Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности индукции генетических эффектов у сельскохозяйственных растений при комбинированном действии ионизирующих излучений и тяжелых металлов

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности индукции генетических эффектов у сельскохозяйственных растений при комбинированном действии ионизирующих излучений и тяжелых металлов"

{!\а / р

О V

На правах рукописи

\ УДАЛОВА

• Алла Александровна \

V..,......................

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИНДУКЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ КОМБИНИРОВАННОМ ДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ И ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

Специальность 03.00.01 — радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск — 1995

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

кандидат биологических наук ГЕРАСЬКИН С. А. кандидат биологических наук ЗЯБЛИЦКАЯ Е. Я.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор, академик УАТН ГУДКОВ И. Н. доктор биологических наук, профессор СЕВАНЬКАЕВ А. В

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Объединенный Институт Ядерных Исследовании, г. Дубна.

Защита диссертации состоится »1995 г

в часов на заседании Специализированного совета

Д 120.81.01 при Всероссийском НИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии по адресу: Калужская обл., г. Обнинск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского НИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии.

Отзывы просим направлять по адресу: 249020, Калужская обл., г. Обнинск, ВНИИСХРАЭ, Специализированный совет Д 120.81.01.

Автореферат разослан «^ » ^^

1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Санжаров

а

ОБЩАЯ ХАРАК ТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Астуапьнасть проблемы Резкое возрастание техногенного загрязнения окружающей среды. которое в ряде регионов России уже сегодня достигло масштабов экологического бедствия, а также аварии на объектах атомной энергетики, химической и воспой громыш-лежгсти вцдвин/гм на первый план проблему корректной количествен«»! оцени биологических эффектов комбитрованюго действия факторе» разной природы в дозах и кощентра-ииях. характерна для совремежои среды обитания человека. Даже в сгучае такого хорошо изучежого фактора, как ионизирующие излучежя. характер дозовой зависимости в области малых доз по выходу генетических повреждении в области малых доз остается под вопросом. Принятая ранее МКРЗ и НКДАР ООН в качестве официальной концепции (Публикация МКРЗ N 26,1978) гатш беспороговая гипотеза в настоящее время подвергается ispwnwe как не имеющая прочного биологического обоснования (Филюшкин Петоян 1988; Гераськик 1995) и вступающая в противоречие с имеющимися зкеперимекгалы-ыми даными. В случае других поппштянтов физической, химическом и биологической природы связать экспозицию с биоло-¡ическим эффектом гораздо сложнее, поскольку мехажзмы их действия изучены значитель-!ю хуже. Еще более сложной является задача оцени последствий комбинированного деи-cihhh факюров разной привода вследствие возможности ицаукции н&гмнеиьых (синергизм, знгагамзм) эффектов. Следует также отметить, что для реалыых ситуаций характерно од-нпвременюе воздействие на объекты живой природы пракгичеси* неограшчежэго количества пшац^алиих мутагенов в невысоки дозах, что обуславливает малую величлу превышения и»у\уцировзных повреждении над спонтанным уровнем и часто не позволяет корректно оцешгь наблюдаемые биологические эффекты Таким образом, оцени реального дологического риска техногенного загрязнения невозможна без разработки принцте® и ме-i окон ноличипвенюи оцеши отклика биологической системы на комбинированное воздействие факторов разяои природы.

Удобным объектом для проведения таких исследовании являются сельскохозяйствен-s ыс рзстенип, обладающие рядом преимуществ по сравнению с другими тест-объектами: возможность получения репрезентативных выборов стационарном (прикреппеньм) образ жизж, дешевизна и технологичность проведения всех видов экспериментов, наличие эмбриональных тканей - меристем - долго сохраняющих способность к деленно и близких по чувствительности к критическим тканям человека и животных (Гудков, 1985).

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является изучение закономерностей формирован** генетических эффектов у сельскохозяйственных растений в условиях раздельного и комбинированного действия ионюируккцих излучений и тяжелых металлов. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать принципы и методы анализа биологических эффектов комбинированного действия факторов разной природы, которые применимы в реальных ситуациях, характеризующихся большим числом одновременно действующих факторов. наличием нелинейных (антагонизм, синергизм) эффектов взаимодействия повреждений, небольшим превышением экспозиции к отдельным агентам над фоновым значением и малым объемом доступной исследователю экспериментальной информации.

2. Исследовать закономерности индукции аберраций хромосом в клетках корневой и листовой меристем сельскохозяйственных растений в зависимости от вида и экспозиции повреждающего агента.

3. Исследовать закономерности индукции аберраций хромосом в ингеркаляр-ной меристеме сельскохозяйственных растений при комбинированном действии облучения и тяжелых металлов.

4. Исследовать формирование генетических эффектов у растений, выращенных в сложных реальных условиях, характеризующихся комбинированным действием малых доз повреждающих факторов разной природа.

Положения, выносимые на защиту

1. Частота выхода индуцированных ионизирующим излучением структурных мутаций в клетках листовой и корневой меристемы сельскохозяйственных растений нелинейно зависит от величины поглощенной дозы.

2. Для выхода цитогенетических повреждений в клетках листовой меристемы ячменя Hordeum vulgare в условиях комбинированного действия ионизирующего излучения и загрязнения почвы солями тяжелых металлов (свинец кадмий) характерно проявление нелинейных (синергизм, антагонизм) эффектов взаимодействия, которые имейт место преимущественно в области малых значений экспозиции.

3. Частота структурных мутаций в клетках корневой меристемы семян ячменя, выращенных в 30-км зоне Чернобыльской АЭС, не имеет достоверной связи с поглощенной за вегетационный период дозой 0.06-3.30 сГр. Статистически достоверное различие ряда цитогенетических показателей, получетях на различных по

плотности радиоактивного эагрязнешя участках, обусловлено действием нерадиационных факторов.

Научная новизна. Впервые:

— разработана и применена к анализу конкретного экспериментального материала система принципов и методов анализа биологических эффектов комбинированного действия факторов разной природы;

— показан нелинейный характер дозовой зависимости выхода цитогенетических повреждений, индуцированных ионизирующим излучением в клетках листовой и корневой меристем сельскохозяйственных растений, в области малых значений поглощений дозы;

— исследованы закономерности индукции аберраций и их распределения по клеткам, формирования поврежденности аберрантных клеток и спектра структурных мутаций у сельскохозяйствежых растений при раздельном и комбинированном действии ионизирующих излучений и тяжелых металлов;

— при исследовании закономерностей выхода структурных мутаций в корневой меристеме облученных семян ячмен» выявлен участок (1-10 Гр), в пределах которого частота аберрантных клеток статистически достоверно превышает спонтанный уровень и не зависит от величины дозы:

— показано, что в условиях комбинированного действия ионизирующего излучения и тяжелых металлов имеют место достоверные нелинейные эффекты по выходу цитогенетических повреждений, которые характерны главным образом для сочетания малых уровней воздействия этих повреждающих агентов;

— использован бугстреп-метод для анализа биологических данных;

— показано, что уровень цитогенетических повреждений в клетках корневой меристемы семян ячменя, выращенных в 30-км зоне Чернобыльской АЭС, не имеет достоверной связи с поглощежой за вегетацию дозой в диапазоне 0.06-3.30 сГр, однако статистически значимо зависит от интенсивности воздействия факторов нерадиационной природы.

Теоретическая и практическая значимость. Предложенная в диссертационном исследовали методология анализа отклика биологической системы на сочетанное действие повреждающих факторов разной природы позволяет получить научно обоснованные количественные оценки реального генетического риска воздействия на человека и экологические системы комбинированного техногенного загрязнения среды, которые могут стать основой для принятия оптимальных (а, значит, экономически эффективных) управленческих решений по размещению экологически вред-

гмх производств, целесообразности их перепрофилирования, допустимых масштабах применения агротоксикангов, разработки нормативных доцентов.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что при оценке и нормировании техногенного воздействия на человека и биоценозы необходимо учитывать возможность синергических и антагонистических эффектов взаимодействия факторов разной природы.

Предложенные в исследовании методы анализа экспериментальных данных легко реализуемы на практике и дают хорошие результаты в условиях малых выборок и многомерности экспериментальной информации.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на 2-ои международной конференции 'Радиобиологические последствия аварий на атомных электростанциях* (Москва, 1994). Биофизическом семинаре Объединенного института ядерных исследований (Дубна. 1995). 10-ом Международном конгрессе по радиационным исследованиям (Вюрцбург, 1995), представлены на II Радиобиологическом съезде (Киев, 1993), Международной конференции "Проблемы смягчения последствий Чернобыльской катастрофы' (Брянск. 1993). 26-ой Ежегодной конференции Европейского радиобиологического общества (Амстердам, 1994). Апробация диссертации состоялась на межлабораторном научном семинаре ВНИИСХРАЭ в апреле 1995 г.

Публикации По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения. выводов и списка литературы. Работа изложена на 174 страницах машинописного текаа, включая 27 таблиц и 25 рисунков. Список литературы содержит 148 наименований, в том числе 45 иностранных.

ПРИНЦИПЫ И МЕТОДЫ ОЦЕНКИ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ МАЛЫХ ДОЗ И КОНЦЕНТРАЦИЙ ФАКТОРОВ РАЗНОЙ ПРИРОДЫ

Проблема корректной количественной оценки биологических эффектов соче-т энного воздействия связана с практически неограниченным количеством потенциальных мутагенов, различием механизмов их действия и внутриклеточных мишеней, возможностью нелинейных эффектов взаимодеиствия. а также отсутствием единой методологии анализа эффектов многофакторного воздействия.

Для обеспечения корректной оценки, анализ отклика биологической системы на комбинированное воздействие должен включать следующие этапы:

1. Анализ отклика биологической системы на раздельное действие изучаемых в эксперименте факторов.

2. Выявление возможных нелинейных эффектов комбинированного действия и классификация их по группам: аддитивность, синергизм, антагонизм.

3. Оценка относительного вклада повреждающих факторов в индукцию наблюдаемой изменчивости биологических показателей.

4. Формирование на основе полученных результатов содержательных представлений о механизмах ответной реакции биологической системы на комбинированное воздействие.

Рассмотрим некоторые из этих этапов более подробно.

1. Одной из важных задач при планировании биологического эксперимента является определение числа проб, необходимого для оценки с заданной точностью значений параметров, характеризующих ответ системы на внешнее воздействие. Гераськин с соавт. (1994) предлагают проводить такую оценку, опираясь на знание вероятностного закона распределения эмпирических величин Тогда число проб, необходимое для определения среднего значения с относительной вероятной погрешностью б, можно оцежгь по формуле

п = 1, где V = 8/ х - коэффициент вариации.

Если возможности эксперимента ограничены и не могут обеспечить достаточного количества данных, используют статистические методы, специально разработанные для случаев малых выборок: непараметрические методы анализа информации. понижения дисперсии, отбраковки недостоверной информации (выбросов) и т.д Одним из удобных и простых в реализации приемов является бугстреп-метод, впервые использованный нами (Гераськин и др., 1993) для анализа радиобиологических данных.

2. Для оценки нелинейных эффектов комбинированного действия целесообразно использовать коэффициент взаимодействия Кщ, который определяется как отношение инкремента ответной реакции системы на комбинированное действие к сумме инкрементов при раздельном действии каждого из факторов:

К, ДА(Х.У)

ДА(0,У)+ДА(Х,0) '

где X, Y - действующие факторы, л A(X.Y) = A(X,Y) - А(0,0). Для классификации отклика биологической системы на комбинированное воздействие по группам: синергизм, аддитивность, антагонизм - необходимо произвести проверку статистическои гипотезы о равенстве К(п единице (если К<„ ~ 1, то результат комбинированного действия классифицируют как аддитивныи; если К[0 достоверно меньше 1, имеет место антагонизм; если Kw значимо больше 1, эффект • синергический). которую можно свести к оценке существенности различии между средними значениями генеральных совокупностей, из которых были получены выборки для оценки значений числителя и знаменателя Ьсли распределение этих величин не отличается от нормального. то можно воспользоваться критерием Стьюденга.

3. Ионизирующее излучение и другие мутагены не порождают каких-либо новых биологических феноменов, а лишь увеличивают вероятность возникновения мутаций и других событий, которые происходят в клетке и спонтанно. Однако частота выхода разных типов мутации увеличивается под воздействием разных внешних факторов не в одинаковой степени, на чем может быть основана оценка их относительного вклада в регистрируемый эффект. Анализ характера поклеточного распределения аберраций хромосом также может быть использован для оценки вклада каждого из факторов, причем в условиях относительно малых выборок для идентификации вида эмпирического распределения удобнее всего использовать критерий Колмогорова-Смирнова.

Кратко изложенные в этом разделе общие подходы были использованы при оценке биологических эффектов комбинированного действия типичшх и широко распространенных техногенных стрессоров - ионизирующего излучения и тяжелых металлов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Закономерности индукции структурных штаиий в корневой меристеме обпученных ионизирующим излучением семян пшенииы и ячменя. Эксперименты по изучению закономерностей индукции иоинизирующим излучением ци-тогенетических эффектов проводили на семенах яровой пшеницы Triücum aesthaim L. сорта Энита и ячменя HorcJeum vulgare U сорт Зазерский. Воздушно-сухие семена пшеницы облучали /-квантами 60Со в дозах 0.1, 0.5, 1, 10, 50 и 100 Гр, ячменя -0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50. 100, 200 и 300 Гр. Спустя 24 часа после облучения сев

мена проращивали в чашках Петри. Образцы по 20-40 корешков на вариант, достигших длины 5-10 мм, фиксировали в ацетоуксусном спирте (3:1). Временные давленые препараты готовили из апикальной меристемы главного зародышевого корня и окрашивали ацетоорсеином. Генотоксичность оценивали по выходу аберраций хромосом в ана-телофазных клетках: анализ спектра аберраций проводили с выделением хромэтмдных (одиночных) и хромосомных (двойных) мостов и фрагментов, а также отставаний хромосом (геномные мутации).

Рис. 1. Изменение частоты аберрантных клеток в корневой меристеме проростков облученных семян ячменя (сплошная линия) и пшеницы (пунктирная линия) в за, висимости от дозы облучения.

По оси абсцисс - доза, Гр, по оси ординат - частота аберрантных клеток, %; слева - для пшеницы, справа - для ячменя.

На рис. 1 представлены зависимости выхода аберрантных клеток в корневой меристеме проростков семян пшеницы и ячменя от дозы облучения. В обоих случаях характер зависимостей ставит под вопрос их линейность в области малых величин поглощенной дозы. Чтобы выяснить, наблюдаем ли мы дозонезависимый участок либо имеет место линейная или какая-то другая зависимость, был проведен статистический анализ экспериментальных данных с использованием нескольких различных критериев (Стьюденга, Колмогорова-Смирнова, доверительных интервалов и др.). результаты которого показали, что в случае пшеницы в диапазоне 0-1 Гр от-: сутствует зависимость частоты выхода аберрантных клеток от дозы облучения; в случае ячменя достоверное отличие выхода радиационно-индуцированных генетических повреждений от спонтанного уровня имеет место начиная с дозы 1 Гр и вы?

uie; s пределах участка 1-10 Гр, несмотря на 10-кратное увеличение дозы, выход аберраций остается постоянным, т.е. в этом диапазоне наблюдается отличный от спонтанного уровня дозонезависимый участок (плато); начиная с 25 Гр частота генетических повреждений увеличивается с дозой.

В работах ряда авторов, выполненных в основном на лимфоцитах периферической крови человека (Севанькаев, 1991; Спитковский, 1992), а также на фиб-робластах китайского хомячка и проростках Vicia faba (Заичкйна и др., 1992), также было зафиксировано отличное от контрольного уровня плато по выходу генетических нарушений. Наиболее распространенное объяснение выявленного феномена связано с гипотезой об индукции малыми дозами ионизирующего излучения мутагенной ветви репарации, что и обуславливает повышенный (относительно контроля) выход генетических нарушений. Отсутствие аналогичного результата в эксперименте с пшеницей, по-видимому, связано с повышетым уровнем спонтанного мутагенеза у данного объекта (см. рис.1), обусловленным, в частности, сложной организацией генетического материала в ее гехсаплоидном геноме. Сопоставление выявленной в ходе настоящего исследования формы эмпирической дозовой зависимости с результатами других авторов, полученными на других объектах, позволяет сделать важный вывод отом. что форма зависимости выхода радиационно-ищуцированных цитогенетических повреждений от дозы имеет универсальный характер, различаясь для разных объектов лишь значениями доз, при которых происходит изменение ха-рактерЬ зависимости и которые определяются их чувствительностью к внешним воздействиям.

На рис.2 представлена зависимости среднего числа повреждений на клетку от дозы облучения Статистический анализ показал, что, как в с^чае ячменя, так и пшеницы в диапазоне доз от фонэвых вплоть до коща дозонезависимого участка отсутствует достоверное увсшчете число поиреждежй на клетку. В табл.1 представлена) средние значеюя нару-жежости айерракгьых клеток повреждениями (поереждежость), расчитажые с учетом вариабельности показателей по растещям. Анализ экспериментальна даных показал что у пшен/щы зависимость поереждежослм клеток меристемы от дозы носит аномальный характер: после резкого увеличен«] при дозах 10 и 5 0 Гр, при дозе 100 Гр Нафужежость падает до уровня конфоля. При этом максимальное число аберраций на кпепуравно6(1 клетка с б аберрациями, 4Шшл с 5 аберрациями), в то время как при дозе 50 Гр зафиксировав клетки с 6, 7, 8, 10 и даже 11 аберрациями. На самой деле нафужентлъ клеток структурными м/тациями при дозе &Q Г р еще выше, тек как при оценке этого показателя не учиты-

о

1.24-

9.8 Н

М II

Рис.2. Изменение числа аберраций на клетку в корневой меристеме пшеницы (1) и ячменя (2) в зависимости от дозы облучения.

Покоси абцисс -доза,"Гр; по оси- ординат - среднее число повреждений на клетку, 102.

8.1

т ¡6

«3

190

—I— 1000

вались клетки со сложными, не поддающимися распознаванию аберрациями и микроядрами, которых при этой дозе почти на 2 порядка больше, чем при других.

Анализ представленных в табл.1

Таблица! Нагружежость аберрантных клеток повреждениями

Доза, Гр Нагруженность клеток, отн.ед.

пшеница ячмень

0 1.52 ±0.49* 1.00 ±0.00

0.1 1.8в±0.58* 1.40 ±0.49

0.5 1.64±0.41* 1.40 ±0.49

1.0 1.43±0.51* 1.42 ±0.52

5.0 1.00±0.00

10.0 2.21 ±1.21 1.21 ±0.21

25.0 1.31 ±0.40

50.0 2.20 ±0.41 1.55 ±0.51

100.0 1.83 ± 0.21* 1.49 ±0.72

200.0 1.89 ±0.09 ••

300.0 1.92±0.54 ••

Примечание: * • различие поврежденное™ от уровня, индуцированного при доз* 50 Гр, значимо с доверительной вероятностью 95%;

** - различив поврежденное™ от уровня, индуцированного при доза 0.1 Гр, значимо с доверительной вероятностью 95%

экспериментальных данных позволил выявить общие черты в закономерностях изменения нагруженности аберрантных клеток повреждениями у ячменя и пшеницы: 1) в обоих случаях отсутствует достоверный рост поврежденности на начальном участке зависимости; 2) имеет место уменьшение значения изучаемой характеристики до уровня контроля при дозах, близких к концу дозонезависимого участка, т.е. при облучении в дозе 1'Гр э случае пшеницы и при дозе 5 Гр в случае ячменя; 3) за пределами дозонезависимого участка нагруженность возрастает за счет появления клеток с множественными аберрациями, при этом значительно увеличивается число клеток со слож-

ними. не поддающимися распознаванию повреждениями.

Согласно теории мишени (Тимофеев-Ресовскии и др.. 196й). при действии ред-коионизирующего излучения распределение первичных повреждении молекул ДНК по клеткам должно соответствовать закону Пуассона Однако распределение аберрации, являясь итоговым показателем, отражает не столько картину первичных повреждении. сколько процессы реализации их в истинные мутации, на которые су-щес)венное влияние оказывают процессы восстановления. Поэтому чем большую роль играют процессы репарации в формировании структурных мутаций, тем больше итоговое эмпирическое распределение должно отличаться от предполагаемого закона Пуассона. Исследование статистического закона распределения аберраций по клеткам с помощью критерия Колмогорова-Смирнова показало, что распределение числа повреждений по клеткам корневой меристемы пшеницы при облучении в дозах 10 и 50 Гр, а также по клеткам меристемы ячменя при облучении дозами 200 и 300 Гр не может быть удовлетворительно описано ни нормальным, ни пуассонов-ским законами. То. что распределение Пуассона не является адекватной моделью в этом случае - совершенно оправдано, поскольку при облучении в больших дозах события индукции аберраций хромосом нельзя считать редкими. Однако нормальный закон также не подходит для описания распределения числа повреждений по клеткам при этих дозах. По-видимому, даже в случае действия достаточно высоких доз радиации, индуцирующих множественные повреждения в молекулах ДНК. значительное влияние на формирование отклика биологической системы оказывают процессы восстановления повреждений, что и отражается на виде распределения.

В табл.2 сопоставлены биологические эффекты, индуцированные облучением семян пшеницы и ячменя в дозах, соответствующих одинаковому характеру распределения повреждений. Для пшеницы можно выделить три участка, различающиеся видом статистического распределения повреждений по клеткам. 1 - при облучении дозами вплоть до 10 Гр распределение аберраций хорошо описывается обоими исследованными статистическими законами (Пуассона и Гаусса); II - при дозах 10 и 50 Гр наблюдается отклонение распределения как от пуассоновского, так и от нормального; III - при дозе 100 Гр только нормальное распределение адекватно экспериментальным данным. В случае ячменя характер распределения повреждений по клеткам меняется аналогично: участок (соответствует дозовому диапазону 0-100 Гр. участок II - дозам 200 и 300 Гр. Несмотря на существенное различие в величине дозы, индуцированные ионизирующим излучением в семенах пшеницы и ячменя на

участках I и II биологические эффекты равнозквиваленпы по критериям "макси-гв

чальное число повреждений на клетку*, "среднее число повреждений на клетку" и ' "нагруженность аберрантных клеток". Интересно отметить, что вместе с изменением характера распределения повреждений на соответствующий выделенному нами участку III. среднее число структурных мутаций на клетку впервые становится больше единицы (рис.2, кривая 1). В эксперименте с ячменем максимальный биологиче-скии эффект по представленным в табл.2 критериям не выходит за пределы участка II. т.е. воздействие на семена ячменя дозами облучения вплоть до 300 Гр оказалось недостаточным для индукции в клетке количества повреждений, соответствующего участку III.

При анализе табл2 закономерно возникает вопрос - чем обусловлено многократное различие доз. икцуиурукхцих равное количество поврежден« в клетках пшениц и ячменя. Исчерпывающее объяснение этому дать сложна, однако нэсомнежо, что главной причинам является различие экспериментальных объектов. Выше уже упоминалось, что организация генетического материала в гексаплоиднэм геноме мягкой пшенцы является более сложной, чем в дитлоццном геноме ячмега, что не может не сразить«» ж характере отвепсмреазщум объекта на облучеше. Кроме того, сорт пшеюцы Этта является габридным, что также влияет на его устойчивость к внеииим воздействиям и величин (¿нгацирова+сго облучежем эффекта

Преобладающим типом структурных мутаций у изученного сорта пшеницы в

Таблица 2

Сравнение биологических эффектов, индуцированных облучением семян пшеницы и ячменя в дозах, соответствующих одинаковому характеру распределения повреждений по клеткам

| ¡Дозы, I Тип статистичо-I Гр I ского распреде-1 | ! пения I 1 I 2 I i 3

j участок 1 | j {пшеница 1« <0 1 Пуассон. Гаусс ! ячмень «'200 j Пуассон, Гаусс % 6 5 <0.12 £0.11 1.2+1.9 1.0+1.8

| участок И j j 1 пшеница | 10. | не Пуассон, | • | 50 j не Гаусс 1 ячмень 1200. I не Пуассон. j ¡300______! не Гаусс _____ ! участок 111 1 Г ¡пшеница ¡100 ¡Гаусс |ячмень j - | 10. 11 7. 8 8 0.12+0 88 0.1110 29 2.0+2.4 1 8+2.2

1.27 1.5+1.7

Примечание:

1 - максимальное число повреждений.

2 - число повреждений на клетку,

J - поврежденность аберрантных клеток |ДИ.> пО

И

норме и при облучении во всем диапазоне доз является геномные мутации (47-72%) (что обусловлено гибридным происхождением сорта Энита), затем следуют хрома-тидные (26-50%) и хромосомные (2-4%); у ячменя преобладающим типом являются хроматидные аберрации (46-82%), геномные составляют 9-52%, хромосомные - 210%. Большой вклад аберраций хроматидного типа, по-видимому, связан с возможностью индукции в фазе Gi длительно живущих потенциальных повреждений, реализующихся затем в фазах S и G2 в мутации хроматидного типа (Дубинин Немцова, 1972). Хромосомные аберрации как у пшеницы, так и у ячменя появляются после облучения в дозах, превышающих диапазон плато, и. в случав ячменя, относительный вклад хромосомных аберраций достоверно увеличивается с ростом дозы, что подтверждает возможность использования этого типа повреждений в качестве маркера радиационного воздействия.

Таким образом, анализ радиационно-индуцированных генетических эффектов в клетках корневой меристемы ячменя и пшеницы показал, что зависимости выхода структурных мутаций от дозы имеют ярко выраженный нелинейный характер. Выявлен участок дозовой зависимости (1-10 Гр), в пределах которого частота аберрантных клеток в корневой меристеме ячменя статистически достоверно превышает спонтанный уровень и не зависит от величины поглощенной дозы. В диапазоне доз от фоновых до конца доэонезависимого участка характер распределения повреждений па клеткам остается одним и тем же. несмотря на достоверное возрастание выхода аберрантных клеток с дозой. Показано, что при облучении в дозах, превышающих пределы доэонезависимого участка,, первичные повреждения способны реализоваться в аберрации хромосомного типа. Установлена связь величины цитогенети-ческого повреждения с закономерностями распределения аберраций по клеткам.

2. Инбукиия ионизирующим излучением у тяжелыми металлами генетических эффектов в листовой меристеме ячменя. Вегетационный эксперимент по изучению закономерностей индукции генетических эффектов в листовой меристеме растений в условиях комбинированного действия ионизирующего излучения и тяжелых металлов проводили на яровом ячмене Hordeum vulgare I.. сорт Московский 2. Растения выращивали в условиях вегетационного опыта в почвенной культуре по общепринятой методике. Тяжелые металлы вносили в почву при набивке сосудов в виде азотнокислых солей - Pb(N03h в концентрациях 40, 50, 200 и 500 мг/кг почвы и Cd(N02)-4H;0 в концентрациях 4, 10, 20 и 100 мг/кг почвы. Растения подвергали облучению в дозах 4. 8,10, 20.100 и 1000 сГр на V этапе органогенеза. Пробы ингеркалярной меристемы листьев отбирали через двое суток после облуче-

■Л

«я и фиксировали в уксусном алкоголе (1:3). Цитогенетический анализ проводили в )на-телофазах на давленых временных микроскопических препаратах, окрашенных зцетоорсеином. Учитывали частоту клеток с хромосомными нарушениями и число аберраций на клетку. В каждом варианте анализировалидо 500 ана-телофаз.

Рис.3. Изменение частоты выхода аберрантных клеток в листовой меристеме ячменя в зависимости от дозы облучения. По оси абцисс -доза, сГр; по оси ординат -частота аберрантных клеток, эти. ад.

' На рис. 3-5 представлены зависимости выхода цитогенетических повреждений от дозы (концентрации) для каждого из изучавшихся в эксперименте факторов. Все они имеют ярко выраженный нелинейный характер. Несмотря на качественно различающийся характер зависимостей, все они гораздо лучше описываются логарифмической функцией, чем линейной. Это, в частности, свидетельствует о том, что при действии малых доз и концентраций исследуемых факторов выход цитогенэти-ческих повреждений растет быстрее, чем при больших. Проверка с помощью статистических критериев показала, что в случае ионизирующего излучежя (рис.3) с первых же использованных в эксперименте доз имеет место достоверное отличие частоты выхода аберрантных клеток от контрольного уровня. Характер представ-лежой на рис.3 эмпирической зависимости может быть расценен как аргумент в пользу существования дозонезависимого участка на кривой выхода цитогенетических нарушений и хорошо корреспондирует с полученными нами (см. раздел 1) и другими авторами (Севанькаев, 1991; Заичкина и др., 1992) на разных объектах и генетических тест-системах результатами, свидетельствующими о нарушении линейного характера дозовой зависимости в области малых значений экспозиции.

Выход цитогенетических повреждений в присутствии свинца (рис.4) характеризуется резким увеличением числа аберрантных клеток при малых уровнях загряз-

13

№

265

т

Рис.4. Изменение частоты выхода аберрантных клеток в листовой меристем» ячменя в зависимости от концентраций солей свинца в почве. По оси абсцисс - концентрация РЬ, мг/кг почвы, по оси ординат - частота аберрантных клеток, %.

нения почвы (40-50 мг/кг почвы) с последующей стабилизацией этого показателя на уровне, в два раза превышающем контрольный. Такой характер поведения зависимости заставляет с осторожностью относиться к выбору ПДК для этого металла, поскольку даже небольшое увеличение его концентрации ведет к непропорционально высокому росту генетических нарушений.

В случае кадмия (рис.5) уровень "насыщения" также достигается (10-20 мг/кг) и, более того, наблюдается даже снижете выхода аберрантных клеток при сильном загрязнении лочвы (возможно, это связано с цитотокси-ческим действием металла). Причем умен>шен*е выхода

Рис.5 Изменение частоты выхода аберрантных клеток аберрантных клеток выра-в листовой меристеме ячменя в зависимости от

концентрации солей кадмия в почве. жено настолько сильно, что

По оси абсцисс - концентрация Сй, мг/кг почВы, количество пои иювнв

по оси ординат - частота аберрантных клеток, %. Их К0ШЧвСТВ0 "РИ У"0*"®

загрязнения лочвы 100 мг/кг

от такового в контроле. достоверно не отличается

Подученные результаты свидетельствуют о том, что использованная нами ци-тогенетическая тест-система - учет выхода аберрантных клеток в ингеркалярной меристеме листьев - является достаточно чувствительной и информативной и может быть использована для индикации слабых воздействий повреждающих агентов. В частности, ло чувствительности к действию ионизирующего излучения (позволяет

достоверно регистрировать индуцированные структурные мутации при дозах порядка единиц сГр) интеркалярная меристема листьев ячменя сравнима с классическим гестом "частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека".

Исследование поверхности отклика интеркапярной меристемы на комбинированное воздействие ионизирующего излучения и тяжелых металлов с помощью дисперсионного анализа позволило сделать следующие выводы: 1) существует до-

44%

4%

52%

85%

С<1 + у

51%

Т/о

42%

30%

\2°л

□

РЬ + у

взаимодействие

, ионизирующее излучение , тяжелый металл

Рис 6 Относительный вклад ионизирующего излучения и тяжелых металлов в наблюдаемую генетическую изменчивость, а - выход аберрантных клеток, Ь - нагру-женность клеток повреждениями, стоверная связь между уровнем экспозиции повреждающих агентов и выходом

аберрантных клеток 2) излучение и металлы вносят приблизительно равный вклад в индукцию аберрантных клеток (рис.6, а); 3) степень повреждения клеток зависит в основном от концентрации тяжелых металлов (рис.6, Ь); 4) имеют место нелинейные эффекты, уровень значимости которых для случая Сй+ у составил 2.56%, а для РЬ +• у, соответственно, 0.03%. Вычисление коэффициентов взаимодействия (табл.3) и статистическая проверка их значимости показали, что нелинейные эффекты синер-

Таблица 3

Частота выход а аберрантных клеток в интеркапярнои меристеме ячменя и эначетя коэффициента взаимодействия при комбинированном действии облучения и тяжелых металлов

Вариант Доза, сГр Металл, мг.кг ' Инкремент частоты аберрантных клеток, % Коэффициент взаимодействия, Kg, Р

Г 0 4 8 10 20 100 1000 | о о о о о о о 0.00 ±2.02 6.07±2.36 4.17 + 2.25 9.00 ±2.66 9.97 ±2.54 15.30 ± 2.88 24.00 ± 3.07

Ц+ у 0 4 1.47 ± 2.07

ч 4 4 5.87 ± 2.35 0.79 0.446

8 4 13.53 ±2.71 2.40 * 0.980

20 0 4 10 25.27 ±3.03 10.80 ±2.T3¡ 2.21 ** 0.997

10 10 18.80 ¿2.97 0.95 0.25S

100 10 16.00 + 2.90 0.61 * 0.982

1000 10 28.00 ±3.12 0.80 0.930

0 20 10.61 ±2.56

4 20 11.32 ±2.60 0.68 0.934

8 20 13.53 ±2.71 0.92 0.342

20 0 20 100 25.83 ± 3.03 3.80 ± 2.42 1.25 0.905

10 100 6.00 ± 2.53 0.47 0.940

100 100 19.80 ± 2.98 1.03 0.128

1000 100 25 00 ± 3.08 0.90 0.618

0 40 4.13 12.26

' 4 40 2.17*2.12 0.21 ** 0.991

8 40 12.47 ± 2.66 1.47 0.836

20 0 40 50 21.87 ± 2.98 6.40 ± 2.55 1.53* 0.972

10 50 14.00 ± 2.84 0.91 0.355

100 50 16.40 ±2.91 0.76 0.874

1000 50 25.60 ±3.09 0.84 0.838

0 200 9.47 ± 2.54

4 200 7.47 i 2.44 0.48 * 0.978

8 200 16.27 ± 2.81 1.19 0.618

20 200 28.27 ± 3.08 1.45* 0.982

0 500 10.20 ±2.71

10 500 19.00 ± 2.97 0.98 0.053

100 500 24.20 * 3.07 0.95 0.322

1000 500 30.80 ± 3.14 0.90 0.898

Примечание:

Нелинейны» эффекты достоверны: * - при (1-Р) < 0.05;

**-при <1-Р)< 0.01

гического типа имеют место при сочетании малой концентрации кадмия (4 мг/кг) с облучением в дозах 8 и 20 сГр (N^=2.40 и 2.21, соответствежо), а антагонистического типа - при концентрации кадмия 10 мг/кг и дозе облучения 1 Гр (Ксо= 0.61). Таким образом, на характер нелинейности (синергизм или антагонизм) в этом случае решающее влияние оказывает интенсивность воздействия повреждающих факторов.

При комбинированном действии ионизирующего излучения и нитрата свинца решающую роль играет доза излучежя. малая доза (4 сГр) в сочетании с разными концентрациями свинца вызывает антагонистические эффекты (Кю =0.21-0.48), а доза 20 сГр в этих же условиях приводит к синергизму (¡£«,=1.45-1.53). Аналогичные закономерности были обнаружены Шершуновой с соавт. (1990) и Диневой с соавт. (1993) при изучении комбижроважото действия у-иэлучежя и нитрата свинца. Хотя, как следует и» результатов наших экспериментов, свинец и не определяет тип нелинейности при комбинированном действии с ионизирующим излучением, недооценивать его опасность нельзя, поскольку с увеличением дозы облучения ослабление эффекта быстро сменяется усилением, в отличие от кадмия, с увеличением концентрации которого синергические эффекты сменяются антагонистическими. Следует обратить вжмание на то, что нелинейные эффекты взаимодействия исследованных в эксперименте факторов имеют место преимущественно в области малых значений экспозиции

Каковы же причины и молекулярные механизмы формирования наблюдаемых нелинейных аффектов? По нашему мнению, характер отхпиха биологической системы на комбинированное воздействие во многом определяется биохимическими свойствами тяжелых металлов. Хорошо известно, что ионы свинца способны воздействовать на клетку сразу по нескольким механизмам: 1) вступая в непосредственное взаимодействие с ДНК и индуцируя мутации (Relchmayr-Lals, Kurchgessner; 1984, Реутова, Шевченко, 1992); 2) частично подавляя системы репарации, сшжая эффективность их функционирования (Спитковский и др., 1992; Hartwig et а).. 1990) и увеличивая выход мутаций за счет реализации повреждений ДНК, репарировавшихся в норме; 3) оказывая общее токсическое действие вследствие образования устойчивых комплексов с аминокислотами (Динева и др., 1993). Имежо способностью свинца подавлять работу систем репарации и объясняется, по-видимому, та картина нелинейных эффектов, которая наблюдалась в нашем исследовании и работах других авторов. Действительно, если присутствие избыточного количества ионов РЬН в клетке способно частично ингибировать работу

ИНДУЦИбельных систем мутагенной репарации, то совместное действие ионов свинца и ионизирующего излучения должно приводить к антагонистическим эффектам в области малых доз (вследствие подавления мутагенной ветви репарации, обеспечивающей повышенный по сравнению с контролем выход генетических повреждений в области малых доз) и, одновременно, к сйнергическим эффектам в области средних доз (вследствие подавления мутагенной ветви репарации, обеспечивающей в этом дозовом диапазоне эффективное устранение множественных генетических повреждений).

В отличие от свинца, в основе токсичности и мутагенности кадмия лежит его денатурирующее действие на метаболически важные белки (Ваулина и др, 1978), что, по-видимому, и определяет наблюдаемую нами картину нелинейных эффектов. Действительно, если небольшие, близкие к ПДК концентрации кадмия оказывают преимущественно мутагенное действие, что в сочетании с облучением приводит к синергизму, то токсические концентрации металла, вызывая серьезные нарушения плоидности и летальные поражения клеток, практически не увеличивают частоту аберраций, что обуславливает преимущественно аддитивный и даже антагонистический характер выхода генетических эффектов. Таким образом, качественное различие наблюдаемых нелинейных эффектов взаимодействия кадмия и свинца с ионизирующим излучением обусловлено принципиальным отличием механизмов биологического действия этих тяжелых металлов.

Таким образом, в ходе проведенного исследования показано, что зависимости выхода структурных мутаций в клетках листовой меристемы ячменя от дозы (концентрации) всех изученных в эксперименте факторов имеют ярко выраженный нелинейный характер. Обнаружены достоверные нелинейные эффекты взаимодействия изученных агентов, которые преимущественно наблюдаются в области малых экспозиций. При комбинированном действии малых доз ионизирующего излучения и малых концентраций кадмия в почве имеют место синзргические эффекты, а при сочетании больших доз и концентраций - анл-агонистические. В случае комбинированного действия ионизирующего излучения и загрязнения почвы свинцом решающую роль в формировании типа нелинейности играет доза ионизирующего излучения: малые дозы в сочетании с разными концентрациями свинца вызывают антагонистические эффекты, а высокие дозы в этих же условиях приводят к синергизму. Тяжесть поражения аберрантных клеток определяется главным образом действием тяжелых металлов. 18

Полученные в ходе настоящего исследования результаты, свидетельствующие о значительном вкладе нелинейных эффектов в отклик биологической системы, особенно в области малых значений экспозиции, говорят о необходимости учета синергических и антагонистических эффектов комбинированного, действия факторов разной природы при нормировании техногетого воздействия на агроценозы.

3. Генетические последствия хронического облучения а малых дозах на Фоне комбинированного техногенного загрязнения. Полевые мелкоделяноч-ные эксперименты были проведены с апреля по август 1991 года на четырех различных по плотности загрязнения участках 30-кйлометровой зоны ЧАЭС. Объект исследования - ячмень сорта Роланд Определение дозовых нагрузок на растения проводили на основе информации о плотности загрязнения почвы, радионуклидном составе выпадений и мощностях экспозиционных доз, измеренных на высоте 1 м от

Таблица 4 Характеристики опытных делянок

Вариант опыта Коэффициент кор-

Показатель i 2 Э 4 реляции с частотой

Храпков Кожушки Радин Уласы аберрантных клеток

Плотность радиоактивно- 380 1010 7548 13915

го загрязнения. кБк/м?

Поглощенная за вегета- о.ов 0.08 1.80 3.30 -0.137 *

ционный период доза, сГр

Агрохимические характе-

ристики почвы

рН в. 5 5.3 7.3 5.2 -0.014

Нг, мг-эквЛООг 10 3.1 0.3 1.7 0.023

Э. ш-этИООг в.О 1.0 в.О 2.7 0.053

Гумус, % 2.1 2.4 1.8 1.3 0.092

Р205, мг/МОг 32.2 34.0 6.3 8.4 0.162 *

К20. мг/ЮОг 9.5 12.в 8.0 9.4 0.083

Валовое содержание тя-

желых металлов, мг/кг

Ре 4807.0 2385.2 3924.6 3627.3 0.091 + 0.093

Мп 502.9 139.7 160.7 170.7 0.2150.227 *

вл 51.6 66.6 21.5 16.8 0.069-г 0.149

гп 57.8 22.9 38.2 10.1 0.137 ¡ 0.219*

Сг 564 46.2 24.7 11.7 0.097 ^-0.178*

т 20.8 38.4 13.5 16.2 0.071 -г 0.072

РЬ 18.1 8.5 12.3 7.8 0.108 -=- 0.141 *

Со 9.2 4.6 3.1 3.2 0.10S 0.199 *

Си в.1 15.8 5.2 5.5 0.046 н- 0.053

Мо 7.2 3.9 3.6 3.9 0.101 ч 0.228 *

са 2.9 0.7 0.3 0.2 0.151 + 0.167 *

Примечание: * - корреляция значима с доверительной вероятностью 95%

Í9

почвы. Необходимые для дальнейшего анализа характеристики опытных делянок представлены в табл.4. Генотоксичность оценивали по выходу структурных мутаций в корневой меристеме проростков семян Мг поколения. Семена проращивали в чашках Петри при смешанном температурном режиме. Фиксацию проростков осуществляли в ацетоалкоголе (1:3) каждые 2 часа с 24 по 32 час проращивания при 25°С (период прохождения клеток через первый митоз); на точку брали 25 растений. Цитогенетический анализ проводили в ана-телофазных клетках апикальной корневой меристемы на давленых препаратах, окрашенных ацетоорсеином.

Из табл.5 видно, что увеличение степени радиоактивного загрязнения местности не сопровождается соответствующим ростом выхода аберрантных клеток, более того, наблюдается снижение их числа с 1.06-1.38% на экспериментальных участках с низким уровнем радиоактивного загрязнения до 0.54-0.69% на делянках с

ч ___

более высоким уровнем загрязнения. Поскольку из теоретических соображений следует, что распределение радиационно-индуцированных первичных повреждений по клеткам должно соответствовать закону Пуассона, для определения достоверности различий в выходе генетических повреждений на разных экспериментальных участках сравним соответствующие значения параметра распределения Пуассона к. Из представленных в табл.5 результатов расчетов следует, что использование классических методов математической статистики не позволяет обнаружить достоверных отличии в уровне аберраций хромосом между участками, различающимися по уровню химического и радиоактивного загрязнения.

Дальнейший анализ этого экспериментального материала был основан на бутстреп-методе. Алгоритм метода прост. Пусть имеется выборка X = {х|.хг,...,х„}

Таблица 5

Экспериментальные и расчетные характеристи выхода аберрантных клеток в корневой меристеме ячменя

Вариант опыта ............1....... 2 3 4

Доза. сГр 0.06 0 08 1.80 3.30

всего клеток 3364 8577 7215 7385

Аберрантных клеток 46 70 39 51

Среднее, % 1.38*0.20 106 ±0.13 0.54 ±0.09 0.68 ±0.10

Оценка параметра Пуассона 1

Д. • 10 87.4 44.9 28.8 34.6

ДИои-Ю"* | 2.5 4-517 9.6 + 476.8 21.3 + 443.5 15.3 -г 458

Оценка параметра Пуассона II

А • 10* 67.6 ± 14.2 45.2 ± 7.9 27.1 ±8.1 35.0 ±8.9

¡ДИ,)95« Ю"4 48.1 + 92.6 32.8 + 58.1 16.9 + 37.2 23.8 ч-46.6

Примечание: I - расчет классическим методом, II - расчет бутстреп-методом

го

Объема п .а все х, независимы и одинаково распределены в соответствии с неизвестным законом распределения Р. На основе имеющейся информации нам необходимо оценить случаин/ю величину й, которая может зависеть и от Р. и от X. Процедура оценивания Д включает следующие шаги (Эфрон. 1988):

1) построить эмпирическое распределение вероятностей Р. полагая, что каждая из точек х(, Х2..... х„ т.юьт массу 1/п;

2) на основе выборки X методом случайного выбора с возвращением сформировать бугстреп-выборку X* объема п. распределенную по закону Р: .-к,*, х*.....х* ~

Р, и оценить на ее основе к .....х„);

3) независимо повторить шаг 2) В раз, получив при этом бутстреп-значения X*1, л**-,.... л.*6 и вычислить оценки среднего значения и дисперсии для X:

Г* = С у А* I /в: о4* = ~ У(ГЬ- ?7)2.

1Й )! в-1 I

Результаты выполнения описанной бутстреп-процедуры с числом повторов В^ЮОО приведены в табл.5 и свидетельствует о том, что участки 1 и 3, 1 и 4 статистически достоверно отличаются друг от друга уровнем генетической изменчивости. Таким образом, применение бутстреп-процедуры позволило выявить информацию, которую невозможно было получить с помощью классических статистических методов.

Возникает вопрос: чем же обусловлены обнаруженные между экспериментальными участками различия? Поскольку уровень генетической изменчивости на участке 1 (Храпков), которому соответствует наименьшая поглощенная доза, достоверно превышает ряд аналогичных показателей для участков 3 и 4, повышенный уровень структурных нарушений хромосом вряд ли является следствием облучения. Наиболее вероятное объяснение выявленного феномена заключается в гено-токсическом действии других компонентов техногенного загрязнения среды, в первую очередь тяжелых металлов. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что именно участок 1 характеризуется их повышенным содержанием (табл.4).

Тахже, как и в лабораторных экспериментах, хроматидные и геномные аберрации преобладают на всех участках. Вклад хромосомных аберраций составляет всего 6%. Было выявлено три хромосомных фрагмента при дозах 0.06, 0.08 и 3.30 сГр. Анализ удельного вклада мостов (как одного из наиболее тяжелых повреждений) в общее число аберраций показывает, что в клетках растешй с участкоз 2-4

одиночных мостов в 4.5-6 3 раза меньше, чем одиночных фрагментов, а двойные мосты вообще отсутствуют. Участок 1. который характеризуется наименьшей поглощенной дозой и наибольшим уровнем химического загрязнения, демонстрирует другой характер распределения типов структурных мутаций, здесь зафиксировано два двойных моста, а количество одиночных мостов всего лишь в 1.7 раз меньше, чем количество хроматидных фрагментов. В рассмотренных выше лабораторных экспериментах первые двойные мосты наблюдали при облучении дозами, на 1-3 порядка Солее высокими. Таким образом, сохраняется тенденция, выявленная в вегетационном эксперименте (раздел 2): тяжесть повреждения клеток в большей степени определяется действием химических агентов, чем ионизирующего излучения.

Для идентификации агентов, вносящих наибольший вклад в наблюд аемую онтогенетическую изменчивость, была проанализирована 18-мерная (11 тяжелых металлов, 6 агрохимических характеристик и поглощения доза) поверхность отклика использованной в эксперименте тест-системы. В табя4 представлены оцеши коэффициентов корреляции включенных в анализ предикторов с числом аберрантных клеток в корневой меристеме проростков ячменя; приведенные интервалы их значений обусловлены имеющейся информацией о вариабельности содержания тяжелых металлов в почве опытных участков. Несмотря на то, что абсолютные значения коэффициентов корреляции малы. 9 предикторов (содержание в почве Мп, Сс). 2п. Р,05, Мо, Со, Сг. РЬ и поглощенная за вегетацию доза) статистически достоверно (р<0.05) связаны с уровнем аберрантных клеток Чтобы выявить тонкую структуру корреляционного поля и значимость установления« связей, для 5-ти предикторов, имеющих наибопьиую корреляцию с выходом аберрантных клеток - концентрация Мп, С4 2п и Рт06 в почве и по-тощежая доза - были расчигзны значения частных коэффициентов корреляции, которые являются показателем "очищетэйГ от других "мешающих" факторов связи, усредненной по всевозможным значениям фиксируемых на определенна« уровнях "мешающи/ переменных (Айвазжи др.. 1985). Анализ значений часпых корреляций показал, что с выходом аберрантных клеток статистически достоверно связано лишь содержание в почве Мп и РА- Значимого влияния дозы ионизирующего излучения на уровень генетичеомх повреждений в гро-ростках семян ячменя М2 не обнаружено.

Таким образом, уровень цитогенетических повреждений в клетках корневой меристемы семян ячменя, выращенных в 30-км зоне Чернобыльской АЭС, не имеет достоверной связи с поглощенной за вегетационный период дозой в диапазоне 0.063.30 сГр. Установленное значимое различие между экспериментальными участками по ряда цитогенетических показателей обусловлено, по-видимому, тенотоксиче-ским действием нерадиационных факторов. 22 -

выводы

1. Разработана и применена к анализу конфетного экспериментального материала система принципов и методов количественной оценси отклика биологической системы на комбинированное воздействие повреждающих факторов разной природы. ориентированная на сложные реальные ситуации, которые характеризуются большим числом одновременно действующих факторов, наличием нелинейных (антагонизм, синергизм) эффектов взаимодействия повреждений, небольшим превышением экспозиции к отдельным агентам над фоновым значением и малым объемом доступной исследователю экспериментальной информации.

2. Зависимость выхода генетических нарушений в клетках листовой и корневой меристем сельскохозяйственных растени. от дозы ионизирующего излучения или концентрации солей тяжелых металлов (свинца, кадмия) в почве в области малых значений экспозиции имеет нелинейный характер. Качественное различие эмпири-

. ческих зависимостей обусловлено различием механизмов биологического действия исследованных агентов.

3. При исследовании закономерностей выхода структурных мутаций в корневой меристеме облученных ионизирующим излучением семян ячменя выявлен участок дозовой зависимости (1-10 Гр), в пределах которого частота аберрантных кпетох статистически достоверно превышает спонтанный уровень и нз зависит от величины дозы.

4. При исследовании выхода цитогенетических повреждений в листовой меристеме ячменя, индуцированных комбинированным действием ионизирующих излучений и загрязнения почвы солями тяжелых металлов (свинец, кадмий) показано наличие статистически достоверных нелинейных эффектов (синергизм, антагонизм), которые преимущественно проявляются в области малых значений экспозиций изученных агентов.

При сочетанном действии ионизирующих излучений и загрязнения почвы солями кадмия тип нелинейности определяется интенсивностью воздействия: в диапазоне малых доз и концентраций имеют место синершческие эффекты, в диапазоне более высоких экспозиций • антагонистические.

В случае комбинированного действия ионизирующих излучений и загрязнения почвы свинцом решающую роль в формировании закономерностей выхода повреждений играет доза ионизирующих излучений: малые дозы в сочетании с разными

концентрациями свища вызывают антагонистические эффекты, а высокие дозы в этих же условиях приводят к синергизму.

Тяжесть повреждения аберрантных клеток определяется главным образом действием тяжелых металлов.

5. Цитогенетический тест "частота аберрантных клеток в ингеркалярной меристеме листьев" является достаточно чувствительным и информативным и может быть использован в качестве биологической тест-системы для индикации слабых воздействий техногенных факторов разной природы. В частности, по чувствительности к действию ионизирующих излучений он сравним с классическим тестом "частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека" и позволяет достоверно регистрировать иццуцированные структурные мутации при дозах порядка единиц сГр.

6. Уровни» цитогенетических повреждений в клетках корневой меристемы семян ячменя, выращенных в условиях комбинированного радиационного и техногенного загрязнения 30-километровой зоны ЧАЭС, не имеет достоверной связи с поглощенной за вегетацию дозой в диапазоне доз 0.06-3.30 сГр. Установленное значимое различие между экспериментальными участками по ряду цитогенетических показателей обусловлено действием агентов нерадиационной природы.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Гераськин С.А., Эяблицкая Е.Я., Удалова А.А., Бабчаник Л.Н. Генетические эффекты у растений в условиях комбинированного радиоактивного и техногенного загрязнения 30-километровой зоны ЧАЭС II Проблемы смягчения последствий Чернобыльской катастрофы. Брянск, 1993. С.360-363.

2. Удалова А.А., Зяблицкая Е.Я., Гераськин С.А. Статистический анализ закономерностей индукции аберраций хромосом малыми дозами облучения II Радиобиологический съезд. Тезисы докл. Т.З. Пущино, 1993. С.1018.

3. Гераськин С.А., Зяблицкая Е.Я., Удалова А.А. Статистический анализ мутагенной эффективности хронического облучения в малых дозах на фоне техногенного загрязнения среды//Генетика, 1993. Т.29. N11. С.1901-1913.

4. Udalova А.А., Geraskin S.A., Dikarev V.G. Development and experimentat justification of combined effect investigation methodology // In: 26 Annual Meeting оf the Eurbpean Society for Radiation Biology. Abstracts. Amsterdam, 1994. P077.

5. Udalova A.A., Geraskin S.A., Dikarev V.G. Criterions and methods of quantitative estimation of ecological risk under conditions of combined radioactive and technogenous

environmental contaminaUon//In: 2 International Conference «Radiobiological Consequences of Nuclear Accidents», Abstracts. Moscow, 1994. p. 288.

6. Гераськин С. А., Зяблицкая E. Я., Удалова A.A. Закономерности индукции -у-радиацией структурных мутаций в корневом меристеме проростков семян гексаплоидной пшешщы//Радиацпонная биология. Радиоэкология. 1995. Т. 35. Вып. 2. С. 137—149.

7. Geraskin S.A., Zjablitzkaja Ye. Ya., Udalova A.A. Induction of structural mutations by low doses of radiation in agricultural plants//10 International Congress of Radiation Research. Abstracts. Wurzburg, 1995. p. 386.

8. Udalova A.A., Geraskin S.A., Dikarev V. G. Induction of chromosome aberrations by radiation + heavy metals//I0 International Congress of Radiation Research. Abstracts. Wurzburg, 1995. p. 384.

9. Гераськин С. А., Дикарев В. Г., Удалова A.A., Дикарева Н. С., Алексахин Р. М. Закономерности индукции структурных мутаций в листовой меристеме ячменя в условиях комбинированного действия ионизирующего излучения и тяжелых ыеталлов//Доклады Академии наук. 1995. Т. 343. № 6.

10. Гераськин С. А., Дикарев В. Г., Дикарева Н. С., Удалова A.A. Индукция ионизирующим излучением и тяжелыми металлами генетических эффектов в листовой меристеме ячменя. I. Раздельное действие//Ге-нетика. 1996. Т. 32. Лз 2.

11. Гераськин С. А , Дикарев В. Г., Удалова A.A., Дикарева Н. С. Индукция ионизирующим излучением и тяжелыми металлами генетических эффектов в листовой меристеме ячменя. II. Комбинированное дейст-вие//Генетика. 1996. Т. 32. Да 3.

12. Гераськин С. А., Зяблицкая Е. Я., Удалова A.A. Закономерности Еыхода структурных мутаций в корневой меристеме облученных ионизирующим излу е:шем семян ячменя.//Радиационная биология. Радиоэколо-

гия. 1996. Т. 36.

Заказ 1726 Тираж 100 Формат 60x84'/i« Объем 1 и. л.

Отпечатано в Обнинской городской типографии г. ОЗшшск, ул. Комарова, 6