Аккумуляция кадаверина и его физиологическая роль при действии солевого стресса

Шорина, Марина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аккумуляция кадаверина и его физиологическая роль при действии солевого стресса
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Аккумуляция кадаверина и его физиологическая роль при действии солевого стресса"

На правахрукописи

ШОРИНА Марина Владимировна

АККУМУЛЯЦИЯ КАДАВЕРИНА И ЕГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПРИ ДЕЙСТВИИ СОЛЕВОГО СТРЕССА

03.00.12 - «физиология и биохимия растений»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярных и физиологических механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Шенякова Нина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАЕН Обручева Наталья Владимировна кандидат биологических наук, доцент Пильщикова Наталия Владимировна

Ведущая организация: Вологодский Государственный Педагогический Университет, естественно-географический факультет

Защита состоится 26 апреля 2005 г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного совета К 002.210.01 при Институте физиологии растений им. КА. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (095) 977 8018, e-mail: llr@ippras.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. КА Тимирязева РАН.

Автореферат разослан/Гмарта 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время во многих лабораториях мира ведутся интенсивные исследования в области адаптации растительных организмов к неблагоприятным факторам окружающей среды, в том числе к одному из главных абиотических стрессоров - засолению. Большой интерес вызывает участие полиаминов в стресс-реакциях и адаптации растений к экстремальным условиям среды. Во многих работах показано, что полиамины в условиях адаптационного процесса проявляют защитные свойства (Galston et al., 1997; Bouchereau et al., 1999). При этом обращает на себя внимание тот факт, что в основном исследуется метаболизм и биологическая роль полиаминов семейства путресцина (путресцин, спермидин, спермин).

Гораздо менее изученным полиамином следует признать кадаверин. По сравнению с путресцином и его производными (спермидин и спермин) специальные исследования по аккумуляции кадаверина при действии на растения абиотических стрессоров практически не проводились. Только спорадически единичные сведения об его аккумуляции в растениях в стрессорных условиях можно встретить в публикациях.

Известно, что регуляция полиаминами физиологических процессов осуществляется в тесном взаимодействии с этиленом. Подавляющая часть проведенных в этом направлении исследований также касается лишь полиаминов семьи путресцина, что вполне естественно, поскольку у этих полиаминов с этиленом имеется общий предшественник - S-аденозилметионин (SAM) (Altaian, 1986; Kaur-Sawhney, 1995).

В подобных исследованиях практически не уделялось внимания кадаверину, хотя процессы биосинтеза этилена, полиаминов (спермидина и спермина) и кадаверина косвенно связаны, поскольку кадаверин образуется в боковом ответвлении аспартатного пути, ведущего к биосинтезу метионина и SAM.

Тем не менее, в ряде работ еще в 90-е годы было установлено необычное поведение кадаверина в отношении этилена и полиаминов группы путресцина у

некоторых кадаверин-содержащих видов растений (Лре1Ъаиш Ы а1., 1985; БакЬатйЬуШ ег а1., 1985; ¡секоп ег а1., 1986). Недавно в ряде исследований (Дам, 1999; Китежу ег а1., 2000; Кузнецов и др., 2000; 8Иеууакоуа ег а1., 2001; Кшпезоу ег а1., 2002) был обнаружен необычный характер взаимодействия кадаверина и этилена у хрустальной травки в условиях теплового шока, который являлся не конкурентным, как в случае со спермидином, а скорее синергическим. Хрустальная травка отвечала на тепловой шок транзиторным выделением этилена и последующей межорганной транслокацией кадаверина, что могло быть связано с процессами адаптации и выживания растений в экстремальных условиях.

Однако, особенности аккумуляции кадаверина при действии других абиотических стрессоров, в частности засоления, а также характер отношений между кадаверином и этиленом в этих условиях, в настоящее время практически не изучены. Не выяснена также биологическая роль кадаверина при стрессе. Изучение данных вопросов способно внести определенный вклад в выяснение общих механизмов адаптации растений к действию абиотических стрессоров.

Цели и задачи исследования. Настоящая работа является продолжением выше указанных исследований в направлении более углубленного изучения способности растений хрустальной травки аккумулировать кадаверин при солевом стрессе (N01), выяснения механизмов индуцирующего действия этилена, установления связи аккумуляции кадаверина с функционированием САМ-фотосинтеза и его возможной физиологической роли в условиях засоления.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определить содержание кадаверина у растений трех возрастных групп в норме и при засолении №01 и сравнить его с изменениями в активности лизиндекарбоксилазы (ЛДК) и содержанием полиаминов семейства путресцина.

2. Установить изменения в эндогенном уровне этилена у хрустальной травки при действии №С1 и исследовать взаимовлияние экзогенного этилена и кадаверина в опытах с изолированными листьями.

3. Исследовать механизмы индуцирующего действия этилена на аккумуляцию кадаверина в опытах с изолированными листьями при экспонировании их в присутствии предшественника этилена 1-аминоциклопропан-1 -карбоксиловой кислоты (АЦК) и при действии №С1.

4. Выяснить, включаются ли процессы фосфорилирования/дефосфорилирования белков как компоненты цепи трансдукции этиленового сигнала в образование кадаверина, проведя для этой цели ингибиторный анализ.

5. Исследовать, вовлекается ли кадаверин и этилен в индукцию САМ-типа фотосинтеза, применив для этой цели оценку уровня мРНК гена (Ррс 1) ключевого фермента САМ-метаболизма фосфоенолпируваткарбоксилазы (ФЕПК) с помощью метода обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

6. Изучить влияние экзогенного кадаверина на процесс растяжения гипокотилей проростков и рост корешков проростков хрустальной травки и арабидопсиса и сравнить с действием на эти параметры АЦК, а также выяснить влияние долговременной обработки растений хрустальной травки экзогенным кадаверином на накопление биомассы и определить изменения в составе полиаминов.

7. Исследовать суточную динамику содержания кадаверина в корнях и листьях растений хрустальной травки в период протекания САМ-фотосинтеза.

Научная новизна. Впервые продемонстрировано, что компетентность растений хрустальной травки к аккумуляции кадаверина и полиаминов семьи путресцина в норме находится под онтогенетическим контролем, а в регуляцию их эндогенного уровня при действии солевого стресса включается этилен. Подтвержден ранее установленный характер взаимодействия в системе этилен/полиамины: синергический в отношении этилен «-»кадаверин и реципрокный в отношении этилен спермидин. Впервые установлено, что этилен-индуцированное образование кадаверина в листьях хрустальной травки

может быть опосредовано процессами фосфорилирования/дефосфорилирования белков на этапе трансдукции этиленового сигнала. Впервые представлены экспериментальные доказательства того, что аккумуляция в листьях хрустальной травки кадаверина и повышенное образование в них этилена не имеют отношения к регуляции экспрессии стресс-индуцибельного гена ФЕПК (Ррс 1) на уровне аккумуляции соответствующей мРНК. Впервые установлены суточные колебания содержания кадаверина в листьях и корнях хрустальной травки в фазе САМ-фотосинтеза. Показана двойственность действия кадаверина на процесс растяжения пшокотилей проростков хрустальной травки: стимуляция при низких концентрациях диамина (0,2-1,0 мМ) и торможение растяжения при высоких (свыше 2,0 мМ), что может иметь адаптивное значение в условиях засоления.

Практическая значимость. Полученные в работе теоретические данные о механизмах аккумуляции кадаверина и полиаминов семьи путресцина у хрустальной травки в условиях засоления имеют существенное значение для выяснения хода формирования адаптивных процессов у галофитов и при разработке технологии создания трансгенных модельных растений с повышенной солеустойчивостью. Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов и вузов страны.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, 2001), на международном симпозиуме «Plant under Invironmental Stress» (Москва, 2001), на V Съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений -основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

на 138 страницах машинописного текста, включая 6 таблиц, 35 рисунков; библиография содержит 199 названий, в т.ч. 170 на иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служила хрустальная травка (Mesembryanthemum crystallinum L.), которая принадлежит к кадаверин-содержащим видам. Растения выращивали в условиях водной культуры на питательном растворе Джонсона (Johnson, 1957), модифицированном по Winter (1973), в камере фитотрона при 23-25 °С и относительной влажности воздуха ~55% в дневное время суток. Ночью температуру и влажность воздуха поддерживали на уровне 15-17°С и ~70%, соответственно. Длина фотопериода составляла 14 ч при освещенности 350+50 мкмоль.м-2.секунд-1.

Засоление (300-400 мМ NaCl) проводили ступенчато, увеличивая концентрацию NaCl на 100 мМ каждый день до требуемой концентрации.

Для опытов с экспонированием изолированных листьев в присутствии предшественника этилена АЦК или NaCl использовали 6 пару настоящих листьев взрослых растений с САМ-типом фотосинтеза и 3-4 пару листьев молодых растений, произраставших на контрольной среде (без засоления). Листья срезали и экспонировали в чашках Петри в воде (контроль) и в водных растворах с добавками: NaCl (300 мМ) или АЦК (50 мкМ) или NaCl (300 мМ) + АЦК (50 мкМ) в течение 2-х и 4-х часов в тех же световых условиях, которые указаны выше.

В экспериментах по влиянию кадаверина и этилена на удлинение гипокотиля и зародышевого корешка проростков хрустальной травки, семена проращивали в темноте в стерильных условиях в чашках Петри (4 дня при +4°С, 7 дней - при +25°С) в присутствии 0,2-2,0 мМ кадаверина или 10-40 цМ АЦК.

В опытах с ингибиторами различных компонентов фосфорилирующего каскада 3 пару листьев 4-5-недельных растений срезали с контрольных растений и черешками погружали в водные растворы ингибиторов на 3 часа в темноте, после чего отделенные листья экспонировали в атмосфере этилена или на

воздухе. Обработку растений экзогенным этиленом (10 мкл л"1) проводили в герметичных стеклянных камерах (V=20 л), снабженных специальными щтуцерами для ввода этилена. С помощью шприца в камеру вводили заданное количество этилена. Время обработки этиленом: 4 часа.

В опытах по влиянию кадаверина и этилена на экспрессию гена ФЕПК экзогенный кадаверин (0,5 мМ), предшественник этилена АЦК (0,5 мМ) и NaCl (400 мМ) вносили в корневую среду. Время экспозиции корней в водном растворе кадаверина и АЦК составляло 2 ч. с последующей отмывкой их в дистиллированной воде. Обработку корней интактных растений кадаверином и АЦК проводили дважды в течение экспериментального периода (6 дней). Для создания повышенной концентрации этилена на листья интактных растений дважды наносили 0,1-0,2 мМ водный раствор 2-хлорэтилфосфоновой кислоты (этрэль) с добавлением 0,05% раствора Тритон Х-100.

Свободные полиамины определяли в виде их бензоильных производных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Flores, Galston, 1982).

Эндогенный уровень в листьях этилена определяли методом газовой хроматографии (Ракитин, Ракитин, 1986).

Активность ЛДК определяли спектрофотометрическим методом (Phan et al, 1982; Beieretal., 1987).

Содержание свободного пролина определяли в кислой среде с помощью нингидринового реактива по методу Бейтса с соавт. (Bates et al., 1973), используя в качестве стандарта пролин фирмы "Serva".

Измерения рН и титруемой кислотности в клеточном соке производили с помощью рН-метра фирмы "Orion Research" (Швеция) (Кузнецов и др., 2000, Круглова, 2002).

При изучении экспрессии гена ФЕПК использовали метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Тотальную РНК из образцов растительного материала выделяли фенольным методом (Westhoff et al., 1981). Препарат РНК обрабатывали ДНКазой в течение 30 мин при 37°С, после чего белки удаляли фенольной депротеинизацией. Обратную транскрипцию проводили в соответствии с инструкцией фирмы "Fermentas",

применив oligo(dT)21VN в качестве затравки. ПЦР осуществляли с использованием Tag-ДНК-полимеразы. Последовательность нуклеотидов гена ФЕПК и контрольного гена актина были взяты на сайте www.tigr.org (The Institute for Genomic Research).

Образцы растительного материала для измерения титруемой кислотности отбирали в конце темнового (7.30) и в конце светового (19.30) периодов, для изучения влияния кадаверина и этилена на экспрессию гена ФЭПК - в начале темнового периода (20.30), для изучения суточных колебаний в содержании кадаверина - в течение дня и ночи, для всех остальных анализов - в 11 ч. Фиксация материала проводилась жидким азотом, после чего образцы хранили до начала анализов при - 80 °С.

Все опыты проводили в трехкратной биологической повторности. Результаты обрабатывали статистически и выражали как среднюю арифметическую и ошибку репрезентативности среднего квадратического отклонения (Доспехов, 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Возрастные особенности аккумуляции кадаверина и полиаминов семейства путресцина у хрустальной травки в нормальных условиях произрастания. Для исследования онтогенетических особенностей содержания полиаминов были использованы растения трех возрастных групп, различающихся по морфологическим и физиологическим признакам. Первую группу составляли молодые растения (возраст - 5 недель) с Сз-типом фотосинтеза, которые характеризовались полностью сформированными 3-й и 4-ой парами листьев и отсутствием боковых побегов. Растения второй группы (возраст - 7 недель) имели хорошо развитые первичные листья, зачатки боковых побегов с еще неразвернувшимися вторичными листьями. Третья группа была представлена наиболее онтогенетически взрослыми растениями с САМ-типом фотосинтеза, имеющими хорошо развитые вторичные листья (возраст - 9 недель).

Об индукции САМ судили по изменению суточной динамики титруемой кислотности клеточного сока, которая являлась следствием накопления малата в листьях.

Прежде чем изучить возрастные особенности накопления кадаверина у хрустальной травки целесообразно было провести оценку уровня полиаминов путресцинового ряда у растений трех возрастных групп.

Как видно из рис. 1, листья растений разного возраста изначально различались по содержанию главных полиаминов. Наибольшим уровнем полиаминов (нмоль/г сырой массы) характеризовались растения второй группы, что, вероятнее всего, связано с общей перестройкой растительного организма, связанной с индукцией САМ-типа фотосинтеза. Конститутивный уровень доминирующего у хрустальной травки полиамина, спермидина, в листьях растений 3-й группы был в 10 и 7 раз ниже, чем в листьях растений 2-й и 1-й группы, соответственно.

¡□Пут ВСпд ИСпм |

Подобное значительное снижение уровня спермидина у наиболее онтогенетически взрослых растений может указывать на заметное снижение активности спермидин-синтазы - скорость лимитирующего фермента биосинтеза полиаминов (спермидина и спермина). Можно предположить, что динамика изменений в концентрации спермидина скорее связана с активностью ростовых процессов в листьях, чем с онтогенетическим переходом растений на САМ-тип фотосинтеза. Подобные результаты были получены в работе Дам (Дам,

1999) при исследовании динамики содержания спермидина в онтогенезе листьев хрустальной травки.

Исследование содержания кадаверина у растений трех возрастных групп показало отсутствие определяемых концентраций данного диамина в листьях молодых растений. Кадаверин был обнаружен в листьях растений второй и третьей группы, при этом его аккумуляция в листьях линейно возрастала с увеличением возраста растений, достигая максимума у растений полностью перешедших на САМ-тип фотосинтеза (рис. 2).

Характер изменения активности ЛДК - кадаверин-образующего фермента положительно коррелировал с уровнем кадаверина у растений хрустальной травки 2-й и 3-й возрастной группы (рис. 2).

Однако, у молодых растений хрустальной травки, не накапливающих кадаверин, в листьях обнаружена высокая активность ЛДК (рис. 2). Отсутствие корреляции между активностью ЛДК и накоплением кадаверина в этом случае может объясняться высокой активностью диаминоксидазы у молодых листьев, о

чем свидетельствует усиленное образование в них Н2О2 - продукта окислительной деградации диаминов (Шевякова и др., 2003). Как установлено в лаборатории молекулярных и физиологических механизмов адаптации ИФР РАН (Стеценко Л.А., неопубликованные данные), в листьях молодых растений хрустальной травки активность диаминоксидазы оказывалась повышенной как в норме, так и при действии на растения №01.

Тагам образом, кадаверин, который можно назвать минорным полиамином из-за его более низкого по сравнению с основными полиаминами содержания в растениях, у хрустальной травки обнаруживается на более поздних стадиях развития.

2. Изменения в содержании кадаверина и полиаминов путресцинового ряда у хрустальной травки при адаптации к засолению. Одним из главных абиотических факторов природной среды, к которому хрустальная травка вынуждена адаптироваться в процессе онтогенеза, является засоление. Известно, что специализированная адаптация к действию №С1 у этих растений проявляется в ускорении перехода на эффективный водосберегающий путь фиксации углекислоты САМ-тип фотосинтеза. Для опытов с засолением в качестве стартовых использовали растения тех же трех возрастных групп.

В результате исследований установлено, что после 6 суток произрастания в присутствии №С1 (300 мМ) эндогенный уровень спермидина в листьях молодых растений (1-я группа) и растений 8 фазе начала индукции САМ (2-я группа) имел тенденцию к снижению, но з них з 3 к более раза возрастало количество спермина (рис. ЗА, ЗБ). В листьях САМ-растений (3-я группа) в условиях засоления возрастало содержание обоих полиаминов - спермидина и спермина (рис. ЗВ).

Таким образом, сравнение изменений в содержании полиаминов семьи путресцина в листьях растений трех возрастных групп хрустальной травки выявило редко встречающееся у растений накопление в условиях засоления спермина. Подобная картина снижения количества путресцина и спермидина на фоне увеличения эндогенного уровня спермина при действии солевого стресса

была указана для солеустойчивого сорта Lycopersicon esculentum (Boucheгeau et з1, 1999).

Исследование аккумуляции кадаверина у хрустальной травки в условиях засоления свидетельствует об усилении аккумуляции кадаверина при действии

№С1. При этом, повышение содержания кадаверина происходило только у растений 2-й и 3-й возрастной группы (рис. 4).

Таким образом, для хрустальной травки оказалось характерным повышенное накопление кадаверина в присутствие №С1 в первичных листьях на поздней стадии развития растений. При этом, характер аккумуляции кадаверина при действии №С1 соответствовал характеру повышения уровня титруемой кислотности клеточного сока, которое является следствием повышения содержания малата при переходе растений на САМ-тип фотосинтеза в условиях засоления.

Совокупность полученных данных позволяет придти к выводу, что у факультативного галофита хрустальной травки аккумуляция в листьях диамина кадаверина положительно коррелировала с периодом протекания САМ-типа фотосинтеза как конститутивного характера, так и индуцируемого засолением.

3. Влияние этилена на аккумуляцию кадаверина. Особое место в координации физиологических процессов у растений отводится взаимодействию полиаминов и этилена, во многом оказывающих на растительный организм противоположные эффекты (ОакЬоп Ы а1., 1997; 8Иеууакоуа е! а1., 2001; Кузнецов и др., 2002). Ранее было обнаружено этилен-зависимое образование диамина кадаверина у хрустальной травки в условиях гипертермии (Дам, 1999;

8Иеууакоуа Ы а1., 2001; Кузнецов и др., 2002). Обработка хрустальной травки тепловым шоком (ТШ) приводила к транзиторной аккумуляции этилена и последующему накоплению и межорганному транспорту кадаверина.

В связи с этим представлялось важным выяснить, связана ли повышенная аккумуляция кадаверина в условиях засоления с образованием этилена.

Исследование влияния засоления на содержание этилена в листьях хрустальной травки показало увеличение его содержания при действии №С1 (рис. 5).

На этом основании было высказано предположение, что у хрустальной травки сигнальным фактором, ответственным за накопление кадаверина в условиях засоления, также как и при гипертермии, может сказаться этилен.

Ранее было показано индуцирующее действие этилена на образование кадаверина в срезанных листьях ювенильных растений М. crystallinum, не содержащих кадаверин - обработка листьев этиленом приводила к резкому повышению в них содержание кадаверина, но при этом эндогенный уровень спермидина заметно снижался (Дам, 1999).

Для подтверждения индуцирующего действия этилена на образование кадаверина были проведены опыты с изолированными первичными листьями (56 пара) САМ-растений хрустальной травки. Листья инкубировали в присутствии прямого предшественника при биосинтезе этилена в растительных клетках АЦК (50 мкМ) как дополнительного источника повышения его эндогенного уровня. В

качестве теста на образование кадаверина использовали изменение активности

Полученные данные (рис. 6) показали, что при экспонировании изолированных листьев растений в период САМ-фотосинтеза экзогенная АЦК (50 мкМ) повышала активность ЛДК. №0 (400 мМ) снижал активность фермента в первые 2 ч., а при инкубации листьев в течение 4 ч. его активность восстанавливалась и превосходила исходный уровень почти в 2,5 раза. Еще более высокий уровень активации ЛДК был характерен для совместного действия №0+АЦК (4 ч. экспозиции), что, возможно, вызвано более высокой эндогенной концентрацией этилена, характерной для стрессорных условий.

На основании результатов данного опыта можно заключить, что стимуляция активности фермента могла быть опосредована этиленом, прямым продуктом АЦК-оксидазы, катализирующей последний этап его биосинтеза. Полученные данные развивают высказанное ранее положение (Shevyakova et э1., 2000; Shevykova et al., 2001; Кузнецов и др., 2002) о синергическом характере отношений этилена и кадаверина, наиболее выраженное в стрессорных условиях.

ЛДК.

Рис. 6.

1,6 -1

Контроль №С1 АЦК АЦК+ЫаС!

□ 2ч 0 4ч

Повышение активности лизиндекарбоксилазы в изолированных листьях взрослых растений хрустальной травки при экспонировании в присутствии АЦК (50 мкМ) или №С1 (300 мМ) и при их совместном действии (АЦК, 50 мкМ + №С1, 300 мМ).

При этом обращает на себя внимание тот факт, что инкубация изолированных листьев в присутствии предшественника этилена (АЦК) снижала содержание полиаминов, в том числе спермидина. Таким образом, подтвержден

ингибирующий эффект этилена на содержание доминирующего у хрустальной травки полиамина спермидина.

4. Механизмы этилен-индуцированного образования кадаверина. Ранее в опытах с мутантом ЛтаЫйор818 ШаНапа, не чувствительным к этилену (вШ4), было установлено, что ТШ-индуцируемый транспорт кадаверина по растению был связан с функционированием системы рецепции этилена ^Иеууакоуа е! а1., 2001; Кузнецов и др., 2002). Вовлекаются ли при этом другие компоненты цепи передачи этиленового сигнала, также важные и для включения этилен-индуцированного биосинтеза кадаверина, в настоящее время неизвестно. Такими процессами могут быть реакции фосфорилирования белков, тем более, что из ряда работ (Иаг, НиЪт, 1993; КоУкоуа е! а1., 1993) следует, что при обработке растений этиленом происходило усиление процессов фосфорилирования белков в цепи передачи этиленового сигнала. Однако, вопрос о том, вовлекаются ли процессы фосфорилирования/дефосфорилирования белков в этилен-индуцированное образование кадаверина, оставался открытым.

Для того, чтобы выяснить функционирование этого механизма в сигнальной цепи этилена, в работе были использованы ингибиторы различных компонентов фосфорилирующего каскада: №3У04 предотвращает активацию тирозиноБой фосфатазы (КоУкоуа е! а1., 1993), №Р - блокатор мембранных фосфатаз (Та88от е! а1., 1996), апигенин - некоторых МАП-киназ (Сага1е е! а1., 1998). О влиянии ингибиторов на образование кадаверина судили по уровню активности ЛДК.

Как показали результаты экспериментов, все примененные в работе ингибиторы снимали (на 70-80%) стимулирующий эффект экзогенного этилена на активность ЛДК, лишь незначительно влияя при этом на активность ЛДК в контрольных листьях, экспонированных в отсутствие этилена (рис. 7).

1 - Контроль

2 - №3У04 (50 мкМ)

3 - Кар (50 мМ)

4 - Апигенин (20 мкМ)

5-Этилен

6-Ма3У04(50мкМ) +этилен

7 - КаБ (50 мМ) +этилен

8 - Апигенин (20 мкМ) 12345678 + этилен

Варианты опыта

Рис. 7. Влияние ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз на активность ЛДК в изолированных листьях хрустальной травки, экспонированных на воздухе (контроль) и в атмосфере этилена (10 мкл/л, 3 ч). Обозначения: Д- без обработки этиленом, Щ - в атмосфере этилена.

На основании полученных результатов пришли к выводу, что в этилен-индуцированное образование кадаверина могут быть вовлечены процессы фосфорилирования/дефосфорилирования белков - типичных компонентов систем трансдукции гормонального сигнала.

В связи с реципрокным характером взаимодействия этилена и спермидина, необходимым представлялось также оценить действие ингибиторов компонентов сигнальной цепи этилена (Ка3У04, и апигенин) на образование данного полиамина.

Результаты экспериментов, проводимых по той же схеме, что и в опытах с кадаверином, представлены на рис. 8. Как следует из рисунка, в листьях (3-я пара), показавших стимулирующий эффект экзогенного этилена на образование кадаверина, содержание спермидина снижалось в тех же условиях экспонирования изолированных листьев в атмосфере этилена. При этом ингибиторы (Ка3У04 и апигенин), примененные на фоне этилена, не влияли на уровень ингибирующего действия гормона на содержание полиамина.

Исключение составил №Р (блокатор мембранных фосфатаз), который частично снимал ингибирующий эффект этилена.

Рис. 8. Влияние ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз на содержание спермидина в изолированных листьях (3-я пара) хрустальной травки, экспонированных в атмосфере этилена (10 мкл/л, 3 ч.).

Таким образом, можно предположить, что ингибирующий эффект этилена на образование спермидина может быть также частично связан с функционированием мембранных фосфатаз, о чем свидетельствует снятие ингибирующего эффекта этилена в присутствии №Р - блокатора мембранных фосфотаз.

5. Влияние аккумуляции кадаверина на процессы роста и развития. Для изучения влияния этилена и кадаверина на элонгацию клеток был проведен фенотипический анализ реакции проростков хрустальной травки на различные концентрации кадаверина и этилена В результате проведенных исследований установили, что кадаверин в диапазоне концентраций от 0,2 до 1,0 мМ активирует удлинение гипокотиля этиолированных проростков хрустальной травки (рис. 9). Стимуляция кадаверином удлинения корня менее выражена. Установлено, что содержание кадаверина в растворе свыше 2,0 мМ является ингибирующим для проростков хрустальной травки. Как следует из рис. 10, 1040 цМ АЦК тормозит растяжение как гипокотиля, так и корня, что является типичной ответной реакцией на этилен.

Таким образом, характер действия экзогенного кадаверина на ростовой процесс в фазе проростков зависит от концентрации диамина: в низких -действует как стимулятор («гормональный» эффект), а в высоких - как ингибитор.

Для того чтобы оценить физиологическую роль аккумуляции кадаверина у хрустальной травки в условиях засоления у взрослых растений, провели опыты по сравнительному действию экзогенного кадаверина, засоления №С1 и их совместного действия на рост и развитие растений. Длительная (14 суток) ежедневная обработка листьев 1 мМ кадаверина ускорила переход растений к репродуктивной фазе развития. Это выразилось в более быстром старении и опадении первичных листьев и развитии только боковых побегов, что, в

конечном итоге, отразилось на снижении биомассы. В этом варианте было отмечено также более раннее образование репродуктивных органов и начало цветения по сравнению с контролем. Вместе с тем, фенотип растений после обработки листьев кадаверином практически не отличался от фенотипа растений, произраставших в условиях засоления. Анализ содержания полиаминов показал, что в этот период наблюдений во вторичных листьях в варианте с засолением можно было обнаружить в основном спермин и кадаверин. В листьях, получавших экзогенный кадаверин, также были найдены только эти полиамины, но в гораздо более высокой концентрации.

Таким образом, обнаруженный физиологический эффект долговременной обработки растений экзогенным кадаверином, проявившийся в ингибировании роста и ускорении процессов развития у хрустальной травки, сопровождался одновременной аккумуляцией в листьях самого кадаверина и спермина.

5. Влияние кадаверина и этилена на экспрессию гена ключевого фермента САМ-метаболизма. В связи, с обнаружением этилен-индуцированного образования кадаверина у хрустальной травки, приуроченного к фазе перехода растений на САМ, и участия этого диамина в дистанционной передаче стрессорного сигнала мы предположили, что накопление в листьях этилена и кадаверина в условиях заселения может активировать экспрессию стресс-индуцируемого гена (Ррс1) ключевого фермента САМ-пути фотосинтеза - ФЕПК на уровне аккумуляции соответствующих транскриптов. Для этого исследовали действие экзогенных кадаверина и этилена на экспрессию гена ФЕПК в листьях хрустальной травки, используя для этой цели метод ОТ-ПЦР. Для опытов использовали растения хрустальной травки в возрасте 6-7 недель, находившиеся в начале перехода на САМ-тип фотосинтеза. В результате проведенных экспериментов установлено, что уровень титруемой кислотности в листьях после 6 дней воздействия на растение вышеупомянутых факторов оказался повышенным только у растений, произраставших в условиях засоления. В этом же варианте листья аккумулировали пролин, что свидетельствовало о стрессорном воздействии засоления. Обработка растений экзогенным

кадаверином, АЦК и этрэлем практически не вызвала в листьях изменений в уровне титруемой кислотности, т.е. признаки начала формирования САМ у этих растений не проявились.

Как следует из рисунка 11, повышенная экспрессия гена ФЕПК обнаружена только при воздействии на растения хрустальной травки №С1. Кадаверин и этилен (варианты с обработкой АЦК и этрэлем) не изменили содержания мРНК по сравнению с контролем.

»■"■** Щф ****** о»*** Ррс 1

«•и жи* цп» мадш АсИп

Рис. 11. Уровень транскрипции гена ФЕПК в 4-й паре листьев хрустальной травки в контроле (1), на б-е сутки после засоления (2) и обработки растений экзогенным кадаверином (3), 1-аминоциклопропан-1-карбоксиловой кислотой (4), 2-хлорэтилфосфоновой кислотой (5).

На основании проведенных исследований заключили, что аккумуляция в листьях взрослых растений хрустальной травки диамина кадаверина и повышенное образование в них этилена не влияют на экспрессию гена ФЕПК. Таким образом, приуроченность накопления кадаверина к более поздним стадиям развития не была связана с индукцией САМ - ключевым механизмом адаптации растений к водному дефициту, специфичным для группы растений семейства толстянковых, а, по всей видимости, является следствием онтогенетической адаптации хрустальной травки.

Суточные колебания содержания кадаверина в листьях и корнях хрустальной травки в период С^М-фотосинтеза.

Учитывая способность полиаминов как органических катионов выступать в качестве метаболических буферов клеточной рН, представлялось важным выяснить, может ли кадаверин проявлять эти свойства для регуляции клеточной

кислотности, вызванной образованием малата во время протекания САМ-фотосинтеза, у хрустальной травки. Ранее, в одной из работ, посвященной исследованию полиаминов у представителя толстянковых (Kalanchoe и Bryophyllum), были обнаружены синхронные колебания в содержании полиаминов (путресцина, спермидина) и малата в ночной и дневной периоды. (Morel et al., 1980). В связи с этим исследовали суточную ритмику содержания

кадаверина в СМ-растениях хрустальной травки. Как следует из рисунка 12, содержание кадаверина в листьях и корнях испытывало резкие колебания в течение светового и темнового периодов. В утренние часы (7 ч.) содержание диамина в листьях и корнях было минимальным и постепенно повышалось в дневное время (13 и 16 ч.) преимущественно в листьях, когда наблюдался массовый выход малата из вакуолей в цитоплазму. В начале темнового периода (20 ч.) в листьях, когда малат был израсходован в процессе декарбоксилирования, избыток кадаверина транспортировался в корни. Однако, ко времени интенсивного синтеза малата в ночной период (1 ч.) кадаверин снова

оказывался в листьях. Обнаруженные суточные колебания содержания кадаверина в листьях и корнях хрустальной травки могли быть направлены на нейтрализацию кислой рН клеточного сока, создаваемой при аккумуляции малата, что ранее было показано для полиаминов семьи путресцина (Morel et al., 1980). В целом ряде публикаций (Шевякова, 1981) накопление в растениях диамина путресцина и кадаверина было обнаружено в ответ на подкисление клеточного сока при дефиците К+ или искусственном создании кислой среды при выращивании многих видов растений. Таким образом, сновываясь на результатах выше упомянутых работ, можно предполагать, что сама кислая рН служит индуктором образования диаминов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В отличие от низкомолекулярных метаболитов с осмопротекторной функцией, вопрос о роли полиаминов в формировании солеустойчивости растений, в частности галофитов, остается открытым. В наибольшей степени это относится к кадаверину, стресс-зависимая аккумуляция которого обнаружена не у всех видов растений. Факультативный галофит Mesembryanthemum crystallinun L. (хрустальная травка) явился важным для изучения метаболизма и роли кадаверина исключением: аккумуляция этого диамина у типичного представителя толстянковых, формирующих водосберегающий механизм САМ-типа, оказалась стресс - (гипертермия) и этилен - зависимой, что до нас было обнаружено в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации ИФР РАН (Дам, 1999; Shevyakova et al., 2000, 2001; Кузнецов и др., 2002).

Настоящая работа является продолжением выше указанных исследований в направлении более углубленного изучения способности растений хрустальной травки аккумулировать кадаверин при солевом стрессе (NaCl), выяснения механизмов индуцирующего действия этилена, установления связи аккумуляции кадаверина с функционированием САМ-метаболизма и его возможной физиологической роли в условиях засоления.

Проведенные исследования показали, что определяемые количества свободного кадаверина в первичных листьях контрольных растений найдены только у онтогенетически взрослых растений, находящихся в начале перехода с С3 на ОЛЯИП фотосинтеза или полностью его сформировавших. В условиях постепенного засоления (300 мМ, 6 суток) компетенция растений к аккумуляции кадаверина также определялась его онтогенетическим статусом и совпадала с развитием САМ-метаболизма. Аккумуляция кадаверина у растений как в норме, так и в условиях засоления однозначно была связана с увеличением их онтогенетического возраста, совпадающего с переходом растений к репродуктивной фазе развития, когда у растений снижается ростовая активность первичных листьев и начинается образование вторичных побегов.

Известно, что на поздних стадиях онтогенеза в регуляцию физиологических процессов могут вовлекаться гормональные сигналы и, прежде всего, этилен. Как показали наши, исследования эндогенный уровень этилена в растениях хрустальной травки повышался при действии засоления. Исследование возможной роли этилена как сигнального фактора, ответственного за накопление кадаверина, показало индукцию этиленом аккумуляции кадаверина. Специфичность индуцирующего действия этилена была подтверждена тем фактом, что в тех же опытах экзогенный этилен снижал в листьях содержание спермидина.

Исследование возможных механизмов передачи этиленового сигнала для образования этого диамина показало, что этилен-индуцирующее образование кадаверина связано с функционированием сигнальной цепи этилена с участием процессов фосфорилирования/дефосфорилирования белков.

Выяснение физиологической роли кадаверина показало, что накопление кадаверина на поздних стадиях развития хрустальной травки не было связано с индукцией САМ-типа. фотосинтеза. Таким образом, впервые представлены доказательства того, что аккумуляция в листьях взрослых растений хрустальной травки кадаверина и этилена не имеют отношения к регуляции экспрессии стресс-индуцибельного гена ФЕПК (Ррс1) на уровне соответствующей мРНК. Обнаруженная нами активация этиленом процессов

фосфорилирования/дефосфорилирования белков в связи со стресс-индуцированной и этилен-зависимой аккумуляцией и межорганной транслокацией кадаверина могла указывать на вовлечение кадаверина в регуляцию активности ФЕПК на пострансляционном уровне. Нельзя также исключать, что выраженные суточные колебания кадаверина в листьях и корнях хрустальной травки, показанные в наших опытах, направлены на ослабление регуляции активности ФЕПК малатом и аспартатом - аллостерическими ингибиторами фермента (1гш е! а1., 2004), а также обусловлены действием кадаверина как высокопротонированного соединения на рН-стат цитоплазмы. В этом предположении мы опирались на хорошо известную роль полиаминов как регуляторов клеточной рН при кислотном стрессе (ОаМоп е! а1., 1997) и аккумуляцию полиаминов семьи путресцина в ответ на выход малата в цитоплазму у представителя толстянковых (Ка1апекое и ВгуоркуИыш) (Могге1 е! а1., 1980).

Другим аспектом физиологической роли аккумуляции кадаверина в условиях засоления может быть его влияние на регуляцию роста клеток растяжением. Известно, что выживание растений и в том числе галофитов в условиях засоления сопровождается снижением ростовой активности, включающей клеточное растяжение, что позволяет поддерживать в растениях необходимый энергетический баланс для формирования механизмов адаптации как на уровне стресс-реакции так и в период долговременного действия засоления. Опыты по влиянию различных концентраций кадаверина и этилена на процесс растяжения гипокотилей проростков хрустальной травки показали, что кадаверин в низких концентрациях способен поддерживать рост клеток растяжением, а при высоких - оказывает ингибирующий эффект, тормозя накопление биомассы, но ускоряя развитие репродукционных процессов подобно засолению.

ВЫВОДЫ

1. У растений хрустальной травки в норме кадаверин обнаружен у онтогенетически взрослых растений на фоне пониженного содержания спермидина, доминирующего у молодых растений. Аккумуляция кадаверина в условиях засоления заметно усиливается и также приурочена к позднему периоду онтогенетического развития растений, совпадающего с формированием у хрустальной травки САМ-типа фотосинтеза. В противоположность кадаверину, аккумуляция спермина, завершающего цепь превращения путресцина, в присутствии №С1 стабильно проявлялось как у молодых, так и взрослых растений, что могло быть связано с его ролью как защитного фактора.

2. №С1-индуцированная аккумуляция кадаверина у хрустальной травки сопровождалась повышением уровня в листьях эндогенного этилена, а экспозиция изолированных листьев в присутствии предшественника этилена, АЦК, повышала в них активность ЛДК, на основании чего предположили, что этилен у хрустальной травки в условиях засоления может выступать в роли сигнального фактора.

3. Приведены экспериментальные доказательства того, что этилен-индуцируемое образование кадаверина может быть связано с функционированием сигнальной цепи этилена с участием процессов фосфорилирования/дефосфорилирования белков, что показано с помощью применения ингибиторов отдельных компонентов цепи транедукции (Ка3У04, КаБ и апигенин).

4. Подтвержден реципрокный тип взаимодействия этилена и доминирующего у хрустальной травки полиамина спермидина. Установлено, что ингибитор мембранных фосфатаз №Р снимает ингибирующий эффект этилена на образование спермидина, что может указывать на участие процесса фосфорилирования белков.

5. Впервые представлены экспериментальные доказательства с помощью оценки уровня мРНК гена (Ррс 1) ключевого фермента САМ-метаболизма

ФЕПКазы методом ОТ-ПЦР, что аккумуляция в листьях взрослых растений хрустальной травки кадаверина и этилена не имеет отношения к регуляции экспрессии стресс-индуцибельного гена ФЕПК.

6. Обнаруженная нами активация этиленом процессов фосфорилирования/дефосфорилирования белков в связи со стресс-индуцированной и этилен-зависимой аккумуляцией и межорганной транслокацией кадаверина может указывать на вовлечение кадаверина в регуляцию активности ФЕПК на пострансляционном уровне.

7. Обнаружены выраженные суточные колебания кадаверина в листьях и корнях хрустальной травки, которые, возможно, направлены на регуляцию активности ФЕПК аллостерическими эффекторами (малат и аспартат) или рН цитоплазмы.

8. Физиологическая значимость аккумуляции кадаверина у растений хрустальной травки в условиях засоления на поздних этапах онтогенеза может состоять также в торможении высокой концентрацией кадаверина роста растяжением, позволяющим экономить энергию для формирования долговременных механизмов адаптации, а также, благодаря усиленной окислительной деградации диамина в апопласте, способствовать образованию суберина и лигнина, снижающих проницаемость клеточной стенки для солей.

По материалам диссертации оцубликованы следующие работы:

1. Шевякова Н.И., Шорина МБ. Исследование «тройного ответа» проростков хрустальной травки на кадаверин и этилен//Тезисы Межд. Конф. «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке». Сыктывкар, Республика Коми, Россия, 1-6 октября 2001 г., с. 131132.

2. Shevyakova N.I., Shorina M.V., Kuznetsov.Vl.V. The ethylene and the cadaveiine as a possible components in the inter organ chain of stress signal in plants//International symposium "Plant under environmental stress". Moskow, 2001.Abstracts. P.267-268.

3. Kuznetsov Vl., Rakitin V., Shorina M., Stetsenko L., Shevyakova N. Protein phosphorylation/dephosphorylation is involved in ethylene signal transduction in Mesembryanthemum crystallinum plants//Ameiican Society of Plant Biologist. 2003. P. 234-235.

4. Парамонова Н.В., Шевякова Н.И., Шорина М.В., Стеценко ЛА, Ракитин В.Ю., Кузнецов Вл.В. Влияние путресцина на ультраструктуру апопласта мезофилла листьев Mesembryanthemum crystallinum при засолении//Физиология растений. 2003. Т. 50. № 5. С. 1-14.

5. Кузнецов Вл.В., Шорина М.В., Ракитин В.Ю., Стеценко ЛА., Шевякова Н.И. Этилен-индуцированное образование кадаверина в листьях хрустальной травки//Тезисы V Съезда общества физиологов растений России и Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза, 15-21 сентября 2003 г., с.294-295.

6. Стеценко ЛА, Шорина М.В., Шевякова Н.И. Окислительная деградация кадаверина и образование пероксида водорода у Mesembryanthemum crystallinum L. в условиях засоления/Тезисы V Съезда общества физиологов растений России и Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза, 15-21 сентября 2003 г., с. 339.

7. Шевякова Н.И., Стеценко ЛА, Шорина М.В., Аронова Е.Е., Кузнецов Вл.В. Механизмы адаптации Mesembryanthemum crystallinum L. к NaCl-индуцированному оксилительному стрессу на разных стадиях развития растения//Тезисы V Съезда общества физиологов растений России и Международная конференция «Физиология растений - основа фитпбиотехнологии». Пенза. 15-21 сентября 2003 г, с. 359-360.

8. Шевякова Н.И., Шорина М.В., Ракитин В.Ю., Стеценко ЛА, Кузнецов Вл.В. Этилен-индуцированное образование кадаверина опосредовано процессами фосфорилирования/дефосфорилирования белков//Доклады АН. 2004. Т. 395. №2. С. 283-285.

9. Шорина М.В., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Вовлекаются ли кадаверин и этилен в индукцию САМ-типа фотосинтеза у хрустальной травки?//Доклады АН. 2005. Т.400. №1. С. 1-3.

Принято к исполнению 23/03/2005 Исполнено 24/03/2005

Заказ № 717 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 «'«'«'.аШогеГега!.™

2 2 АП° ?:D5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шорина, Марина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Общие представления о полиаминах и их биологической роли.

1.2 Общие представления о биосинтезе главных полиаминов (путресцина, спермидина, спермина).

1.3 Катаболизм и превращение полиаминов у растений.

1.4 Роль полиаминов в адаптации растений к неблагоприятным условиям окружающей среды.

1.5 Особенности метаболизма кадаверина и его физиологической роли.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Объект исследования.

2.2 Условия выращивания хрустальной травки в водной культуре.

2.3 Условия проведения опытов.

2.4 Определение содержания свободных полиаминов.

2.5 Определение интенсивности выделения этилена и Ог.

2.6 Определение содержания этилена в тканях растений.

2.7 Определение содержания свободного пролина.

2.8 Измерение рН и титруемой кислотности.

2.9 Определение активности лизиндекарбоксилазы.

2.10 Определение содержания ионов СГ.

2.11 Определение количества перекиси водорода.

2.12 Определение активности растворимой пероксидазы.

2.13 Определение интенсивности транскрипции гена ФЕПК.

2.14 Математическая обработка данных.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Содержание кадаверина и главных полиаминов у хрустальной травки в норме и при действии NaCl.

3.1.1 Возрастные особенности аккумуляции кадаверина и полиаминов семейства путресцина в листьях хрустальной травки в нормальных условиях произрастания.

3.1.2 Изменения в содержании кадаверина и полиаминов путресцинового ряда у хрустальной травки при адаптации к засолению.

3.2 Особенности взаимодействия этилена и кадаверина в условиях засоления.

3.2.1 Влияние этилена на аккумуляцию кадаверина.

3.2.2 Механизмы этилен-индуцированного образования кадаверина.

3.2.3 Влияние экзогенного кадаверина на содержание главных полиаминов и элюцию этилена листьями.

3.3 Физиологическая роль этилен-индуцированной аккумуляции кадаверина у хрустальной травки в стрессорных условиях.

3.3.1 Влияние аккумуляции этилена и кадаверина на процессы роста и развития.

3.3.2 Влияние кадаверина и этилена на экспрессию гена ключевого фермента С4А/-метаболизма.

3.3.3 Суточные колебания содержания кадаверина в листях и корнях хрустальной травки в период С4Л/-фотосинтеза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аккумуляция кадаверина и его физиологическая роль при действии солевого стресса"

В настоящее время во многих лабораториях мира ведутся интенсивные исследования в области адаптации растительных организмов к неблагоприятным факторам окружающей среды, в том числе к одному из главных абиотических стрессоров - засолению. Большой интерес вызывает участие полиаминов в стресс-реакциях и адаптации растений к экстремальным условиям среды. Во многих работах показано, что полиамины в условиях адаптационного процесса проявляют защитные свойства (Galston et al., 1997; Bouchereau et al., 1999). При этом обращает на себя внимание тот факт, что в основном исследуется метаболизм и биологическая роль полиаминов семейства путресцина (путресцин, спермидин, спермин).

Тем не менее, в ряде работ еще в 90-е годы было установлено необычное поведение кадаверина в отношении этилена и полиаминов группы путресцина у некоторых кадаверин-содержащих видов растений (АреШаиш е1 а1., 1985; ВакЬапазИуШ е1 а1., 1985; кекэоп е1 а1., 1986). Недавно в ряде исследований (Дам, 1999; Ки^л^БОУ а а1., 2000; Кузнецов и др., 2000; БЬеууакоуа е1 а1., 2001; Кигпе150У е1 а1., 2002) был обнаружен необычный характер взаимовлияния кадаверина и этилена у хрустальной травки в условиях теплового шока, который являлся не конкурентным, как в случае со спермидином, а скорее синергическим. Хрустальная травка отвечала на тепловой шок транзиторным выделением этилена и последующей межорганной транслокацией кадаверина, что могло быть связано с процессами адаптации и выживания растений в экстремальных условиях.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа является продолжением выше указанных исследований в направлении более углубленного изучения способности растений хрустальной травки аккумулировать кадаверин при солевом стрессе (ЫаС1), выяснения механизмов индуцирующего действия этилена, установления связи аккумуляции кадаверина с функционированием С4М-метаболизма и возможной физиологической роли кадаверина в условиях засоления.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Определить содержание кадаверина у растений трех возрастных групп в норме и при засолении КаС1 и сравнить его с изменениями в активности лизиндекарбоксилазы (ЛДК) и содержанием полиаминов семейства путресцина.

2. Установить изменения в эндогенном уровне этилена у хрустальной травки при действии и исследовать взаимовлияние экзогенного этилена и кадаверина в опытах с изолированными листьями.

3. Исследовать механизмы индуцирующего действия этилена на аккумуляцию кадаверина в опытах с изолированными листьями при экспонировании их в присутствии предшественника этилена 1-аминоциклопропан-1-карбоксиловой кислоты (АЦК) и при действии КаС1.

4. Выяснить, включаются ли процессы фосфорилирования/дефосфорили-рования белков как компоненты цепи трансдукции этиленового сигнала в образование кадаверина, проведя для этой цели ингибиторный анализ.

5. Исследовать, вовлекается ли кадаверин и этилен в индукцию САМ-типа фотосинтеза, применив для этой цели оценку уровня мРНК гена ключевого фермента СЛМ-метаболизма фосфоенолпируват-карбоксилазы (ФЕПК) - Ррс 1 с помощью метода обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

6. Изучить влияние экзогенного кадаверина на процесс растяжения гипокотилей проростков и рост корешков проростков хрустальной травки и арабидопсиса и сравнить с действием на эти параметры АЦК, а также выяснить влияние долговременной обработки растений хрустальной травки экзогенным кадаверином на накопление биомассы надземными органами и корнями и определить изменения в составе полиаминов.

Научная новизна. Впервые продемонстрировано, что компетентность растений хрустальной травки к аккумуляции кадаверина в норме находится под онтогенетическим контролем, а в регуляцию их эндогенного уровня при действии солевого стресса включается этилен. Подтвержден ранее установленный характер взаимодействия в системе этилен/полиамины: синергический в отношении этилен«->кадаверин и реципрокный в отношении этилен«->спермидин. Впервые установлено, что этилен-индуцированное образование кадаверина в листьях хрустальной травки могло быть опосредовано процессами фосфорилирования/дефосфорилирования белков на этапе трансдукции этиленового сигнала. Впервые представлены экспериментальные доказательства того, что аккумуляция в листьях хрустальной травки кадаверина и повышенное образование в них этилена не имеют отношения к регуляции экспрессии стресс-индуцибельного гена ФЕПК (Ррс 1) иг. уровне аккумуляции соответствующей мРНК. Впервые установлены суточные колебания содержания кадаверина в листьях и корнях хрустальной травки в фазе С4М-фотосинтеза. Показана двойственность действия кадаверина на процесс растяжения гипокотилей проростков хрустальной травки: стимуляция при низких концентрациях диамина (0,2-1,0 мМ) и торможение растяжения при высоких (свыше 2,0 мМ), что может иметь адаптивное значение в условиях засоления.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, 2001), на международном симпозиуме «Plant under Invironmental Stress» (Москва, 2001), на V Съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включая 6 таблиц, 35 рисунков; библиография содержит 199 названий, в т.ч. 170 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шорина, Марина Владимировна

выводы

1. У растений хрустальной травки в норме кадаверин обнаружен у онтогенетически взрослых растений на фоне пониженного содержания спермидина, доминирующего у молодых растений. Аккумуляция кадаверина в условиях засоления заметно усиливается и также приурочена к позднему периоду онтогенетического развития растений, совпадающего с формированием у хрустальной травки С4М-типа фотосинтеза. В противоположность кадаверину, аккумуляция спермина, завершающего цепь превращения путресцина, в присутствии ИаС1 стабильно проявлялось как у молодых, так и взрослых растений, что могло быть связано с его ролью как защитного фактора.

2. ЫаС1-индуцированная аккумуляция кадаверина у хрустальной травки сопровождалась повышением уровня в листьях эндогенного этилена, а экспозиция изолированных листьев в присутствии предшественника этилена, АЦК, повышала в них активность ЛДК, на основании чего предположили, что этилен у хрустальной травки в условиях засоления может выступать в роли сигнального фактора.

3. Приведены экспериментальные доказательства того, что этилен-индуцируемое образование кадаверина может быть связано с функционированием сигнальной цепи этилена с участием процессов фосфорилирования/дефосфорилирования белков, что показано с помощью применения ингибиторов отдельных компонентов цепи трансдукции (ТЧазУ04, ЫаР и апигенин).

4. Подтвержден реципрокный тип взаимодействия этилена и доминирующего у хрустальной травки полиамина спермидина. Установлено, что ингибитор мембранных фосфатаз ИаР снимает ингибирующий эффект этилена на образование спермидина, что может указывать на участие процесса фосфорилирования белков.

5. Впервые представлены экспериментальные доказательства с помощью оценки уровня мРНК гена (Ррс 1) ключевого фермента САМ-метаболизма ФЕПКазы методом ОТ-ПЦР, что аккумуляция в листьях взрослых растений хрустальной травки кадаверина и этилена не имеют отношения к регуляции экспрессии стресс-индуцибельного гена ФЕПК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Повышенная солеустойчивость растений — представителей галофитной флоры, формируется в процессе специализированной адаптации в ходе онтогенеза, включающей экспрессию генов осмопротекторов, ион-транспортных и антиоксидантных систем, ряда стресс-белков и других полезных для выживания растений механизмов. Это делает актуальным изучение механизмов солеустойчивости галофитов в аспекте возрастных изменений на физиологическом, метаболическом и молекулярном уровне.

Среди стресс-индуцируемых метаболитов с защитными свойствами и высокой биологической активностью большой интерес для выяснения механизмов выживания растений в фазе стресс-реакции и формирования механизмов долговременной специализированной адаптации представляют полиамины (путресцин, спермидин, спермин и кадаверин). В норме полиамины - мультифункциональные регуляторы, а при стрессорных воздействиях выступают как защитные факторы.

Однако, в отличие от низкомолекулярных метаболитов с осмопротекторной функцией, вопрос о роли полиаминов в формировании солеустойчивости растений, в частности галофитов, остается открытым. В наибольшей степени это относится к кадаверину, стресс-зависимая аккумуляция которого обнаружена не у всех видов растений. Факультативный галофит МеБетЬгуаыИетит сгуБ1аШпит Ь.(хрустальная травка) явился важным для изучения метаболизма и роли кадаверина исключением: аккумуляция этого диамина у типичного представителя толстянковых, формирующих водосберегающий механизм СЛМ-типа, оказалась стресс (гипертермия)- и этилен - зависимой, что до нас было обнаружено в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации (Дам, 1999; ЗИеууакоуа & а1. 2000, 2001; Кузнецов и др. 2002).

Настоящая работа является продолжением выше указанных исследований в направлении более углубленного изучения способности растений хрустальной травки аккумулировать кадаверин при солевом стрессе (МаС1), выяснения механизмов индуцирующего действия этилена, установления связи аккумуляции кадаверина с функционированием С4М-метаболизма и его возможной физиологической роли в условиях засоления.

Проведенные исследования показали, что определяемые количества свободного кадаверина в первичных листьях контрольных растений (произраставшие в отсутствие засоления) найдены только у онтогенетически взрослых растений, находящихся в начале перехода с Сз на САМ-тип фотосинтеза или полностью его сформировавших. В условиях постепенного засоления (300 мМ, 6 суток) компетенция растений к аккумуляции кадаверина также определялась его онтогенетическим статусом и совпадала с развитием С4М-метаболизма. Эндогенный уровень доминирующего у хрустальной травки полиамина спермидина в контрольных растениях, напротив, был высоким у молодых растений и резко падал с возрастом, что свидетельствовало об его связи с активно идущими ростовыми процессами. В условиях засоления стабильно выраженная аккумуляция полиаминов семьи путресцина была характерна в основном для спермина - конечного продукта цепи превращения путресцина, что могло быть специфически связано с защитной ролью полиаминов. Таким образом, сравнительная оценка содержания полиаминов семьи путресцина и кадаверина - продукта другого метаболического пути, выявила контрастный характер ответной реакции на засоление ИаС1 у различающихся онтогенетическим возрастом растений хрустальной травки. Аккумуляция кадаверина у растений как в норме, так и в условиях засоления однозначно была связана с увеличением их онтогенетического возраста, совпадающего с переходом растений к репродуктивной фазе развития, когда у растений снижается ростовая активность первичных листьев и начинается образование вторичных побегов.

Известно, что на поздних стадиях онтогенеза в регуляцию физиологических процессов могут вовлекаться гормональные сигналы и прежде всего этилен. Ранее у хрустальной травки было обнаружено этилен-зависимое образование кадаверина (Дам, 1999; БЬеууакоуа е1 а1.2000, 2001; Кузнецов и др. 2002). Как показали наши исследования эндогенный уровень этилена в растениях хрустальной травки повышался при действии засоления. Исследование возможной роли этилена как сигнального фактора, ответственного за накопление кадаверина, показало индукцию этиленом аккумуляции кадаверина. Специфичность индуцирующего действия этилена была подтверждена тем фактом, что в тех же опытах экзогенный этилен снижал в листьях содержание спермидина.

Исследование возможных механизмов передачи этиленового сигнала для образования этого диамина показало, что этилен-индуцирующее образование кадаверина могло быть связано с функционированием сигнальной цепи этилена с участием процессов фосфорилирования/дефосфорилирования белков.

Выяснение физиологической роли кадаверина показало, что накопление кадаверина на поздних стадиях развития хрустальной травки не было связано с индукцией С4М-типа фотосинтеза. Таким образом, впервые представлены доказательства того, что аккумуляция в листьях взрослых растений хрустальной травки кадаверина и этилена не имеют отношения к регуляции экспрессии стресс-индуцибельного гена ФЕПК (.Ррс1) на уровне соответствующей мРНК. Обнаруженная нами активация этиленом процессов фосфорилирования/дефосфорилирования белков в связи со стресс-индуцированной и этилен-зависимой аккумуляцией и межорганной транслокацией кадаверина могла указывать на вовлечение кадаверина в регуляцию активности ФЕПК на пострансляционном уровне. Нельзя также исключать, что выраженные суточные колебания кадаверина в листьях и корнях хрустальной травки, показанные в наших опытах, направлены на ослабление регуляции активности ФЕПК малатом и аспартатом — аллостерическими ингибиторами фермента (1гш е1 а1., 2004), а также обусловлены действием кадаверина как высокопротонированного соединения на рН-стат цитоплазмы. В этом предположении мы опирались на хорошо известную роль полиаминов как регуляторов клеточной рН при кислотном стрессе (ваЫоп е1 а1., 1997) и аккумуляцию полиаминов семьи путресцина в ответ на выход малата в цитоплазму у представителя толстянковых (Ка1апское и ВгуорЪуИит) (Могге1 е1 а1., 1980).

Другим аспектом физиологической роли аккумуляции кадаверина в условиях засоления может быть его влияние на регуляцию роста клеток растяжением. Известно, что выживание растений и в том числе галофитов в условиях засоления сопровождается снижением ростовой активности, включающей клеточное растяжение, что позволяет поддерживать в растениях необходимый энергетический баланс для формирования механизмов адаптации как на уровне стресс-реакции так и в период долговременного действия засоления. Исходя из этого положения, нами были проведены опыты с влиянием различных концентраций кадаверина и этилена (АЦК) на процесс растяжения гипокотилей у проростков хрустальной травки и арабидопсиса, а также влияние долговременной обработки взрослых растений хрустальной травки экзогенным кадаверином, что сравнивалось с влиянием засоления или совместным действием ШС1 и кадаверином. Полученные данные показали, что кадаверин в низких концентрациях способен поддерживать рост клеток растяжением, а при высоких - оказывает ингибирующий эффект, тормозя накопление биомассы, но ускоряя развитие репродукционных процессов подобно засолению.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шорина, Марина Владимировна, Москва

1. Аронова Е.Е., Шевякова Н.И., Стеценко JI.A., Кузнецов Вл.В. (2005) Индукция кадаверином экспрессии гена супероксиддисмутазы у растений Mesembryanthemum Доклады Академии Наук (в печати).

2. Дам Б.З. (1999) Аккумуляция полиаминов и выделение этилена у растений Mesembryanthemum crystallinum L. При гипертермии и засолении. Диссертация кандидата биологических наук. Москва: Институт физиологии растений РАН. 121 с.

3. Доспехов Б. А. (1985) Методика полевого опыта. М.: Агропромиздат. 259 с.

4. Круглова А.Г. (2001) Гормональная регуляция индукции САМ в растениях хрустальной травки Mesembryanthemum crystallinum L. при стрессе. Диссертация кандидата биологических наук. Москва: Институт физиологии растений РАН. 111с.

5. Кузнецов Вл.В., Хыдыров Б., Шевякова Н.И., Ракитин В.Ю. (1991) Индукция тепловым шоком солеустойчивости хлопчатника: участие полиаминов, этилена и пролина. Физиол. растений. Т.38. №6. С.877-883.

6. Кузнецов Вл. В. (1992) Индуцибельные системы и их роль при адаптации растений к стрессорным факторам. Диссертация в форме научного доклада, Кишинев — 74 с.

7. Кузнецов Вл. В., Старостенко Н. В. (1994) Синтез белков теплового шока и их вклад в выживание интактных растений огурца при гипертермии. Физиол. растений. Т. 41. №3. С. 374-380.

8. Кузнецов Вл. В., Шевякова Н. И. (1999) Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция. Физиол. Растений. Т.46. № 2. С 321-336.

9. Кузнецов Вл.В., Нэто Д.С., Борисова H.H., Дам З.Б., Ракитин В.Ю., Александрова С.Н., Холодова В.П. (2000) Стресс-индуцируемое формирование САМ и предельный адаптационный потенциал растений

10. Селье Г. (1977) Концепция стресса. Как мы ее понимаем в 1976 году. -Новое о гормонах и механизмы их действия. Киев: Наукова Думка. 27 с.

11. Строгонов Б. П. (1973) Метаболизм растений в условиях засоления. М.: Наука. 51 с.

12. Хочачка П., Сомеро Дж. (1988) Биохимическая адаптация. М.: Мир, 568 с.

13. Шевякова Н.И. (1966) О стимулирующем и токсическом действии диаминов на рапстения. Физиол.растений. Т. 13. №3. С.522-524.

14. Шевякова Н.И. (1979) Метаболизм серы в растениях. Из-во «Наука». 160 с.

15. Шевякова Н.И. (1981) Метаболизм и физиологическая роль ди- и полиаминов в растениях. Физиология растений. Т. 28. Вып. 4. С. 1052-1061.

16. Шевякова Н.И., Кирьян И.Г., Строгонов Б.П. (1984) Повышенная скорость образования спермидина у NaCl-резистентной клеточной линии Nicotiana sylvestris. Физиология растений. Т. 31, №5. С. 810-816.

17. Шевякова Н.И. (1988) Полиамины, рост и адаптация растений к стрессам. Рост и устойчивость растений. Отв. Ред. Саляев Р.К., Кефели В.И. Новосибирск: наука. С. 168-175.

18. Шевякова Н.И., Рощупкин Б.В., Парамонова Н.В., Кузнецов В.В. (1994) Стрессорный ответ клеток Nicotina sylvestris L. На засоление и высокую температуру. 1. Аккумуляция пролина, полиаминов, бетаинов и Сахаров. Физиол. Растений. Т.41. №4. С. 558-565.

19. Шевякова Н.И., Кирьян И.Г. (1995). Особенности регуляции биосинтеза метионина в солеустойчивых клетках Nicotiana sylvestris L. Физиол. Растений. Т.42. Вып.1. С.94-99.

20. Шевякова Н.И., Стеценко Л.А., Мещерякова А.Б., Кузнецов Вл. В. (2003) Изменение активности пероксидазной системы в процессе стресс-индуцированного формирования САМ. Тезисы докладов V Съезда физиологов растений России. Пенза. С. 359.

21. Adams Р., Nelson D. Е., Yamada S., Chmara W., Jensen R.G., Bohnert H.J., Griffiths H. (1998) Growth and development of Mesembryanthemum crystallinum (Aizoaceae). New Phytol. V. 138. P. 171-190.

22. Allakhverdiev S.J., Sakamoto A., Nishiyama Y., Inaba M., Murata N. (2000) Ionic and osmotic effect of NaCl-induced inactivation of photosystems I and II in Synechococcus sp. Plant Physiol. V. 123. P. 1047-1056.

23. Altman A., Bachrach U. (1981) Involvement of polyamines in plant growth and senescence. In: Advances in Polyamine Research, edited by Caldarera C.M., Zappia V., Bachrach U. Raven Press. New York. P. 365.

24. Altman A., Friedman R., Amir D., Levin N. (1982) Polyamine effect and metabolism in plants under stress conditions. In: Plant Growth Substances, edited by Wareing P.F. London/New York Acad. Press. P. 483-494.

25. Altman A. (1989) Polyamines and plant hormones. In: The Physiology of Polyamines, edited by Bacharch U. and Heimer Y.M. CRC Press, Boca Raton, FL. V. 2. P. 121-145.

26. Antognoni F., Pistocchi R., Casali P., Bagni N. (1995) Does calcium regulate polyamine uptake in carrot protoplasts? Plant Physiol. Biochem. V. 33. P. 701-702.

27. Antognoni F., Fornale S., Grimmer C., Komor E., Bagni N. (1998) Long-distance translocation of polyamines in phloem and xylem of Ricinus communis L. Plants. Planta. V. 204. P. 520-527.

28. Apelbaum A., Goldlust A., Icecson I. (1985) Control by ethylene of arginine decarboxylase activity in pea seedlings and its implication for hormonal regulation of plant growth. Plant Physiol. V. 79. P. 635-640.

29. Aziz A., Martin-Tanguy J., Larher F. (1997) Plasticity of polyamine metabolism associated with high osmotic stress in rape leaf discs and with ethylene treatment. Plant Growth Regul. V. 21. P. 153-163.

30. Aziz A., Martin-Tanguy J., Larher F. (1998) Stress-induced changes in polyamine and tyramine levels can regulate □ ukaryo accumulation in tomato leaf discs treated with sodium chloride. Physiol. Plant. V. 104. P. 195-202.A168

31. Bagni N. (1966) Aliphatic amines and a growth factor of coconut milk asstimulating cellular proliferation of Helianthus tuberosus (Jerusalem artichoke) in vitro. Experientia. V. 22. P. 732.

32. Bagni N., Seraflni-Fracassini D. (1974) The role of polyamines as growth factors in higher plants and their mechanism of action. Plant Growth Subs. Part VII. Tokio: Hirokawa Publ. Co. P. 1205-1271.

33. Bakhanashvili M., Icekson I., Apelbaum A. (1985) Cadaverine formation by specific lysine decarboxilation in Pisum sativum seedlings. Plant Cell Reports. V.4. P.297-299.

34. Bastola D.R., Minocha S.C. (1995) Increased putrescine biosynthesis through transfer of mouse ornithine decarboxylase cDNA in carrot promotes somatic embryogenesis. Plant Physiol. V. 109. P. 63-71.

35. Basu R., Maitra N., Ghosh B. (1988) Salinity results in polyamine accumulation in early rice (Oryza sativa L.) seedlings. Aust. J. Plant Physiol. V. 15. P. 777786.

36. Bates L.S., Waldren R.P. And Teare I.D. (1973) Rapid determination of free □ukaryo for water-stress studies. Plant and Soil. V.39. P. 205-207.

37. Beier H., Fecker L.F. And Berlin J. (1987) Lysine decarboxylase from Hafnia, molecular data and preparation of polyclonal antibodies. Z.Naturforsh. C.42. S.1307-1312.

38. Bell E., Malmberg R.L. (1990) Analysis of a cDNA encoding arginine decarboxylase from oat reveals similarity to the Escherichia coli arginine decarboxylase and evidence protein processing. Mol.Gen.Genet. V. 224. P. 431-436.

39. Besford R.T., Richardson C.M., Campos J.L., Tiburcio A.F. (1993) Effect of polyamines on stabilization of molecular complexes of thylakoid membranes of osmotically stressed oat leaves. Planta. V. 189. P. 201-206.

40. Bohnert H.J., Ostrem J.A., Cushman J.C., Michalowski J.C., Rickers J., Meyer G., DeRocher E.J., Vernon D.M., Krueger M., Vazquez-Moreno L., Velten J.,

41. Hofher R., Schmitt J.M. (1988) Mesembryanthemum crystallinum, a higher plant model for the study of environmentally induced changes in gene expression. Plant Mol Biol Rep. V. 6. P. 10-28.

42. Bohnert H.J., Nelson D.E., Jensen R.G. (1995) Adaptation to environmental stress. Plant Cell. V. 7. P. 1099-1111.

43. Borell A., Culianez-Macia A., Altabella T., Besford R.T., Flores D., Tiburcio A. F. (1995) Arginine decarboxylase is localized in chloroplasts. Plant Physiol. V. 109. P. 771-776.

44. Borell A., Besford R.T., Altabella T., Masgrau C., Tiburcio A.F. (1996) Regulation of arginine decarboxylase by spermine in osmotically stressed oat leaves. Physiol. Plant. V. 98. P. 105-110.

45. Bors N., Langebartels C., Michel H., Sanderman Jr. (1989) Polyamines as radical scavengers and protectants against ozone damage. Phytochemistry. V. 28. P. 1589-1595.

46. Bouchereau A., Aziz A., Larher F., Martin-Tanguy J. (1999) Polyamines and environmental challenges: recent development. Plant Science. V. 140, P. 103-125.

47. Bracale M., Levi M., Savini C., Dicarto N., Galli M.G. (1997) Water deficit in pea root tips: effect on the cell cycle and on the production of dehydrin-like proteins. Ann. Bot. V. 79. P. 593-600.

48. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitations of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analitical Biochemistry. V. 72. P. 248-254.

49. Bratton D.L. (1994) Polyamine inhibition of transbilayer movement of plasma membrane phospholipids in the erythrocyte ghost. J. Biol. Chem. V. 269. P. 22517-22523.

50. Brennan T., Frenkel C. (1977) Involvment of hydrogen peroxide in the regulation of senescence in pear. Plant Physiol. V.59. P.411-416.

51. BriegerL. (1885-1886) Über ptomaine. Berlin. Bd.1-3.

52. Bright S.W., Lea P.J., Miflin B.J. (1980) The regulation of methionine biosynthesis and metabolism in plants and bacteria. Sulfur in Biology: Ciba Foundation Symp. 72. Experienta Medica. P. 101.

53. Biyan J.K. (1980) In the Biochemistiy of Plants. Ed.Miflin B.J. Academic. New York. V.5. P.403-452.

54. Buchanan B.B., Gruissem W., Jones R.L. (2000) Biochemistry and molecular biology of plants. American society of plant physiologists. Rockville, Maryland.

55. Bueb J.L., Da Silva A., Mousli M., Landry Y. (1992) Natural polyamines stimulate G-proteins. Biochem. J. V. 282. P. 545-550.A60

56. Cazale A.-C., Rouet-Mayer M.-A., Barbier-Brygoo H., Mathien Y., Lauriere C. (1998) Oxidative burst and hypoosmotic stress in tobacco cell suspensions. Plant Physiol. V. 116. P. 659-669.

57. Cho S.H. (1983) Enhancement by putrescine of gibberellin-induced elongation in hypocotyls of lettuce seedlings. Plant Cell Physiol. V. 24. P. 305-308.

58. Chu C., Dai Z., Ku M.S.B., Edwards G.E. (1990) Induction of Crassulacean acid metabolism in the facultative halophyte Mesembryanthemum crystallinum by abscisic acid. Plant Physiol. V. 93. P. 1253-1261.

59. Coleman R.G. and Richards F.J. (1956) Physiological studies in plant nutrition. Some aspects of nitrogen metabolism in barley and other plants in relation to potassium deficiency. Ann.Bot., N.S. V.20. N 79.

60. Cushman J.C., Bohnert H.J. (1997) Molecular genetics of Crassulacean Acid Metabolism. Plant Physiol. V. 113. P. 667-676.

61. DeScenzo R.A., Minocha S.C. (1993) Modulation of cellular polyamines in □ukaryo by transfer and expression of mouse ornithine decarboxylase cDNA. Plant Mol. Biol. V. 40. P. 235-269.

62. Dobrovinskaya O.R. Muniz J., Pottosin I.I. (1999a) Inhibition of vacuolar ion channels by polyamines. J. Membr. Biol. V. 167. P. 127-140.

63. Dobrovinskaya O.R. Muniz J., Pottosin I.I. (1999b) Assimetric block of the plant vacuolar Ca (2+) permeable channel by organic cations. Eur. Biophys. J. V. 28. P. 552-563.

64. Dodds R.A., Pitsillides A.A., Frost T.B. (1990) A quantitative cytochemical methods for ornithine decarboxylase activity. J. Histochem. Cytochem. V. 38. P. 123-127.

65. Dong J.G., Fernandez-Maculet, Yang S.F. (1992) Purification and characterization of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate oxidase from apple fruit. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. V. 89. P. 9789-9793.

66. Drolet G., Dumbroff E.B., Legge R.L., Thompson J.E. (1986) Radical scavenging properties of polyamines. Phytochemistry. V. 25. P. 367-371.

67. Ecker J.R. (1995) The ethylene signal transduction pathway in plants. Science. V. 268. P. 667-675.

68. Erdei L., Szegletes Z., Barabas K., Pestenacz A. (1996) Responces in polyamine titer under osmotic and salt stress in sorghum and maize seedlings. J. Plant Physiol. V. 147. P. 599-603.

69. Escribano M.I., Aguado P., Reguera R.M., Merodio C. (1996) Conjugated PA levels and Put synthesis in Cherimoya fruit during storage at different temperatures. J. Plant Physiol. V. 147. P. 736-742.

70. Evans Ph.T., Malmberg R.L. (1989) Do polyamines have roles in plant development? Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V. 40. P. 235-269.

71. Fecker L.F., Beier H. And Berlin J. (1986) Cloning and characterization of a lysine decarboxylase gene from Hafnia alvei. Mol.Gen.Genet. V.203. P. 177-184.

72. Fecker L.F., Hillebrandt S., Riigenhagen C., Herminghaus S., Landsmann J. and Berlin J. (1992) Metabolic effect of a bacterial lysine dekarboxylase gene expressed in hairy root culture of Nicotiana glauca. Biotechnology Letters. V.14. №11. P.1035-1040.

73. Feuerstein B.G., Pattabiraman N., Marton L.J. (1990) Molecular mechanisms of the interactions of spermine with DNA: DNA bending as a result of ligand bending. Nucleic Acids Res. V. 18. P. 1271-1282.

74. Flores H.E., Galston A.W. (1982) Analysis of Polyamines in Higher by Performance Liquid Chromatography. Plant Physiol. V.69. P.701-706)

75. Flores H.E., Galston A.W. (1984) Osmotic stress-induced polyamine accumulation in cereal leaves. I. Physiological parameters of the response. Plant Physiol. V. 75. P. 102-109.

76. Flores H.E., Filner P. (1985) Polyamine catabolism in higher plants: characterization of pyrroline dehydrogenase/ Plant Growth Regul. V. 3. P. 277-291.

77. Flores H.E. (1990) Polyamine and heat stress. In: Stress responces in plants: adaptation and acclimation mechanisms, edited by Allsher R.G. and Cumming J.R. Wiley Liss Inc., New York. V. 12. P. 217-239.

78. Flores H.E. (1991) Changes in polyamine metabolism in response to abiotic stress. In: The Biochemystry and Physiology of Polyamines in Plants, edited by Slocom R.D., Flores H.E. CRC Press, Boca Raton, FL. P. 214-225.

79. Fowler M.R., Kurby M.J., Scott N.M., Slater A., Elliott M.C. (1996) Polyamine metabolism and gene regulation in the transition of autonomous sugar beet cell in suspension culture from quiescence to division. Physiol. Plant. V. 98. P. 439-446.

80. Friedman R., Levin N., Altman A. (1986) Presence and identification of polyamines in xylem and phloem exudates of plants. Plant Physiol. V. 82. P. 1154-1157.

81. Fuhrer J., Kaur-Sawhney R., Shih L.M., Galston A.W. (1982) Effect of exogenous 1,3-diaminopropane and spermidine on senescence of oat leaves. II. Inhibition of ethylene and possible mode of action. Plant Physiol. V. 70. P. 1597-1600.

82. Galston A.W., Kaur-Sawhney R. (1995) Polyamines as endogenous growth regulators. Plant hormones: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. P. 158178.

83. Galston A. W., Kaur-Sawhney R., Altabella T. and Tiburcio A. F. (1997) Plant polyamines in reproductive activity and responce to abiotic stress. Bot. Acta. V. 110. P. 197-207.

84. Gamarnik A., Frydman R.B. (1990) Effect of cadaverine on root elongation and second root formation in soybean (Glycine max.) seedlings. Abstract of International Symposiom on polyamines in molecular and medical biology. P.64.

85. Gamarnik A., Frydman R.B. (1991) Cadaverine, an essential diamine for the normal root development af germinating soybean (Glycine max.) seeds. Plant Physiol. V.97. N2. P.778.

86. Guilfoyle T.J., Hanson J.B. (1973) Increased activity of chromatin-bound ribonucleic acid polymerase from soybean Dukaryotic with spermidine and high ionic strength. Plant Physiol. V. 51. P. 1022-1030.

87. Guye M.G. Vigh L., Wilson J.M. (1986) Polyamine titre in relation to chilling sensitivity in Phaseolus sp. J.Exp.Bot.

88. Hamana K., Matsuzaki S. (1982) Widespread occurrence of norspermidine and norspermine in Dukaryotic algae. J.Biochem. (Tokyo). V. 91. P. 1321-1328.

89. Hamasaki N., Oshima T., Pösö H. (1986) Biosynthetic pathways of unusual polyamines of thermophilic bacteria. Abstr. International conference on polyamines in life sciences. Japan. P. 171.

90. Hartmann T., Schoofs G., Wink M. (1980) A chloroplast-localized lysine decarboxylase of Lupinus polyphyllus. FEBS Letters. V. 115. №. P. 35-38.A130

91. Hasegawa P.M., Bressan R.A., Zhu J.-K., Bohnert H.J. (2000) Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. V. 51. P. 463-497.

92. Herbs E.I., Shell E.E. (1948) Putrescine as a growth factor for Hemophilus parainfluenzae. J.Biol.Chem. V.176. N2.

93. Herminghaus S., Schreier P.H., McCarthy J.E.G., Landsmann J., Botterman J. and Berlin J. (1991) Expression of Bacterial lysine decarboxylase gene and transport of the protein into chloroplasts of transgenic tobacco. Plant.Mol.Biol. V.17. P.475-486.

94. Hiatt A. (1989) Polyamine synthesis in maize cell lines. Plant Physiol. V. 90. P. 1378-1381.

95. Kakkar R.K., Sawhney V.K. (2002) Polyamine research in plants a changing perspective. Physiol. Plant. V. 116. P. 281-292.

96. Kaur-Sawhney R., Flores H.E., Galston A.W. (1980) Polyamine-induced DNA synthesis and mitosis in oat leaf protoplasts. Plant Physiol. V. 65. P. 368371.

97. Kaur-Sawhney R., Flores H.E., Galston A.W. (1981) Polyamine oxidase in oat leaves: a cell wall localized enzyme. Plant Physiol. V. 68. P. 494-498.

98. Kaur-Sawhney R., Shih L.M., Flores H.E., Galston A.W. (1982) Relation of polyamine synthesis and titer to aging and senescence in oat leaves. Plant Physiol. V. 69. P. 405-411.

99. Kaur-Sawhney R., Tiburcio A.F., Altabella T., Galston A.W. (2003) Polyamines in plants: An overview. Journal of Cell and Molecular Diology. V. 2. P. 1-12.

100. Kende H. (1983) Ehylene biosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V. 44. P. 283-307.

101. Kingsbury R.W., Epstein E., Pearcy R.W. (1984) Physiological responces to salinity in selected lines of wheat. Plant Physiol. V. 74. P. 417-423.

102. Kinnersle A.M., Fang Lin. (2000) Receptor modifiers indicate that y-aminobutyric acid is potential modulator of ion transport in plants. Plant Growth Reg.1. V.32. N1. P.65-68.

103. Koenig H., Goldstone A., Lu C.Y. (1983) Polyamines regulate calcium fluxes in a rapid plazma membrane occurrence. Nature. V. 305. P. 530-534.

104. Kotzabazis K., Dorneman D., Novakoudis E. (1993) Polyamines in photosynthetic apparatus. Photosystem II highly resolved subcomplexes are enriched in spermine. Photosynth. Res. V. 38. P. 83-88.

105. Kramer G.F., Wang C.Y. (1989) Correlation of reduced chilling injury with increased spermidine and spermine levels in zucchini squash. Physiol. Plant. V. 76. P. 479-482.

106. Kramer G.F., Wang C.Y. (1990) Effect of chilling and temperature preconditioning on the activity of polyamine biosynthetic enzymes in zucchini squash. J. Plant Physiol. V. 136. P. 115-122.

107. Krishnamurthy R., Bhagnat K.A. (1984) Polyamines as modulators of salt tolerance in rice cultivars. Plant Physiol. V. 91. P. 500-504.

108. Krishnamurthy R. (1991) Amelioration of salinity effect in salt tolerant rice (Oryza sativa L.) by foliar application of putrescine. Plant Cell Physiol. V. 32. №5. P. 699-703.

109. Kuehn G.D., Rodriguez-Garay B., Bagga S., Phillips G.C. (1990) Novel occurrence of uncommon polyamines in higher plants. Plant Physiol. V. 94. P. 855-857.

110. Malmberg R.L., Smith K.E., Bell E., Cellino M.L. (1992) Arginine decarboxilase of oats is clipped from a precursor into two polypeptides found in the soluble enzyme. Plant Physiol. V. 100. P. 146-152.

111. Malmberg R.L., Cellino M.L. (1994) Arginine decarboxylase of oats is activated by enzymatic cleavage into two polypeptides. J. Biol. Chem. V. 28. P. 27032706.

112. Martin-Tanguy J. (1997) Conjugated polyamines and reproductive development: biochemical, molecular and physiological approaches. Physiol. Plant. V. 100. P. 675-688.

113. Messiaen J., Cambier P., Van Cutsem P. (1997) Polyamines and Pectins. I. Ion Exchange and selectivity. Plant Physiol. V. 113. P. 387-395.

114. Morel C., Villanueva V.R., Queiroz O. (1980) Are polyamine involved in the induction and regulation of the Crassulacean acid metabolism? Planta. V. 149. P. 440-444.

115. Negrel J. (1989) The biosynthesis of cinnamoylputrescines in callus tissue cultures of Nicotiana tabacum. Phytochemistry. V. 28. P. 477-481.

116. Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R., Hall M.A. (1993) Ethylene and phosphorylation of pea epicotyl proteins. Cellular and Molecular Aspects of the Plant Hormone Ethylene, edited by Pech J.C. et al. Dordrecht: Kluver Academic. P. 371-372.

117. Nurse P. (1990) Universal control mechanisms regulating onset of M-phase. Nature. V. 334. P. 667-678.

118. Ormrod D.P., Beckerson D.W. (1986) Polyamines as antiozonats for tomato. HortScience. V. 21. P. 1070-1071.

119. Oshima T. (1983) Novel polyamines in Thermus thermophylus. Methods Enzymol. V. 94. P. 401-410.

120. Ozaki S., DeWald D.B., Shope J.S., Chen J., Prestwich G.D. (2000) Intracellular delivery of phosphoinositides and inositol phosphates using polyamine carriers. Proc. Natl. AcadJ Csi. USA. V. 97. P. 11286-11291.

121. Pedreno M.A., Ros Barcelo A., Sabater F., Minoz R. (1989) Control by pH of cell wall peroxidase activity involved in ligniflcation. Plant Cell Physiol. V. 30. P. 237-241.

122. Phan A.P.H., Ngo T.T., and Lenhoff H.M. (1982) Spectrophotometry assay for lisine decarboxylase. Analytical Biochemistry. V. 120. P. 193-197.

123. Pistocchi R., Bagni N. (1986) Polyamine uptake< kinetics and interactions with Ca in carrot cell culture. Abstract of International Conference on Polyamones in Life Sciences. Japan. P. 57-58.

124. Pistocchi R., Kashiwagi K., Miyamoto S., Nucui E., Sadakata Y., Kobayashi H., Igarashi K. (1993) Characteristics of the operon for putrescine transport system that maps at 19 minutes on the Escherichia coli chromosome. J. Biol. Chem. V. 268. P. 146-152.

125. Popovic R.K., Kyle D.J., Cohen A.S., Zalik S. (1979) Stabilization of thylakoid membranes by spermine during stressOinduced senescence of barley leaf discs. Plant Physiol. V. 64. P. 721-726.

126. Prakash L., Prathapsenan G. (1988) Effect of NaCl salinity and putrescine on shoot growth, tissue ion concentration and yield of rice (Oryza sativa). J. Agron. Crop Sci. V. 160. P. 325-334.

127. Rabiti A.L., Pistocchi R., Bagni N. (1989) Putrescine uptake and translocation in higher plants. Physiol. Plant. V. 77. N 2. P. 225-230.

128. Racz I., Kovacs M., Laszity D., Veisz O., Szalai G., Paldi E. (1996) Effect of short-term low temperature stress on polyamine biosynthesis in wheat genotypes with varying degrees of frost tolerance. J. Plant Physiol. V. 148.1. P. 368-373.

129. Ramakrishna S., Adiga R.P. (1975) Amine levels in Lathirus sativus seedlings during development. Phytochem. V. 14. P. 63-68.

130. Razin S., Gery I.A., Bachrach U. (1959) The degradation of natural polyamines and diamines by bacteria. Biochem. J. V.71. N3.

131. Reggiani R., Bertani A. (1989) Effect of decreasing oxygen concentration on polyamine metabolism in rice and wheat shoots. J. Plant Physiol. V. 135. P. 375-377.

132. Reggiani R., Hochkoeppler A., Bertani A. (1989) Polyamines and anaerobic elongation of rice coleoptile. Plant Cell Physiol. V. 30. P. 893-898.

133. Reggiani R., Giussani P., Bertani A. (1990) Relationship between the accumulation of putrescine and the tolerance to oxygen-deficit stress in gramineae seedlings. Plant Cell Physiol. V. 31. P. 484-494.

134. Richards F.J., Coleman R.G. (1952) Occurence of putrescine in potassium deficiency barley. Nature. V. 170. P. 460.

135. Richards F.J. (1954) Potassium deficiency in relation to putrescine production. Rapp. et commus. Huitieme Congr. Inter.Bot. Paris. Sec. 11-12.

136. Roberts D.R., Dumbroff E.B., Thompson J.E. (1986) Exogenous polyamines alter membrane fluidity in bean leaves a basic for potential misinterpretation of their true physiological role. Planta. V. 167. P. 395-401.

137. Roy M., Ghosh B. (1996) Polyamines, both common and uncommon, under heat stress in rice {Oryza sativa) callus. Physiol. Plant. V. 98. P. 196-200.

138. Ruz V., Fluhr R. (1993) Ethylene signal is transducedvia protein phosphorylation events in plants. Plant Cell. V. 5. P. 523-530.

139. Santa-Cruz A., Acosta M., Peres-Alfocea F., Bolarin M.C. (1997) Changes in free polyamine levels induced by salt stress in leaves of cultivated and wild tomato species. Physiol. Plantarum. V. 101. P. 341-346.

140. Schuppler U., Pe P.H., John P.C.C., Munns P. (1998) Effect of water-stress on celldevision and cell-devision cycle 2-like cell-cycle kinase actyvity in wheat leaves. Plant Physiol. V. 118. P. 667-678.

141. Serafini-Fracassini D., Del Duca S., Beninati S. (1995) Plant transglutaminases. Phytochemistry. V. 40. P. 355-365.

142. Sheath P.H.E. (1955) Putrescine as an essential growth factor for mutant of Aspergillus nidulans. Nature. V.175. P. 1055.

143. Shevyakova N.I., Sadomov N.G., Kuznetsov Vl.V. (2000) Regulatory polyamines-ethylene interaction in Arabidipsis thaliana L. S-adenosylmethionine overproducing mutant. Plant Physiol. Biochem. Special issue. V.38. P.205.

144. Shevyakova N.I., Rakitin V.Yu., Dam B.D., Sadomov N.G., Kuznetsov Vl.V. (2001) Heat-shock induced cadaverine accumulation and translocation throughout the plant. Plant Science. V. 161. P. 1125-1133.

145. Slocum R.D., Kaur-Sawhney R., Galston A.W. (1984) The physiology and biochemistry of polyamines in plants. Archives of Biochemistry and Biophysics. V. 235. N 2. P. 283-303.

146. Slocum R.D. (1991) Polyamine biosynthesis in plants. In: The Biochemystry and Physiology of Polyamines in Plants, edited by Slocom R.D., Flores H.E. CRC Press, Boca Raton, FL. P. 78-89.

147. Slocum R.D., Furey M.J. (1991) Electron-microscopic cytochemical localization of diamine and polyamine oxidases en pea and maize tissues. Planta. V. 183. P. 443-450.

148. Smith T.A., Wilshire G. (1975) Distribution of cadaverine and other amines in higher plants. Phytochemistry. V. 14. P. 2341-2346.

149. Smith T.A. (1977) Further properties of the polyamine oxidase from oat seedlings.

150. Phytochemistry. V. 16. P. 1647-1649. Smith T.A. (1985) Polyamines in plants. In: Polyamines in plant, edited by Galston

151. Thomas J.C., Richard L. De Armond, Bohnert H.J. (1992) Influence of NaCl on growth, proline and phosphoeno/pyruvate carboxilase levels in Mesembryanthemum crystallinum suspension cultures. Plant Physiol. V. 98. P. 626-631.

152. Tiburcio A.F., Masdeu M.A., Dumortier F.M., Galston A.W. (1986) Polyamines metabolism and osmotic stress. I. relation to protoplast viability. Plant Physiol. V. 82. P. 369-374.

153. Tiburcio A.F., Campos J.L., Figueras X.L., Besford R.T. (1993) Recent advances in the understanding of polyamine functions during plant development. Plant Growth Regul. V. 12. P. 331-340.

154. Tiburcio A.F., Besford R.T., Capell T., Borell A., Testillano P.S., Resueno M.C. (1994) Mechanisms of polyamine action during senescence responces induced by osmotic stress. J. Exp. Bot. V. 45. N. 281. P. 1789-1800.

155. Tiburcio A.F., Altabella T., Borell A., Masgrau C. (1997) Polyamine metabolism and its regulation. Physiol. Plant. V. 100. P. 664-674.

156. Tomitori H., Kashiwagi K., Sakata K., Kakinuma Y., Igarashi K. (1999) Identification of a gene for a polyamine transport protein in yeast. J. Biol. Chem. V. 274. P. 3265-3267.

157. Torrigiani P., Scoccianti V. (1995) Regulation of cadaverine and putrescine levels in different organs of chick-pea seed and seeflings during germination. Physiol. Plant. V. 93. P. 512-518.

158. Turano F.J., Kramer G.F. (1993) Effect of metabolic intermediates on the accumulation of polyamines in detached soybean leaves. Phytochemistry. V. 34. P. 959-968.

159. Walden R., Cordeiro A., Tiburcio A.F. (1997) Polyamines: small molecules triggering pathways in plant growth and development. Plant Physiol. V. 113. P. 1009-1013.

160. Walton N.J., Peerless A.CJ., Robins RJ., Rhodes M.J.C., Boswell H.D., Robins D.J. (1994) Purification and properties of putrescine N-methyltransferase from transformed roots of Datura stramonium L. Planta. V. 193. P. 9-15.

161. Westhoff P., Nelson N., Bunemann H., Herrman R.G. (1981) Curr. Genet. V. 4. P. 109-120.

162. Willadino L.,Camara T., Boget N., Claparols I., Santos M., Torne J.M. (1996) Polyamine and free amine acid variations in NaCl-treated embryogenic maize callus from sensitive and resistant cultivars. J. Plant Physiol. V. 149. P. 179-185.

163. Wink M., Hartmann T. (1982) Localization of the enzymes of quinolizidine alkaloid biosynthesis in leaf chloroplasts of Lupinus polyphyllus. Plant Physiol. V. 70. P. 74-77.

164. Winter K. (1973) C02-Fixirungsreaktionenbei der Salzpflanze Mesembryanthemum crystallinum unter variierten Aubenbendingungen. Planta. V. 114. P. 75-85.

165. Xiong H., Stanley B.A., Tekwani B.L., Pegg A.E. (1997) Processing of mamalian and plant S-adenosylmethionine decarboxylase proenzymes. J.Biol.Chem. V. 272. P. 28342-28348.

166. Yamotomo S., Aoyama Y., Kawaguchi M., Iwado A., Makita M. (1983) Identification and determination of sym-homospermidine in roots of water hyacinth Eichhornia crassipes Solms. I I Chem. Pharm. Bull. V. 31. P. 33153318.

167. Yang S.F., Hoffman N.E. (1984) Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plant. Annu. Rev. Plant Physiol. V. 35. P. 155-189.

168. Young N.D., Galston A.W. (1983) Putrescine and acid stress. Plant Physiol. V. 71. P. 767-771.

169. Zarembinski T.I., Theologis A. (1994) Ethylene biosynthesis and action: a case of conservation. Plant Mol. Biol. V. 26. P. 1579-1597.

170. Zhou Z., Brown N., Crist B. (1995) Stress induced ethylene biosynthesis in pine needles a search for the putative 1-aminocyclopropane 1-carbocylic acid independent pathway. J. Plant Physiol. V. 145. P. 1047-4051

Информация о работе

Шорина, Марина Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.12

Диссертация

Аккумуляция кадаверина и его физиологическая роль при действии солевого стресса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы