Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метод 1 Н ЯМР спектроскопии в исследовании экзометаболитов развивающихся микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юркевич, Дмитрий Иосифович

Введение

Глава I. Обзор литературы

1. Применения ЯМР-спектроскопии для исследования клеточного метаболизма

1.1. Энергетический метаболизм

1.2. Гликолиз и метаболизм углеводов

1.3. Цикл трикарбоновых кислот

1.4. Внутриклеточный редокс-потенциал

1.5. Метаболизм аминокислот

1.6. Метаболизм жирных кислот и липидов

1.7. Вода:

1.8. Одновалентные ионы

1.9. Двухвалентные катионы

1.10. Ферментативные кинетики

1.11. Измерение внутриклеточного рН

2. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса. Протонный магнитный резонанс ^Н-ЯМР)

3. Особенности адаптации и культивирования микроорганизмов в D2O

3.1. Микроводоросли

3.2. Бактерии

3.3. Дрожжи

3.4. Грибы

4. Общие положения о клеточных культурах и их культивировании

4.1. Пролиферация

4.2. Условия, необходимые для культивирования

4.3. Кривая роста и ее связь с метаболизмом

5. Медузомицет (чайный гриб)

5.1. Физические свойства и условия культивирования

5.2. Состав чайного гриба

5.3. Метаболизм чайного гриба

5.4. Антибактериальные свойства чайного гриба

Глава II. Экспериментальная часть

1. Объекты и методы исследований '

1.1. Культивирование культур клеток фибробластов

1.2. Культивирование медузомицета

2. Техника ЯМР эксперимента

Глава III. Результаты и их обсуждение

1. Поиск корреляции между кривыми накопления метаболитов и кривой роста клеток

1.1. Культивирование клеток на стеклянной поверхности

1.2. Культивирование клеток на поверхности пластмассы

1.3. Культивирование клеток в коллагеновом геле

2. Исследование методом 'Н-ЯМР спектроскопии процессов роста и утилизации глюкозы медузомицетом

2.1. Культивирование медузомицета в средах на Н2О

2.2. Культивирование медузомицета в средах на D2O

3. Идентификация частично дейтерированных экзометаболитов при культивировании медузомицета в тяжелой воде

3.1. Отнесение спектральных линий изотопомеров ацетата и этанола

3.2. Определение степени дейтеризации экзаметаболитов

4. Анализ путей включения изотопов 2Н и 13С в экзометаболиты в ходе утилизации глюкозы медузомицетом

4.1. Состав метальной группы

4.2. Состав метиленовой группы

5. Идентификация минорных компонент экзаметаболитов медузомицета. Особенности 1Н-ЯМР спектров при некоторых замещениях 13С и деитерия

6. Влияние тяжелой воды на метаболизм симбиотического организма

6.1. Общая характеристика симбиотических отношений в медузомицете

6.2. Влияние включения дейтерия на ход обмена веществ

6.3. Особенности метаболизма симбиоза при адаптации

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метод 1 Н ЯМР спектроскопии в исследовании экзометаболитов развивающихся микроорганизмов"

Актуальность работы. Стремительное развитие биофизики за последние полвека значительно расширило наши знания о физических и физико-химических процессах, протекающих в живых организмах, а также ультраструктуре биологических систем на всех уровнях организации живой материи - от субмолекулярного и молекулярного до клетки и целого организма. Развитие биофизики тесно связано с интенсивным взаимопроникновением идей, теоретических подходов и методов современной биологии, физики, химии и математики. Важное значение имеет разработка и усовершенствование физических методов исследования биологических систем, без которых невозможно современное биологическое исследование. Одним из таких методов является открытый полвека назад метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), постоянное совершенствование которого вскоре позволило применять его для решения многочисленных проблем биологии.

Уже с 70-х годов 20-го столетия ЯМР на ядрах углерода-13 и фосфора-31 позволяет исследовать метаболизм углеводов и фосфорилированных соединений, получать информацию относительно концентрации метаболитов и рН в образцах биологического происхождения. Неинвазивный характер метода дает возможность соотносить полученные данные с физиологической и морфологической информацией об объекте, не разрушая его. К настоящему времени число параметров метаболизма, которые могут успешно изучаться ЯМР, значительно увеличилось. Различные вариации метода позволяют исследовать внутриклеточный окислительно-восстановительный потенциал, метаболизм аминокислот, липидов и жирных кислот, ферментативные кинетики, следить за мембранными градиентами ионов.

ЯМР на атомах углерода позволяет получать значительно более полную и динамичную информацию в случае использования искусственно селективно обогащенного изотопом 13С субстрата. Наблюдение за включением метки в продукты метаболизма позволяет изучать их прохождение через метаболические пути, вычислить потоки через ферменты, участвующие в гликолизе. Следя за соединениями, относящимися к циклу трикарбоновых кислот и степенью мечения в различных позициях, можно определить активность цикла, степень распределения меток, и точку входа в цикл. При культивировании организмов в тяжелой воде, изотопной меткой может служить дейтерий. Наблюдая за замещением протонов на дейтроны в необмеиваемых позициях молекул метаболитов, можно получить дополнительную информацию о ходе обмена веществ. Кроме того, исследование адаптации микроорганизмов к тяжелой воде и ее влияние на процессы роста представляют самостоятельную важную и интересную биологическую проблему.

Однако ядерный магнитный резонанс на ядрах 13С, 31Р и 2Н обладает рядом недостатков. В их числе низкая чувствительность 31Р-ЯМР, длительные времена накопления 13С-ЯМР'(не только из-за низкой чувствительности, но и из-за релаксационных характеристик) и неудовлетворительное разрешение 2Н спектров. Для 13С и 2Н-ЯМР необходимо использовать дорогие изотопно обогащенные материалы. Мы предположили, что часть этих недостатков можно преодолеть, используя для исследования метаболизма протонный резонанс. С точки зрения регистрации спектров, 'Н-ЯМР-спектроскопия является наиболее удобным методом. Присутствие водорода во всех органических соединениях и высокая магнитная восприимчивость протонов делает метод универсальным для исследования всех аспектов клеточного метаболизма.

Отработка предложенных нами методик проходила на чистых линиях культур клеток - фибробластов. Они были выбраны из-за своей доступности, хорошей воспроизводимости и достаточной стандартности ростовых характеристик. На поверхности двумерного субстрата в процессе роста они образуют монослой, легко открепляются, что позволяет подсчитывать их количество. Однако для дальнейшего их совершенствования понадобился менее требовательный к условиям культивирования объект исследований. На наш взгляд, таким объектом, позволяющим проводить более оперативные эксперименты в рамках ЯМР-лаборатории, является симбиотический организм - медузомицет. Этот малоизученный, но интересный объект исследования, предоставляет уникальную возможность изучать не только особенности метаболизма в симбиозе, но и влияние внешних условий на связи и целостность симбиотической ассоциации. Таким образом, исследование медузомицета позволило не только полностью раскрыть потенциал разработанных нами методик 1Н-ЯМР-спектроскопии, но также представляет практический интерес с точки зрения изучения благоприятных для человеческого организма и стимулирующих здоровье свойств этого организма.

Цель данной работы состояла в разработке новых методик исследования клеточного метаболизма методом 'Н-ЯМР-спектроскопии высокого разрешения и установлении зависимости параметров, определяемых из протонных спектров с параметрами цикла роста клеток.

Для выполнения данной цели решались следующие задачи:

1) Изучение методом 1Н-ЯМР утилизации глюкозы и производства экзометаболитов в чистых культурах клеток фибробластов. Установление связи между кинетикой накопления экзометаболитов и численностью клеток.

2) Изучение методом 1 Н-ЯМР утилизации глюкозы и производства экзометаболитов в медузомицете в Н2О и D20.

3) Анализ путей образования дейтероизотопомеров этанола и ацетата в медузомицете по протонным спектрам.

4) Изучение по протонным спектрам перераспределения в экзометаболитах метки углерода-13 в случае использования изотопно-меченой глюкозы.

5) Изучение адаптации медузомицета к D20 и низким температурам.

Научная новизна исследований состоит в том, что протонный резонанс, известный, в основном, как метод структурного исследования молекул, был впервые применен для количественного определения концентрации как обычных, так и обогащенных изотопами углерода-13 и дейтерия экзометаболитов.

Практическая значимость работы заключается в том, что данные о физиологических и биохимических особенностях роста медузомицета могут быть использованы в биотехнологии для получения биологически активных веществ и использования организма в медицине, а так же для получения дейтерированных соединений.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Юркевич, Дмитрий Иосифович

Выводы:

1) Разработана методика применения 'Н-ЯМР спектроскопии для исследования клеточного метаболизма, позволяющая неинвазивно в режиме реального времени отслеживать концентрации всех промежуточных продуктов обмена веществ в культуральной среде. Кривые накопления экзаметаболитов в ходе гликолиза, полученные с помощью этой методики в культуре клеток фибробластов, представляют собой, с точностью до постоянного коэффициента, кинетики роста численности клеток. Получены данные о взаимодействиях клеток между собой и с матриксом.

2) С помощью разработанной методики 1 Н-ЯМР спектроскопии установлено, что в процессе роста медузомицета идет утилизация источника углерода - глюкозы с образованием этанола и последующим его превращением в уксусную кислоту. В растущей культуре медузомицета идентифицированы вещества, присутствующие в малом количестве, такие как глюконовая и янтарная кислоты, глицерин, измерены их концентрации. Полученные данные указывают на то, что медузомицет представляет собой симбиоз дрожжей и как минимум двух видов уксуснокислых бактерий.

3) В случае культивирования медузомицета на средах, приготовленных вместо обычной воды на 98% D2O, происходит его быстрая адаптация в течение нескольких часов, что несвойственно другим до сих пор исследованным организмам в D2O. Методом 1Н-ЯМР спектроскопии показано, что в D2O происходит частичное дейтерирование промежуточных продуктов метаболизма медузомицета. Установлено, что сложившееся процентное соотношение изотопомеров метильной группы этанола и ацетата определяется на этапах интерконверсии глюкозы в фруктозо-6-фосфат и превращения фосфоенолпирувата в пируват. Максимальное включение дейтерия в метальную группу этанола не превышает 2-х атомов, протоны метиленовой группы способны полностью замещаться дейтронами.

4) Разработана методика наблюдения по спектрам ' Н-ЯМР за естественным

2 13 биохимическим обогащением экзаметаболитов изотопами Ни С, поступающими из питательной среды. Установлено, что при культивировании медузомицета в D2O происходит селекция субстрата на этапе образования триозофосфатов, заключающаяся в преимущественной утилизации протонированных изотопомеров из первого фрагмента глюкозы С1-С2-С3. Таким образом, замедление метаболизма медузомицета в

187

2.5-г-З раза при увеличении доли тяжелой воды в среде связано со стерическими свойствами фрагментов молекулы глюкозы на пути преобразования ее в этанол.

5) Предложенными методиками использования 'Н-ЯМР для исследования клеточного метаболизма показано, что около 10% симбионтов в медузомицете находятся в особом состоянии «динамического экстрацеллюлярного эндосимбиоза». Они образуют организм с обменом веществ, элементы которого локализованы у разных партнеров, а передача промежуточных продуктов метаболизма осуществляется через плотный межклеточный контакт, минуя внешнюю среду. Относительное число членов такой ассоциации может меняться в зависимости от внешних условий. Благодаря этому факту и способности накапливать внутренний резерв источника углерода, медузомицет обладает способностью к быстрой адаптации.

Заключение:

Проведенные нами эксперименты продемонстрировали, что 'Н-ЯМР спектроскопия позволяет неинвазивно в режиме реального времени отслеживать концентрации всех промежуточных продуктов обмена веществ в среде для культивирования. Данные, полученные этим методом, могут быть использованы для изучения процессов роста различных микроорганизмов.

В экспериментах по культивированию клеток фибробластов линий HSR-1, HSR-8, HET-SR методом 'Н-ЯМР спектроскопии было показано, что происходит утилизация глюкозы и накопление молочной кислоты. Кривые изменения концентраций этих экзометаболитов коррелируют с кривой роста клеток. Нами было доказано, что на этапах лаг-фазы и логарифмической фазы потребление глюкозы и накопление молочной кислоты с точностью до постоянного коэффициента пропорционально увеличению количества клеток. Значение этого коэффициента зависит от того, какого типа энергетический метаболизм преобладает в культуре микроорганизмов. Таким образом, кривые накопления лактата, полученные из спектров, представляют собой маркеры кинетики роста культур клеток. Нами были получены кинетики роста, измерены скорости роста и периоды удвоения численности клеток в культуре при росте на различных субстратах. Показано, что рост клеток на пластиковой поверхности происходит медленнее, чем на стеклянной.

Методом 1 Н-ЯМР было показано, что в культурах клеток фибробластов HSR-1, HSR-8, HET-SR имеет место специфический процесс под званием «топоингибирование». Достижение плотного монослоя приводит к прекращению клеточных делений, что сопровождается уменьшением потребления питательных веществ и выработки лактата. Подобное поведение культуры фибробластов соответствует участку «плато» на кривой роста клеток и характеризует их как «вышедшие из клеточного цикла ». Образование «искусственной раны» в плотном монослое приводит к стимуляции пролиферации клеток и этот процесс наблюдался по ЯМР спектрам как рост концентрации молочной кислоты. Полученные данные доказывают, что характерные фазы на кривой роста клеток соответствуют таким же участкам на кривых выхода экзометаболитов. Таким образом, по характеру изменения относительных интегральных интенсивностей экзометаболитов в спектрах 1 Н-ЯМР можно выяснить на каком этапе цикла роста находится популяция клеток (а в некоторых случаях - и на каком этапе клеточного цикла).

Эксперименты показали возможность исследования 3-х мерных клеточных структур по продуктам метаболизма так же, как и в случае 2-х мерных структур. Морфологическая картина роста культуры клеток в 3-х мерном коллагеновом геле коренным образом отличается от роста в монослое и наиболее близка к картине роста ткани. Скорость роста клеток замедляется и они проявляют явную тенденцию к дифференцировке. Так же как и в монослое, в 3-х мерном коллагеновом геле синтезируется молочная кислота и расходуется глюкоза. Но обмен веществ, в конечном итоге, связан с разными процессами. Химическая энергия в этом случае тратится, в основном, на реорганизацию коллагенового геля. Следовательно, исследуя методом 'Н-ЯМР динамику накопления лактата, мы можем получать информацию, отражающую процессы взаимодействия клеток с матриксом.

Дальнейшее развитие методов 'Н-ЯМР спектроскопии для исследования клеточного метаболизма осуществлялось на довольно неприхотливом с точки зрения культивирования микрообъекте - медузомицете. Первоначально выбранный нами лишь для отработки методических приемов, этот малоизученный микроорганизм оказался чрезвычайно интересным объектом исследования. 'Н-ЯМР использовался для изучения углеводного метаболизм в процессе роста медузомицета на средах, приготовленных на глюкозе. Показано, что в процессе роста медузомицета идет утилизация глюкозы с образованием этанола и последующее его превращение в уксусную кислоту. В культуральной среде идентифицированы вещества с малой концентрацией, такие как глюконовая и янтарная кислоты, глицерин. По спектрам 1 Н-ЯМР определены их молярные концентрации. Исследовано влияние на скорость производства этих метаболитов различных концентраций глюкозы и этанола. Было показано, что оптимальная концентрация глюкозы в среде для культивирования составляет 5-10%. Медузомицет обладает способностью расти в средах с низким рН (до рН 3±0.2) и высоким содержанием этилового спирта (до 50%).

В случае культивирования медузомицета на средах, приготовленных вместо обычной воды на 98% D20, увеличивается лаг-фаза производства этанола (25-^-30 час.) по сравнению с Н20 и снижается скорость роста. В течение экспоненциальной фазы роста содержание этанола и ацетата в кондиционированной среде в 2.5-3 раза меньше, чем при росте на Н20. Эти данные позволяют предположить, что именно в течение лаг-фазы и логарифмической фазы роста происходит адаптация медузомицета к D20. Таким образом, динамика переработки глюкозы в этиловый спирт на этой стадии может служить маркером процесса адаптации. Результаты, полученные методом 'Н-ЯМР спектроскопии, показывают торможение процессов метаболизма в культуре медузомицета, наблюдаемое для любого организма в D20. Однако в медузомицете обнаружена способность к быстрой адаптации (в течение суток) к новой среде, несвойственная другим до сих пор исследованным организмам в D20.

Из данных, полученных методом протонного и дейтериевого резонанса высокого разрешения, следует, что в период адаптации медузомицета к D2O происходит частичное дейтерирование промежуточных продуктов его метаболизма. Показано, что по степени замещения протона на дейтерий в метальной группе ацетата, существует три изотопомера: -СН3; -CH2D; -CHD2. Этанол представлен шестью изотопомерами: -CHD-СН3; -CD2-CH3; -CD2-CH2D; -CD2-CHD2; -CHD-CH2D; CHD-CHD2. Измерены относительные концентрации этих изотопомеров и степень дейтеризации метальной и метиленовой групп. Показано, что включение дейтерия в необмениеваемые позиции метальной группы этанола и ацетата может произойти только на этапах интерконверсии глюкозы в фруктозо-6-фосфат и превращения фосфоенолпирувата в пируват. Причем по отдельности ни один из этих шагов не может отвечать за сложившееся распределение дейтерия. Максимальное включение дейтерия в метальную группу составляет не более 2-х атомов для первого фрагмента глюкозы (С1-С2-С3) и не более 1-го для второго (С4-С5-Сб)-Метиленовая группа этанола более доступна для дейтронов, поскольку атомы углерода С2 и С5 полностью меняют свое протонное окружение. Сделан вывод, что наибольший обмен протонов достигается в положениях С2 и С5, несколько меньший в положении Ci и менее всего в положении Сб.

Нами была разработана методика наблюдения по спектрам ]Н-ЯМР за естественным селективным биохимическим обогащением экзаметаболитов медузомицета стабильными изотопами 2Н и 13С, поступающими из питательной среды. Для этих целей

I Q использовалась как обычная глюкоза, так и обогащенная (99%) углеродом-13 [1- С]-, [2-13С]-, [6-13С]-глюкоза и (99%) D2O. Наличие изотопов в определенных положениях молекул приводит к заметным изменениям и усложнениям протонных спектров экзометаболитов, но обеспечивает бесценной дополнительной информацией о путях биохимических реакций. Наблюдение за распределением метки в этих молекулах показало, что утилизация глюкозы идет по основному (ЭМП) пути гликолиза. Однако, около 10% С1-С3 триозы, происходящей из первого фрагмента глюкозы, выходит из цикла гликолиза и используется в других процессах развития организма.

С помощью этой методики нам удалось показать, что в случае использования D2O происходит селекция протонированного субстрата на этапе образования триозофосфатов. Преимущественно утилизируется протонированные изотопомеры из первого фрагмента глюкозы С1-С2-С3. Тормозящее действие тяжелой воды на рост медузомицета связано со стерическими свойствами фрагментов молекулы глюкозы на пути преобразования ее в этанол. По-видимому, этим и объясняется замедление метаболизма организма при увеличении доли тяжелой воды в среде. Использование полностью дейтерированной

99%) [2Н]-глюкозы доказало полную симметрию в отношении тяжелой глюкозы и легкой воды, с одной стороны, и легкой глюкозы и тяжелой воды, с другой - в биохимических процессах трансформации глюкозы. Показано, что место атаки дейтронов, приводящей к заметному сбою в метаболизме, связано с преобразованием промежуточных продуктов утилизации глюкозы в глицерин.

Анализ образующихся в ходе культивирования медузомицета экзаметаболитов и кинетики их накопления подтверждает тот факт, что медузомицет представляет собой симбиоз дрожжей и как минимум двух видов уксуснокислых бактерий Acetobacter xylinum и Gluconobacter oxydans. Большинство этих организмов, участвующих в симбиозе медузомицета, связаны между собой коммуникационно-трофическими отношениями 1 посредством среды для культивирования. Однако, на основании включения изотопа С в ацетат, накапливаемый в культуре медузомицета, показано, что около 10% членов ассоциации в медузомицете находятся в особом состоянии динамического экстрацеллюлярного эндосимбиоза. Эти организмы отличает возможность передачи промежуточных продуктов метаболизма через плотный межклеточный контакт, минуя внешнюю среду. В результате образуется организм с обменом веществ, элементы которого локализованы у разных партнеров. Относительное число членов такой ассоциации может меняться в зависимости от внешних условий. Благодаря этому факту и способности накапливать внутренний резерв источника углерода, медузомицет обладает способностью к быстрой адаптации.

Представленные результаты показывают несомненное преимущество комбинации методов протонного магнитного резонанса и метода естественного биохимического изотопного обогащения для идентификации неизвестных органических экзометаболитов, уточнения путей биохимических реакций и наличия возможных изомеров некоторых метаболитов. Методики были отработаны на чистых культурах клеток фибробластов и далее усовершенствованы при исследовании сложного симбиотического организма -медузомицета. Таким образом, они доказали свою эффективность и универсальность для неинвазивного исследования энергетического метаболизма и процессов, происходящих в цикле роста и в клеточном цикле любых организмов. Данные о физиологических и биохимических особенностях роста медузомицета могут быть использованы для получения заранее прогнозируемого выхода биологически активных веществ. Это позволило бы использовать объект в биотехнологии. Представляет интерес способность медузомицета продуцировать ряд биологически активных веществ, придающих его настою лечебный эффект. Имеется необходимость в нем и в медицине, например, для лечения ожогов. Быстрая адаптация к тяжелой воде позволяет использовать медузомицет

185 в дальнейшем как для получения дейтерированных соединений, образуемых в процессе его роста, так и для изучения биологически важного феномена адаптации. Таким образом, разработанные нами методики 'Н-ЯМР спектроскопии интересны и в плане решения прикладных задач, и для изучения фундаментальных проблем биологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юркевич, Дмитрий Иосифович, Пущино

1. Abadie М., Association de Candida mycoderma Rees Lodder et d'Acetobacter xylinum Brown dans la fermentation acetique des infusion de the. IIAnnates des Sciences Naturelles, Botanique et Biologie Vegetale, 1962, v. 12, pp. 765-800.

2. Adams M.R., Hall C. J., Growth inhibition of food-borne pathogen by lactic and acetic acids and their mixtures. Hint. J. FoodSci. Technol., 1988, v. 23, pp. 278-292.

3. Allis J.L., Snaith C.D., Seymour A.M.L., Radda G.K., 87Rb NMR studies of the perfused rat heart. IIFEBS Lett., 1989, v. 242, pp. 215-217.

4. Atkinson O.E. Cellular Energy Metabolism and It's Regulation, Academic Press, New York, 1977.

5. Bazarewski S., Uber den sogenannten Wunderpilz in den baltichen Provinzen. IIKorrespondenzbalt des Naturforscher-Vereins Riga, 1915, v. 57, pp. 61-69.

6. Bechtel D.B., Mueller D.D., Whaley T.W., and Bulla L.A., In vivo mobility of fatty acid end groups of Bacillus thuringiensis plasma membrane lipids during growth and sporulation. HJ. Biol. Chem., 1985, v. 260, 9784-9792.

7. Bell E., Tissue-equivalent and method for preparation thereof. USA patent 4,485,096. 1982.

8. Bell E., Sher S., Hull В.,Merrill C. and other, The reconstitution of living skin IIThe J. of Investigative Dermatology, 1983, v. 81, 25-105.

9. Bell J.D., Sadler P.J., Macleod A.F., Turner P.R., La Ville A., .H NMR studies of human blood plasma. Assignment of resonances for lipoproteins. IIFEBS Lett., 1987, v. 219, pp. 239-243.

10. Ben Li Shang, Martin Y.L., Martin M.L., Site-specific isotope fractionation in the characterization of biochemical mechanisms IIThe J. of Biological Chemistry, 1995, vol. 270, N27, pp. 16023-16029.

11. Benk E., The tea fungus fermented drink. HVerbaucherdedienst, 1988, v. 33, pp. 213-214.

12. Bing M., Der symbiont Bacterium xylinum-Schizosaccharomyces pombe als Therapeuticum. HMed. Welt, 1928, v. 2, pp. 1576-1577.

13. Blanc P. J., Characterization of the tea fungus metabolites. 11 Biotechnology Letters, 1996, v. 18, no. 2, pp. 139-142.

14. Bloch F., Hansen W.W., Packard M., I/Phys. Rev., 1946, 69, 127.

15. Brainard J.R., Hutson J.Y., Hoekenga D.E., Lenhoff, R., Ordered synthesis and mobilization of glycogen in the perfused heart. 11 Biochemistry, 1989, v. 28, pp. 9766-9772.31

16. Brindle K.M., P NMR magnetization-transfer measurements of flux between inorganic17