уровень свободных полиаминов повышался через 24 ч, растворимых конъюгатов -через 12 ч. Основной вклад в накопление всех форм полиаминов вносил также Пут, но его содержание увеличилось в меньшей степени, чем только при добавлении экзогенного пролина, что может свидетельствовать об использовании Пут в процессе репарации растений после УФ-В облучения. Содержание конъюгатов полиаминов после 24 ч снижалось, что, возможно, связано с их расходованием на "тушение" АФК (рис. 9).

2500 •

Общее содержание свободных полиаминов

2 «

0 12 24 36 48 Время после облучения, ч

2500 п 2000 -1500 -.1000 500 0

Общге содержание нерастворимых конъюгатов

Общее содержание растворимых конъюгатов

12 24 36 48 Время после облучения, ч

□ УФ-В

КЗ УФ-В+пролин Рис.

, ^

9. Общее содержание разных форм полиаминов в корнях при добавлении экзогенного пролина в условиях УФ-В облучения по сравнению с действием только УФ-В облучения.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что в листьях без облучения экзогенный пролин не вызывал изменений в содержании полиаминов. При облучении экзогенный пролин дополнительно стимулировал синтез полиаминов в условиях действия стресс-фактора, увеличивая содержание свободных полиаминов в 2 раза. Это косвенно могло свидетельствовать о том, что метаболические пути биосинтеза иролина и полиаминов строго координируются, и пересечения этих путей могут быть связаны с изменением окислительного статуса и только тогда, когда повреждающее действие стрессора является достаточно сильным.

Стимуляция синтеза нолиаминов могла происходить за счет вовлечения пролина в оршггаловый цикл митохопдрий и активации биосинтеза Пут через орнитиндекарбоксилазный путь при дирадации экзогенного пролина до глутамата. Однако, в корнях, где накопление пролина было наиболее выражено, экзогешшй пролин мог выступать как прооксидаит и уже без облучения индуцировал синтез полиаминов. Доказательством прооксидантной роли избыточного накопления в корнях пролина могут служить изменения в активности СОД.

Влияние экзогенного пролина. совместного действия УФ-В облучения и экзогенного пролина на активность СОД. Ключевым ферментом антиоксидантной защиты является СОД. При исследовании стресс-зависимой стимуляции активности СОД в условиях действия только УФ-В облучения было показано, что в листьях активность фермента снижалась в первые сутки после облучения, а затем возрастала после 36 ч и превысила контрольный уровень в 2 раза (рис. 10А). Снижение активности фермента в первые сутки после облучения УФ-В могло объясняться инактивацией фермента в сгрессорных условиях. Активность СОД в листьях незначительно изменялась в течение экспозиции растений, как в присутствии, так и в отсутствие в среде пролина (рис. 10А). Совместное действие УФ-В и пролина привело к тому, что активность фермента стабилизировалась на постоянном уровне, и . снижение активности фермента (следовательно, и инактивации) отмечено не было. Полученные результаты подтверждают, что пролин способен оказывать протекторное действие на макромолекулы в условиях стресса (О/Лшк, Всшп, 2002). В корнях, которые в отличие от листьев испытывали опосредованное действие УФ-В стресса, гранзиторная вспышка активности СОД наблюдалась уже через 12 ч, затем активность фермента, хотя и снижалась через 24 ч после облучения, но оставалась на гораздо более высоком уровне, чем в листьях в тех же условиях (рис. 1 ОБ).

На среде с экзогенным пролином без воздействия облучения в корнях максимум активности СОД появлялся позже (через 36 ч экспозиции растений) (рис. 10Б), по сравнению с действием только облучения. В корнях растений, подвергавшихся облучению, накопление экзогенного пролина снимало ярко выраженный транзиторный характер повышения активности СОД, наблюдаемый в условиях действия только УФ-В, т.е. аккумуляция пролина способствовала стабилизации высокой активности СОД более длительное время. Увеличеш1е активное™ СОД в корнях, которые не подвергались облучению, свидетельствует о возможной транедукции стрессового сигнала из облученных листьев в корни, что так же было показано в опытах с действием УФ-В на растения кукурузы (Casati, Walbot, 2004) и арабидопсиса (Kilian et al., 2007).

Время после облучения, ч Время после облучения, ч

Рис. 10. Влияние УФ-В облучения, экзогенного пролина и их совместного действия на активность СОД в листьях (А) и в корнях (Б).

Поскольку в растениях присутствуют несколько изоформ СОД, вносящих различный вклад в общую активность фермента, было важно исследовать изоферментный состав СОД в листьях шалфея и оценить вклад каждой изоформы в общую активность фермента при действии УФ-В облучения. Кроме того, для установления механизма стабилизирующего влияния пролина на общую активность СОД необходимо было выяснить, как пролин влияет на активность разных изоформ фермента. Поскольку изоформы СОД отличаются разной устойчивостью к ингибиторам, определение типа изоформ было проведено с помощью ингибиторного анализа, который показал, что в растениях шалфея лекарственного содержатся три типа изоформ СОД (рис. 11 А).

А.

контроль КОМ Н2О2

Мп-СОД

Ре-СОД Си®1-СОД

Ре-СОД

СиСп-СОД

Мп-СОД

Рис. 11. Ингибиторный анализ изоферментиого спектра СОД шалфея (А) и изменение активностей изоформ СОД в условиях УФ-В радиации (Б).

В листьях растений шалфея за первые 12 ч после облучения активность Ре -СОД снижалась, а ее стресс - индуцируемое повышение начиналось только через 2430 ч после облучения (рис. 11Б). Повышалась активность Си.^п-СОД. активность Мп-СОД не изменялась. Результаты, полученные с помощью нативного электрофореза (рис. 11Б), позволяют предположить, что в облученных УФ-В растениях в повышение активности СОД после 36 ч (рис. 10А) вносят наибольший вклад 1-е- и Си/^п-СОД, которые присутствуют в цитозоле и пластидах. В митохондриях, где локализуется Мп-СОД, развитие ОС, вызванного УФ-В облучением, происходит либо в незначительной степени, либо основная роль в детоксикации супероксидрадикала принадлежит изоформе (КНеЬепз1ет е1 а!.. 1998).

При совместном действии УФ-В и экзогенного пролина установлено, что активность Мп-СОД не изменялась, активность Си/2п-С0Д также оставалась на постоянном уровне (рис. 12).

Оч 6ч 12 ч 24 ч 30 ч 36 ч 43 ч

Мп-СОД Ре-СОД

сыгп-со/

Рис. 12. Влияние совместного действия УФ-В облучения и экзогенного пролина на изоферментный спектр СОД шалАея.

Экзогенный пролин предотвращал снижение активности Fe-СОД в первые сутки после облучения и приводил к появлению дополнительных изоформ Fe-СОД. Таким образом, в стресс-индуцируемое повышение общей активности СОД наибольший вклад вносила Fe-СОД.

В связи с наблюдаемой дифференциальной стресс-зависимой индукцией активностей изоформ СОД в условиях УФ-В было важным установить, являлась ли такая индукция посттранскрипционной или затрагивала транскрипционный уровень. Необходимо было также выяснить, проявилось ли влияние экзогенного пролина на изоформы СОД на транскрипционном уровне.

Поскольку нуклеотидные последовательности генов изоформ СОД у шалфея неизвестны, необходимо было их определить. Полученные нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР имели высокий процент сходства с последовательностями генов-ортологов: для CSD (ген, кодирующий Cu/Zn-СОД) 93,1%; для MSD (ген, кодирующий Мп-СОД) - 86,2%; для FSD (ген, кодирующий Fe-СОД)-81,4%.

Исследование экспрессии генов изоформ СОД показало, что в листьях растений, облученных УФ-В, уровень транскриптов генов CSD и MSD заметно повышался через 6-12 ч после облучения, при этом уровень транскриптов генов FSD не изменялся (рис. 13А). Наибольшие изменения в уровне экспрессии, вызванные УФ-В облучением, наблюдались для гена CSD, кодирующего Cu/Zn - СОД.

В корнях, испытывавших опосредованное действие облучения, количество мРНК исследуемых генов СОД было гораздо меньше, чем в листьях. В первые часы после облучения повышалось количество транскриптов CSD, затем наблюдалось повышение количества матриц MSD с последующим снижением до контрольного значения. Пик повышения количества транскриптов FSD наблюдался через 30 ч после облучения (рис. 13А).

Согласно данным по изменению активности исследованных изоформ СОД в условиях радиации (рис. 11Б) и результатам, полученным в ходе исследования экспрессии генов СОД (рис. 13А), следует, что регуляция активности Мп - СОД осуществлялась на транскрипционном (повышение уровня экспрессии гена через 6 ч после облучения), и на постгранскрипционном уровнях, т.е. высокий уровень экспрессии гена не определял уровень активности этой изоформы. Несмотря на низкий уровень экспрессии гена FSD, активность изоформы повышалась очень

сильно в условиях УФ-В радиации (рис. 11 Б). Скорее всего, регуляция активности Fe-СОД происходила на посттранскрипционном уровне. Повышение уровня экспрессии гена CSD коррелирует с повышением активности данной изоформы, что свидетельствует о транскрипционном уровне регуляция активности Cu/Zn- изоформы СОД. Причем уровень экспрессии гена данной изоформы изменялся под воздействием УФ-В облучения в наибольшей степени по сравнению с другими генами СОД.

CSD MSD +—FSD

18 24 30 36 Время после облучения, ч

0 6 12 18 24 30 36 Время после облучения, ч

Рис. 13. Влияние УФ-В облучения (А) и совместного действия экзогенного пролина и УФ-В облучения (Б) на экспрессию генов изоформ СОД.

Исследование экспрессии генов трех типов изоформ СОД при совместном действии УФ-В и экзогенного пролина показало, что количество транскриптов А/£0 в процессе эксперимента в листьях не изменялось (рис. 13Б), как не изменялась и активность Мп-СОД (рис. 12). Было установлено, что экзогенный пролин в листьях

снимает стимулирующее действие УФ-В радиации на уровень экспрессии гена MSD. В корнях экзогенный пролин, напротив, особенно сильно влиял на интенсивность транскрипции гена, кодирующего Mn-СОД, которая, как известно, локализована в митохондриях. Возможно, в данном случае местом восприятия негативного сигнала при высокой концентрации пролина в корнях оказалась именно электрон-транспортная цепь (ЭТЦ) митохондрий, которая могла нарушаться из-за активной деградации экзогенного пролина до Д1- пирролин-5-карбоксилата, проявляющего в высокой концентрации токсичные свойства (Verbruggen, Hermans, 2008). Изменения в количестве транскриптов в корнях FSD не наблюдались, в листьях уровень экспрессии этого гена незначительно возрастал после 24 ч, что возможно обеспечило увеличение активности данной изофрмы при стрессе. Количество матриц CSD возрастало в листьях уже в первые часы эксперимента, но в меньшей степени, чем только при УФ-В облучении, в корнях - после 12 ч, и сохранялось на достаточно высоком уровне до конца экспозиции (рис. 13Б).

Обнаружено, что пролин, изменяя активность изоформ СОД, в первую очередь влияет на уровень экспрессии генов СОД. Повышение количества матриц наблюдалось позже и в меньшей степени, чем только в условиях облучения, что косвенно свидетельствует о снятии пролином негативного действия радиации на листья. В корнях экзогенный пролин нарушал ЭТЦ митохондрий, индуцируя транскрипцию MSD. В опыте с облучением УФ-В и при совместном действии УФ-В и экзогенного пролина наибольший уровень экспрессии наблюдался для гена CSD.

Влияние экзогенного пролина. совместного действия УФ-В облучения и экзогенного пролина на активность пероксидазы и каталазы. После обнаруженного эффекта пролина на активность СОД, важно было понять, являлся ли данный эффект специфичным для СОД, или пролин взаимодействует и с другими ферментами-антиоксидантами. В результате реакции дисмутации, катализируемой СОД, образуется пероксид водорода. Самыми распространенными ферментами, регулирующими уровень внутриклеточного содержания перекиси водорода, являются пероксидазы и каталаза. Облучение УФ-В приводило к повышению активности пероксидазы в листьях и в корнях (рис. 14А). Добавление экзогенного пролина в среду привело к снижению активности данного фермента в листьях. Совместное действие пролина и УФ-В активировало пероксидазу в меньшей степени, чем только облучение.

а 300 -i

А.

контроль пролин УФ-В УФ-В+

пролин Б.

контроль пролин УФ-В УФ-В+ пролин

Рис. 14. Влияние экзогенного пролина. УФ-В облучения и их совместного действия на активность пероксидазы (А) и каталазы (Б).

Исследование активности каталазы показало, что УФ-радиация снижала активность фермехгга (рис. 14Б). Действие экзогенного пролина приводило к увеличению активности каталазы. Облучение растений на фоне экзогенного пролина вызвало увеличение активности каталазы, что еще раз доказывает влияние пролила на активность антиокидантных ферментов. Способность пролина активировать или ингибировать ферменты связывают с его влиянием и на конформационные изменения белков (К^епёгакитаг е! а1., 1994).

Полученные в работе результаты по воздействию УФ-В облучения, экзогенного пролина и их совместного действия на растения шалфея (Salvia officinalis L.), позволили подтвердить гипотезу о существовании координированной регуляции метаболических путей при формировании адаптационного ответа. Было показано, что повышение содержания пролина в нормальных и етрессорных условиях вызывало усиление синтеза Пут, а также изменяло функционирование ферментов-антиоксидантов.

При проведении исследований в выше указанном направлении мы исходили из существующих представлений о том, что общим и начальным повреждающим компонентом стрессоров различной природы, в том числе и УФ-В радиации, является

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

развитие ОС (Asada, 1994; Matysik et al., 2002). Было показано, что в листьях при действии УФ-В облучения, как содержание перекиси водорода, так и интенсивность повреждения мембран повышались в большей степени, чем в корнях, которые испытывали действие облучения опосредованно. При этом накопление защитных метаболитов (пролина и полиаминов), которое было зафиксировано в листьях и корнях, резко различалось как по абсолютным значениям, так и по времени: повышение содержания полиаминов начиналось раньше, чем пролина и значительно превышало его количественно. Более того, уровень пролина в листьях и корнях шалфея не достигал тех максимальных значений, которые характерны для действия других стрессоров у большинства растений (Радюкина и др., 2007; Шевякова и др., 2009). Особый интерес представлял тот факт, что УФ-индуцированная аккумуляция полиаминов распространялась только на Пут, как в свободной, так и в коньюгированной форме.

Экзогенный пролин в листьях без облучения не вызывал изменений в содержании полиаминов. В то же время при облучении экзогенный пролин дополнительно стимулировал накопление полиаминов (Пут), увеличивая их содержание в 2 раза по сравнению с действием только УФ-В радиации. Полученные данные могут указывать на то, что накопление пролина и Пут в листьях в стрессорных условиях (в данном случае в присутствии повышенной УФ-В радиации) синергически действуют как антиоксиданты. Известно, что полиамины особенно в коньюгированной форме служат "ловушками" АФК (Bors et al., 1989; На et al., 1998; Kuznetsov, Shevyakova, 2007). Возможно, антаоксидантные свойства пролина проявляются в дополнительной активации биосинтеза полиаминов.

Важным результатом исследований являются впервые установленные факты о том, что роль экзогенного пролина при действии УФ-В стресса проявлялась органоспецифично: в листьях как антиоксиданта, а в корнях как прооксиданта, что, возможно, зависило от значительного превышения его допустимой концентрации, специфичной для каждого вида растений, его адаптивных возможностей, длительности воздействия стрессора и развития адаптационного процесса.

Установлено также, что экзогенный пролин участвует в регуляции функционирования антиоксидантных ферментов, стабилизируя активность СОД, вызывая появление дополнительных изоформ Fe-СОД и изменяя экспрессию генов

СОД. Пролин ингибировал активность гваякол-зависимой пероксидазы и снимал ингибирующий эффект УФ-В облучения на активность каталазы.

Таким образом, совокупность представленных данных однозначно свидетельствует о том, что пролин модифицирует процессы аккумуляции полиаминов как в оптимальных условиях выращивания растений, так и в сгрессорных. Пролин принимает участие в функционировании антиоксидантных ферментов при действии УФ-В облучения. Проявление им антиоксидантных и прооксидаптных свойств зависит от его внутриклеточной концентрации, действия стрессора и стадии адаптационного процесса.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что окислительный стресс, развивающийся при УФ-В облучении, приводит к стимуляции антиоксидантной защитной системы, которая проявляется в повышении активности СОД и гваякол-зависимых перокепдаз, а также уровня внутриклеточного пролина и полиаминов.

2. Показано, что в растениях шалфея функционируют три типа изоформ одного из ключевых антиоксидантных ферментов супероксидцисмутазы: Мп-, Ре-, СиЖп-содсржащие СОД. При этом установлено, что наибольший вклад в общую (конститутивную и стресс-индуцируемую) активность СОД вносит Ре-содержащая изоформа фермента.

3. Проведена оценка уровня экспрессии генов трех изоформ СОД на уровне индивидуальных мРНК с помощью метода ОТ-ПЦР в растениях шалфея при УФ-стрсссе. Сравнительный анализ динамики уровней мРНК и активностей различных изоформ СОД позволил высказать предположение, что регуляция активности Си/гп- изоформы СОД при УФ-В облучении преимущественно происходила на транскрипционном уровне; Бе-СОД - на поспранскршщионном; Мп-СОД как на транскрипционном, так и на поспранскршщионном уровнях.

4. Продемонстрировано, что экзогенный пролин участвует в регуляции функционирования антиоксидантных ферментов, стабилизируя активность СОД, вызывая появление дополнительных изоформ Ре-СОД и замедляя изменения в экспрессии генов СОД. Кроме того, пролин снимал ингибирующий эффект УФ-В облучения на активность каталазы и ингибировал активность гваякол-

зависимой пероксидазы. Показано, что экзогенный пролии увеличивал содержание путресцина в листьях и в корнях растений шалфея при УФ-В облучении.

5. Установлено, что аккумуляция полиаминов в растениях шалфея при действии УФ-В облучения является органоспецифичной. При этом в листьях стресс-зависимая аккумуляция полиаминов начинается раньше, и она обусловлена повышением содержания свободных полиаминов, тогда как в корнях наблюдается более медленное повышение уровня полиаминов, которое осуществляется преимущественно за счет фракции растворимых конъюгатов полиаминов.

6. Установлено, что экзогенный пролин способен проявлять не только антиоксидантные, но и прооксидантные свойства. Проявление биологического эффекта пролит в нормальных условиях и при стрессе зависело от его внутриклеточной концентрации. Показано, что 30-кратное превышение уровня эндогенного пролина в корнях шалфея вызвало окислительный стресс, что проявилось в повышении содержания перекиси водорода, интенсивности перекисного окисления липидов и активности СОД.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Шашукова А.В., Бакулина Е.А., Радюкина Н.Л., Кузнецов Вл.В. (2007) Исследование защитных систем у Mesembryanthemum crystallinum в ответ на действие NaCl и УФ-В // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 11-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых. Сб. тезисов. (Пущино, 29 октября -2 ноября 2007 г.), Пущиио, 2007. - С. 165-166.

2. Шашукова А.В., Радюкина Н.Л., Кузнецов Вл.В. (2008) Сравнительное изучение антиоксидантных защитных систем Salvia officinalis L. при действии УФ-В и NaCl // Материалы Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 0611 октября 2008 г.), Екатеринбург, 2008. - С. 434 - 435.

3. Шашукова А.В., Радюкина Н.Л. (2008) Исследование состояния антиоксидантной системы Salvia officinalis L. под действием параквата // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 12-я Международная Пущинская школа-

конференция молодых ученых. Сб. тезисов. (Пущино, 10 - 14 ноября 2008 г.), Пущино, 2008. —С. 115.

4. Шашукова А.В. (2008) Влияние экзогенного пролина на функционирование антиоксидантной защитной системы Salvia officinalis L. при действии параквата // БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 12-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых. Сб. тезисов. (Пущино, 10 - 14 ноября 2008г.), Пущино, 2008.-С. 115-116.

5. Радюкина H.JI., Шашукова А.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. (2008) Участие пролина в системе антиоксидантной защиты у шалфея при действии NaCl и параквата. Физиология растений, 55, 721 -730.

6. Shashukova A., Raduykina N., Mapelli S., Kuznetsov Vl.V. (2009) Influence of exogenous proline on polyamine content in common sage under UV-B irradiation // International Conference: Plant Abiotic Stress Tolerance. Programme and Abstracts. 8 -I I February, 2009. Vienna, Austria. P. 265.

7. Шашукова A.B., Радюкина НЛ., Макарова С.С. (2009) Пролин и полиамины у растений Salvia officinalis L. при действии УФ-В // Материалы Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего севера» (Апатиты, 07-11 июня 2009 г.), Апатиты, 2009. - С. 359 - 361.

Подписано в печать: 17.11.2009

Заказ № 3074 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шашукова, Антонина Васильевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Повреждающее действие УФ-В радиации на растения и их защитные механизмы.

1.2. Развитие окислительного стресса при облучении растений УФ-В и антиоксидантная система защиты клетки.

1.3. Мультифункциональная роль пролина в растении.

1.3.1. Строение, свойства и биосинтез пролина.

1.3.2. Роль пролина в растении.

1.3.3. Влияние пролина на ферменты-антиоксиданты.

1.3.4. Токсичность пролина.

1.3.5. Пролин в растении при действии УФ-В облучения.

1.4. Мультифункциональная роль полиаминов в растении.

1.4.1. Строение и биосинтез полиаминов.

1.4.2. Роль полиаминов в растении.

1.4.3. Полиамины в растении при действии УФ-В облучения.

1.5. Взаимосвязь аккумуляции пролина и полиаминов в растении при стрессорных условиях.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Условия выращивания растений.

2.3. Условия проведения опытов.

2.4. Определение содержания МДА.

2.5. Определение содержания перекиси водорода.

2.6. Определение активности СОД.

2.7. Определение активности ПО.

2.8. Определение активности каталазы.

2.9. Определение эндогенного содержания пролина.

2.10. Определение активности пролиндегидрогеназы.

2.11. Определение эндогенного содержания полиаминов.

2.12. Определение содержания белка.

2.13. Методика нативного электрофореза СОД и ПО.

2.14. Ингибиторный анализ изоформ СОД.

2.15. Определение уровня транскрипции генов СОД.

2.16. Математическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Влияние различных доз УФ-В облучения на растения шалфея.

3.2. Влияние экзогенного пролина на содержание и спектр полиаминов и функционирование антиоксидантных ферментов в растениях шалфея в нормальных условиях и при УФ-В облучении.

3.3. Участие пролина в функционировании антиоксидантной защитной системы шалфея в модельном опыте с паракватом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие пролина в регуляции уровня полиаминов и функционирования антиоксидантных ферментов у растений Salvia officinalis L. при действии УФ-В облучения"

Действие абиотических стрессоров вызывает снижение продуктивности культурных и уменьшение биоразнообразия дикорастущих растений. Исследование клеточных и молекулярных механизмов, позволяющих растениям адаптироваться к действию неблагоприятных факторов внешней среды, является одной из фундаментальных проблем биологии в целом и физиологии растений в частности. Формирование адаптационного ответа растительного организма на действие абиотических стрессоров происходит в результате множественных метаболических изменений (Bouchereau et al., 1999; Zhu, 2001; Kavi Kishor et al., 2005; Kuznetsov, Shevyakova, 1999; 2007). Учитывая многообразие и сложность метаболических путей, ответственных за адаптацию растений, следует ожидать, что их регуляция является координированной. Для изучения такого типа регуляции особый интерес могут представлять пути метаболизма низкомолекулярных антиоксидантов -пролина и полиаминов.

В норме гомеостаз пролина и полиаминов у растений поддерживается сбалансированной системой их биосинтеза и деградации. Чаще всего, общим предшественником в их биосинтезе является глутамат. Глутамат превращается в пролин в результате протекания двух последовательных реакций, ключевым ферментом которых является А'-пиррол ин-5-карбоксилатсинтетаза. В биосинтезе полиаминов глутамат служит более отдаленным предшественником, превращающимся сначала в орнитин или ,аргинин. Образовавшиеся аминокислоты являются прямыми субстратами двух ферментов (орнитиндекарбоксилазы или аргининдекарбоксилазы), катализирующих биосинтез путресцина (Пут) — родоначальника высокомолекулярных полиаминов (спермидина (Спд) и спермина (Спм)). Несмотря на тесную взаимосвязь путей синтеза пролина и полиаминов, вопрос о возможности координированной регуляции метаболизма этих низкомолекулярных соединений, особенно в стрессорных условиях, остается дискуссионным.

В настоящее время все исследования, касающиеся изучения взаимодействия пролина и полиаминов, сосредоточены на изучении влияния полиаминов на содержание пролина (Aziz et al., 1998; Tonon et al., 2004). Исследование участия пролина в регуляции уровня полиаминов до настоящего времени не проводилось. Наименее изучено взаимодействие двух классов метаболитов в условиях УФ-В облучения, несмотря на то, что одним из ответов растений на УФ-В является интенсивная аккумуляция полиаминов, прежде всего Пут (Ракитин и др., 2009). Кроме того, основным повреждающим эффектом УФ-В облучения является образование активных форм кислорода (АФК), для нейтрализации которых растения используют низкомолекулярные соединения (в том числе, пролин и полиамины), а также специальные ферменты-антиоксиданты (Jenkins, 2009). В связи с тем, что пролин, полиамины и антиоксидантные ферменты являются компонентами одной антиоксидантной защитной системы, изменение внутриклеточного уровня пролина, возможно, модифицирует не только содержание и спектр полиаминов в клетке, но и функционирование антиоксидантных ферментов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать влияние различных доз УФ-В облучения на растения S. officinalis.

2. Изучить функционирование компонентов антиоксидантной защитной системы S. officinalis при УФ-В облучении.

3. Изучить действие УФ-В облучения на содержание и спектр свободных и конъюгированных полиаминов.

Научная новизна. Впервые показано, что пролин модифицирует процессы аккумуляции полиаминов как в оптимальных условиях выращивания растений, так и в стрессорных. Характер воздействия экзогенного пролина на содержание полиаминов определяется не только его концентрацией, но и продолжительностью действия на растение, органной спецификой объекта исследования, природой и интенсивностью стрессорного воздействия, а также соотношением свободных и конъюгированных форм полиаминов. Установлено, что пролин принимает участие в регуляции функционирования антиоксидантных ферментов при действии УФ-В облучения. Впервые показано, что пролин стабилизирует активность супероксиддисмутазы (СОД), вызывая появление дополнительных изоформ Fe-СОД и замедляя изменения в экспрессии генов, кодирующих изоформы СОД, а также снимает ингибирующий эффект УФ-В облучения на активность каталазы и ингибирует активность гваякол-зависимых пероксидаз (ПО). Впервые определены нуклеотидные последовательности центральных частей генов, кодирующих изоформы СОД в растениях шалфея, и показана их 80-93% идентичность с последовательностями генов-ортологов других видов растений.

Практическая значимость. Полученные в работе экспериментальные данные по изменению содержания пролина, полиаминов семейства Пут и активностей антиоксидантных ферментов у S. officinalis в условиях УФ-В облучения и при действии экзогенного пролина имеют существенное значение для понимания механизмов координированной регуляции антиоксидантов при адаптации растений к окислительному стрессу (ОС) и могут использоваться в разработке технологии создания трансгенных растений с повышенной устойчивостью к ультрафиолету. Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов страны.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на 11-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2007); 12-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); годичном собрании общества физиологов растений России и Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008); годичном собрании общества физиологов растений России и Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего севера» (Апатиты, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из которых 1 статья в рецензируемом журнале, и 1 работа направлена в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, включая 2 таблицы, 40 рисунков; библиография содержит 272 названия, из которых 248 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шашукова, Антонина Васильевна

выводы

1. Установлено, что окислительный стресс, развивающийся при УФ-В облучении, приводит к стимуляции антиоксидантной защитной системы, которая проявляется в повышении активности СОД и гваякол-зависимых пероксидаз, а также уровня внутриклеточного пролина и полиаминов.

2. Показано, что в растениях шалфея функционируют три типа изоформ одного из ключевых антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы: Мп-, Бе-, Си^п-содержащие СОД. При этом установлено, что наибольший вклад в общую (конститутивную и стресс-индуцируемую) активность СОД вносит Бе-содержащая изоформа фермента.

3. Проведена оценка уровня экспрессии генов трех изоформ СОД на уровне индивидуальных мРНК с помощью метода ОТ-ПЦР в растениях шалфея при УФ-стрессе. Сравнительный анализ динамики уровней мРНК и активностей различных изоформ СОД позволил высказать предположение, что регуляция активности СиУ^п- изоформы СОД при УФ-В облучении преимущественно происходила на транскрипционном уровне; Бе-СОД - на посттранскрипционном; Мп-СОД как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях.

4. Продемонстрировано, что экзогенный пролин участвует в регуляции функционирования антиоксидантных ферментов, стабилизируя активность СОД, вызывая появление дополнительных изоформ Бе-СОД и замедляя изменения в экспрессии генов СОД. Кроме того, пролин снимал ингибирующий эффект УФ-В облучения на активность каталазы и ингибировал активность гваякол-зависимой пероксидазы. Показано, что экзогенный пролин увеличивал содержание путресцина в листьях и в корнях растений шалфея при УФ-В облучении.

6. Установлено, что экзогенный пролин способен проявлять не только антиоксидантные, но и прооксидантные свойства. Проявление биологического эффекта пролина в нормальных условиях и при стрессе зависело от его внутриклеточной концентрации. Показано, что 30-кратное превышение уровня эндогенного пролина в корнях шалфея вызвало окислительный стресс, что проявилось в повышении содержания перекиси водорода, интенсивности перекисного окисления липидов и активности СОД.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в работе результаты по воздействию УФ-В облучения, параквата, экзогенного пролина и их совместного действия на растения шалфея {Salvia officinalis L.), позволили подтвердить гипотезу о существовании координированной регуляции метаболических путей при формировании адаптационного ответа и обсудить некоторые важные аспекты регуляции содержания пролина и полиаминов в нормальных и стрессорных условиях, а также участие пролина в регуляции активностей ферментов-антиоксидантов.

При проведении исследований в выше указанном направлении мы исходили из существующих представлений о том, что общим и начальным повреждающим эффектом действия различных стрессов, в том числе и УФ-В радиации, является развитие ОС (Asada, 1994; Matysik et al., 2002). Было установлено, что у шалфея в условиях УФ-В наблюдалась стресс-индуцируемая аккумуляция полиаминов и пролина (в 2 раза), повышалась активность СОД и ПО. Следует отметить также, что стресс-зависимые изменения в функционировании антиоксидантной системы происходили не только в листьях, непосредственно подвергавшиеся УФ-В облучению, но и в корнях. В общую активность СОД и в корнях и в листьях наибольший вклад вносили Fe- и Cu/Zn - СОД изоформы. Детоксикация образующейся перекиси водорода осуществлялась, прежде всего, ПО, а активность каталазы снижалась. Анализ экспрессии генов, кодирующих изоформы СОД, показал, что УФ-В облучение вызывало стресс-зависимые изменения не только на биохимическом уровне, но и на уровне экспрессии генов, кодирующих Cu/Zn- и Mn-СОД. При сопоставлении результатов нативного электрофореза и ОТ-ПЦР установлено, что регуляция активности Fe-СОД осуществляется на посттранскрипционном уровне, Cu/Zn-СОД - на транскрипционном, Мп-СОД - как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях.

Действие УФ-В вызывало индукцию синтеза Пут уже в первые сутки после облучения, а также аккумуляцию растворимых и связанных конюгатов полиаминов. При более высокой дозе облучения (20 мин) значительно снижалось содержание растворимых конъюгатов, что, возможно, указывает на активное их использование в процессе репарации.

Следует отметить, что изменения в содержании и спектре полиаминов предшествовали аккумуляции пролина, которая была незначительной и наблюдалась значительно позже. Более того, уровень пролина в листьях и корнях шалфея не достигал тех максимальных значений, которые характерны для действия других стрессоров, в том числе солевого, найденных у большинства растений, особенно у галофитов (Радюкина и др. 2007; Шевякова и др. 2009).

Важным результатом исследований является впервые установленные факты о том, что роль экзогенного пролина при действии УФ-В стресса проявлялась органоспецифично: в листьях как антиоксиданта, а в корнях как прооксиданта, что, возможно, зависило от значительного превышения его допустимой концентрации, специфичной для каждого вида растений, длительности воздействия стрессора и развития адаптационного процесса.

В листьях без облучения экзогенный пролин не вызывал изменений в содержании полиаминов. В то же время при облучении экзогенный пролин дополнительно стимулировал накопление полиаминов (Пут), увеличивая их содержание в 2 раза по сравнению с действием только УФ-В радиации. Полученные данные могут указывать на то, что накопление пролина и Пут в листьях в стрессорных условиях (в данном случае в присутствии повышенной УФ-В радиации) синергически действуют как антиоксид анты. Известно, что полиамины особенно в коньюгированной форме служат "ловушками" АФК (Bors et al., 1989; На et al., 1998; Kuznetsov, Shevyakova, 2007). Возможно, антиоксидантные свойства пролина проявляются в дополнительной активации биосинтеза полиаминов. Следует также отметить, что это косвенно могло свидетельствовать о том, что метаболические пути биосинтеза пролина и полиаминов строго координируются, и метаболические пересечения этих путей могут быть связаны с изменением окислительного статуса и только тогда, когда уровень УФ-В стресса являлся достаточно сильным. Стимуляция синтеза полиаминов могла происходить за счет вовлечения пролина в орнитиновый цикл митохондрий и активации биосинтеза Пут через орнитиндекарбоксилазный путь при деградации экзогенного пролина до глутамата.

В корнях, которые напрямую длительное время были связаны с высокой концентрацией пролина в питательной среде, проявилась его прооксидантная роль. В данном случае, можно предположить, что местом восприятия негативного сигнала при высокой концентрации пролина в корнях могла оказаться электрон-транспортная цепь митохондрий, которая нарушалась из-за активной деградации экзогенного пролина и образования синглетного кислорода и супероксид аниона НАО(Р)Н-оксидазой.

Установленная нами способность экзогенного пролина тормозить образование конъюгированных форм Спд и Спм может способствовать увеличению содержания свободных полиаминов и, таким образом, влиять на конкурентные отношения метаболических путей биосинтеза пролина и полиаминов за единый предшественник.

Совокупность представленных данных однозначно свидетельствует о том, что пролин модифицирует процессы аккумуляции полиаминов как в оптимальных условиях выращивания растений, так и в стрессорных. Характер воздействия пролина на баланс полиаминов определяется не только концентрацией первого, но и продолжительностью действия экзогенного пролина на растение, видоспецифичностью объекта исследования, природой и интенсивностью стрессорного воздействия, а также балансом свободных и конъюгированных форм полиаминов.

Продемонстрировано участие пролина в регуляции активности антиоксидантных ферментов. Возможно, образование координационных связей пролина с аминокислотными остатками полипептидных цепей ферментов может приводить как к стабилизации этих структур, так и изменять их конформацию, вызывая активацию или подавление их активности. Экзогенный пролин участвует в регуляции функционирования антиоксидантных ферментов, стабилизируя активность СОД, вызывая появление дополнительных изоформ Бе-СОД и замедляя изменения в экспрессии генов СОД. Кроме того, пролин снимает ингибирующий эффект УФ-В облучения на активность каталазы и ингибирует активность гваякол-зависимой пероксидазы. Влияние пролина на активность ферментов антиоксидантной защиты может быть связано с «тушением» им АФК и, как следствие, снижением их концентрации.

Таким образом, можно заключить, что пролин принимает участие в регуляции уровня полиаминов и функционирования антиоксидантных ферментов при действии УФ-В облучения. Проявление им антиоксидантных и прооксидантных свойств зависит от его внутриклеточной концентрации, действия стрессора и стадии адаптационного процесса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шашукова, Антонина Васильевна, Москва

1. Аронова Е.Е., Шевякова Н.И., Стеценко Л.А., Кузнецов Вл.В.2005) Индукция кадаверином экспрессии гена супероксиддисмутазы у растений Mesembryanthemum crystallinum L. Докл. АН, 403, 1-3.

2. Байкова Е.В. (2006) Род шалфей. Морфология, эволюция, перспективы интродукции. Новосибирск: Наука, 248 с.

3. Бараненко В.В. (2006) Супероксиддисмутаза в клетках растений. Цитология, 48, 465-474.

4. Бритиков Е.А., Мусатова H.A., Владимерцева С.В. (1965) О метаболизме пролина в подрастающей пыльце и тканях пестика. Физиология растений, 12, 953-957.

5. Бухов Н.Г. (2004) Динамическая световая регуляция фотосинтеза. Физиология растений, 51, 825-837

6. Заец В.Н., Карпов П.А., Смертенко П.С., Блюм Я.Б. (2006) Молекулярные механизмы устранения растениями повреждений ДНК ультрафиолетом. Цитология и генетика, 5, 40-68.

7. Зайцев Г.Н. (1984) Математическая статистика в экспериментальной ботанике. М.: Наука, 424 с.

8. Иванов Ю.В. (2008) Экспрессия генов ферментов биосинтеза полиаминов у галофитов и гликофитов при засолении и УФ-В облучении. Дисс. канд. биол. наук, Москва, 122 с.

9. Карташов A.B., Радюкина Н.Л., Иванов Ю.В., Пашковский П.П., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. (2008) Роль антиоксидантных систем при адаптации дикорастущих видов растений к солевому стрессу. Физиология растений, 55, 516-522.

10. Кузнецов Вл.В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И. (2006) Полиамины при стрессе: биологическая роль, метаболизм и регуляция. Физиология растений, 53, 658-683.

11. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. (1999) Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция. Физиология растений, 46, 321-336.

12. Полесская О.Г. (2007) Растительная клетка и активные формы кислорода. М.: КДУ, 140 с.

13. Прудникова О.Н. (2006) Этилен, АБК, полиамины при УФ-В стрессе у растений Arabidopsis thaliana: Автореф. дисс. канд. биол. наук, Москва, 24 с.

14. Радюкина H.JL, Карташов A.B., Иванов Ю.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл. В. (2007) Сравнительный анализ функционирования защитных систем у представителей галофитной и гликофитной флоры в условиях засоления. Физиология растений, 54, 902-912.

15. Радюкина H.JL, Шашукова A.B., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. (2008) Участие пролина в антиоксидантной защитной системе шалфея при действии NaCl и параквата. Физиология растений, 55, 721-730.

16. Ракитин В.Ю., Прудникова О.Н., Карягин В.В., Ракитина Т.Я., Власов П.В., Борисова Т.А., Новикова Г.В., Мошков И.Е. (2008) Выделение этилена, содержание АБК и полиаминов в Arabidopsis thaliana при УФ-В стрессе. Физиология растений, 55, 355-361.

17. Ракитин В.Ю., Прудникова О.Н., Ракитина Т.Я., Карягин В.В., Власов П.В., Новикова Г.В., Мошков И.Е. (2009) Взаимодействие этилена и АБК при регуляции уровня полиаминов у Arabidopsis thaliana во время УФ-В стресса. Физиология растений, 56, 163-170.

18. Ракова Н.Ю., Романов Г.А. (2005) Полиамины препятствуют проявлению первичных эффектов цитокининов. Физиология растений, 52, 59-67.

19. Садомов Н.Г. (2001) Возможная биологическая роль и характер взаимодействия этилена и полиаминов при адаптации растенийарабидопсиса к засолению и гипертермии. Дисс. канд. биол. наук, Москва, 143 с.

20. Соловченко А.Е., Мерзляк М.Н. (2008) Экранирование видимого и УФ излучения как механизм фотозащиты у растений. Физиология растений, 55, 803-822.

21. Шевякова Н.И. (1981) Метаболизм и физиологическая роль ди- и полиаминов в растениях. Физиология растений, 28, 1052-1061.

22. Шевякова Н.И. (1983) Метаболизм и физиологическая роль пролина при водном и солевом стрессе. Физиология растений, 30, 768-783.

23. Шевякова Н.И., Бакулина Е.А., Кузнецов Вл.В. (2009) Антиоксидантная роль пролина у галофита Mesembryanthemum crystallinum при действии засоления и параквата, инициирующих окислительный стресс. Физиология растений, 56, 736-742.

24. Шевякова Н. И., Рощупкин Б.В., Парамонова Н.В., Кузнецов Вл.В. (1994) Стрессовый ответ клеток Nicotiana sylvestris L. на засоление и высокую температуру. 1. Аккумуляция пролина, полиаминов, бетаинов и Сахаров. Физиология растений, 41, 558-565.

25. Ahmad J., Hellebust J.A. (1988) The relashionship between inorganic nitrogen metabolism and proline accumulation in osmoregulatory responses of two euryhaline microalgae. Plant Physiol., 88, 348-354.

26. Alexieva V., Sergiev I., Mapelli S., Karanov E. (2001) The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant Cell Environ., 24, 1337-1344.

27. Alia, Saradhi P.P., Mohanty P. (1993) Proline in relation to free radical production in seedlings of Brassica juncea raised under sodium chloride stress. Plant Soil, 155/156, 497-500.

28. Alia, Saradhi P.P., Mohanty P. (1997) Involvement of proline in protecting thylakoid membranes against free radical-induced photodamage. J. Photochem. Photobiol., 38, 253-257.

29. Alonso R., Elvira S., Castillo F.J., Gimeno B.S. (2001) Interactive effects of ozone and drought stress on pigments and activities of antioxidative enzymes in Pinus halepensis. Plant Cell Environ., 24, 905-916.

30. An L.Z., Liu G.X., Zhang M.X., Chen T., Liu Y.H., Feng H.Y., Xu S.J., Qiang W.Y., Wang X.L. (2004) Effect of enchanced UV-B radiation on polyamine content and membrane permeability in cucumber leaves. Russ. J. Plant Physiol., 51,658-662.

31. Angelini R., Federico R. (1990) Histochemical evidence of polyamine oxidation and generation of hydrogen peroxide in cell wall. J. Plant Physiol., 135, 212-217.

32. Asada K. (2006) Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and their functions. Plant Physiol., 141, 391-396.

33. Aziz A., Larher F. (1995) Changes in polyamine titers associated with the proline response and osmotic adjustment of rape leaf discs submitted to osmotic stress. Plant Sci., 112, 175-186.

34. Aziz A., Martin-Tanguy J., Larher F. (1998) Stress-induced changes in polyamine and tyramine levels can regulate proline accumulation in tomato leaf discs treated with sodium chloride. Physiol. Plant., 104, 195-202.

35. Bagni N., Pistocchi R. (1991) Uptake and transport of polyamine and inhibitors of polyamine metabolism in plants. In: Biochemistry and Physiology of Polyamines in Plants, Slocum R.D., Flores H.E. (eds). CRC Press Inc, Boca Raton, FL USA, pp. 105-120.

36. Bagni N., Tassoni A. (2001) Biosynthesis, oxidation and conjugation of aliphatic polyamines in higher plants. Amino Acids, 20, 310-317.

37. Bagni N., Torrigiani P.A., Barbieri P. (1981) Effect of varios inhibitors of polyamine synthesis on the growth of Heliantus tuberosus. Med. Biol., 59, 403-406.

38. Bais H.P., Ravishankar GA. (2002) Role of polyamines in the ontogeny of plants and their biotechnological applications. Plant Cell Tissue Organ Cult., 69, 1-34.

39. Balakrishnan V., Venkatesan K., Ravindran K.C., Kulandaivelu G.2005) Protective mechanism in UV-B treated Crotalaria juncea L. seedlings. J. Plant Sci., 41, 115-120.

40. Balestreri E., Cioni P., Romagnoli A., Bernini S., Fissi A., Felicioli R. (1987) Mechanism of polyamine inhibition of a leaf protease. Arch. Biochem. Biophys., 255, 460-463.

41. Barnes P.W., Searles P.S., Ballare C.L., Ryel M., Caldwell M.M. (2000) Non-invasive measurements of the epidermal transmittance of UV radiation using chlorophyll fluorescence: field and laboratory studied. Plant Physiol., 109, 274-283.

42. Barnes P.W., Shinkle J.R., Flint S.D., Ryel R.J. (2005) UV-B radiation, photomorphogenesis and plant-plant interactions. Ann. Bot., 66, 313-340.

43. Bartoli C.G., Yu J., Gomez F., Fernandez L., Mcintosh L., Foyer C.H.2006) Interrelationships between light and respiration in the control of ascorbic acid synthesis and accumulation in Arabidopsis thaliana leaves. J. Exp. Bot., 57, 1621-1631.

44. Basu R., Ghosh B. (1991) Polyamines in various rice genotypes with respect to NaCl salinity. Plant Physiol., 82, 575-581.

45. Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. (1973) Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil, 39, 205-207.

46. Beauchamp Ch., Fridovich I. (1971) Superoxide dismutase improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Anal. Biochem., 44, 276287.

47. Besford R.T., Richardson C.M., Campos J.L., Tiburcio A.F. (1993) Effect of polyamines on stabilization of molecular complexes of thylakoid membranes of osmotically stressed oat leaves. Planta, 189, 201-206.

48. Bieza K., Lois R. (2001) An Arabidopsis mutant tolerant to lethal ultraviolet-B levels shows constitutively elevated accumulation of flavonoids and other phenolics. Plant Physiol., 126, 1105-1115.

49. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. (2003) Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. Ann. Bot., 91, 179-194.

50. Borrell A., Besford R.T., Altabella T., Masgrau C., Tiburcio A.F. (1996) Regulation of arginine decarboxylase by spermine in osmotically-stressed oat leaves. Plant Physiol., 98, 105-110.

51. Bors W., Langebartels C., Michel C., Sandermann H. (1989) Polyamines as radical scavengers and protectans against ozone damage. Phytochemistry, 28, 1589-1595.

52. Bouchereau A., Aziz A., Larher F., Martin-Tanguy J. (1999) Polyamines and environmental challenges: recent development. Plant Sci., 140, 103-125.

53. Bowler C., Van Camp W., Van Montagu M., Inze D. (1994) Superoxide dismutase in plants. Crit. Rev. Plant Sci., 13, 199-218.

54. Bracale M., Levi M., Savini C., Dicarato N., Galli M.G. (1997) Water deficit in pea root tips: effects on the cell cycle and on production of dehydrin-like proteins. Ann. Bot., 79, 593-600.

55. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitations of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal Biochem., 72, 248-254.

56. Brennan T., Frenkel C. (1997) Involvement of hydrogen peroxide in the regulation of senescence in pear. Plant Physiol., 59, 411-416.

57. Britt A., May G.D. (2003) Re-engineering plant gene targeting. Trends Plant Sci., 8, 90-95.

58. Burkey K.O. (1999) Effects of ozone on apoplast: cytoplasm partitioning of ascorbic acid in snap bean. Physiol. Plant., 107, 188-193.

59. Bursell E., Slack E. (1976) Oxidation of proline by sarcosomes of the tsetse fly, Glossina morsitans. Insert Biochem., 6, 159-167.

60. Capell T., Bassie L., Christou P. (2004) Modulation of the polyamine biosynthetic pathway in transgenic rice confers tolerance to drought stress. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 10, 9909-9914.

61. Casati P., Walbot V. (2004) Rapid transcriptome responses of maize (Zea mays) to UV-B in irradiated and shielded tissues. Genome Biol., 5, 319-332.

62. Cechin I., Fumis T.F., Dokkedal A.L. (2007) Growth and physiological responses of sunflower plants exposed to ultraviolet-B radiation. Cienc. Rural, 37, 85-90.

63. Chang C.J., Kao C.H. (1997) Paraquat toxicity is reduced by polyamines in rice leaves. Plant Growth Regul., 22, 163-168.

64. Chattopadhayay M.K., Tiwari B.S., Chattopadhayay G., Bose A., Sengupa D.N., Ghosh B. (2002) Protective role of exogenous polyamines on salinity-stressed rice (Oryza sativa) plants. Plant Physiol., 116, 192-199.

65. Chen C.T., Chen L.M. Lin C.C., Kao C.H. (2001) Regulation of proline accumulation in detached rice leaves exposed to excess copper. Plant Sci., 160, 283-290.

66. Cockell C.S., Knowland J. (1999) Ultraviolet radiation screening compounds. Biol. Rev. City Coll, 74, 311-345.

67. Cohen S. S. (1990) The inlarging interest of polyamine studies. Abst. Int. Symp. Polyamines in molecular and medical biology. Kyoto, Japan, p. 18.

68. Cohen S.S. (1998) A guide to the polyamines. Oxford University Press, New York, p.231.

69. Cona A., Rea G., Angelini R., Federico R., Tavladoraki P. (2006) Function of amine oxidase in plant development and defence. Trends Plant Sci., 11, 80-88.

70. Costa H., Gallego S.M., Tomaro M.L. (2002) Effect of UV-B radiation on antioxidant defense system in sunflower cotyledons. Plant Sci., 162, 939945.

71. Cowley T., Walters D.R. (2005) Local and systemic changes in arginine decarboxylase activity, putrescine levels and putrescine catabolism in wounded oilseed rape. New Phytol., 165, 807-811.

72. D'Orazi D., Bagni N. (1987) In vitro interactions between polyamines and pectic substances. Biochem. Biophys. Res. Commun., 148, 1159-1163.

73. Dany A.-L., Douki T., Triantaphylides C., Cadet J. (2001) Repair of the main UV-induced thymine dimeric lesions within Arabidopsis thaliana DNA: evidence for the major involvement of photoreactivation pathways. J. Photochem. Photobiol., 16, 127-135.

74. Dat J.F., Pellinen R., Beeckman T., Van De Cotte B., Langebartels C., Kangasjarvi J., Inze D., Van Breusegem F. (2003) Changes in hydrogen peroxide homeostasis trigger an active cell death process in tobacco. Plant J., 33, 621-632.

75. Delauney A.J., Verma D.P.S. (1993) Proline biosynthesis and osmoregulation in plants. Plant J., 4, 215-223.

76. Demmig-Adams B., Adams W.W. (1992) III Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43, 599-626.

77. Demmig-Adams B., Adams W.W. (2006) III Photoprotection in an ecological context: the remarkadle complexity of thermal energy dissipation. New Phytol, 172, 11-21.

78. Demmig-Adams B., Gilmore A.M., Adams W.W. (1996) In vivo function of carotenoids in higher plants. FASEB J., 10, 403-413.

79. Dobrovinskaya O.R., Muniz J., Pottosin I. (1999a) Inhibition of vacuolar ion channels by polyamines. J. Membr. Biol., 167, 127-140.

80. Dobrovinskaya O.R., Muniz J., Pottosin I. (19996) Asymmetric block of the plant vacuolar Ca -permeable channel by organic cations. Eur. Biophys. J., 28, 552-563.

81. Dondini L., Seraflni-Fracassini D., del Duca S., Bregoli A.M., Tsolova M. (1994) Plant transglutaminasis. In: Polyamines: biological and clinical aspects, Caldare C.M., Clo C., Moruzzi M.S. (eds). Bologna: CLUEB, pp. 183-194.

82. Duan J., Li J., Guo S., Kang Y. (2008) Exogenous spermidine affects polyamine metabolism in salinity-stressed cucumis sativus roots and enhances short-term salinity tolerance. J. Plant Physiol., 165, 1620-35.

83. Durmus N., Kadioglu A. (2005) Spermine and putrescine enhance oxidative stress tolerance in maize leaves. Acta Physiol. Plant., 27, 515-522.

84. Elthon T. E., Stewart C.R. (1981) Submitochondrial location and electron transport characteristics of enzymes involved in proline oxidation. Plant Physiol, 67, 780-784.

85. Erdei L., Szegletes Z., Barabas K., Pestenacz A. (1996) Response in polyamine titer under osmotic and salt stress in sorghum and maize seedlings. Plant Physiol., 147, 599-603.

86. Esen A. A. (1978) Simple method for quantitative, semiquantitative, and qualitative assay of protein. Anal. Biochem., 89,264-273.

87. Fedina I.S., Georgieva K.M., Grigorova I.D. (2002) Light-dark changes in proline content of barley leaves under salt stress. Biol. Plant., 45, 59-63.

88. Fedina I.S., Georgieva K.M., Grigorova I.D. (2003) Response of barley seedlings to UV-B radiation as affected by proline and NaCl. Biol. Plant., 47, 549-554.

89. Feuerstein B.G., Pattabiraman N., Marton L.J. (1990) Molecular mechanisms of the interactions of spermine with DNA: DNA bending as a result of ligand bending. Nucleic Acids Res., 18, 1271-1282.

90. Ficker E., Taglialatella M., Wible B.A., Henley Ch.M., Brown A.M.1994) Spermine and spermidine as gating molecules for inward rectifier K+ channels. Plant Sci., 266, 1068-1071.

91. Flores H.E. (1991) Changes in polyamine metabolism in response to abiotic stress. In: The biochemistry and physiology of polyamines plants, Slocum R.D., Flores H.E. (eds). CRS Press, Boca Raton, pp. 214-255.

92. Flores H.E., Filner P. (1985) Polyamine catabolism in higher plants: characterization of pyrroline dehydrogenase. Plant Growth Regul., 3, 277291.

93. Flores H.E., Galston A.W. (1982) Analysis of polyamines in higher plants by performance liquid chromatography. Plant Physiol, 69, 701-706.

94. Foyer C.N., Noctor G. (2000) Oxygen processing in photosynthesis: regulation and signalling. New Phytol., 146, 359-388

95. Frohnmeyer H., Staiger D. (2003) Ultraviolet-B radiation-mediated responses in plants. Balancing damage and protection. Plant Physiol., 133, 1420-1428.

96. Frydman R.B., Gamarnik A. (1991) Cadaverine, an essential diamine for normal root development of germinating soybean (<Glycine max) seeds. Plant Physiol, 97, 778-785.

97. Fu J., Huang B. (2001) Involvement of antioxidants and lipid peroxidation in the adaptation of two cool-season grasses to localized drought stress. Environ. Exp. Bot., 45, 105-114.

98. Fuerst P.E., Nakatani H.Y., Dodge A.D., Penner D., Arntzen C.J. (1985) Paraquat resistance in Conyza. Plant. Physiol., 77, 984-989.

99. Fuhrer J., Kaur-Sawhney R., Shih L.M., Galston A.M. (1982) Effects of exogenous 1.3-diaminopropane and spermidine on senescence of oat leaves. Plant Physiol., 70, 1597-1600.

100. Galston A.W., Kaur-Sawhney R. (1995) Polyamines as endogenous growth regulators. In: Plant hormones: physiology, biochemistry and molecular biology. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. The Netherlands, pp. 158-178.

101. Galston A.W., Kaur-Sawhney R., Atabella T., Tiburcio A.F. (1997) Plant polyamines in reproductive activity and response to abiotic stress. Bot. Acta, 110,197-207.

102. Garufi A., Visconti S., Camoni L., Aducci P. (2007) Polyamines as physiological regulators of 14-3-3 interaction with the plant plasma memdrane if-ATPase. Plant Cell Physiol., 48, 434-440.

103. Gomez L., Vanacker H., Buchner P., Noctor G., Foyer C.H. (2004) The intercellular distribution of glutathione synthesis and its response to chilling inmaizq. Plant Physiol., 134, 1662-1671.

104. Groppa M.D., Benavides M.P. (2008) Polyamines and abiotic stress: recent advances. Amino Acids, 34, 35-45.

105. Groppa M.D., Benavides M.P., Tomaro M.L. (2003) Polyamines metabolism in sunflower and wheat leaf discs under cadmium or copper-stress. Plant Set, 164, 293-299.

106. Groppa M.D., Tomaro M.L., Benavides M.P. (2001) Polyamines as protectors against cadmium or copper-induced oxidative damage in sunflower leaf discs. Plant Sci., 161, 481-488.

107. Ha H.L., Sirisoma N.S., Kupptisamy P., Zweller J.L., Woster P.M., Casero R.A. (1998) The natural polyamine spermine functions as a free radical scavenger. Proc. Nat. Acad, Sci., USA, 95, 11140-11145.

108. Halliwell B. (2006) Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life. Plant Physiol., 141, 312-322.

109. Hanfrey C., Sommer S., Mayer M.J., Burtin D., Michael A.J. (2001) Arabidopsis polyamine biosynthesis: absence of ornitine decarboxylase and the mechanism of arginine decarboxylase activity. Plant J., 27, 551-560.

110. Hare P.D., Cress W.A. (1997) Metabolic, implications of stress-induced proline accumulation in plants. Plant Growth Regul., 21, 79-102.

111. He Y-Y., Hader D-P. (2002) Reactive oxygen species and UV-B: effect on cyanobacteria. J. Photochem. Photobiol., 1, 729-736.

112. Heath R.L., Packer L. (1968) Photoperoxidation in isolated cloroplasts. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch. Biochem. Biophys., 125, 189-198.

113. Heck D.E., Vetrano A.M., Mariano T.M., Laskin J.D. (2003) UV-B light stimulates production of reactive oxygen species. J. Biolog. Chem., 278, 22432-22436.

114. Heim W.G., Sykes K.A., Hildreth S.B., Sun J., Lu R-H, Jelesko J.G.2007) Cloning and characterization of a Nicotiana tobacum methylputrescine oxidase transcript. Phytochemistry, 68, 454-463.

115. Hellmann H., Funck D., Rentsch D., Frommer W.B. (2000) Hypersensitivity of an Arabidopsis sugar signaling mutant toward exogenous proline application. Plant Physiol, 122, 357—367.

116. Herminghaus S., Schreier P.H., McCarthy J.E.G., Landsmann J., Botterman J., Berlin J. (1991) Expression of bacterial lysine decarboxylase gene and transport of the protein into chloroplasts of transgenic tobacco. Plant Mol. Biol., 17, 475-486.

117. Hidema J., Kumagai T. (2006) Sensitivity of rice to ultraviolet-B radiation. Ann. Bot., 97, 933-942.

118. Huang A.H.C., Cavalieri A.J. (1979) Proline oxidase and water stress-induced proline accumulation in spinach leaves. Plant Physiol, 63, 531-535.

119. Iyer S., Caplan A. (1998) Products of proline catabolism can induce osmotically regulated genes in rice. Plant Physiol, 116, 203-211.

120. Janne J., Alholen L., Pietila M., Keinane T.A. (2004) Genetic approaches to the cellular functions of polyamines in mammals. Eur. J. Biochem., 271, 877-894.

121. Jansen M.A.K., Gaba V., Greenberg B.M. (1998) Higher plants and UV-B radiation: balancing damage, repair and acclimation. Trends Plant Sci., 3, 131-135.

122. Jenkins G.I. (2009) Signal transduction in responses to UV-B radiation. Annual Rev. Plant Biol, 60, 407-431.

123. Jithesh M.N., Prashanth S.R., Sivaprakash K.R., Parida A.K. (2006) Antioxidative response mechanisms in halophytes: their role in stress defense. J. Genet., 85, 237-254.

124. Jovanovic Z.C., Milosevic J.D., Radovic S.R. (2006) Antioxidative enzymes in the response of buckwheat (Fagopyrum esculentum moench) to ultraviolet B radiation. J. Agrie. Food Chem., 54, 9475-9478.

125. Kakkar R.K., Sawney V.K. (2003) Polyamine research in plants — a changing perspective. Physiol. Plant., 116, 281-292.

126. Kao C.H. (1997) Physiological significance of stress-induced changes in polyamines in plants. Bot. Bull. Acad. Sin., 38, 141-144.

127. Kaul S., Sharma S.S., Mehta I.K. (2008) Free radical scavenging potential of L-proline: evidence from in vitro assays. Amino Acids, 34, 315-320.

128. Kaur-Sawhney R., Flores H.E., Galston A. W. (1981) Polyamine oxidase in oat leaves: a cell wall localized enzymes. Plant Physiol., 68, 494-498.

129. Kaur-Sawhney R., Tiburcio A.F., Atabella T., Galston A. W. (2003) Polyamines in plants: an overview. J. Mol. Cell Biol., 2, 1-12.

130. Kavi Kishor P.B. (1989) Salt stress in cultured rice cells: effects of proline and abscisic acid. Plant Cell Environ., 12, 629-633.

131. Kavi Kishor P.B., Hong Z., Miao G.-H., Hu C.-A.A., Verma D.P.S. (1995) Overexpression of pirroline-5-carboxilate synthetase increase proline production and confer osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol., 108,1387-1394.

132. Kilian J., Whitehead D., Horak J., Wanke D., Weinl S. (2007) The AtGenExpress global stress expression data set: protocols, evaluation and model data analysis of UV-B light, drought and cold stress responses. Plant J., 50,347-363.

133. Kim C.S., Jung J. (1995) Inactivation of the respiratory chain in plant mitochondria by visible light: the primary target for damage and endogenous photosensitizing chromophores. J. Photochem. PhotobioL, 29, 135-139.

134. Kim T.E., Kim S.K., Han T.J., Lee J. S., Chang S.C. (2002) ABA and polyamines act independently in primary leaves of cold-stressed tomato (Lycopersicon esculentum). Plant Physiol., 115, 370-376.

135. Kliebenstein D.J., Monde R-A., Last R.L. (1998) Superoxide dismutase in Arabidopsis: an eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization. Plant Physiol., 118, 637-650.

136. Kohl D.H., Kennelly E.J., Zhu Y., Schubert K.R., Shearer G. (1991) Proline accumulation, nitrogenase (C2H2 reducing) activity and activities of enzymes related to proline metabolism in drought-stressed soybean nodules. J. Exp. Bot., 42, 831-837.

137. Kohl D.H., Schubert K.R., Carter M.B., Hagedorn C.H., Shearer G.1988) Proline metabolism in N2- fixing root nodules: energy transfer and regulation of purine synthesis. Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 85, 2036-2040.

138. Kondo N., Kawashima M. (2000) Enchancement of the tolerance to oxidative stress in cucumber (Cucumis sativus L.) seedlings by UV-B irradiation: possible involvement of phenolic compounds and antioxidative enzymes. J. Plant. Res., 113, 311-317.

139. Kramer G.F., Norman H.A., Krizek D.T., Mirecki R.M. (1991) Influence of UV-B radiation on polyamines, lipid peroxidation and membrane lipids in cucumber. Phytochemistry, 30, 2101-2108.

140. Krapp A., Hofmann B., Schafer C., Stitt M. (1993) Regulation of the expression of rbcS and other photosynthetic genes by carbohydrates: A mechanism for the sink regulation of photosynthesis. Plant J., 3, 817-828.

141. Krishnamurthy R., Bhagwat K.A. (1989) Polyamines as modulators of salt tolerance in rice cultivars. Plant Physiol., 91, 500-504.

142. Kurepa J., Smalle J., Montagu V.M., Inze D. (1998) Polyamines and paraquat toxicity in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol., 39, 987-992.

143. Kusano T., Berberich T., Tateda C., Takahashi Y. (2008) Polyamines: essential factors for growth and survival. Planta, 228, 367-381.

144. Kusano T., Yamaguchi K., Berberich T., Takahashi Y. (2007) Advances in polyamine research in 2007. J Plant Res., 120, 345-350.

145. Kuthanova A., Gemperlova L., Zelenkova S., Eder J., Machackova I., Opatrny Z., Cvikrova M. (2004) Cytological changes and alterations in polyamine contents induced by cadmium in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. Biochem., 42, 149-156.

146. Kuznetsov VI.V., Rakitin V.Yu., Zholkevich V.N. (1998) Interaction of heat shock and drought stress in plants. In: Responses of plant metabolism to air pollution, De Kok L.J., Stulen I. Leiden (eds). The Netherlands: Backhuys Publ. pp. 359-366.

147. Kuznetsov VI.V., Shevyakova N.I. (2007) Polyamines and stress tolerance of plants. Plant Stress, 1, 50-71.

148. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. Nature, 227, 680-685.

149. Langebartels C., Kerner K. J., Leonardi S., Schraudner M., Trost M., Heller W., Sandermann H. Jr. (1991) Biochemical plant responses to ozone. I. Differential induction of polyamine and ethylene biosynthesis in tobacco. Plant Physiol, 95,882-889.

150. Larher F., Aziz A., Deleu C., Lemesle P., Ghaffar A., Bouchard F., Plasman M. (1998) Suppression of the osmoinduced proline response of rapeseed leaf discs by polyamines. Plant Physiol., 102, 139-147.

151. Legocka J., Zaichert J. (1999) Role of spermidine in the stabilization of apoprotein of the light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex of Photosystem II during leaf senescence process. Acta Physiol. Plant., 21, 127-137.

152. Li Z.Y., Chen S.Y. (2000) Differential accumulation of the S-adenosylmethionine decarboxylase transcript in rice seedlings in response to salt and drought stresses. Theor. Appl. Genet., 100, 782-788.

153. Lindahl T. (1993) Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature, 362, 709-715.

154. Liu K., Fu H., Bei Q., Luan S. (2000) Inward potassium channel in guard cell as a target for polyamine regulation of stomatal movements. Plant Physiol., 124, 1315-1326.

155. Logan B.A., Kornyeyev D., Hardison J., Holaday A.S. (2006) The role of antioxidant enzymes in photoprotection. Photosyn. Res., 88, 119-132.

156. Lutts S., Guerrier G. (1995) Peroxidase activities of two rice cultivars differing in salinity tolerance as affected by proline and NaCI. Biol. Plant., 37, 577-586.

157. Lutz C., Navakoudis E., Seidlitz H.K., Kotzabasis K. (2005) Simulated solar irradiation with enchanced UV-B adjust plastid and thylakoid-associated polyamine changes for UV-B protection. Biochim. Biophys. Acta, 1710,24-33.

158. Mackerness S.A.-H. (2000) Plant responses to ultraviolet-B (UV-B: 280320 nm) stress: What are the key regulators? Plant Growth Regul., 32, 2739.

159. Mackerness S.A.-H., John C.F., Jordan B., Thomas B. (2001) Early signaling components in ultraviolet-B responses: distinct roles for different reactive oxygen species and nitric oxide. FEBS Lett., 489, 237-242.

160. Maehly A.C., Chance B. (1954) The assay of catalases and peroxidases. In: Methods of Biochemical Analysis, Glick D. (eds.). Interscience, New York, pp. 357-408.

161. Martin-Tanguy J. (2001) Metabolism and function of polyamines in plants: Recent development (new approaches). Plant Growth Regul., 34, 135-148.

162. Mattioni C., Lacerenza N.G., Troccoli A., De Leonardis A.M., Di Fonzo N. (1997) Water and salt stress-induced alterations in proline metabolism of tritictim durum 1. seedlings. Plant Physiol., 101, 787-792.

163. Matysik J., Alia, Bhalu B., Mohanty P. (2002) Molecular mechanisms of quenching of reactive oxygen species by proline under stress in plants. Curr. Sci., 82, 525-532.

164. Minocha R., Minocha S.C., Long S. (2004) Polyamines and their biosynthetic enzymes during somatic embryo development in red spruce {Picea rubens Sarg.) In vitro Cell. Dev. Biol., 40, 572-580.

165. Mpoloka S.W. (2008) Effects of prolonged UV-B exposure in plants. Afr. J. Biotechnol., 7, 4874-4883.

166. Navakoudis E., Vrentzou K., Kotzabasis K. (2007) A polyamine- and LHCII protease activity-based mechanism regulates the plasticity and adaptation status of the photosynthetic apparatus. Biochim. Biophys. Acta, 1767, 261-271.

167. Nayyar H. (2005) Putrescine increases floral retention, pod set and seed yield in cold stressed chickpea. J. Agron. Crop Sci., 191, 340-345.

168. Nayyar H., Chander S. (2004) Protective effects of polyamines against oxidative stress induced by water and cold stress in chickpea. J. Agron. Crop Sci., 190, 355-365.

169. Nicolopoulos D., Manetas Y. (1991) Compatible solutes and in vitro stability of Salsola soda enzymes: proline incompatibility. Phytochemistry, 30,411-413.

170. Niyogi K. (1999) Photoprotection revisited: genetic and molecular approaches. Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50, 333-359.

171. Noctor G., Arisi A.-C.M., Jouanin L., Kunert K.J., Rennenberg H., Foyer C.Y. (1998) Glutathione: biosynthesis, metabolism and relationship to stress tolerance explored in transformed plants. J. Exp. Bot., 49, 623-647.

172. Ozturk L., Demir Y. (2002) In vivo and in vitro protective role of proline. Plant Growth Regul., 38, 259-264.

173. Ozturk L., Demir Y. (2003) Effect of putrescine and ethephon on some oxidative stress enzyme activities and proline content in salt stressed spinach leaves. Plant Growth Regul., 40, 89-95.

174. Parvanova D., Ivanov S., Konstantinova T., Karanov E., Atanassov A., Tsvetkov T. (2004) Transgenic tobacco plants accumulating osmolytes show reduced oxidative damage under freezing stress. Plant Physiol. Biochem., 42, 57-63.

175. Perez-Amador M.A., Leon J., Green P.J., Carbonell J. (2002) Induction of the arginine decarboxylase ADC2 gene provides evidence for the involvement of polyamines in the wound response in Arabidopsis. Plant Physiol, 130, 1454-1463.

176. Pfeifer G.P., Drouin R., Riggs A.D., Holmquist G.P. (1992) Binding of transcription factors creates hot spots for UV photoproducts in vivo. Mol Cell Biol, 12, 1798-1803.

177. Phang J.M. (1985) The regulatory functions of proline and A1- pyrroline-5-carboxylic acid. Curr. Top. Cell. Regul., 25, 91-132.

178. Pierantonio Pesci, Remo Reggiani (2006) The process of abscisic acid-induced proline accumulation and the levels of polyamines and quaternary ammonium compounds in hydrated barley leaves. Plant Physiol., 84, 134139.

179. Pistocchi R., Bagni N. (1990) Effect of calcium on spermine uptake in carrot cell cultures and protoplasts. J. Plant Physiol., 136, 728-733.

180. Poduslo J.F., Curran G.L. (1996) Increased permeability of superoxide dismutase at the blood-nerve and blood-brain barriers with retained enzymatic activity after covalent modification with naturally occurring putrescine. J. Neurochem., 61, 734-741.

181. Rajendrakumar C.S.V., Reddy B.V.D., Reddy A.R. (1994) Prolineprotein interactions: protection of structural and functional integrity of M4 lactate dehydrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 957-963.

182. Ranieri A., Petacco F., Castagna A., Franco Soldatini G. (2000) Redox state and peroxidase system in sunflower plants exposed to ozone. Plant Set, 159, 159-167.

183. Rao V.M., Paliyath G., Ormrod P.D. (1996) Ultraviolet-B- and ozone-induced biochemical changes in antioxidant enzymes of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol., 110, 125-136.

184. Rayapati P.J., Stewart C.R. (1991) Solubilization of a proline dehydrogenase from maize {Zea mays L.) mitochondria. Plant Physiol., 95, 787-791.

185. Ridge I., Osborne D.J. (1971) Role of peroxidase when hydroxyproline-rich protein in plant cell wall is increased by ethylene. Nature, 229, 205-208.

186. Rio L.A., Pastori G.M., Palma J.M., Sandalio L.M., Sevilla F., Corpas F.J., Jimenez A., Lopez-Huertas E., Hernandez J.A. (1998) The activated oxygen role of peroxisomes in senescence. Plant Physiol., 116, 1195-1200.

187. Roy P., Niyogi K., SenGupta D.N., Ghosh B. (2005) Spermidine treatment to rice seedlings recovers salinity stress induced damage of plasma membrane and PM-bound H+-ATPase in salt-tolerant and salt-sensitive rice cultivars. Plant Sci., 168, 583-591.

188. Ruiz J.M., Sanchez E., Garcia P., Lopez-Lefebre L.R., Rivero R.M., Romero L. (2002) Proline metabolism and NAD kinase activity in green bean plants subjected to cold-shock. Phytochemistry, 59, 473-478.

189. Samuel D., Kumar R. K.S., Jayaramoan G., Yang P.W., Yu C. (1997) Proline is a protein solubilizing solute. Biochem. Mol. Biol. Int., 41, 235242.

190. Sancar A., Lindsay-Boltz L.A., Unsal-Kacmaz K., Linn S. (2004) Molecular mechanism of DNA repair and the DNA damage checkpoints. Annu. Rev. Biochem., 73, 39-85.

191. Sancar A., Sancar G.B. (1998) DNA repair enzymes. Annu. Rev. Biochem., 57,29-67.

192. Saradhi A., Saradhi P.P. (1991) Proline accumulation under heavy metal stress. Plant Physiol., 138, 554-558.

193. Saradhi P.P., Arora S., Prasad V.V.S.K. (1995) Proline accumulation in plants exposed to UV radiation protects them against induced peroxidation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 290, 1-5.

194. Savoure A., Jaoua S., Hua X.J., Ardiles W., Van Montagu M., Verbruggen N. (1995) Isolation, characterization and chromosomal location of a gene encoding the A'-pyrroline-5-carboxylate synthetase in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett., 372, 13-19.

195. Scalet M., Federico R., Guido M.C., Manes F. (1995) Peroxidase activity and polyamine changes in response to ozone and stimulated acid rain in Aleppo pine needles. Environ. Exp. Bot., 35, 417-425.

196. Scebba F., Pucciarelli L, Soldatini G. F., Ranieri A. (2003) 03 induced changes in the antioxidant systems and their relationship to different degrees of susceptibility of two clover species. Plant Sci., 165, 583-593.

197. Scharer O.D. (2003) Chemistry and biology of DNA repair. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 42, 2946-2974.

198. Schobert B., Tschesche H. (1978) Unusual solution properties of proline and its interaction with proteins. Biochem. Biophys. Acta, 541, 270-277.

199. Schwab K.B., Gaff D.F. (1990) Influence of compatible solutes on soluble enzymes from desiccation -tolerant Sporobolus stapfians and desiccation — sensitive Sporobolus pyramidalis. Plant Physiol., 137, 208-211.

200. Sebela M., Radova A., Angelini R., Tavladoraki P., Frebort I., Pec P. (2001) FAD-containing polyamine oxidase: a timely challenge for researchers in biochemistry and physiology of plants. Plant Sci., 160, 197207.

201. Seiler N., Raul F. (2005) Polyamines and apoptosis. Cell Mol. Med., 9, 623642.

202. Sells D.D., Koeppe D.E. (1981) Oxidation of proline by mitochondria isolated from water-stressed maize shoots. Plant Physiol., 68, 1058-1061.

203. Sfichi L., Ioannidis N., Kotzabasis K. (2004) Thylakoid-associated polyamines adjust the UV-B sensitivity of the photosynthetic apparatus by means of light-harvesting complex II changes. J. Photochem. Photobiol., 80, 499-506.

204. Shen B., Jensen R.C., Bohnert H.J. (1997) Mannitol protects against oxidation by hydroxyl radicals. Plant Physiol., 115, 527-532.

205. Shen W., Nada K., Tachibana S. (2000) Involvement of polyamines in the chilling tolerance of cucumber cultivars. Plant Physiol., 124,431-439.

206. Shevyakova N. I., Rakitin V.Yu., Dam B.D., Sadomov N.G., Kuznetsov VI.V. (2001) Heat-shock induced cadaverine accumulation and translocation throughout the plant. Plant Sci., 161, 1125-1133.

207. Simon Sarkadi L., Kocsy G., Varhegyi A., Galiba G., de Ronde J.A.2006) Effect of drought stress at supraoptimal temperature on polyamine concentrations in transgenic soybean with increased proline levels. Z. Naturforsch., 61, 833-839.

208. Siripornadulsil S., Train S., Verma d.P.S., Sayre R.T. (2002) Molecular mechanisms of proline mediated tolerance toxic heavy metals in transgenic microalgae. Plant Cell., 14, 2837-2847.

209. Slocum R.D. (1991a) Tissue and subcellular localisation of polyamines and enzymes of polyamine metabolism. In: Biochemistry and Physiology of Polyamines in Plants, Slocum R.D. and Flores H.E. (eds). CRC Press, Boca Raton, FL, USA, pp. 93-103.

210. Slocum R.D. (19916) Polyamine biosynthesis in plants. In: Biochemistry and Physiology of Polyamines in Plants, Slocum R.D., Flores H.E. (eds). CRC Press, Boca Raton, FL, USA, pp. 22-40.

211. Slocum R.D., Furey M.J. (1991) Electron-microscopic cytochemical localization of diamine and polyamine oxidases on pea and maize tissues. Planta, 183,443-450.

212. Slocum R.D., Galston A.W. (1985) Changes in polyamine biosynthesis associated with post-fertilization growth and development in tobacco ovary tissue. Plant Physiol., 79, 336-343.

213. Smirnoff N. (2000) Ascorbate biosynthesis and function in photoprotection. Philos. Trans. R. Soc. Lond. A, 355, 1455-1464.

214. Smirnoff N., Cumes Q.J. (1989) Hydroxyl radicals scavenging activity of compatible solutes. Phytochemistry,. 28, 1057-1059.

215. Smith J., Burrit D., Bannister P. (2001) Ultraviolet-B radiation leads to a reduction in free polyamines in Phaseolns vulgaris L. Plant Growth Regul., 35, 289-294.

216. Smith T.A., Marshall J.H.A. (1988) The di and polyamine oxidases of plants. In: Progress in Polyamine Research (Advances in Experimental

217. Biology and Medicine, 250), Plenum Press, New York, pp. 573-587.

218. Smith T.A., Wilshire G. (1975) Distribution of cadaverine and other amines in higher plants. Phytochemistry, 14, 2341-2346.

219. Stapleton A.E. (1992) Ultraviolet radiation and plants: Burning questions. Plant Cell, 4, 1353-1358.

220. Stewart C., Boggess S., Aspinall D., Paleg L. (1997) Inhibition of proline oxidation by water stress. Plant Physiol., 59, 930-932.

221. Tabor C.W., Tabor H. (1984) Polyamines. Annu. Rev. Biochem., 53, 749790.

222. Takahashi Y., Berbirich T., Miyazaki A., Seo S., Ohashi Y., Kuzano T.2003) Spermine signalling in tobacco: activation of mitogen-activated protein kinases by spermine is mediated through mitochondrial dysfunction. Plant J., 36, 820-829.

223. Tang C.F., Liu Y.G., Zeng G.M., Li X., Xu W.H., Li C.F., Yuan X.Z. (2005) Effects of exogenous spermidine on antioxidant system responses of Typha latifolia L. under Cd2+ stress. J. Integr. Plant Biol., 47, 428-434.

224. Taylor C.B. (1996) Proline and water deficit: ups, down, ins and outs. Plant Cell, 8, 1221-1224.

225. Thomas J.C., Mcelwain E.F., Bohnert H.J. (1992) Convergernt induction of osmotic stress-responses: abscisic acid, cytokinin and the effects of NaCl. Plant Physiol., 100,416-423.

226. Thomas T., Thomas T.J. (2001) Polyamines in cell growth and cell death: molecular mechanisms and therapeutic applications. Cell Mol. Life Sci., 58, 244-258.

227. Thompson J.F. (1980) Arginine synthesis, proline synthesis and related processes. In: The Biochemistry of Plants, Stumpf P. and Conn E.E. (eds). New York: Academic Press, pp. 375-402.

228. Tian X.R., Lei Y.B. (2007) Physiological responses of wheat seedlings to drought and UV-B radiation. Effect of exogenous sodium nitroprusside application. Rus. J. of Plant Physiol., 54, 676-682.

229. Tiburcio A.F., Besford R.T., Capell T., Borell A., Testillano P.S., Risueño M.C. (1994) Mechanisms of polyamine action during senescence responses induced by osmotic stress. J. Exp. Bot., 45, 1789-1800.

230. Tonon G., Kevers C., Faivre-Rampant O., Graziani M., Gaspar T. (2004) Effect of NaCl and mannitol iso-osmotic stresses on proline and free polyamine levels in embryogenic Fraxinus angustifolia callus. J. Plant Physiol., 161, 701-708.

231. Torrigiani P., Altamura P.P., Pasqua S., Moncelli B., Seratini-Fracassini D., Bagni N. (1987) Free and conjugated polyamines during de novo floral and vegetative bud formation in thin cell layers of tobacco. Physiol. Plant., 70, 453-460.

232. Torrigiani P., Scoccianti V. (1995) Regulation of cadaverine and putrescine levels in different organs of chick-pea seed and seedlings during germination. Plant Physiol., 93, 512-518.

233. Torrigiani P., Serafini-Fracassini D., Biondi S., Bagni N. (1986) Evidence for the subcellular localization of polyamines and their biosynthetic enzymes in plant cells. J Plant Physiol, 124, 23-29.

234. Tun N.N., Santa-Catarina C., Begum T., Silveira V., Handro W., Floh E.I., Scherer G.F. (2006) Polyamines induce rapid biosynthesis of nitric oxide (NO) in Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Cell Physiol., 47, 346354.

235. Tuteja N., Singh B.M., Misra M.C., Bhalla P.L., Tuteja R. (2001) Molecular mechanism of DNA damage and repair: progress in plants. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol, 36, 337-397.

236. Van Buuren M.L., Guidi L., Fornale S., Ghetti F., Franceschetti M., Soldatini G.F., Bagni N. (2002) Ozone-response mechanisms in tobacco: implication of polyamine metabolism. New Phytol., 156, 389-398.

237. Venekamp J.H., Lampe J.E.M., Koot J.T.M. (1989) Organic acids as sourses of drought-induced proline synthesis in field bean plants Vieia faba L. Plant Physiol, 133, 654-659.

238. Verbruggen N., Hermans C. (2008) Proline accumulation in plants: a review. Amino Acids, 35, 753-759.

239. Verbruggen N., Hua X.-J., May M., Van Montagu M. (1996) Environmental and developmental signals modulate proline homeostasis: evidence for a negative transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 8787-8791.

240. Wada Y., Miyamoto T., Kusano T., Sano H. (2004) Assosiation between up-regulation of stress-responsive genes and hypomethylation of genomic DNA in tobacco plants. Mol. Genet. Genomics, 271, 658-666.

241. Waiden R., Cordeiro A., Tiburcio A.F. (1997) Polyamines: Small molecules triggering pathways in plant growth and development. Plant Physiol, 113, 1009-1013.

242. Walton E.F., Clark C.J., Boldingh H.L. (1991) Effect of hydrogen cyanamid on amino acid profiles in kiwifruits buds during bud break. Plant Physiol, 97, 1256-1259.

243. Wang X., Shi G., Xu Q., Hu J. (2007) Exogenous polyamines enhance copper tolerance of Nymphoides peltatum. Plant Physiol., 164, 1062-1070.

244. Waterworth W.M., Jiang Q., West C.E., Nikaido M., Brays C.M. (2002) Characterization of Arabidopsis photolyase enzymes and analysis of their role in protection from ultraviolet-B radiation. J. Exp. Bot., 53, 1005-1015.

245. Wu G., Bazer F.W., Datta S., Johnson G.A., Li P., Satterfield M.C., Spencer T. E. (2008) Proline metabolism in the conceptus: implications for fetal growth and development. Amino Acids, 35, 691-702.

246. Xiong L., Zhu J.K. (2002) Salt tolerance. In: The Arabidopsis Book, Meyerowitz E.M., Somerville C.R. (eds.), American Society of Plant Biologists, Rockville, MD, USA, pp. 1-22.

247. Yamaguchi K., Takahashi Y., Berberich T., Imai A., Takahashi T., Michael A., Kusano T. (2007) A protective role for the polyamine spermine against drought stress in Arabidopsis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 352, 486-490.

248. Yamasaki H., Cohen M.F. (2006) NO signal at the crossroads: polyamine-induced nitric oxide synthesis in plants? Trends Plant Sci., 11, 522-524.

249. Ye B., Muller H., Zhang J., Gressel J. (1997) Constitutively elevated levels of putrescine and putrescine-generating enzymes correlated with oxidant stress resistance in Coniza bonariensis and wheat. Plant Physiol., 115, 1443-1451.

250. Yokota A., Takahara K., Akashi K. (2006) Water Stress. In: Physiology and Molecular Biology of Stress Tolerance in Plants, Madhava Rao K.V., Raghavendra A.S, Junardhan Reddy K. (eds). The Netherlands: Springer, pp. 15-40.

251. Youn H.-D., Kim E.-J., Roe J.H., Hah Y.C., Kang S.-O. (1996) A novel nickel-containing superoxide dismutase from Streptomyces spp. Biochemistry, 318, 889-896.

252. Zacchini M, Marotta A, de Agazio M. (1997) Tolerance to salt stress inmaize callus lines with different polyamine content. Plant Cell Rep., 17, 119-122.

253. Zacchini M., de Agazio M. (2004) Spread of oxidative damage and antioxidative response through cell layers of tobacco callus after UV-C treatment. Plant Physiol Biochem., 41, 445-450.

254. Zhang C.S., Lu Q., Verma D.P.S. (1995) Removal of feedback inhibition of P5CS, a Afunctional enzyme catalyzing the first two steps of proline biosynthesis in plants. J. Biol. Chem., 270, 20491-20496.

255. Zhu J.-K. (2001) Plant Salt Tolerance. Trends Plant Sci., 6, 66-71.

Информация о работе

Шашукова, Антонина Васильевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.12

Диссертация

Участие пролина в регуляции уровня полиаминов и функционирования антиоксидантных ферментов у растений Salvia officinalis L. при действии УФ-В облучения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы