Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций неорганических полифосфатов у дрожжей Saccharomyces сerevisiae

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций неорганических полифосфатов у дрожжей Saccharomyces сerevisiae"

На правах рукописи

ТРИЛИСЕНКО ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И МЕТАБОЛИЗМА ОТДЕЛЬНЫХ ФРАКЦИЙ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ПОЛИФОСФАТОВ У ДРОЖЖЕЙ Б А ССНАЯОЛГУСЕБ СЕЯЕШ1АЕ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино, 2005

Работа выполнена в Лаборатории регуляции биохимических процессов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор И.С. Кулаев;

доктор биологических наук, В.М. Вагабов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор М.С. Крицкий;

кандидат биологических наук, В.Н. Хмеленина.

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится «_«£_» 2005 г. в час мин на заседании

Диссертационного совета Д 002.121.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат разослан « Х>Ь » oLfñJLüjuX 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, ^

доктор биологических наук - — В.М. Вагабов

znmf

-1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фосфор, входящий в состав многих важных клеточных компонентов, в том числе нуклеотидов, нуклеиновых кислот, фосфолшшдов и других соединений, абсолютно необходим для жизнедеятельности клеток. Неорганические полифосфаты (полиР) - полимеры, состоящие из остатков ортофосфорной кислоты, соединенных между собой макроэргическими фосфоангидридными связями, при гидролизе которых высвобождается энергия примерно такая же, как и при отщеплении терминального фосфата от АТФ. Благодаря этому, полиР являются запасниками фосфора и энергии. Они также выполняют другие многочисленные функции: участвуют в связывании катионов, обеспечивая внутриклеточных ионный баланс (Oshumi and Anraku, 1981; Lichko et al., 1982), в формировании и функционировании клеточной оболочки (Вагабов и др., 1990; Иванов и др., 1996), в регуляции активности ряда ферментов (Wolska-Mitaszko, 1997; Кулаев и др., 1999), в преодолении осмотического и щелочного стрессов, температурного шока (Greenfield et al., 1987; Castro et al., 1997), в формировании специальных каналов, транспортирующих некоторые ионы через клеточные мембраны (Рош, 2000) и др. Все это выдвигает исследования путей метаболизма неорганических полифосфатов в ряд актуальных задач биохимии и клеточной биологии.

В зависимости от компартментации и состояния в клетке полиР экстракцией можно разделить на несколько фракций, функции которых определяются компартментом, с которым связаны эти соединения. Однако о динамике и структуре фракций полиР в процессе роста клеток в литературе имеются фрагментарные данные. Они касаются, в основном, общего содержания полиР в клетке или в отдельной органелле (Liss and Langen, 1962; Greenfield et al., 1987, Beauvoit et al., 1989). Количественное содержание фракций является результатом двух противоположных процессов - синтеза и деградации полиР. Пути синтеза полиР у дрожжей, в отличие от бактерий, до сих пор остаются неясными. Доказан только путь сопряженного синтеза фракции высокомолекулярных полиР, локализованной в клеточной оболочке, и маннопротеина клеточной стенки, который обеспечивает образование части общего пула полиР в клетке (Kulaev, Vagabov, and Shabalin, 1987). Одним из подходов к пониманию путей биосинтеза полиР может быть изучение влияния метаболических ингибиторов на биосинтез отдельных фракций этих полимеров. Имеющиеся сообщения касаются суммарного количества полиР в целых клетках и их содержания в митохондриях дрожжей (Beauvoit et al., 1991; Loureiro-Dias and Santos 1989; Pestov et al., 2003).

Экзополифосфатазы, участвующие в деградации полиР, обнаружены почти во всех клеточных структурах дрожжей и имеют определенную специфичность по отношению к длине субстрата. (Lichko et al., 2003а). Однако, механизмы вовлечения полиР в метаболизм с участием этих ферментов пока не известны. Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций полиР у дрожжей

обусловлено необходимостью выяснения путей биосинтеза и функций полиР, локализованных в клеточных органеллах, что позволит, в конечном итоге, более полно представить картину обмена этих необычных полианионов.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение структуры и содержания отдельных фракций полифосфатов в клетках дрожжей БассИаготусев сегеуЫае в зависимости от фазы роста, условий культивирования, а также мутаций по основным генам полифосфатного обмена.

Исходя из поставленной цели, было необходимо решить следующие задачи:

1) подобрать оптимальный метод экстракции фракций полиР из дрожжей, позволяющий осуществлять более полное и дробное извлечение их из клеток, и определить структуру фракций методом мР-ЯМР-спектроскопии;

2) определить содержание и структуру фракций полиР на разных фазах роста культуры дрожжей, а также в процессе фосфорного голодания и последующего сверхсинтеза полиР;

3) определить длину цепи и содержание полиР в вакуолях в обычных условиях роста дрожжей и в условиях сверхсинтеза полиР;

4) изучить влияние ингибиторов различных биохимических процессов на синтез фракций полиР;

5) изучить содержание отдельных фракций полиР у мутантов 5. сегытае с ин активированными генами экзополифосфатазы РРХ1 и эндополифосфатазы РРЫ1.

Научная новизна работы. Установлено, что в процессе роста 5. сегегЫае ВКМ У-1173 каждая фракция полиР характеризуется своей динамикой накопления и потребления. Сочетанием химической экстракции полиР из клеток и метода 31Р-ЯМР впервые показано, что средняя длина цепи разных фракций не является константной величиной, а изменяется в процессе роста и в зависимости от условий культивирования дрожжей.

Впервые выявлен ступенчатый характер синтеза щелочерастворимых полифосфатов, когда после фосфорного голодания на первом этапе происходит накопление полифосфатов, а на следующем - только увеличение длины их цепи.

Обнаружено, что полифосфаты вакуолей и щелочерастворимой фракции полиР4, в отличие от других фракций этих соединений, не подвержены сверхнакоплению, что свидетельствует о существовании различных механизмов регуляции синтеза полиР в клетках дрожжей.

Установлено, что ингибиторы биохимических процессов по-разному влияют на синтез отдельных фракций полифосфатов, в частности, ЦГИ и БССР полностью подавляют накопление фракции полиР4, а 2-дезоксиглюкоза -фракции полиРЗ.

С помощью мутантов с инактивированными генами, кодирующими экзополифосфатазу цитозоля РРХ1 и эндополифосфатазу вакуолей РРШ, впервые выявлена метаболическая связь между содержанием

кислоторастворимой фракции полиР 1 и уровнем экзополифосфатазной активности цитозоля у дрожжей.

Совокупность полученных данных дает основания выдвинуть гипотезу о множественности путей биосинтеза отдельных фракций полифосфатов у дрожжей S. cerevisiae.

Научно-практическое значение. Данная работа является фундаментальным исследованием. Полученные результаты систематизируют и расширяют представления о структуре и метаболизме фракций полиР у дрожжей, в частности, в условиях фосфорного голодания и последующем их сверхсинтезе, при воздействии ингибиторов, а также влияние на их уровень мутаций по основным генам полифосфатного обмена. Материалы работы могут быть использованы в лекциях и практических занятиях студентов по биохимии микроорганизмов.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 114 страницах, содержит 1S таблиц и 14 рисунков. Библиографический указатель включает 211 источников литературы.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях, в том числе, "Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты" (Пущино, 1995), 8th International, conference on phosphorus chemistry (Jerusalem, Israel, 1995), 2-й съезд Российского биохимического общества (Москва, 1997), «Modern problem of microbiol biochemistry and biotechnology» (Pushchino, 2000). По материалам диссертации опубликовано шесть статей в журналах: «Биохимия», «Микробиология», «Молекулярная биология», «Process Biochemistry».

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объект исследования. Объектом исследования в данной работе были следующие штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae: ВКМ Y-1173, а также полученные из лаборатории А. Корнберга (Стенфордскнй университет, США) родительский штамм CRY и его мутанты с инактивированными генами экзо- и эндополифосфатаз - CRX, CRN и CNX.

Среда и условия культивирования. Штамм ВКМ Y-1173 выращивали на синтетической среде Ридер (Reader, 1927), включающей неорганические соли, 0,2% дрожжевой экстракт, 2% глюкозу в качестве источника углерода и содержащей 9 мМ ортофосфат (Р,) (полноценная среда, «+Р»). Для создания условий гиперкомпенсации полиР использовали среду без фосфата («-Р»), заменяя его эквимолярным количеством КС1, и без дрожжевого экстракта (из-за присутствия в нем Pi), внося дополнительно инозит (2 мг/л). В экспериментах по изучению влияния ингибиторов на накопление полиР у дрожжей полноценная среда Ридер содержала 18,3 мМ Р(, а фосфат дефицитная - 1,3 мМ

Pj. Штаммы CRY, CRX, CRN и CNX, являющиеся ауксотрофами, выращивали на среде YPD, состоящей из 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% глюкозы (Sethuraman et al., 2001). Культивирование дрожжей проводили в колбах с 200 мл среды на качалке (120 об/мин) при 29°С.

Выделение вакуолей. Сферопласты из целых клеток получали с использованием «улиточного фермента», как описано ранее (Андреева и др.,1993). Полученные сферопласты разрушали в изотонических условиях (1 М сорбит в 10 мМ цитратном буфере, рН 6,8) в гомогенизаторе Поттера. Неразрушенные сферопласты осаждали из раствора 1 М сахарозы и 1 М сорбита (1,5:1) центрифугированием при 1800 g в течение 15 мин. К супернатанту добавляли 1 М сорбит до соотношения сахарозы и сорбита 1:3 и центрифугировали при 3600 g в течение 50 мин. Полученный осадок вакуолей промывали 1 М сорбитом, центрифугируя 30 мин при 3600 g.

Для экстракции полиР из клеток дрожжей использовали 3 способа: метод Лангена и Лисса в модификации Кулаева и др. (I960), этот же метод в модификации Чернышевой и др. (1971) и метод Кларк и др. (Clark et al., 1986). Для получения более концентрированных растворов полиР, облегчающих их осаждение солями Ва2+, количество экстрагента уменьшали от 2 до 20 раз в зависимости от содержания полиР во фракции. Экстракция полиР из клеток по методу Лангена и Лисса в модификации Кулаева и др. позволила разделить полимеры на пять фракций: кислоторастворимую (полиР1), солерастворимую (полнР2), две щелочерастворимые - при рН 9-10 (полиРЗ) и рН 12 (полиР4) и растворимую в горячей хлорной кислоте (полиР5).

Подготовка образца полиР и снятие ^Р-ЯМР-спектров. Из полученных экстрактов полиР осаждали насыщенным раствором Ba(N03)2 при рН 8,2. Из кислоторастворимой фракции выделяли два осадка полиР: сначала при рН 4,5, а затем при рН 8,2. Осадки полиР переводили в растворимую форму, обрабатывая их ионообменной смолой Dowex AG 50Wx8 в NHZ-форме. Избыточное количество ионов Ва2+ и других металлов связывали добавлением к растворам полиР ЭДТА в концентрации 20 мМ. Значение рН образцов доводили до 7,2. Концентрация полиР в них варьировала от 150 до 1000 мкг Р/мл раствора. 31Р-ЯМР -спектры снимали на приборе АМ-400 фирмы «Broker» (Германия) с преобразованием Фурье со сверхпроводящим магнитом и с рабочей частотой на ядрах 31Р, равной 116,98 мГц. Число сканирований было более 1000. Длину цепи (п) полиР фракций рассчитывали по формуле, основанной на соотношении площадей пиков центральных (коровых, РР4) и терминальных (РР1) фосфатных групп в 31Р-ЯМР-спектрах (Pilatus et al., 1989):

й = 2 (3 [РР1]+[РР4]) / [РР1]

Содержание полиР в полученных фракциях определяли после гидролиза аликвоты фракции в 1 М НС1 на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Из кислоторастворимой фракции нуклеотиды удаляли сорбцией на активированный уголь Норит А. Количество полиР во фракциях рассчитывали

по образовавшемуся в результате гидролиза Р„ а в кислоторастворимой фракции - по разнице Pi до и после сорбции нуклеогидов на уголь.

Общий фосфор в каждой фракции определяли сжиганием на специальной плитке 0,2 мл фракции в концентрированной НСЮ4 с постепенным повышением температуры до 150°С.

Ортофосфат. получившийся в результате гидролиза полиР, определяли после нейтрализации образцов по методу Беренблюма и Чейна в модификации Вейль-Малербе и Грина (Weil-Malherbe and Green, 1951). Ортофосфат, образовавшийся в результате ферментативных реакций, определяли по методу Якке и др.. (Yakka et el., 1981).

Ферментативные активности определяли как описано ранее: экзополифосфатазы цитозоля (Андреева и др., 1994); экзополифосфатазы и АТФазы вакуолей (Андреева и др. 1993); а-маннозидазы (Wilden et al.,1973) и а-глюкозидазы (Kratky et al., 1975).

За единицу количества фермента (Е) принимали такое его количество, которое катализировало образование 1 мкмоль Р, или и-нитрофенола за 1 мин.

Белок определяли по методу Лоури в модификации Петерсона (Peterson, 1977).

Очистка полиР от примесей низкомолекулярных компонентов. Неорганические полиР (Monsanto, США; Sigma, США), используемые при определении полифосфатазной активности, подвергали очистке от примесей орто-, пиро- и триполифосфатов на колонке (1,5 х 30 см) с Sephadex G-15 или G-25. 200-250 no1 полиР в 20 мМ трис-HCl буфере, pH 7,2 наносили на колонку и элюировали тем же буфером, собирая фракции по 2 мл.

Сухую биомассу клеток дрожжей определяли нанесением аликвоты суспензии клеток на фильтры, доведенные до постоянной массы под вакуумом при температуре 85°С, и высушивали до постоянной массы в том же режиме.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительный анализ содержания фракций полифосфатов, выделенных различными методами из дрожжей S. cerevisiae.

Для количественного выделения из клеток дрожжей отдельных фракций полиР и определения длины их цепи методом 'Р-ЯМР, необходимо было подобрать наиболее оптимальный способ извлечения фракций из клеток. С этой целью было проанализировано несколько известных методов: экстракция полиР, разработанная Лангеном и Лиссом в модификации Кулаева и др.; метод, предложенный Чернышевой и др. и являющийся некоторой модификацией первого метода; и метод, успешно используемый для экстракции полиР из бактерий, сравнительно недавно предложенный Кларк и др. Из клеток дрожжей перечисленными методами были выделены фракции полиР и проведен их количественный и качественный анализ. Длину цепи полиР определяли

Таблица 1. Содержание (мкмоль Р/г сухой биомассы) и длина цепи (Я) полиР фракций, выделенных из дрожжей Б.сегеуШае.

Условия экстракции Метод Лангена и Лисса в модификации Кулаева и др. (i960) Метод Лангена и Лисса в модификации Чернышевой и др. (1971) Метод Кларк и др. (Clark et al., 1986)

Pi ПолиР % Л Pi ПолиР % Л Pi ПолиР % Я

2% ТХУ-ацетон, 20*С, 3 мин 102 13 2 8-12

0,5 M НС104,0'С, 30 мин (dojihPI) 93 209 32 8-26 93 209 32 8-26

NaC104,0*С, 60 мин (полнР2) 101 15 20-28 101 15 20-28

2 мМ ЭДГА, рН 7-8,20'С, 3 мин 3 256 39 29-35

NaOH, рН9-10,0'С, 30 мин (полиРЗ) 185 28 32-37

2 мМ ЭДТА, рН 7-8,2 0'С, фенол-хлороформ, 5 мин 170 25 37-46

NaOH, 0,05 M, 0'С, 30 мин (оолиР4) 154 23 50-55

1% SDS, рН 7.4,0'С, 30 мин 228 35 50-62

Сумма экстрагированных полиР 649 98 538 82 439 66

0,5 M НСЮ4,90"С, 40 мин (полиР5) 11 2 122 18 221 34

Сумма полиР в биомассе 660 100 660 100 660 100

с помощью 31Р-ЯМР. Результаты представлены в табл. 1. Из нее следует, что первый и второй методы позволяли экстрагировать полиР с большей длиной цепи, чем третий. Кроме того первый метод давал возможность наиболее полно извлечь полиР из клеток - 98% против 82% вторым и 66% третьим методами. И, наконец, он позволял разделить полиР дрожжевой клетки на 5 фракций, в то время как при помощи второго и третьего методов можно выделить только 4 фракции. Поэтому в дальнейших исследованиях был использован первый метод экстракции полиР.

2. Зависимость содержания и длины цепи фракций полиР в клетках от фазы роста дрожжей

Дальнейшие исследования были посвящены изучению количественных и качественных изменений полиР в клетках 5. сегеутае в процессе роста. Изучались дрожжи, находящиеся в разных фазах роста: посевной материал-иноку лят (0 ч роста), начало (3 ч) и середина (6 ч) логарифмической фазы роста, фаза замедления роста (10,5 ч), начало стационарной фазы (15 ч) и стационарная фаза (24 ч) роста (рис.1).

Глюкоза, Р|,

0 10 20 30 Время, ч

Рве. 1 Кривая роста (о) дрожжей 5. сегЫзше на среде Рядер, содержание глюкозы (я) я фосфата (А) в среде культивирования.

Как видно из рис.1, в течение 10 часов роста дрожжи полностью поглощали глюкозу из культуральной среды и переходили в стационарную фазу развития. При этом содержание ортофосфата (Р,) в среде изменялось незначительно. В период активного роста дрожжей в них происходило увеличение содержания

Таблица 2. Содержание общей суммы полиР в клетках дрожжей Я. сегемзгае на разных фазах роста.

Время роста, ч

0 3 6 10,5 15 24

Сумма полиР, мкмоль Р/г сухой биомассы 376 440 544 240 216 345

суммарных полиР (табл.2, 3-6 часов). По мере исчезновения глюкозы из среды уровень их в клетках снижался и снова возрастал к 24 часам культивирования дрожжей (табл.2, 24 часа). Значительное снижение количества полиР в клетках на фоне исчерпания глюкозы и высокой концентрации Р; в среде свидетельствует о том, что в этот период полиР использовались как источник энергии.

Анализ содержания отдельных фракций полиР показал (рис.2), что они в процессе роста изменялись по-разному. Максимальных значений фракции достигали в логарифмической (рис.1 и 2, 6 ч) фазе роста, когда наиболее активно идут биосинтетические процессы и в среде достаточно глюкозы. После исчезновения глюкозы из среды дрожжи замедляли свой рост, и в этот период снижалось содержание полиР во всех фракциях (10,5-15 ч). Наибольшее количество полиР в логарифмической фазе роста накапливалось в кислоторастворимой (полиР 1) и щелочерастворимой при рН 9-10 (полиРЗ) фракциях, их сумма составляла более 65% клеточного пула полиР (3 и 6 ч).

ПолиР, мкмоль Р/г сухой биомассы

12 3 45 12 3 45 1 2 34 5 1 2 34 5 1 2 34 5 1 2 34 5

0 3 6 10,5 15 24 ч

Рис.2. Изменение содержания отдельных фракций полиР в клетках в процессе роста дрожжей & сегеуЫае: 1 - полиР 1; 2 - полиР2; 3 - полиРЗ; 4 - полиР4; 5 -полиР5. Фракции получали последовательной обработкой клеток при 0°С 0,5 М НС104 (полиР 1), насыщенным раствором №СЮ4 (полиР2), раствором ЫаОН, рН 9-10 (полиРЗ), 0,05 М №ОН (полиР4) и 0,5 М НС104 при 90°С (полиР5).

Фракции полиР отличались не только уровнем накопления, но и степенью изменения содержания каждой из них в процессе роста культуры. Фракции полиР 1 и полиР2 были подвержены наименьшим колебаниям. Содержание их в процессе роста дрожжей изменялось примерно в 1,5 раза. Наибольшими колебаниями характеризовались фракции полиРЗ и полиР5. В зависимости от фазы роста культуры, уровень накопления фракции полиРЗ изменялся в 5 раз, а фракции полиР5 - в 40 раз, причем максимального накопления последняя фракция достигала в стационарной фазе роста дрожжей (рис. 2).

Показано, что фракции полиР у дрожжей имеют различную длину цепи (Langen and Liss, 1960). Однако изменения степени полимерности отдельных фракций этих соединений в процессе роста S.cerevisiae не были изучены.

Из рис.3 следует, что степень полимерности полиР двух подфракций кислоторастворимой фракции полиР 1 в процессе роста оставалась постоянной. Субфракция полиРЫ (осаждаемая ионами Ва2+ при pH 8,2) состояла из 8-12 фосфатных остатков. Вторая субфракция - полиР 1-2 (осаждаемая ионами Ва2+ при pH 4,5), содержала более высокомолекулярные полиР, степень их полимерности равнялась 20-23 фосфатным остаткам. Длина цепи полиР трех других фракций: солерастворимой (полиР2) и двух щелочерастворимых (полиРЗ и полиР4) была подвержена довольно значительным изменениям в процессе роста. Клетки, находящиеся в покоящемся состоянии (0 ч и 24 ч роста) имели более высокую степень полимерности щелочерастворимых фракций полиРЗ и полиР4 по сравнению с активно растущими клетками. Степень полимерности фракции полиР2 вначале падала, в период активного роста культуры она увеличивалась, а в стационарной фазе снова снижалась. Причем длина цепи этой фракции могла иметь значения, равные значениям фракций полиР 1 или полиРЗ. Таким образом, в процессе роста дрожжей длина цепи полиР разных фракций может существенно изменяться в зависимости от фазы роста культуры.

Полученные данные свидетельствуют о том, что полиР в процессе роста культуры дрожжей находятся в состоянии активного обмена, причем каждая отдельная фракция полиР характеризуется своей динамикой накопления и потребления, что, видимо, является отражением разной локализации и, возможно, функциональной специфичности этих фракций в клетке. Длина цепи, выделяемых из клеток фракций полиР, зависит не только от природы экстрагента (Langen and Liss, 1960), но и от фазы роста дрожжей.

3. Влияние концентрации Р| в среде на накопление и степень полимерности фракций полифосфатов у дрожжей S. cerevisiae.

В дальнейшем было важно выяснить, в какой степени экстремальные условия, вызванные резкими колебаниями концентрации Р, в среде, влияют на

ПолиР, п

Время, ч

Рис. 3 Изменение длины цепи полиР отдельных фракцнй в процессе роста дрожжей & сегеувме. Условия эксперимента и опытные точки соответствуют условиям и точкам, указанным на рис.1 и 2.

уровень и структуру отдельных фракций полиР. Подобные данные могли бы иметь существенное значение для более глубокого понимания роли полиР в жизнедеятельности микробной клетки и ее выживании в изменяющихся условиях внешней среды. Вначале были подобраны условия, позволявшие получить эффект гиперкомпенсации полиР, когда после длительного фосфорного голодания клеток и последующего переноса их на среду с фосфатом, последние накапливают в несколько раз больше полиР, чем в обычных условиях. Окончательная схема эксперимента представлена на рис.4.

Рнс.4. Кривая роста дрожжей в условиях фосфорного голодания и гнперкомпенсации полиР. Дрожжи выращивали на среде Рид ер, содержавшей 9 мМ Р| и 2% глюкозу, в течение 4 часов до ОП = 0,36-0,4 ед. (точка А). Затем клетки переносили, на среду без фосфата и продолжали выращивание в течение 7 часов до ОП = 1,5-1,6 ед. (точка В). Дрожжи отделяли от среды, переносили снова на свежую среду с фосфатом и растили в течение 2 (точка С) и 4 (точка О) часов. В указанных точках отбирали биомассу для анализа.

В активно растущей культуре фосфор полиР составлял почти половину всего фосфора дрожжевой клетки (табл.3, точка А). Фосфорное голодание вызывало 20-ти кратное снижение уровня полиР (точка В). При этом во время всего периода голодания поддерживалась достаточно высокая скорость роста культуры (рис.4). Очевидно, именно полиР в этих условиях обеспечивают клетки необходимым фосфатом. Перенос культуры на свежую среду с фосфатом приводил к увеличению содержания полиР в клетках более чем в 2 раза по сравнению с уровнем этих соединений в точке А, т.е. наблюдался

Таблица 3. Содержание различных фосфорных соединений (мкмоль Р/г сухой биомассы) в клетках дрожжей на среде Ридер в условиях фосфорного голодания («-Р», т. В) ■ гнперкомпенсации полиР («+Р», т. С и D).

Время роста Р. р 1 нухл Рстяб ПолиР Рост ^общ

4 ч, «+Р» (А) 187 38 398 543 28 1194

7 ч, «-Р» (В) 34 12 252 26 23 347

2 ч, «+Р» (С) 153 13 419 1245 41 1871

4 ч, «+Р» (D) 101 12 289 1143 40 1585

эффект гиперкомпенсации полиР (табл.3 точка С). Их количество достигало 2/3 суммарного фосфора клеток дрожжей против 1/2 в обычных условиях роста. За счет прироста этого полимера содержание общего фосфора увеличивалось более, чем в 1,5 раза.

Особый интерес представляет динамика накопления в клетке отдельных фракций полиР.

600

л 1 500

| | 400

* в 300

| Г00

С " 100

о

12345 12345 12345 12345 А В С Б

Рис.5. Содержание отдельных фракций полиР в клетках дрожжей при культивировании на полной среде (А), в условиях фосфорного голодания (В) я гиперкомпенсации полиР (С и О). Обозначения: 1 - полиР 1, 2 - полиР2, З-полиРЗ, 4-полиР4, 5-полиР5.

Как видно из рис.5, основную часть синтезированных в процессе гиперкомпенсации полиР составляли кислоторастворимая (полиР 1), солерастворимая (полиР2) и щелочерастворимая при рН 9-10 (полиРЗ) фракции, на долю которых приходилось около 80% всех полиР клетки (точка С). Необходимо отметить и различие в степени накопления отдельных фракций. Так, уровень накопления фракций полиРЗ и полиР5 увеличивался примерно в 5 и 8 раз, соответственно, а полиР 1 и полиР2 - в 1,5 и 2 раза по сравнению с исходными клетками (точки С и А). В течение последующих 2 ч роста дрожжей происходило незначительное изменение содержания отдельных фракций (точка О). Необходимо отметить особое поведение полиР щелочерастворимой при рН 12 фракции (полиР4), уровень которой в условиях гиперкомпенсации лишь к 4 ч роста на среде с фосфатом достигал уровня в исходных клетках (точки А, С и Б), из чего следовало, что фракция полиР4 не подчинялась эффекту гиперкомпенсации. Полученные результаты свидетельствуют о том, что пути синтеза отдельных фракций полиР различны или, по крайней мере, они по-разному регулируются в условиях гиперкомпенсации.

На рис. 6 представлено изменение длины цепи каждой фракции в процессе фосфорного голодания клеток и в условиях гиперкомпенсации полиР. Рост дрожжей на среде без фосфата сопровождался не только падением содержания полиР, но и значительным уменьшением длины цепи фракций

полиР1, полиРЗ и полиР4. ПолиР солерастворимой фракции (полиР2) во время фосфорного голодания, напротив, наращивали длину цепи (точка В).

После переноса клеток на фосфат содержащую среду, в первые 2 ч интенсивного синтеза полиР длина цепи фракций полиРЗ и полиР4 почти не изменялась (точки В и С). Возможно, что в этот период активный синтез полиР протекал либо на уровне сравнительно низкомолекулярных (причем для каждой фракции своей степени полимерности) соединений, либо, одновременно с синтезом, происходило интенсивное их потребление. При дальнейшем росте дрожжей на среде с фосфатом на фоне полного отсутствия накопления -фракция полиРЗ, или незначительного - фракция полиР4, отмечался резкий рост длины цепи этих соединений (точки С и D). Т.е. наблюдался ступенчатый характер синтеза отдельных фракций полиР, когда в условиях гиперкомпенсации вначале образовалось сверхвысокое количество этих соединений, и только в процессе дальнейшего роста дрожжей происходило увеличение длины цепи этих соединений.

4. Накопление полифосфатов в вакуолях дрожжей S. cerevisiae.

Из полученных данных следовало, что каждая фракция полиР в процессе развития культуры дрожжей характеризуется своей динамикой накопления и потребления. Не исключено, что такое поведение фракций отражает не только разную их клеточную локализацию, но и, что очень важно, выполнение ими различных функций в жизнедеятельности этого микроорганизма, возможно, связанных с особенностями метаболизма клеточного компартмента. К настоящему времени полиР обнаружены во многих клеточных структурах: цитоплазме, клеточной оболочке, ядрах, митохондриях и вакуолях (Kulaev et al., 2004). По данным литературных источников в вакуолях в определенных условиях может находиться основной пул клеточных полиР. В связи с этим, интересно было изучить накопление полиР в этом компартменте клетки в используемых нами условиях. Для этого из клеток дрожжей вначале были получены сферопласты, а затем наиболее щадящим для полиР способом (Wiemken, A., and М. Dürr, 1974) в изотонических условиях, была выделена

A BCD

Рис. 6. Зависимость длины цепи (Я) полиР различных фракций в клетках дрожжей от содержания Р| в среде культивирования.

Экспериментальные точки А, В, С и D соответствуют точкам на рис. 4 и 5.

фракция вакуолей. В табл.4 представлены данные содержания полиР в целых клетках и вакуолях.

Таблица 4. Содержание Р( и полиР (мкмоль Р/г сухой массы клеток) в целых клетках и вакуолях в условиях стандартного уровня Р( (9 мМ) в среде культивирования.

Объект исследования Р| ПолиР ПолиР, %

Клетки 111 543 100

Вакуоли 3,3 74 14

В логарифмической фазе роста дрожжей в вакуолях содержалось около 15 % клеточного пула полиР (табл.4). Остальные полиР, очевидно, были расположены в других клеточных органеллах: цитоплазме, ядре, митохондриях. Экстракцией из вакуолей были выделены две фракции полиР: кислого- и щелочерастворимая. Из табл. 5 видно, что кислоторастворимая фракция

Таблица 5. Распределение полнР вакуолей по фракциям я степень их полимерностн.

Фракция Содержание полиР, (%) Степень полимерности, Я

Кислоторастворимая фракция: рН4,5 рН 8,2 44,2 39,4 20±5 5±2

Щелочерастворимая фракция 12 -

Остаток 4,4 -

Сумма полиР вакуолей 100

Рис. 7. 3|Р-ЯМР-спектры (+5 - -30 м.д.) фракции кяслоторастворимых полиР, экстрагированных из вакуолей дрожжей & сегетше". а -спектр субфракции полиРЫ; б -спектр субфракции полиР 1-2. 1 -Коровые (внутренние) фосфатные группы полиР; 2 - предтерминальные фосфатные группы полиР; 3 -терминальные фосфатные группы полиР; 4 - у-фосфатные группы нуклеозидгрифосфатов; 5 — Р,.

составляла более 80% полиР вакуолей. Осаждением ионами Ва2+ при разных значениях рН она была разделена на две субфракции, различавшиеся степенью полимерности: 5±2 (при рН 8,2) и 20±5, (при рН 4,5) (рис.7). В щелочерастворимой фракции находилась незначительная часть полифосфатного пула вакуолей (12%).

Таким образом, полученные данные убедительно доказывают, что в вакуолях изучаемой культуры расположена лишь часть клеточных полиР, основная масса которых представляет собой низкомолекулярную кислоторастворимую фракцию этих соединений. Имеющиеся в литературе данные о локализации основного пула этих соединений в вакуолях объясняются, видимо, изменениями содержания полиР в разных компартментах клетки, зависящими от особенностей изучаемого биологического объекта, состава среды выращивания и фазы развития организма.

Таблица 6. Содержание полиР в клетках н вакуолях дрожжей 5.

сегешше. Дрожжи растили в течение 4 ч на среде, содержавшей 9 мМ Р, («+Р»), затем в течение 7 ч на бесфосфатной среде («-Р»), и еще в течение 2 ч на среде со стандартным (9 мМ) уровнем Р, («+Р», гиперкомпенсация).

Условия культивирования Клетки Вакуоли

мкмоль Р/г сух. биомассы % мкмоль Р/г сух. биомассы %

«+Р» 544 100 74 100

«-Р» 65 12 9 12

«+Р», гиперкомпенсация 1236 230 21 28

В вакуолях в условиях голодания, полиР используются в той же степени, что и в клетках в целом (табл.6). Но при гиперкомпенсации, в отличие от целых клеток, количество полиР в вакуолях увеличивалось незначительно и достигало примерно 30% содержания полимера в этом же компартменте дрожжей в обычных условиях роста (табл. 6).

Таким образом, при росте дрожжей в условиях гиперкомпенсации в вакуолях не удалось обнаружить сверхсинтез полимера. Полученные результаты свидетельствуют о возможности существования в разных компартментах клетки различных механизмов регуляции биосинтеза полиР.

4. Влияние ингибиторов на накопление полифосфатов у дрожжей

■У. сеге^ше.

Пути, обеспечивающие накопление полиР в клетках дрожжей, и, в частности, роль в этом экзополнфосфатаз, деградирующих эти полимеры, остаются малоизученными. Одним из подходов к изучению механизма синтеза этих соединений является использование биохимических ингибиторов. В связи с этим было исследовано влияние на накопление полиР в условиях активного

их синтеза следующих ингибиторов: циклогексимида (ЦГИ) протонофора карбонилцианид-4-(трифторметокси) фенилгидразона (ТССР), бафиломицина А1 и 2-дезокси-(3-глюкозы (2ДГ).

Таблица 7. Влияние ингибиторов на накопление полиР, содержание Р| в целых клетках и общую активность экзополифосфатяз I и П в цитозоле дрожжей 5. сегепх1ае после переноса клеток из среды без фосфата в полную среду и культивирования в течение 2 часов.

Вариант опыта Сухая биомасса, г/л Pi, мкмоль Р/г сухой биомассы ПолиР, мкмоль Р/г сухой биомассы Общая активность, Е/г сухой биомассы

экзополи-фосфатаза 1 жзополи-^юсфатаза II

исходная культура 1,56 100 75 18,5 1.1

контрольная культура (без ингибитора) 2,9 170 730 10,3 10,2

циклогексимид (10 мкг/мл) 1,6 180 660 14,5 3,4

РССР (ЮшсМ) 2,3 120 540 13,0 14,0

2-дезоксич1-глюкоза (12 мМ) 2,09 246 422 14,5 8,2

бафиломицин А1, (0,05 мкМ) 2,9 180 660 11,2 12,8

Дрожжи после голодания по фосфату (исходная культура) переносили на свежую, полноценную среду и культивировали в присутствии соответствующего ингибитора в течение 2-х часов. За этот период в клетках возрастал уровень Р| и почти на порядок увеличивалось суммарное содержание полиР (табл.7).

Из данных табл. 7 видно, что исследуемые ингибиторы в различной степени влияли на рост дрожжей. Различное влияние они оказывали и на накопление полиР.

Ингибитор белкового синтеза ЦГИ, подавляя полностью рост дрожжей, тем не менее, практически не влиял на общее накопление полиР и уровень Р, в клетках. В то же время он оказывал различное воздействие на синтез отдельных фракций. Несколько снижая уровни фракций полиР 1 и полиРЗ, ЦГИ полностью ингибировал синтез фракции полиР4 (табл.8). Это, видимо, являлось следствием подавления ЦГИ образования компонента клеточной стенки маннопротеина, биосинтез маннановой части которого, как показано, сопряжен с биосинтезом полиР4 (Вагабов, 1988).

Протонофор РССР, разрушающий градиент электрохимического потенциала на мембранах дрожжевой клетки, примерно в 2 раза тормозил рост дрожжей (табл.7). В клетках, по сравнению с контрольным вариантом, был значительно ниже уровень Р; и наблюдалось уменьшение на 25% суммарного

накопления полиР. При этом ингибитор полностью подавлял накопление фракции полиР4 и, за исключением полиР2, только снижал прирост остальных фракций (табл.8). Следовательно, можно считать, что накопление, по крайней мере, части полиР в условиях активного их синтеза зависит от ДцйГ на мембранах, особенно это относится к фракции полиР4.

Таблица 8. Влияние ингибиторов на накопление отдельных фракций полиР у дрожжей 5. сегегкше после переноса клеток из среды без фосфата в полную среду и культивирования в течение 2 часов. Прирост полиР каждой фракции в варианте без ингибитора по сравнению с исходными клетками принят за 100% (контроль).

Фракции полиР Варианты

Контроль, 2 ч., «+Р» ЦГИ, 2 ч., «+Р» РССР, 2 ч., «+Р» Бафиломицин А1 2 ч., «+Р» 2ДГ 2 ч., «+Р»

ПолиР1 100 80 64 103 63

ПолиР2 100 178 148 74 61

ПолиРЗ 100 72 60 66 3

ПолиР4 100 0 0 76 68

ПолиР5 100 105 20 80 110

Бафиломицин А1, ингибитор Н*-АТФазы вакуолярной мембраны, в отличие от других ингибиторов, не влиял на рост дрожжей, а суммарное накопление полиР подавлял в такой же степени как и ЦГИ. Не затрагивая содержание фракции полиР 1, он уменьшал прирост накопления остальных фракций по сравнению с контролем в пределах 15-30%. (табл.8).

2-Дезоксиглюкоза, ингибитор углеводного обмена, значительно снижал рост дрожжей (на 60%) и суммарное содержание полиР (на 47%). Подавляя на 35-40% прирост фракций полиР1 и полиР2, он полностью ингибировал накопление фракции полиРЗ, что свидетельствует о тесной связи ее синтеза с углеводным обменом (Кулаев, 1975).

Кроме полиР в цитозоле клеток определяли экзополифосфатазную активность. В данном компартменте дрожжей, наряду с низкомолекулярной, основной экзополифосфатазой I, обнаружена экзополифосфатаза II, отличающаяся от первой рядом свойств и более высокой молекулярной массой (Авдреева и др., 2001). В контрольном варианте общая активность экзополифосфатаз фактически оставалась на уровне исходной культуры, но при этом изменялось их соотношение: в 2 раза снижалась активность экзополифосфатазы I, и примерно в 10 раз увеличивалась активность экзополифосфатазы П (табл.7). Это давало возможность предполагать, что экзополифосфатаза II может участвовать в биосинтезе полиР в этих условиях. Однако сравнительный анализ результатов по влиянию ингибиторов на накопление полиР и активность этого фермента не позволял судить о его участии в синтезе или деградации общего пула полиР (табл.7).

Таким образом, проведенный анализ показал различную степень влияния ингибиторов на накопление отдельных фракций полиР, что указывает на существование у дрожжей множественности путей биосинтеза этих соединений. Отсутствие корреляции между накоплением полиР и экзополифосфатазами цитозоля в присутствии ингибиторов свидетельствует скорее в пользу того, что эти ферменты не оказывают существенного влияния на накопление полиР.

Влияние инактивации генов РРХ1 и PPN1 на уровень полифосфатов у дрожжей S. cerevisiae.

К основным ферментам деградации полиР в клетках дрожжей кроме экзополифосфатаз, относятся и эндополифосфатазы, расщепляющие молекулы полиР на более низкомолекулярные фрагменты. Важным остается вопрос участия этих полифосфатаз в метаболизме отдельных фракций полиР. С этой целью были исследованы следующие мутанты по этим ферментам: родительский штамм CRY, мутант CRX с инактивированным геном РРХ1, кодирующим экзополифосфатазу цитозоля, мутант CRN с инактивированным геном PPN1, кодирующим эндополифосфатазу вакуолей и мутант CNX с инактивированными обоими генами РРХ1 и PPN1 (Wurst et al., 1995; Kumble and Komberg, 1996; Sethuramanet al., 2001.

Таблица 9. Содержание полиР в клетках 4-х штаммов дрожжей в стационарной стадии роста. ( 1 - мкмоль Р/г сухой биомассы). Все штаммы выращивали на среде УРБ в течение 24 часов.

Соединение Штамм

CRY CRX CRN CNX

Сумма полиР 283 359 407 507

Из представленных в табл.9 данных видно, что мутации в генах РРХ1 и PPN1 повлияли на накопление полиР у мутантов. Общая сумма полиР увеличивалась в ряду культур CRY, CRX, CRN, и CNX. Большая часть клеточных полиР, от 46% до 67% общей их суммы, у всех 4-х штаммов была представлена кислоторастворимой фракцией, которая в точности повторяла у них тенденцию поведения суммарных полиР (рис.8). Из остальных фракций только у двойного мутанта CNX, не содержащем ни цитозольных экзополифосфатаз, ни вакуолярной эндополифосфатазы, был выше уровень щелочерастворимой фракции полиРЗ. Содержание солерастворимой фракции полиР2 мало отличалось у всех 4-х штаммов. У всех штаммов наблюдался невысокий уровень фракций полиР4 и полиР5 (рис.8).

ПолнР

200

12345 12345 12345 12345

CRY

CRX

CRN

CNX

Рис. 8. Содержание фракций полиР (мкмоль Р/г сухой биомассы) штаммов CRY, CRX, CRN и CNX.

Обозначения: 1 - полиР1; 2 -полиР2; 3 - полиРЗ; 4 -полиР4; 5 - полиР5.

ПолиР1, экзополяфосфатазняя активность, %

Рис. 9. Содержание полиР1 и экзополнфосфатазной активности в цитозоле в родительском в мутантвых штаммах 5. сегегШае в стационарной стадии роста. Обозначения: 1 - экзополифосфатазная активность, 2 - фракция полиР1. 100% для экзополнфосфатазной активности соответствуют 39 Е/г, а для фракции полиР1 - 292 мкмоль Р/г сухой биомассы клеток.

У рассматриваемых штаммов общее количество полиР находилось в обратной зависимости от уровня экзополнфосфатазной активности цитозоля. Т.к. общий пул полиР у штаммов определялся в значительной степени уровнем кислоторастворимой фракции полиР1 (табл. 9, рис.8), можно считать, что на самом деле от уровня экзополнфосфатазной активности, в первую очередь, зависит уровень фракции полиР 1 (рис. 9). Следовательно, полученные данные впервые указывают на взаимосвязь между метаболизмом отдельной кислоторастворимой фракции полиР 1 и экзополифосфатазой цитозоля.

Таким образом, данные о содержании полиР у мутантных штаммов дрожжей с поврежденными структурными генами полифосфатаз впервые продемонстрировали возможную функциональной связь низкополимерной фракции полиР 1 и, частично, высокополимерной полиРЗ с экзополифосфатазами и эндополифосфатазой.

ВЫВОДЫ

1. Впервые сочетанием методов химической экстракции и 31Р-ЯМР-спектроскопии выделены и охарактеризованы отдельные фракции полиР, различающиеся изменением степени полимерности и динамикой накопления и потребления в процессе роста Saccharomyces cerevisiae.

2. Выявлен ступенчатый характер синтеза щелочерастворимых полифосфатов, характеризующийся тем, что на первом этапе после фосфатного голодания происходит накопление этих соединений, а на следующем - только увеличение длины их цепи.

3. Обнаружено, что полифосфаты вакуолей и щелочерастворимой фракции полиР4, в отличие от основной массы этих соединений клетки, не подвержены гиперкомпенсации, что указывает на существование различных механизмов регуляции синтеза полиР у дрожжей.

4. Установлено, что ингибиторы биохимических процессов по-разному влияют на накопление отдельных фракций полифосфатов, в частности, процесс синтеза фракции полиР4 является более чувствительным к действию протонофора FCCP и циклогексимида, а фракции полиРЗ - к действию 2-дезоксиглюкозы.

5. С помощью мутантов с инактивированными генами экзополифосфатазы цитозоля РРХ1 и эндополифосфатазы PPN1, впервые выявлена метаболическая связь между содержанием кислоторастворимой фракции полиР 1 и уровнем экзополифосфатазной активности цитозоля у дрожжей.

6. Совокупность полученных данных дает основания выдвинуть гипотезу о множественности путей биосинтеза отдельных фракций полифосфатов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключении автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям: член-корреспонденту РАН, профессору Игорю Степановичу Кулаеву и д.б.н Владимиру Мамедовичу Вагабову за постоянное внимание к работе и обсуждение полученных результатов, а также к.б.н. H.A. Андреевой и к.б.н. Л.П. Личко, совместно с которыми проведена часть экспериментальной работы и A.B. Мудрик за оказанную помощь при проведении экспериментов.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Вагабов В.М., Трилисенко JI.B., Щипанова И.Н., Сибельдина JI.A., Кулаев И.С. (1998). Изменение длины цепи неорганических полифосфатов в зависимости от стадии роста Saccharomyces cerevisiae. Микробиология. Т. 67. № 3. С. 193-198.

2. Кулаев И.С.,. Вагабов В.М, Кулаковская Т.В, Личко Л.П., Андреева Н.А, Трилисенко Л.В. (2000). Развитие идей А.Н. Белозерского по биохимии полифосфатов. Биохимия. Т. 65. №.3. С. 325-333.

3. Вагабов В.М., Трилисенко Л.В., Кулаев И.С. (2000). Зависимость длины цепи неорганических полифосфатов от содержания ортофосфата в среде у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия. Т. 65. № 3. С. 414420.

4. Трилисенко Л.В., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (2002). Содержание и длина цепи полифосфатов вакуолей дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКМ Y-1173. Биохимия. Т.67. № 5. С. 711-716.

5. Трилисенко Л.В., Андреева Н.А., Кулаковская Т.К., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (2003). Ингибиторный анализ обмена полифосфатов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях гиперкомпенсации. Биохимия. Т. 68. № 5. С. 706-711.

6. Kulakovskaya T.V., Andreeva N.A., Trilisenko L.V., Vagabov V.M., Kulaev I.S. (2004). Two exopolyphosphatases in Saccharomyces cerevisiae cytosol at different culture conditions. Proc. Biochem. V. 39. P. 1625-1630.

7. Кулаев И.С., Вагабов B.M., Кулаковская T.B., Андреева Н.А., Личко Л.П., Трилисено Л.В. (2005). Особенности метаболизма и функций высокомолекулярных неорганических полифосфатов у низщих эукариот на примере дрожжей. Молекулярная биология. Т.39, № 4. С. 4-i5

8. Vagabov V.M., I.N. Shipanova, L.V.Trilisenko, L.A. Sibel'dina. I.S. Kulaev, (1996). ""P-NMR study of polyphosphate in yeast cells" in "Phosphorus, Sulfiir, Silicon", Ed. I. Heby, Gordon and Breach publishers inc., London. P. 1727.

9. Вагабов B.M., Трилисенко Л.В. (1997.) Изменение содержания и длины цепи неорганических полифосфатов в зависимости от условий роста дрожжей. 2-й съезд биохимического общества РАН, Пущино, ПНЦ. С. 175.

10. Kulaev I.S, Vagabov V.M., Kulakovskaya T.V., Lichko L.P., Andreeva N.A., Trilisenko L.V. (2000). New aspects of polyphosphate biochemistry.Intern. Symp. "Modern problem of microbiol biochemistry and biotechnology". Pushchino. P. 12.

11. Trilisenko L.V., Shchipanova I.N., Sibeldina L.A., Vagabov V.M. (2000). 31P-NMR spectroscopic study of polyphosphates in the yeast. In "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology". Pushchino. P. 60.

?Í2 6

РНБ Русский фонд

2006-4 22895

Подписано в печать 20 октября 2005 г. Заказ 490. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Трилисенко, Людмила Васильевна

Введение 6 ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУ РЫ

Глава 1. Полифосфаты, их локализация в клетках дрожжей, метаболизм и функции.

1.1. Содержание, локализация и длина цепи фракций полифосфатов в клетках дрожжей.

1.1.1. Содержание полифосфатов

1.1.2. Фракции полифосфатов и их локализация в клетках дрожэ/сеу

1.1.3. Длина iienu полифосфатов у дрожжей

1.2. Динамика содержания полифосфатов в клетках в процессе роста дрожжей

1.3. Явление гиперкомпенсации полифосфатов у микроорганизмов

1.3.1. Прокариоты

1.3.2. Эукариоты.

1.4. Синтез и деградация полифосфатов в клетках дрожжей.

1.4.1. Пути синтеза

1.4.2. Ферменты деградации

1.5. Функции полифосфатов в клетках дрожжей.

Глава 2. Влияние ингибиторов на содержание полифосфатов в клетках дрожжей.

Глава 3. Влияние инактивации генов полифосфатного метаболизма на уровень полиР в клетках мутантов S. cerevisiae 38 ЧАСТЬ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования

2.2. Условия культивирования.

2.3. Получение биомассы клеток

2.4. Получение сферопластов из клеток дрожжей

2.5. Выделение вакуолей

2.6. Методы экстракции полифосфатов 44 2. б. 1. Метод Лангена и Лисса в модификации Кулаева и др.

2.6.2. Метод Лангена к Лисса в модификации Чернышевой и др.

2.6.3. Метод Кларк и др.

2.7. Определение различных фосфорных соединений во фракциях.

2.В. Сорбция нуклеотидов на уголь

2.9. Подготовка образца полиР для 31Р-ЯМР-спектроскопии

2.10. Рабочие параметры прибора при снятии Э1Р-Я№Р-спектров полиР.

2. "J 1. Количественные методы определения фосфора. 49 2.11.1. Метод Беренблюма и Чейиа в модификации Вейль - Малеров и

Грина.

2. Л. 2. Метод Якке и др.

2.12. Определение белка по методу Лоури в модификации Петерсона.

2.13. Определение глюкозы 51 2.14 Разделение экзополифосфатаз I и II цитозоля

2.15. Определение ферментативных активностей.

2.15.1. Определение экзополифосфатазной активности цитозоля.

2.15.2. Определение экзополифосфатазной активности вакуолей.

2.15.3. Определение АТФазной активности вакуолей.

2.15.4. Определение о.-маннозидазы.

2.14.5. Определение а-глюкозидазы. '

2.16. Очистка полиР от примесей низкомолекулярных компонентов.

2.17. Определение сухой биомассы клеток дрожжей. 53 ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Сравнительный анализ фракций полифосфатов, выделенных различными методами из клеток S. cerevisiae.

3.2. Зависимость содержания и длины цепи фракций полифосфатов от фазы роста дрожжей S .cerevisiae.

3.2.1. Изменение содержания фракций полифосфатов в прогрессе роста дрожжей.

3.2.2. Изменение длины цепи отдельных фракций полифосфатов в процессе роста дрожжей.

3.3. Влияние концентрации Р; в среде на накопление и степень полимерности различных фракций полифосфатов у дрожжей S. cerevisiae.

3.3.1. Подбор оптимальных условий культивирования дрожжей, обеспечивающих феномен гитркомпенсаг\ии полифосфатов.

3.3.2. Динамика содержания полифосфатов в клетках дрожжей в условиях фосфорного голодания и гиперкомтнсагпт. 71 3.3.3. Изменение длины tie ни полифосфатов в клетках дрожжей в условиях фосфорного голодания и гиперкомпенсаиии.

3.4. Полифосфатазная активность в дрожжевых сферопластах и вакуолях в условиях фосфорного голодания и гиперкомпенсации полиР.

3.5. Влияние ингибиторов на накопление полифосфатов у S .cerevisiae в условиях интенсивного их синтеза.

3.6. Влияние инактивации генов РРХ1 и PPN1 на уровень полифосфатов у

S. cerevisiae.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций неорганических полифосфатов у дрожжей Saccharomyces сerevisiae"

Актуальность проблемы. Фосфор, входящий в состав многих важных клеточны компонентов, в том числе нуклеотидов, нуклеиновых кислот, фосфолипидов и других соединений, абсолютно необходим для жизнедеятельности клеток. Неорганически полифосфаты (полиР) - полимеры, состоящие из остатков ортофосфорной кислоты, соединенных между собой макроэргическими фосфоангидридными связями, при гидролиз которых высвобождается энергия примерно такая же, как и при отщеплении терминального фосфата от АТФ. Благодаря этому, полиР являются запасниками фосфора и энергии, а такж выполняют другие многочисленные функции: участвуют в связывании катионов, обеспечивая внутриклеточных ионный баланс (Oshumi and Anraku, 1981; Lichko et al., 1982), в формировании и функционировании клеточной оболочки (Вагабов и др., 1990; Иванов и др., 1996), в регуляции активности ряда ферментов (Wolska-Mitaszko, 1997; Кулаев и др., 1999), в преодолении осмотического и щелочного стрессов, температурного шока (Greenfield et al., 1987; Castro et al., 1997), в формировании специальных каналов, транспортирующих некоторые ионы, через клеточные мембраны (Рош, 2000) и др. Все это выдвигает исследования путей метаболизма неорганических полифосфатов в ряд актуальных задач биохимии и клеточной биологии.

В зависимости от компартментации и состояния в клетке полиР экстракцией можно разделить на несколько фракций, функции которых определяются компартментом, с которым связаны эти соединения. О динамике и структуре фракций полиР в процессе роста клеток в литературе имеются фрагментарные данные. Они касаются, в основном, общего содержания полиР в клетке или в отдельной органелле (Liss and Langen, 1962; Greenfield et al., 1987, Beauvoit et al., 1989). Количественное содержание фракций является результатом двух противоположных процессов - синтеза и деградации полиР. Пути синтеза полиР у дрожжей, в отличие от бактерий, до сих пор остаются неясными. Доказан только путь сопряженного синтеза фракции высокомолекулярных полиР, локализованной в клеточной оболочке, и маннопротеина клеточной стенки, который обеспечивает образование части общего пула полиР в клетке (Kulaev, Vagabov, and Shabalin, 1987). Одним из подходов к пониманию путей биосинтеза полиР может быть изучение влияния метаболических ингибиторов на биосинтез отдельных фракций этих полимеров. Имеющиеся сообщения касаются суммарного количества в целых клетках и содержания полиР в митохондриях дрожжей (Beauvoit et al., 199]; Loureiro-Dias and Santos 1989; Pestov et al., 2003).

Экзополифосфатазы, участвующие в деградации полиР, обнаружены почти во всех клеточных структурах дрожжей и имеют определенную специфичность по отношению к длине субстрата. (Lichko et al., 2003а). Однако, механизмы вовлечения полиР в метаболизм с участием этих ферментов пока не известны. Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций полиР у дрожжей обусловлено необходимостью выяснения путей биосинтеза и функций полиР, локализованных, в клеточных органеллах, что позволит, в конечном итоге, более полно представить картину обмена этих необычных полианионов.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение структуры и содержания отдельных фракций полифосфатов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisicte в зависимости от фазы роста, условий культивирования, а также мутаций по основным генам полифосфатного обмена.

Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

1) подобрать оптимальный метод экстракции фракций полиР из дрожжей, позволяющий осуществлять более полное и дробное извлечение их из'клеггок, и определить структуру фракций методом "'Р-ЯМР-спектроскопии:

2) определить содержание и структуру фракций полиР на разных фазах роста культуры дрожжей, а также в процессе фосфорного голодания и последующего сверхсинтеза полиР;

3) определить длину цепи и содержание полиР в вакуолях в обычных условиях роста дрожжей и в условиях сверхсинтеза полиР;

4) изучить влияние ингибиторов различных биохимических процессов на синтез фракций полиР;

5) изучить содержание отдельных фракций полиР у мутантов ' S. cerevisicie с инактивированными генами экзополифосфатазы РРХ1 и эндополифосфатазы PPN1.

Научная новизна работы. Установлено, что в процессе роста S. cerevisicie ВКМ Y-] 173 каждая фракция полиР характеризуется своей динамикой накопления и потребления. Сочетанием химической экстракции полиР из клеток и метода 3,Р-ЯМР впервые показано, что средняя длина цепи разных фракций не является константной величиной, а изменяется в процессе роста и в зависимости от условий культивирования дрожжей.

Впервые выявлен ступенчатый характер синтеза щелочерастворимых полифосфатов, когда после фосфорного голодания на первом этапе происходит накопление полифосфатов, а на следующем — только .увеличение длины их цепи.

Обнаружено, что полифосфаты вакуолей и щелочерастворимой фракции полиР4, в отличие от других фракций этих соединений, не подвержены сверхнакоплению, что свидетельствует о существовании различных механизмов регуляции синтеза полиР в клетках дрожжей.

Установлено, что ингибиторы биохимических процессов по-разному влияют на уровень накопления отдельных фракций полифосфатов, в частности, ЦГИ и FCCP полностью подавляют накопление фракции полиР4, а 2-дезоксиглюкоза - фракции полиРЗ.

С помощью мутантов с инактивированными генами, кодирующими экзополифосфатазу цитозоля РРХ1 и эндополифосфатазу вакуолей PPN1, впервые выявлена метаболическая связь между содержанием кислоторастворимой фракции полиР 1 и уровнем экзополифосфатазной активности цитозоля у дрожжей.

Совокупность полученных данных дает основания выдвинуть гипотезу о множественности путей биосинтеза отдельных фракций полифосфатов у дрожжей S. cerevisicie.

Научно-практическое значение. Данная работа является фундаментальным, исследованием. Полученные результаты систематизируют и расширяют представления о структуре и метаболизме фракций полиР у дрожжей, в частности в условиях фосфорного голодания и последующей их гиперкомпенсации, при воздействии ингибиторов, а также влияние на их уровень мутаций по основным генам полифосфатного обмена. Материалы работы могут быть использованы в лекциях и практических занятиях студентов по биохимии микроорганизмов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 114 страницах, содержит 15 таблиц и 14 рисунков. Библиографический указатель включает 211 источников литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Трилисенко, Людмила Васильевна

ВЫВОДЫ

Впервые сочетанием методов химической экстракции и 31Р-ЯМР-спектроскопии выделены и охарактеризованы отдельные фракции полиР, различающиеся изменением степени полимерности и динамикой накопления и потребления в процессе роста Saccharomyces cerevisiae.

Выявлен ступенчатый характер синтеза щелочерастворимых полифосфатов, характеризующийся тем, что на первом этапе после фосфатного голодания происходит накопление этих соединений, а на следующем - только увеличение длины их цепи.

Обнаружено, что полифосфаты вакуолей и щелочерастворимой фракции полиР4, в отличие от основной массы этих соединений клетки, не подвержены гиперкомпенсации, что указывает на существование различных механизмов регуляции синтеза полиР у дрожжей.

Установлено, что ингибиторы биохимических процессов по-разному влияют на накопление отдельных фракций полифосфатов, в частности, процесс синтеза фракции полиР4 является более чувствительным к действию протонофора FCCP и циклогексимида, а фракции полиРЗ - к действию 2-дезоксиглюкозы.

С помощью мутантов с инактивированными генами экзополифосфатазы цитозоля РРХ1 и эндополифосфатазы PPN1, впервые выявлена метаболическая связь между содержанием кислоторастворимой фракции . полиР! и уровнем экзополифосфатазной активности цитозоля у дрожжей.

Совокупность полученных данных дает основание выдвинуть гипотезу о множественности путей биосинтеза и регуляции отдельных фракций полифосфатов у дрожжей S. cerevisiae.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На начальном этапе экспериментальной работы нами был проведен сравнительный анализ различных химических методов выделения фракций полиР из клеток дрожжей. Исследование содержания отдельных фракций было впервые проведено в сочетании с 3|Р-ЯМР-спектроскопическим определением длины их цепи. Такой подход позволил с одной стороны оценить количественный вклад каждой фракции в общий пул полиР, с другой -определить среднюю степень полимерности каждой из них. Метод выделения фракций полиР, предложенный Лангеном и Лиссом в модификации И.С.Кулаева и др.(1960), позволил по сравнению с другими, во-первых, более полно экстрагировать эти соединения из клеток и, во-вторых, разделить общий пул полиР дрожжевой клетки на большее число фракций, различающихся степенью полимерности. Благодаря этому в дальнейших исследованиях удалось обнаружить особенности в поведении отдельных фракций полиР в различных условиях культивирования дрожжей.

В данной работе нами было прослежено изменение содержания отдельных фракций полиР в процессе роста дрожжей S. cerevisiae, начиная с посевного материала (0 ч) и заканчивая глубоким стационаром (24 ч). Большая часть полифосфатного пула клеток сосредоточена в двух фракциях - полиР! и полиРЗ. Часть кислоторастворимой фракции полиР1, около 30%, расположена в вакуолях. В процессе роста дрожжей каждая фракция полиР характеризуется при наличии глюкозы в среде своей динамикой накопления, а в ее отсутствии - своей динамикой потребления. Последнее указывает на использование полиР клетками в качестве источника энергии. Обнаруженные изменения степени полимерности отдельных фракций на разных фазах роста дрожжей позволили выделить несколько особенностей в поведении фракций в процессе роста культуры. Во-первых, как утверждалось и ранее (Langen and Liss, 1959), каждая фракция имеет свою степень полимерности, которая возрастает от полиР 1 до полиР4. Во-вторых, было обнаружено, что в процессе роста дрожжей степень полимерности фракций не постоянна, причем для каждой из фракций отмечен свой характер изменения длины цепи. Наиболее высокополимерные фракции полиРЗ и полиР4 имеют более высокую степень полимерности в стационарной фазе. Длина цепи фракции полиР2 подвержена значительным колебаниям в процессе всего развития культуры, в то же время длина цепи субфракций полиР1-1 и полиР1-2 практически не изменяется. В-третьих, на некоторых фазах роста разные фракции полиР могут иметь одинаковые длины цепей (рис. 8, полиР2 и полиРЗ). Эти факты свидетельствуют или о неодинаковом их состоянии в клетке, или о различной их компартментации.

В условиях дефицита экзогенного фосфата в среде дрожжи активно используют все фракции полиР в качестве внутриклеточного резерва этого элемента (табл.10). При этом, за исключением полиР2, происходит снижение степени полимерности фракций полиР, что безусловно связано с деградацией этих соединений в процессе их активного потребления. Перенос клеток на свежую фосфат содержащую среду вызывает быстрый рост содержания полифосфатных фракций (гиперкомпенсация), но больше всего их накапливается во фракциях полиР 1, полиР2 и особенно полиРЗ (рис.11, точка С). Исключение составляет локализованная в клеточной оболочке фракция полиР4, первоначальный уровень которой восстанавливается только к 4 ч культивирования на среде с фосфатом. Аналогичный эффект наблюдается и в вакуолях, полиР которых, как и полиР других компартментов клетки, в условиях фосфорного голодания быстро потребляются, но в условиях гиперкомпенсации в них не происходит сверхнакопление этих соединений. Этот факт позволяет предполагать, что в разных компартментах имеются различные пути метаболизма полиР и их регуляции.

Измерение длины цепи отдельных фракций полиР показало, что она зависит не только от способа фракционирования, как считалось ранее (Langen and Liss, 1959, Кулаев, 1975), но и от условий роста дрожжей. Интересно, что длина цепи фракций полиРЗ и полир4 в течение первых 2 ч интенсивного синтеза в условиях гиперкомпенсации находится практически на том же уровне, что и в условиях фосфорного голодания (рис. 12а, точка С) и увеличивается только при продолжении роста культуры на фосфатной среде (рис. 12а, точка D). Это предполагает существование ступенчатого характера синтеза высокомолекулярных фракций полиР. В этом случае в них в условиях гиперкомпенсации вначале образуется сверхвысокое количество полиР, и только в процессе дальнейшего роста культуры происходит увеличение длины цепи этих соединений при неизменном их количестве во фракции.

Анализ результатов по накоплению фракций полиР в процессе роста и в условиях их интенсивного потребления и гиперкомпенсации (рис. 6 и П) показывает, что полиР щелочерастворимой при рН 9-10 фракции (полиРЗ), в отличие от фракций полиР 1, полиР2 и полиР4, способны более интенсивно накапливаться и более интенсивно потребляться. В условиях гиперкомпенсации ее содержание в клетках достигает 40% суммы всех полиР клетки. Высокая мобильность данной фракции позволяет предполагать, что ее основная роль в дрожжевой клетке заключается в создании резерва фосфора и энергии.

Суммируя полученные нами данные о влиянии ингибиторов на накопление фракций полиР, следует отметить следующее. Использованные ингибиторы в разной степени действуют на накопление отдельных фракций полиР. Так, накопление фракции полиР4 полностью подавляется ЦГИ. Это подтверждает представление о том, что данная фракция имеет особый путь биосинтеза, связанный с синтезом маннопротеинов клеточной стенки (Шабалин и др., 1979; Kulaev and Vagabov, 1983; Kulaev et al., 1987; Вагабов, 1988). Возможно, она и функционально также связана с этой органеллой (Вагабов и др., 1990; Иванов и др., 1996). Отсутствие или слабое влияние ЦГИ на накопление других фракций полиР указывает на то, что индукция синтеза соответствующих ферментных систем происходит еще на этапе фосфорного голодания.

Полное торможение синтеза фракции полиР4 и снижение уровня накопления остальных фракций, за исключением полиР2, под воздействием FCCP показывает, что наличие электрохимического потенциала ДрН* на мембранах клеточных органелл является важным фактором для накопления каждой из них, хотя и в разной степени. Наиболее вероятной причиной такого эффекта может быть низкое содержание Pi у дрожжей (табл.13). Известно, что поступление Pj в клетку зависит от уровня градиента электрохимического потенциала ДцН+ на цитоплазматической мембране (Persson et al., 2003), понижающегося в данном случае в присутствии FCCP.

Ингибирование Н'-АТРазы вакуолей бафиломицином А1, хотя и в значительно меньшей степени, чем FCCP, также приводит к уменьшению накопления фракций полиР, за исключением полиР 1, что подтверждает важное значение для биосинтеза полиР существования A|iH+ на мембранах.

2-Дезоксиглюкоза, снижая почти в 2 раза накопление общей суммы клеточных полиР, в разной степени тормозит синтез отдельных фракций и полностью подавляет накопление только фракции полиРЗ. Это свидетельствует о тесной связи их синтеза с углеводным обменом, а для полиРЗ - полной от него зависимости (Кулаев, 1975). Различное влияние ингибиторов на накопление отдельных фракций полиР подтверждает множественность путей биосинтеза полиР.

Использование ингибиторов позволило разграничить два процесса, протекающих в клетках после пересева дрожжей с фосфат-дефицитной на полноценную среду - накопление полиР и синтез de novo высокомолекулярной экзополифосфатазы (II) цитозоля (табл. 13). Так, ЦГИ, блокирующий синтез этого фермента, почти не влияет на содержании полиР, 2-дезоксиглюкоза, подавляющая практически в 2 раза накопление полиР, всего на 20% снижает биосинтез экзополифосфатазы, a FCCP, не снижающий уровень активности фермента, на 30% тормозит накопление полиР. Следовательно, экзополифосфатаза (И) цитозоля, по-видимому, не имеет отношения к синтезу полиР. Для выяснения роли этих ферментов потребовались дополнительные исследования.

При фосфорном голодании дрожжей вакуолярная экзополифосфатаза экзополифосфатазы сферопластов вели себя по-разному. В вакуолях происходило более чем четырех кратное увеличение активности фермента, которая после культивирования дрожжей в условиях гиперкомпенсации полиР, снижалась примерно в 7 раз, в то время как в сферопластах в этих условиях наблюдалось незначительное изменение активности. Т.е. в вакуолях регуляция синтеза фермента осуществляется экзогенным Р;, как это наблюдается у бактерий (Harold, 1964; Несмеянова и др., 1974) и отличается от таковой в сферопластах. Это позволяет считать, что в условиях фосфорного голодания полиР вакуолей используются для поддержания жизнедеятельности клетки именно при участии экзополифосфатазы. В то же время механизм мобилизации клеткой полиР, находящихся в других органеллах, в этих условиях роста, по-видимому, иной.

Изучение накопления фракций полиР у мутантов, имеющих инактивированные гены цитозольной экзополифосфатазы I и вакуолярной эндополифосфатазы, позволило уточнить связь между обменом отдельных фракций полиР и названными ферментами.

Наши исследования отдельных фракций у данных штаммов показали, что на изменения ферментного состава у мутантов реагирует наиболее представительная у данного штамма дрожжей кислоторастворимая фракция полиР1 (рис.15). Поскольку экзополифосфатаза I -цитозольный фермент, а эндополифосфатаза - вакуолярный, повышение уровня фракции полиР! у мутанта CRX на 40%, а у мутантов CRN и CNX более, чем в 2 раза по сравнению с родительским штаммом, подтверждает, что данная фракция имеет множественную клеточную локализацию. Часть ее находится в цитоплазме, а часть - в вакуолях. Это, в свою очередь, согласуется с полученными нами данными о содержании в вакуолях дрожжей S. cerevisiae штамм ВКМ Y-1173 до 30% кислоторастворимой фракции клеток.

В то же время у двойного мутанта CNX увеличивается не только фракция полиР 1, но и щелочерастворимая фракция полиРЗ. Видимо, только одновременное отсутствие полифосфатаз цитозоля и вакуолей приводит к торможению потребление клеткой полиР этой фракции. Практически одинаковый уровень солерастворимой фракции полиР2 у всех штаммов демонстрирует отсутствие функциональной связи вакуолярной эндополифосфатазы и цитоплазматических экзополифосфатаз I и II с данной фракцией полиР и говорит в пользу возможной локализации последней в ядре (Кулаев и др., 1970; Kulaev et al., 2004).

Полученные в работе данные четко показывают, что исследованные фракции полиР имеют разную компартментацию, как и предполагалось ранее (Kulaev and Vagabov, 1983), и разные пути метаболизма, и, следовательно, они могут выполнять специфические функции, связанные с особенностями конкретного компартмента.

В нашем исследовании использовано понятие «накопление», которое отражает сумму полифосфатов в клетке, получаемую в результате двух противоположных процессов -синтеза и потребления данных полимеров. Однако, использование методического приема, приводящего к интенсивному синтезу полиР после переноса клеток из среды без фосфата в фосфат содержащую среду и дополненного ингибиторным анализом, позволяет с большей определенностью судить о процессах синтеза этих соединений.

Представленные результаты, свидетельствующие о различной динамике накопления отдельных фракций полиР и изменяющейся при этом степени их полимерности как в процессе роста дрожжей, так и в условиях гиперкомпенсации полиР, а также различное влияние ингибиторов на накопление отдельных фракций полиР, дают основание выдвинуть гипотезу о множественности путей биосинтеза этих полимеров.

У дрожжей к настоящему времени достоверно показан путь синтеза полиР, сопряженный с синтезом важнейшего компонента клеточной стенки - маннопротеина (Kulaev et al., 1987; Kulaev et al., 2004). У некоторых грибов и ряда других микроорганизмов обнаружен путь синтеза полиР с участием 1,3 дифосфоглицерата (Кулаев и Бобык,1971; Kulaev et al., 2004). Однако, такой путь синтеза пока не выявлен у дрожжей. Широко распространенный у бактерий синтез полиР за счет терминального фосфата АТФ при участии полифосфаткиназы, у дрожжей до настоящего времени не доказан. Незначительная активность фермента (Felter and Stahl, 1973) обнаружена только в вакуолях, при этом на порядок более активно протекала обратная реакция образования АТФ из полиР (Шабалин и др, 1977; Kulaev et al., 2004). Поэтому вопрос о путях синтеза полиР у дрожжей до сих пор остается одной из важнейших проблем биохимии полиР.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трилисенко, Людмила Васильевна, Пущино

1. Андреева Н.А., Личко Л.П., Кулаковская Т.В., Окороков Л.А. (1993). Характеристика полифосфатазной активности вакуолей дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 58, 1053-1 Об 1.

2. Андреева Н.А., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (1994). Характеристика полифосфатазной активности цитозоля дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 59, 1882-1892.

3. Андреева Н.А., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (1996). Очистка и характеристика полифосфатазы из цитозоля S. cerevisiae. Биохимия, 61, 1714-1724.

4. Андреева Н. А., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (2001). Две экзополифосфатазы цитозоля дрожжей S. cerevisiae: сравнительная характеристика. Биохимия, 66, 187194.

5. Андреева Н.А., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (2004). Очистка и свойства экзополифосфатазы цитозоля Saccharomyces cerevisiae, не кодируемой геном PPXI. Биохимия, 69, 480-487.

6. Ашмарнн И.П., Ключарев Л.А. (1975). Ингибиторы синтеза белка. «Медицина», М., с. 206.

7. Бобык М.А., Кулаев И.С. (1971). Обнаружение у Neurospora crassa нового фермента 1,3-дифосфоглицерат:полифосфатфосфотрансферазы. Биохимия, 36, 426-429.

8. Вагабов В.М., Циоменко А.Б., Шабалин Ю.А. (1973). Изучение взаимосвязи метаболизма полифосфатов и маннана у дрожжей. ОНТИ НЦБИ, Пущино, 144155.

9. Вагабов В.М. (1988). Биосинтез углеводных компонентов клеточной стенки дрожжей. ОНТИ НЦБ, Пущино, с. 197.

10. Вагабов В.М., Чемоданова О.В., Кулаев И.С. (1990). Влияние неорганических полифосфатов на величину отрицательного заряда клеточной оболочки дрожжей. Докл. АН СССР, 313, 989-992.

11. Ван Везер (1962) Фосфор и его соединения. М., ИЛ, с. 416

12. Дмитриева С.В., Беккер З.Е. (1962). Природа волютиновых гранул у Penicillium chrysogemm. Цитология, 4, 691-695.

13. Крицкий М.С., Чернышева Е.К., Кулаев И.С. (1970). О корреляции накопления некоторых фракций неорганических полифосфатов и РНК у Neurospora crassa Ad 28-610. Докл. АН СССР, 192, 1166-1169.

14. Крицкий М.С., Чернышева Е.К., Кулаев И.С. (1972). Изучение полифосфат деполимеразной активности в клетках гриба Neurospora crassa. Биохимия, 37, 983995.

15. Кулаев И.С., Белозерский А.Н., Крицкий М.С., Кокурина Н.А. (1960а). О полифосфатах плодовых тел шампиньонов и строчков. Докл. АН СССР, 130, 667670.

16. Кулаев И.С., Крицкий М.С., Белозерский А.Н. (19606). Обмен полифосфатов и некоторых других фосфорных соединений в процессе развития плодовых тел шампиньонов Agaricus bisporus L Биохимия, 25, 735-748.

17. Кулаев И.С., Белозерский A.BL (19626). Конденсированные неорганические фосфаты в обмене веществ живых организмов. Изв. АН СССР, 3, 502-521

18. Кулаев И.С. и Вагабов В.М. (1967). Влияние условий выращивания на обмен неорганических полифосфатов и некоторых других фосфорных соединений у Scenedesmus obliquus. Биохимия, 32,253-260.

19. Кулаев И.С., Крашенинников И.А, Поляков В.Ю. (1970). Фосфорные соединения препаратов клеточных ядер Neurospora crassa. В сб. «Клеточное ядро и его ультраструктуры». Изд-во «Наука», М., с. 310-315.

20. Кулаев И.С., Коношенко Г. И. (1971). О локализации 1,3- дифосфоглицерат: полифосфатфосфотрансферазы в клетках Neurospora crassa. Докл. АН СССР, 200, 10-12.

21. Кулаев И.С., Вагабов В.М., Цноменко А.Б. (1972а). О корреляции накопления полисахаридов клеточной стенки и некоторых фракций высокомолекулярных полифосфатов у дрожжей. Докл. АН СССР, 204, 734-736.

22. Кулаев И.С., Коношенко Г.И., Чернышева Е.К., Крицкий М.С. (19726). Локализация и возможная роль полифосфат деполимеразы в клектах Neurospora crassa. Докл. АН СССР, 206, 233-235.

23. Кулаев И.С., Крашенинников И.А., Тырснн Ю.А. (1973). Нуклеиновые кислоты, высокополимерные фосфаты и некоторые ферменты полифосфатного обмена в синхронизированной культуре Schizosaccharomyces pomhe. Микробиология, 42, 613-622.

24. Кулаев И.С., Рожанец В.В., Кобылянский А.Г., Филиппович Ю.Б. (1974). Обнаружение пирофосфата и других полифосфатов у некоторых насекомых. Жури. Эаол. биохим. фюиол., 10, 147-152.

25. Кулаев И.С. (1975). Биохимия неорганических полифосфатов. Москва. Изд. МГУ.

26. Кулаев И.С. (1995). Эволюционные аспекты биохимии неорганических полифосфатов. Молекулярная биология, 29, 1210-1217.

27. Кулаев И.С., Т.В. Куликовская, Н.А. Андреева, JI.П. Личко (1997). Эволюция функций неорганических полифосфатов на разных этапах филогенетического развития живых существ. Ж.Эвол.биохим.фюиол.,33, 74-82.

28. Курода А. И Отаке X (2000). Молекулярный анализ накопления полифосфатов у бактерий. Биохимия., 65, 362-367.

29. Левчук Т.П., Гершкович В.Г., Лозинов А.Б. (1969). Некоторые особенности фосфорного метаболизма у дрожжей Candida при росте на «-алканах. Микробная. Спит., 7, 22-27.

30. Личко Л.П. (1981). Компартментация неорганических ионов и регуляция их уровня в цитоплазме эукариотических микроорганизмов. Канд. Дисс., Пущино.

31. Личко Л.П. (1994). Биоэнергетика вакуолярной мембраны дрожжей. ОНТИ НЦБИ, Пущино.

32. Личко Л.П., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (1996). Характеристика ядерной полифосфатазной активности в Saccharomyces cerevisiae. Биохимия,61, 361-366.

33. Личко Л. П., Кулаковская Т. В., Кулаев И. С. (2000). Очистка и характеристика растворимой полифосфатазы из митохондрий Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 65, 421-427.

34. Личко Л. П., Пестов Н. А., Кулаковская Т. В., Кулаев И. С. (2003). Инактивация гена, кодирующего экзополифосфатазу РРХ1, приводит к изменению спектра экзополифосфатаз цитозоля и митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 68, 902-910.

35. Личко Л.П., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (2004). Частичная очистка и характеристика экзополифосфатазы ядер штамма Saccharomyces cerevisiae с инактивированным геном PPXI, кодирующим основную экзополифосфатазу дрожжей. Биохимия, 69, 338-343.

36. Несмеянова М.А., Дмитриев А.Д., Кулаев И.С. (1973). Высокомолекулярные полифосфаты и ферменты полифосфатного обмена в процессе роста культуры Escherichia coli. Микробиология, 42, 213-219.

37. Несмеянова М.А., Дмитриев А.Д., Кулаев И.С. (1974). Регуляция экзогенным ортофосфатом ферментов фосфорного обмена и уровня полифосфатов у Escherichia coli К-12. Микробиология, 43, 227-234.

38. Несмеянова М.А., Гонима С.А., Кулаев И.С. (1975а). Биосинтез полифосфатаз Escherichia coli под контролем общих с щелочной фосфатазой регуляторных генов. Докл. АН СССР, 224, 710-712.

39. Несмеянова М.А., Мараева О.В., Северин А.И. и Кулаев И.С. (19756). Локализация полифосфатазы в клетках Escherichia coli с репрессированным и дерепрессированным биосинтезом этого фермента. Докл.Акад.Наук СССР, 223, 1266-1268.

40. Островский Д.Н., Сепетов Н.Ф., Решетняк В.И., Сибельдииа JI.A. (1980). Изучение локализации полифосфатов в клетках микроорганизмов с помощью 31Р ЯМР с разрешением 78 Мгц. Биохимия, 45, 517-525.

41. Пестов Н. А., Т. В. Кулаковская, И.С. Кулаев (2003). Полифосфаты и экзополифосфатазы митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях гиперкомпенсации по фосфату. Докл. Академии Наук, 389, 830-832.

42. Рош Р. (2000). Транспорт ионов через мембрану посредством полифосфат- поли-(Р)-гидроксибутиратных комплексов. Биохимия, 65, 335-353.

43. Скрябин К.Г., Рубцов П.М., Вертелецкая HJL, Кулаев (1973). Обнаружение высокомолекулярных полифосфатов в ядрах гриба Ertdomyces magnusii. Докл. высш.школы.биол. пауки, 10, 84-89.

44. Трилисенко JI.B., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (1982). Изучение свойств полифосфатфосфогидролазы "leaky" мутанта Neurospora crassa по данному ферменту. Биохимия, 47, 1963-1969.

45. Трилисенко JI.B., Ильинская О.Н., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (1985). Полифосфаты и полифосфатфосфогидролаза у мицелиальных штаммов и slime-вариантов Neurospora crassa. Биохимия, 50, 1120-1126.

46. Умнов А.М.,Стебляк А.Г.,Умнова Н.С., Мансурова С.Э. и Кулаев И.С. (1975). О возможной физиологической роли системы «высокомолекулярные полифосфаты полифосфатфосфогидролаза» у Neurospora crassa. Микробиология, 44, 414-421.

47. Цноменко А.Б. (1978). Исследование взаимосвязи обмена компонентов дрожжевой клеточной оболочки. Канд. Дисс., Пущино.

48. Чернышева Е.К., Крицкий М.С., Кулаев И.С. (1971). Определение степени полимеризации различных фракций неорганических полифосфатов из мицелия Neurospora crassa. Биохимия, 36, 138-142.

49. Шабалин Ю.А., Вагабов В.М., Циоменко А.Б., Землянухина О.А., Кулаев И.С.1977). Изучение полифосфаткиназной активности в вакуолях дрожжей. Биохимия, 42, 1642-1648.

50. Шабалин Ю.А., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (1979). О механизме сопряжения биосинтеза высокомолекулярных полифосфатов и маннана у дрожжей Saccharomyces carlsbergensis. Докл. АН СССР , 249, 243-246.

51. Шабалин Ю.А. (1979).Изучение биосинтеза высокомолекулярных полифосфатов, сопряженного с биосинтезом маннана, у дрожжей Saccharomyces carlsbergensis. Канд.Дисс., Пущино.

52. Шабалин Ю.А., Наумов А.В., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (1984). Обнаружение активности нового фермента долихилдифосфат: полифосфатфосфотрансферазы у дрожжей. Докл. АН СССР, 278,482-485.

53. Шабалин Ю.А., Кулаев И.С. (1989). Солюбилизация и свойства долихилдифосфат: полифосфатфосфотрансферазы дрожжей. Биохимия, 54, 68-75.

54. Akiyama, М., Е. Crooke, and A. Kornberg (1993). An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. J. Biol. Chem., 268, 633-639.

55. Andreeva, N. A., and L. A. Okorokov . (1993). Purification and characterization of highly active and stable polyphosphatase from Saccharomyces cerevisiae cell envelope. Yeast, 9, 127-139.

56. Andreeva, N. А., Т. V. Kulakovskaya, A. V. Karpov, I. A. Sidorov, and I. S. Kulaev .1998a). Purification and properties of polyphosphatase from Saccharomyces cerevisiae cytosol. Feast, 14, 383-390.

57. Andreeva, N. А., Т. V. Kulakovskaya, and I. S. Kulaev (1998b). Purification and properties of exopolyphosphatase isolated from Saccharomyces cerevisiae vacuoles. FEBS Lett., 429, 194-196.

58. Ault-Rich6, D., and A. Kornberg. (1999). Definitive enzymatic assays in polyphosphate analysis. In H. C. Schroder and W. E. G. Miiller, eds. Inorganic Polyphosphates. Biochemistry, Biology, Biotechnology, Springer, ProgMol. Cell. Biol., 23,241-253.

59. Beauvoit, В., M. Rigonlet, В. Guerin, and P. Canioni. (1989). Polyphosphates as a source of high energy phosphates in yeast mitochondria: a P-NMR study. FEBS Lett., 252, 17-22

60. Biely P., Kratky Z., Kovarik J., Bauer S. (1971). Effect of 2-deoxyglucose on cell wall formation in Saccharomyces cerevisiae and its relation to cell growth inhibition. J.Bacteriol., 107, 121-129.

61. Biely P., Kovarik Z., Bauer S. (1973). Lisis of Saccharomyces cerevisiae with 2-deoxy-2-fluoro-d-glucose, an inhibition of the cell wall glucan synthesis. J. Bacteriol., 115, 1108-1120.

62. Booth, J.W., and G. Guidotti (1995). An alleged yeast polyphosphate kinase is actually diadenosine-5',5"'-P1,P4-tetraphosphate a,P-phosphorylase. J. Biol. Chem270, 1937719382.

63. Bostian, K. A., J. M. Lemize, and H. OJHalvorson. (1983). Physiological control of repressible acid phosphatase gene transcripts in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol, 3, 839-853.

64. Bowman E.J., Siebers A.,and Altendorf K* (1988). Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells and plant cells. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 85, 7972-7976/

65. Bun-ya, M., Nishimura,M., Narashima, S., and Oshima, Y. (1991). The PH084 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes an inorganic phosphate transporter. Mol. Cell. Biol., 11, 3229-3238.

66. Burt, С. Т., Т. Glonek, and M. Barany (1977). Analysis of living tissues by phosphorus-31 magnetic resonance. Science, 195, 145-149.

67. Cassone A., Carpinelli G., Angiolella L., MaddalunoG., Podo F. (1983). 31P nuclear magnetic resonance study of growth and dimorphic transition in Candida albicans. J Gen.Microbiol., 129, 1569-1575.

68. Castro, С. D„ A. P. Koretsky, and M. M. Domach (1999). NMR-Observed phosphate trafficking and polyphosphate dynamics in wild-type and vphl-1 mutant Saccharomyces cerevisae in response to stresses. Biotechnol. Prog,. 15, 65-73.

69. Clark, J.E., H. Beegen, and H. G. Wood (1986). Isolation of intact chains of polyphosphate from Propionibacterium shermanii grown on glucose or lactate. J. Bacteriol., 168, 1212-1219.

70. Clark, J. E., and H. G. Wood (1987). Preparation of standarts and detrmination of sizes of long-chain polyphosphates by gel electrophoresis. Anal. Biochem., 161, 280-290.

71. Cramer, C. L., L. E. Vaught, and R. H. Davis (1980). Basic amino acids and inorganic polyphosphates in Neurospora crassa vacuoles: independent regulation of vacuolar pools. J. Bacteriol,. 142, 945-952.

72. Dassa, E., and P. L. Boquet (1981). Is the acid phosphatase of Escherichia coli with pH optimum 2,5 a polyphoposhate depolymerase? FEBSLett., 135, 148-150.

73. Den Hollander, J.,A., K. Ugurbil, T. R. Brown, and R. G. Shulman (1981). Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance studies on the effect of oxygen upon glycolysis in yeast. Biochemistry, 20, 5871-5880.

74. Dirheimer, G. (1964). Recherches sur les phosphates condenses chez les microorganismes. Etude de leur nature et de quelques enzymes intervenants dans leur utilisation metabolique. These Doct. Sci. Phys., Strasbourg.

75. Dubois M., Gilles R.A., Hamilton J,K., Rebers P.A., Smith F. (1956). Colorimetric method for determination of sugars and related substrates. AnaLChem., 28, .350-356.

76. Dunn, Т., К. Gable, and T. Beeler (1994). Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J. Biol. Chem., 269, 7273-7278.

77. Durr M., K. Urech, T. Boiler, A. Wiemken, J. Schwencke, and M. Nagy (1979) Sequestration of arginine by polyphosphate in vacuoles of yeast Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiol., 121, 169-175.

78. Ebel, J. P. (1952a). Recherches sur les polyphosphates contenus dans diverses cellules vivantes. II. Etude chromatographique et potentiometrique des polyphosphates de levure. Bull. Soc. Chim. Biol., 34, 330-335.84.