Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие α-спиральных пептидов в биомембранах: моделирование методом Монте-Карло

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие α-спиральных пептидов в биомембранах: моделирование методом Монте-Карло"

па праплх рукописи

УДК 533.9

ВЕРЕЩАГА ЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

Взаимодействие а-спирапьных пептидов в биомембранах: моделирование методом Монте-Карло.

/

03.00.02. - биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

I

Москва 2005

Работа выполнена в Лаборатории структурной биологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии Факультета молекулярной и биологической физики Московского Физико-Технического Института.

Научный руководитель:

Доктор физико-математических наук Ефремов Роман Гербертович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Короткое Евгений Вадимович

Доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович

Ведущая организация:

МИФИ, Факультет экспериментальной и теоретической физики, Кафедра прикладной математики.

Защита состоится 15 декабря 2005 г. в час. мин на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ. Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

В.Е. Брагин

♦¿'¿оот

ШЫ10СТ1. проблемы.

Исключительно важная роль мембранных бел ко» (МБ) в клетке обусловлена их способностью детектировать и передавать сигналы через линидный бислой, осуществлять транспорт ионов и различных веществ, участвовать в слиянии мембран и т.п. Понимание связи между структурой МБ и их функцией представляет собой одну из актуальных и интереснейших задач структурной биологии. Решение указанной проблемы имеет и большой практический интерес. В частности, МБ являются привлекательными объектами для создания новых лекарственных препаратов. Многие такие белки содержат в своих мембранных доменах несколько участков полипептидной цепи и/или функционируют в олигомерных состояниях - в виде димеров, тримеров и т.д. Механизмы ассоциации и межбелкового узнавания, играющие важную роль в ряде клеточных процессов [1-2], являются ключом для понимания функционирования белковых комплексов. В связи с этим, большой интерес представляют задачи по изучению детальных молекулярных механизмов межбелковых взаимодействий в такой гетерогенной среде, какой является липидный бислой. Получение структурной информации о процессах олигомеризации белков в мембранах с помощью современных экспериментальных методов крайне затруднено из-за больших сложностей с выделением, очисткой, приготовлением образцов [3]. Многообещающей альтернативой в решении данной проблемы является применение методов компьютерного моделирования.

Наиболее подходящими объектами для разработки и тестирования таких методов являются а-спиральные комплексы в мембранах. Эти системы достаточно стабильны и состоят из гидрофобных и/или амфифильных а-спиралей. Появление единственной на сегодняшний день пространственной модели трансмембранного (ТМ) димера гликофорина А человека ((ЗрА) [4] стимулировало разработку теоретических методов исследования взаимодействия а-спиралей в мембранных доменах белков. В настоящее время предпринимаются лишь первые попытки создания указанных подходов. Предлагаемые методики характеризуются целым рядом ограничений, возникающих вследствие сложности корректного представления влияния мембранного окружения [5-7]. Цели настоящей работы:

- разработка теоретического метода предсказания пространственной структуры а-спиральных димерных комплексов в мембранном окружении;

- применение разработанного подхода для моделирования димерных комплексов с неизвестной пространственной структурой.

Ha j а щиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Разработана методика моделирования а-спирапьных димерных комплексов методом Монте-Карло (МК) с использованием модели неявно заданной мембраны (на примере димера GpA).

2. Моделирование без учета мембранного окружения не позволяет корректно описать поведение ТМ а-спиралей GpA.

3. Предложенная методика адекватно описывает следующие аспекты поведения а-спиралей GpA в бислое: а) Пептиды, сохраняя а-спиральную хонформацию, встраиваются в мембрану в ТМ положении и образуют днмеры в ориентации «голова к голове»; б) Конформации низкоэнергетических состояний хорошо согласуются с данными мутагенеза; в) Найдена группа димерных состояний, структура которых близка к установленной экспериментально с помощью спектроскопии ЯМР.

4. Предложена альтернативная модель димера, также хорошо согласующаяся с данными мутагенеза и удовлетворяющая ограничениям на расстояния, полученным методом спектроскопии ЯМР.

5. Впервые проведено моделирование пространственной структуры димера ТМ сегмента белка BNIP3 с помощью предложенного подхода. Полученные модели хорошо согласуются с данными мутагенеза.

6. На основании анализа гидрофобных/гидрофильных характеристик ТМ сегментов GpA/BNIP3 и расчетов МК предложены мутантные формы ТМ пептида BNIP3, потенциально обладающие улучшенной димернзационной способностью.

Научное значение и новизна работы.

Разработана новая теоретическая методика, позволяющая предсказывать пространственную структуру а-спиральных димерных комплексов в мембранном окружении. Подход не подразумевает использования априорной информации ни о расположении субъединиц в комплексе, ни об их ориентации относительно мембраны. Метод дает возможность охарактеризовать особенности спираль-спирального взаимодействия в мембранном окружении, а также идентифицировать а.к. остатки, важные для димеризации. Практическое значение работы.

Применение разработанного подхода открывает перспективы конструирования пептидов с заданными свойствами, например, с измененной димернзационной способностью. Полученные результаты помогут создавать de novo пептиды, обладающие (или, наоборот, не обладающие) высокой аффинностью друг к другу, либо к заданным пептидам-мишеням, что имеет большое значение для разработки новых лекарственных препаратов, вакцин и т.д. В частности, данная методика может оказать существенную

помощь в проектировании пептидов-ингибиторов для ражоображых ТМ рецепторов, пептидов с канал-образующей активностью и т.д.

Таким образом, создан подход для дальнейшего изучения димеризации белков с неизвестной пространственной сгруктурой. Высказанные в работе гипотезы и созданные модели дают возможность их проверки в эксперименте, что будет стимулировать дальнейший прогресс в понимании физико-химических закономерностей, определяющих механизм олигомеризации пептидов и белков в липидных бислоях, и позволит усовершенствовать существующие алгоритмы моделирования этих сложных систем. Публикации и апробация.

Основные результаты работы изложены в статье, опубликованной в Journal of Chemical Theory and Computation, и в двух статьях, направленных в печать. Материалы диссертации докладывались международном симпозиуме «Пептид-мембранные взаимодействия» (Намюр, Бельгия, 2004), на 4-ой международной конференции по биоинформатике (Новосибирск, 2004), международной конференции по вычислительной молекулярной биологии (Москва, 2003), на 10-ом германо-российском пептидном симпозиуме (Тюрингия, 2003), на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), на 15-ой и 14-ой зимних международных молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003/2002).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа имеет следующую структуру: Во Введении (Глава I) сформулированы основные цели и задачи, их взаимосвязь с общими тенденциями развития моделирования олигомерных взаимодействий в а-спиральных комплексах. Глава II представляет собой обзор литературы, посвященный известным теоретическим моделям упаковки спиралей. Рассматриваются наиболее изученные экспериментально димерные комплексы, представляющие интерес для биомедицинских применений. Полученные результаты и их обсуждение представлены в Главе III, состоящей из 2-х разделов. В разделе Ш.1 на примере димера GpA показана поэтапная разработка методики моделирования димерных комплексов в гетерогенном мембранном окружении. В разделе Ш.2 предложенный подход использован для исследования возможных механизмов димеризации ТМ сегмента белка BN1P3, пространственная структура которого еще не установлена. Глава IV (Заключение) содержит перечень основных результатов работы, обсуждение их научно-практического значения, а также дальнейшие перспективы исследований в данной области. Завершает диссертационную работу Список литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. ВВЕДЕНИЕ

В первой главе обосновывается необходимость применения методов молекулярного моделирования для исследования ассоциации а-спирапьных пептидов в мембранном окружении, сформулированы направления и цели исследования.

II. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ.

В данной главе рассматриваются основные принципы образования а-спиральных

комплексов в мембранном окружении. Проведен обзор нескольких белков, функционирующих в димерном состоянии и активно изучаемых в настоящий момент в мире. Рассматриваются существующие на сегодняшний день подходы в молекулярном моделировании ассоциации ТМ а-спиралей.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

111.1. Разработка методики моделирования пространственной структуры а-спиральных димеров в мембранном окружении на примере димера гликоЛорина А (GoА).

В данной главе описана поэтапная разработка методики моделирования пространственной структуры димерных а-спиральных комплексов в мембранном окружении на примере ТМ сегмента (S69EPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRR97) гликофорина А человека.

111.1.1. Моделирование мономера GpA в «вакууме».

Расчет мономера GpA в «вакууме» приводит к нарушению а-спиральной структуры в области, наиболее подверженной конформационным перестройкам: Gly79-Glygi (Рис.1А-В) (структуры такого вида в дальнейшем будут называться «шпильками»). Существенное влияние на формирование подобных состояний оказывают пары заряженных аминокислотных остатков на концах - Glu7o,7i и Arg%,97- Противоположно заряженные группы атомов формируют выгодные электростатические контакты. Ранее [89] поведение мономера было изучено с применением модели неявно заданной мембраны. В этом случае наиболее энергетически выгодным состоянием является ТМ а-спираль (Рис.1Д). Таким образом, наличие сольватационного терма, имитирующего гетерогенное мембранное окружение, препятствует образованию нековалентных взаимодействий между удаленными по последовательности остатками. Структура пептида определяется балансом следующих групп энергетических вкладов: сольватационного терма и энергии водородных связей - с одной стороны, и ван-дер-ваальсовых и кулоновских взаимодействий - с другой. Пренебрежение эффектами среды приводит к преобладанию взаимодействий второй группы и, следовательно, к дестабилизации вытянутой а-спирапьной конформации и образованию «шпильки».

в в Рисунок 1. МК расчет и-спиральных мономеров ОрА в

«вакууме» (А-В) и в мембране с ТМ потенциалом (Г-Д). •VI А-, А) Стартовая структура а-спирального мономера ОрА в

"¡'¡¡У^/ "«С^ «вакууме»; Б-В) Ншкоэнсргстичсскис конформации тина 3 У п«^ »/ «шпилька». Г) Стартовая конформация «развернутой» полипептидной цепочки ОрА. Д) Низкоэнсргетическос состояние в мембране - а-спирапь. Ленточной А диаграммой обозначена а-спиральная структура

мономера. и "С" - N и С - концы, соответственно. Значками «+» и «-» указаны заряженные остатки Аодб-от, ^ 01и»72, соответственно. Выделены боковые цепи этих

- остатков и тяжелые атомы их полипептидной цепи.

ч Границы а-спнральных сегментов обозначены числами,

¡1 соответствующими номерам а.к. остатков.

III. 1.2. Моделирование двух а-спиралъных сегментов в «вакууме».

Среди низкоэнергетических состояний наблюдали два вида топологий: «спираль-шпилька» и димерные состояния в ориентации «голова к хвосту» (антипараллельный димер, Между мономерами возникает образование ряда выгодных ван-дер-

ваальсовых и электростатических контактов, что, по-видимому, приводит к стабилизации а-спиральной конформации (Рис. 2). Образуется большое число выгодных электростатических контактов на концах мономеров (Рис. 2). В центральной части димера плотной упаковки между а-слиралями не наблюдается, что хорошо видно из Рис.2Б-В, поэтому взаимодействуют мономеры преимущественно за счет остатков с длинными боковыми цепями.

Таким образом, межмономерные контакты для структур, рассчитанных в «вакууме», сильно отличаются от «мотива димеризации» ЫххОУххСУххТ (где х - любой остаток), установленного для врА экспериментально. По-видимому, мембранная среда оказывает существенное влияние как на взаимную ориентацию мономеров (в структуре, полученной методом спектроскопии ЯМР (в дальнейшем - модель СрАямр), мономеры расположены «голова к голове»), так и на плотность их упаковки. Следовательно, необходимо рассмотреть механизм межмолекулярного взаимодействия с учетом гетерогенного окружения «вода-мембрана-вода». Ниже приводятся результаты, полученные с использованием подобной модели, в которой обе поверхности эквивалентны с точки зрения их математического описания. В этом приближении модель представляет собой мембрану без приложенного ТМ электростатического потенциала.

в

5^2

чЛ»

Рисунок 2. Моделирование двух а-спиральных мономеров йрА в «вакууме». А) Исходное расположение мономеров относительно друг друга: показан мономер 1 и различные положения мономера 2 (2, 2', 2"); Б-В) Ниэкоэнергетические димерные конформации. Буквенными обозначениями показаны остатки, образующие межмономерные контакты, серым цветом выделены а.к. остатки, совпадающие с данными мутагенеза [10]. Остальные детали - как в подписи к Рис. 1.

III. 1.3. Взаимодействие а-спиральных сегментов в мембранах разной толщины без приложенного ТМ потенциала.

/

2

Рисунок 3. Расположение мономеров в стартовых состояниях при расчете методом МК (А-В). Г) Стартовая структура димера СтрАлм^. «1» и «2» -мономеры I и 2, соответственно. Серым цветом обозначена гидрофобная область мембраны.

МК-поиск низкоэнергетических

г ч состояний с произвольно заданных стартовых

положений а-спиральных мономеров (Рис. 3)

показал, что обеим субъединицам

энергетически выгодно принять ТМ ориентацию - при этом практически все гидрофобные

остатки располагаются в неполярной области (\г\ < й, где О - толщина мембраны, г -

координата Ъ атомов остатков, ось Ъ перпендикулярна плоскости мембраны),

имитирующей липидный бислой, а полярные и заряженные остатки экспонированы в

водную фазу.

Из Рис. 4 видно, что мономеры взаимодействуют друг с другом, образуя комплексы с различной структурой Среди низкоэнергетических состояний обнаружены следующие виды топологий - антипараллельный ТМ-димер (ТМц, Рис. 4-.А1-2, БЗ, В1), параллельный ТМ-димер (ТМц Рис 4:Б4), «спираль-шпилька» (Рис. Ш.4:В5), «шпилька-шпилька» (Рис. 4:В6), нетрансмембранные димеры. Заметим, что «шпильки» образовывались только при Э = 36 А (Рис 4В) и 40 А, а нетрансмембранные димеры - при Э = 40 А (не показаны).

Анализ отдельных энергетических термов полученных комплексов свидетельствует о том, что оба типа состояний, ТМц и ТМц, характеризуются низкой энергией

взаимодействия со средой Симметричиая модель мембраны не создает выделенного направления для липольных моментов «-спиралей, поэтому оба типа димеров (ТМц и ТМ^) являются энергетически выгодными состояниями. Очевидно, что структуры ТМц гораздо более стабильны в мембране без ТМ потенциала - учитывая значительную величину дипольного момента а-спирали врА (-90-100 Дебай), можно ожидать, что наличие ТМ электростатического потенциала (А\|/ Ф 0) будет приводить к значительному повышению энергии таких конформаций.

Рисунок 4. Низкоэнсргетичсские конформации димеров ОрА, полученные методом МК в симметричной мембране разной толщины (Е>=24А; ЗОА; ЗбА). Цифрами обозначены группы выделенных состояний.

' Многие обнаруженные группы состояний

Б наблюдаются лишь при одном из значений О.

Исключение составляет группа 1 состояний с

<

| параметрами: <1 ~ 9.5 ± 0.5 А и |0| = 160' ± 10' (здесь <1 и

о

0 - расстояние и угол между осями а-спиралей) (Рис. 4:А1,В1), которая присутствует при всех значениях И. В этом наборе структур интерфейс димеризации формируется посредством аминокислотных остатков ЫххОУххОхххТххЫ, что хорошо согласуется с данными мутагенеза (ЫххОУххОУххТ). Видно, что даже при антипараллельной ориентации мономеров образуются схожие контакты, обеспечиваемые специфической последовательностью пептида. Замечено, что плотные контакты между а-спиралями позволяют мономерам синхронно «подстраиваться» под толщину мембраны (Рис. 4А1.В1), т.е. угол наклона осей спиралей по отношению к плоскости мембраны (ср) меняется одновременно на одну и ту же величину при увеличении толщины мембраны от 24 до 36 А. Так, при Е>=24 А угол наклона каждого из мономеров составлял <р( = <р2 = 45"( Рис. 4А1), при 0=30 А - ф] = фг ~ 60", а при О =36 А ф1 ~ ф2 ~ 75' ( Рис. 4В1) (ф1 и <р2 - углы наклона мономеров 1 и 2, соответственно). При такой «подстройке» гидрофобный участок каждого из мономеров врА наилучшим образом контактирует с гидрофобной областью мембраны, что хорошо согласуется с известным эффектом «гидрофобного/гидрофильного соответствия», наблюдаемого экспериментально [11]. Таким образом, мы полагаем, что в дополнение к описанным выше факторам, важным для стабилизации ТМ а-спиральных олигомеров, на формирование структуры также оказывают существенное воздействие электростатические взаимодействия и эффект «гидрофобного/гидрофильного соответствия».

111.1.4. Моделирование с электростатическим потенциалом на Л1ембране.

Присутствие разности потенциалов на мембране имеет большое значение для многих процессов в клетке, например, для явлений, связанных с запасанием и преобразованием энергии, для управления транспортом ионов и молекул через мембрану, для встраивания белков в липидный бислой, и т.д. [12]. ТМ потенциал может играть существенную роль во взаимодействии белков с мембраной и в процессах сборки мсмбраиосвязанных белковых фрагментов. Следует ожидать, что при этом влияние Ду будет особенно значительным для а-спиральных пептидов, обладающих большим значением дипольного момента. Учет изменения потенциала вдоль нормали к плоскости мембраны (координата ъ, Д V = 300 мВ) описывали энергетическим термом ( последний добавляли в выражение для полной энергии системы) следующего вида: м

Ек¥ = (М (<//£>)£ , где и - парциальный заряд и координата Ъ атома 1, Р -

1-1

константа Фарадея. В случае |>г0, £дг = 0 [9].

МК поиск с трех независимых стартовых положений спиралей (ЗрА друг относительно друга и относительно мембраны показал, что низкоэнергетические состояния (с энергией в диапазоне [Ешн, Еи1Ш + ДЕ], где Еит • минимальная энергия, ДБ = 15 ккал/моль), характеризуются следующим образом. Как и в случае симметричной (Ду = 0) мембраны, мономеры хорошо сохраняют а-спиральную конформацию (Рис. 5). При этом каждая из а-спиралей принимает ТМ ориентацию, мономеры образуют плотно упакованные комплексы в мембране в ориентации «голова-к-голове».

1 2 (ОрАмф 3 * « ОрАанщп.

Рисунок 5. Низкоэнергетические состояния, рассчитанные методом МК в неявно заданной мембране с приложенным ТМ потенциалом (1-6). Номера групп соответствуют номерам групп в Табл. 1. врАямг-ио - низкоэнергетическос состояние, полученное в результате моделирования методом МК в мембране при старте с экспериментально установленной структуры (Рис.ЗГ) [4]. Остальные детали см. в подписи к Рис. I

Приложенный потенциал существенно влияет на геометрию упаковки ТМ а-спиралей (ЗрА в димере при Ду * 0. Среди низкоэнергетических структур наблюдаются разнообразные типы упаковки спиралей (Рис. 5), отличающиеся значениями параметров <1 и 0 (Табл. 1). Тем не менее, во всех этих структурах в спираль-спиральных контактах участвуют остатки, важная роль которых в процессе димеризации врА была установлена экспериментально [4].

Таблица I. Параметры групп низкоэнсргстичсскнх состояний, рассчитанных в несимметричной (йу Ф 0) мембране.__

Группа' (/ 2 в1 Интерфейс димеризации' Е ' (-МММ. Е ''МЛСК К

1 ГТМтт) 10. (0. 1 1) -50 1 (0.5) 8ЕРЕГГШР№ММЙГ1<Я1ЫЛ8УС1|<!> п т у т 1(1 «И 1» I 629 (0 8 5) 18.2 (0.2) -370.4 (0.3) 191.В (0.4)

2 (СРАмк) ^ 9. (0. 1 -25.9 (1 4) I Е.ЛДТРУ да ч г 628. (4 4 4) 17.4 (0 4) -372.7 (2 5) -192.0 13 71

(ТМн)

3 (ТМТ1) 9. (0. 2 1) 22.1 (1.1) -'-ннн^;-0- -632 (1 .4 .7) 18.9 (0.2) -382.3 (1.5) -185.9 (0.6)

4 (ТМп) 6. (0. .9 .1) 42.6 (0.8) -629 (1 .3 .61 21.6 10.«) -392.3 (1.41 -174.8 (0.7)

5 (ТМП)' 5 (0. .5 .2) 60.2 (2.0) -626 (2 .5 • 9) 19.3 (1.3) "-378.6 (3.0) -190.2 (1.2)

« (ТМтт) 9 (0. .0 .1) 5.9 10.2) _I_I и I_I_1_ —в д и а <*—>1—о— -626 <2 .9 .7) 18.8 (0.3) -379.3 (1.9) -188.0 (1.3)

ОрАямг^ем« (ТМгт) 7 (0 .1 • 1) -39.8 (0 3) _Е ■ ■ И | I гб 1 1 I I -622.3 (1.0) 20.6 (0.2) -382.5 (3.7) -187.0 (2.8)

1 Номера групп соответствуют номерам групп на Рис 5 ТМгт - димеры в параллельной ориентации, соответственно.

2 <1 и в - средние значения расстояния (в А) и угла (в град.) между осями а-спиралей. В скобках приведены значения стандартных отклонений.

1 Остатки, найденные на интерфейсе димеризации, обозначены буквой. Серым цветом окрашены а.к остатки на интерфейсе димеризации, совпадающие с данными мутагенеза [10].

4 Е<тт, "......... Ещп* - полная энергия, энергия электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий,

энергия сольватации (ккал/моль), соответственно. В скобках приведено стандартное отклонение.

5 (ЗрАик - группа расчетных конформеров, наиболее близкая к структуре димерв (ОрА*мг), установленной экспериментально [4].

ОрАямг-м«* - низкоэнергетичесиие состояния, полученные при моделировании методом МК при старте с экспериментально установленной модели СЗрАямг структуры (Рис.ЗГ) [4].

Интересно также, что возможны варианты укладки спиралей как с положительными (кластеры 3-6, Табл. 1), так и с отрицательными (кластеры 1-2, Рис. 5, Табл. 1) значениями угла 0. Первые из них отвечают двойной суперспирали с левой закруткой, а вторые - с правой. Среди состояний с 0 < 0 наилучшее совпадение с экспериментально установленной структурой (}рАямг (<1 * 7 А, 0 « -40°) наблюдается у состояний из кластера-2: <1 ® 8.3 А, © ® -27* (Табл. 1, Рис. 5), хотя расстояние между мономерами в них несколько превышает наблюдаемое в ЯМР-моделях. (В дальнейшем эта структура обозначается символом ОрАмк ) Именно для подобных состояний интерфейс димеризации полностью симметричен и практически не отличается от обнаруженного по данным мутагенеза и ЯМР.

Ш.1.5. Сравнительный анализ моделей димера, полученных с помощью спектроскопии ЯМР и рассчитанных методом Монте-Карло.

Особый интерес представляет набор рассчитанных состояний, обладающих плотной упаковкой спиралей и левой закруткой друг относительно друга (0 > 0). К ним относятся состояния из кластеров 4 и 5 с параметрами (d ~ 7.0 А; 0 ~ 40') и (d = 6.0 А; 0 = 55*), соответственно (Табл. 1). Мономеры в указанных кластерах образуют выгодные ван-дер-ваальсовы контакты, обладают энергетически выгодной симметричной и плотной упаковкой a-спиралей за счет контактов в их центральной части - посредством мотива GVxAGxxG. На наш взгляд, наличие структур такого типа поднимает вопрос о возможном существовании моделей димера GpA, альтернативных полученным по данным ЯМР-спектроскопии. Заметим, что основанием для построения моделей GpA Энгельманом и др. являлись данные мутагенеза, позволившие определить остатки, участвующие в димеризации [10], а также набор из пяти пар ограничений на расстояния между мономерами, полученный из анализа сигналов ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) в спектрах ЯМР [4]. Возможно ли существование гипотетической структуры димера с 0 > 0°, удовлетворяющей данным мутагенеза [10] и ЯМР [4] ?

Для ответа на этот вопрос был проведен следующий вычислительный эксперимент. Полученная методом МК конформация димера с параметрами d = 6.0 А, в ~ 55' была выбрана в качестве структурного шаблона для построения искомой модели. На ее основе сконструирована конформация димера, состоящего из идеальных а-спиралей, ориентированных друг относительно друга как в исходной МК-модели ( в дальнейшем эта структура обозначается символом GpA[.). Анализ экспериментальных данных по ограничениям на межмономерные расстояния [4] для моделей СрАямр, GpAL и GpAmk показывает, что суммарные значения нарушений достаточно близки. ( Для 19 моделей димера GpA, рассчитанных на основе ограничений ЯМР, среднее отклонение от ограничений составило 0.74 ± 0.07 А, для моделей GpAt и GpAMK суммарное значение нарушений -1.10 А и 2.17 А, соответственно.) Следовательно, пространственная структура гипотетической модели GpA|_ в целом не противоречит имеющимся данным ЯМР-спектроскопии. Анализ упаковки мономеров в модели GpAL показывает, что интерфейс димеризации в ней сформирован остатками I76XXG79V80XA82G83XXG86XXL89L90 (Табл. 1). Заметим, что ряд остатков, важная роль которых в димеризации была установлена с помощью мутагенеза, формируют интерфейс спираль-спираль в модели с в > 0°. Это -Leuis, liéis, Gly79, ValM, Gly«, Thrgi. Кроме них, в межспиральном взаимодействии участвуют Gly*6, Leuj?, Leu«. Согласно данным мутагенеза, замена каждого из указанных остатков может существенно влиять на процесс димеризации, хотя в итоговой модели Энгельмана они не лежат на межмономерном интерфейсе.

III. 1.6. Гидрофобная оргашиация а-спирш/ьиых Химерных комплексов GpA.

Одним из критериев качества пространственных моделей димера может служить характер распределения их гидрофобных/гидрофильных свойств на поверхности каждою из мономеров. В частности, комплементарность таких свойств в областях контакта спираль-спираль и спираль-мсмбрана характерна для ТМ сегментов белков. Для оценки гидрофобных свойств a-спиралей GpA использовали метод молекулярного гндрофобною потенциала (МГП), который ранее успешно применялся для изучения мембрано-связанных а-спиралей [13]. На Рис. 6 представлены двумерные карты гидрофобности, рассчитанные для одной из о-спиралей (69-97) в моделях (ЗрАямр. GpAL и GpAMK-

Д£В Рисунок 6. Распределение

гидрофобных / гидрофильных свойств и димерная унаковьа Вверху: Июпотенциальные

двумерные карты молекулярно! о гидрофобного потенциала (МГП) на поверхности а-спиральных

мономеров в днмерных комплексах. Серым цветом окрашена область межмономерных контастон в димерных структурах: А) СрАям,.. Б) GpAMK; В) GpAL- Переменная пи оси X - угол вращения относительно оси спирали Переменная по оси Y- смешение вдоль оси спирали. Показаны только области с МГП > 0 09. контурные линии построены с интервалом 0.015 Позиции остатков показаны буквенными обозначениями. Карты рассчитаны, как описано в [13]. Внизу Модели соответствующих димеров

Пептиды изображены с помощью ленточных диаграмм, в области димерного интерфейса показаны атомы структуры Остатки Gl> окрашены в черный цвет. Val - в серый, Не» н Thr17 - в темно-серый. Неполярная область мембраны окрашена в светло-серый цвет

Контурными изолиниями показаны только наиболее гидрофобные области поверхности, обладающие высокими значениями МГП. Характерной особенностью поверхности о-спирали является ее высокая степень гидрофобности и наличие относительно более полярного «А-образного» паттерна, формируемого остатками Sery>. Thrs7, Glym, С1у?9, Gly*6 и Gly«. Можно предположить, что a-спирали GpA могут взаимодействовать посредством контактов между остатками, которые образуют протяженную область полярности на их поверхности. В тгом случае обеспечивается высокая степень комплементарности между их полярными участками, а большая часть гидрофобной поверхности экспонирована в неполяриое липидное окружение. В принципе, согласно предложенным критериям, для a-спиралей GpA возможны два варианта yk.ia.ikii

- с участием остатков, формирующих левый (Бсгчг, ТЬг*7, С1ун, С1у7о) и правый (01уи4, 01ух(.. 01у?->) «рукава» «Л-образного» пагтерна. Интересно, что именно эти два варианта и реализуются как в реальном, так и в вычислительном экспериментах. 13 частности, в моделях с правой закруткой а-спиралей (СрАяме и йрАмк) интерфейс димеризации совпадает с первой из полярных областей (Рис. 6А,Б), а в модели с левой закруткой (СрА|) - со второй (Рис. 6В). Как видно и! Рис. 6А,Б, в структуре брАмк область межспирального контакта хорошо согласуется с наблюдаемой в СрАямр. хотя в теоретической модели паттерн интерфейса на поверхности характеризуется меньшим углом наклона к оси спирали и, следовательно, меньшей степенью суперспирализации днмера. Кроме того, в обеих моделях зона контакта включает как гидрофильный, так и параллельный ему гидрофобный паттерн. Последний образован остатками Ие7б, \,а180, Уа1м, Не,,.

111.1.7. Влияние степени гидрофобности мембраны на результаты моделирования.

Чтобы оценить, насколько результаты моделирования димера йрА чувствительны к изменению параметров липидного бислоя, расчеты, аналогичные описанным выше, были проведены с использованием как «менее», так и «более гидрофобной мембраны». (В дальнейшем термины «менее гидрофобная мембрана» и «более гидрофобная мембрана» обозначают модели неявно заданной среды, описываемые атомными параметрами сольватации «вода-октанол-вода» и «вода-циклогексан'-вода» (см, ниже)).

В первом случае «менее гидрофобное» мембранное окружение моделировали с помощью аппроксимации неполярной части октанолом, обладающего более полярными свойствами по сравнению с циклогексаном. Полученные в результате МК-поиска низкоэнергетические состояния представляют собой ТМ а-спиральные димеры. большинство из которых обладают параметрами <1 = 10 А, |0| < 10" (Рис.7: А Г), а менее представленная группа состояний - параметрами <1 = 9 А, |0| = 50" (Рис.7:АЗ'). Также присутствовали шпилькообразные димеры, где «излом» а-спирали наблюдался на участке Схххв (Рис.7:А2*). а-Спирали взаимодействуют в основном за счет остатков с протяженными гидрофобными боковыми цепями, и интерфейс димеризации сильно отличается от экспериментально установленного (данные не приведены). Таким образом, более полярное окружение способствует образованию контактов между наиболее гидрофобными остатками. При этом не найдено групп состояний, близких по структуре к описанным выше (полученным экспериментально, либо рассчитанных в немодифицированной мембране).

Модель «более гидрофобной мембраны» основана на искусственном увеличении (на 40%) степени гидрофобности центрального слоя мембраны путем изменения значений АПС в модели неявно заданного растворителя [8]. (Циклогексан' имитируется

модифицированными ЛИС «водяной пар - никло! сксан»). Среди набора

низкоэнер!стичсских коиформерок (-101 структур) наиболее специфичной упаковкой (

конформации воспроизводились в независимых расчетах с различных стартовых

состояний ) обладала группа I (— 150 структур) - эти состояния представляли собой

лсвозакрученные, плотно упакованные димеры с параметрами (1= 6.5 ±0.3 А. 0= 65.2 ±4.2°

и интерфейсом димеризации 1ххОУхАОхОхх1Л_ххУ (Рис. 7:Б1"). Конформации

представителей данного класса практически совпадают с моделями ОрА|,

наблюдавшимися в немодифицированной мембране («вода-циклогсксан-вода», см. выше)

Конформеры, соответствующие остальным расчетным состояниям, обладают сильной

гетерогенностью (Рис. 7:Б2"-6"), и для них

представляется затруднительным выявить

специфичность в образовании

межспиральных контактов.

Рисунок 7. Низкоэнергетическис димерные состояния, полученные методом МК в неявно заданных мембранах с размой степенью гидрофобное™ А) в «менее гидрофобной мембране»; Б) в «более гидрофобной мембране»

Мы полагаем, что на стадии сборки димерного комплекса в мембране важную роль играют эффекты сольватации, и необходима аккуратная параметризация используемого силового поля. Нарушение баланса между энергетическими термами Есоли- и Б.Л., Ездст и т.д. приводит к нарушению сборки димерных комплексов. В значении АПС заложена в неявном виде информация о многих факторах - понижение энтропии, связанное с упорядочением растворителя у поверхности белка, дальнодействующая электростатическая компонента свободной энергии сольватации белка, конфигурационная энтропия боковых цепей и т.д. Данный численный эксперимент демонстрирует также, что разные по свойствам модельные искусственные мембраны могут влиять на способность к димеризации.

Таким образом, аЬ ЫИю предсказание структуры димера возможно лишь при условии корректного описания мембранного окружения - например, с помощью модели сольватации, основанной на АПС «водяной пар - вода» и «водяной пар - циклогексан».

///.?. Изучение димепизацни ТМ сегмента белка В1Ч1РЗ методом Монте-Карло в пенено заданной мембране.

111.2.1. Характер взаимодействия мономера В1Ч1РЗ с мембраной: роль заряженных остатков на концах.

Белок ВМРЗ (Вс1-2/19-кЭа, домен 3) является представителем семейства ВСЬ-2,

отнстствсиного за реализацию активной формы гибели клетки - апоптоза. Установлено, что этот белок образует гомодимеры в мембранах и в мицеллах детергентов [14-15]. В отсутствие С - концевого ТМ домена он не способен образовывать димеры и локализоваться на внешней митохондриапьной мембране, вследствие чего теряется его проапоптотическая активность.

С - концевой участок ВМ1РЗ включает в себя ярко выраженный гидрофобный сегмент Уа1|6з-01у|м> на Ы-конце которого содержится ряд заряженных (А^мб, Ьузш, Ьувиз, ОЫкд, Ьув|бз) и ароматических ( РЬе^, РЬекя, РЬени) остатков, а на С-конце расположены положительно заряженные остатки - А^|85-18б (Рис. 8Б). Исследование возможных мод связывания пептидов с мембраной проводили с мономерами разной длины (варианты 1-6) (Рис. 8): «длинными» (1,2) «средними» ( 3, 4), «короткими» ( 5, 6).

5 6

Б Типы мономеров

«Длинные* 1 К|4бМТЗУМКК0|М01Р1!78АЕН1(11ЬК1(13У1мР1нЬР31ХЬЗНЬЬА1СЬС1¥ЮаК11б

2 ..ьк, V,, Р,„ЬР51.1Х8Н1ХАЮЬСтОЫ1 61 1оЗ 164 16} 186

«Средние» 3 (ВЫ1РЗ|«)

4 (ВМРЗ») К V Р ьрзил^ниАЮьсмок,« 1оЗ 164 16}

«Короткие» 5 V, к ьрз1Х1.5Н1.1.А1сьошоаа 164 16) 186

6 У1ыР1М1.Р51хишььА101-0та

Рисунок 8. А) Низкоэнергетичсские состояния ТМ сегментов пептида ВМ1РЗ разной длины (см. п. Б), полученные методом МК в неявно заданной мембране; Б) А.к. последовательности моделируемых пептидов. Другие детали см. в подписи к Рис.1.

Уже на первых шагах конформационного поиска методом МК энергия мономеров значительно уменьшилась за счет перехода субъединиц из водного окружения в мембрану (Рис 8А), и, независимо от длины а к. последовательности, наиболее гидрофобный участок Уа1|67-С1у|84 мономеров находился преимущественно в а-спиральной

копформации в бислос. Между тем, также присутствовали и состояния с изломом а-спирали для пептидов группы 4 (Рис 8А, 4а). Оказалось, что на характеристики связывания мономеров разной длины с мембраной влияет ирисугствис заряженных остатков на концах пептидов. Так, a-спирали в «средних» и «длинных» мономерах располагались под углом 75-80* к плоскости мембраны (Рис. 8), в то время как угол наклона оси спирали «коротких» пептидов составил ~ 45*. Таким образом, ориентация ТМ сегмента BN1P3 в мембране определяется как длиной гидрофобного участка (происходит «подстройка» пептида под толщину гидрофобной области мембраны за счет изменения угла наклона оси спирали), так и за счет взаимодействия заряженных остатков Lysi«, Argus, окаймляющих гидрофобный участок, с водным окружением. Заряженные остатки Argiu, Lysi32-i53. Glui6o в примембранном a-спиральном участке не влияют на характеристики связывания ТМ сегмента с мембраной. В дальнейшем, для упрощения задачи конформационного поиска и более эффективного исследования спираль-спиральных контактов, при моделировании димера была выбрана группа 4 «средних» пептидов (BNIP3r).

I¡ 1.2.2. Гидрофобные/гидрофильные свойства ТМ сегмента BNIP3.

Рисунок 9. Распределение гидрофобных/гидрофильиых свойств на поверхности ТМ сегмента белка BN1P3. Другие детали см. в подписи к Рис.6.

Гидрофильный паттерн на поверхности а-спирали

BNIP3 ( гидрофильный относительно сильно

гидрофобных остатков этих пептидов Leu, Val, Phe и т.д.)

имеет вид : Si68XxxSi72Hi73XxAi76XxxG|goxxxGi84 (Рис. 9).

Он содержит все три остатка (Hisnt, Alauj, G|go). влияние

которых на димеризацию было выявлено с помощью

экспериментов по направленному мутагенезу [14]. Как

отмечают авторы [14], влияние остатка Hispj на

димеризацию не всегда очевидно. Известно, что

ионизация боковой цепи остатка His в сильной степени зависит от окружения (рКа боковой

цепи = 6.3). Экспериментально зафиксирована активация белка BNIP3 только при низких

значениях рН [16]. Возможно, что протонирование остатка Hisnj имеет функциональное

значение. В настоящий момент механизм действия BN1P3 на молекулярном уровне далек от

понимания, поэтому влияние зарядового состояния остатка Hisnj на димеризацию требует

дополнительного изучения.

Ш.2.3. Расчет димериых состояний ТМ сегментов BNIP3.

Проведен ab initio конформационный поиск (в данном контексте термин ub тшо

означает, что при моделировании не использовали каких-либо ограничений на структуру)

низкоэнергетических состояний системы, состоящей из двух субъединиц BNIP3r в

Угол ■ращения, град.

мембранном окружении. Влияние последнего аппроксимируется с помощью модели неявно сданного растворителя [8]. Выявлены группы параллельных димерных упаковок, как с правой, так и с левой закруткой. Наиболее специфичными межспиральными взаимодействиями обладала группа правозакручениых димеров (Табл. 2) с параметрами d = 5 7 А, 0 = -19.8° и симметричным интерфейсом димеризации FxxLxxxHxxAxxLGxxIG (МаЫ 1r) Интересно, что могут реализовываться и другие состояния, для которых также характерны контакты вдоль гидрофильного паттерна (0 = -20.5°, Mabl2R) (Рис. 9). Однако, ввиду того, что мономеры в комплексе расположены несимметричным образом, не достигается плотной упаковки между мономерами (6.2 + 10.0 А, Табл. 2), и теряется тонкая специфическая межспиральная подстройка. Таким образом, высокая степень комплементарное™ обеспечивает плотную межмономерную упаковку, что, по-видимому, является приоритетным при олигомеризации, также как и в процессах межбелкового узнавания.

Роль ионизаиии боковой цепи остатка His / -д.

Моделирование проводили с учетом двух возможных зарядовых состояний боковой цепи Hisi73- Класс правозакручениых димерных упаковок (МаЪПц) воспроизводился как в случае протонированного, так и в случае непротонированного остатка His^ (Табл. 2). Интересным фактом является образование левозакрученных димерных структур с плотной упаковкой на С - конце. Интерфейс димеризации также совпадает с данными мутагенеза - межспиральные контакты образованы за счет остатков Hi7jxxAi76xxxGi«o. В данном случае упаковка левозарученных димеров зависела от зарядового состояния Hisi7j. Так, в вычислительном эксперименте с His+ш формировались структуры с 0 » 20° (Mab2U), а в случае с незаряженным остатком Hism угол 0 составил = 60° (МаЬ22ц). Сравнение ориентации остатков His друг относительно друга в разных укладках показало (Рис. 10), что боковые группы His)73 имеют тенденцию образовывать невалентные «стэкинг» взаимодействия. В зависимости от типа укладки, ароматические кольца находятся на разных расстояниях (h). Так, наибольшая

сближенность между плоскостями ароматических

А

б

в

колец His (h) наблюдается у состояний с 0 = 60°: h = 4.0 А. В конформациях с 0= 20°: h= 7.0 А, а в моделях с ©я - 20°: h= 8.5 А.

Рисунок 10. Нижний ряд: расположение расчетных структур в «мембране» с параметрами: А)

МаЫ 1„(His,His+) d ~ бА, 0 = -20°; Б) Mab21„ (His+) d = 9А, 0 = 20"; В) Mab22„(His) d s g A, в = 60° (см Табл. 2). Верхний ряд: вид сверху этих структур. С полноатомном виде представлены остатки His,,), а также заряженные остатки на концах (Lysiu, Argus). Остальные детали см. в подписи к Рис.5.

Таблица 2. Ннзкоэнсргстичсскис димсрныс состояния, рассчитанные методом МК в неявно заданной мембране. В скобках показано, была ли эта группа получена с заряженным остатком Hisl7) (llis+), незаряженным (Mis) или в обоих случаях (!Iis+, His).

■Л»' d2 @г Последовательности Ecu».«

Ab initio расчет

Kabll, KVFLPSLLLSHLLAIGLGIYIGR

(Hi»,Hi S.7t0 0 -19.810.1 Г L s)t | tft IG -441.2Ю.6 23.010.1 -314.310 S 1U.410.4

•«) _Г_L_se_|l_J_0_

II ■ MM 111 ■ ■ T—ГТ 'T ' I -m^—— «щд димс I 14» II и—i ■■ . ■ ...........I I I ни ■ 1 «

ИаЫ2,

(Hl«,Hi 8.010.8 -20.SU.S »»I

_L fl |т_gl_GR -444.612.6 22.710.4 -310.912.3 -114.211.0

-V-SL_S_lf_gt_I_

МдЬ21.

(Hio) 8.710.4 19.910.5

L Д А

НаЬ22, 8.310.0 62.513.4 (His)

-443.610.8 20.810.1 -299.SU.2 118 710.5

¡1-Й -I—

1 Обозначения групп низкоэнергетических состояний, полученных при расчете методом МК.

'd ив- средние значения расстояния (в А) и угла (в град.) между осями а-спнралей.

1 Остатки, найденные на интерфейсе димеризацин, обозначены буквой Серый цветом окрашены а.к остатки на интерфейсе димеризацин, совпадающие с д анными мутагенеза [14].

4 Етш., Еж*ш, - полная энергия, энергия электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий,

энергия сольватации (исал/моль), соответственно.

Ш.2.4. Мутагенез in silico: поиск гомологов ТМ пептида BNIP3, способных к эффективной димеризацин.

Пептиды с потенииально улучшенной димеризаиионной способностью.

Как упоминалось ранее, мотив GxxxG (х - любые остатки последовательности) в последовательностях различных белков способствует образованию плотных димерных упаковок [17]. Методом мутагенеза установлено, что в ТМ сегменте белка BNIP3 важным для димеризацин, является мотив, образованный остатками AxxxG [14]. Мы предположили, что замена А1апб на остаток Gly (также производили замену Hisns—»Leu для исключения влияния остатка His 173 ) будет способствовать образованию более плотных контактов между а-спирапями, и, возможно, повышенной способностью к димеризацин.

МК расчет в неявно заданном мембранном окружении показал, что наиболее энергетически выгодный и заселенный класс состояний образуют димерные конформации с правой закруткой (параметры d = 6.6 А, 0 я -35.4°) и интерфейсом димеризацин VFxxSLxSL|7}XxGi76bcLGi«oXxIG. Заметим, что на интерфейсе, присутствуют все три остатка Gly, и угол между осями а-спиралей несколько увеличился по сравнению с правозакрученной моделью димера для ТМ сегмента белка BNIP3 дикого типа. Мы предполагаем, что такая мутантная форма гомодимера должна обладать более плотной

пан-дср-ваальсовой «подстройкой» за смет остатков С1у п более высокоГ| димеризациопноП способностью по сравнению с ТМ сегментом белка ВЫ1РЗ дикого типа

Модетрование ассоциации ТМ сегмента ВЫ1РЗ с мутантом ВМ1РЗ^щгг в неявно заданном мембранном окружении.

Целью данного этапа работы являлось создание /п $Шсо пептида, способного конкурировать за димеризацию с ТМ сегментом белка ВЫ1РЗ дикого типа Предполагается, что мутантная форма пептида с заменой остатка А1а|7б—Ю1у будет способна образовывать гетеродимеры с ТМ пептидом В№РЗ дикого типа.

Вычислительный эксперимент показал возможность образования гетеродимерных моделей с протяженным интерфейсом димеризации, где образование плотной упаковки происходит как за счет мугируемого остатка Оуп« мономера А, так и остатка А1аиб мономера Б дикого типа (серым закрашены остатки, важные для димеризации [14], и мутируемый остаток Оупб):

Модель гетеродимера обладает более плотной «подстройкой» боковых иепей остатков А1аПб, О1уцо, 01у184 одного мономера и остатков С1упб, Оуко, Оупи другого за счет гидрофильных «лощин», образуемых остатками Оу (Рис. 11). Заметим, что более тонкая «подстройка» межатомных контактов может быть осуществлена путем расчетов МД димеров в явно заданных гидратированных липидных бислоях. Расчет свободной энергии ассоциации мономеров мог бы помочь в оценке стабильности межмономерных взаимодействий в различных комплексах. Данная задача носит нетривиальный характер, в настоящее время, она решается в Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН. Резюме.

Таким образом, с помощью моделирования /и ¡Шсо показано, что мутантные формы пептида А1апб—>С1у, №5пз—*Ьеи образуют плотно упакованные димерные структуры с правой закруткой. Мы полагаем, что димеризационная способность этих мутантных пептидов может быть выше, чем в белке дикого типа, за счет более плотных контактов между остатками С^бХххОцохххСш-

Мономер А: _F_L_sfl В1""1_В1—IG—

Мономер Б: VF SL_S_1|пб_Щ_1С_

А

в\

Рисунок 11. Упаковка a-спиралей на С - концевом участке ТМ сегмента белка BNIP3 дикого типа (А, модель MabllR) и гетеродимера (Б). Показаны атомы, образующие наиболее плотные межепирольные контакты. Светло-серым показаны остатки Gly, темно-серым - остатки Ala. Другие детали см. в подписи к Рис.6.

Моделирование показало возможность образования гетеродимеров между ТМ сегментами мутанта А1апб—►Иу и белка

BNIP3 дикого типа. Отмстим, что в образовании гсчеродимсра участвует как G|7(.xxxGikoxxxGik4, так и AnbXxxGmoXXxGna мотив. Мы полагаем, что данный мутантный пептид сможет конкурировать за образование димерных состояний с ТМ пептидом белка BN1P3 дикого типа.

Безусловно, данные предположения должны пройти экспериментальную апробацию. В Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН уже ведутся работы по изучению возможности создания de novo пептидов, способных ингибировать или усиливать ассоциацию природных ТМ пептидов. Механизм олигомеризации далек от понимания и в настоящее время лишь начинается создание таких искусственных систем. В решении этой сложной задачи существенную помощь могут оказать методы молекулярного компьютерного моделирования.

ГУ. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В этой главе проведен обзор выполненных исследований и полученных результатов

Основные результаты.

1. Исследована роль гетерогенной, полярно-неполярной, среды при моделировании белок-белковых взаимодействий в мембране. Вывод: а) Моделирование без учета эффектов среды не позволяет корректно описать поведение как одного, так и двух ТМ а-спиралей GpA. Расчет методом МК двух мономеров GpA в «вакууме» показывает, что полученные конформации димерных состояний значительно отличаются от установленных в экспериментах. Кроме того, не наблюдается специфичности в образовании межспиральных контактов.

2. Изучены механизмы ассоциации пептидов в гетерогенном мембранном окружении. Выводы: а) Моделирование пептидов GpA в мембране без приложенного ТМ потенциала показало, что пептиды, сохраняя а-спнральную структуру, располагаются в ТМ положении, образуя димеры как в ориентации «голова к хвосту», так и в ориентации «голова к голове». Найдена только одна группа структур с антипараллельной ориентацией пептидов, хорошо коррелирующая с данными мутагенеза (СрАмкц); б) При расчете с мембранами разной толщины наблюдается эффект «подстройки» димера GpAmku под толщину гидрофобного слоя без нарушения межспиральных контактов; в) Субъединицы в комплексах обладают а-спиральной структурой при толщине мембраны D < 36 А, при дальнейшем увеличении толщины мембраны наблюдаются нарушения а-спиральной конформации.

3. Проведены исследования формирования димеров GpA в мембране с приложенным ТМ потенциалом. Выводы: а) Пептиды, сохраняя а-спирапьную конформацию, встраиваются в мембрану в ТМ положении и образуют димеры в ориентации «голова к голове»; б) Конформации низкоэнергетических состояний хорошо согласуются с данными мутагенеза; в) Найдена группа состояний с правой закруткой, по параметрам упаковки

близкая к -экспериментально установленной димерной структуре; г) Наблюдается группа плотно упакованных лимерных структур с левой закруткой, также хорошо согласующихся с данными мутагенеза и удовлетворяющих ограничениям на расстояния, полученным методом спектроскопии ЯМР; д) Проведен анализ особенностей образования лево- и правозакрученных димерных упаковок, рассмотрено влияние мутаций на упаковку димера и т.д. Таким образом, впервые предложена методика моделирования димерных комплексов в мембранном окружении.

4 Разработанный вычислительный подход применен для моделирования димера с неизвестной пространственной структурой - ТМ сегментов белка BNIP3. Выводы: а) ЛЬ initio поиск низкоэнергетических состояний выявил несколько возможных групп димерных состояний как с правой, так и с левой закруткой. Наблюдается высокая корреляция полученных конформеров с данными мутагенеза; б) Сделан вывод о роли состояния ионизации остатка Hisnj в ассоциации а-спирапей; в) Предложены мутантные формы BNIP3 с потенциально более высокой, чем в белке дикого типа, димеризационной способностью.

V. ВЫВОДЫ.

1. Разработана методика моделирования а-спиральных димерных комплексов методом Монте-Карло с использованием неявно-заданной модели мембраны. В подходе не используются ограничения на пространственную структуру исследуемых объектов.

2. Установлено, что моделирование без учета эффектов среды не позволяет корректно описать поведение двух ТМ а-спиралей GpA. Полученные конформации димерных состояний значительно отличаются от установленных в экспериментах.

3. Образование димерных комплексов, хорошо согласующихся с экспериментальными данными, возможно при следующих условиях: а) Толщина гидрофобной части мембраны должна примерно соответствовать длине гидрофобного участка мономера GpA 32 А); б) Необходим учет ТМ потенциала мембраны; в) Свойства липидного бислоя наилучшим образом аппроксимируются моделью среды «вода-циклогексан-вода».

4. Разработанная методика применена для моделирования димера ТМ сегмента белка BNIP3 с неизвестной пространственной структурой. Полученные модели хорошо согласуются с данными мутагенеза. Показано, что степень ионизации остатка H1S173 влияет на характер ассоциации а-спиралей.

5. На основании анализа гидрофобных/гидрофильных характеристик ТМ сегментов GpA/BNIP3 и расчетов методом Монте-Карло предложены мутантные формы ТМ пептида BNIP3, потенциально обладающие улучшенной димеризационной способностью.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Y.A. Vcrcshaga, Р.Е. Volynsky, D.E. Noldc, A.S. Arscnicv, R.G. Efremov. Helix interactions in membranes : lessons from unrestrained Monte Carlo simulations. Journal of Chcmical Theory and Compulation, 2005, v.l, № 6, DOI: 10.1021/ct05012S0.

2. R.G. Efremov, D.E. Noldc, P.E Volynsky, Y.A Vcreshaga, N.A. Simakov, A A Polyansky. Molecular modeling of membrane peptides and proteins Fundamental and Clinical Pharmacology, 2004, v. 18, p. 594.

3. R.G. Efremov, P.E. Volynsky, D.E. Nolde, Y.A. Vcreshaga, A.G. Konshina, N.A. Simakov, A.S Arseniev. Membrane proteins: the new insights via computational experiments. Computational structural and functional proteomics Proceedings of the Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS), Novosibirsk, 2004, p. 255-257,

4. R.G. Efremov, D.E. Nolde, P.E. Volynsky, Y.A. Vereshaga, N.A. Simakov, A.S. Arseniev. In silica Modeling of Peptides and Proteins in Membranes: Structural, Dynamical, and Functional Aspects. Proceedings of the International Simposium "Peptide-Membrane Interactions", Namur, Belgium, 2004, p. OL-2.

5. Y.A. Vcreshaga, P.E. Volinskii, D.E. Nolde, R.G. Efremov. Helix-helix association in membrane: Monte Carlo simulations of glycophorin A. Proceedings of the international Moscow conference on computational molecular biology, Moscow, 2003, Add.1-2.

6. Р.Г. Ефремов, Д.Е Нольде., П.Е. Волынский, Н.П. Сырцев, Я.А. Верещага, А.Г. Коншина, Н.А. Симаков, А.С Арсеньев. Белки в мембранах: результаты и уроки вычислительных экспериментов. //Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, Москва, 2003 г., тезисы докладов, с. 24.

7. R.G.Efremov, D.E.Nolde, P.E.Volynsky, A.G.Konshina, N.P.Syrtcev, Ya.A.Vereshaga, A.S.Arseniev. Peptides in Membrane-Mimic Media: Molecular Modeling Studies. Proceedings of the Tenth German-Russian Peptide Symposium, Friedrichroda/Thuringia, Germany, 2003, p. 2.10-5.10.

8. R.G.Efremov, D.E.Nolde, P.E.Volynsky, A.G.Konshina, N.P.Syrtcev, Ya.A.Vereshaga, A.S.Arseniev. Peptides and proteins in membranes: what can we learn via computer simulations? Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, Moscow, 2003, p. 62-63.

9. Я.А. Верещага, П.Е. Волынский, Р.Г. Ефремов. Структурные и энергетические аспекты димеризации гликофорина А в мембранном окружении //XV Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2003, тезисы докладов, с. 5.

10. Я.А. Верещага, П.Е. Волынский, Д. Е. Нольде, Р.Г Ефремов. Новый метод молекулярного моделирования олигомернзации белков в мембране. //Первая национальная конференция: «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины», Москва, 2002, сборник тезисов и докладов, с 20-21.

11. Я.А. Верещага, П.Е. Волынский, Р.Г. Ефремов. Молекулярное моделирование структуры гидрофобного участка гомодимера гликофорина А в мембране. //XIV Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективы и направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2002, тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 72.

12. Я.А. Верещага, П.Е. Волынский, Р.Г. Ефремов. Моделирование пептид-пептидного взаимодействия в мембране методом Монте-Карло. //Научная сессия МИФИ. Москва, 2002, сборник научных трудов т. 5, с. 35-36.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1 Harder, T , Philos. Trans R. Soc Lond B Biol. Sei, (2003), 358: 863

2 Ubarretxena-Belandia, I. and Engelman, D.M., Curr. Opin. Struct. Biol., (2001), 11: 370.

3 Liang, J., Cun. Opin. Chcm. Biol., (2002), 6: 878.

4 MacKcnzie, K.R., PrcsiL-.ml, J 11 and Engelman, D.M., Science, (1997), 276: 131.

5. Adams, P.D., Engelman, D.M. and Brilnger, A.T., Proteins, (1996), 26: 257.

6. Ducarme, P., Thomas, A. and Brasscur, R., Biochim. Biophys. Acta., (2000), 1509: 148.

7. Im, W., Feig, M. and Brooks III, C.L., Biophys. J., (2003), 85: 2900.

8. Efremov, R.G., Volynsky, P.E., Nolde, D.E. and Arseniev, A.S., Theor. Chem. Acc., (2001), 106:48.

9. Efremov, R.G., Volynsky, P.E., Nolde, D.E., van Dalen, A., de KruijfF, B. and Arseniev, A.S., FEBS Lett., (2002), 526: 97.

10. Lemmon, M.A., Flangan, J.M., Treutlein, H.R., Zhang, J. and Engelman, D.M., Biochemistry, (1992), 31: 12719.

11. Bechinger, B„ Mol. Membr. Biol., (2000), 17: 135.

12. Gennis, R.B. Biomembranes. Molecular Structure and Function. Springer-Verlag. New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo, (1989).

13. Efremov, R.G., Nolde, D.E., Vergoten, G. and Arseniev, A.S., Biophys. J., (1999), 76: 2448.

14. Sulistijo, E.S., Jaszewski, T.M. and MacKenzie, K.R., J. Biol. Chem., (2003), 278: 51950.

15. Chen, G., Ray, R., Dubik, D., Shi, L„ Cizeau, J., Bleackley, R. C., Saxena, S., Gietz, R. D„ Greenberg, A. H., J. Exp. Med., (1997), 186:1975.

16. Kubasiak, L.A, Hernandez, O.M., Bishopric, N.H. and Webster, K.A., Proc. Natl. Acad. Sei. U S A., (2002), 99: 12825.

17. Senes, A., Engel, D.E. and DeGrado, W.F., Curr. Opin. Struct. Biol., (2004), 14: 465.

Верещага Яна Александровна

Взаимодействие а-спиральных пептидов в биомембранах: моделирование методом Монте-Карло

Подписано в печать 02.11.2005. Формат 60*84/16. Печать офсетная. Уел неч я 1,0 Уч-иад л 1,0. Тираж 70 эю Зака! №ф-519

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Московский физико-технический институт (государственный университет) Отдел автоматизированных издательских систем «ФИЗТЕХ-ПОЛИГРАФ»

141700, Московская обл., г.Долгопрудный, Институтский пер., 9

Ii

í

l<

í

í!

í

I

'i

i ?

/

¡!

j

2314

РНБ Русский фонд

2006-4 20290

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Верещага, Яна Александровна

ГЛАВА I. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА II. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТРАНСМЕМБРАННЫХ (ТМ) А-СПИРАЛЬНЫХ ДИМЕРОВ: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ.

11.1. Общие принципы организации а-спиральных комплексов в липидном бислое.

II. 1.1 Геометрические аспекты упаковки спиралей.

II.1.2. Гидрофобная/гидрофильная организация комплексов.

II. 1.3. Особенности взаимодействия а-спиралей с границей раздела мембрана/вода.

II. 1.4. Резюме.

11.2. Перспективные а-спиральные димеры — уроки экспериментального изучения.

П.2.1. Гликофорин А человека.

Н.2.2. Рецепторы тирозин-киназы ЕгЬВ/Ыеи.

Н.2.3. ТМ сегмент белка ВМРЗ семейства ВСЬ-2.

Н.З. Методы компьютерного моделирования а-спиральных комплексов.

11.3.1. Метод молекулярной динамики в «вакууме» с отжигом.

11.3.2. Моделирование с использованием неявно заданных моделей мембраны.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

III. 1. Разработка методики моделирования пространственной структуры а-спиральных димеров в мембранном окружении на примере димера гликофорина А (врА).

III. 1.1. Подбор оптимальных характеристик моделей, имитирующих влияние мембраны, для изучения ассоциации мономеров врА.

111.1.1.1. Моделирование в «вакууме» (мономер и димер врА).

111.1.1.2. Взаимодействие а-спиральных сегментов в мембранах разной толщины без приложенного ТМ потенциала.

Ш.1.1.3. Резюме.

III. 1.2. Моделирование с приложенным ТМ потенциалом.

III. 1.2. Влияние ТМ потенциала на ориентацию а-спиралей в комплексах.

III. 1.2.2. Энергетические особенности полученных классов олигомерных состояний 54 III. 1.2.3. Сравнительный анализ моделей димера, полученных с помощью спектроскопии ЯМР и рассчитанных методом Монте-Карло.

III. 1.2.4. Гидрофобная организация а-спиральных димерных комплексов GpA.

III. 1.2.5. Модель димера, установленная методом спектроскопии ЯМР: поведение в неявно заданном мембранном окружении.

III. 1.2.6. Энергетические аспекты димеризации.

III. 1.2.7. Влияние толщины мембраны на упаковку димерных состояний.

III. 1.2.8. Влияние степени гидрофобности мембраны на результаты моделирования.

III. 1.2.9. Мутагенез in silico, влияние точечных мутаций на димеризацию GpA.

III. 1.2.10. Резюме.

III.2. Изучение димеризации ТМ сегмента белка BNIP3 методом Монте-Карло в неявно заданной мембране.

III.2.1 Характер взаимодействия мономера BNIP3 с мембраной: роль заряженных остатков на концах.

111.2.2. Гидрофобные/гидрофильные свойства ТМ сегмента BNIP3.

111.2.3. Расчет димерных состояний BNIP3 с применением ограничений.

111.2.4. Ab initio моделирование димера BNIP3: роль остатка His 173 в димеризации.

111.2.5. Мутагенез in silico: поиск гомологов ТМ пептида BNIP3, способных к эффективной димеризации.

111.2.6. Резюме.

ГЛАВА IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

IV. 1. Обзор проведенных исследований и полученных результатов.

IV.2. Научно-практическое значение работы.

IV.3. Перспективы.

ГЛАВА V. МЕТОДЫ.

V.1. Вычислительные протоколы.

V.2. Гетерогенная модель мембраны.

V.3. Метод молекулярного гидрофобного потенциала (МГП).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие α-спиральных пептидов в биомембранах: моделирование методом Монте-Карло"

Исключительно важная роль мембранных белков (МБ) в клетке обусловлена ихспособностью детектировать и передавать сигналы через липидный бислой, осуществлятьтранспорт ионов и различных веществ, участвовать в слиянии мембран и т.п. Кроме того,-30% всех белков, кодируемых целыми геномами, способны взаимодействовать смембранами (Wallin et al., 1998; Arkin et al., 2002). Понимание связи между структуройМБ и их функцией представляет собой одну из актуальных и интереснейщих задачструктурной биологии. Рещение указанной нроблемы имеет и большой нрактическийинтерес. В частности, МБ являются привлекательными объектами для создания новыхлекарственных нрепаратов (-50% всех представленных на рынке лекарственныхпрепаратов направлено на взаимодействие с МБ), осуществляющих коррекцию нередачисигнала через мембрану (взаимодействие с мембранными рецепторами, модификациюпроводимости ионных каналов). Указанные процессы являются ключевыми при развитииряда заболеваний. Многие такие белки содержат в своих мембранных доменах несколькоучастков нолипептидной цепи и/или функционируют в олигомерных состояниях - в виде,димеров, тримеров и т.д. Механизмы ассоциации и межбелкового узнавания, играющиеважную роль в ряде клеточных процессов (Harder et al., 2003; Ubarretxena-Belandia &Engelman, 2001), являются ключом для нонимания функционирования белковых-.:комнлексов. В связи с этим, большой интерес нредставляют задачи но изучениюдетальных молекулярных механизмов межбелковых взаимодействий в такой гетерогеннойсреде, какой является линидный бислой. Получение структурной информации о процессахолигомеризации белков в мембранах с помощью современных экспериментальныхметодов крайне затруднено из-за больших сложностей с вьщелением, очисткой,нриготовлением образцов (Liang et al., 2002). Многообещающей альтернативой в рещенииданной проблемы является применение методов компьютерного моделирования.Наиболее подходящими объектами для разработки и тестировапия таких методовявляются а-спиральные комплексы в мембранах. Эти системы достаточно стабильны исостоят из гидрофобных и/или амфифильных а-спиралей. Последние представляютнаиболее часто встречающийся структурный элемент в мембранных доменах белков,ответственный за их связывание с липидпым бислоем. Взаимодействия междумембрапосвязанными а-спиралями обеспечивают функциональную активность огромногочисла белков и пептидов. Среди них - интегральные мембранные реценторы (например,семейство рецепторов, чье действие опосредовано G-белками, рецепторы гормонов,компоненты сенсорных систем), разнообразные ионные каналы (АТФазы, калиевыеканалы, лиганд-зависимые ионные каналы) и молекулярные транснортеры, дефензины.мембрано-активные пептиды, обладающие антибактериальной, фузогенной, мембранолитической активностью и др. (Efremov et al., 2004). В настоящее время расшифрованыпространственные структуры около 50 белков, имеющих в своем составе комплексытрансмембрапных (ТМ) а-спиралей (сайтhttp://blanco.biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtal.html)).Появление пространственной модели ТМ димера гликофорина А человека (GpA)стимулировало разработку теоретических методов исследования взаимодействия аспиралей в мембранных доменах белков (см. разд. П.З), т.к. появилась возможностьсравнения результатов расчетов с экспериментом. Эти работы можно разбить на тригруппы: 1) Подходы, основанные на расчетах энергии спираль-спиральныхвзаимодействий. При этом жестко фиксируется а-спиральная структура, и расчетыпроводят либо в «вакууме», либо в однород1юй среде с низкой диэлектрическойнроницаемостью (см. разд. II.3.1); 2) Методы, использующие статистические данные новзаимодействию аминокислотных остатков а-спиральных пучков в белках с известнойпространственной структурой (см. разд. П.З.З); 3) Моделирование, основанное на учетемембранного окружения неявным образом, например, с помощью обобщенной моделиБорна, с использованием энергии поверхностного натяжения и др. (см. разд. II.3.2) (Вдальнейшем термин «мембрана» будет употребляться и для математических моделей,имитирующих влияние мембранного окружения). Поскольку в настоящее времяпредпринимаются лишь первые попытки создания указанных подходов, предлагаемыеметодики характеризуются целым рядом ограничений. Так, в методах первой группы,ввиду отсутствия гетерогенного мембранного окружения, «естественным образом»стабилизирующего а-спиральную конформацию ТМ участков субъединиц, приходитсявводить искусственные ограничения, предотвращающие дестабилизацию спирали. Какбудет показано в настоящей работе, в этих случаях нет возможности выявитьспецифичность взаимодействия спираль-спираль (см. разд. III. 1.1). Кроме того,ограниченное число доступных пространственных структур делает трудновыполнимойзадачу использования статистики для предсказания спираль-спиральных контактов(методы группы 2). Наиболее перспективными являются подходы с использованиеммоделей неявно-заданной среды. С их помощью недавно были получены интересныерезультаты для ряда а-спиральных димеров (Ducarme et al., 2000; Im et al., 2003).Авторам удалось осуществить моделирование ассоциации спиралей в гетерогенноммембранном окружении без «стягивающих» межмономерных ограничений. Вместе стем, следует отметить и ряд серьезных допущений, сделанных в этих работах. Так, ТМсегменты заведомо располагали в гидрофобном слое мембраны, в ориентации «голова кголове», что не дает возможности проанализировать энергетические характеристикивстраивания пептидов в мембрану. Кроме того, авторы избегают вопроса о ролизаряженных остатков на концевых участках пептидов (Im et al., 2003),В данной работе предлагается метод моделировапия а-спиральных димерныхкомплексов в мембранном окружении, основанный на поиске наиболее энергетическивыгодных состояний системы «спираль-спираль-мембрана» методом Монте-Карло (МК).Важно отметить, что вычисления проводятся без применения каких-либо ограничений.Метод МК позволяет эффективно исследовать конформационные возможностиполипептидной цепи небольшой системы, состоящей из двух а-спиральпых сегментов.Ключевым моментом в предлагаемой методике является применение модели неявнозаданной мембраны, основанной на совместном использовапии атомных параметровсольватации для воды и углеводородов, описывающих гидратированные полярные группыи ацильные цени линндов, соответственно (Efremov et al,, 2001). Данная модель обладаетвысокой вычислительной эффективностью и хорошо себя зарекомендовала при описанииосновных особенностей взаимодействия белок-мембрана. Так, применение МК метода всовокупности с неявно заданной моделью мембраны нозволило адекватно описатьособенности взаимодействия целого ряда пептидов и белков с различным типом укладкиполипептидной цепи (а-спиральные, р- и а/р-структурные) и с различным характеромсвязывания с мембраной (ТМ, периферические).Работа состоит из трех частей. В первой рассматривается, каким образом окружениес разными характеристиками влияет на ассоциацию белковых субъединиц. Вторая частьпосвящена описанию результатов моделирования структуры димера GpA в гетерогенноммембранном окружении и сравнению результатов расчетов с известнымиэкспериментальными данными. Сделан вывод о том, что разработанный нодход позволяетадекватно онисать структуру димера GpA в мембрано-подобном окружении. В третьейчасти ноказано применение разработанной методики для изучения возможных механизмовдимеризации ТМ сегмента белка BNIP3, нространственная структура которого еще неустановлена. Полученные модели комплексов хорошо согласуются с данными мутагенеза.Научная новизна.В ходе выполнения работы был впервые создан комнлекс новых вычислительныхметодик и компьютерных программ, позволяющих нолучать информацию о структуребелок-белковых комнлексов в линидном бислое. Кроме того, применение разработанныхоригинальных подходов к апализу димерных структур помогло установить ряд факторов изакономерностей, имеющих фундаментальное значение для попимания особенностейдимерной организации и функционирования белков. Среди них: механизм взаимодействияТМ а-спиральпых пептидов, взаимосвязь между гидрофобной/гидрофильной организациейпептидов и их укладкой в димере, физические принципы встраивания а-сниральныхпептидов в мембранное окружение, энергетические аспекты димеризации в «бислое» и др.Основные результаты.1. Исследована роль гетерогенного, полярпо-неполярного, растворителя примоделировании белок-белковых взаимодействий. Выводы: а) Моделирование без учетаэффектов среды не позволяет корректно описать поведение двух ТМ а-сниралей GpA; б)Присутствие второго пептида при расчете МК двух мономеров GpA в «вакууме»стабилизирует а-спиральную структуру мономеров за счет ван-дер-ваальсовыхвзаимодействий. Однако полученные конформации димерных состояний значительноотличаются от установленных в экспериментах. Кроме того, не наблюдаетсяспецифичности межспиральных контактов.2. Исследованы механизмы ассоциации пептидов в гетерогенном мембранномокружении. Выводы: а) Моделирование пептидов GpA в мембране без приложенного ТМпотенциала показало, что пептиды, сохраняя а-спиральную структуру, располагаются вТМ положении, образуя димеры как в ориентации «голова к хвосту», так и в ориентации«голова к голове». Найдена только одна группа структур с антипараллельной ориентациейпептидов хорошо коррелирующая с данными мутагенеза (GpAMKti); б) При расчете сразной толщиной мембраны наблюдается эффект подстройки димера GpAMKti подтолщину гидрофобного слоя без нарушения межспиральных контактов; в) Субъединицы вкомплексах обладают а-спиральной структурой при толщине мембраны D < ЗбА, придальнейшем увеличении толщины наблюдаются нарушения а-сниральной конформации.3. Димеры GpA в мембране с приложенным потенциалом. Выводы: а) Пептиды,сохрапяя а-спиральпую копформацию, встраиваются в мембрану в ТМ положении иобразуют димеры в ориентации «голова к голове»; б) Конформации низкоэнергетическихсостояний хорошо согласуются с данными мутагенеза; в) найдена группа состояний справой закруткой, по параметрам упаковки близкая к экспериментально установленнойдимерной структуре ((ЗрАямрУ, г) Наблюдается группа плотно унакованных димерныхструктур с левой закруткой, также хорошо согласующаяся с данными мутагенеза иудовлетворяющая ограничениям на расстояния, получеппым методом спектроскопииЯМР (MacKenzie et al., 1997); д) Исследованы энергетические аспекты встраивания аспиралей в мембрану и их олигомеризации, проведен анализ особенностей образованиялево- и нравозакрученных димерных упаковок, рассмотрено влияние мутаций на упаковкудимера и т.д. Таким образом, впервые предложена методика моделирования днмерныхкомплексов в мембранном окружении.4. Разработанная методика применена для моделирования димера с неизвестнойпространственной структурой - ТМ сегмента белка BNIP3. Выводы: а) АЬ initio поискнизкоэнергетических состояний выявил несколько возможных грунн димерных состоянийкак с правой, так и с левой закруткой. Наблюдается высокая корреляция с даннымимутагенеза; б) Сделан вывод о роли состояния ионизации остатка Hisi73 в ассоциации аспиралей; в) Предложены мутантные формы BNIP3 с потенциально более высокой, чем вбелке дикого тина, димеризационной способностью.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Верещага, Яна Александровна

Выводы:

1. Моделирование без учета мембранного окружения не позволяет корректно описать поведение ТМ a-спиралей GpA. Так, полученные конформации димерных состояний значительно отличаются от установленных в экспериментах. Не наблюдается специфичности в образовании межспиральных контактов.

2. Исследовано влияние гетерогенного окружения с разными характеристиками на ассоциацию ТМ сегментов GpA. Показано, что образование димерных комплексов, хорошо согласующихся с экспериментальными данными, возможно при следующих условиях: 1) толщина гидрофобной части мембраны должна примерно соответствовать длине гидрофобного участка мономера GpA 32Á); 2) необходим учет ТМ потенциала мембраны; 3) свойства липидного бислоя наилучшим образом аппроксимируются моделью среды «вода-циклогексан-вода».

3. На основании результатов моделирования предложены две модели пространственной структуры димера ТМ сегмента белка BNIP3. Полученные модели хорошо согласуются с данными мутагенеза.

4. На основании анализа гидрофобных/гидрофильных характеристик ТМ сегментов GpA/BNIP3 и расчетов МК предложены мутантные формы ТМ пептида BNIP3, потенциально, обладающие улучшенной димеризационной способностью. Апробация мутантных форм будет осуществлена экспериментально в нашей Лаборатории.

IV. 2. Научно-практическое значение работы.

Представленные в работе результаты дополняют существующие представления о молекулярных механизмах ассоциации белков в мембранном окружении и позволяют лучше понять основные факторы, способствующие образованию ТМ димерных комплексов.

Разработанная методика позволяет предсказывать пространственную структуру а-спиральных димерных комплексов в мембранном окружении и выявлять особенности спираль-спирального взаимодействия в мембранном окружении. В частности, созданный подход дает возможность идентифицировать а.к. остатки, важные для димеризации. Полученные результаты помогут создавать de novo пептиды, обладающие (или, наоборот, не обладающие) высокой аффинностью друг к другу, либо к заданным пептидам-мишеням.

IV. 3. Перспективы.

Основываясь на результатах выполненной работы и анализе литературных данных, можно обозначить направления дальнейших исследований и сформулировать перспективные задачи в области молекулярного моделирования олигомерных комплексов в мембранном окружении.

1) Поскольку димеризация пептидов и белков в мембране окружении играет важную роль при передаче сигнала в клетке, в настоящее время ведутся активные исследования механизмов олигомеризации с целью последующего целенаправленного управления процессами ассоциации ТМ белковых фрагментов. Существенную помощь в понимании функционирования таких систем могут оказать методы, позволяющие предсказать возможные типы белок-белковых взаимодействий между белковыми субъединицами, а также проектировать мутантные формы белков, обладающие улучшенной димеризационной способностью. Поскольку функционирование целого ряда рецепторов сопровождается значительными конформационными перестройками, представляется чрезвычайно важным понять энергетические аспекты таких процессов и исследовать их in silico. Также, с фундаментальной точки зрения представляется важным научиться оценивать свободную энергию ассоциации пептидов в модельном мембранном окружении - это даст возможность сравнения степени димеризации различных природных и искусственных ТМ сегментов.

2) Дальнейшее совершенствование моделей сольватации с явно и неявно заданным бислоем. В первом случае основное внимание, по-видимому, будет уделяться уточнению параметров силовых полей, описывающих ван-дер-ваальсовы и электростатические взаимодействия, проблемам совместимости силовых полей, отработанных по-отдельности для «чистых бислоев» и изолированных белков. Во втором случае большое внимание будет уделено разработке дополнительных термов в выражении для потенциальной энергии, которые позволят учесть в процессах взаимодействия белок - мембрана роль таких важных явлений, как влияние внешнего электрического поля (например, при деполяризации мембраны), упругие свойства мембраны, «отклик» липидного бислоя и процессы его дестабилизации при встраивании пептидов и белков и т.д.

ГЛАВА V. Методы.

V. 1. Вычислительные протоколы.

Объект исследования: ТМ сегмент гликофорина А человека.

Расчеты проводили для ТМ сегмента гликофорина А человека из мембран эритроцитов. Аминокислотная последовательность: 86уЕРЕ1ТШРСУМАОУ1СТ1Ь 1Л5УС11Ш97. Стартовую структуру каждого мономера (А и Б) задавали в а-спиральной конформации, в полноатомном представлении. В расчетах не применяли каких-либо ограничений для поддержания а-спиральной структуры и задания положения пептидов относительно мембраны.

А В 1 )Л/\/УУ\/УУ\/Ч() 2 )

Рис.У.1 А) Модель объекта для работы в пространстве двугранных углов. Цилиндры обозначают а-спиральные участки мономеров ТМ сегментов гликофорина А. В) Геометрические параметры, использованные для характеристики взаимного расположения мономеров в димере: 0 - угол, с1 - расстояние между осями а-спиралей. Пояснения см. в тексте.

С целью изменения в ходе МК-процедуры ориентации пептидов как друг относительно друга, так и относительно бислоя, к И-концу мономера А были присоединены 10 "фиктивных" остатков, а между мономерами А и Б введены 20 "фиктивных" остатков (Рис. V.1). Атомы данных остатков имели нулевые параметры силового поля, поэтому не давали вклад в энергию системы. Атом N в первом "фиктивном" остатке помещали в начало системы координат (0, 0, 0). Стартовые конформации системы задавали случайным образом: в водном и в мембранном окружении, а также с частичным погружением в мембрану (Рис. Ш.З).

Исследование конформационного пространства методом Монте-Карло.

Исследование поверхности потенциальной энергии пептидов осуществляли методом МК в пространстве двугранных углов с помощью программы FANMEM (усовершенствованная авторами версия программы FANTOM (von Freyberg and Braun, 1991)). Цель - поиск и последующий анализ наиболее низкоэнергетических состояний системы - структура и взаимное расположение мономеров, их ориентация относительно мембраны, белок-белковые и белок-мембранные взаимодействия. Предварительно структуры подвергали энергетической минимизации: 80-150 циклов методом сопряженных градиентов. Отбор конформеров на каждом шаге МК осуществляли по критерию Метрополиса (Metropolis et al., 1953). Вычисления проводили без наложения каких-либо ограничений, если это не оговорено особо. Выбор варьируемых двугранных углов производили случайным образом (варьировали 1-2 угла), минимизацию на каждом цикле МК осуществляли методом сопряженных градиентов. В качестве начального состояния при каждом запуске программы FANMEM брали наиболее низкоэнергетический конформер, полученный в предыдущем расчете. В "вакууме" было проведено ~2-10 и 4-104 МК -итераций для одиночного мономера и двух субъединиц, соответственно. Для эффективного преодоления локальных минимумов использовали схему с подстройкой температуры, аналогично (von Freyberg & Braun, 1991). При вычислении нековалентных взаимодействий использовали сферическую отсечку с радиусом 30 А. В методе МК углы а не варьировали (за исключением углов а "фиктивных" остатков). Для учета гетерогенной мембранной среды использовали модель неявно заданной мембраны, описанной ранее (Efremov et al., 2001/2002а). Расчеты проводили при различной толщине мембраны (D): 24, 30, 34, 36, 40 А. Для каждого значения D выполняли по ~ 6-104 шагов МК. Остальные детали расчета можно найти в работе (Efremov et al., 1999а).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Верещага, Яна Александровна, Долгопрудный

1. Adams J.M. and Cory S., Science, 281 (1998) 1322-1326. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Review.

2. Adams P.D., Engelman D.M. and Briinger A.T., Proteins, 26 (1996) 257-261. An improved prediction for the structure of the dimeric transmembrane domain of Glycophorin A obtained through global searching.

3. Arkin I.T., Biochim. Biophys. Acta., 1565 (2002) 347-363. Structural aspects of oligomerization taking place between transmembrane a-helices of bitopic memrane proteins. Review.

4. Ashkenazi., Dixit V.M., Science, 281 (1998) 1305-1308. Death receptors: signaling and modulation. Review.

5. Baker J.B. and Cannigham, D.D., J. Supramol. Struct., 9 (1978) 69-77. Glucocorticoid-mediated alteration in growth factor binding and action: analysis of the binding change.

6. Bargman C.I. and Weinberg R.A., EMBO J., 7 (1988) 2043-2052. Oncogene activation of the neu-encoded receptor protein by point mutations and deletion.

7. Bargman C.I., Hung M.-C. and Weinberg R.A., Nature, 319 (1986a) 226-230. The neu oncogene encodes epidermal growth factor receptor-related protein.

8. Bargman C.I., Hung M.-C. and Weinberg R.A., Cell, 45 (1986b), 649-657. Multiple independent activations of the neu oncogene by a point mutations altering the transmembrane domain of pl85.

9. Barinaga M., Science, 281 (1998) 1302-1305. Stroke-damaged neurons may commit cellular suicide. Is apoptosis key in Alzheimer's disease?

10. Bechinger, В., Mol. Membr. Biol., 17 (2000) 135-142. Biophysical investigations of membrane perturbations by polypeptides using solid-state NMR spectroscopy. Review.

11. Beckstein O., Biggin,P.C., Bond P., Bright J.N., Domene C., Grottesi A., Holyoake J. and Sansom M.S., FEBS Lett., 555 (2003) 85-90. Ion channel gating: insights via molecular simulations.

12. Berman H.M, Bhat T.N., Bourne P.E., Feng Z., Gilliland G., Weissig H., Westbrook, J. Nat. Struct. Biol., 7 (2000) 957-959. An ontology for immune epitopes: application to the design of a broad scope database of immune reactivities

13. Biggin P.C., Sansom M.S., Biophys. Chem., 60 (1996) 99-110. Simulation of voltage-dependent interactions of a-helical peptides with lipid bilayers.

14. Biggin, P.C. and Sansom M.S., Biophys. Chem., 76 (1999) 161-183. Interactions of alpha -helices with lipid bilayers: a review of simulation studies.

15. Blume-Jensen P. and Hunter Т., Nature, 411 (2001) 355-365. Oncogenic kinase signaling.

16. Borner C., Martinou I., Mattmann C., Irmler M., Schaerer E., Martinou J.C., Tschopp J., J Cell Biol., 126 (1994) 1059-1068. The protein bcl-2 alpha does not require membrane attachment, but two conserved domains to suppress apoptosis.

17. Bowie J.U., Nature Struct. Biol., 4 (1997) 915-917. Helix packing angle preferences.

18. Bowie J.U., J. Mol. Biol., 272 (1997) 780-789. Helix packing in membrane proteins.

19. Boyd D., Schierle C. and Beckwith J., Protein Sci., 7 (1998) 201-205. How many membrane proteins are there?

20. Braun R., Engelman D.M., Schulten K., Biophys J., 87(2) (2004) 754-763. Molecular Dynamics Simulations of Micelle Formation around Dimeric Glycophorin A Transmembrane Helices.

21. Breed J., Biggin P.C., Kerr I.D., Smart O.S., Sansom M.S., Biochim. Biophys. Acta., 1325 (1997) 235-249. Alamethicin channels modelling via restrained molecular dynamics simulations.

22. Bretscher M.S. and Munro S., Science, 261 (1993) 1280-1281. Cholesterol and the Golgi apparatus.23.