Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

31Р-ЯМР спектроскопия бактерий и грибов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "31Р-ЯМР спектроскопия бактерий и грибов"

?Г6 од-2 5 ЛПР

ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи УДК

Щипанова Ирина Николаевна

31Р-ЯМР СПЕКТРОСКОПИЯ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ.

03.00.02 Биофизика ,

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - !993

Работа выпояюна в Институте Хинической Физики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Сибельдина Л.А.

N

Официальные оолонекты: локтор физико-математических наук

Пулатова М. К.

^ кандидат медицинских наук

Панов В.О.

Ведущая организация: Государственна Научный Центр Антибиотиков. • Россия

Защита диссертации состоится

в 1С часов на заседании Специализированного Совета Д. 170. Ol.Cil при Агенстве биоинформатики и экологии человека. MHO 'Форун'. по адресу: 1178. Москва. ГСП-7. пр-т. 60-лстия Октября, д.7x1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Агенстве биоинфорнатикх и экологии человека

Автореферат разослан «I

7, »Oil 994 р.

Ученый секретарь Специализированного доктор биологических наук

Совета

Львов К.М.

ОбШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Благодаря своим уникальных свойствам микроорганизмы находят широкое применение в разных областях жизнедеятельности человека. Развитие метода "Р-ЯМР спектроскопии высокого разрешения микроорганизмов началось в 70-х годах. но обладая определенными преимуществами перед другим нетодами исследований, в той числе и перед методами 'н.^С-ЯМР спектроскопиями. он скоро зарекомендовал себя как один из плодотворных ц перспективных методов.

Цель и задачи. Целью данной работы било дальнейшее развитие применения метода МР-ЯКР спектроскопии высокого разрешения для изучения фосфатного метаболизма в нихроорганиэмах: бактериях и грибах. Достижение данной цели предполагало решение следующих задач:

- исследование особенностей биохимии бактерии в условиях окислительного стресса, идентификация соединения. вц»батываемого рядом бактерий в ответ на окислительный стресс;

- выявление взаимосвязи показателей параметров В1Р-Я№ спектра и длины цепи полифосфатов, разработка кетодики определения длины цепи и концентрации полифосфатов с г.омошью "Р-ЯМР свистров;

изучение взаимосвязи уровней внутриклеточного рН. фосфорного обмена и,-уровня антибиотикообразования в грибе РиггсНиа сосЫпеив-

Научная новизна и практическая ценность. В итоге работы:

- было обнаружено и идентифицировано новое фосфорное соединение сг-метилбутап-1,2.3.4-тетраол-2.4-циклопирофосфатЭ . которое вырабатывается рядом бактерий в условиях окислительного стресса.

о

\Л

сделано предположение об участии данного соединения в - защитном механизме клетки в экстремальных условиях;

-разработаю нетолика определения длины цепи и концентрации полифосфатов с помощью >Р-ЯМР спектров, на этой основе расчитама ляпа цели полифосфатов для разных фракций в различные моменты роста культуры БассЬагопусез сегеУ1эае;

- исследовааы особенности фосфорного метаболизма. найдена

ззаиносвязь между внутриклеточный рН и уровнем антибиотикообразования у разных штаммов Г.соссдлеип; предложена схена регулирования биосинтеза антибиотика у р.сосохпеио в результате дшамики изменения внутриклеточного рН. Апробация работы и публикации. Основные материалы диссертации бьши представлены ва конкурсе фундаментальных работ Института биохимии им. А.И.Баха СМосква. 1992. 19933; 4 Всесоюзной конференции ' Биоантиоксшвнт' С Москва. 19923; 15 Международном симпозиуме по ароххан СРнгл. 19913, 10 Европейском конгрессе общества магнитного резонанса С Рим. 19933.

По материалам диссертации опубликовано 13 научных статей и 5 тезисов в сборниках трудов конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит иэ введения, литературного обзора. трех глав. выводов и списка литературы.

Работа азложена на 121 страницах и включает 75 листов

основного текста. 31 рисунок. 6 таблиц. 166 источников цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава 1. Основными объектами исследований были следуюже культуры микроорганизмов: ВгеуаЬа^еНип авпопгадепег, ЯусоЬасЪегхип гюевпа^г.

Культуры выращивали в колбах обьвмон 750нл на качалке при С^З*^ на средах разного состава с- добавками и без добавок индукторов нового фосфорного соединения. Это вещество хорошо экстрагировалось 50/С этиловым спиртом, для получения чистого соединения применяли йонообненную хроиотографию СЛаукс 1x43.

Исследование нолекулярной нассы соединения онпоягено методой вторично-эниссионной масс-спектрометрии на приборе ИИ 1201-Э. Глава 2. Объектами исследования били культуры 5.сегеУ1вае. 5.саг15Ьегвепэ15.

Культуры выращивали в колбах объемом 200нл на среде Ридор при 29°С при непрерывной перемешивании. Точками контроля были выбраны моменты роста на 1. 3. 6. 10.3, 15 и 24 часа развития культуры.

Длину цепи определили для пяти полифосфатнш: фракций на основе "данных /"Р-ЯГСР спектров экстрактов.

Глава 3. Объектани исследований были штампы гриба К.сосС1пеит, различавшиеся по своей антибиотической активности в 10 раз.

Культуру выращивали в колбах объемом 750нл на качалке при на комплексной среде в течение 7 суток. Точками контроля были выбраны нопенты роста гриба на 2.4,7 сутки развития.

Контроль эа изменением активности штампов проводили методом ВЭ2Х. . ■ " .

*Н, "с. мР-ЯМР спектри регистрировались н а приборах: АМХ-300. АГОС-400 С"Згикег"Э. В качестве образцов для ЯИР-исследованиЯ использовали экстракты и клеточные суспезии клетох. Для решения задач исследований применяли методики двунеряэй гомо-, гетеро-ядерноЯ корре"яционноЯ спгкторскопия СС05Т).

Па основе интегральных кривых с.;рд~ляли количественное содержание соединения з образце, в ряде случаев для этого использовали ранее построенные калиброзочные крише.

СОДЕРЖАНИЕ

Во введении обосновывается актуальность работы, сформулированы цели диссертации.

В литературное обзоре проведен анализ данных по • тене ' 31Р-ЯМР спектроскопия высокого разрешения в изучении фосфатного нетаболизна шкроорганизнов•, в отдельный раздел вынесен обзор об особенностях '1Р-ЯМР спектроскопии высокого разрешения полифосфатов шкроорганизнов.

Главы затрагивает разные проблемы фосфатного нетаболизна в клетке микроорганизмов. Каждая из глав имеет обзор, в котором дается понятие по исследуемой тене. ставится задача исследования. Каждая глава заканчивается выводом.

Глава 1 посвячена исследованию особенностей биохимии бактерий в

условиях окислительного стресса. и идентификации нового

фосфорного соединения СНОО. вырабатывапого рядом бактерий в ответ

на окислительный стресс. Новизна исследований подтверждается

данными ,1Р-Я!Р спектров экстракта НСС. где химический сдвиг

одного сигнала фосфорного атома соответствует 6—14.8м. д. . а

второй фосфорвий атом, соединенный с первый пирофосфатной связью

СКССВ. 3-г2Ги>, инеет <5—10. вн.я. Срис.15. На основе данных метода

ЯМР разных ядер с*Н. "с. . а также двумерной гоио- и гетеро-

корреляционноЯ спектроскопии НФС было идентифицировано как

2-мети лбутан-1.2.3.4- тетраол-2.4-циклопирофосфат Срис.23. Таблица

1 представляет данные соотнесения *Н."с-ЯНР спектров НОС.

Структура била ' подтверждена методой Масс-спектрометрии.

К СН0СЭ-27В. г

По данкщ "Р-ЯМР спектров щелочной гидролиз НФС приводит к

появлению новой структуры - трехчленного цикла, замкнутого на один атом фссфора С¿-17.4м. д. > . это соединение било идетжфииировано как 2-метилбутан-1,2.3.4-тетраол-1.2-ииклофосфо-4-фосф«т Срис.33. Относительная легкость перехода основной формы в новый иикл Свозможен переход и спонтанной рециклиэацииЭ [ позволяет предположить, что и этот новый цикл наряду с основнь» соединением может являться естественным метаболитом клетки. При агработке НфС борат-йонами в слабощелочной среде происходит' образование комплекса. . вызывающего обратимое СрН-зависиное> . смешение химического сдвига с <5—14. вн. д. до <5—15.5«. д.

Согласно экспериментальным данным. бактерии» способные накапливать НФС. обладают устойчивостью к редокс-ииклируюшим лекарствам, что ножет быть связано с регуляторньи действием НОС на катионныЛ состав цитоплазмы бактерий. Для проверки данного предположения были проведены модельные опыты по связыванию НФС с катионами СИе2+, Са2+, 1п2*, Сс12+). Обнаружено, что ЮС селективно связывается с йонамк металлов, и видимо, эта способность НФС леяит в основе регуляции действий катион-зависимых ферментов.

Таким образом, обнаруженный нами новый ижелопирофосфат синтезируется в ряде бактерий в условиях окислительного стресса. Вероятно. НФС является элементом антистрессорной заамты клетки Пока нельзя однозначно указать какие процессы аключает или выключает НОС в клетке при действии окислительного стресса. Также остаются нерешенными вопросы. связанные с яеханнзмами энергетического, углеродного и других обменов» вызывающих образование НОС.

Следует заметить.• что среди бактерий, синтезирукзих НФС. есть микоБактерии. которыг печально известны как возбудители таких

-10 -И -12 -13 -14 -15 ХИМИЧЕСКИЙ СДВИГ , М.Д.

Рис. 1 З'Р-ЯМР спектр НФС.

- Н СНз I I

Н2С-С-С-СН2 1111

0 ОНО ОН

1 I

но — Р-О-Р-ОН II II 0 0

Рис. 2. Формула НФС (2-метилбуган-1,2,3,4-тстраол-2,4-ии1и10пирофосфат).

Таблица 1. Соотнесение сигналов в 'Н и '-'С - ЯМР спектрах НФС.

'Н ЯМР спектр (м. д.) 1,38 3,58 3,74 4,10

13С ЯМР спектр (м. Д.) 17,6 67,1 68,3 69,8 85,2

ОН Н Н енз I I I I НО - Р-0-С-С-С-СН2 "II ! I I I

О н оно о \ /

о =г ? - он

Рис. 3. Формула НФС г.осле репмоизации (2-}.:етилбутан-1.2,3,!1-тпраа1-2,4-т;!Слопкрофосфо-4-фосфат).

страшных заболеваний как лепра, туберкулез, а также усиливавших отрицательные последствия СПИДа. И - ножет быть. повышенная устойчивость иккобактерий к ударам иппунной системы теплокровных и других факторов среды связана с данной способность» синтеза НФС.

Кроне того, наличие в ряду индукторов синтеза НОС производных дипиридилов. нафтахинонов. феиаэинов. являющихся компонентами некоторых пестицидов Скоторые, как известно также влияют на развитие микроорганизмов^ тесно связано с проблемой охраны окружавшей среды.

Таким образом, изучение НФС напрямую сочетается с проблемами биотехнологии, медицинской п р омьшленно стии и з кологической безопасности.

Глава 2 посвящена разработке методики определения длины цепи и концентрации подифосфатов с помощью В1Р-ЯИР спектров. Построен калибровочный график зависимости отношения интенсивностей сигналов С сигнал искового соединения/' сигнал стандарта^ от концентрации и длины цепи полифосфатов Срис.СЗ. Обнаружено, что с уменьшением длины цепи полифосфатов отношение интенсивности сигналов пропорцион&яьяо снижается лишь до определенной величины: до молекул с числом п£535-40 фосфорных звеньев, после чего наблюдается быстрое уменьшение отношения интенсивности. Это связано с эффектом образования общего де локализованного электронного облака вокруг кислородно-фосфатного остова полифосфатных молекул. В высокомолекулярных фосфатах Сп-Е003 действие эффекта ослабляется из-за конфораационных изменений в нолекуле. Выяснено, что чен меньше будет отличаться длина искомого полифосфата от длины полифбёфата . используемого для построения калибровочного графика, тем точнее будет определена длима цепи искомого полифосфата.

Э иск/ Э ст

Рис. 4 Калибровочный график для нахождения длины цепи и концентрации полифосфатов по 31Р-ЯМР спектрам. Обозначения кривых полифосфатов: Р ортофосфат (—о—), п=208 ( -в- ), ц= 119 ( -А- ), п=» 62 (-х-), п =39 ( -о-). п=15 ( (-Ф- ).

мг Р/мл х 1(Р

2

Рис. 5. Динамика накопления фосфорсодержащих соединений в Б-штамме ( -»- ) и в Н-штамме (-е- ) р. соссмшш: полифосфатов(П, неорганического фосфора в цитозоле(2), неорганического фосфора в вакуолях, фосфодиэфкрои (3) к фосфоманнаяа (4).

Рис. 6. Дина;.;.;ка изменения внутриклеточного рН в В-шиыме (-й- ) и в } ¡-штамме ( —) Е сосстеиш. Сплошная линия -изменения в цитоплазме, пунктирная - в вакуолях.

На основе разработанной нетолики было найдено количественное содержание и определена длина цепи полифосфатов в разных полифосфзтнюс фракциях в процессе развития культуры дрожжей З.сегеу1эае. Выявлено. что длина цепи полифосфатов подвержена резкий колебаниям в процессе роста культуры.

Глава 3 посвящена изучению взаимосвязи уровней фосфатного метаболизма, внутриклеточного р.Н и уровня антибиотикообразоеания в штанмэх гриба Р.соссапеит: низкоактивного СН-лггаммаЗ и высокоактивного СВ-пггамнаЭ. На рис.5 представлены графики зависимости накопления фосфат-содержаших соединений в процессе роста культур. У В-пгтамма найдена пряная зависимость иегяу накоплениями полифосфатсв. неорганического фосфата в цитозоле и вакуолях, и фосфодиэфиров. Для Н-игамна обнаружена пряная зависимость между накоплениями полифосфатов и неорганического фосфата в вакуолях и фосфодиэфиров. Установлено, что существует пряная зависимость между уровнен аккумуляции фосфоманнана и уровнем антибиотикопродуцируюшей активности. На рис. 6 представлены динамики изменения внутриклеточного рН в процессе ферментации культур. У В-штамма начало периода интесивного синтеза антибиотика характеризуется повышением значений внутриклеточного рН, тогда кок у Н-шгамма наблюдается уменьшение значений внутриклеточного рН. Предложена схема действия внутриклеточного рН на биосинтез антибиотика у Г.еоос1пеии.

выводы

1. С помощью методе мР-ЯМР спектроскопии высокого разрешения показано, что в условиях окислительного стресса у бактерий СБг.аппопхавепег, М. Н50йе1кЛ1сиЕ. Богс1оп1&_ гиЬгорегЬйгсЬиБ, НусоЬасЬегхиа Боедоа^Б. ИусоЬасЪсггип рЬ1е1) наряду с известными соединениями происходит накопление .ранее неизвестного циклопирофосфата, который может существовать в нескольких конфорнационных состояниях. На "Р-ЯМР спектре ену соответствуют сигналы 10.8м.д. и 6—14.8м.д. С помощью нетолов *Н. 13С. мР-ЯМР спектроскопии этот никло'фосфат был идентифицирован как 2-метилбутан-1.2,3,4-тетраол-2.4-циклопирофосфат.

2. Разработана методика определения длины цепи и концентрации полифосфатов с помощь» а1Р-ЯКР спектров. На основ» данной методики проведено определение ллкны цепи и количественного содержания полифосфатов ралных фракций на различных этапах роста культуры дроасг-Я Э. сегеу15ге. Впервые установлено, что длина цели лолиДосфатов Ззэисит от стадии роста культуры. .

3. С лонощыо метода "Р-ЯМР V.: спектроскопии высокого разрешения исследована зависимость мехду .уровнями накопления (юсфор-содерхащих соединений и актибиотикопродуиирупсей активностью у разных лггяимов грн'За Т. сосаз-пеик. Установлена взаимосвязь некду -изненет.ями внутриклеточного рН и уровнен антибиотикопродуцируявей активности у разных ятснмов Г.соссхпеип. На ос::ове этих данных предложен* схема регуляции биосинтеза антибиотика у р.соссы1еив в результате динамики изменения внутриклеточного рН.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Д. Н. Островский.И. Н. Шипанова. Л. А. Сибельдина.С. И. Степанов.Е. О. Хар.э тьян.К. Б. Шумаев: 'Окислительный стресс вызывает у бактерий накопление дигликозилпирофосфата*.ДАН. 1991. 320. 2. 477-480.

2. Д. Н. Островский.И.Н.Шипанова.И. А. Малярова.Л.А.Сибельдина.Е. Ф. Ха-тьян.Г. Д.Танцырев.А.С. Шашков: 'Продукт окислительного стресса бактерий идентифицирован как 2-метилбутан-1.2,3.4-тетраол-2.4-цик лофосфат*. ДАН. 1992. 322. 1. 179-184.

3. И.Н. Шипанова, Е.Ф.Харатьян. Л. А. Сибельдина. О.Д.Огрель, Д. Н. Островский: '0 природе нового накроэрга, возникающего у бактерий в ответ на окислительный стресс'. Биохиния. 1992. 37. 6. 862-872.

4. Д. Н.Островский.О.Д.Огрелъ.В. Е. Бинюков.Г.Тартусова,Е. Ф. Харатьян. А. С. Шашков.И.Н. Шипанова: 'Взаимосвязь устойчивости никобактерий с биосинтезом новых метаболитов: • циклопирофосфата и радикалобразуюшего соединения', ДАН, 1992. 325, 5, 1071-1076.

5. D.Ostrovsky, I.Shipanova, L.Sibeldina, A.Shashcov, E.Kharatian, I.Halyarova, G.Tantsyrev: 'A new cyclopyrophosphate as a bacterial antistressor', FEBS tetters, 1992, 258, 2/3, 159-181.

6. D.Ostrovsky, E.Kharatian, I.Halyarova, I.Shipanova, L.Sibeldina, A.Shashcov, G.Tantsyrev: "Synthesis of а пев organic pyrophospate in a large quantitiesis induced in some bacteria by oxidative stress', BioFactors, 1992, 3, 4, 261-264.

7. D.Ostrovsky, E.Kharatian, T.Dubrovsky, O.Ogrel, I.Shipanova, L.Sibeldina: The ability of bacteria to synthesize а пен cyclopyrophosphate correlates with their tolerance to redox-cycling drugs: on a crossroad of chenotherapy, environmental toxicology and iiuounobiochenical problens', Biofactors, 1992, 4, 1, 63-68.

8. И.Н.Шипанова. Ю. Э.Бартошевич. Л, А.Сибельдина. А.В.Мищенко: 'Изучение нетаболизма Fusidiun coccineuo, продуцента фузидина. методом "Р-ЯМР спектроскопии', Биохиния. 1993. 38, 10. 1625-1629.

9. И. Н. Шипанова.Г.Р.Демина.О. Д. Огрель.Д.Н.Островский.А.Ф.Свиридов. Л. А. Сибельдина.А.С. Шашков: 'Спонтанные превращения и встречный синтез углеродного скелета нового бактериального макроэрга', ДАН.

334• 5. Св печати}.

10.' V. Vafiabov, I.Vilenskaya. L.Trilisenko,I.Shipanova,L.Sibeldina, I.bulaev: 'Inorganic yeast polyphosphates: deternination of the polyneric value of fractions by "p-HHR spectroscopy", Abst. 15th International specialized synposiun on yeasts, Riga, Sept.30 - Oct.6, 1991.'

11. Д.Н.Островский. Л.А.Сибельдина. E.Ф.Харатьян. А.С. Шашков. И.Н.Иипанова: 'Биоантиоксиданты бактерий'. тезисы, 4 Всероссийская конференция *БиоантиоксидантМосква, апр.. 1992 -.

12. И.Н.Шипанова: 'Химическая структура и свойства соединения, аккунулируеного бактериями'.тезисы, 4 Всероссийская конференция 'Биоантиоксидант'. Москва, апр.. 1992

13. I.Shipanova, L.Sibeldina; 'Redox-суcling agents and а пен cyclopyrophosphate', Abst. , 10th Annual Seier.tif ie Heating and Exhibition (FSMR), Rone, June 3-6, 1993, p.831.

14. I.Shipanova, L.Sibeldina, V.Vagabov, L.Trilisenko, I.Kulaev: 'Deternination of polyphosphate chain lenght in different fractions', Abst., 10th Annual Scientific Meeting and Exhibition (ESMR), Rone, June 3-6, 1993, p.531.

15. D.Ostrovsky, R.Anirov, H.Kharatian, O.Ogrel, S.Stepanov, I.Shipanova, L.Sibeldina, S.Tartykova: "Bacteria and pesticides. A печ aspect of interaction", 1993, 4. 3. в печати.

IS. D.Ostrovsky, G.Dionina, I.Shipanova, L.Sibeldina, A.Shashkov: "Bacterial oxidative stress substance spontaneously recyclises to for» 2-nethylbutane-1,2,3,4-tetrao1-1,2-cyclcphosphate-4-phospha-te", Biofactors, 1993, 4. 3. в печати.

17. Д. Остроьский. К.Досанов. А.Калек. О.Огрель. Д.Сибелдина. Е.Харатьян, И.Иипановз. А.Шаров: 'Действие антисептических средств и редоксииклнруюших агентов на Corynebacteriu« annoniagenes и родственные микроорганизмы в связи с синтезом нового макроэрга'. 1993. Мл.~робиология. в печати.

18. Д.Островский. М.Мартынова. Е.Матус, О.Огрель. Е.Лызак, Е.Харатьян. Д.Сибельдина. И.Шипанова: 'Озон: новый аспект действия на микроорганизмы*. 1993. 331. 1. 1054-108.