Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов взаимодействия лимбических структур мозга при экспериментальном эпилептогенезе

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов взаимодействия лимбических структур мозга при экспериментальном эпилептогенезе"

На правах рукописи

Синельникова Виктория Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИМБИЧЕСКИХ СТРУКТУР МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ

ЭПИЛЕПТОГЕНЕЗЕ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МДП ¿012

Пущино-2012

005043056

Работа выполнена в лаборатории системной организации нейронов им. О.С. Виноградовой Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук и Пущинском государственном естественно-научном институте

Научный руководитель:

доктор биологических наук Кичигина Валентина Федоровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Архипов Владимир Иванович

(в.н.с. лаб. экспериментальной нейробиологии)

кандидат биологических наук

Бобкова Наталья Викторовна

(зав.лаб. нейрохимических механизмов патологии

памяти)

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН

Защита состоится "30" мая 2012 г. в 13 час. 30 мин. на заседании Совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.

Автореферат диссертации разослан апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.ф.-м.н.

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эпилепсия — это заболевание мозга, поражающее около 50 миллионов человек в мире. Согласно эпидемиологическим исследованиям, 30% пациентов с этим заболеванием остаются рефрактерными к известным антиэпилептическим препаратам [Andres-Mach et al., 2011]. Для создания более эффективных противосудорожных средств необходимо более глубокое исследование проблем эпилептогенеза и нейрональных нарушений, развивающихся в мозге после судорог.

Наиболее распространенной разновидностью эпилепсии является ее височная форма, при которой патологический очаг развивается в височных структурах (гиппокамп, амигдала, энторинальная кора), относящихся к лимбической системе мозга. В норме они участвуют в регуляции различных поведенческих и когнитивных процессов; во время патологических состояний, в частности, при генерации судорожной активности, тонкая регуляция механизмов функционирования этой системы нарушается [Helmstaedter, 2002; Leritz, 2006; Briellmann et al., 2007]. Известно, что коррелятами когнитивных функций мозга являются ритмические процессы в разных диапазонах частот [Steriade, Contreras, 1995; Vinogradova, 1995; Buzsaki, 2002; Engel, Fries, 2010]. Изменения различных типов осцилляций при эпилептогенезе изучены слабо; в то же время они могут быть основой патологической синхронизации, возникающей при развитии судорожного очага. Таким образом, исследование нарушений ритмической активности в мозге представляет большой интерес и может использоваться при разработке подходов для терапии височной эпилепсии.

При действии повреждающих факторов в мозге происходят патологические морфофункциональные перестройки, в результате чего могут формироваться фокусы судорожной активности; при этом для определенных регионов (очагов) синхронность активности может повышаться, а для других -падать [Uhlhaas, Singer, 2006]. Исходя из этого, для расшифровки патологических изменений, лежащих в основе эпилептогенеза, представляется важным исследование корреляционных отношений структур лимбической системы мозга.

В литературе описаны многочисленные патологические изменения в лимбической системе при эпилепсии [Spencer, Spencer, 1994; Bartolome! et al., 2001; Avoli et al., 2005], возникающие в результате перевозбуждения при

судорогах. Выявлены структуры, в которых эти изменения наиболее выражены - гиппокамп, амигдала, энторинальная кора [Pitkanen et al., 1998; Kendal et all., 1999; Bartolomei et al., 2001]. Тем не менее, отсутствуют данные о том, какие области мозга играют ведущую роль в инициации судорожной активности. Одним из методов, позволяющих проследить последовательность патологической активации нейронов в мозге, может быть регистрация экспрессии c-fos - интегрального компонента сложных сигнальных механизмов, ответственных за клеточный ответ на различные внешние воздействия. Обнаружено, что уровень его экспрессии коррелирует с частотой интериктальной активности, и может служить маркером эпилептических событий [Rakhade et all., 2007]. Таким образом, исследование уровня экспрессии c-fos может быть важным для определения как последовательности, так и степени вовлечения структур мозга в патологический процесс при инициации судорожной активности, что необходимо для выяснения механизмов эпилептогенеза.

Особый интерес представляет изучение септо-гиппокампальных взаимодействий и роли в эпилептогенезе медиальной септальной области (МСО). МСО является субкортикальным входом в гиппокамп и играет критическую роль в генерации тета-ритма, необходимого для осуществления когнитивных функций мозга. Хотя в МСО показаны значительные морфологические перестройки при эпилептогенезе [Colom et al., 2006], что указывает на её участие в этом процессе, значение этой структуры в формировании эпилептического очага в настоящее время не известно. Выяснение конкретной роли МСО в формировании височного патологического фокуса представляет собой одну из первоочередных задач современной нейробиологии и медицины.

Цели и задачи исследования

Цель работы состояла в расшифровке механизмов височной эпилепсии: выяснении особенностей активности и корреляционных отношений между различными лимбическими структурами при эпилептогенезе, по сравнению с таковыми у здоровых бодрствующих животных. Основные задачи исследования:

1. Анализ активности и корреляционных отношений гиппокампа, медиальной септальной области, пириформной коры и амигдалы в дельта-, тета-, альфа- и бета-диапазонах частот у здоровых животных и при формировании патологического очага.

2. Выяснение временной последовательности вовлечения различных структур в патологический процесс при инициации эпилептического статуса.

3. Исследование способности медиальной септальной области вовлекаться в судорожную активность и участвовать в формировании эпилептического очага.

4. Роль функционального отключения медиальной септальной области в генерации острой судорожной активности в септо-гиппокампальной системе.

Научная иовнзна

Настоящее исследование внесло определенный вклад в выяснение механизмов развития височной эпилепсии. В работе впервые проведен анализ суммарной активности (внутримозговой электроэнцефалограммы (ЭЭГ)) и корреляционных отношений четырех структур мозга (гиппокампа, МСО, пириформной коры и амигдалы) в нескольких диапазонах частот (дельта-, тета-, альфа- и бета-) в норме и после вызванного эпилептического статуса (ЭС). Обнаружено снижение мощности и увеличение средней частоты активности для каждого исследуемого диапазона через 5 месяцев эпилептогенеза; наиболее сильные нарушения выявлены для дельта- и тета-осцилляций.

Проведено изучение последовательности вовлечения структур в ЭС с помощью молекулярных и электрофизиологических методов. Показана ключевая роль амигдалы, некоторых базальных ядер, латеральных ядер уздечки и пириформной коры в инициации судорожной активности. Описана также сложная динамика изменения корреляционных отношений исследуемых структур во время ЭС и степень снижения их взаимодействий при эпилептогенезе.

Проанализирована роль МСО в инициации судорожной активности. Показана способность МСО к самостоятельной генерации спонтанных и вызванных судорожных разрядов при эпилептогенезе на модели электрического киндлинга и сокращение длительности судорожной активности, вызванной электрической стимуляцией, при ее функциональном отключении.

Научно-практическая значимость работы

Проведенная работа позволила выявить изменения, которые могут лежать в основе развития патологических процессов в эпилептическом мозге. Параллельная регистрация внутримозговой ЭЭГ из нескольких структур

показала, что изменения ритмической активности при эпилетогенезе наблюдаются не только в гиппокампе, но и в других лимбических образованиях. В связи с тем, что наибольшие изменения выявлялись в дельта-и тета-диапазонах, можно предположить, что изменение таламо-кортикальных и септо-гиппокампальных взаимоотношений, лежащих в основе их генерации, играет наиболее значимую роль в развитии патологического очага.

Выявление структур, первыми проявляющих признаки гиперактивации, а также последовательности активации различных областей мозга во время ЭС, может быть использовано в поиске фармакологических мишеней для остановки либо компенсации развивающейся судорожной активности. Обнаруженная в нашей работе способность МСО к самостоятельной генерации судорожной активности позволяет рассматривать ее как мишень для фармакологических манипуляций в поиске путей компенсации патологических изменений во время эпилептогенеза.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены на Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущине, 2010), Международном симпозиуме «Гиппокамп и память» (Пущино, 2006), Зем, 40м, 5ом, 6°м международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, 2007-2010), Всероссийской конференции «Гиппокамп и память: норма и патология» (Пущино, 2009), конференции молодых ученых ИТЭБ РАН «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2010, 2011), а также на школах: «Нейробиология поведения: нерешенные проблемы» (Московская обл., Менделеево, 2008), «Models in neuroscience: turning experiments into knowledge» (FENS, Санкт-Петербург, 2008), «Biomolecules in health and disease» (Finland, 2009). По материалам диссертации опубликовано 5 работ в рецензируемых журналах, включенных в список ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на /2>6 страницах, содержит рисунка.

Список литературы включает i^o источников отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовались морские свинки (450-540 г, п=34) и крысы линии Вистар (190-240 г, п= 28). Все манипуляции проводили согласно международным нормам этического обращения с животными [Guide for the care and use of laboratory animals, 2010].

Модели эпилепсии.

1. Литий-пилокарпиновая модель эпилепсии. Литий-пилокарпиновый эпилептический статус вызывался введением хлорида лития (3 мг/кг, внутрибрюшинно) и через 20 часов после инъекции раствора пилокарпина (60 мг/кг, подкожно). Для устранения периферических реакций, за 30 минут до введения пилокарпина животные получали метилскополамин (1 мг/кг, подкожно). ЭС определяли как непрерывную судорожную активность, регистрируемую в поведении, и останавливали через 2-3 часа инъекцией диазепама (10 мг/кг, внутримышечно).

2. Киндлинг. Модель создавалась путем повторяющейся электрической стимуляции перфорирующего пути (ПП, частота 5-7 Гц, интенсивность стимула 100-500 мкА, длительность - 0,3-0,8 мс, частота 5 Гц) либо медиальной септальной области (частота 5-7 Гц, интенсивность стимулов 200900 мкА, длительность - 0,3-0,8 мс). В течение дня предъявлялись три серии стимуляций. Ежедневно на каждом животном проводили один эксперимент.

Проведение электрофизиологических экспериментов. За неделю до начала экспериментов проводили хирургическую операцию: по рассчитанным координатам [Rapisarda, Bacchelli, 1977] под общим наркозом (золетил, 18 мг/кг; ксилазин, 12 мг/кг) имплантировали монополярные микроэлектроды в поле CAI гиппокампа (АР=6,6; L=3,0; Н=5,0), медиальную септальную область (АР=12,2; L=2,0; Н=7,5; угол 15°), центральное ядро амигдалы (ЦАМ, АР=9,8; L=5,0; Н=10,7), пириформную кору (ПК, АР=13,4; L=5,2; Н=7,5); биполярные раздражающие электроды вживляли в ПП (АР=9,5; L=6,5; Н=5,5) или МСО (АР=11,5; L=2,0; Н=8,0; угол 14°); референтный электрод устанавливали в затылочную кость. У части животных (п=1) над МСО устанавливали направляющую канюлю для дистанционного введения веществ (АР=11,8; L=2,0; Н=8,0; угол 14°).

Эксперименты проводились в стандартных условиях, в затемнённой, экранированной камере, после адаптации к ней животного. Суммарную активность структур регистрировали в контроле, литий-пилокарпиновой модели эпилепсии (во время ЭС и в течение 6 месяцев после него), в модели

киндлинга и при функциональном отключении МСО. Отключение МСО осуществляли с помощью 10%-ого раствора лидокаина (1мкл), в контрольной группе вводили 0,9%NaCl (1мкл).

Обработка активности. При анализе локальных полевых потенциалов для 5-секундных фрагментов активности строили автокорреляционные и спектральные гистограммы, кросс-корреляционные функции. Анализировали ритмическую активность в дельта-, тета-, альфа- и бета-диапазонах частот. Степень связи между структурами определяли по величине коэффициента кросс-корреляции (Ккр).

Определение экспрессии c-Fos. Мозг извлекали через 30, 60 либо 90 мин после введения пилокарпина (экспериментальная группа, «=18) либо 0,9% NaCl (контроль, «=10). Замороженные фронтальные срезы получали на трех уровнях: АР от 0,48 до 0,2 мм, АР от -1,3 до -1,4 мм и АР от -3,6 до -3,8 мм. На стекло помещали срезы одного уровня из контрольной группы и трех экспериментальных (30, 60 и 90 мин после введения пилокарпина), фиксировали их 4%-ным раствором параформальдегида, инкубировали последовательно с 6%-ной козьей сывороткой, первичными (c-Fos (Н-125): sc-7202, Santa Cruz Biotechnology) и вторичными (Alexa Fluor 488, Invitrogen) антителами. Контроль специфичности связывания проводили методом пропускания антител. Препараты анализировали на конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 (разрешение 1,307 пикс/мкм, увеличение 100Х). c-Fos-экспрессия оценивалась полуколичественным методом [Hughes, Dragunow, 1993]: число c-Fos-иммунореактивных нейронов определяли как «+», если они занимали до 20% площади сечения структуры, «++» - до 50-70%, «+++» - до 100%. Оценка по каждой группе давалась в том случае, если иммунореактивность в структуре мозга выявлялась для 90% срезов.

Морфологический контроль. По окончании экспериментов осуществлялся контроль гибели клеток в хилусе (окраска по Нисслю) и реорганизации аксонов гранулярных клеток зубчатой фасции (окраска по Тимму), являющихся маркерами эпилептогенеза [Mello et al., 1993; Zhang, Buckmaster, 2009]. Для окраски по Тимму после интракардиальной перфузии растворами Na2S (0,37%) и параформальдегида (4%) получали срезы мозга, которые инкубировали в растворе гуммиарабика (50%) с гидрохиноном (5,8%), цитратным буфером и AgN03 (16,6%). При окраске по Нисслю фронтальные срезы мозга инкубировали в растворе крезил-виолета (0,1%). После окраски в обоих протоколах проводили дегидратацию препаратов. Анализ

осуществлялся на микроскопе Leica DM6000B (камера Leica DFC490, разрешение 3,467 пикс/мкм, увеличение 200Х). Наличие спрутинга мшистых волокон определяли по полосе темных гранул в гранулярном и внутреннем молекулярном слое зубчатой фасции. Число окрашенных ядер в хилусе зубчатой фасции и площадь, занимаемая ими на данном срезе, подсчитывались в программе ImageJ 1.44m (США).

Статистический анализ. При анализе данных использовали однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) с применением поправки Бонферрони, в случае повторных измерений (эксперименты с функциональным отключением МСО) статистическая значимость изменений оценивалась с помощью парного критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Суммарная электрическая активность и корреляционные отношения гиппокампа, МСО, ПК и ЦАМ у здоровых животных.

Параметры ритмической активности изучаемых структур в контроле представлены в таблице 1. Средняя частота активности в диапазоне 0,5-30 Гц в гиппокампе была выше, чем в остальных структурах, в связи с преобладанием в нем тета- и альфа-активности; в МСО, ПК и ЦАМ в большей степени регистрировались дельта-волны, в связи с чем средняя частота по всему диапазону анализируемой активности была ниже. Бета-активность в структурах была выражена слабее и чаще встречалась в ПК и гиппокампе.

Таблица 1. Характер активности в гиппокампе, МСО, ПК и ЦАМ в контроле.

Дельта-ритм Тета-ритм Альфа-ритм Бета-ритм 0,1-30 Гц

гиппо-камп частота (Гц) 3,1±0,2 6,3±0,4 9,3±0,4 13,9±0,6 6,4±0,7

мощность (отн.ед,) 4,9±1,2 9,5±1,8 7,0±1,7 2,8±0,7 10,8±1,9

МСО частота (Гц) 2,6±0,3 5,7±0,4 9,5±0,3 13,9±0,6 4,6±1,4

мощность (отн.ед.) 3,5±0,8 2,5±0,9 2,8±1,9 1.U0.4 4,6±3,2

ПК частота (Гц) 2,8±0,2 5,8±0,4 9,5±0,4 13,9±0,5 5,6±1,0

мощность (отн.ед.) 4,5±0,9 4,7±0,9 4,4±1,7 2,8±1,2 7,9±1,6

ЦАМ частота (Гц) 2,6±0,3 5,7±0,4 9,4±0,4 13,9±0,5 5,1±1,3

мощность (отн.ед.) 6,8±1,6 5,7±1,2 4,7±1,8 1,7±0,4 8,1 ±3,1

Кросс-корреляционный анализ показал достаточно высокую синхронность активностей МСО и гиппокампа: Ккр в контроле равнялся 0,67±0,12. Высокие

значения Ккр регистрировались также для активностей МСО и ЦАМ (0,64±0,12), МСО и ПК (0,61 ±0,17), ПК и ЦАМ (0,68±0,12).

2. Взаимоотношения гиппокампа, МСО, ПК и ЦАМ во время эпилептического статуса и последующего эпилептогенеза.

Введение пилокарпина вызывало развитие характерных для ЭС поведенческих судорог [ТигвЫ е( а!., 1983]. В полевой активности гиппокампа, МСО, ЦАМ и ПК после инъекции конвульсанта регистрировалось нарастание высокочастотной бета- и гамма-активности (рис. 1 Б). К моменту развития клонико-тонической судороги высокочастотные осцилляции в структурах сменялись пароксизмами, которые в первую очередь выявлялись в ЦАМ (рис. 1 В), а через 1-2 мин в МСО, гиппокампе, и ПК. Приступы пароксизмов регистрировались с интервалом 20-30 мин и при повторной генерации возникали одновременно во всех структурах (рис. 1 Г)-

Кросс-корреляционный анализ выявил значимое повышение Ккр (р<0,05) сразу после введения пилокарпина для активностей гиппокампа и ПК на 37±16%, МСО и ЦАМ на 13,0±6,5%, гиппокампа и ЦАМ на 22±15%, МСО и ПК на 29±7%, ПК и ЦАМ на 26±8%. Во время генерации первого эпизода пароксизмальной активности в ЦАМ, когда в других структурах продолжали доминировать бета- и гамма-осциляции, Ккр активностей ЦАМ с МСО и гиппокампом падал соответственно на 32±20% и 20±15% относительно контроля, хотя для остальных структур он оставался повышенным. Кроме того, в этот период возрастал Ккр активностей МСО и гиппокампа (на 19±12%) и гиппокампа и ПК (на 50±21%). К моменту, когда пароксизмальная активность начинала регистрироваться и в остальных структурах, корреляция МСО с ЦАМ и гиппокампа с ЦАМ вновь возрастала. Во время последующих эпизодов пароксизмальной активности Ккр падал только для активностей МСО, ПК и ЦАМ с гиппокампом (на 55±13%, 32±10% и 56±19% соответственно), для МСО и ЦАМ, МСО и ПК, ПК и ЦАМ он оставался повышенным в сравнении с контролем. Таким образом, была выявлена сложная динамика изменений кросс-корреляционных взаимодействий исследуемых структур мозга при развитии ЭС.

Морфологический контроль показал нормальный паттерн окраски клеточных слоев в срезах гиппокампа морских свинок в контроле; через 5 месяцев после введения пилокарпина были обнаружены абберантные связи, обусловленные спрутингом цинк-содержащих аксонов нейронов зубчатой фасции, в гранулярном и внутреннем молекулярном слоях (рис. 2). Окраска по

Нисслю выявила снижение числа клеток в хилусе зубчатой фасции через 5 месяцев после ЭС на 45% (с 10,4±1,9 до 5,7±1,5 кл/мм2, р<0,01). д р „ I гиинокам

11 к

ъкр&Л! у/у«, ^муЩЫ^щ^'А

' МСО

^гЫ^к^А"^- ^'^Му^иллМ ^ЙУ^МЦ^Амн*^

ЦАМ

IB

fjj

гиппокамп - МСО 11К-ЦАМ

Рис. 1. ЭЭГ и спектральные гистограммы гиппокампа, МСО, ПК и ЦАМ в контроле (А), через 15 мин (Б), 17 мин (В) и 60 мин (Г) после введения пилокарпина. Калибровка: 1 с, 0,5 мВ.

Рис. 2. Спрутинг мшистых волокон, в вентральном гиппокампе. а и в - контроль; б и г - 5 месяцев после ЭС. Увеличение 2.5Х (а, в) и 10Х (б, г). Масштаб 150 мкм. Стрелки указывают на абберантные Тимм-окрашенные участки во внутреннем молекулярном слое зубчатой фасции у животных с эпилептогенезом.

Изменения частоты и мощности осцилляций в дельта-, тета-, альфа- и бета-диапазонах были обнаружены через 2 месяца после ЭС, при этом динамика нарастания патологических изменений варьировала; спустя 5 месяцев они были отчетливыми у всех экспериментальных животных. Наибольшие нарушения выявлены в диапазонах дельта- и тета-частот: дельта-активность практически отсутствовала, ее мощность составляла 3,0±2,5% относительно контрольных значений, мощность тета-осцилляций падала на 8595%; частота активности в каждом диапазоне повышалась. Аналогично, снижение мощности и возрастание средней частоты осцилляций были выявлены для альфа- и бета-диапазонов частот. Таким образом, через 5 месяцев эпилептогенеза максимумы частот сместились в область высокочастотного тета-, а также в альфа- и бета- диапазоны (рис. 3).

Корреляционный анализ также выявил существенные изменения межструктурных взаимодействий в процессе эпилептогенеза. Через 5 месяцев после ЭС, снижался коэффициент кросс-корреляции активностей гиппокампа с ПК (20,5±8,0%), с ЦАМ (22±8%) и с МСО (22,5±4,0%), а также МСО с ЦАМ (14±6%) и с ПК (21,5±4,0%); для ПК и ЦАМ достоверных изменений выявлено не было.

4=300

.1

гиппокамп ПК

МСО ЦАМ дельта-

гиппокамп ПК МСО ЦАМ тета- - альфа- - бета-

Рис. 3. Изменение средней частоты и мощности осцилляторной активности гиппокампа, ПК, МСО и ЦАМ через 5 месяцев после эпилептического статуса. Контроль (обозначается пунктирной линией) в каждом измерении принят за 100%. Изменения достоверны при р< 0,05 для частоты, р< 0,01 для мощности активности.

3. Выявление последовательности активации структур мозга методом c-Fos экспрессии при инициации эпилептического статуса.

В контроле очень ограниченное число нейронов, экспрессирующих c-Fos, регистрировалось в коре, зубчатой фасции и поле CAI гиппокампа, медиальной и латеральной септум, прилежащем ядре, а также в ядрах таламуса; более высокий уровень экспрессии c-Fos наблюдался в ПК, обонятельном бугорке и 6СМ слое неокортекса (рис. 4).

Через 30 минут после начала ЭС было обнаружено нарастание уровня экспрессии c-Fos в ПК, обонятельном бугорке и 60м слое неокортекса (++); в остальных структурах, в которых в контроле выявлялись иммунореактивные клетки, достоверных отличий не было выявлено. Кроме того, в процесс активации вовлекались дорзапьная часть хвостатого ядра, латеральные ядра уздечки и септо-гиппокампальное ядро (рис. 4).

Через 60 минут после начала ЭС максимальное число иммунореактивных клеток (+++) наблюдалось в ПК, обонятельном бугорке, 60М слое неокортекса, септо-гиппокампальном ядре, базомедиальном ядре амигдалы, некоторых ядрах таламуса и латеральных ядрах уздечки. На этом

сроке экспрессия c-Fos обнаруживалась также в вентральной части хвостатого ядра, полях СА2 и САЗ гиппокампа, неопределенной субстанции, в базолатеральном, латеральном и кортикальных ядрах амигдалы, амигдапо-стриатарной и амигдало-гиппокампальной областях, латеральной и вентролатеральной гипоталамических областях, медиальном и магноцеллюлярном преоптических ядрах гипоталамуса, однако она имела там низкие значения (+). Большее же число c-Fos позитивных нейронов (++) среди вновь вовлекаемых структур регистрировалось в латеральной области бледного шара, базапьном ядре Мейнерта, передней амигдалярной области, задней гипоталамической области и паравентрикулярном ядре гипоталамуса.

контроль 30 мин 60 мин 90 мин

Г | ......(ЩЯ**.

\ i \ .....\ р

Рис. 4. Схематическое

V ( ; • ( \ * ( 4 ' I изображение распределения

г С • ¡11;.. с-Роэ экспрессии I!

-ч; структурах мозга через

разные временные

I, . : интервалы после инициации

^ ^ ^ ЭС пилокарпином. Светло-

¿1, серый «+», серый «++».

-I /' -.-шшш —т ^.шшякшшшяш

темно-серым «+++».

' ' tS^X : Через 90 минут

■ I ШКУ% Ш »)

х 7J

возрастало число с-Ров-¥/ позитивных нейронов в коре, гиппокампе, медиальной и латеральной септапьной областях, прилежащем ядре, ядре Мейнерта, латеральной области бледного шара, амигдапе (латеральное ядро, амигдало-стриатарная и передняя амигдалярная области), латеральных ядрах уздечки, а также в некоторых областях гипоталамуса и таламуса. В остальных структурах (неопределенная субстанция, кортикальные ядра амигдалы, ядра таламуса, латеральная гипотапамическая область, преоптические ядра) уровень экспрессии с-Роэ имел средние значения, но тем не менее, превышал значения, регистрируемые через 60 мин после начала ЭС.

4. Изменения электрической активности в передне-мозговых структурах на модели электрического кнндлинга.

Стимуляция перфорирующего пути вызывала изменения как в гиппокампальной, так и в септапьной активности. В гиппокампе уже Iм серия

стимулов приводила к возникновению ответов следования за стимулом, в МСО регулярные вызванные ответы появлялись с 7-8°" серии стимуляции, и на 10-11ую они становились такими же высоко-амплитудными, как в гиппокампе. Стимуляция ПП с определенными параметрами уже при первом раздражении приводила к генерации в гиппокампе судорожных послеразрядов (СП); в МСО судорожная активность возникала после 7-10 серий стимуляций (рис. 5). По шкале Racine [Racine, 1972] максимальная стадия судорожного поведения оценивалась в 3-4 балла и регистрировалась только при генерации СП в активности и гиппокампа, и МСО.

При стимуляции МСО с аналогичной частотой (5-7 Гц) на первые серии раздражителей отчетливые регулярные ответы на каждый стимул возникали только в самой септальной области, а в гиппокампе появлялись лишь на 25-ЗО5"0 серию раздражений. После предъявления 16-18" серий раздражений в поведении регистрировалось беспокойство с быстро нарастающими тонико-клоническими судорогами всего тела (5 баллов по шкале Racine), тогда как СП в гиппокампе и МСО возникали лишь на 200-210ую серию раздражений (рис. 5).

д 1 гиппокамп

A s тДл/ j ^W^VV-—.r-.f'K/--

гиппокамгг-

Рис.

судорожной

5. Развитие активности в ответ на электрическое раздражение ПП и МСО. А. Iм серия раздражения ПП. Б. 7-10ая серия раздражения ПП. В. Iм серия раздражения I МСО. Г. 200-210™ серия раздражения МСО.

Калибровка: 0,5 с, 0,5 мВ. Стрелки — окончание стимуляции.

При генерации СП, независимо от сайта стимуляции, в активности структур регистрировались периоды значительно сниженной корреляции (Ккр=0,32±0,11, р<0,01). После окончания СП Ккр активностей структур возрастал и достигал значения 0,84±0,06, достоверно превышая контрольную среднюю величину.

В протоколе с ежедневной стимуляцией МСО у животных не удавалось вызвать устойчивое эпилептоподобное состояние: через 3 месяца раскачки не

обнаружено признаков спонтанной судорожной активности и каких-либо изменений в поведении, свидетельствующих об эпилептизации. Анализ фоновой активности гиппокампа и МСО выявил возрастание значения Ккр (на 21,0±9,8%), мощности осцилляций в гиппокампе (на 70±20%) и МСО (на 26±15%), обусловленное усилением активности в тета- и альфа-диапазонах (р<0,05). Частота активности достоверно не изменялась.

После 90-100 серий стимуляций ПП в поведении животных появлялись признаки эпилептизации: повышенная возбудимость, ороалиментарные автоматизмы, периодические судорожные подергивания тела. Активность гиппокампа отличалась появлением бифазных острых событий, превышающих по амплитуде острые волны, регистрируемые в контроле (1, 1±0,2 мВ в контроле и до 2,0±0,3 мВ после серии стимуляций, р<0,05); бифазные острые события появлялись и в МСО (где острые волны в контроле практически отсутствовали). Повышалась частота встречаемости веретен (с 0,015±0,004 событий/с до 0,042±0,012 событий/с) и их длительность (с 0,9±0,2с до 1,8±0,4с, р< 0,05). А

\ гиппокамп

•1 1

амаа--

Рис. 6. Контроль (А) и спонтанные судорожные разряды (Б) у животных с киндлингом ПП. Справа налево: полевая активность, спектральная гистограмма (по оси абсцисс - частота, Гц; по оси ординат — мощность, отн.единицы), кросс-корреляционная функция (по оси абсцисс - время, с; по оси ординат - величина Ккр). Калибровка: 1 с, 0,5 мВ.

Спектральный анализ выявил снижение мощности активности в диапазоне 0,5 - 30 Гц в гиппокампе у 75% животных (на 55±18%, р<0,05) и возрастание частоты у 40% животных (на 19±5%, р<0,05). В МСО средняя частота увеличивалась на 16±5% у 60% животных (р<0,05). Возрастание частоты было в основном обусловлено усилением активности в альфа- и бета-диапазонах; у половины животных возрастала частота тета- и дельта-ритма. Кроме того, у животных спонтанно возникала эпилептиформная активность: повторяющиеся

периоды острых событий, имеющих ритмический характер и следующих с частотой 6-8 Гц, по амплитуде в 10-13 раз превышающих спонтанную активность (рис. 6). Ккр в диапазоне частот от 0,5 до 30 Гц во время спонтанных судорог, так же, как и во время послеразрядов, снижался и равнялся 0,26±0,15. Ккр фоновой активности гиппокампа и МСО при киндлинге ПГ1 у 70% животных снижался на 9,0±3,4% (р<0,05).

5. Активность гиппокампа и МСО при временном функциональном отключении септальной области.

В течение дня предъявляли две стимуляции ПП с интервалом 6 часов, контрольной группе перед стимуляцией всегда вводили 0,9% ЫаС1, экспериментальной перед первой стимуляцией - 0,9% №С1 и перед второй -10%-ый лидокаин. В связи с этим фоновая активность анализировалась перед первым и вторым введением препарата: на спектральных гистограммах активности гиппокампа и МСО не выявлено существенных различий в частотных полосах активности структур и их мощности (рис.7). Эксперименты проводили с интервалом 3-4 дня, чтобы избежать раскачки.

б в

Рис. 7. Примеры спектральных гистограмм активностей гиппокампа и МСО при введении лидокаина и 0,9% 1ЧаС1 в МСО. Фон перед (а) и через 10 мин (б) после введения 0,9% КаС1. Фон перед (в) и через 10 мин (г) после введения 10%-ого лидокаина. По оси абсцисс - частота, Гц; по оси ординат-мощность, отн.ед. Спектральные максимумы обозначены сверху. Анализ произведен в полосе частот 0,5-25 Гц, бин 0,5 Гц.

Введение 0,9% ИаС1 (1 мкл) в МСО приводило к кратковременному снижению мощности суммарной полевой активности в гиппокампе (на 37±5%) и МСО (на 57±11%) и возрастанию частоты в гиппокампе (на 7±5% в 30% экспериментов). Активность восстанавливалась в течение 5-6 минут после

микроинъекции и к моменту нанесения раздражения возвращалась к контрольным значениям (рис. 7).

Инъекция 10%-ого лидокаина (1мкл) в МСО значительно подавляла активность: в гиппокампе мощность осцилляции снижалась на 78±8% (в большей степени подавлялась активность в тета- и альфа-диапазонах, на 81 ±7% и 79±8% соответственно, р<0,05), в МСО - на 85,0±8,5% (р<0,05, изменения в равной степени касались всех анализируемых диапазонов). Кроме того, инъекция лидокаина вызывала увеличение средней частоты активности в гиппокампе на 14,0±3,8% (р<0,05). Изменения, вызванные анестетиком (рис. 7), достигали максимального значения в течение 10-15 минут, после чего стимулировался ПП.

Функциональное отключение МСО введением лидокаина при тех же параметрах стимуляции (частота, длительность и время, в течение которого раздражали ПП) сокращало длительность судорожных послеразрядов с 72,5±20,5с (после введения 0,9% NaCl) до 58,5±16,5с (после введения 10%-ого лидокаина) (/><0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Суммарная активность в контроле. Обнаруженная у здоровых животных высокая степень корреляции активностей исследуемых структур свидетельствует об их тесных функциональных взаимоотношениях, что подтверждается имеющимися данными о наличии между ними анатомических связей [Toth, Freund, 1992; Pitkänen, 2000; Colom et al., 2005]. Во всех анализируемых структурах регистрировалась активность в дельта-, тета-, альфа- и бета-диапазонах, что, вероятно, обусловлено мощными связями их как друг с другом, так и с источниками генерации осцилляций (септо-гиппокампальная система, ядра таламуса и кора). Большая выраженность дельта-осцилляций в МСО, ПК и ЦАМ, возможно, обусловлена мощными таламо-кортикальными афферентами и связями с ретикулярным ядром таламуса [Steriade, 1993; Lee et al., 2004]. Бета-активность была лучше выражена в гиппокампе и ПК, по-видимому, в связи с тем, что они являются кортикальными структурами [Engel, Fries, 2010].

Изменение активности передне-мозговых структур при экспериментальном эпилептогенезе. Анализ суммарной активности гиппокампа, ПК, ЦАМ и МСО выявил их раннюю активацию после введения пилокарпина в виде резкого нарастания высокочастотных бета- и гамма-

осцилляций с последующей трансформацией в пароксизмы, которые начинались в ЦАМ и спустя несколько минут распространялись в МСО, ПК и гиппокамп. Инициация пароксизмальной активности в амигдале, обнаруженная нами, подтверждает данные о том, что наряду с гиппокампом она может быть очагом эпилептической активности и способна вызывать судорожную активность благодаря наличию в ней мощной глутаматергической системы [Rogawski et al., 2003]. Показано, что амигдала более склонна к генерации судорожной активности, чем гиппокамп, а интериктальные разряды, независимо от места стимуляции, имеют тенденцию инициироваться в амигдале и ПК [Mclntyre, 2008].

Анализ корреляционных отношений показал, что при инициации пароксизмов в ЦАМ корреляция ее активности с другими структурами падала; вовлечение гиппокампа в электрографические судороги приводило к аналогичному изменению его корреляционных отношений. Возможно, что возникающая десинхронизация могла облегчать развитие судорожной активности путем изоляции патологически разряжающихся нейронов эпилептического фокуса от контролирующего влияния окружающей сети. Снижение синхронности в областях, окружающих эпилептический фокус, было продемонстрировано также в отведениях внутричерепными электродами во время преикталыюй активности [Quyeen et al., 2003]. Для отведений ПК, ЦАМ и МСО во время вторично возникающих пароксизмов, наоборот, регистрировалось усиление корреляционных отношений. Повышенная локальная синхронность активностей структур может отражать ненормальную функциональную связь в пределах эпилептогенных областей. В других работах также показано повышение когерентности в регионах, являющихся частью эпилептогенных зон [Towle, Syed et al. 1998].

Возрастание средней частоты и снижение мощности активности в гиппокампе, МСО, ПК и ЦАМ, обнаруженное через 5 месяцев после инициации ЭС, подтверждают их высокую уязвимость при эпилептогенезе. Установлено, что судороги, вызванные пилокарпином, приводят к гибели ГАМКергических клеток в гиппокампе, септум (до 40%), амигдале (44-75%) и пириформной коре (46%) [Garrido-Sanabria et al., 2006; Chen et al., 2007; Tuunanen et al., 1997], а также к повышению глутаматергической трансмиссии [Benini, Avoli, 2006; Yang et al., 2006; Santos et al., 2011]. Кроме того, снижается частота тормозных постсинаптических потенциалов и эффективность ГАМК рецепторов [Braga et al., 2004; Wyeth et al., 2010]. Таким

образом, в исследуемых структурах возбуждающие процессы начинают преобладать над тормозными, что отражается в ЭЭГ как возрастание частоты активности. Кроме того, гибель ГАМКергических клеток, например в ПК, ослабляет тормозным контроль активности пирамидных клеток, проецирующихся в различные отделы базалыюго мозга [Wyss, 1981; Carmichael et al., 1994], и способствует генерализации судорожной активности.

Снижение мощности активности, обнаруженное в нашей работе, может быть обусловлено как гибелью нейронов в структурах, критичных для генерации определенного типа активности, так и патологическими изменениями в работе медиаторных систем после инициации судорожной активности. Ослабление дельта-ритма может быть связано с гибелью клеток ретикулярного ядра таламуса, уменьшением торможения в кортикальных сетях, повышенным выбросом глутамата и дефицитом калиевых каналов (Kv3.1), экспрессирующихся в ГАМКергических нейронах [Marini et al., 2000; Hairston et al., 2004; Hong et al., 2010]. Таким образом, усиление процессов возбуждения при эпилептогенезе может способствовать подавлению дельта-активности. Генерация альфа-активности, как и дельта-ритма, осуществляется таламокортикальной системой, таким образом, она также нарушается при потере ГАМКергических нейронов ретикулярных ядер и возбуждающих клеток релейных ядер таламуса [Sohal et al., 2003; Lee et al., 2004]. Так как для генерации дельта-ритма необходим больший уровень гиперполяризации, то в результате ослабления тормозных влияний при эпилептогенезе, он нарушался в первую очередь.

Выявленное нами нарушение тета-активности в гиппокампе эпилептического мозга подтверждается работами других авторов [Colom et al., 2006; Arabadzisz et al., 2007]. В основе этих изменений во время эпилептогенеза могут лежать такие события, как потеря нейронов в энторинальной коре, ГАМКергических клеток в септальной области и слоях oriens-Iacunosum moleculare поля СА1 [Du et al., 1995; Cossart et al., 2001; Garrido-Sanabria et al., 2006], вовлеченных в генерацию и контроль тета-ритма. Нарушенный ритмогенез в гиппокампе препятствует распространению тета-активности в ПК, МСО, ЦАМ. Снижение мощности бета-ритма, показанное в данной работе, может быть связано с ослаблением кортикальных влияний и гибелью ГАМКергических интернейронов, которые работают как пейсмейкеры в генерации высокочастотных осцилляций, а также с усилением НМДА-трансмиссии и активацией дофаминергических нейронов, число

которых, как показано в пилокарпиновой модели, увеличивается при эпилепсии [Roopun et al., 2008; Holgado et al., 2010; Cifelli, Grace, 2011].

В основе изменения корреляционных отношений структур при эпилептогенезе возможно также лежат морфофункциональные перестройки, которые приводят к формированию изолированных очагов активности со сниженной корреляцией. В нашей работе изменения корреляционных отношений не зарегистрировано только для ЦАМ и ПК, что возможно указывает на меньшую подверженность связей между этими структурами патологическим изменениям; высокая синхронизация активности этих структур может способствовать генерации и распространению спонтанных судорог в эпилептическом мозге.

Аналогичные, но менее выраженные изменения активности гиппокампа и МСО получены в модели киндлинга ПП, что, вероятно, связано с локальной инициацией судорожной активности в гиппокампе; введение пилокарпина, по-видимому, патологически активирует большее число структур с последующими мощными морфологическими повреждениями и соответственно более глубоким нарушением осцилляторной активности.

Последовательность активации структур мозга при инициации эпилептического статуса. Методом регистрации c-Fos-экспрессии в нашей работе установлено, что первыми при инициации ЭС пилокарпином активировались структуры, получающие мощную холинергическую иннервацию (обонятельный бугорок, ПК, ядра таламуса), а также хвостатое ядро, где имеется большое количество холинергических интернейронов [Turski et al., 1989; Nathanson, 2008]. Этот факт подтверждает роль холинергических медиаторных систем в инициации судорог. Далее судорожная активность развивается с участием глутамат- и дофаминергической систем мозга [Nagao et al., 1996; Fritschy et al., 1999]; по-видимому, именно в связи с этим через 60 минут после инъекции пилокарпина в процесс активации вовлекались гиппокамп, прилежащее ядро, септальная область, амигдала, базальное ядро Мейнерта, богатые глутаматергическими клетками. Активация в лимбические структуры могла распространяться из ПК и обонятельного бугорка [Ray, Price, 1992; Datiche, Cattarelli, 1996], где в первую очередь выявлялась c-Fos-экспрессия. Латеральные ядра уздечки, выявляющие раннюю c-Fos-иммунореактивность, наряду с ПК могут быть одной из ключевых структур в генерализации пилокарпиновых судорог. Они функционируют как релейные звенья между базальными ядрами и гиппокампом: инъекция антагониста

НМДА-рецепторов либо агониста ГАМКд рецепторов в латеральные ядра уздечки тормозит развитие ЭС после введения пилокарпина [Patel et al., 1988].

В нашей работе подтвердились данные других авторов по экспрессии с-Fos, которая отражает нарастание общей клеточной возбудимости вследствие постепенного вовлечения возбуждающих нейротрансмиттеров в распространение судорог, что в итоге приводит к гибели нейронов. В подтверждение этого c-Fos-иммунореактивность довольно точно соответствует распространению клеточной гибели после вызванных пилокарпином судорог [Turski et al., 1986, 1989], и в том числе более поздней активации гипоталамуса, где гибель клеток достигает максимума на больших сроках [Covolan, Mello, 2000].

Роль МСО в генерации острой судорожной активности в гиппокампе. В модели с киндлингом МСО не удалось вызвать устойчивого эпилептоподобного состояния, что, вероятно, связано с меньшей склонностью МСО к генерации судорог в отличие от гиппокампа и амигдалы. Повышение корреляционных отношений гиппокампа и септальной области, наблюдаемые при киндлинге МСО, а также возрастание мощности тета-осцилляций в гиппокампе, указывает на усиление функциональных взаимодействий этих структур. В связи с описанной протекторной ролью тета-осцилляций в развитии судорог в гиппокампе [Miller et al., 1994; Colom et al., 2006], возможно, стимуляция МСО, которая является пейсмейкером гиппокампального тета-ритма, стабилизирует это состояние и затрудняет развитие патологической активности. Тем не менее, со временем взаимодействия в септо-гиппокампальной системе нарушаются, что возможно связано с вовлечением в возбуждение подкорковых структур и распространением судорог из них. Нельзя исключить и возможность того, что в эпилептическом мозге ритмогенез нарушается, в связи с чем тета-осцилляции потенциируют патологическую синхронизацию.

В модели с киндлингом ПП для возникновения судорожных послеразрядов в МСО требовалась более длительная раскачка в сравнении с таковой, необходимой для их появления в гиппокампе, что, возможно, свидетельствует об особых свойствах септальных нейронов и очень мощной системе внутренних тормозных связей в МСО [Henderson et al., 2001, 2004]. Тем не менее, ежедневная стимуляция приводила к развитию патологической активности и появлению у МСО способности к самостоятельной, независящей от гиппокампа, генерации судорожных разрядов. В основе этой перестройки

может лежать гибель нейронов [Sutula, 1990; Garrido-Sanabria et al., 2006]. Предполагается, что локальные и проекционные ГАМКергические клетки МСО осуществляют внутрисептальныи тормозный контроль активности разных нейронных популяций (ГАМКергических, холинергических и глутаматергических) [Henderson, 2001, 2004]. Показано также, что селективное разрушение холинергических нейронов МСО облегчает развитие киндлинга [Ferencz et al., 2001]. Таким образом, гибель ГАМКергических клеток, а также снижение их активности при дегенерации холинергических нейронов, в норме активирующих ГАМКергические нейроны [Wu et al., 2000], в процессе эпилептогенеза могут обеспечивать ослабление тормозных процессов в МСО и способствовать появлению спонтанных эпилептиформных разрядов.

Кроме этого, причиной появления судорожной активности в МСО могут быть внутригиппокампальные перестройки, включающие повреждение нейронов в полях САЗ, СА1 и зубчатой фасции, спрутинг аксонов с формированием аберрантных связей, снижение общего числа синапсов во всех полях гиппокампа [Henshall et al., 2000; Fujikawa et al., 2000; El Bahh et all., 1999]. Это, несомненно, приводит к перестройке гиппокампально-септальных отношений и, в связи с этим, к изменению модулирующего влияния гиппокампа на активность МСО, как прямого, так и через латеральное септальное ядро. В результате может нарушаться активность как ГАМКергических, так и холинергических нейронов МСО, что в итоге должно приводить к срыву тормозных процессов в этой области. Эти данные свидетельствуют о том, что в эпилептическом мозге МСО может быть структурой, участвующей вместе с гиппокампом в инициации судорог.

Эксперименты с введением анестетика в МСО показали, что в условиях генерации судорожной активности функциональное отключение МСО приводит к сокращению длительности судорожных разрядов. Возможно, что сильные функциональные связи МСО и гиппокампа, которые в норме обеспечивают генерацию тета-ритма и когнитивные функции, при развитии патологического состояния могут облегчать генерацию судорожных разрядов. Вследствие этого, разъединение звеньев этой сети позволяет сократить длительность судорог. Кроме того, функциональное отключение МСО приводило к возрастанию средней частоты и снижению мощности суммарной активности в гиппокампе, что также наблюдается в эпилептическом мозге [Colom et al., 2006]. В то же время, в нормальном мозге медиальная септальная область обеспечивает оптимальный уровень осцилляторной тета-активности в

гиппокампе [Vinogradova, 1995; Vertes, Koesis, 1997; Buzsaki, 2002, 2006]. Это может свидетельствовать об изменении общего характера септальных влияний на гиппокамп при эпилептогенезе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные эксперименты с использованием моделей экспериментального эпилептогенеза (литий-пилокарпиновый эпилептический статус, электрический киндлинг ПП) позволили выявить сходные изменения, характерные для суммарной активности гиппокампа и МСО: возрастание средней частоты и падение мощности активности в дельта-, тета-, альфа- и бета-диапазонах частот, снижение корреляционных отношений. Анализ активности пириформной коры и амигдалы выявил аналогичные изменения; таким образом, очевидно, что развитие патологического очага не ограничивается гиппокампом и энториналыюй корой - структурами, которые наиболее подробно изучаются при височных патологиях, а распространяется в другие области мозга. Возрастание средней частоты активности в регистрируемых структурах, вероятно, связано с ослаблением тормозной трансмиссии и увеличением возбуждающих влияний при эпилептогенезе, что наряду с массивной гибелью клеток может также лежать в основе подавления мощности ритмической активности. Наиболее значимые изменения, выявленные в диапазонах дельта- и тета-частот, могут быть обусловлены большей уязвимостью источников их генерации (таламо-кортикальная и септо-гиппокампальная системы) при эпилепсии.

Изменение осцилляторной активности и морфо-функциональные перестройки связей между структурами могут также лежать в основе изменения корреляционных отношений гиппокампа, МСО, ПК и амигдалы при эпилептогенезе. Ослабление взаимодействий между структурами в свою очередь может способствовать образованию изолированных очагов активности и дальнейшему развитию судорог.

Электрофизиологические и молекулярные методы показали, что при инициации эпилептического статуса гиппокамп, МСО, амигдала и ПК активируются одними из первых и в дальнейшем участвуют в поддержании патологической активности. Кроме того, регистрация экспрессии c-Fos на ранних этапах развития ЭС, позволила провести более масштабный анализ и выявить структуры, участвующие в инициации судорог. Так, выявленная ранняя активация ПК, базальных ядер, амигдалы и латеральных ядер уздечки указывает на то, что при эпилептогенезе эти образования способствуют

генерализации патологический активности и распространению ее в другие регионы мозга.

Анализ активности МСО выявил ее устойчивость к вовлечению в судорожную активность на ранних этапах эпилептогенеза, что, вероятно, обусловлено особенностями внутрисептальных связей. Однако в патологических условиях обнаружены изменения функционирования МСО: обнаружена способность к самостоятельной генерации судорожной активности и сокращение длительности судорожных послеразрядов во время ее функционального отключения. Таким образом, полученные данные показали, что в условиях формирования височного судорожного очага синхронизирующие влияния со стороны МСО способствуют поддержанию и распространению патологической активности.

ВЫВОДЫ

1. На моделях височной эпилепсии в гиппокампе, медиальной септальной области, пириформной коре и амигдале выявлено подавление мощности и возрастание средней частоты активности в дельта-, тета-, альфа- и бета-частотных диапазонах. Результаты указывают на нарушение тормозных процессов, обеспечивающих оптимальный уровень осцилляторной активности в этих структурах, необходимый для осуществления их функций.

2. Высокая корреляция активностей структур в контроле, свидетельствующая об их тесных функциональных взаимодействиях, снижалась при эпилептогенезе, что указывает на развитие процессов дезинтеграции; очевидно, что нарушение межструктурных коммуникаций способствует прогрессированию патологических изменений.

3. Амигдала, базальные ядра, латеральные ядра уздечки и пириформная кора первыми активировались во время эпилептического статуса в литий-пилокарпиновой модели эпилепсии. Таким образом, их можно рассматривать как структуры, играющие ключевую роль в инициации эпилептогенеза.

4. Обнаружена относительная (по сравнению с гиппокампом) устойчивость медиальной септальной области к развитию судорожных послеразрядов, сменяющаяся в процессе эпилептогенеза появлением у этой структуры способности к самостоятельной генерации судорожной активности; можно предполагать, что появление такого свойства является критическим фактором, поддерживающим развитие патологического очага в септо-гиппокампальной системе.

5. Во время генерации судорожной активности функциональное отключение медиальной септальной области сокращало длительность эпилептиформных разрядов. Этот факт подтверждает предположение о решающей роли медиальной септальной области в эпилептогенезе, что вносит определённый вклад в понимание механизмов развития височной эпилепсии и поиск подходов для её терапии.

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (проект № 2.1.1/2280, 2.1.1/3876), РФФИ (№ 12-04-00776, 06-04-48637, 09-04-90718-моб_ст) и Президента РФ (грант НШ-850.2012.4).

Выражаю благодарность консультанту по морфологической части работы, д.б.н. Лосевой Елене Владимировне.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Кичигина В.Ф., Кутузова М.В., Синельникова В.В. Медиальная септальная область как мишень для модуляции судорожных разрядов в гиппокампе в модели острой височной эпилепсии // Журн. высш. нерв. деят. 2007, 57 (1), 52-64.

2. Синельникова В.В., Попова И.Ю., Кичигина В.Ф. Корреляционные отношения гиппокампа и медиальной септальной области и их изменения в процессе эпилептогенеза//Журн. высш. нерв. деят. 2008, 58 (3), 345-350.

3. Popova I.Yu., Sinelnikova V.V., Kitchigina V.F. Disturbance of the correlation between hippocampal and septal EEGs during epileptogenesis // Neuroscience Letters. 2008, 442, 228-233.

4. Синельникова B.B., Кичигина В.Ф. Изменения в электрической активности медиальной септальной области, пириформной коры и миндалины при эпилептогенезе на модели височной эпилепсии // Журн. высш. нерв. деят. 2011,61 (2), 219-226.

5. Кабанова И.В., Синельникова В.В., Попова И.Ю., Кичигина В.Ф., Алиев P.P. Когерентный и фазовый анализ тета-осцилляций в септо-гиппокампальной системе при генерации судорожной активности // Журн. высш. нерв. деят. 2011,61 (6), 743-749.

Тезисы докладов:

1. Синельникова В.В., Попова И.Ю. Взаимоотношения септум и гиппокампа во время электрически вызванной эпилептической активности // Зий Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», г.Судак, Украина, 2007, с.214.

2. Синельникова В.В., Кичигина В.Ф. Электрическая активность гиппокампа при стимуляции двух афферентных входов в моделях эпилепсии // 4Ы" Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», г.Судак, Украина, 2008, с.270.

3. Синельникова В.В. Изменения в электрической активности медиальной септальной области и амигдалы при эпилептогенезе на модели височной эпилепсии // 5ЬШ Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», г.Судак, Украина, 2009, с.620

4. Синельникова В.В. Изменения в электрической активности медиальной септальной области, пириформной коры и амигдалы при эпилептогенезе на модели височной эпилепсии // Всероссийская конференция «Гиппокамп и память: норма и патология», г.Пущино, Россия, 2009, с.88.

5. Синельникова В.В., Шубина Л.В. Исследование развития патологической активности в мозге животных при эпилептогенезе с использованием электрофизиологических и иммунохимических методов // 14-я Международная Путинская школа-конференция, г.Пущино, Россия, 2010, с. 177.

6. Синельникова В.В., Шубина Л.В. Гольтяев В.М., Иерусалимский В.Н., Лосева Е.В. Определение путей и динамики распространения патологической активности в мозге животных с экспериментальной моделью височной эпилепсии методом выявления экспрессии раннего гена с-Ров // 6ой Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», г.Судак, Украина, 2010, с.271.

7. Синельникова В.В. Исследование развития патологической активности в гиппокампе, медиальной септальной области, пириформной коре и амигдале при эпилептогенезе на модели височной эпилепсии II «Экспериментальная и теоретическая биофизика '10», г.Пущино, Россия, 2010, с. 24.

8. Синельникова В.В. Роль медиальной септальной области в генерации острой судорожной активности в гиппокампе II «Экспериментальная и теоретическая биофизика '11», г.Пущино, Россия, 2011, с. 24.

Список сокращений: сп _ судорожный „ослеразряд

ПК - пириформная кора эс _ эпилептический

статус

МСО - медиальная септальная область ш _ перфорирующий пугь

ЦАМ - центральное ядро амигдалы ГАМК - 7-аминомасляная кислота

ЭЭГ - электроэнцефалограмма нмдд. к.метил.0.аспартат

Ккр - коэффициент кросс-корреляции

Подписано в печать:

24.04.2012

Заказ № 7260 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Синельникова, Виктория Владимировна, Пущино

61 12-3/916

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

СИНЕЛЬНИКОВА ВИКТОРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИМБИЧЕСКИХ СТРУКТУР МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ

ЭПИЛЕПТОГЕНЕЗЕ

03.03.01 - физиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук В.Ф. Кичигина

Пущино-2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................................................6

1. Структурные и биохимические особенности гиппокампа, медальной септальной области, пириформной коры и амигдалы..................................................................6

1.1. Гиппокамп................................................................................................................................................................6

1.2. Медиальная септальная область......................................................................................................8

1.3. Пириформная кора........................................................................................................................................9

1.4. Амигдала................................................................................................................................................................10

1.5. Связи гиппокампа, медиальной септальной области, пириформной коры и амигдалы..............................................................................................................................................................11

2. Осцилляторная активность в коре и лимбических структурах..............................15

3. Общие представления об эпилепсии. Роль лимбических структур в эпилептогенезе..................................................................................................................................................................21

3.1. Эпилепсия как заболевание..................................................................................................................21

3.2. Височная эпилепсия....................................................................................................................................23

3.3. Значение внутригиппокампальных изменений при височной эпилепсии 24

3.4. Значение амигдалы в развитии височной эпилепсии....................................................27

3.5. Роль пириформной коры в эпилептогенезе............................................................................29

3.6. Роль медиальной септальной области в развитии височной эпилепсии... 30

4. Модели височной эпилепсии на животных............................................................................32

4.1. Эпилептический статус..................................................................................................................................32

4.2. Пилокарпиновая модель височной эпилепсии....................................................................33

4.3. Киндлинг................................................................................................................................................................37

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................................................................................40

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................................................................................40

1. Модели височной эпилепсии................................................................................................................41

2. Проведение электрофизиологических экспериментов................................................41

3. Определение экспрессии с-Боз............................................................................................................45

4. Морфологический контроль. Окраска по Нисслю и Тимму....................................46

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................................................................47

1. Суммарная электрическая активность и корреляционные отношения пириформной коры, медиальной септальной области, гиппокампа и

центрального ядра амигдалы в контроле..................................................................................................47

2. Изменения электрической активности в передне-мозговых структурах

на литий-пилокарпиновой модели эпилепсии........................................... 50

2.1. Активность пириформной коры, медиальной септальной области, гиппокампа и центрального ядра амигдалы во время литий-пилокарпинового эпилептического статуса..................................................................... 50

2.2. Выявление формирования эпилептического очага посредством гистологического контроля.................................................................. 53

2.3. Активность пириформной коры, медиальной септальной области, гиппокампа и центрального ядра амигдалы после эпилептического статуса..... 54

3. Распространение патологической активности, выявленное иммунохимической детекцией с-Боз...................................................... 56

4. Изменения электрической активности гиппокампа и медиальной септальной области на модели киндлинга................................................ 60

4.1. Вызванные ответы в гиппокампе и медиальной септальной области при киндлинге....................................................................................... 60

4.2. Электрическая активность гиппокампа и медиальной септальной области у эпилептизированных животных............................................... 68

5. Изучение активности гиппокампа при временном функциональном

отключении медиальной септальной области........................................... 73

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................... 76

1. Суммарная электрическая активность и корреляционные отношения гиппокампа, медиальной септальной области, пириформной коры и амигдалы

в здоровом мозге............................................................................... 77

2. Предполагаемые клеточные механизмы нарушения ритмической активности и корреляционных отношений структур в эпилептическом мозге... 78

3. Последовательность активации структур мозга при инициаци эпилептического статуса..................................................................... 89

4. Роль медиальной септальной области в генерации острой судорожной активности в гиппокампе. Предполагаемые клеточные механизмы изменения

септо-гиппокампальных отношений в эпилептическом мозге....................... 94

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................. 105

ВЫВОДЫ....................................................................................... 106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................. 108

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АКГ - автокорреляционная гистограмма

ВПСП - возбуждающий постсинаптический потенциал

ВЭ - височная эпилепсия

ГАМК - у-аминомасляная кислота

ГАД (GAD) - глутаматдекарбоксилаза

ГлуР5-КР - каинатные рецепторы, содержащие 5-ую субъединицу

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

Ккр - коэффициент кросс-корреляции

МВЭ - медиальная височная эпилепсия

МДТ - медиодорзальное таламическое ядро

МРТ - магнитно-резонансная томография

МСО - медиальная септальная область

ПВ - парвальбумин

ПК - пириформная кора

ПП - перфорирующий путь

СГ - спектральная гистограмма

СП - судорожные послеразряды

CP - спектральная развертка

ТПСП - тормозный постсинаптический потенциал

ХАТ - холинацетилтрансфераза

ЦАМ - центральное ядро амигдалы

ЭК - энторинальная кора

ЭС - эпилептический статус

ЭЭГ - электроэнцефалограмма

мГлуР - метаботропный глутаматный рецептор

АМРА - а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изокСАЗол

PBS - стандартный солевой буфер

НМДА - К-метил-Б-аспартат

VIP - вазоактивный интестинальный полипептид

ВВЕДЕНИЕ

Эпилепсия - это заболевание мозга, поражающее около 50 миллионов человек в мире. Согласно эпидемиологическим исследованиям 30% пациентов с этим заболеванием остаются рефрактерными к известным антиэпилептическим препаратам [Andres-Mach et al., 2011]. Для создания более эффективных противосудорожных средств необходимо более глубокое исследование проблем эпилептогенеза и нейрональных нарушений, развивающихся в мозге после судорог.

Наиболее распространенной разновидностью эпилепсии является ее височная форма, при которой патологический очаг развивается в височных структурах (гиппокамп, амигдала, энторинальная кора), относящихся к лимбической системе мозга. В норме они участвуют в регуляции различных поведенческих и когнитивных процессов; во время патологических состояний, в частности, при генерации судорожной активности, тонкая регуляция механизмов функционирования этой системы нарушается [Helmstaedter, 2002: Leritz, 2006; Briellmann et al., 2007]. Известно, что коррелятами когнитивных функций мозга являются ритмические процессы в разных диапазонах частот [Steriade, Contreras, 1995; Vinogradova, 1995; Buzsaki, 2002; Engel, Fries, 2010]. Изменения различных типов осцилляций при эпилептогенезе изучены слабо; в то же время они могут быть основой патологической синхронизации, возникающей при развитии судорожного очага. Таким образом, исследование нарушений ритмической активности в мозге представляет большой интерес и может использоваться при разработке подходов для терапии височной эпилепсии.

При действии повреждающих факторов в мозге происходят патологические морфофункциональные перестройки, в результате чего могут формироваться фокусы судорожной активности; при этом для определенных регионов (очагов) синхронность активности может повышаться, а для других - падать [Uhlhaas, Singer, 2006]. Исходя из этого, для расшифровки патологических изменений, лежащих в основе эпилептогенеза, представляется важным исследование корреляционных отношений структур лимбической системы мозга.

В литературе описаны многочисленные патологические изменения в лимбической системе при эпилепсии [Spencer, Spencer, 1994; Bartolomei et al., 2001; Avoli et al., 2005], возникающие в результате перевозбуждения при судорогах.

Выявлены структуры, в которых эти изменения наиболее выражены - гиппокамп, амигдала, энторинальная кора [Pitkanen et al., 1998; Kendal et all., 1999; Bartolomei et al., 2001]. Тем не менее, отсутствуют данные о том, какие области мозга играют ведущую роль в инициации судорожной активности. Одним из методов, позволяющих проследить последовательность патологической активации нейронов в мозге, может быть регистрация экспрессии c-Fos - интегрального компонента сложных сигнальных механизмов, ответственных за клеточный ответ на различные внешние воздействия. Обнаружено, что уровень его экспрессии коррелирует с частотой интериктальной активности, и может служить маркером эпилептических событий [Rakhade et all., 2007]. Таким образом, исследование уровня экспрессии с-Fos может быть важным для определения как последовательности, так и степени вовлечения структур мозга в патологический процесс при инициации судорожной активности, что необходимо для выяснения механизмов эпилептогенеза.

Особый интерес представляет изучение септо-гиппокампальных взаимодействий и роли в эпилептогенезе медиальной септальной области (МСО). МСО является субкортикальным входом в гиппокамп и играет критическую роль в генерации тета-ритма, необходимого для осуществления когнитивных функций мозга. Хотя в МСО показаны значительные морфологические перестройки при эпилептогенезе [Colom et al., 2006], что указывает на её участие в этом процессе, значение этой структуры в формировании эпилептического очага в настоящее время не известно. Выяснение конкретной роли МСО в формировании височного патологического фокуса представляет собой одну из первоочередных задач современной нейробиологии и медицины.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Структурные и биохимические особенности гиппокампа, медиальной септальной области, пириформной коры и амигдалы 1.1. Гиппокамп

Гиппокамп - это филогенетически одна из самых древних структур мозга; он является центральным звеном лимбической системы и представляет собой отдел старой коры, расположенный в рогах боковых желудочков. Исходя из морфологии клеточных элементов и организации их афферентных и эфферентных связей,

основными полями гиппокампа считают поля CAI и САЗ. Пирамиды поля CAI имеют малые размеры и плотно расположены; длинные апикальные дендриты отходят на значительное расстояние от тела клетки. Пирамидные нейроны поля САЗ крупнее и расположены менее плотно; толстые апикальные дендриты образуют бифуркацию недалеко от сомы. Морфологическое деление гиппокампа на два основных отдела основано также на том факте, что поле САЗ, в отличие от поля CAI, связано с зубчатой фасцией системой афферентных мшистых волокон.

Основными внутренними связями гиппокампа являются мшистые волокна и коллатерали Шаффера. Мшистые волокна образованы аксонами гранулярных клеток зубчатой фасции; этот путь заканчивается гигантскими синапсами на шипиках проксимальной части апикальных дендритов пирамид поля САЗ и хилуса зубчатой фасции. Второй путь состоит из аксонов пирамидных клеток поля САЗ, идущих к полю CAI и заканчивающихся на апикальных дендритах пирамидных клеток в str. radiatum и str. lacunosum. Основными нейромедиаторами пирамидных клеток являются возбуждающие аминокислоты - глутамат и аспартат. В них также выявлен кальций-связывающий белок кальбиндин [Freund, Buzsaki, 1996].

Второй тип клеток гиппокампа, составляющих 10% клеточной популяции, представлен интернейронами. Практически все интернейроны гиппокампа являются ГАМКергическими, лишь в одной работе были обнаружены отдельные холинергические интернейроны [Frotcher et al., 1986]. Различные популяции интернейронов также содержат пептиды (соматостатин, холецистокинин, субстанция Р, VIP, нейрокинин) и кальций-связывающие белки (кальбиндин, парвальбумин, кальретинин) [Freund, Buzsaki, 1996; Freund, 2003]. В самых ранних исследованиях методом окраски по Гольджи в гиппокампе было выделено 20 типов интернейронов [Ramón у Cajal, 1893; Lorente de No, 1934], которые разделяли на основе строения аксонов и дендритов (т.е. баскетные, горизонтальные и звездчатые клетки). Развитие молекулярных методов позволило более подробно изучить процессы в отдельных дендритах и аксонах, что привело к выявлению большего количества типов интернейронов; тем не менее, единая их классификация к настоящему времени еще не разработана. При морфологическом анализе выделены четыре основных типа интернейронов: баскетные (корзинчатые) клетки, клетки-

канделябры (или аксо-аксональные клетки), дендритные тормозные клетки и интернейроны, иннервирующие другие интернейроны [Freund, Buzsaki, 1996].

1.2. Медиальная септальная область

Медиальная септальная область (МСО) - часть передне-базального мозга, выполняющая роль релейного ядра для восходящих влияний, поступающих в гиппокамп (поле САЗ и зубчатая фасция) от структур, находящихся в стволе и диенцефалоне [Vertes, Kocsis, 1997]. Анатомически МСО разделяют на медиальную, интермедиальную (вертикальная ветвь диагонального пучка Брока) и вентральную (горизонтальная ветвь диагонального пучка Брока) части.

Первоначально в МСО были идентифицированы две нейротрансмиттерные системы - ГАМК- и холинергическая [Kimura et al., 1980; Panula et al., 1984], позже были обнаружены глутаматергические нейроны [Manns et al., 2001; Sotty et al., 2003; Colom et al., 2005]. Показано также, что нейроны септальной области иммунореактивны к различным пептидам - тирозин-гидроксилазе, серотонину [Gall, Мооге; 1984]. ГАМК- и холинергические нейроны - это преимущественно крупные мультиполярные клетки; холинергические нейроны обычно несколько крупнее. Ацетилхолин-содержащие нейроны МСО (ХАТ-позитивные), выявляют как ко-трансмиттер пептид галанин. Они иннервируют пирамидные нейроны и интернейроны гиппокампа [Frotcher, Leranth, 1983]. По распределению фермента глутаматдекарбоксилазы (ГАД, ГАД 65 и ГАД 67) в септум большая часть клеток иммунореактивна к ГАД67, и только небольшое количество является ГАД65-позитивными [Castañeda et al., 2005]. Различные группы ГАМК-нейронов содержат также кальций связывающие белки - парвальбумин, кальбиндин и кальретинин [Kiss et al., 1997].

ГАМКергические клетки МСО можно разделить на две популяции на основании наличия или отсутствия в них белка парвальбумина (ПВ) [Freund, 1989]. ПВ-содержащие нейроны являются основными, то есть проекционными; они локализуются преимущественно в срединной зоне МСО и посылают аксоны к ПВ-содержащим клеткам гиппокампа (а получают проекции от кальбиндин-содержащих интернейронов гиппокампа) [Toth et al., 1993]. ПВ-негативные ГАМКергические клетки располагаются в латеральной зоне МСО и не дают

проекций к гиппокампу. Кроме того, обнаружено, что клетки МСО могут ко-экспрессировать ГАМК и ацетилхолин [Sotty et al., 2003].

Нейроны, экспрессирующие глутамат, обычно меньшего размера и имеют разнообразную форму (овальная, пирамидная, веретенообразная, круглая, полигональная) [Colom et al., 2005]. Некоторые септальные глутаматергические нейроны, также как и ГАМКергические, могут экспресировать кальций связывающие протеины [Gritti et al., 2003; Colom et al., 2005]. Небольшое число глутаматергических нейронов в МСО экспрессируют два или более медиаторов, большинство септальных глутамат-иммунореактивных нейронов не содержат других медиаторов. Распределение нейронов в септум является относительно упорядоченным: выделяются области, в которых преобладают ХАТ-, парвальбумин-, кальбиндин- или кальретинин-позитивные нейроны [Colom et al., 2005].

1.3. Пириформная кора

Пириформная кора (ПК) расположена двусторонне в вентролатеральной части переднего мозга и получает прямой вход от обонятельной луковицы через латеральный обонятельный тракт. В ПК традиционно выделяют переднюю и заднюю области с границей возле каудальной оконечности ольфакторного тракта.

Как и другие кортикальные области, она имеет слоистую структуру, но включает только три слоя, в отличие от шестислойного неокортекса. Плексиформный слой 1 образован многочисленными аксонами и дендритами, а также включает в се�