Выявление и характеристика каинатных рецепторов гамкергических нейронов гиппокампа, управляющих синхронной активностью популяции нейронов в культуре

Кононов, Алексей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление и характеристика каинатных рецепторов гамкергических нейронов гиппокампа, управляющих синхронной активностью популяции нейронов в культуре
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Выявление и характеристика каинатных рецепторов гамкергических нейронов гиппокампа, управляющих синхронной активностью популяции нейронов в культуре"

005003554

На правах рукописи

Кононов Алексей Владимирович

ВЫЯВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КАИНАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ГАМКЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА, УПРАВЛЯЮЩИХ СИНХРОННОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПОПУЛЯЦИИ НЕЙРОНОВ В

КУЛЬТУРЕ

03.01.02-Биофизика

2 4 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2011

005003554

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Зинченко Валерий Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Новоселов Владимир Иванович

доктор биологических наук, Хаспеков Леонид Георгиевич

Ведущап организация: Учреждение Российской академии наук

Институт теоретической и

экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится «/5» декабря 2011 г. в 14 ч. 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Учреждении Российской академии наук: Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН. Автореферат разослан ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совет

кандидат биологических наук / / Смолихина Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Колебания уровня цитозолыюго кальция являются важным параметром клеточной сигнализации, который запускает и регулирует секрецию межклеточных трансмиттеров и активирует экспрессию специфичных генов (Dolmetsch et а/., 1998). В нейронных сетях различных отделов мозга наблюдается спонтанная синхронная активность, которая также возникает в нейронах гиппокампа in vitro через несколько дней культивирования и обусловлена установлением синаптических контактов между нейронами.

Эта активность сопровождается кальциевыми осцилляциями и отражает функционирование целой сети, что позволяет исследовать механизмы передачи сигнала между нейронами и механизмы переключения информационных потоков в нейрональной сети. Физиологическое значение спонтанных синхронных кальциевых осцилляции (ССКО) состоит в синхронной секреции нейротрансмиттеров и гормонов для повышения их концентраций в обширных областях мозга, модуляции нейрональной пластичности в развивающихся нейронах (Spitzer et al., 1995) и для синхронизации экспрессии генов в больших популяциях нейронов. Выявление механизмов контроля частоты и амплитуды колебаний Са2+ в нейронах гиппокампа со стороны различных рецепторов открывает возможности управления отдельными популяциями клеток мозга с использованием лигандов этих рецепторов.

Основу синхронной спонтанной активности, наблюдаемой в культуре нейронов гиппокампа, составляет синаптическая передача возбуждения с участием глутамата, который действует на ионотропные и мстаботропные глутаматные рецепторы. В настоящее время установлены механизмы участия NMDA-, АМРА- и ГАМК(А) рецепторов, а также потенциал-чувствительных кальциевых каналов в модуляции ССКО. Лиганды каинатных рецепторов также являются претендентами на роль регуляторов ССКО, однако об участии этих рецепторов в колебаниях в литературе существуют противоречивые данные.

В предварительных экспериментах нами было показано, что агонисты КА рецепторов подавляют ССКО. Также была обнаружена большая вариабельность ответов (по форме и амплитуде) индивидуальных нейронов на агонисты КА рецепторов.

Цель исследования. Исходя из этого, целью данной работы стало выявление и характеристика каинатных рецепторов нейронов гиппокампа, управляющих синхронной активностью популяции нейронов в культуре.

Основные задачи исследования.

1. Для выявления и характеристики каииатных рецепторов на основе систем анализа изображения и конфокальной микроскопии разработать методику количественного анализа взаимодействия агонистов/антагонистов с каинатными рецепторами.

2. Исследовать причины вариабельности ответов индивидуальных нейронов на агонисты КА рецепторов.

3. Изучить влияние каинатных рецепторов на синхронные спонтанные кальциевые осцилляции в популяции нейронов в культуре клеток гиппокампа.

4. По степени десенситизации и амплитуде Са2+ ответа на агонисты КА рецептора выявить нейроны, управляющие синхронной активностью нейрональной сети.

5. Охарактеризовать по субъединичному составу КА рецепторы нейронов, управляющих синхронной активностью нейрональной сети.

# Идентифицировать тип нейронов, управляющих синхронной активностью нейрональной сети.

Научная новизна работы. В работе разработаны новые методики выявления лигандов каинатных рецепторов и количественного анализа их активности.

Показано, что все нейроны отличаются по форме и АКО на агонисты КА глутаматных рецептов. Амплитуда и форма кальциевого ответа являются характерными параметрами индивидуальной клетки. Нейроны в основном равномерно распределены по амплитуде кальциевого ответа, однако небольшой процент клеток генерирует ступенчатый ответ большой амплитуды без десепситизации. Показано, что нейроны различаются по степени десенситизации КА рецепторов. Ингибитор десенситизации убирает эти различия и не действует на нейроны, генерирующие ступенчатый ответ большой амплитуды.

Выявлены новые механизмы регуляции каинатными рецепторами синхронных спонтанных кальциевых колебаний в нейронах гиппокампа крыс. Показано, что агонисты каинатных рецепторов ингибируют спонтанные синхронные кальциевые осцилляции в популяции нейронов, понижая базальный уровень концентрации ионов кальция в цитоплазме большинства клеток и сильно повышая его в единичных нейронах.

Обнаружены нейроны, управляющие через каинатные рецепторы без десенситизации синхронной активностью всей популяции. Эти нейроны подавляют колебания кальция в других нейронах, генерируя в ответ на агонисты КА-рецепторов кальциевый сигнал большой амплитуды без

десенситизации. Показано, что КА-рецепторы этих нейронов содержат субъединицу 01и115.

Методом иммуноцитохимии показано, что управляющие нейроны, отличающиеся большей амплитудой кальциевого ответа на агонисты КА-рецепторов без десенситизации и имеющие КА-рецепторы, содержащие субъединицу 01иК5, являются ГАМКергическими интернейронами.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволят глубже понять процессы, связанные с регуляцией каинатными рецепторами синхронной активности целых популяций нейронов, а также предположить механизм избирательной гибели ГАМКергических нейронов при таких нейродегенеративных заболеваниях, как эпилепсия, болезнь Хантингтона и другие. Результаты данной работы могут расширить круг мишеней действия фармакологических препаратов при указанных расстройствах.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011), «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Клязьма, 2010 год), на международных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, г. Судак, 2010г., 2011г.), на всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010г.), на международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 16 печатных работах, из них 4 статьи в реферируемых журналах, 5 статей в сборниках и 7 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на М страницах с использованием рисунков таблиц и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит/с%ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ГИППОКАМПА. Клетки выделяли из новорожденных (1-3 дня) линейных крыс породы Бргаяие ОаиЛау. После декапитации, гиппокампы извлекали и помещали в холодный НВ8Й с добавлением 20мкг/мл гентамицина. После измельчения с помощью ножниц,

ткань помещали в раствор Версена (Gibco) с добавлением 0,03% трипсина. Инкубировали 15мин при 37°С на термошейкере при 600об/мин. Затем трипсин инактивировали равным объемом холодной FBS, клетки осаждали на центрифуге 4мин при ЗОООоб/мин и еще два раза отмывали в нейробазалыюй среде (Gibco). Затем клетки ресуспендировали в нейробазальной среде с добавлением глутамина (0,5мМ), Supplement В27 (2%), гентамицина (20мкг/мл). Готовую суспензию наносили на круглые покровные стекла диаметром 25мМ, покрытые полиэтиленимином из расчета 1 гиппокамп на 10 стекол и помещали в 35мм чашки Петри. При этом использовали стеклянные цилиндры с отшлифованными торцами с внутренним диаметром 6мм, установленные на покровных стеклах. В каждый такой цилиндр помещали ЮОмкл суспензии клеток и оставляли на б часов для прикрепления во влажной атмосфере 5% С02 и 95% воздуха. После этого цилиндры убирали, а объем культуральной среды доводили до 1,5мл и культуру помещали в С02-инкубатор. Один раз в неделю заменяли 2/3 культуральной среды на свежую. В экспериментах использовали культуру в возрасте 1-21 дня в зависимости от решаемой задачи. Нейроны в культуре идентифицировали по транзитному увеличению [Ca2+]i в ответ на кратковременное (20сек) приложение 50мМ KCl за Юмин до начала эксперимента.

ИЗМЕРЕНИЯ УРОВНЯ ЦИТОЗОЛЬНОГО КАЛЬЦИЯ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ. Изменения [Ca2+]i в нейронах регистрировали по интенсивности флуоресценции двухволнового Са2+-чуствителыюго зонда Fura-2 [23, 24]. Для измерения [Ca2+]j использовали систему анализа изображений на базе инвертированного моторизованного микроскопа Leica DMI6000 В, оснащенного высокоскоростной монохромной CCD -камерой HAMAMATSU С9100, системой высокоскоростной смены возбуждающих светофильтров Leica's Ultra-Fast Filter Wheels (время переключения 17 мс). Для работы использовали объектив Leica HC PL АРО 20х/0.7 IMM. В качестве источника возбуждения флуоресценции использовали осветитель Leica EL6000 с ртутной лампой высокого давления НВО 103 W/2. Для возбуждения и регистрации флуоресценции Fura-2 использовали набор светофильтров FU2 (Leica, Германия) с фильтрами возбуждения ВР340/30 и ВР387/15, светоделителем FT410 и фильтром эмиссии ВР510/84. Полученные на двух различных каналах временные серии изображений обрабатывали в программе ImageJ с использованием программ Time Series Analyzer и RatioPlus. При обработке серий изображений измеряли амплитуду кальциевых ответов одиночных клеток, выраженную как отношение сигналов флуоресценции Fura-2 при возбуждении 340 и 380нм. Для построения графиков и статистической обработки использовали Origin 7.5. В случае транзитного сигнала амплитуду рассчитывали исходя из максимального значения флуоресценции за период аппликации вещества, в случае с сигналом в виде плато амплитуда рассчитывалась исходя из

среднего значения интенсивности флуоресценции во время нахождения сигнала на плато. Ошибка расчета среднего значения составляла 0,04.

Для ультраскоростной съемки флуоресценции Fura-2 использовался осветитель на базе ксеноновой лампы Lambda DG-4 производства Sutter Instrument. Lambda DG-4 основан на применении двойного сканирующего гальванометра и интерференционных фильтров для выбора длины волны. Свет от ксеноновой дуговой лампы фокусируется на первом гальванометрическом зеркале, которое направляет его через параболическое зеркало в каналы интерференционных фильтров 340 и 380нМ. После фильтров расположено второе параболическое зеркало и зеркало второго гальванометра, направляющего свет в выходной оптический канал. Первое холодное зеркало отсекает инфракрасное излучение, существенно снижая нагрев оптической системы при работе. Таким образом, достигается скорость смены возбуждения в 2 миллисекунды.

СИСТЕМА БЫСТРОЙ АППЛИКАЦИИ ВЕЩЕСТВ. Быстрые концентрационные изменения веществ производились с помощью перфузионной системы VC-6MCS производства Warner Instruments. Система включала в себя следующие компоненты:

- VC-66MCS - полная 6-канальная мини-клапанная перфузионная система

- SF-77B - система быстрой смены положения подающей пипетки.

- MM-33R- микроманипулятор

Подачу растворов производили через стеклянные квадратные пипетки. С обратной стороны в отсеки пипеток вводились тонкие полиэтиленовые трубочки, которые через систему управляемых клапанов присоединялись к гравитационной системе подачи растворов. Система быстрой смены положения подающей пипетки SF-77B позволяла быстро помещать капилляр с заданным раствором в область регистрируемых клеток. Таким образом, скорость смены раствора, омывающего клетки, была 50мс. Перемещение пипеток и управление запирающих клапанов производились с помощью программного обеспечения Axio Vision.

ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ

ГАМКЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ. После записи кальциевых ответов клетки фиксировали, окрашивали антителами и Hoechst 33342, и регистрировали флуоресценцию антител на инвертированном конфокальном микроскопе. Для окрашивания использовали растворы: фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4; 3% парафармальдегид в PBS; 2 и 10% сыворотку осла в PBS. Клетки фиксировали 3% парафармальдегидом в PBS в течение 10 мин. Затем препарат промывали PBS 3 раза по 5 минут. После этого клетки заливали PBS, содержащим Triton Х-100 в концентрации 0,3% на 10 минут и промывали PBS 3 раза по 5 минут. Для блокирования неспецифического связывания к клеткам добавляли 10 % сыворотку осла на 30 мин. На

покровное стекло с культурой клеток ставили стеклянный цилиндр (внутренний диаметр 6 мм), и добавляли в него 100 мкл раствора первичных кроличьих антител против глутаматдекарбоксилазы 65/67, разведенных в 2% сыворотке осла в отношении 1:100. Через час цилиндр убирали и промывали 3 раза по 15 минут PBS, содержащим 0,3% Triton Х-100. Далее на покровное стекло с культурой клеток опять ставили стеклянный цилиндр и добавляли в него 100 мкл вторичных антител осла против кролика, конъюгированных с Atto565 и разведенных в отношении 1:100 в фосфатно-солевом буфере, содержащим 0,3% Triton Х-100 и 0,05% NaN3, согласно руководства производителя (НПФ «Биотехнологии»). Окрашивание производили в темноте. После промывки (3 раза по 5 минут в PBS) препарат окрашивали в течение 3 минут в растворе Hoechst 33342 для визуализации ядер клеток. После отмывки PBS клетки заливали глицерином. Флуоресценцию Hoechst 33342 и Atto565 регистрировали на инвертированном конфокальном микроскопе Leica TCS SP5, используя для возбуждения линии лазеров длиной волны 405 и 565 нМ, регистрацию флуоресценции производили в областях 450-500 и 575-650нМ соответственно.

СОПОСТАВЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ ОТВЕТОВ НЕЙРОНОВ С ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИМ АНАЛИЗОМ. На стекла с культурой клеток после монтирования в измерительную ячейку на обратную сторону наносилась сетка для координации при поиске и сопоставления клеток. Далее производилась регистрация кальциевых ответов с помощью флуоресцентного зонда Fura-2 на флуоресцентном микроскопе. После окончания съемки клетки фотографировались в проходящем свете, используя дифференциально-интерференционный контраст. Далее проходил этап покраски антителами против глутаматдекарбоксилазы 65/67, которая экспрессируется в ГАМКергических нейронах и катализирует реакцию превращения глутаминовой кислоты в ГАМК. После этого клетки покрывались глицерином и на конфокальном микроскопе в проходящем свете с помощью нанесенной ранее сетки, определялось местоположение клеток, снятых на флуоресцентной станции. Далее проводилась регистрация флуоресценции антител и сопоставление с кальциевым сигналом каждой индивидуальной клетки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ АГОНИСТОВ КАИНАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ. Хорошо известно, что каинатные рецепторы, деполяризуя клеточную мембрану, способствуют активации входа кальция через NMDA-и потенциал-зависимые кальциевые каналы, кроме этого отдельные изоформы этих рецепторов также проводят кальций (Silva et al.,2001). Поэтому для детекции активности каинатных рецепторов мы использовали систему анализа изображения, регистрирующую концентрацию ионов Ca"

по флуоресценции двухволнового флуоресцентного зонда Рига-2, что позволяет количественно и быстро регистрировать индивидуальную активность рецепторов сотен клеток одновременно и визуализировать функциональное взаимодействие нейронов в культуре.

Среди агонистов каинатиых рецепторов исследователями наиболее широко используются два лиганда - это каиновая (КА) и домоевая (ВА) кислоты. На рисунке I представлены кривые зависимости изменения [Са2'} от времени в нескольких клетках при действии домоевой (ЭА) кислоты. Кратковременное добавление (30 секунд) 200нМ домоевой кислоты приводит к резкому повышению уровня цитозольного к&тьция в нейронах гиппокампа с последующим возвращением концентрации кальция до базалытого уровня.

о га

Время, с

Рис. 1. Кальциевые ответы нейронов на 200нМ ВА с последующей отмывкой от агониста. Здесь и далее время приложения агониста указано горизонтальной чертой.

Как видно из рисунка домоевая кислота вызывает разнообразные по амплитуде и форме кальциевые ответы в клетках. Анализ ответов единичных клеток на приложение 200нМ ОА показал наличие трех типов кальциевых сигналов среди клеток одной культуры: импульсный, ступенчатый и промежуточный.

Повторная (кратковременная) аппликация агонистов с промежуточной паузой в 10 минут вызывала в большинстве клеток кальциевый ответ, практически идентичный первому (рис 2а). Видно, что хотя амплитуда и форма ответов в клетках различны, но ответ на повторную аппликацию лиганда в каждой клетке с высокой точностью повторяет первый ответ. Для проверки постоянства амплитуды кальциевого ответа (АКО) при

повторных добавках домоевой кислоты во всех нейронах в поле зрения микроскопа, мы построили зависимость АКО на вторую добавку домоевой кислоты от АКО на первую добавку для всех нейронов (рис. 26) и аппроксимировали полученные данные линейной функцией. Коэффициент наклона кривой оказался равен 1. Таким образом, АКО на агонисты каинатных рецепторов глутамата сильно отличаются в разных нейронах. Вместе с тем, при кратковременной аппликации агонистов АКО строго повторяются при повторной добавке и являются характеристикой каждой клетки.

Рис. 2.

А - Изменение [Са2+]1 в четырех нейронах в ответ на повторные добавки ЭА. Б - Зависимость АКО в ответ на вторую добавку ОА (Амплитуда 2) от АКО в ответ на первую добавку (Амплитуда1) для всех нейронов в поле зрения микроскопа, ответивших наОА.

Поскольку БА не является абсолютно селективным агонистом КА рецепторов по отношению к АМРА рецепторам, то для селективной активации КА рецепторов мы добавляли ОА в присутствии селективного ингибитора АМРА рецепторов ОУК1-52466 .

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АМПЛИТУД КАЛЬЦИЕВЫХ ОТВЕТОВ НЕЙРОНОВ НА АГОНИСТЫ КАИНАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ. Для дальнейшей разработки методики количественного анализа взаимодействия лигандов с рецепторами было необходимо проанализировать и выявить причины наблюдаемых различий Са2+-ответов отдельных нейронов и закономерности распределения АКО на агонисты каинатных рецепторов. Для этого АКО каждого нейрона были измерены и расположены по возрастанию. На рисунке 3 показано, что АКО нейронов на агонисты рецепторов в основном равномерно распределены в широком диапазоне интенсивностей и лишь небольшой процент клеток в каждом распределении обладает аномально высокими АКО. Наблюдаемое разнообразие АКО нейронов может быть обусловлено несколькими причинами: различиями в количестве рецепторов, индивидуальном наборе изоформ рецепторов и степенью десенситизации рецепторов.

1.5

Рис. 3. Распределение нейронов по амплитуде кальциевого ответа в культуре клеток гиппокампа в ответ на добавление агонистов АМРА-, КА-, NMDA-рецепторов и K.CI: 2мкМ FW (1), 50мкМ NMDA (2), 50мМ КС1 (3), 200 иМ DA и ЗОмкМ GYK1-52466 (4).

ДЕСЕНСИТИЗАЦИЯ КАИНАТНЫХ И АМРА-РЕЦЕПТОРОВ. Известно, что процессы десенситизации AMP А- и КА-рецепторов приводят к уменьшению АКО (Silva el al.,2001, Ambrosio et al., 2000). Чтобы проверить, не является ли равномерное распределение и разнообразие АКО результатом различной степени десенситизации рецепторов, мы измеряли АКО на агонисты КА- и АМРА-рецепторов в присутствии ингибиторов десенситизации этих рецепторов. Степень десенситизации обычно характеризуется соотношением амплитуд пик/плато (Lee et al., 2001, Holm et al., 2005). Десенситизацию КА- и АМРА-рецепторов снимали конканавалином A (Con А) и циклотиазидом (CTZ) соответственно (Silva et al.,2001, Ambrosio et al, 2000). На рис. 4 показан усредненный кальциевый ответ 23-х нейронов на активацию КА-рецепторов домоевой кислотой в отсутствии и в присутствии ингибитора десенситизации СопА. Видно, что в присутствии ингибитора десенситизации импульсный кальциевый ответ меняется на ступенчатый. АКО возрастает и остается такой же в ответ на повторную аппликацию агониста КА-рецептора. Третья добавка сделана, чтобы показать, что эффект ингибитора десенситизации сохраняется даже после отмывки Con А. На рисунке 5 приведены: распределение клеток по АКО на DA в контроле (1); АКО тех же клеток на DA в присутствии ингибитора десенситизации Con А (2) и разность между этими амплитудами (4). Хотя АКО в присутствии Con А в большинстве нейронов увеличивается с ростом АКО в контроле (линейная аппроксимация 3), разность амплитуд в присутствии и отсутствии Con А при этом в среднем уменьшается. В клетках с самой большой исходной АКО на DA эффект увеличения амплитуды в присутствии ингибитора десенситизации отсутствует. Отсюда следует, что КА-рецепторы разных нейронов отличаются по степени десенситизации и есть нейроны, в которых десенситизация отсутствует.

СУК! 52466 + Соп А

0УКЙ2466 I-1

Время, с

Рис. 4. Увеличение [Са2_г]1 в нейронах в ответ на добавление агонистаКА-рецептора 200нМ ЭА + ЗОмкМ СУК1-52466 в отсутствии и в присутствии 200мкг/мл СопА. Стрелками указаны паузы в регистрации изображения. Приведен усредненный ответ 23 клеток.

Номер клетки

Рис. 5. Распределение клеток но АКО на 200нМ ОА + ЗОмкМ вУК! (1). АКО тех же клеток в присутствии ингибитора десенситизации СопА (2) и ее линейная аппроксимация (3). Разность амплитуд в присутствии и отсутствии Соп А (4) и ее линейная аппроксимация (5).

Аналогичные эксперименты были проведены и с агонистами АМРА-рецепторов. Присутствие ингибитора десенситизации АМРА-рецептора циклотиазида (CTZ) также приводило к увеличению АКО клеток на селективный агонист АМРА-рецептора фторвиллардиин (Р\¥). На рисунке 6 приведено распределение клеток по АКО на (1) и соответствующие значения АКО в присутствии ингибитора десенситизации CTZ (2), а также разность между этими амплитудами (4). Как и в случае КА-рецепторов, разность между АКО в присутствии и отсутствии СТг в большинстве нейронов уменьшается с ростом амплитуды ответа в контроле и стремится к нулю у клеток с исходно максимальной АКО, указывая на отсутствие эффекта ингибитора десенситизации в этих клетках. Таким образом, наблюдаемые различия АКО на агонисты глутаматных рецепторов большинства нейронов частично объясняются различной степенью десенситизации этих рецепторов в различных нейронах.

8 < 0.0

100 200 Номер клетки

Рис. 6. Распределение клеток по АКО на 750 нМ (1). Соответствующее распределение АКО в присутствии СТ2 (2) и ее линейная аппроксимация (3). Разность амплитуд в присутствии и отсутствии СТг (4) и ее линейная аппроксимация (5).

Исходя из полученных зависимостей уменьшения эффекта ингибиторов десенситизации при увеличении исходной АКО, мы предположили, что поскольку увеличение концентрации агоииста увеличивает амплитуду ответа, оно может приводить к исчезновению эффекта десенситизации рецептора. Действительно, при исследовании концентрационной зависимости активности КА-рецепторов было установлено, что при увеличении концентрации агониста эффект десенситизации рецептора ослабляется, и ответ из импульсного превращается в ступенчатый (рис. 7). Видно, что эффект повышения АКО в присутствии ингибитора в среднем уменьшается при повышении концентрации агониста. Таким образом, сами агонисты КА-рецепторов в больших концентрациях выполняют функцию ингибитора десенситизации.

Время, с

Рис. 7. Изменение степени десенситизации рецепторов (формы кальциевого ответа) при последовательной аппликации четырех концентраций ЭА (200, 400, 800 и 1600 нМ).

ХАРАКТЕРИСТИКА АГОНИСТОВ КА-РЕЦЕПТОРОВ.

Использование блокаторов десенситизации дает возможность получить более адекватные усредненные характеристики взаимодействия агонистов с КА рецепторами. Так, на рисунке 8 в полулогарифмических координатах представлены зависимость АКО от концентрации БА. Из полученной зависимости были определены концентрация ПА, вызывающая полумаксимальное увеличение в нейронах (ЕС50 - 28нМ),

максимальная амплитуда ответа (Етах = 0,6) и коэффициент Хилла = 2,4. Исходя из этих значений далее для характеристики антагонистов КА-рецепторов в качестве стандартной аппликации использовали ОА в концентрации ЗОнМ.

0,6-

Рис.8. Зависимость АКО от концентрации ЭЛ. Представлены средние ответы 90-110 нейронов. Здесь и на рис.3, б, 8,9,11, 12-каждая точка кривой является средним

значением по результатам 3-5 экспериментов.

0,0-

-8,5 -8,0 -7,5 -7,0 -€,5

1од([ОА]/М)

ХАРАКТЕРИСТИКА АНТАГОНИСТОВ КА-РЕЦЕПТОРОВ. Семейство каинатных-рецепторов, экспрессированных в нейронах гиппокампа, могут иметь в своем составе 5 типов субъединиц: вЫЖЛ, ОШК2, ОШКЗ, вШК4 и ОШК5. На данный момент еще не синтезированы антагонисты, действующие селективно на каждую из 5 типов субъединиц, а использование антагонистов селективных к одному определенному типу субъединиц не позволяет выявить агонисты КА-рецепторов, действующие сразу на несколько типов субъединиц. Поэтому для регистрации активности КА-рецепторов, состоящих из различных субъединиц, мы предлагаем использовать неселективный по отношению к различным субъединицам КА-рецепторов агонист Е)А в присутствии селективного антагониста АМРАЯ - ОУК1-524бб и ингибировать полученный ответ неселективным антагонистом ЫВ<ЗХ, как показано на рис.9.

0,4-

СУК1

Рис.9. Изменение [Са2+]1 в нейронах в ответ на ОА (200нМ) в контроле и в присутствии 20мкМ ОУК1-52466, ЗОмкМИВОХ (п= 15).

ОА

КС1

400 600 800 1000 1200 1400 Время, сек

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТЫ ИНГИБИРОВАНИЯ КА-РЕЦЕПТОРОВ КОНКУРЕНТНЫМ АНТАГОНИСТОМ ЫВдХ. На рис.10 показаны «кальциевые ответы» нейронов гиппокампа на повторные аппликации агониста КА-рецептора ЭА (40нМ) в присутствии различных концентраций конкурентного ингибитора ЫВОХ. По результатам подобных экспериментов была построена кривая зависимости АКО на йЛ от концентрации антагониста. Экспериментальные точки аппроксимированы сигмовидной кривой дозовой зависимости, из которой была определена константа ингибирования 1С50 = 3,8мкМ. В дальнейшем эта концентрация антагониста использовалась при проведении экспериментов по определению типа ингибирования.

0,5

200 400 600 800 Время, сек

Рис.10. ИВСЗХ в концентрациях 0,5, 1, 2, 5, 7,5, 10,20,40мкМ дозозависимо подавляет кальциевый сигнал в нейронах, индуцированный РА (40пМ). СопА (200мкг/мл) добавлен за 15мин до начала регистрации. Аппликация ГЗА производилась на фоне ЗОмкМ ОУК1-52466. Пауза между аппликациями Юмин. Показан средний ответ 39 клетки.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИПА ИНГИБИРОВАНИЯ. Для определения типа антагонистической активности проводили титровку рецептора агонистом ОЛ в присутствии антагониста в концентрации, вызывающей полумаксимальный эффект ингибирования активности КА-рецептора (3,8мкМ ИВС^Х). На рис.11 представлены зависимости АКО нейронов на БА от концентрации О А в присутствии этой концентрации антагониста КА-рецеитора. Из полученных зависимостей были определены концентрации О А, вызывающие полумаксимальное увеличение [Са2+]; ЕС50 = 51нМ, и 78нМ, а также значение максимального Са2+-отвега - Етах = 0,49 в контроле и в присутствии антагониста 1МВ(ЗХ. Из рисунка видно, что в присутствии ингибитора происходит смещение кривой доза-эффект вправо, значение максимального ответа при этом не меняется, что, согласно оккупационной теории, указывает на конкурентный тип ингибирования.

0,5-,

I 0,3-

5 О"

■О

£0,4-

Ш 0,2-

0,0-

-9

-8

-7

-6

!од ([РА]/М)

Рис.11. Зависимости АКО на ОА от концигтрации РА в контроле (1) и в присутствии конкурентного ингибитора КА рецептора ШС>Х (3,6мкМ) (2) ЕС50 = 51нМ, и 78нМ, в контроле и в присутствии антагониста МВС>Х соответственно.

Таким образом, впервые с помощью методики анализа изображения (методики измерения АКО на агонисты КА рецепторов) получены количественные характеристики взаимодействия известных лигандов КА рецепторов. Разработанный универсальный метод позволяет определить и охарактеризовать все лиганды каинатных рецепторов.

Используя данный метод, мы смогли проанализировать участие каинатных рецепторов в синхронных спонтанных кальциевых осцилляциях.

ВЫЯВЛЕНИЕ УЧАСТИЯ КАИНАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В СИНХРОННЫХ СПОНТАННЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ ОСЦИЛЛЯЦИЯХ. К 9-10 дню культивирования у нейронов, выделенных из гиппокампа, возникает синхронная спонтанная активность. К этому времени в культуре клеток формируются многочисленные синаптические связи между нейронами. Эта активность хорошо обнаруживается по изменению уровня цитозольного кальция. Мы проверили действие агонистов и антагонистов глутаматных (ЫМПА, АМРА и КА) и ГАМКа рецепторов на спонтанные синхронные колебания Са2+ и получили сильную зависимость частоты и амплитуды колебаний от активности ГАМКл-рецепторов. На рис. 12 видно, что антагонист ГАМКА-рецепторов бикукуллин в концентрации ЮмкМ приводит к уменьшению частоты, увеличению амплитуды кальциевых колебаний и синхронности возникновения колебаний, указывая на важную роль

ГАМКергических нейронов в регуляции синхронной активности нейронных популяций.

0.5

= 0.4 о

Q 0,3 0,2

Bicucuüíne 10/nkM

Рис.12. Сиихронизации кальциевых колебаний и увеличение амплитуды под действием бикукуллина (ЮмкМ).

240 270 300 330 360 Время, с

Для выявления участия каинатных рецепторов в ССКО мы использовали неселективный антагонист АМРА/КА рецепторов ЫВ(}Х и селективный неконкурентный антагонист АМРА-рецептора ОУК1-52466. На рис.13 показано, что ЫВ(}Х в концентрации ЗОмкМ вызывал полное ингибирование спонтанной активности, что указывало на участие рецепторов этого семейства в генерации колебаний.

$ 0,35 о

СМ' 0,30-Э

О.

| .........

§ 0 1 00 200 300 400 600 600 700

Время, с

Рис.13. Спонтанные колебания [Ca2+]i в нейронах гиппокампа. Неселекгивный антагонист АМРА/КА рецепторов N.BQX в концентрации ЗОмкМ вызывает полное ингибирование спонтанной активности. Показан усредненный ответ 41 клетки.

На рис. 14 показано действие антагонистов АМРА и NMDA-рецепторов на ССКО. Селективный блокатор АМРА-рецептора GYKI-52466 в насыщающей концентрации хотя и уменьшал амплитуду колебаний, но не подавлял ее полностью. Кроме того, этот эффект был обратим. Блокирование NMDA-рецептора селективным антагонистом МК-801 также не приводило к полному подавлению ССКО. МК-801 медленно уменьшал амплитуду колебаний. GYKI-52466 только совместно с МК-801 полностью подавлял ССКО. Добавление GYKI-52466 на его фоне прекращало колебания. Это говорит о том, что каинатные рецепторы, расположенные на постсинаптической мембране могут во время ССКО, наряду с АМРА рецепторами, также выступать в роли деполяризирующего стимула и стимулировать вход ионов кальция через NMDA рецептор.

Время, с

Рис.14. Селективный антагонист АМРА-рецептара GYKI-52466 в концентрации ЗОмкМ, как и антагонист NMDA-рецептора МК-801 в концентрации ЮмкМ не полностью блокирует ССКО. Совместная аппликация этих лигандов приводит к полному подавлению

ССКО.

UBP302, селективный антагонист КА-рецепторов, содержащих субъединицу GluR5. в концентрации 20мкМ вызывал полное подавление кальциевых колебаний в течение 2-х мин (Рис. 15). Этот эффект вероятно опосредуется через каинатные рецепторы пресинаятической мембраны, подавляя секрецию глутамата, поскольку субъединица GluR5 в основном располагается на пресинаптической мембране и участвует в регуляции выброса нейромедиаторов. Эти данные согласуются с результатами, полученными Cunningham М.О. et al. (2006) методом пэтч-клямп на срезах энторинальной коры. Таким образом, приведенные данные демонстрируют участие каинатных рецепторов в ССКО и предполагают особую роль в этом каинатных рецепторов, содержащих GLUR5 субъединицу.

UBP302

200 300 400 500

Время, С

Рис.15. Антагонист 0!иЯ5 субъединицы КА рецепторов 1)ВР302 в концентрации 20мкМ вызывает ингибирование ССКО. Показан усредненный ответ 71 клетки.

ДЕЙСТВИЕ АГОНИСТОВ КАИНАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА ССКО. На рисунке 16 представлены изменения уровня цитозольного кальция от времени в трех нейронах, зарегистрированных на 14 день культивирования. Видно, что аппликация агониста каинатных рецепторов домоевой кислоты в концентрации 200нМ приводит к полному подавлению синхронных спонтанных кальциевых осцилляций во всех клетках.

Рис. 16. Подавление ССКО в нейронах агонистом КА-реценторов домоевой кислотой (БА). Показаны индивидуальные ответы 3 нейронов. ОА вызывает повышение [Са2+]* в одних нейронах (1) и понижает [Са21"Ь в других нейронах. Спонтанная активность восстанавливается только после того как в клетках I ¡Са2+]; возвращается до базального уровня.

Причем в части клеток домоевая кислота приводила к ступенчатому ответу большой амплитуды, то есть кальциевый ответ в этих клетках не обладает десенситизацией и цитозольный кальций поддерживается на высоком уровне вплоть до убирания из среды лиганда рецептора. При анализе данных было обнаружено, что повышенное содержание уровня кальция в клетках со ступенчатым ответом препятствует восстановлению колебаний во всех нейронах культуры даже после отмытия агониста каинатных рецепторов (увеличенная часть рисунка 16). Этот факт говорит об управляющей функции этих клеток. Таким образом, нами были обнаружены нейроны, управляющие активностью нейрональной сети в культуре, причем агонисты К А рецепторов вызывают в этих нейронах Са2+ ответ без признаков десенситизации.

120

Время, с

360

480

ДЕЙСТВИЕ СЕЛЕКТИВНЫХ АГОНИСТОВ КАИНАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА СИНХРОННЫЕ СПОНТАННЫЕ КАЛЬЦИЕВЫЕ ОСЦИЛЛЯЦИИ. Для определения подтипа каинатных реиепторов, вызывающих ступенчатый кальциевый сигнал в управляющих нейронах, мы использовали селективные в отношении определенных субъединиц рецепторов агонисты. На рисунке 17 показано, что агонист КА-рецепторов, содержащих 01и115/01иК.6 субъединицы, 8УМ2081 и агонист КА-рецепторов, содержащих 01иЯ5 субъединицу, АТРА также подавляет колебания.

Рис. 17. Подавление ССКО в нейронах агонистами КА-рецепторов. (А) ЮмкМ SYM2081, агониста GluR5 и GluR6 и (Б) - 0,5мкМ АТРА, агониста GluRS-субъединицы КА-рецептора. Агонисты вызывают повышение [Ca2+]i в одних нейронах (1) и понижают [Ca2+]i в других нейронах (2).

Агонист вызывает повышение [Ca2l"]j в одних нейронах и понижает [Са24]| в других. Таким образом, применение селективного к отдельным субъединицам КА-рецепторов агониста показало, что агонисты рецепторов, содержащих субъединицу GluR5, вызывают в отдельных нейронах Са2+ ответ без десенситизации, и на время повышения [Са_+]| в этих нейронах останавливаются колебания во всей популяции. Нейроны, содержащие эти рецепторы, могут подавлять колебания кальция в других нейронах, генерируя кальциевый сигнал большой амплитуды без десенситизации.

НЕЙРОНЫ С МАКСИМАЛЬНЫМИ АКО. Значения АКО на агонисты каинатных рецепторов, в среднем, достигают 0,3, а максимальные сигналы -0,6. Из этой закономерности выпадают одиночные клетки с очень большими АКО: 0,9 - 1,2. Таких нейронов в культуре клеток встречается 1-3%. Ингибиторы десенситизации не увеличивают АКО таких нейронов, что означает присутствие КА-рецепторов без десенситизации в данных нейронах. По-видимому, отсутствие десенситизации КА рецепторов в этих нейронах приводит к развитию максимального ступенчатого ответа на агонист, что может привести к повышенной активации секреции трансмиттеров, а также к избирательной гибели этих нейронов (Ambrosio el al., 2000). В работе (Carriedo et al., 1998) показано, что высокая АКО на КА в отдельных

ГАМКергических интернейронах коррелирует с высокой токсичностью и высоким уровнем активных форм кислорода в этих клетках. Только в этих нейронах АКО на агонист достигала микромолярных значений, что сопровождалось деполяризацией митохондрий. Также показана токсичность именно ступенчатого, а не импульсного кальциевого ответа. Этот тип нейронов отличался также экспрессией КА рецепторов, проницаемых для Са2+.

Поэтому нами было предположено, что нейроны, подавляющие колебания кальция в других нейронах, генерируя в ответ на агонисты КА-рецепторов кальциевый сигнал большой амплитуды без десенситизации, являются ГАМКергическими интернейронами гиппокампа.

ВЫЯВЛЕНИЕ ГАМКЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ

ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ. Для идентификации типа нейронов, управляющих нейрональной сетью, мы использовали различные антитела, в том числе антитела против глутаматдекарбоксилазы 65/67. Этот фермент экспрессируется в ГАМКергических нейронах и катализирует реакцию превращения глутаминовой кислоты в ГАМК. На рисунке 20 показаны клетки гиппокампа, окрашенные Hoechst 33342 (голубой) и антителами против глутаматдекарбоксилазы 65/67 (красный). Видно, что лишь в единичных нейронах наблюдается высокое содержание фермента (цитоплазма и отростки окрашены) и на этом основании могут быть отнесены к ГАМКергическим. По форме окрашенные нейроны напоминают мультиполярные звездчатые интернейроны (рис. 20).

Для сопоставления Са2+ сигналов нейронов и активности глутаматдекарбоксилазы изображения живых клеток (после регистрации на инвертированном флуоресцентном микроскопе их кальциевых сигналов в ответ на аппликацию домоевой кислоты) совмещали с изображением этих же клеток, фиксированных и окрашенных антителами против глутаматдекарбоксилазу 65/67, полученном на конфокальном микроскопе. На рисунке 20 приведены изображения окрашенных антителами клеток и Ca" сигналы, полученные с этих нейронов. Видно, что только клетки с интенсивно окрашенной цитоплазмой в ответ на агонист КА-рецептора генерируют кальциевый сигнал без десенситизации. В остальных нейронах наблюдаются сигналы с различной степенью десенситизации. Из приведенных экспериментов следует, что нейроны, отличающиеся большей амплитудой кальциевого ответа на агонисты КА-рецепторов без десенситизации и имеющие КА-рецепторы (содержащие субъединицу GluR5) в пресинаптической мембране, являются ГАМКергическими интернейронами, повышение [Са2+]; в которых подавляет синхронную активность целой популяции нейронов.

Нейроны без десенситизации, регулирующие спонтанную кальциевую активность, -ГАМКЕРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОНЫ

Рис. 20. Клетки гиппокампа в культуре, окрашенные Hoechst 33342 (голубой) и антителами против GAD65/67 (красный). В единичных нейронах цитоплазма окрашена антителами. Только эти нейроны генерируют ступенчатый Са2+ ответ на агонист КА-рецептора. В остальных нейронах DA вызывает импульсное повышение [Ca2+]i.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большинство исследований в области изучения физиологической роли каинатных рецепторов сосредоточено на выяснении роли этих рецепторов в возникновении различных нейродегенеративных заболеваний, таких как эпилепсия, болезни Хантингтона и др. При этом существует достаточное количество противоречивых данных об участии каинатных рецепторов в этих заболеваниях. Это связано как с отсутствием селективных лигандов рецепторов, так и с противоположно направленным влиянием на синаптическую передачу. Поскольку каинатные рецепторы располагаются как на постсинаптической, так и на пресинаптической мембранах, активация этих рецепторов может приводить и к усилению нейропередачи, и к подавлению секреции глутамата и активации секреции ГАМК, что приведет к подавлению возбудимости нейронов. Кроме этого, от остальных ионотропных рецепторов каинатные рецепторы отличаются крайне высокой степенью десенситизации, что также усложняет исследование их роли в различных заболеваниях.

В настоящем исследовании детально исследованы причины разнообразия амплитуд кальциевых ответов на агонисты каинатных рецепторов в культуре нейронов гиппокампа. В частности показано, что причиной такого разнообразия являются различия в количестве рецепторов и степени десенситизации каинатных рецепторов. Среди разнообразных кальциевых ответов на агонисты каинатных рецепторов выделяются три группы клеток, различающихся по форме ответа и амплитуде. Первая группа клеток характеризуется быстрым транзитным кальциевым ответом, что говорит о высокой степени десенситизации. Другая часть клеток

-20-

характеризуется медленным спадом уровня кальция еще до удаления агониста из среды. Кроме этого, была обнаружена небольшая группа (2-4%) клеток, отвечающих необычно большим по амплитуде кальциевым ответом. Причем уровень цитозольного кальция в этих клетках не понижался вплоть до удаления агониста из среды. Это говорит о том, что эти клетки содержат каинатные рецепторы без десенситизации, что также подтверждено отсутствием эффекта блокатора десенситизации КА- рецепторов.

При исследовании действия лигандов КА-рецепторов на спонтанные синхронные кальциевые осцилляции, было обнаружено, что каинатные рецепторы, содержащие субъединицу Ст1и115, в ответ на агонисты КА-рецепторов могут генерировать кальциевый ответ ступенчатой формы без десенситизации. Было обнаружено, что повышение концентрации кальция в этих клетках имеет отношение к механизму блокирования кальциевых колебаний в остальных нейронах, у которых синхронная активность возобновляется только после понижения концентрации Са2+ в «управляющих» нейронах до суббазалыюго.

Использование агонистов, активирующих только каинатные рецепторы, содержащие ОШ15 субьединицу, также приводило к блокированию кальциевых колебаний, причем селективный антагонист этих рецепторов ивР320 отменял действие агониста как на колебания, так и на повышение копцетрации Са2+ в «управляющих» нейронах.

Иммуноцитохимическим методом показано, что нейроны, регулирующие активность нейронной сети, экспрессируют фермент глутаматдекарбоксилазу.

Таким образом, было определено, что нейроны, регулирующие активность нейроналыюй сети, являются ГАМКергическими нейронами, имеющие, каинатные рецепторы с 01и115 субъединицей без десенситизации. Полученные результаты позволят глубже понять процессы, связанные с регуляцией каинатными рецепторами нейропередачи, а также их роль в различных нейродегенеративных заболеваниях. Результаты данной работы могут расширить круг мишеней действия фармакологических препаратов при указанных расстройствах.

выводы

1. На основе систем анализа изображения разработаны методики выявления и анализа активности каииатных рецепторов нейронов.

2. Показано, что амплитуда и форма кальциевого ответа на агонисты глутаматных рецепторов являются характерными параметрами индивидуальной клетки в процессе ее развития. Одной из причин наблюдаемых различий амплитуд Са2+ ответа на агонисты глутаматных рецепторов является различная степень десенситизации этих рецепторов в различных нейронах.

3. Обнаружено, что эффект ингибиторов десенситизации уменьшается с ростом амплитуды кальциевого ответа на агонисты КА-рецепторов в контроле и стремится к нулю в нейронах с исходно максимальной амплитудой ответа.

4. Выявлены новые механизмы регуляции каинатными рецепторами синхронных спонтанных кальциевых колебаний в нейронах гиппокампа крыс. Показано, что агонисты каинатных рецепторов ипгибируют спонтанные синхронные кальциевые осцилляции в популяции нейронов, понижая базальный уровень концентрации ионов кальция в цитоплазме большинства клеток и сильно повышая его в единичных нейронах.

5. Обнаружены нейроны, управляющие через каинатные рецепторы без десенситизации синхронной активностью всей популяции. Эти нейроны подавляют колебания кальция в других нейронах, генерируя в ответ на агонисты КА-рецепторов кальциевый сигнал большой амплитуды без десенситизации. Показано, что КА-рецепторы этих нейронов содержат субъединицу 01и115.

6. Методом иммуноцитохимии показано, что управляющие нейроны отличающиеся большей амплитудой кальциевого ответа на агонисты КА-рецепторов без десенситизации и имеющие КА-рецепторы, содержащие субъединицу С1и115, являются ГАМКергическими интернейронами.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах

1. Кононов A.B., Валь Н.В., Зинченко В.П.. Вариабельность кальциевых ответов нейронов гиппокампа на агонисты глутаматных рецепторов. Биологические мембраны, 2011. Т.28(2): 127-36.

2. Бережное A.B., Кононов A.B.. Федотова E.H., Зинченко В.П. Способ выявления и характеристика лигандов ГАМК(А) рецепторов с помощью кальций-чувствигельпых флуоресцентных зондов. Биофизика, 2011. Т.56(4):673-83.

3. Кононов A.B.. Баль Н.В., Зинченко В.П. Регуляция споптанных синхронных осцилляций Са2+ в нейронах гиппокампа ГАМКергическими нейронами, содержащими каинатные рецепторы без десенситизации. Биологические мембраны, 2012. Т.29(1):В печати.

4. Victoria. V. Roshchina, Valerii A. Yashin, and Alexev V. Kononov. Autofluorescence of developing plant vegetative microspores studies by confocal microscopy and microspectrofluormetry. Journal of Fluorescence, V.14(6):745-50.

Статьи в сборниках

1. Бережное A.B., Кононов A.B.. Федотова Е.И., Толмачева A.B., Зинченко В.П. Методика выявления лигандов NMDA-, АМРА/КА- и G ABA- рецепторов с помощью кальций-чувствительных флуоресцентных зондов. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2009. (2-4 июня) 2, стр. 709-713.

2. Зинченко В.П., Кононов A.B. , Баль Н.В. , Бережное A.B. , Федотова Е.И. Применение системы анализа изображения для характеристики лигандов ионотропных глутаматных рецепторов в культуре нейронов. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 81-83.

3. Бережное A.B., Федотова Е.И., Кононов A.B., Баль Н.В., Зинченко В.П. Характеристика лигандов NMDA-рецепторов с помощью кальций-чувствительных флуоресцентных зондов. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 83-88.

4. Кононов A.B., Баль Н.В., Бережное A.B., Федотова ЕМ, Зинченко В.П. Характеристика лигандов АМРА- и каинатных рецепторов с помощью кальций-чувствительных флуоресцеотных зондов. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 88-93.

5. Кононов A.B.. Баль Н.В., Зинченко В.П. Регуляция каинатными рецепторами синхронных спонтанных кальциевых колебаний в нейронах гиппокампа крыс. В сб. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 125-131.

Тезисы докладов

1. Кононов A.B.. Баль Н.В., Зинченко В.П. Исследование синхронной спонтанной активности нейронов методом флуоресцентной микроскопии. XXIII Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва 2011. стр. 126.

2. Кононов A.B.. Баль Н.В., Зинченко В.П. Методика выявления агонистов СВ1-рецепторов с применением кальциевых флуоресцентных зондов. 5-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Клязьма 2010 год, стр. 133.

3. Кононов A.B.. Баль Н.В., Зинченко В.П. Выявление агонистов АМРА- и КА-рецепгоров с помощью кальциевых флуоресцентных зондов. Шестой Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука дая медицины и психологии», Судак 2010 год, стр. 172.

4. Зинченко В.П., Долгачева Л.П., Кононов A.B.. Баль Н.В. Регуляция частоты и амплитуды синхронных спонтанных колебаний Са2+ в культуре клеток гиппокампа рецепторами к

каинату и ГЛМК. Шестой Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Судак 2010 год, стр. 135-136.

5. Кононов A.B.. Баль Н.В., Зинченко В.П. Кальциевые ответы нейронов гиппокампа на агонисты ионотрошшх глутаматных рецепторов. Закономерности распределения амплитуд. Всероссийский конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2010», Нижний Новгород 2010 год стр. 175.

6. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Бережное A.B., Федотова Е.И., Кононов A.B. Выявление лигандов глутаматных и gaba ионотропных рецепторов в нейронах гиппокампа с помощью кальций-чувствительных флуоресцентных зондов. Шестой Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Судак 2010 год, стр. 136-137.

7. Зинченко В.П., Кононов A.B.. Баль Н.В., Долгачева Л.П. Идентификация индивидуальных нейронов в культуре по характеру кальциевых ответов на агонисты глутаматных рецепторов. Седьмой международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Судак 2011 год, стр. 185.

Подписано в печать:

27.10.2011

Заказ №6176 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кононов, Алексей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Л.Каинатные рецепторы.

1.1.1. История открытия.

1.1.2. Структура и функции.

1.1.3. Роль каинатных рецепторов в работе нейронов гиппокампа.

1.2.Молекулярные механизмы секреции нейромедиатора.

1.2.1. Зависимость скорости выброса нейромедиатора от концентрации кальция.

1.2.2. Локальные кальциевые домены.

1.2.3. Потенциал-чувствительные кальциевые каналы и их роль в секреции нейромедиаторов.

1.2.4. Вклад КуЛ-опосредованного выброса кальция из эндоплазматического ретикулума в секрецию нейромедиаторов.

1.2.5. Вклад пресинаптических митохондрий в секрецию нейромедиаторов.

1.3.Спонтанные осцилляции нейронов.

1.3.1. Влияние потенциал-чувствительных кальциевых каналов на спонтанные осцилляции нейронов.

1.3.2. Влияние ионотропных глутаматных рецепторов на спонтанные осцилляции нейронов.

1.3.3. Влияние метаботропных глутаматных рецепторов на спонтанные осцилляции нейронов.

1.3.4. Влияние ГАМКергических нейронов на спонтанные осцилляции нейронов

1.4.Селективная гибель популяций нейронов при различных патологиях.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1.Получение культуры клеток гиппокампа.

2.2.Измерения уровня цитозольного кальция методом флуоресцентной микроскопии.

2.3.Система быстрой аппликации веществ.

2.4.Иммуноцитохимический метод выявления ГАМКергических нейронов.

2.5. Материалы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.Анализ активности агонистов каинатных рецепторов.

3.2.Распределение амплитуд кальциевых ответов нейронов на агонисты каинатных рецепторов.

3.2.1. Увеличение амплитуды кальциевых ответов нейронов с возрастом культуры.

3.2.2. Десенситизация каинатных и АМРА-рецепторов.

3.3.Характеристика агонистов каинатных рецепторов.

3.4.Регистрация активности антагонистов каинатных рецепторов.

3.4.1. Определение константы ингибирования каинатных рецепторов конкурентным антагонистом ИВСрС.

3.4.2. Определение типа ингибирования.

3.5.Выявление участия каинатных рецепторов в синхронных спонтанных кальциевых осцилляциях.

3.6.Действие агонистов каинатных рецепторов на ССКО.

3.7.Действие селективных агонистов каинатных рецепторов на синхронные спонтанные кальциевые осцилляции.

3.8.Нейроны с максимальными АКО.

3.9.Выявление ГАМКергических нейронов иммуноцитохимическими методами.

3.10. Определение пре- или постсинаптической локализации каинатных рецепторов, управляющих синхронной активностью нейрональной сети.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление и характеристика каинатных рецепторов гамкергических нейронов гиппокампа, управляющих синхронной активностью популяции нейронов в культуре"

Актуальность проблемы. Колебания уровня цитозольного кальция являются важным параметром клеточной сигнализации, который запускает и регулирует секрецию межклеточных трансмиттеров и активирует экспрессию специфичных генов (Dolmetsch et al., 1998). В нейронных сетях различных отделов мозга наблюдается спонтанная синхронная активность, которая также возникает в нейронах гиппокампа in vitro через несколько дней культивирования и обусловлена установлением синаптических контактов между нейронами.

Эта активность сопровождается кальциевыми осцилляциями и отражает функционирование целой сети, что позволяет исследовать механизмы передачи сигнала между нейронами и механизмы переключения информационных потоков в нейрональной сети. Физиологическое значение спонтанных синхронных кальциевых осцилляций (ССКО) состоит в синхронной секреции нейромедиаторов и гормонов для повышения их концентраций в обширных областях мозга, модуляции нейрональной пластичности в развивающихся нейронах (Spitzer et al., 1995) и синхронизации экспрессии генов в больших популяциях нейронов. Выявление механизмов контроля частоты и амплитуды 4колебаний Ca в нейронах гиппокампа со стороны различных рецепторов открывает возможности управления отдельными популяциями клеток мозга с использованием лигандов этих рецепторов.

Основу синхронной спонтанной активности, наблюдаемой в культуре нейронов гиппокампа, составляет синаптическая передача возбуждения с участием глутамата, который действует на ионотропные и метаботропные глутаматные рецепторы. В настоящее время установлены механизмы участия NMDA-, AMP А- и ГАМК(А)-рецепторов, а также потенциал-чувствительных кальциевых каналов в модуляции ССКО. Лиганды каинатных рецепторов также являются претендентами на роль регуляторов ССКО, однако об участии этих рецепторов в колебаниях в литературе существуют противоречивые данные.

В предварительных экспериментах нами было показано, что агонисты КА-рецепторов подавляют ССКО. Также была обнаружена большая вариабельность ответов (по форме и амплитуде) индивидуальных нейронов на агонисты КА-рецепторов.

Основные задачи исследования.

1.Для выявления и характеристики каинатных рецепторов на основе систем анализа изображения и конфокальной микроскопии разработать методику количественного анализа взаимодействия агонистов/антагонистов с каинатными рецепторами.

2. Исследовать причины вариабельности ответов индивидуальных нейронов на агонисты каинатных рецепторов.

4. По степени десенситизации и амплитуде Са ответа на агонисты каинатных рецептора выявить нейроны, управляющие синхронной активностью нейрональной сети.

5. Охарактеризовать по субъединичному составу каинтаных рецепторы нейронов, управляющих синхронной активностью нейрональной сети.

6. Идентифицировать тип нейронов, управляющих синхронной активностью нейрональной сети.

Показано, что все нейроны отличаются по форме и АКО на агонисты каинатных глутаматных рецептов. Амплитуда и форма кальциевого ответа являются характерными параметрами индивидуальной клетки. Нейроны в основном равномерно распределены по амплитуде кальциевого ответа, однако небольшой процент клеток генерирует ступенчатый ответ большой амплитуды без десенситизации. Показано, что нейроны различаются по степени десенситизации КА-рецепторов. Ингибитор десенситизации устраняет эти различия и не действует на нейроны, генерирующие ступенчатый ответ большой амплитуды.

Методом иммуноцитохимии показано, что управляющие нейроны, отличающиеся большей амплитудой кальциевого ответа на агонисты КА-рецепторов без десенситизации и имеющие КА-рецепторы, содержащие субъединицу С1иК.5, являются ГАМКергическими интернейронами.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Каинатные рецепторы.

Глутамат - основной возбуждающий нейромедиатор в центральной нервной системе млекопитающих. Его действие опосредуется ионотропными и метаботропными глутаматными рецепторами. Среди ионотропных глутаматных рецепторов выделяют три основных семейства: NMDA, АМРА и каинатные рецепторы (Hollmann et al., 1989; Lodge, 2009). Они все участвуют в возбуждающей нейротрансмиссии, однако каинатные рецепторы, в отличие от двух других типов, выступают в основном как модуляторы в передаче сигналов. По мнению некоторых авторов, каинатные рецепторы связаны с метаботропными сигнальными путями в нейронах (Flint et al., 1999; McBain, 1994; Collin, 2009).

1.1.1. История открытия.

История открытия каинатных рецепторов началась с фармакологических исследований токсического действия каиновой кислоты, выделенной из морских водорослей Digenea simplex. В 1970 году было показано, что каинат обладает токсичным действием по отношению к нейронам коры. Далее был открыт квисквилат, действующий на нейроны через рецепторы глутамата, после чего исследователи выделили три типа глутаматных рецепторов: NMDA, каинатные и квисквилатные. В 1979 году было показано, что токсическое действие каината уменьшается при деафферентации нейронов, то есть было открыто пресинаптическое действие каинатных рецепторов (Biziere and Coyle, 1979). Существование отдельных каинатных рецепторов продемонстрировано в исследованиях на С-волокнах в ганглиях задних корешков спинного мозга, в которых глутаматные рецепторы активировались каинатом, меньше — квисквилатом, но не NMDA и АМРА (Agrawa and Evans, 1986). В 1980-х годах произошло окончательное фармакологическое разделение ионотропных глутаматных рецепторов на три подкласса: NMDA, АМРА и каинатные рецепторы.

Однако разделение АМРА и каинатных рецепторов фармакологическими методами по-прежнему оставалось трудной задачей. Открытие таких антагонистов, как DNQX и CNQX, а позже и NBQX, было важным шагом на пути к ее решению. Дело в том, что NBQX обладает в 30 раз более высокой аффинностью к АМРА-рецепторам, чем к каинатным (Sheardown, 1990).

В 1989 году был открыт 2,3-бензодиазепин GYKI-52466, обладающий высокой селективностью по отношению к АМРА-рецептору по сравнению с каинатными (Ouardouz and Durand, 1991). В настоящее время в качестве антагонистов АМРА-рецепторов кроме GYKI-52466 в основном используются соединения GYKI-53655 (LY300168) и SYM2206.

Следующим шагом в разработке инструментов для исследования АМРА- и каинатных рецепторов стало открытие ингибиторов десенситизации циклотиазида и конканавалина А, соответственно (Wong and Mayer, 1993). Механизмы действия ингибиторов десенситизации в настоящее время обсуждаются.

Прогрессу в изучении глутаматных рецепторов способстововали также открытие и разработка различных агонистов. Однако если для АМРА-рецепторов разработаны полные и селективные агонисты и антагонисты, то для каинатных рецепторов сохраняется проблема отсутствия селективных агонистов для всех субъединиц рецепторов. Так, применяемые в исследованиях агонисты каиновая кислота и более сильная домоевая кислота активируют как каинатные, так и АМРА-рецепторы. В качестве полного антагониста используется NBQX и другие соединения, ингибирующие оба подкласса рецепторов. Однако существуют соединения, с высокой селективностью активирующие и ингибирующие изоформы рецепторов с определенным субъединичным составом. Так, для рецепторов, содержащих 01иЯ5-субъединицу, существуют такие лиганды, как антагонисты UBP-302, АСЕТ и агонисты SYM2081, АТРА, (S)-(-)-5-Iodowillardiine.

Кроме фармакологических инструментов, большую роль в исследовании каинатных рецепторов сыграли молекулярно-генетические методы. Скрининг на основе гибридизации с низкой точностью (low-stringency hibridization screening) привел к открытию субъединицы с 40% гомологией с GluRl-4 (субъединицы АМРА-рецептора), которую назвали GluR-Kl (GluR5) (Hollmann et al., 1989). Годом позже была описана субъединица GluR6, а в следующем, 1992 году - GluR7. Фармакологические исследования показали, что эти субъединицы проявляют чувствительность к каинату. Эта группа из трех субъединиц имеет около 70% гомологии между собой и 40% гомологии с субъединицами АМРА-рецепторов (Lodge, 2009).

В это же время были клонированы субъединицы с более высокой аффинностью к каинату, чем GluR5-7, которые были названы КА1 и КА2. Исследования показали, что Ко сайтов связывания каината низкоаффинных GluR5-7 составляет ~50нМ, тогда как для высокоаффинных она примерно в 10 раз меньше. Позже было показано, что КА1-КА2 субъединицы не могут формировать функциональных гомомерных рецепторов, и участвуют в формировании гетеромерных рецепторов в комбинации с субъединицами GluR5-7 (Lodge, 2009).

В настоящее время в научную литературу вводятся новые наименования субъединиц согласно рекомендаций IUPHAR (The International Union of Basic and Clinical Pharmacology). Так, субъединицы GluR5-7 переименованы в GluK5-3, а субъединицы KA1-2 теперь называются GluK4-5. Гены, соответствующие этим субъединицам, носят наименования GRIK1,GRIK2, GRIK3, GRIK4, GRIK5 соответственно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кононов, Алексей Владимирович, Пущино

1. Абушик П. А. Большаков А. Е., Сибаров Д. А., Антонов С. М. Гетерогенность механизмов кальциевого ответа на каинат и типы нейронов в первичной культуре коры головного мозга крыс // Биологические мембраны. 2011 г. - Т. 28. - № 1. — С. 25-34.

2. Adler Е.М., Augustine G.J., Duffy S.N., Charlton M.P. Alien intracellular calcium chelators attenuate neurotransmitter release at the squid giant synapse //JNeurosci. 1991.-Vol. ll.-№6.-P. 1496-507.

3. Agrawa S.G., Evans R.H. The primary afferent depolarizing action of kainate in the rat // Br. J. Pharmac. 1986. Vol. 87. - P. 345-355.

4. Aliène С., Cattani A., Ackman J.B., Bonifazi P., Aniksztejn L., Ben-Ari Y., Cossart R. Sequential generation of two distinct synapse-driven network patterns in developing neocortex // J Neurosci. 2008 . Vol. 28. - № 48. - P. 12851-12863.

5. Augustine G.J., Santamaria F., Tanaka K. Local calcium signaling in neurons // Neuron. 2003. Vol. 40. -№ 2. - P. 331-346.

6. Bacci A., Verderio C., Pravettoni E., Matteoli M. Synaptic and intrinstic mechanisms shape synchronous oscillations in hippocampal neurons in culture //Eur J Neurosci. 1999.-Vol. 11.-№2.-P. 389-397.

7. Bahn S., Volk В., Wisden W. Kainate receptor gene expression in the developing rat brain // J Neurosci. 1994. Vol. 14. - № 9. - P. 5525-5547.

8. Baimbridge K.G., Celio M.R., Rogers J.H. Calcium-binding proteins in the nervous system // Trends Neurosci. 1992. Vol. 15. - № 8. - P. 303-308.

9. Beal M.F. Does impairment of energy metabolism result in excitotoxic neuronal death in neurodegenerative illnesses? // Ann Neurol. 1992. Vol. 31. - № 2. — P. 119-130.

10. Ben-Ari Y., Cherubini E., Corradetti R., Gaiarsa J.L. Giant synaptic potentials in immature rat CA3 hippocampal neurones // J Physiol. 1989. Vol. 416. - P. 303-325.

11. Ben-Ari Y. Limbic seizure and brain damage produced by kainic acid: mechanisms and relevance to human temporal lobe epilepsy // Neurosci. 1985.-Vol. 14.-№2.-P. 375-403.

12. Berridge M.J. Neuronal calcium signaling // Neuron. 1998. Vol. 21. — № 1. — P. 13-26.

13. Best N., Mitchell J., Baimbridge K.G., Wheal H.V. Changes in parvalbumin-immunoreactive neurons in the rat hippocampus following a kainic acid lesion //Neurosci Lett. 1993.-Vol. 155.-№ l.-P. 1-6.

14. Billups В., Forsythe I.D. Presynaptic mitochondrial calcium sequestration influences transmission at mammalian central synapses // J Neurosci. 2002. — Vol. 22. -№ 14. P. 5840-5807.

15. Biziere K., Coyle J.T. Effects of cortical ablation on the neurotoxicity and receptor binding of kainic acid in striatum // Journal of Neuroscience Research. 1979. Vols. 4. - № 5-6. - P. 383-398.

16. Blankenship M.B., Feller A.G. Mechanisms underlying spontaneous pat-terned activity in developing neural circuit // Nat Rev Neurosci. 2010. — Vol. 11. № l.-P. 18-29.

17. Bollmann J.H., Sakmann В., Borst J.G. Calcium sensitivity of glutamate release in a calyx-type terminal // Science. 2000. Vol. 289. - № 5481. - P. 953-957.

18. Borst J.G., Sakmann B. Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse // Nature. 1996. Vol. 383. - № 6599. - P. 431-434.

19. Bouchard R., Pattarini R., Geiger J.D. Presence and functional significance of presynaptic ryanodine receptors // Prog Neurobiol. 2003. Vol. 69. - № 6. - P. 391-418.

20. Braak H., Braak E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. // Acta Neuropathol. 1991. Vol. 82. - № 4. - P. 239-259.

21. Breustedt J., Schmitz D. Assessing the Role of GLUK5 and GLUK6 at Hippocampal Mossy Fiber Synapses // J Neurosci. 2004. — Vol. 24. № 45. — P.10093-10098.

22. Broadie K., Bellen H.J., DiAntonio A., Littleton J.T., Schwarz T.L. Absence of synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission // Proc Natl Acad Sci USA. 1994,- Vol. 91. № 22.- P. 10727-10731.

23. Burnashev N., Rozov A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy // Cell Calcium. 2005. Vol. 37. - № 5. - P. 489-495.

24. Caiati M.D., Sivakumaran S., Cherubini E. In the Developing Rat Hippocampus, Endogenous Activation of Presynaptic Kainate Receptors Reduces GABA Release from Mossy Fiber Terminals // The Journal of Neuroscience. 2010. Vol. 30. - № 5. - P. 1750 -1759.

25. Carriedo S.G., Sensi S.L., Yin H.Z., Weiss J.H. AMPA exposures induce mitochondrial Ca. № 2+) overload and ROS generation in spinal motor neurons in vitro // J Neurosci. 2000. - Vol. 20. - № 1. - P. 240-250.

26. Carriedo S.G., Yin H.Z., Sensi S.L., Weiss J.H. Rapid Ca2+ entry through Ca2+ permeable AMPA/kainate channels triggers marked intracellular Ca2+ rises and consequent oxygen radical production // J. Neurosci. 1998. Vol. 18 . -№ 19.-P. 7727-7773.

27. Castillo P.E., Malenka R.C., Nicoll R.A., Kainate receptors mediate a slow postsynaptic current in hippocampal CA3 neurons // Nature. 1997. Vol. 388. -№6638.-P. 182-186.

28. Cattani A.A., Bonfardin V.D., Represa A., Ben-Ari Y., Aniksztejn L.Generation of Slow Network Oscillations in the Developing Rat HippocampusAfter Blockade of Glutamate Uptake // J Neurophysiol. 2007. Vol. 98. - № 4.-P. 2324-2336.

29. Chittajallu R., Braithwaite S.P., Clarke V.R., Henley J.M. Kainate receptors: subunits, synaptic localization and function // Trends Pharmacol Sci. 1999. -Vol. 20.-№ 1.-P. 26-35.

30. Cobb S.R., Buhl E.H., Halasy K., Paulsen O., Somogyi P. Synchronization of neuronal activity In hippocampus by individual GABAergic interneurons // NATURE. 1995. Vol. 378. - № 6552. - P. 75-78.

31. Contractor A., Mulle C., Swanson G.T. Kainate receptors coming of age: coming of age // Trends in Neurosciences. 2011. — Vol. 34. № 3.

32. Cossart R., Dinocourt C., Hirsch J.C., Merchan-Perez A., De Felipe J., Ben Ari Y., Esclapez M., Bernard C. Dendritic but not somatic GABAergic inhibition is decreased in experimental epilepsy // Nat Neurosci. 2001. Vol. 4. — № 1. — P. 52-62.

33. Cossart R., Esclapez M., Hirsch J.C., Bernard C., Ben-Ari Y. GluR5 kainate receptor activation in interneurons increases tonic inhibition of pyramidal cells //Nat Neurosci. 1998.-Vol. l.-№6.-P. 470-478.

34. Cossart R., Tyzio R., Dinocourt C., Esclapez M., Hirsch J.C., Ben-Ari Y., Bernard C. Presynaptic Kainate Receptors that Enhance the Release of GABA on CA1 Hippocampal Interneurons // Neuron. 2001.- Vol. 29. № 2. - P. 497-508.

35. Crepel V., Aronov D., Jorquera I., Represa A., Ben-Ari Y., Cossart R. A parturition-associated nonsynaptic coherent activity pattern in the developinghippocampus // Neuron. 2007. Vol. 54. - № 1. - P. 105-20.

36. Cunha R.A., Malva J.O., Ribeiro J.A. Kainate receptors coupled to G(i)/G(o) proteins in the rat hippocampus // Mol Pharmacol. 1999. 2 : Vol. 56. — P. 429433.

37. Cunha R.A., Malva J.O., Ribeiro J.A. Pertussis toxin prevents presynaptic inhibition by kainate receptors of rat hippocampal (3)H.GABA release // FEBS Lett. 2000. Vols. 469. - № 2-3. - P. 159-162.

38. Cunningham M.O., Pervouchine D.D., Racca C., Kopell N.J., Davies C.H., Jones R.S., Traub R.D., Whittington M.A. Neuronal metabolism governs cortical network response state // Proc Natl Acad Sci USA. 2006. Vol. 103. -№ 14.-P. 5597-5601.

39. Damier P., Hirsch E.C., Agid Y., Graybiel A.M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease//Brain. 1999. Vol. 122 . -№ 8. - P. 1437-1448.

40. Dodge F.A., Jr Rahamimoff R. Co-operative action a calcium ions in transmitter release at the neuromuscular junction // J Physiol. 1967. Vol. 193. -№2. -P. 419-432.

41. Dolmetsch R.E., Xu K., Lewis R.S. Calcium oscillations increase the efficiency and specificity of gene expression. // Nature. 1998 . Vol. 392. - № 6679.-P. 933-936.

42. Dravid S.M., Murray T.F. Spontaneous synchronized calcium oscillations in neocortical neurons in the presence of physiological Mg(2+).: involvement of AMPA/kainate and metabotropic glutamate receptors // Brain Res. 2004. -Vol. 1006.-№ l.-P. 8-17.

43. Ertel E.A., Campbell K.P., Harpold M.M., Hofmann F., Mori Y., Perez-Reyes E., Schwartz A., Snutch T.P., Tanabe Т., Birnbaumer L., Tsien R.W., Catterall W.A. Nomenclature of voltage-gated calcium channels. // Neuron. 2000. -Vol. 25. -№ 3. P. 533-535.

44. Fay M.L., Bowie D. Concanavalin-A reports agonist-induced conformational changes in the intact GluR6 kainate receptor // J Physiol. 2006. Vol. 572. -№ l.-P. 201-213.

45. Felmy F., Neher E., Schneggenburger R. Probing the intracellular calcium sensitivity of transmitter release during synaptic facilitation // Neuron. 2003. -Vol. 37. -№ 5. P. 801-811.

46. Fernández-Chacón R., Konigstorfer A., Gerber S.H., García J., Matos M.F., Stevens C.F., Brose N., Rizo J., Rosenmund C., Südhof T.C. Synaptotagmin I functions as a calcium regulator of release probability // Nature. 2001. Vol. 410.-№6824.-P. 41-49.

47. Flint A.C., Connors B.W. Two types of network oscillations in neocortex mediated by distinct glutamate receptor subtypes and neuronal populations // J Neurophysiol. 1996.-Vol. 75.-№2.-P. 951-957.

48. Flint A.C., Dammerman R.S., Kriegstein A.R., Endogenous activation of metabotropic glutamate receptors in neocortical development causes neuronal calcium oscillations//PNAS. 1999.-Vol. 96.-№ 21.-P. 12144-12149.

49. Fogelson A.L., Zucker R.S. Presynaptic calcium diffusion from various arrays of single channels. Implications for transmitter release and synaptic facilitation //Biophys J. 1985.-Vol. 48,-№6.-P. 1003-1017.

50. Franck J.E., Kunkel D.D., Baskin D.G., Schwartzkroin P.A. Inhibition in kainate-lesioned hyperexcitable hippocampi: physiologic, autoradiographic, and immunocytochemical observations // J Neurosci. 1988. Vol. 8. - № 6. -P.1991-2002.

51. Franck J.E., Schwartzkroin P.A. Do kainate-lesioned hippocampi become epileptogenic? // Brain Res. 1985. Vols. 329. - № 1-2. - P. 309-313.

52. Fukuda T., Kosaka T. Gap junctions linking the dendritic network of GABAergic interneurons in the hippocampus // J Neurosci. . 2000. Vol. 20. -№4.-P. 1519-1528.

53. Garaschuk O., Hanse E., Konnerth A. Developmental profile and synaptic origin of early network oscillations in the CA1 region of rat neonatal hippocampus//J Physiol. 1998.-Vol. 507 .-№ l.-P. 219-236.

54. Gebhardt C., Cull-Candy S.G. Influence of agonist concentration on AMPA and kainate channels in CA1 pyramidal cells in rat hippocampal slices // J Physiol. 2006. Vol. 573. - P. 371-394.

55. Gersdorff H., Matthews G. Dynamics of synaptic vesicle fusion and membrane retrieval in synaptic terminals // Nature. 1994. Vol. 367. - № 6465. - P. 735739.

56. Goda Y., Stevens C.F. Two components of transmitter release at a central synapse // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. Vol. 91. - № 26. - P. 1294212946.

57. Hampson D.R., Huang X.P., Oberdorfer M.D., Goh J.W., Auyeung A., Wenthold R.J. Localization of AMPA receptors in the hippocampus and cerebellum of the rat using an anti-receptor monoclonal antibody // Neuroscience. 1992. Vol. 50. -№ l.-P. 11-22.

58. Hampson D.R., Huang X.P., Wells J.W., Walter J.A., Wright J.L. Interaction of domoic acid and several derivatives with kainic acid and AMPA binding sites in rat brain // Eur J Pharmacol. 1992. Vol. 218. -№ 1. - P. 1-8.

59. Hayashi H., Miyata H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2+ // J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 1994. Vol. 31. - № 1. - P. 1-10.

60. Heidelberger R., Heinemann C., Neher E., Matthews G. Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal // Nature. 1994. — Vol. 371. № 6497.-P. 513-515.

61. Hilton G.D., Bambrick L.L., Thompson S.M., McCarthy M.M. Estradiol modulation of kainic acid-induced calcium elevation in neonatal hippocampal neurons // Endocrinology. 2006. Vol. 147. - № 3. - P. 1246-55.

62. Hirsch E., Graybiel A.M., Agid Y.A. Melanized dopaminergic neurons are differentially susceptible to degeneration in Parkinson's disease // Nature.1988. Vol. 334. -№ 6180. - P. 345-348.

63. Hollmann M., O'Shea-Greenfield A., Rogers S.W., Heinemann S. Cloning by functional expression of a member of the glutamate receptor family // Nature.1989. Vol. 342. - № 6250. - P. 643-648.

64. Holm M.M., Lunn M.L., Traynelis S.F., Kastrup J.S., Egebjerg J. Structural determinants of agonist-specific kinetics at the ionotropic glutamate receptor 2 //Proc Natl Acad Sci U S A. 2005.-Vol. 102.-№34.-P. 12053-12058.

65. Houser C.R., Esclapez M. Vulnerability and plasticity of the GABA system in the pilocarpine model of spontaneous recurrent seizures. // Epilepsy Res. 1996. Vol. 26. -№ 1. -P. 207-218.

66. Hyman B.T., Van Hoesen G.W., Damasio A.R., Barnes C.L. Alzheimer's disease: cell-specific pathology isolates the hippocampal formation // Science. 1984. Vol. 225. - № 4667. - P. 1168-1170.

67. Iacopino A.M., Christakos S. Specific reduction of calcium-binding protein . -№ 28-kilodalton calbindin-D) gene expression in aging and neurodegenerative diseases // Proc Natl Acad Sci USA. 1990. Vol. 87. - № 11. - P. 4078-4082.

68. Iwasaki S., Momiyama A., Uchitel O.D., Takahashi T. Developmental changesin calcium channel types mediating central synaptic transmission // J Neurosci.2000. Vol. 20. - № 1. - P. 59-65.

69. Jane D.E., Lodge D., Collingridge G.L. Kainate receptors: pharmacology, function and therapeutic potential // Neuropharmacology. 2009. Vol. 56. - № l.-P. 90-113.

70. Jena B.P. Membrane fusion: role of SNAREs and calcium // Protein Pept Lett. 2009.-Vol. 16.-№ 7.-P. 712-717.

71. Juuri J., Clarke V.R., Lauri S.E., Taira T. Kainate Receptor-Induced Ectopic Spiking of CA3 Pyramidal Neurons Initiates Network Bursts in Neonatal Hippocampus//J Neurophysiol. 2010.-Vol. 104.-№3.-P. 1696-1706.

72. Kayadjanian N., Lee H.S., Pina-Crespo J., Heinemann S.F. Localization of glutamate receptors to distal dendrites depends on subunit composition and the kinesin motor protein KIF17 // Mol Cell Neurosci. 2007. Vol. 34. - № 2. - P. 219-230.

73. Kortenbruck G., Berger E., Speckmann E.J., Musshoff U. RNA editing at the Q/R site for the glutamate receptor subunits GLUR2, GLUR5, and GLUR6 in hippocampus and temporal cortex from epileptic patients // Neurobiol Dis. 2001.-Vol. 8. -№ 3. P. 459-68.

74. Kosaka Т., Hama K. Gap junctions between non-pyramidal cell dendrites in the rat hippocampus (CA1 and С A3 regions): a combined Golgi-electron microscopy study // J Comp Neurol. 1985. Vol. 231. - № 2. - P. 150-161.

75. Kwon H.B., Castillo P.E. Role of Glutamate Autoreceptors at Hippocampal Mossy Fiber Synapses // Neuron. 2008. Vol. 60. - № 26. - P. 1082-1094.

76. Lacinova L. Voltage-dependent calcium channels // Gen Physiol Biophys. 2005.-Vol. 24.-№ l.-P. 1-78.

77. Landfield P.W., Pitler T.A. Prolonged Ca2+-dependent afterhyperpolarizations in hippocampal neurons of aged rats // Science. 1984. Vol. 226. - № 4678. -P. 1089-1092.

78. Lando L., Zucker R.S. Ca2+ cooperativity in neurosecretion measured using photolabile Ca2+ chelators // J Neurophysiol. 1994. Vol. 72. - № 2. - P. 825830.

79. Larm J.A., Beart P.M., Cheung N.S. Neurotoxin domoic acid produces cytotoxicity via kainate- and AMPA-sensitive receptors in cultured corticalneurons//Neuroche. Int. 1997. Vol. 31. - P. 677-82.

80. Lauri S.E., Bortolotto Z.A., Bleakman D., Ornstein P.L., Lodge D., Isaac J.T., Collingridge G.L. Critical Role of a Facilitatory Presynaptic Kainate Receptor in Mossy Fiber LTP // Neuron. 2001. Vol. 32. - № 4. - P. 697-709.

81. Lee C.J., Kong H., Manzini M.C., Albuquerque C., Chao M.V., MacDermott A.B. Kainate receptors expressed by a subpopulation of developing nociceptors rapidly switch from high to low Ca2+ permeability // J. Neurosci. 2001. Vol. 21.-№ 13.-P. 4572-4581.

82. Leinekugel X., Khazipov R., Cannon R., Hirase H., Ben-Ari Y., Buzsaki G. Correlated Bursts of Activity in the Neonatal Hippocampus in Vivo // Science. 2002. Vol. 296. - № 5575. - P. 2049-2052.

83. Lerma J., Paternain A.V., Rodriguez-Moreno A., Lopez-Garcia J.C. Molecular physiology of kainate receptors // Physiol Rev. 2001. Vol. 81. - № 3. - P. 971-998.

84. Lerma J., Roles and rules of kainate receptors in synaptic transmission // Nat Rev Neurosci. 2003. Vol. 4. -№ 6. -P. 481-495.

85. Liu Q., Chen B., Ge Q., Wang Z.W. Presynaptic Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II modulates neurotransmitter release by activating BK channels at Caenorhabditis elegans neuromuscular junction // J Neurosci. 2007. Vol. 27.-№39.-P. 10404-10413.

86. Mathew S.S., Hablitz J.J. Calcium release via activation of presynaptic IP3 receptors contributes to kainate-induced IPSC facilitation in rat neocortex // Neuropharmacology. 2008. Vol. 55. -№ 1. - P. 106-116.

87. McBain C.J., Fisahn A. Interneurons unbound // Nat Rev Neurosci. 2001.-Vol. 2. -№ 1. P. 11-23.

88. McBain C.J., DiChiara T.J., Kauer J.A. Activation of metabotropic Glutamate Receptors Differentially Affects Two Classes of Hippocampal Interneurons and Potentiates Excitatory Synaptic Transmission // J Neurosci. 1994. Vol. 14. -№ 7. - P. 4433-4445.

89. Meinrenken C.J., Borst J.G., Sakmann B. Calcium secretion coupling at calyx of held governed by nonuniform channel-vesicle topography // J Neurosci. 2002. Vol. 22. - № 5. - P. 1648-1667.

90. Meinrenken C.J., Borst J.G., Sakmann B. Local routes revisited: the space and time dependence of the Ca2+ signal for phasic transmitter release at the rat calyx of Held. // J. Physiol. 2003.-Vol. 547.-№3.-P. 665-689.

91. Meldrum B.S. Excitotoxicity and selective neuronal loss in epilepsy // Brain Pathol. 1993. Vol. 3. -№ 4. - P. 405-412.

92. Michaelis M.L., Bigelow D.J., Schoneich C., Williams T.D., Ramonda L., Yin D., Huhmer A.F., Yao Y., Gao J., Squier T.C. Decreased plasma membrane calcium transport activity in aging brain // Life Sci. 1996. Vols. 59. - № 5-6. -P. 405-412.

93. Michaelis M.L., Foster C.T., Jayawickreme C. Regulation of calcium levels in brain tissue from adult and aged rats // Mech Ageing Dev. 1992. Vol. 62. - № 3.-P. 291-306.

94. Midgett C.R., Madden D.R. The quaternary structure of a calcium-permeable AMPA receptor: conservation of shape and symmetry across functionally distinct subunit assemblies // J Mol Biol. 2008. Vol. J Mol Biol. - P. 578-584.

95. Morin F., Beaulieu C., Lacaille J.C. Selective loss of GAB A neurons in area CA1 of the rat hippocampus after intraventricular kainate // Epilepsy Res.1998. Vol. 32. -№ 3. - P. 363-368.

96. Moyer J.R., Disterhoft J.F. Nimodipine decreases calcium action potentials in rabbit hippocampal CA1 neurons in an age-dependent and concentration-dependent manner//Hippocampus. 1994. -Vol. 4. -№ l.-P. 11-17.

97. Mueller S.G., Stables L., Du A.T., Schuff N., Truran D., Cashdollar N., Weiner M.W. Measurement of hippocampal subfields and age-related changes with high resolution MRI at 4T // Neurobiol Aging. Vol. 28. - № 5. - P. 719-726.

98. Mulle C., Sailer A., Swanson G.T., Brana C., O'Gorman S.5 Bettler B., Heinemann S,F. Subunit Composition of Kainate Receptors in Hippocampal Interneurons // Neuron. 2000. Vol. 28. - № 2. - P. 475-484.

99. NadlerJ.V. Minireview. Kainic acid as a tool for the study of temporal lobe epilepsy // Life Sci. Vol. 29. -№ 20. - P. 2031-2042.

100. O'Banion M.K., Coleman P.D., Callahan L.M. Regional neuronal loss in aging and Alzheimer's disease: a brief review // Semin. Neurosci. 1994. Vol. 6. - № 5.-P. 307-314.

101. Ogura A., Iijima T., Amano T., Kudo Y. Optical monitoring of excitatory synaptic activity between cultured hippocampal neurons by a multi-site Ca2+ fluorometry // Neurosci Lett. 1987. Vol. 78. -№ l.-P. 1606-1616.

102. Olsson T., Wieloch T., Smith M.L. Brain damage in a mouse model of global cerebral ischemia. Effect of NMD A receptor blockade // Brain Res. 2003. Vol. 982,-№2.-P. 260-269.

103. Ouardouz M., Durand J. GYKI 52466 antagonizes glutamate responses but not NMDA and kainate responses in rat abducens motoneurones // Neurosci Lett. 1991.-Vol. 125.-№ l.-P. 5-8.

104. Partovi D., Frerking M. Presynaptic inhibition by kainate receptors converges mechanistically with presynaptic inhibition by adenosine and GABAB receptors //Neuropharmacology. 2006. Vol. 51. -№ 6. - P. 1030-1037.

105. Paternain A.V., Herrera M.T., Nieto M.A., Lerma J. GluR5 and GluR6 Kainate Receptor Subunits Coexist in Hippocampal Neurons and Coassemble to Form Functional Receptors // J Neurosci. 2000. Vol. 20. - № 1. - P. 196-205.

106. Perez Y., Morin F., Beaulieu C., Lacaille J.C. Axonal sprouting of CA1 pyramidal cells in hyperexcitable hippocampal slices of kainate-treated rats //Eur J Neurosci. 1996. Vol. 8. - P. 736-748.

107. Rodriguez-Moreno A., Lerma J. Kainate receptor modulation of GAB A release involves a metabotropic function // Neuron. 1998. Vol. 20. - № 6. - P. 1211-1218.

108. Rodriguez-Moreno A., Lopez-Garcia J.C., Lerma J. Two populations of kainate receptors with separate signaling mechanisms in hippocampal interneurons // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. Vol. 97. - № 3. - P. 12931298.

109. Rodriguez-Moreno A., SihraT.S. Presynaptic kainate receptor facilitation of glutamate release involves protein kinase A in the rat hippocampus // J Physiol. 2004. Vol. 557. - № 3. - P. 733-745.

110. Rowland L.P., Shneider N.A. Amyotrophic lateral sclerosis // N Engl J Med. 2001.-Vol. 344.-№22.-P. 1688-1700.

111. Sanon N., Carmant L., Emond M., Congar P., Lacaille J.C. Short-term Effects of Kainic Acid on CA1 Hippocampal Interneurons Differentially Vulnerable to Excitotoxicity // Epilepsia. 2005 . Vol. 46. - № 6. - P. 837-848.

112. Satake S., Saitow F., Yamada J., Konishi S. Synaptic activation of AMPA receptors inhibits GABA release from cerebellar interneurons // Nat Neurosci. 2000.-Vol.3.-P. 551 -558.

113. Satrustegui J., Villalba M., Pereira R., Bogonez E., Martinez-Serrano A. Cytosolic and mitochondrial calcium in synaptosomes during aging // Life Sci. 1996. Vols. 59. - № 5-6. - P. 429-434.

114. Schmidt-Kastner R., Freund T.F. Selective vulnerability of the hippocampus inbrain ischemia//Neuroscience. 1991. Vol. 40. -№ 3. - P. 599-636.

115. Schmitz D., Mellor J., Frerking M., Nicoll R.A. Presynaptic kainate receptors at hippocampal mossy fiber synapses // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. Vol. 98.-№20.-P. 11003-11008.

116. Schneggenburger R., Neher E. Intracellular calcium dependence of transmitter release rates at a fast central synapse // Nature. 2000. Vol. 406. - № 6798. - P. 889-893.

117. Sharma G., Vijayaraghavan S. Modulation of presynaptic store calcium induces release of glutamate and postsynaptic firing // Neuron. 2003. — Vol. 38. -№ 6. P. 929-939.

118. Sheardown J. 2,3-Dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)quinoxaline: a neuroprotectant for cerebral ischemia // Science. 1990. Vol. 247. - № 4942. -P. 571-4.

119. Shinozaki H.s Konishi S. Actions of several anthelmintics and insecticides on rat cortical neurones . 1970. Vol. 20. - P. 368-371.

120. Sieghart W. Structure and pharmacology of gamma-aminobutyric acid A receptor subtypes // Pharmacol Rev. 1995. Vol. 47. - № 2. - P. 181-234.

121. Simon S.M., Llinas R.R. Compartmentalization of the submembrane calcium activity during calcium influx and its significance in transmitter release // Biophys J. 1985. Vol. 48. - № 3. - P. 485-498.

122. Sinner B., Friedrich O., Zink W., Fink R.H., Graf B.M. GABAmimetic intravenous anaesthetics inhibit spontaneous Ca2+—oscillations in cultured hippocampal neurons // Acta Anaesthesiol Scand. 2006. Vol. 50. - № 6. - P. 742-748.

123. Spitzer N.C., Olson E., Gu X. Spontaneous calcium transients regulate neuronal plasticity in developing neurons. // J Neurobiol. 1995. Vol. 26. — № 3.-P. 316-324.

124. Starkov A.A., Fiskum G., Chinopoulos C., Lorenzo B.J., Browne S.E., Patel M.S., Beal M.F. Mitochondrial alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex generates reactive oxygen species // J Neurosci. 2004. — Vol. 24. № 36. - P. 7779-7788.

125. Stephenson F.A. Understanding the GABAA receptor: a chemically gated ion channel//Biochem J. 1988.-Vol. 249.-№ 1.-P. 21-32.

126. Stewart B.A., Mohtashami M., Trimble W.S., Boulianne G.L. SNARE proteins contribute to calcium cooperativity of synaptic transmission // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. Vol. 97. -№ 25. - P. 13955-13960.

127. Sutko J.L., Airey J.A., Welch W., Ruest L. The pharmacology of ryanodine and related compounds // Pharmacol Rev. 1997. Vol. 49. - № 1. - P. 53-98.

128. Sutton R.B., Fasshauer D., Jahn R., Brunger A.T. Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 A resolution // Nature. 1998. Vol. 395. - P. 347-353.

129. Swanson G.T., Feldmeyer D., Kaneda M., Cull-Candy S.G. Effect of RNA editing and subunit co-assembly on single-channel properties of recombinant kainate receptors // Journal of Physiology. 1996. Vol. 492. - № 1. - P. 129142.

130. Takahashi T., Momiyama A. Different types of calcium channels mediate central synaptic transmission // Nature. 1993. Vol. 366. - № 6451. - P. 156158.

131. Tamas G., Buhl E.H., Lorincz A., Somogyi P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons // Nat Neurosci. 2000. Vol. 3. - № 4. - P. 366-371.

132. Тапака Т., Saito H., Matsuki N. Intracellular calcium oscillation in cultured rat hippocampal neurons: a model for glutamatergic neurotransmission // Jpn J Pharmacol. 1996. Vol. 70. -№ 1. - P. 89-93.

133. Thibault O., Landfield P.W. Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging // Science. 1996. Vol. 272. - № 5264. - P. 1017-20.

134. Traynelis S.F., Wollmuth L.P., McBain C.J., Menniti F.S., Vance K.M., Ogden K.K., Hansen K.B., Yuan H., Myers S.J., Dingledine R. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function // Pharmacol Rev. 2010. Vol. 62. -№3.-P. 405-496.

135. Turner T.J., Adams M.E., Dunlap K. Multiple Ca2+ channel types coexist to regulate synaptosomal neurotransmitter release // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. Vol. 90. - № 20. - P. 9518-9522.

136. Verkhratsky A. The endoplasmic reticulum and neuronal calcium signalling // Cell Calcium. 2002. Vols. 32. - № 5-6. - P. 393-404.

137. Vitorica J., Satnistegui J. Involvement of mitochondria in the age-dependent decrease in calcium uptake of rat brain synaptosomes // Brain Res. 1985. — Vol. 378.-№ l.-P. 36-48.

138. Voigt Т., Opitz Т., de Lima A.T. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons // J Neurosci. 2001. Vol. 21. -№ 22. - P. 8895-8905.

139. Wahlstedt H., Daniel C., Enstero M., Ohman M. Large-scale mRNA sequencing determines global regulation of RNA editing during brain development // Genome Res. 2009. Vol. 19. - № 6.

140. Wang X., Gruenstein E.I. Mechanism of synchronized Ca2+ oscillations in cortical neurons // Brain Res. 1997. Vol. 767. - № 2. - P. 239-249.

141. Wang X., Pal R., Chen X.W., Limpeanchob N., Kumar K.N., Michaelis E.K. High intrinsic oxidative stress may underlie selective vulnerability of the hippocampal CA1 region // Brain Res. 2005. Vols. 140. - № 1-2. - P. 120-126

142. Wang Z.W., Chen В., Ge Q. Roles and sources of calcium in synaptic exocytosis // Molecular Mechanisms of Neurotransmitter Release / book auth. Wang Z.W. editor. Totowa : Humana Press, 2008.

143. Weiss J.H., Sensi S.L. Ca2+-Zn2+ permeable AMPA or kainate receptors: possible key factors in selective neurodegeneration // Trends Neurosci. 2000. — Vol. 23.-№ 8.-P. 365-371.

144. Wheeler D.B., Randall A., Tsien R.W. Roles of N-type and Q-type Ca2+ channels in supporting hippocampal synaptic transmission // Science. 1994. -Vol. 264.-№5155.-P. 107-111.

145. Wilde G.J., Pringle A.K., Wright P., Iannotti F. Differential vulnerability of the CA1 and С A3 subfields of the hippocampus to superoxide and hydroxyl radicals in vitro // J Neurochem. Vol. 69. - № 2. - P. 883-886.

146. Wilding T.J., Zhou Y., Huettner J.E. Q/R Site Editing Controls Kainate Receptor Inhibition by Membrane Fatty Acids // The Journal of Neuroscience. 2005. Vol. 25. - № 41. - P. 9470 -9478.

147. Williams S., Vachon P., Lacaille J.C. Monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic potentials in CA1 pyramidal cells of hyperexcitable hippocampal slices from kainic acid-treated rats. // Neuroscience. Vol. 52. — № 3. — P. 541-554.

148. Wu L.G., Saggau P. Pharmacological identification of two types of presynaptic voltage-dependen calcium channels at CA3-CA1 synapses of the hippocampus //J Neurosci. 1994. Vol. 14. -№ 9. - P. 5613-5622.

149. Xu J., Wu L.G. The decrease in the presynaptic calcium current is a major cause of short-term depression at a calyx-type synapse // Neuron . 2005. Vol. 46.-№4.-P. 633-645.

150. Yoshihara M., Littleton J.T. Synaptotagmin I functions as a calcium sensor to synchronize neurotransmitter release // Neuron. 2002. — Vol. 36. — № 5. — P. 897-908.

151. Yuste R., Majewska A., Holthoff K. From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines // Nat Neurosci. 2000 : — Vol. 3. — № 7.-P. 653-659.

152. Zaidi A., Gao J., Squier T.C., Michaelis M.L. Age-related decrease in brain synaptic membrane Ca2+-ATPase in F344/BNF1 rats // Neurobiol Aging. 1998.-Vol. 19. -№ 5. P. 487-495.

153. Zalk R., Lehnart S.E., Marks A.R. Modulation of the ryanodine receptor and intracellular calcium // Annu Rev Biochem. 2007. Vol. 76. - P. 367-385.

154. Кононов A.B., Балъ Н.В., Зинченко В.П. Вариабельность кальциевых ответов нейронов гиппокампа на агонисты глутаматных рецепторов. Биологические мембраны, 2011. Т.28(2): 127-36.

155. Бережное A.B., Кононов A.B. Федотова Е.И., Зинченко В.П. Способ выявления и характеристика лигандов ГАМК(А) рецепторов с помощью кальций-чувствительных флуоресцентных зондов. Биофизика, 2011. Т.56(4):673-83.

156. Кононов A.B., Балъ Н.В., Зинченко В.П. Регуляция спонтанных синхронных осцилляций Са2+ в нейронах гиппокампа ГАМКергическими нейронами, содержащими каинатные рецепторы без десенситизации: Биологические мембраны, 2012. Т.29(1):В печати.

157. Victoria. V. Roshchina, Valerii A. Yashin, and Alexey V. Kononov. Autofluorescence of developing plant vegetative microspores studies by confocal microscopy and microspectrofluormetry. Journal of Fluorescence. V.14(6):745-50.Статьи в сборниках

158. Кононов А В. Баль Н.В., Зинченко В.П. Выявление агонистов AMP А- и КА-рецепторов с помощью кальциевых флуоресцентных зондов. Шестой Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Судак 2010 год, стр. 172.

159. Зинченко В.П., Кононов A.B., Баль Н.В., Долгачева Л.П. Идентификация индивидуальных нейронов в культуре по характеру кальциевых ответов на агонисты глутаматных рецепторов. Седьмой международный междисциплинарный конгресс

Информация о работе

Кононов, Алексей Владимирович
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Выявление и характеристика каинатных рецепторов гамкергических нейронов гиппокампа, управляющих синхронной активностью популяции нейронов в культуре - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы