Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности индуцированного этилметансульфонатом мутагенеза в линиях Drosophila melanogaster с генетической нестабильностью и нарушениями репарации

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Закономерности индуцированного этилметансульфонатом мутагенеза в линиях Drosophila melanogaster с генетической нестабильностью и нарушениями репарации"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

РОМАНОВА НАТАЛИЯ ИВАНОВНА

УДК 575.224.4:595.773.4

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИНДУЦИРОВАННОГО ЭТ1ШЕТАНСУЛМОНАТОМ МУТАГЕНЕЗА В ЛИНИЯХ ШЮБОРНИД МЕЬАЮСАБТЕК С ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТЬЮ И НАРУШЕНИЯМИ РЕПАРАЦИИ.

( 03.00.15 - генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1994

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.М.АСЛАНЯН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведущая организация: ^ Санкт-Петербургский Государственный Университет

"часов на заседании специализированно^совета Д.002.85.01 при Институте биологии развитая РАН им. Н.К.Кольцова по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, д.26.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития РАН им. Н.К.Кольцова.

Автореферат разослан " "

В.Г.Митрофанов

кандидат биологических наук

Н.И.Ивапенко

Зашита диссертации состоится сх-

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат, биологических наук

Е.М.Протопопова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. одной из наиболее актуальных проблем современной генетики является изучение закономерностей и механизмов мутагенеза. К настоящему времена детально изучена феноменология возникновения мутаций у разных объектов, наиболее изученным из которых является дрозофила. При изучении механизмов возникновения мутация у дрозофилы как модельного эухариотического организма было установлено, что процесс становления мутаций обеспечивается работой ферлентов и генетически контролируется {Ауэрбах, 1978). известно, что мутационный процесс у дрозофилы является многоступенчатым и насчитывает ке менее двух этапов лабильного повреждения хромосом. При последствии мутагенных факторов в хромосомах возникают как стгбиг^ги& ¡.г/тации, так и осратикыз изменения в гиле потепциальких изменения. Судьба потзнциальннх изменений г.'.зиет сииь дво;.::сл - л;бо восстановление до исходного состояния, „■ибо реажзация в мутглдак■ Причем процесс реализации в мутации зависит от веъ^нкл условий (Шварцман и др., 1972; Тихомирова, 1983; Alexander, Магу. 1972). Физико-химячесяая природа потенциальных повреждений до сих пор но изучена, хотя известно, что доля их сроют возникающих говревдешй при лучевом воздействии и при индукции химическими агентам макет быть очень велика. Так у дрозофилы па спределеншшх стадиях оогенеза "оличество возникающих потенциальных повреждения может в 3-4 рэзз превосходить количество необратимых изменений (Тихомирова, 196?; Лсланян, Смирнова, 1977, 1981).

Установлено, что любые изменения метаболизма генетического

материала в первую очередь ДНК. ферментов репликациоиного комплекса, синтеза предшественников днк ведут к модификации частот мутация (Каменева. 1976). А нарушения структуры и условий функционирования ферментов могут Сыть обусловлены мутациями определенных генов, обладании! мутаторшм или адтимутаторным действием. Кутадаи подобных генов могут затрагивать функционирование различных ферментативных процессов, г том числе репарации, репликации и рекомбинации генетического материала. Многие из мутантов с нарушенной системой репарации, такие как mei-9, mei-4i, обладают мутаторным действием по отношению к разным типам мутаций. После открытия з геноме дрозофилы мобильных генетических элементов (МГЭ) установлено, что в возникновения Оольаого класса нутаций у дрозофилы важную роль играют эти акненты генома (Ilyin et al.. 1978). При этом их перемещения контролируются генетически. Перемещения МГЭ могут иметь различный характер, а именно, это могут быть перемещения одного элемента в системе определенных скрещиваний (Lira et al.. 1983; Ким и др.. 1989) или массовые одномоментные транспозиции нескольких различных элементов (Герасимова. 1983). Используемая в нашей работе система нестабильной мутаторной линии Ш1 характеризуется комплексом уникальных свойств, в том числе повышенным уровнем спонтанного мутирования, связанных 4 со спонтанным перемещением мобильных элементов МДГ4 и hobo.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению закономерностей возникновения спонтанных и индуцированных морфологических мутаций у дрозофилы в линии, дефектной го репарации (mei-91,1) и генетически нестабильной линии МЛ. Балл решены следующие конкретные задачи:

1. определены частоты индуцированных этилметансульфонатом б зрелых спермиях самцов линии те1-91,1 видимых мутаций во второй и третьей хромосомах с использование).! множественно маркированных тестерных линий;.

2. Определена частоты индуцированных этилметансульфонатом видимых мутацей в зрелых спермиях самцов линии МЛ в X хромосоме а такие во второй и третьей хромосомах;

3. Проведен сравнительный анализ закономерностей \ возникновения видимых мутаций в линии, дефектной по репарации шег-э11 и генетически нестабильной линии МЛ.

Научная новизна исследования. Проведенный сравнительный анализ генетических эффектов, индуцированных алкилируштм агентом ЭМС, показал, что мутагенная обработка приводит к существенному повышении уровня мутирования деух генотипически различных линий дрозофилы как по сравнении со спонтанным уровнем, так и то сравнению с контрольными лабораторными линиями. Выявлена и проанализирована больпая группа индуцированных и спонтанных мутаций, в тем числе нестабильных. Экспериментально показан сходный характер проявления спонтанной и индуцировано!? нестабильности в линии МЛ, что мокет свидетельствовать о существовании общих механизмов, а именно, транспозиция мобильных генетических элементов.

Практическая ценность работы. На базе дестабилизированной систем МЛ с ¿^рушениями генетического гомеостаза мокет быть разраоотана тест-систеиэ для определения мутагзнней активности лекарственных препаратов, примесей в продуктах питания, факторов загрязнения окружакщей среды и т. п. Поскольку линии Ш1 чувствительна к низким пороговым дозам мутагенов окружающей

среда и характеризуется увеличенными частотами индуцироЕашшх соматические и генеративных мутаций, она может . служить тест-системой с большой разрешающей способностью для анализа генетических эффектов слабых воздействий (на уровне соматических и генеративных мутаций, хромосомных аберраций и

др-ь

Апробация работы. Основные результаты работы оыли доложены на 3-ей конференции по теоретическим вопросам мутагенеза ( Вильнюс, 1980г.), на совещании по химическому мутагенезу "Применение химического мутагенезе в селекции на качество" ( Москва, 1985г.), на IV Всесоюзном совещании по проблемам биологии и генетики дрозофилы ( Одесса IS89 г. ), на семинаре кафедры ' генетики Биологического факультета ЛГУ а также на семинарах и заседаниях кафедры генетики и селекции Биологического факультета ¿{ГУ.

Структура и объем работы." Диссертация изложена на 114 стр., включая 15 таблиц и 10 рисунков, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуздения, заключения, выводов. Список литературы насчитывает 190 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Исходным материалом в экспериментах служили следудие линии Drosophila iselanogaster:

1. Д-32

2. w

3. mei-911

МЛ- мутпторнзя лтшя, млргагроязгаюя мутзаиеЯ -обработку чистым отилметзнсульаотатом (ЭМС»проводили в газовоП фазе с использованием эксикаторов. Врегз экспозиции '/часов.

После соответствующей мутагенной обработки самцов скрещивали с самками согласно схеме эксперимента. Через двое суток самцов удаляли из пробирок а самок оставляли для дальнейшей откладки яиц еще на двое суток. Анализ потомства проводился до девятого дня лета мух . Все эксперимента проводили не менее, чем в двух повторпостях.

Анализ видимых мутаций, сцепленных с полом.

Для определения частот возникновения индуцированных ЭМС мутаций в X хромосоме проводили скрещивание самцов. обработанных ЭМС с самками линии сцдеи.у/у. Учет мутаций проведали в течение двух поколений. В контрольных экспериментах использовали линию white.

Анализ видимых мутаций ео 2 хромосоме.

Для определения индуцированной мутабильностя пяти локусов второй хромосомы самцов линий mei-91,1 и ШГ скрепиззли с самками линии со множественно маркированной второй хроаосомой (black, ¿aunty, purple, cinnabar, vestigial). Контролем служит линии Д-32 (для .\ппии mei-91'1) и w (для линии ИЛ). ОсоСзй с измененным фснотгпсм исследовали методом генетического анализа.

Диализ видимых мутаций в-3 хромосоме.

Для опрсделзяия индуцированной мутабалыгостя восьми локусов

3 хромосомы самцов личий mei-s1'1 и МЛ скрещивали с самками линии "ruouca" со множественно маркированной 3 хромосской (roughoid, hairy, thread, scarlet, curled, stripe, ebooy", claret).

Контролем служили линии Д-32 .( для те1-91'1) и » ( для МЛ >. Особей с измененным фенотипом исследовали е ряду последующих поколения.

Статистическую обработку результатов проводили по <р-критерию^ (Плох1шский, 1970). Ошибку X вычисляли для 35$ доверительного уровня.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

I .Индугсированвый мутагенез в линии тг1-9^. применяемая нами методика с использованием в качестве тестерных ?шохественно маркированных линий позволяет регистрировать появление в первом поколении рецессивных мутаций по выбранным цепочкам генов второй (ь, 1, рг, сп, и третьей (ги, Ь. гь, 81, си, зг, е3, са) хромосом, а также доминантных мутаций во всех хромосомах самцов линий Д-32 и тох-91''1.

При изучении спонтанных частот видимых изменений, не имевших наследственного характера (морфозов) установлено, что уровень их появления сохраняется в пределах 0,1-0.22 для самцов обеих анализируемых линий Д-32 и теЗ.-Э11, как при использовании в качестве ' тестерной линии с маркированной второй, так и с третьей хромосомой. Видимых мутаций по выбранным генам второй и третьей хромосом на спонтанном уровне обнаружено не было.

1.1.Анализ морфологических видимых мутаций во второй хромосоме, индуцированных ЭМС, у самцов линии те1-9Ь1.

Частота морфозов , возникших под действием ЭМС в зрелых спермиях самцов линии теа.-911 (табл. I) достоверно (Р<0,001) превышала "частоту морфозов у контрольной линии Д-32.

Таблица I.Частоты мутирования локусов хромоеою 2 в нормальней (Д-32) и дефектной по репарации (те 1-91,1) линиях дрозофилы при воздействии ЭМС.

линия Д-32

число проанализированных хромосом 23250 13569

морфозы число частота(%) 169 0,73±0.И 141 1.04*0.18

общая частота мутаций число частота(%) 33 0,14-0,05 34 0.25±0.08

частота мутаций по цепочке генов число частота(%) 25 0.П±0,06 27 0,21*0.09

ь число частота{%) 5 0,02±0,02 2 о,01±0,0г

5 число частота(%) I 0,004^0,005 4 0.03-0,03

рг число частота 2 0,01±0,01 7 0,05-0,04

СП число частота 0 0 3 0.02-0,02

число частота 17 о.о7±о,оз 13 0.10*0.05

- ъ -

Аналогичное превышение уровня мутирования у самцов линии юе!-?1,1 по сравнению с контролем было отмечено при анализе генеративных морфологических мутаций. Это утверждение справедливо как для частоты мутаций по пяти генам 2 хромосомы, так и для общей частоты мутаций, куда входили еще и доминантные мутации по всем хромосомам.При сравнении частот мутирования по отдельным генам цепочки обнаружено, что частота мутирования трех генов ¿,рг и сп у самцов линии теЛ-Э1,1 выше частоты мутирования этих генов у самцов линии Д-32.

1.2.Анализ морфологических видимых мутаций, индуцированных ЭМС. в третьей хромосоме самцов линии те1-9 •

При анализе частоты ненаследуемых видимых изменений, возникших у сакцов линий гаез.-Э1'1 и Д-32 под воздействием ЭМС, а также частоты генеративных мутаций, как по отдельно взятым генам цепочки, так и суммарной частоте, включающей мутации восьми генов 3. хромосомы и доминантные мутации по всем хромосомам не было выявлено отличия у самцов двух анализируемых линий ( табл.2).

2.Индуцированный мутагенез в линии МЛ.

2Л.Индукция мутаций в X хромосоме.

Выбранная нами схема эксперимента позволяла регистрировать уже в первом поколении возникновение рецессивных морфологических мутаций в X хромосоме и доминантных мутаций во всех хромосомах. В контрольных экспериментах использовали линию п. от которой Бедет свое происховдение мутаторная линия МЛ.

При индукции этилметансульфонатом видимых изменений в линии МЛ обнаружено достоверное (Р<0,001) превышение частоты видимых ненаследуемых изменений в данной линии по сравнению с

таолицз 2 Частоты мутирования отдельных локусое хромосомы 3

б нормальной (Д-32) и дефектной по репарации (тез.-?1,1 >

линиях дрозофилы при воздействии ЭМС.

линия Д-32 шв1-9И

число проанализир. хромосом 10522 14186

морфозы ЧИСЛО частота(Ж) 145 1,38*0.23 121 0.85*0,15

общее к-во мутаций ЧИСЛО частота(Ж) 54 0,51*0,14 53 0,37*0.10

к-во мутаций по цепочке ЧИСЛО частота(Ж) 45 0.43*0.13 43 0,30*0.09

ги ЧИСЛО частота(X) 7 0,07*0,05 2 0,01*0.02

11 ЧИСЛО частота(Ж) I 0.01*0,02 0 0

№ ЧИСЛО частота(X) 0 0 0 0

ЧИСЛО частота(Ж) 5 0,05*0,04 8 0.06*0.04

си ЧИСЛО частота(Ж) 7 0,07*0,05 V 0.07*0.05

зг ЧИСЛО частота(Ж) 0 0 2 0.01*0.02

е5 число частота(Ж) 16 0,15*0,07 13 0.09*0.05

са ЧИСЛО частота(Ж) 9 0.09*0.06 II 0.03*0;0!3

контрольной линией « . как е первом , так и во втором поколениях ;табл.3) .Во втором поколении отмечено снижение доли мозаичных особей по сравнению с первым поколением с 504 до 11.73 в линии w и с 48.62 до 8.6% в линии МЛ.

При анализе генеративных мутаций, полученных под действием ЭМС в зрелых спермиях самцов МЛ и контрольной линии w. учитывали мутации . возникайте в первом и во второй поколении. В первом поколении частота мутаций в X хромосоме линии 11Л достоверно (Р<0.01)превышала таковую в линии w (табл.3) .Частота доминантных аутосонных мутаций, полученных в данном опыте, ниже частоты мутаций по X хромосоме и составляет O.Ii. в то^ время, как в контроле вообще не было зафиксировано ни одной мутации в аутосомах.

Сравнение частот спонтанных мутаций и индуцированных ЭМС в МЛ свидетельствует о достоверном увеличении уровня индуцированного мутирования генов X хромосомы над спонтанным с 0.151 до 0.681. Для аутосомных мутация не обнаружено достоверного превышения спонтанного уровня мутирования (табл.5). Во втором поколении обнаружена та же закономерность, что и в . то есть частота индуцированных мутаций выше (Р<0.05) в линии МЛ . чем в контрольной линии m ( табл.3). Это справедливо как для видимых мутаций, сцепленных с полом, так и для аутосомных мутаций.

По длше X хромосомы мутации, полученные в р1 . распределялись наиболее плотно в дистальном районе, в районе 30-40 морганид и в районе 56-58 морганид (рис. I). Мутации, полученные в контроле, входят составной частью более узкого спектра в спектр мутаций, полученных в ЫЛ под действием ЭМС.

Таблица ¿.Частота индуцированных ЭМС мутация в линиях « и МЛ.

поколение *1

линия те Ш * МЛ

число проанализ, особей 0" 1965 2660 5342 6695

? 2520 4444 5502 7300

2 4485 7104 10844 13995

морфозы число 56 182 169 417

частота (X) 1,25*0.20 2.56*0,37 1,56*0.24 2.98*0,28

мутации по X хромосоме число 4 18 4 13

частота (Ж) 0,20*0,29 0,68*0,31 0.10*0.09 0.19*0,09

аутосом. мутации число 0 7 2 6

частота (8) 0 0,10*0,07 0,03*0,04 0.04*0,03

Таблица 4.

Частоты возникновения спонтанных видимых изменений у самцов линий и и ИЛ при скрещивании с самками линии С(1)вд,у.

поколение линия число видимые изменена

0" проанализ. число частота (Ж)

особей

Щ ' 3926 6 0,15 1 О.Ю

ил 4678 23 0,49 ± 0.22

*2 « •2308 4 0.17 ± 0.2I

ил 2970 19 0.64 ± 0,31

Таблица 5.

Частоты возникновения спонтанных видимых мутаций в потомстве самц линий ч и Ш1 при скрещивании с самками линии С(1)ш,у.

поколение линия число проанал. особей МУТАЦИИ--

Х-хромосома Аутосомы

о- ¥ число частота(Ж) число частота(Ж)

и 11049 101-89 0 0+0,0004 0 0±0.0003

МЛ 13607 15502 20 0,15+0,06 17 0,06±0.03

« 7417 7678 0 0±0,0006 0 0±0.0002

МЛ 14575 14974 6 0,04+0,03 19 0.06±0.03

Рис Л. Спектр мутация, индуцированных ЭМС в X хромосоме самцов линий я и МЛ.

п<1 в я

линия МЛ

ау

йтх оь схч

Г

.в

-

I гас

20

линия и>

30 йп 4£

80

линия МЛ ¿УЧГ зп

ео я в * йих йу ыЧ ptd тас

V в ■ ■ ц ■ в п в ■

2 Ь ': ^ 1 ^ 1 1 ^ ' Л

ео линия V)

« - мутация стекловидные глаза (1-30.0)

Во втором поколении были получены как мутации, аналогичные полученным в первом поколении, так и новые (рис.1).

Часть мутаций, полученных в первом поколении и большинство мутаций, полученных во втором поколении имели пучковый характер возникновения.Это свидетельствует о премейотическом характере мутирования ( например.-мутация зп (1-21,0) - в одной пробирке среди 43 потомков одного самца 2 были мутантами, во второй пробирке из 18 самцов - 17 были мутантами).

Наряду с пучковым характером мутирования отдельных мутаций

наблюдали и одновременное появление разных мутаций в потомстве одного самца. Так например, е первом поколении зарегистрировано одновременное появление мутаций crt (1-40.3) и к (Зхр.), а во втором поколении - мутации m (2-93.2) одновременно с мутацией М(2хр.), а мутации ptd (1-52.7) одновременно с мутацией sn (I-2I.0). Более 50% мутаций, полученных под воздействием ЭМС в МЛ , как и большинство мутаций полученных в этой линии спонтанно характеризуются свойством генетической нестабильности, в то время, как ни одна из мутаций, индуцированных в контрольной линии w , таким свойством не обладала. Проявление генетической нестабильности в наших экспериментах принимало различные формы. Так были выявлены случаи обратного мутирования (мутация vac).последовательного мутирования с изменением первоначального состояния( мутации drw, vac), появление реплицирующейся нестабильности, проявляющейся в выщеплении с высокой частотой мутантных и фенотипически нормальных особей, в потомстве которых наблюдаются сходные расщепления (мутации dy, о). Свойство нестабильности сохраняется в течение нескольких поколений.

2.2.Индукция мутаций в пяти локусах Еторой хромосомы.

В опытах с использованием в качестве тестерной линии b j рг en vg частота видимых ненаследственных изменений также как частота рецессивных видимых мутаций по пяти генам второй хромосомы и доминантных мутаций по всем хромосомам в линии МЛ достоверно (Р<0.001) превышала таковую в контрольной линии w. Такая же закономерность обнаружена и для частоты мутаций отдельно по пяти генам цепочки (табл. 6).

Отмечено, что в контрольной линии w мутировало 3 из 5 генов цепочки , а е линии МЛ - 4 кз 5 геноЕ (табл. 6).Частота

Таблица 6. Частоты мутирования отдельных локусов хромосомы 2 в линиях * л МЛ под действием эмс.

линия иг МЛ

число проанализированных хромосом 3116 6347

морфозы число частота(X) 50 ^ 1.60*0.44 213 3,36*0.4

доля мозаиков(Х) 62,0 44,6

общее к-во мутаций число частота(X) 10 0,32*0,20 57 0,90*0,23

мутации по цепочке число частота(X) 5 0,16*0,14 44 0,69*0,20

ь число частота(X) 2 0,06*0,04 7 0,11*0.08

з число частота(X) I 0.03*0,06 7 0,11*0.08

рг число частота(Ж) 0 0 5 0,08*0.07'

СП число частота(X) 0 0 0 0

▼г число частота(X) 2 0,06*0,09 25 0.39*0,15

мутирования каждого гена цепочки в отдельности в линии МЛ значительно превышала частоту мутирования анализируемых генов е линии w.

2.3.Индукция мутаций в восьми локусах третьей хромосомы

Б данном варианте опыта, как ив случае с маркированной второй хромосомой, общая частота мутаций и частота мутаций только по генам цепочки в линии МЛ достоверно (Р<0,05 и Р<0,01 соответственно) выше, чем в контрольной линии w. Та же тенденция сохранялась к для каждого гена цепочки в отдельности. В обеих исследуемых линиях мутировали пять из восьми генов цепочки (табл. 7). Кроме рецессивных мутаций по пяти генам третьей хромосомы в наших экспериментах отмечено появление доминантных мутаций, аналогичных полученным в опытах со второй хромосомой: n; dpD: m.

Так же как и в предыдущем варианте опыта с линией ь j рг сп vg часть мутаций, полученных под действием ЭМС в МЛ . имела пучковый характер.

Кроме рецессивных мутаций по пяти генам второй и восьми генам третьей хромосомы были получены доминантные видимые мутации по другим хромосомам. Спектр доминантных мутаций для обеих линий является перекрывающимся. Наиболее характерным было появление мутаций Notch (1-3-0), Bag (1-51-6). dumpy®, Bristle (2-54.8), Wrinkle (2-76). Roughened (3-1-4). Dihaete (Э-40.7). Beaded (3-93-8), Minute (xp.2,3).

Таким образом, при индукции этслкетансульфонатом видалых изменений и мутаций у самцов четырех анализируемых лглзгй с использованием е качестве тестерных линий с(1)1Ш,у/У; ь j рг сп

Тоолща ':. Частоты мутирования отдельных локусов хромосомы 3 в линиях w к МЛ под действием ЭМС. .

линия w МЛ

число. проанализир. хромосом 2612 3561

морфозы число частотз(Ж) 44 ^ 1,68-0,49 97 2,72±0,53

общее к-во мутаций число частота(й) 9 0,34±0,22 27 0,76-0,29

мутации по цепочке число частота(£) 7 0,27¿0,20 24 0,67^0,27

ги число частота(%) 2 0,08±0,И 8 0,23^0,16

h число частота {,%) 0 0 0 0

th число частота(%) 0 - 0 0 0

3t число частота (X). I 0,04±0,08 3 0,08^0,09

сц число частота(X) 0 0 0 0

sr число частота(2) I 0,04±0,08 3 0,08±0,09

еБ число частота(%) I- 0,04^0,08 5 0,14±0,13

са | число частота**) 2 0,08^0,11 5 0,14^0,13

и "гисиса" наблюдалось общая тенденция: наименее мутабильноп оказывается линия дикого типа Д-32, а наиболее мутабильной линия МЛ. Вероятно, если принять, что соматические изменения (морфозы) являются истинным отражением частоты

г-*

возникновения соматических мутаций, то последние чаще всего возникают в линиях, имеющих какие-либо генотипические отклонения от нормы. Это могут быть как нарушения е системах репарации, примером чего служит линия тег-э1,1. так и влияние мобильных элементов - линия МЛ.

ОБСУЕДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

К настоящему времени описано достаточно много систем генетической нестабильности, обусловленной перемещениями мобильных элементов В обычных условиях транспозиции мобильных элементов в инбредных линиях происходят крайне редко, с частотой менее, чем Ю-5 (Ананьев. 1984). В настоящее время обнаружены генетические системы, где транспозиционные события наблюдаются значительно чаще (I0~2-I0~4). (Kidwell et al., 1979; Bregliano et al.,1981;Bienont et al.. 1936; Iannopulos. et al., 1987 Кайданов., 1991).

В исследованной рами мутаторной линии дрозофилы автономно перемещаются мобильные элементы МДГ4 и hobo, в то время как МДИ, МДГ2, МДГЗ, copia, 17G, Beagle. BS, Doc И другие имеют инвариантную локализацию (Ким, Беляеза, 1990). В клетках мутаторной линии частоты спонтанного мутирования увеличены до Ю"3-Ю"4, мутации появляются на премсйотических стадиях развития гамет и характеризуются свойством генетической нестабильности. В

_ тс. _

нсйрооластах личинок мутаторной линии и ее мутантов повышена частота структурных перестроек хромосом (Державец и др.. 1988). В нашей работе покпзано. что индуцированная мутабильность мужских половых- клеток в лишш МЛ увеличена по сравнению со спонтанным уровнем и выше чем в контрольной стабильной линии дикого типа Д-32, лабораторной линии те и линии те 1-91,1 с нарушенной репарацией. Возрастание частот морфологических видимых мутаций в МЛ по сравнению с линией и наблюдается как в первом так и во втором поколениях. Однако при индукции мутаций химическим агентом частота всех типов анализируемых мутаций во втором поколении снижается, в то время как при анализе спонтанной мутабильности такое снижение наблюдается только для видимых мутаций, сцепленных с полом (Ким,Беляева, 1989). Подобное увеличение мутабильности было обнаружено при сравнительном анализе частот индуцированных соматических мутаций в генетически нестабильной линии иг. содержащей мобильный элемент -ВМ-225 (йуо ег а1.. 1983). При использовании в качестве химического агента и-нитрозо-м-этилмочевины (Л-НЭМ) и изучении ее влияния на свойства линии МЛ также обнаружено увеличение частоты видимых мутаций (Смирнова и др., 1991. В отличие от наших результатов такое увеличение наблюдали только в первом поколении.

При анализе спектра обнаруженных спонтанных мутаций можно выявить некоторую специфичность в распределении мутаций по длине хромосомы. Так, районами предпочтительной локализации мутаций в X хромосоме можно назвать районы локусов у-* и X (Ким,Беляева, 1989). По нашим данным спектр мутаций, индуцированных ЭМС в мутаторной линии, иной - несколько большей мутабильностью характеризуются участки X хромосомы в районе 3-13 , 30-40 и 56-58

моргашщ и район локуса vg во второй хромосоме. Если считатьспектр индуцированных в линии w мутаций составной частью спектра мутаций, индуцированных в МЛ, то при сравнении спектров спонтанных и индуцированных мутаций в линии МЛ перекрывания не обнаружено. за исключением мутации по локусу i , который является "горячей точкой" для транспозиций МДГ4 (Geyer,corses. 1938, Kim et al.. 1990. 1991). Подобная специфичность была обнаружена ранее для локуса out в системе транспозиционных взрывов cut1®2 (Герасимова и др.. 1983, Ыизрохи и др.,1985. Чуриков и др.,1981).

Следует особо отметить высокую частоту мутирования локуса Notch, мутации по которому были обнаружены наш: практически во всех экспериментах и частота мутирования которого доходила до 1,7'ГО"4 на поколение. Большая часть доминантных мутаций в локусе N связана с внедрением мобильных элементов е пределах экзонов, а многие из рецессивных мутаций этого локуса имеют мобильные элементы е интронах (Kidd, Lokett et al., 1983). -

Как описывалось выше, одним из свойств мутаторных линий является премейотический характер мутирования. Многие мутации, спонтанно возникшие в линии МЛ, имели пучковый характер. Причем премейотический характер имело также и .ревертироЕание этих мутаций, как е гомозиготной линии, так и при поддержании мутаций в линии, самки которой имели сцепленные X хромосомы (Ким.Беляева, 1987,1989). Эта закономерность сохраняется и при анализе возникновения хромосомных перестроек, которые, как правило, возникают на митотических фазах развития клеток, и мутирование носит премейотический характер (Деркавец, Ким, 1988).Следует отметить, что пучковый характер имели, кутрцик. полученные не только е первом, но и во втором поколениях. Генотип тестерной

линии не влиял на премейотический характер мутирования, то есть пучки появлялись как в скрещиваниях с самками линии СЦ)ЕМ,у так и с самками Ь з рг сп vg и "гисиса".

В зрелых сперматозоидах лилии МЛ происходит процесс аккумуляции повреждений генетического материала, возникших на более ранних стадиях сперматогенеза. Большая их часть, вероятно, проходит процесс фиксации в мутации еще до момента оплодотворения, о чем свидетельствует высокий уровень спонтанной мутабшшности /¿1 в отношении видимых мутаций. Обработка ЭМС приводит к возникновению потенциальных изменений в генетическом материале сперматозоидов самцов МЛ, о чем свидетельствует увеличенная частота мутаций, регистрируемых во втором поколении. Появившиеся потенциальные изменения реализуются в виде мутаций в течение нескольких поколений. Вероятно, индукция химическим мутагеном увеличивает еозмо*яость возникновения потенциальных изменения или их реализации в мутации, на что указывает пятикратное превышение частоты ^видимых мутаций в X хромосоме под действием ЭМС по сравнении со спонтанным уровнем (Ким, Беляева.1989)?

Таким образом, можно предположить, что механизмы спонтанного и индуцированного мутагенеза в линии МЛ сходны и обусловлены одной причиной - перемещением мобильных генетических элементов. По-видимому, закономерности активизации МГЗ на спонтанном и индуцированном уровнях одинаковы, а системы транспозиции мобильных элементов оказываются дерепрессированными уке непосредственно в самой мутаторной линии на спонтанном уровне.

Исследование мутаторных свойств линий дрозофилы с нарушениями репарзтивных механизмов может помочь приблизиться к пониманию генетического контроля мутационного процесса у

эукариот, поскольку возникновение мутаций к репарация генетического материала имеют оопше ферментативные этош;. С этой целью нами была использована мутация mei-91,1. нарушащая Функционирование эксцизионного механизма репарации (Nguen, Boyd, 1977 ) и ■ обладающая мутаторным действием в отношении некоторых типов мутаций.

Отсутствие различий в уровне мутаоильности зрелых сперматозоидов линий Д-32 и mei-9L1 под действием рентгеновских лучей было описано нами ранее ( Романова, Асланян, 1985; Романова, Ким, 1986). В настоящей работе показано, что частоты мутирования пяти генов второй хромосомы под воздействием ЭМС в линии mei-9L1 достоверно выше, чем в контрольной линии Д-32, а частоты мутирования генов третьей хромосомы не различаются достоверно у этих двух линий. По-видалому, пути становления мутаций, индуцированных рентгеновскими лучами и ЭМС у дрозофилы отличаются друг от друга. Вероятно, такие, что на различную мутабильность • генсв оказывает влияние структура и специфика локуса. его месторасположение на хромосоме. Следует отметить, что большинство анализированных локусов второй хромосомы располагается в прицентромерном гетерохроматинозом районе, тогда как анализируемые локусы третьей хромосомы равномерно распределены по всей ее длине. Этот факт может являться причиной различной стабильности анализируемых генов второй и третьей хромосом, так как в ходе последних исследований установлено, в частности существование предпочтительной локализации встраивания нескольких семейств транспозонов ( в том числе copia, 297 и др. ) в проксимальных концах второй и третьей хромосом (Charles-.-orth et al.. -.992).

- -

Так как мы исследовали влияние ЭМС на зрелые спермин, следует ожидать, что пониженная интенсивность ферментативных процессов на этой стадии гаметогенеза также может быть причиной отсутствия значительного повышения уровня мутирования у линии с нарушенной репарацией по сравнению с линиями Д-32 и я.

В работах по исследованию спонтанного и индуцированного мутагенеза в репарзционпо-дефектных линиях швх-Э1*1 и шиз {1)104 по тестам на ДЛ и РСПЛМ (Магерамова. - Асланян, 1985) показано достоверное повышение индуцированного НЭМ уровня ДЛ у этих линий, причем мутабильность в линии ииз(1)Ю4 была достоверно выше, чем в линии тез.-э1,1. /'

' В тестах на РСПЛМ такого превышения частоты мутирования (как спонтанного, так и индуцированного НЭМ) для линии тех-Э1,1 обнаружено не было (Асланян и др., 1986). Однако, в этих же экспериментах по определению перекрестной чувствительности к мутагенным факторам ряда линий с нарушенной репарацией обнаружили достоверное повышение частоты спонтанных и индуцированных различными агентами РСПЛМ. Это может служить подтверждением наличия различных путей репарации, контролируемых соответствующими генами.

ВЫВОДЫ.

I. Показано, что индуцированная ЭМС мутабильность мужских половых клеток в генетически нестабильной линии МЛ увеличена по сравнению со спонтанным уровнем и контрольной стабильной линией дикого типа Д-32. иг и с линией теЛ-э^.с нарушенной репарацией. Возрастание частот морфологических видимых мутаций в МЛ было отмечено как в первом, так и во втором поколениях и затрагивало

как X хромосому, так и аутосомы. ,

2 Возникновение индуцированных ЭМС мутация е МЛ г ряде случаев имеет пучковый характер, что свидетельствует о премейотическом характере мутирования МЛ под действием ЭМС.

3. При сравнительном анализе частот возникновения отдельных мутаций ярко Ецракенной специфичности в распределении мутацЕП по I, 2 и 3 хромосомам не обнаружено. Несколько большей мутабильностью характеризуются участки X хромосомы в районе 3-13 , 30-40 и 56-58 морганид и район локализации локуса vg во Еторой хромосоме. По-видимому, возникновение изменений генетического материала, ведущих к появлению мутаций не зависит от местоположения в геноме -

4. В зрелых сперматозоидах линии МЛ происходит процесс аккумуляции повреждений генетического материала, возникших на более ранних стадиях сперматогенеза.Большая их часть, вероятно, проходит процесс фиксации клутации еще до момента оплодотворения, о чем свидетельствует высокий уровень спонтанной мутабильности МЛ и превышение уровня частоты индуцированных мутаций в X хромосоме б линии МЛ по сравнению с контрольной линией к* в первом поколении.

5. Обработка ЭМС приводит к возникновению потенциальных изменений е генетическом материале сперматозоидов самцоЕ мутаторной линии, о чем свидетельствует увеличенная частота мутаций, регистрируемая во втором поколении. Появившиеся потенциальное изменения реализуются в видз 1<;уташй в течение нескольких поколений.

6. Большинство мутаций , полученных под воздействием ЭМС е МЛ характеризуются свойством генетической нестабильности.

проявляющейся в виде ревертирования к норме, последовательного мутирования с изменением первоначального мутационного состояния.реплицирующейся нестабильности. По-видимому, индуцированные ЭМС мутации в линии МЛ вызваны перемещениями МГЭ.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ"ДИССЕРТАЦИИ;

1.Асланян М.М., Смирнова В.А., Романова Н.И. "Исследование мутагенной специфичности на D.melanogaster." В кн.: "Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций" Вильнюс, 1982, С.4.

2.Смирнова В.А.,Романова Н.И. "Исследование специфичности химических мутагенов в индукции видимых мутаций на D.melanogaster." Тезисы IV съезда Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова. Кишинев, 1981.

3.Романова Н.И..Асланян М.М.,Ким А.И."Анализ видимых мутаций, индуцированных рентгеновскими лучами и этилметансульфонатом в зрелых спермиях Drosophila melanogaster"."BKWi. науки". 1985, ЖЗ. С.91-95.

4.Романова Н.И.,Ким А.И., Асланян М.М. "Индуцированная этилметансульфонатом и рентгеновскими лучами мутабильность локусов третьей хромосомы в нормальной и дефектной по эксцизионной репарации линиях Drosophila melanoga3ter"."Виол, науки" 1986, JH. С.86-88.

5.Романова Н.И., о Ким А.И., Асланян М.М. "Химически индуцированная нестабильность в системе мутаторной линии дрозофилы". Тезисы VI Всесоюзного совещания по проблемам биологии и генетики дрозофилы". Одесса. 1989, С.24..