Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и свойства изоформ УДФ-Д-галактозо-4-эпимеразы и УДФ-Д-глюкозопирифосфорилазы из Pisum sativum и Caldieria sulphuraria

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Проселков, Павел Владимирович, Воронеж

Воронежский государственный университет

На правах рукописи

Просёлков Павел Владимирович

ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ИЗОФОРМ УДФ-В-ГАЛАКТОЗО-4-ЭПИМЕРАЗЫ И УДФ-В-ГЛЮКОЗОПИРОФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ PISUM SATIVUM И GALDIERIA SULPHURARIA

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

4 - Биохимия

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор А. У. Игамбердиев

Воронеж -1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

I. ВВЕДЕНИЕ 6

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

Глава 1. Метаболизм галактозы у животных и микроорганизмов 12

Глава 2. Пути метаболизма галактозы у растений и её токсичность 16 Глава 3. УДФ-0-галактозо-4-эпимераза - ключевой фермент га-

лактозного метаболизма растительной клетки 25 Глава 4. Роль У Д Ф-Б-глюкозопирофосфо рилазы в метаболизме

галактозы 28

Глава 5. Галактаны как продукт галактозного метаболизма 34

Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 37

Глава 6. Объекты и методы исследований 37

6.1. Объекты исследований 37

6.2. Методы исследований 39

6.2.1. Определение активности галактокиназы 39

6.2.2. Определение активности УДФ-галактозопирофосфорилазы 40

6.2.3. Определение активности галактозо-1-Ф-уридилтрансферазы 40

6.2.4. Определение активности УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы 40

6.2.5. Определение активности УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы 41

6.2.6. Определение активности фосфоглюкомутазы 41

6.2.7. Определение активности фосфоглюкозоизомеразы 41

6.2.8. Определение активности фосфоманнозоизомеразы 42

6.2.9. Определение активности фосфоманномутазы 42

6.2.10. Определение активности глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы 43

6.2.11. Определение активности малатдегидрогеназы 43

6.2.12. Определение активности пероксидазы 43

6.2.13. Определение активности альдолазы 44

6.2.14. Определение активности каталазы 44

6.3. Выделение, очистка и исследование свойств ферментов 44

6.3.1. Получение гомогената 44

6.3.2. Ионообменная хроматография на DEAE-фрактогеле 45

6.3.3. Адсорбционная хроматография на гидроксилапатите 46

6.3.4. Гидрофобная хроматография 46

6.3.5. Аффинная хроматография 47

6.3.6. Гель-фильтрация 47

6.3.7. Жидкостная хроматография низкого давления (LPLC) 48

6.3.8. Определение К , V ,К К. 49

^ m max 1' si

6.3.9. Определение K^ УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы 49

6.3.10. Исследование термостабильности и выяснение оптимальных условий хранения УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы 50

6.3.11. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы 51

6.3.12. Электрофорез на пластинках 52

6.4. Жидкостная хроматография высокой разрешающей способности (HPLC) 53

6.5. Определение концентрации белка 54

6.7. Статистическая обработка экспериментальных данных 54

6.8. Фирменная принадлежность реактивов 55 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 56

Глава 7. Активность ферментов при выращивании Galdieria sulphurа-

ria на среде с различными углеводами 56

Глава 8. Очистка и свойства УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы из

Galdieria sulphuraria 56

8.1. Выделение стабильной изоформы 58

8.2. Активация в ходе очистки нестабильной изоформы 69 Глава 9. Выделение и характеристика УДФ-О-глюкозопирофосфори-

лазы из Galdieria sulphuraria 72

Глава 10. Активность ферментов галактозного метаболизма у Pisum

sativum 11

Глава 11. Нестабильность фермента - УДФ-0-галактозо-4-эпимера-

зы из Pisum sativum 79

11.1. Характеристика первой изоформы 79

11.2. Свойства второй изоформы 81

11.3. Субстратное ингибирование УДФ-0-галактозо-4-эпимера-

зы из проростков Pisum sativum 82

Глава 12. Исследование свойств УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы

из проростков Pisum sativum 83

Глава 13. Изучение транспорта галактозы в клетки корня Pisum sativum 85

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 88

V. ВЫВОДЫ 89 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 92

Список использованных сокращений

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

бисакриламид - N, ИФ - метиленбисакриламид

БСА - бычий сывороточный альбумин

гсм- грамм сырой массы

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ИУК - индолуксусная кислота

кДа - килодальтон

кДж - килоджоуль

Трис - 2-амино-(2-гидроксиметил)-1.3-пропандиол

УДФ - уридиндифосфат

УТФ - уридинтрифосфат

Ф - фосфат

ФЕ - ферментативная единица

AMPS - пероксидсульфатаммония

DEAE - диэтиламиноэтил

DTT - дитиотриитол

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

HPLC - жидкостная хроматография высокой разрешающей способности

LPLC - жидкостная хроматография низкого давления

МВТ - меркаптобензотиазол

MOPS - морфолинопропансульфоновая кислота

NAD(H) - никотинамидадениндинуклеотид (восстановленный)

NADP(H) - никотинамиддинуклеотидфосфат (восстановленный)

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

PP. - неорганический пирофосфат

SDS - додецилсульфат

TEMED - N, N, N', N' -тетраметилендиамин

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. От 20 до 30 различных моносахаридов и до 17 сахарных спиртов присутствует в различных количествах в растениях (Lewis D. Н., 1984). Метаболизм этих соединений детально изучен только для глюкозы и фруктозы. Главная причина ограниченности знаний об участии Сахаров в метаболизме, транспорте, хранении и осмотическом контроле -низкая активность вовлечённых в данные процессы ферментов. У высших растений их активность может быть определена только на определённых стадиях развития или в специальных тканях. Так, например, до сих пор отсутствует целостная картина относительно метаболизма такого важного для клетки углевода как галактоза. Существует также и проблема галактозной токсичности, которая более или менее решена для животных, человека и микроорганизмов (Berry G. Т. et al., 1995; Szczypka М., 1996; Landt М. et al., 1997; Greber-Platzer S. et al., 1997 и мн. др.), однако, для высших растений её причина остаётся невыясненной уже на протяжении восьмидесяти лет (Knudson L., 1917; White P. R., 1940; Reinholz Е., 1954; Farkas G. L., 1954; Ferguson J. D. et al., 1958; Maretzki A., Thom A., 1978; Dressler K. et al., 1982; Frick H., 1991; Frick H., Morley K., 1995 и мн. др.). Из всех ферментов, принимающих непосредственное участие в метаболизме галактозы, особая, ключевая роль принадлежит двум: УДФ-0-галактозо-4-эпимеразе и УДФ-D-глюкозопирофосфорилазе. Продукты этих ферментов являются составляющими многочисленных клеточных компонентов: целлюлозы (Wright В. Е., 1959; Zetsche К., 1968), клеточных полисахаридов как у высших

растений (Feingold D. S. et al., 1958; Goldemberg S. H., Maréchal L. R., 1963; Павлинова О. A., Прасолова M. Ф., 1970), так и y микроорганизмов (FukasawaT. et al., 1962; Lieberman M. et al., 1970), трегалозы (RothR., Sussman M., 1968), гликозидов (Franz G., Meier H., 1969), гликолипидов (Curtino J. A. et al., 1968), гепарина (Danishefsky I., Héritier-Watkins O., 1957), бактериальных антигенов (Bernstein R. L., Robbins P. W., 1965), лактозы (Steelman V. S., Ebner К. E., 1966), глюкуронидов (Shikamura M., Tsuboi К. К., 1961; Roberts R. M., Rao К. M. К., 1971), рамнозы (Sundararajan T. A. et al., 1962; Barber G. A., 1971), рафинозы и стахиозы (Hasegawa M. et al., 1951; Shiroya T., 1963), D- и L-галактанов (Aspinall G. O., 1970; Morvan D. R. et al., 1989; Goubet F. et al., 1993; Goubet F., Morvan G, 1994). Таким образом, получив достоверные сведения относительно свойств эпимеразы и пирофосфорилазы, представляется возможным не только выяснить регуляторные механизмы галактоз-ного метаболизма клетки, но и, возможно, найти ответ на вопрос о причине токсичности галактозы для высших растений. Воспроизведнение полной картины данного процесса позволило бы раскрыть ещё один слабо изученный аспект всего многообразия процессов, происходящих в живой клетке. Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение свойств ферментов, занимающих ключевые позиции в галактозном метаболизме клетки, УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы и УДФ-0-глюкозопиро-фосфорилазы, исследование их физико-химических, каталитических и регуляторных характеристик. С целью выяснения причин токсичности галактозы для высших растений предполагалось осуществить сравнение эпимеразы и пирофосфорилазы из галактозо-чувствительного и галактозо-

резистентного объектов и предположить возможный механизм, объясняющий токсичность.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Очистить, охарактеризовать и сравнить УДФ-0-галактозо-4-эпимеразу из галактозо-чувствительного и галактозо-резистентного объектов.

2. Очистить, охарактеризовать и сравнить УДФ—Б-глюкозо-пирофосфорилазу из галактозо-чувствительного и галактозо-резистентного объектов.

3. Исследовать в гомогенате активность основных ферментов галактозного метаболизма у нечувствительного к галактозе растения.

4. Исследовать в гомогенате активность основных ферментов галактозного метаболизма у чувствительного к галактозе растения.

5. Изучить транспорт галактозы в клетки корня гороха, подверженного влиянию галактозы. Затруднение транспорта галактозы может быть одной из причин токсичности.

6. Представить гипотетическую модель молекулярных механизмов, лежащих в основе токсического действия галактозы на высшие растения. Научная новизна работы. Проведённые исследования расширяют представления о свойствах ферментов галактозного метаболизма клетки и позволяют сделать предположение относительно возможной причины токсичности галактозы для высших растений.

Впервые у термоацидофильной красной водоросли ОсйскеНа зи1ркигапа обнаружено наличие двух изоформ УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы, которые отличаются как по своим свойствам, так и по стабильности. Активация в ходе

очистки одной из изоформ предполагает увеличение её роли в метаболизме поступающей извне галактозы.

В проростках гороха УДФ-О-галактозо-4-эпимераза также представлена в виде двух изоформ. Обе подвергаются субстратному ингибированию УДФ-О-галактозой.

Недостаток знаний относительно свойств растительной УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы был восполнен характеристикой и получением гомогенного препарата фермента из красной водоросли, а также выделением двух его изоформ из гороха. Способность пирофосфорилазы метаболизиро-вать галактозо-1-Ф указывает на его существенную роль во всём галактозном метаболизме, однако, это же свойство является одним из ведущих аспектов галактозной токсичности. Данное наблюдение подтверждает предположение об отсутствии у растений УДФ-Б-галактозопирофосфорилазы, которой ранее приписывалась одна из ведущих ролей в метаболизме галактозо-1-Ф и функционировании альтернативного пути кяе1Ьаскег. Данный фермент у растений отсутствует, что вполне объясняет невозможность его выделения и получения какой-либо чёткой характеристики, а его функция опосредуется неспецифической активностью УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы, роль которой значительно возрастает при увеличении потока экзогенной галактозы.

Из всех девяти ферментов галактозного пути только для УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы обнаружена индукция в два с лишним раза при выращивании красной термоацидофильной водоросли СакИепа $и1ркигапа на среде с галактозой, что свидетельствует о непосредственном вовлечении данного фермента в метаболизм избытка галактозы. Остальные ферменты, в

том числе и из проростков разного возраста Pisum sativum, не показали заметного изменения своей активности. Никем ранее все ферменты галактозного метаболизма в комплексе не рассматривались.

Впервые экспериментально показано, что скорость транспорта и последующего метаболизма галактозы при её попадании внутрь клеток корней гороха очень высока и вполне сопоставима со скоростью потребления клеткой глюкозы и фруктозы.

Обнаружена изначальная причина токсичности галактозы для высших растений. Ею является субстратное ингибирование УДФ-Б-галактозо-4-эпимеразы, которое приводит к накоплению УДФ-Б-галактозы и последующему вовлечению в метаболизм УДФ-Э-глюкозопиро-фосфорилазы. Данное субстратное ингибирование обнаружено только для эпимеразы из проростков гороха, для которых галактоза токсична, но оно отсутствует у Galdieria sulphuraria, для которой галактоза не является ингибитором роста.

Впервые предлагается обобщающая гипотетическая модель молекулярных механизмов, лежащих в основе токсического действия галактозы на высшие растения.

Практическая значимость исследования. Сведения, полученные в ходе выполнения данной работы имеют как фундаментально-теоретическую, так и непосредственную практическую ценность.

Разработанная схема очистки и получения электрофоретически гомогенного препарата УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы может быть использована для получения коммерческих препаратов фермента. Высокая термостабильность эпимеразы делает перспективным её применение в

лабораторных тестах на содержание в крови УДФ-Б-галактозы в клинической диагностике при таком широко распространённом во всём мире заболевании, как галактоземия.

Метаболизм галактозы самым тесным образом связан с процессом формирования галактанов растениями, так как субстратами для их синтеза являются именно галактозо-производные. Применение же галактанов в народном хозяйстве распространяется от их использования в качестве заменителей сахара для больных диабетом до очистителей нефти от кислых загрязнителей.

В сельском хозяйстве морские водоросли широко используются в качестве удобрений и стимуляторов роста. Чаще всего это бурые водоросли, но могут быть и зелёные, и красные. Полисахаридами бурых водорослей являются альгинаты, а красных - галактаны, которые подвергаются в почве действию гидролитических ферментов, экскретируемых бактериями, например, Pseudomonas carrageenovora. Освобождаемая при этом галактоза влияет на рост корней большинства высших растений, поэтому, на основании данной работы, рекомендуется проводить предварительный тест на устойчивость УДФ-В-галактозо-4-эпимеразы к избытку УДФ-Б-галактозы у культивируемых растений во избежание токсикоза галактозой и их последующей гибели.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на конференции Progress in Plant Sciences (Masonmagyarovar, Hungary, 1996). Результаты были сообщены в виде четырёх докладов на Progress-seminar (Freie Universitaet, Berlin, 1995-1998). Они также являются материалами конференций американского общества физиологов растений

(Vancouver, Canada, 1997), NATO ARW (Kolymbari, Crete, 1998) и европейского фитохимического общества Bioactive Plant Carbohydrates (Sandoya, Norway, 1998). Данная работа в сентябре 1998 года удостоена премии европейского фитохимического общества.

Публикации. По теме диссертации опубликована 1 статья и 5 тезисов, подготовлены к печати 3 статьи.

Структура диссертации. Диссертационная работа включает 13 глав; 122 страницы; 27 рисунков; 10 таблиц и 5 фотографий. Использовано 272 литературных источника.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Метаболизм галактозы у животных и микроорганизмов

Галактоза необходима для всех живых организмов. Структурно она представляет собой С-4 эпимер глюкозы (Рис. 1).

н о Н О

\ * \ У/

с 1 С ■

1 н- с -он 1 н - 1 С - ОН

1 НО - с - н 1 НО - 1 с - н 1

1 н- с-он но - 1 с - н

1 н- с - он н- 1 с - он

1 СН2ОН 1 СН2ОН

Глюкоза Галактоза

Рис. 1. Структурные формулы глюкозы и галактозы.

Метаболизм галактозы детально изучен у дрожжей и млекопитающих, особенно у человека, так как некоторые наследственные заболевания связаны с отсутствием ферментов, метаболизирующих галактозу (Рис. 2). Недостаток или пониженная активность ферментов приводят к ряду аномалий, в совокупности называемых галактоземия (Beutler Е., 1991; Petry К. et al., 1991; Reichardt J. К. V. et al., 1992; Reichardt J. К. V., 1992; Ng W. G. et al., 1994; Elsas К. et al., 1994; Ashino J. et al., 1995; Segal S., 1995; Schweitzer S., 1995; Szczypka M., 1996; Landt M. et al., 1997; Greber-Platzer S. et al., 1997; Berry G. T. et al., 1997; Landley S. D. et al., 1997). Больные новорождённые проявляют неспособность к интенсивному росту, увеличение печени и селезёнки, рвоту, желтуху, протеиноурею, аминоацидоурею, повышенный уровень содержания

галактозы в крови и последующую экскрекцию больших количеств данного углевода в моче, диарею, катаракту и недостаточность умственного развития (Schwarz V. et al., 1956; Segal S. et al., 1963). Также одно из последствий галактоземии - ранняя менопауза (Cramer D. W. et al., 1995).

галактоза

галакто-киназа

АТФ

галактозо-1-Ф

УТФ

УДФ-О-галактозопирофосфорилаза

о

УДФ-Б-глюкоза

галактозо-1-Ф-уридилтрансфераза ГЛЮКОЗО-1-Ф

1

УДФ-0-галактоза

Рис. 2. Два альтернативных пути метаболизации галактозы.

Было показано, что причиной галактозной токсичности у питающихся галактозой животных является аккумуляция галактозо-1-Ф, ингибирующего фосфоглюкомутазу (Ginsburg V., Neufeld Е. F., 1957; Sidbury J. В., 1957; Sidbury J. В., 1960), УДФ-О-глюкозопирофосфорилазу (Oliver I. T., 1961), глюкозо-6-Ф-дегидрогеназу (Lerman S., 1959) и глюкозо-6-фосфатазу (Kalckar H. M., Maxwell E. S., 1958); и УДФ-Б-галактозы (Schwarz V., Golberg L., 1955; Hansen R. G. et al., 1956; Klethi J., Mandel P., 1962), ингибирующей УДФ-D-глюкозодегидрогеназу (Salitis G., Oliver I. T., 1964). Молодые животные аккумулируют галатозо-1-Ф в своих тканях как результат диеты с высоким содержанием галактозы (Kosterlitz H. W., 1943; Schwarz V., Golberg L., 1955; Schwarz V. et al., 1956), хотя имеется и сообщение о том, что не известно, играет ли роль диета в уровнях УДФ-О-глюкозы и УДФ-О-галактозы

(Palmieri M. J. et al., 1991). Для микрорганизмов характерно разнообразие путей метаболизма галактозы, так, например, физиологически значимый путь у Staphylococcus aureus - тагатозо-6-фосфатный, ферменты которого являются индуцибельными. Его существование связано с тем, что при транспорте галактозы внутрь клетки формируется галактозо-6-Ф (Simoni J. L., Roseman S., 1973; Bissett D. L., 1974), синтез которого детально изучено для Е. сой, где транспорт галактозы осуществляется фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системой (Roseman S., 1975). Совершенно иной путь метаболизма галактозы характерен для Pseudomonas saccharophila (Doudoroff М. et al., 1956; De Ley J